FR2541116A1 - Procede pour la preparation de vaccins polyvalents (tetanos, diphterie, coqueluche) adsorbes lyophilises - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A UN PROCEDE DE PREPARATION DE VACCINS POLYVALENTS ADSORBES LYOPHILISES. CE PROCEDE SE CARACTERISE EN CE QUE L'ON ADSORBE DES ANTIGENES DE TETANOS, DE DIPHTERIE, DE COQUELUCHE ET EVENTUELLEMENT DE TYPHUS, CONCENTRES A RAISON DE 5 A 15DOSES3ML, A UN PH DE 3 A 6 SUR UN SUPPORT INSOLUBLE CONCENTRE DE LA MEME FACON QUE LES ANTIGENES, L'ON AJUSTE LE PH A 5-6 ET LYOPHILISE LE MELANGE AVEC UNE SUBSTANCE DE PROTECTION UTILISEE COURAMMENT DANS DES PROCEDES DE LYOPHILISATION. APPLICATION A LA PREPARATION DE VACCINS POLYVALENTS STABLES.

Description

La présente invention est relative à un procédé

de préparation de vaccins polyvalents adsorbés lyophilisés.

Les vaccins polyvalents, par exemple le vaccin contre la diphtérietétanos-coqueluche (dénommé par la suite vaccin C T Coqo)jouent un rôle important dans le programme de vaccination étendu de l'Organisation Mondiale de la Santé

(OMS) Ce programme a pour but d'empêcher les maladies infec-

tieuses les plus dangereuses de l'enfance par des vaccina-

tions Cependant, l'efficacité des vaccins disponibles indus-

triellement à l'heure actuelle, se réduit pendant le stockage.

En particulier, dans des conditions tropicales, ces vaccins Do T Coq ne se conservent que pendant une très courte période de temps; ces vaccins ne sont stables que pendant 1 à 2 semaines, en raison de la sensibilité à la chaleur du composant

coqueluche.

La demanderesse a étudié ces dernières années,

de façon détaillée, la stabilité des vaccins contre la coque-

luche et du vaccin D T Coq lCsizér Z Jo 6 Io, Zsidai J, Hegedls Lo Jo Biol Standard 1, 347 ( 1973); Csizér Z, Zsidai J, Joo I: Acta Microbiolo Acad Scio Hung 22, 83 ( 1975);

Csizér Zo, Zsidai J, Joo I: Acta Microbiolo Acado Sci Hung.

, 1 ( 1978)j et elle a réalisé 400 expériences d'immunisa-

tion active sur des souris, en utilisant 53 mélanges de suspen-

sion de souche de pertussis, en une période allant de 1960 à 1973 Par analyse statistique de ces études, on a établi que, dans le cas o les suspensions sont stockées à 5-10 C, leur activité diminue après 8 ans à une valeur inférieure à 4 unités internationales (IU); qui est une dose humaine unique pour l'immunisation De 1968 à 1974, 207 expériences d'immunisation

active sont réalisées sur la souris, avec 21 vaccins D T Coq.

On peut déclarer, à la suite de l'analyse statistique des résultats, que l'activité du composant pertussis, stocké à -100 C, satisfait encore après 6 années aux prescriptions internationales et nationales lWHO Tech Rep Ser 638, 37 ( 1979); Hungarian Pharmacopoeia V Io ( 1967)/o La diminution moyenne annuelle de 'L'activité des mélanges de suspension de

soude de pertussis est de 1,01 IU, tandis que celle du compo-

sant pertussis des vaccins D T Coq est de 0,35 IU Ainsi, un

stockage à 5-100 C est convenable pour maintenir l'activité.

Lorsque des vaccins sont stockés à 370 C, leur activité diminue notablement en 2 semaines, bien que cette température de stockage soit aussi difficile à assurer dans des conditions tropicales La présente invention a pour but de fournir un

procédé pour la préparation de vaccins polyvalents, qui peu-

vent être stockés dans diverses conditions climatiques

pendant une période longue appropriée.

La présente invention repose sur la constatation que l'on peut obtenir des vaccins polyvalents de bonne qualité,

satisfaisant aux exigences ci-dessus, en adsorbant les anti-

gènes concentrés de façon convenable sur un support concentré de la même manière que les antigènes, dans une solution ayant un p H voisin du point isoélectrique des antigènes et en lyophilisant le vaccin obtenu à un p H qui ne provoque aucune désorption notable En vue de l'application, on reconstitue le vaccin lyophilisé avec un tampon qui permet l'ajustement

du vaccin à un p H neutre.

En conséquence, la présente invention est relative

à la préparation de vaccins polyvalents adsorbés, lyophilisés.

Conformément à la présente invention, on concentre les antigènes de ténanos, de diphtérie, de coqueluche et

éventuellement de typhus, on les adsorbe sur un support concen-

tré de la même façon que les antigènes à un p H de 3 à 6, on ajoute le p H des solutions combinées à une valeur de 5 à 6 et

on lyophilise le mélange.

Il est bien connu que l'adsorption optimum des

antigènes a lieuà une valeur de p H voisine de leur point iso-

électrique, alors que les antigènes sont élués à une valeur

de p H qui est beaucoup plus élevée que leur point isoélectrique.

Les conditions doadsorption du toxolde de tétanos en fonction du p H sont indiquées dans le Tabieau ci-après:

TABLEAU I

Phosphate d'aluminium Hydroxyde d'aluminium p H HOLT ERICKSON* 3,0 100 100 non mesurable 3,5 100 95 non mesurable 4,0 90 à 100 80 à 85 non mesurable 4,5 85 à 90 60 à 70 non mesurable

,0 80 à 85 60 à 70 100

,5 80 à 85 60 à 70 100

6,0 80 à 85 50 à 60 100

7,0 20 10 100

7,5 pas d'adsorption 85 8,0 pas d'adsorption 70 8,5 pas d'adsorption 70

*Note: Méthodes de préparation pour le phosphate d'aluminium.

En réalisant ses expériences, la demanderesse a utilisé le support en une quantité convenable pour avoir 1 mg d'ions A 13 + par ml, dans le cas de la mise en oeuvre de 10 BU (unité de liaison) de toxoide de tétanos Les données du tableau expriment le pourcentage d'adsorption par rapport au

toxoide de tétanos employé.

Il est aussi connu que le p H courant d'une solu-

tion d'antigène polyvalente, ne doit pas être inférieur, lors de l'adsorption, au point isoélectrique caractéristique des antigènes individuels Simultanément, le p H courant ne doit pas dépasser un p H pour lequel sont élués plus de 15 % des

antigènes, adsorbés au p H du point isoélectrique.

Le p H est convenablement ajusté à l'aide de solu-

tion d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique, respec-

tivement.

On peut de préférence appliquer le gel de phos-

phate d'aluminium ou d'hydroxyde d'aluminium en tant que

support insoluble, en une quantité déterminée lors d'expé-

riences préliminaires Au cours de ces études, diverses quan-

tités de supports sont ajoutées à des solutions contenant l'antigène à des concentrations différentes et la capacité

immunisante des vaccins modèles ainsi obtenus est mesurée.

L'étude, par exemple, du pouvoir immunisant du toxoîde de tétanos chez les cobayes,avec de l'hydroxyde d'aluminium comme support, a fourni les résultats rassemblés dans le

Tableau II:

TABLEAU II

Hydroxyde Moyenne du titre de l'antitoxine de tétanos d'aluminium après une seule immunisation mq/dose 14 ème jour 28 ème jour 42 eme jour

0,625 0,4 0,8 1,2

1,25 0,8 1,9 2,6

-2,5 0,8 5,0 6,0

,0 1,5 8,0 8,0

,0 0,5 4,0 3,0

,0 0,2 0,5 1,0

En effectuant une évaluation mathématique des

résultats obtenus, il s'avère que la quantité optimum d'hy-

droxyde d'aluminium est de 3,1 mg, 3,06 mg et 3,44 mg respec-

tivement. En utilisant un vaccin modèle contenant 5 BU de toxoide de tétanos et 5 Lf (limes flocculans) de toxoide de diphtérie, on recueille les résultats suivants:

TABLEAU III

Hydroxyde Moyenne du titre de diphtérie après une d'aluminium seule immunisation mg/dose 14 ème jour 28 ème jour 42 ème jour

0,625 0,03 0,3 0,4

1,25 0,12 0,8 0,8

2,5 0,2 1,6 1,6

,0 0,2 1,8 2,0

,0 0,04 0,3 0,6

Par évaluation mathématique des résultats, on constate que la quantité optimum d'hydroxyde d'aluminium est

de 2,72 mg, 2,78 mg et 3,0 mg respectivement.

Des expériences analogues sont effectuées aussi avec du phosphate d'aluminium en tant que support En résumé, des résultats expérimentaux on peut établir que la quantité

préférable des deux supports est entre 1,75 et 3,5 mg par dose.

Conformément au procédé de la présente invention, les antigènes individuels concentrés sont adsorbés à partir de solutions séparées, sur le support concentré de la même

façon que les antigènes, à la valeur de p H optimum caracté-

ristique des antigènes distincts Ainsi, on adsorbe le toxoide de tétanos à environ p H 3, le toxolde de diphtérie à environ p H 4 et les antigènes de coqueluche et de typhus à environ p H 5,8 à 6 Dans une variante, l'adsorption peut aussi être

accomplie dans la solution combinée des antigènes.

Il est connu que les propriétés physiques et chimiques des gels de phosphate d'aluminium et d'hydroxyde

d'aluminium sont modifiées pendant la lyophilisation La dimen-

sion particulaire augmente notablement, tandis que la capacité d'adsorption est réduite Cependant, on peut maintenir les caractéristiques physico-chimiques des gels, en utilisant une

matière convenable de protection.

254 I i i Des matières convenables de protection sont, par exemple, des protéines, des polypeptides, des polysaccharides et d'autres colloïdes protecteurs Les exigences les plus importantes concernent le choix des matières de protection utilisées, se rapportent à l'inertie des points de vue chimique, immunologique et pharmacologique et d'un autre dôté,

à l'absence de toxicité.

L'antigène concentré et adsorbé de façon appropriée exerce également un important effet de protection en raison de sa nature protéinique La demanderesse a observé au cours de ses expériences, que la concentration er antigène est convenable lorsque 10 doses de vaccin sont dissoutes dans un

volume total de 3 ml; cependant, une autre matière de protec-

tion est aussi nécessaire Ces deux effets fournissent

ensemble une protection satisfaisante pendant la lyophilisa-

tion Conformément aux expériences de la demanderesse, la

dextrane ayant un poids moléculaire de 40 000 ou la combinai-

son de dextrane et de polysaccharides, se révèlent respecti-

vement les plus convenables à ce propos.

Les propriétés physico-chimiques du support peuvent être bien caractérisées par la vitesse de sédimentatin

après une reconstitution suivant la lyophilisation Les résul-

tats des expériences portant sur l'effet combiné, exercé par la protéine de l'antigène et le dextrane, sur les

propriétés physico-chimiques du support de-phosphate d'alu-

minium, pendant la lyophilisation, sont rassemblés dans le Tableau IV ciaprès:

2541 1 16

TABLEAU-IV

Quantité de Protéine mg/ml Dextrane % S é d i m e N t a t i o N (mm) mfnutes 30 minutes 5 minutes 30 minutes avant lyophilisation après lyophilisation 0,2 0,8

3,2

13,0 ,0 o O 0,2

0,4

0,8 1,6 3,2 6.,4

13,0

26,0 ,0 0,2

0,4

0,8 1,6 3,2 6,4 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,4 o O o o o O comme du sable Ie Ig I 1 i, VI IV Il

100

comme du sable sédimentation en plusieurs phases avec une agrégatio comme du sable homogène homogène homogène

100

45

23-

28 72

65

66

60

55

40

20

50

45

45

40

8 30

6 16

6 14

En conséquence, on ajoute à la solution des anti-

gènes, 0,5 QI 10 % en poids de matière de protection et 0,01 t en poids de thiomersal en tant qu'agent de conservation Le mélange obtenu est réparti en ampoules et lyophilisé de telle sorte que la température de la matière ne dépasse pas -30 'C, de préférence -350 C au commencement Dans la seconde étape de la lyophilisation, la température de la matière est maintenue à 30-350 C pour fournir la teneur en humidité

inférieure-à 3 % requise.

Le vaccin lyophilisé peut être administré après

dilution à la concentration nécessaire avec une soluphysiolo-

gique saline tamponnée à un p H de 6,8 à 7 avec une solution

de phosphate.

L'avantage du procédé conforme à la présente

invention réside en ce que des vaccins polyvalents lyophi-

lisés et adsorbés préparés selon l'invention,-sont capables de conserver leur activité pendant une période notablement plus longue que les vaccins disponibles industriellement ne peuvent le faire Le vaccin D T Coq préparé conformément au procédé de la présente invention peut être stocké, d'après

les expériences de la demanderesse, pendant au moins 4 semai-

nes à 560 C et pendant au moins une année à 370 C, sans qu'il

y ait une quelconque diminution de son activité.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la

description qui va suivre.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du

complément de description qui va suivre, qui se réfère à des

exemples de mise en oeuvre du procédé, objet de la présente

invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre

d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne cons-

tituent en aucune manière une limitation.

Exemple 1

On cultive des suspensions de Bordatella pertus-

sis dans une cuve de fermentation, puis on les concentre par précipitation acide, en utilisant de l'acide chlorhydrique 1 N, à un p H d'environ 4 et l'on fait décanter les suspensions à 4 C pendant 48 heures Après décantation du surnageant, le sédiment est remis en suspension dans une solution saline isotonique tamponnée à p H 7,2, de façon à ajuster l'opacité

de la suspension à 300 IOU/ml (unité internationale d'opacité).

Les suspensions sont inactivées par 0,02 % en poids de thiomersal et par un traitement à chaud à 56 C pendant

minutes, puis ensuite conservées à 4 C.

Exemple 2

On prépare des vaccins avec les ingrédients sui-

vants (les quantités correspondent à 10 doses en un volume

total de 3 ml).

Toxolde de diphtérie (Lf)4 Suspension de cellules de Pertusis (IOU) Toxoide de tétanos (BU) Salmonella typhi(cellules)

Gel de phosphate d'alumi-

nium (mg) Thiomersal (% en poids) Saccharose (% en poids) Lactose (% en poids) Dextrane (% en poids)

1 2

250 250

x 109

3 4 5 6 7

250 250 300 300 300

30 30 30 30 30 30

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

9 9 9 9 4,5

2,5

Notes: Lf = limes flocculans IOU = unité internationale d'opacité

BU = unité de liaison.

Les antigènes individuels sont séparément adsorbés sur le phosphate d'aluminium, la matière de protection et le thiomersal sont ajoutés à la solution combinée, le p H de la solution est ajouté à 5-5,8, puis chaque volume de 3 ml de la solution est réparti dans des ampoules et lyophilisé La

température de la matière est maintenue à une valeur infé-

rieure à -350 C pendant lés 10 premières heures de la lyophi-

lisation, de -35 à + 20 WC pendant les 8 heures suivantes et

de + 20 à + 350 C pendant les 10 dernières heures.

Exemple 3

Etude de l'aptitude des vaccins à tolérer la chaleur. Activité du composé pertussis Vaccin Matière de protection après un stockage (semaines)

à 560 C à 37 OC

9 % de saccharose 1 26 6 5 % de dextrane 4 53 4,5 % de saccharose

7 + 1 26

2,5 de dextrane Au contraire, l'activité du composant pertussis

du vaccin D T Coq adsorbé de façon habituelle diminue nota-

blement pendant un stockage de 2 semaines à 370 C.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven-

tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire

toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du techni-

cien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée

de la présente invention.

il

Claims (3)

REVENDICATIONS.

1 Procédé pour la préparation de vaccins poly-

valents adsorbés et lyophilisés, caractérisé en ce que l'on adsorbe des antigènes de tétanos, de diphtérie, de coqueluche et éventuellement de typhus, concentrés à raison de 5 à 15

doses/3 ml, à un p H de 3 à 6 sur un support insoluble concen-

tré de la même façon que les antigènes, l'on ajuste le p H à -6 et lyophilise le mélange avec une substance de protec-

tion utilisée couramment dans des procédés de lyophilisation.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise 1,75 à 3,5 mg/dose de gels de phosphate d'aluminium ou d'hydroxyde d'aluminium, comme support insoluble.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise 20 à 35 Lf/dose de toxoide de diphtérie, à 20 IOU/dose de suspension de cellules de Bordatella

pertussis, 5 à 15 BU/dose de toxolde de tétanos et éventuel-

lement une suspension de cellules de Salmonella typhi

contenant 108 à 109 cellules/dose.