NL8400511A - Werkwijze voor de bereiding van gevriesdroogde, geadsorbeerde meervoudige vaccins. - Google Patents

Description

NI/31.900-Kp/vdM » ^ - 1 -• v

Werkwijze voor de bereiding van gevriesdroogde, geadsorbeerde meervoudige vaccins.

De uitvinding heeft betrekking op de bereiding van gevriesdroogde, geadsorbeerde meervoudige vaccins*

De meervoudige vaccins, bijv. de difterie-teta-nus-pertussis (in het vervolg: Di-Te-Pe)-vaccins, spelen een 5 belangrijke rol in het uitgebreide vaccinatieprogramma van de Wereldgezondheidsorganisatie (W.G.O.). Het doel van dit programma is het voorkomen van de gevaarlijkste infectieziektes bij kinderen door vaccinaties. De doelmatigheid van de thans commercieel beschikbare vaccins neemt echter tijdens opslag 10 af. In het bijzonder onder tropische omstandigheden kunnen deze Di-Te-Pe-vaccins slechts gedurende korte tijd worden bewaard; het een en ander ten gevolge van de warmtegevoeligheid van de pertussiscomponent, die slechts gedurende 1-2 weken stabiel is.

15 Gedurende de afgelopen jaren hebben de uitvinders de stabiliteit van de pertussis- en Di-Te-Pe-vaccins grondig bestudeerd /Csizér Z., «Joó I., Zsidai J., Hegedüs L.: J. Biol. Standard jL, 347 (1973); Csizér Z., Zsidai J., Joö I.: Acta Microbiol. Acad. Sci. Hong. 22, 83 (1975); Csizér Z., Zsidai 20 J., Joé I.: Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 25, 1 (1978)./, waarbij zij 400 actieve imunisatieproeven op muizen hebben uitgevoerd, onder gebruikmaking van 53 pertussisstamsuspensie-mengsels, in de periode van 1960 tot 1973. Vastgesteld werd aan de hand van de statistische analyse van deze onderzoe-25 kingen, dat bij opslag bij 5-10°C de activiteit van de suspensies na 8 jaar afnam tot beneden de waarde van 4 internationale eenheden (IE), hetgeen een eenmalige humane dosis voor immunisatie is. Vanaf 1968 tot 1974 werden er 207 actieve immunisatieproeven uitgevoerd, onder gebruikmaking van 21 Di-30 Te-Pe-vaccins op muizen. Vastgesteld kon worden aan de hand van de statistische analyse van de resultaten, dat bij bewaring bij 5-10°C de activiteit na 6 jaar van de pertussiscomponent steeds voldeed aan de internationale en nationale voorschriften /WHO Tchn. Rep. Ser. 638, 37 (1979); Hongaarse 8400511 ί* » - 2 -

Pharmacopoeia VI. (1967).7- De gemiddelde afname per jaar in de activiteit van de pertussisstamsuspensiemengsels bedroeg 1,01 IE, terwijl die van de pertussiscomponent van de Di-Te-Pe-vaccins 0,35 IE bedroeg. Een opslag bij 5-lO°C is derhalve 5 geschikt voor het behouden van de activiteit. Bij opslag bij 37°C blijkt de activiteit van de vaccins binnen 2 weken significant af te nemen, terwijl een dergelijke opslagtemperatuur onder tropische omstandigheden moeilijk kan worden gewaarborgd.

10 Een doel van de .uitvinding is het verschaffen van een werkwijze voor de bereiding van meervoudige vaccins, die onder diverse klimatologische condities kunnen worden bewaard gedurende een geschikte lange periode.

De uitvinding is gebaseerd op de erkenning dat 15 meervoudige vaccins van goede kwaliteit, die voldoen aan de boven gestelde eisen, verkregen kunnen worden door adsorptie van de op de juiste wijze geconcentreerde antigenen aan een drager, die op dezelfde wijze als de antigenen is geconcentreerd, in een oplossing bij een pH-waarde die de pH-waarde 20 van het isoelectrische punt van de antigenen benadert en door vriesdrogen van het verkregen vaccin bij een pH-waarde waarbij geen significante desorptie plaatsvindt. Voorafgaande aan de toepassing wordt het gevriesdroogde vaccin gereconstitueerd onder gebruikmaking van een buffer, die ervoor zorgt dat de 25 pH van het vaccin op een neutrale waarde wordt ingesteld.

Dienovereenkomstig heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de bereiding van gevriesdroogde, geadsorbeerde meervoudige vaccins.

Volgens de uitvinding worden de tetanus-, difte-30 rie-, pertussis- en eventueel tyfusantigenen geconcentreerd, aan een drager geadsorbeerd, welke drager op dezelfde wijze wordt geconcentreerd als de antigenen bij een pH van 3-6, terwijl de pH van de verenigde oplossingen wordt ingesteld op een waarde van 5-6, waarna het mengsel tenslotte wordt ge-35 vriesdroogd.

Bekend is dat de optimale adsorptie van de antigenen plaatsvindt bij een pH-waarde, die ligt' vlak bij hun isoelectrische punt, terwijl de antigenen geëlueerd kunnen

8 4 0 0 5 1 T

« Sr - 3 - worden bij een pH-waarde die veel hoger ligt dan hun iso-electrische punt. De adsorptiecondities van het tetanustoxoide als functie van de pH-waarde zijn in tabel A vermeld.

TABEL A

5 aluminiumfosfaat pH HOLT* ERICKSON* aluminiumhydroxide 3.0 100 100 niet te meten 3.5 100 95 niet te meten 4.0 90 - 100 80 - 85 niet te meten 10 4,5 85 - 90 60-70 niet te meten 5.0 80 - 85 60 - 70 100 5.5 80 - 85 60 - 70 100 6.0 80 - 85 50 - 60 100 7.0 20 10 100 15 7,5 geen adsorptie 85 8.0 geen adsorptie 70 8.5 geen adsorptie 70 dj*

Opmerking: methodes voor de bereiding van aluminiumfosfaat,

In verloop van de proeven volgens de uitvinding 20 werd de drager gebruikt In een hoeveelheid die overeenkwam 3+ .

met 1 mg Al -ionen per 1 ml, terwijl van het tetanustoxoide 10 BE (bindingseenheid) werden gebruikt. De gegevens uit de tabel tonen het percentage aan van de adsorptie voor het gebruikte tetanustoxoide.

25 Bekend is ook dat de normale pH-waarde van een meervoudige antigeenoplossing tijdens adsorptie niet lager moet zijn de de isoelectrische waarde van de afzonderlijke antigenen. Tegelijkertijd dient de normale pH-waarde niet hoger te zijn dan een pH-waarde waarbij meer dan 15 % van de 30 antigenen, geadsorbeerd bij de pH-waarde van het isoelectrische punt, worden geëlueerd.

De pH-waarde wordt gewoonlijk ingesteld door gebruik te maken van een oplossing van natriumhydroxide of zoutzuur.

35 Bij voorkeur kan aluminiumfosfaat of aluminium- hydroxidegel worden gebruikt als onoplosbare drager in een 84 ö ö 5 1 1 ♦ *.

- 4 - hoeveelheid, die in voorafgaande proeven wordt bepaald. In verloop van dit onderzoek werden verschillende hoeveelheden van de dragers toegevoegd aan de oplossingen met diverse antigeenconcentraties erin, terwijl het immuniserende vermogen 5 van de verkregen modelvaccins werd bepaald. Bij onderzoek, bijv. van het immuniserende vermogen van het tetanustoxoide bij Guinese biggetjes onder gebruikmaking van een aluminium-hydroxidedrager, werden de in tabel B vermelde gegevens verkregen.

10 TABEL B

aluminiumhydroxide gemiddelde van de titer van de tetanus- mg/dosis antitoxine na een eenmalige immunisatie 14e dag. . 28 ste dag 42 ste dag 0,625 0,4 0,8 1,2 15 1,25 0,8 1,9 2,6 2.5 0,8 5,0 6,0 5.0 1,5 8,0 8,0 10.0 0,5 4,0 3,0 20.0 0,2 0,5. 1,0 20 Op basis van de methematische evaluatie van de verkregen resultaten blekèn de optimale hoeveelheden aluminiumhydroxide resp. 3,1 mg, 3,06 mg en 3,44 mg te zijn.

Bij gebruikmaking van een modelvaccin met 5 BE tetanustoxoide en 5 Lf ("limes flocculans") difterietoxoide, 25 werden de volgende resultaten verkregen.

TABEL C

gemiddelde van de titer van de difterie aluminiumhydroxide na een eenmalige immunisatie mg/dosis......1.4de dag, . 2.8ste dag. 42ste dag 30 0,625 0,03 0,3 0,4 1,25 0,12 0,8 0,8 2.5 0,2 1,6 1,6 5.0 0,2 1,8 2,0 10.0 0,04 0,3 0,6 35 Op basis van de mathematische evaluatie van de 8400511 • * - 5 - verkregen resultaten bleek de optimale hoeveelheid aluminium-hydroxide resp. 2,72 mg, 2,78 mg en 3,0 mg te zijn.

Soortgelijke proeven werden uitgevoerd onder toepassing van aluminiumfosfaat als drager. Als resultaat van de 5 uitgevoerde experimenten kan gesteld worden, dat de voorkeurshoeveelheid van beide dragers ligt tussen 1,75 en 3,5 mg per dosis.

Volgens de uitvinding worden de geconcentreerde afzonderlijke antigenen geadsorbeerd uit afzonderlijke oplos-10 singen aan de drager, welke op dezelfde wijze wordt geconcentreerd als de antigenen bij de optimale pH-waarde van de afzonderlijke antigenen. Zo wordt het tetanustoxoide geadsorbeerd bij een pH van ca. 3, difterietoxoide bij een pH van ca. 4 en pertussis-en tyfusantigenen bij een pH van ca. 5,8-6.

15 Alternatief kan de adsorptie plaatsvinden in de verenigde oplossing van de antigenen.

Bekend is dat de fysische en chemische eigenschappen van aluminiumfosfaat en aluminiumhydroxidegels tijdens het vriesdrogen veranderen. De deeltjesgrootte neemt aan-20 zienlijk toe, terwijl het adsorptievermogen afneemt. De fysisch-chemische eigenschappen van de gels kan echter behouden blijven door gebruik van een geschikt beschermend materiaal.

Geschikte beschermende materialen zijn bijvoor-25 beeld proteïnen, polypeptiden, polysacchariden en andere synthetische beschermende colloïden. De meest belangrijke vereisten die gesteld dienen te worden aan de toepassing van beschermende materialen zijn de inertheid uit het oogpunt van. chemicaliën, immunologie en farmacologie en aan de andere kant 30 de afwezigheid van toxiciteit.

Het op de juiste wijze geconcentreerde en geadsorbeerde antigeen heeft bovendien een belangrijke beschermende werking als gevolg van zijn proteïne-aard. Tijdens de proeven werd waargenomen, dat de antigeenconcentratie geschikt is 35 wanneer 10 doses van het vaccin zijn opgelost in een totaal volume van 3 ml? ofschoon een ander beschermend materiaal eveneens vereist is. Deze twee effecten te samen geven een bevredigende bescherming tijdens het vriesdrogen. Tijdens de 84005 1 1 T u -δ - uitgevoerde proeven bleek dat voor de onderhavige doeleinden dextraan met een molecuulgewicht van 40.000 of een combinatie van dextraan met polysacchariden het meest geschikt waren.

De fysisch-chemische eigenschappen van de drager 5 kunnen worden gekarakteriseerd door de sedimentatiesnelheid na reconstitutie, welke plaatsvindt na het vriesdrogen. De resultaten van de uitgevoerde proeven met betrekking tot het gecombineerde effect, dat wordt uitgeoefend door het antigeen-proteïne en dextraan op de fysisch-chemische eigenschappen van 10 de aluminiumfosfaatdrager tijdens het vriesdrogen zijn in tabel D vermeld.

TABEL D

, , . sedimentatie (mm) hoeveelheid _______ 15 proteïne dextraan 15 min 30 min 5 min 30 min mg/ml............%..... v.66.r. vriesdrogen na vriesdrogen 0 0 3 14 zandachtig 0,2 0 3 14 zandachtig 0,8 0 3 15 zandachtig 20 3,2 0 4 13 zandachtig 13,0' 0 4 10 verscheidene fasen 50.0 0 1 8 50 100 0 1 4 15 zandachtig 0,2 1 3 14 sedimentatie in Λ . , , c verscheidene fa- 25 °'4 1 3 15 sen bij een zand- 0,8 1 3 14 achtige aggregatie 1.6 1 3 15 100 homogeen 3.2 1 3 14 100 homogeen 6,4 1 3 14 100 homogeen 30 13,0 1 25 45 100 26.0 1 2 6 25 45 50.0 '1 1 4 10 23 0 2 4 14 28 72 0,2 2 3 14 30 65 35 0,4 2 3 14 30 66 0,8 2 3 13 20 60 1.6 2 3 14 20 55 3.2 2 3 15 20 40 8400511 Ό >* - 7 - ÏSBEL D (vervolg) hoeveelheid sedimentatie (mm) proteïne dextraan 15 min 30 min 5 min 30 min mg/ml % voor vriesdrogen na vriesdrogen 5 6,5 2 4 16 10 20 0 4 3 14 15 50 0,2 4 3 15 15 45 0,4 4 3 14 10 45 0,8 4 3 14 10 40 10 1,6 4 3 14 8 30 3,2 4 3 14 6 16 6,4 . . .4 3 1.3 6 14

Dienovereenkomstig werd er 0,5 en 10 gew.% beschermend materiaal en 0,01 gew.% thiomersal als conserveer-15 middel toegevoegd aan de oplossing van de antigenen. Het aldus verkregen mengsel werd verdeeld over ampullen en vervolgens gevriesdroogd op een manier dat de temperatuur van het materiaal de -30°C en bij voorkeur de -35°C in het begin niet overschreed. In de tweede fase van het vriesdrogen werd de 20 temperatuur van het materiaal gehouden op 30-35°C, teneinde ervoor te zorgen dat het vochtgehalte beneden 3 % bleef.

Het gevriesdroogde vaccin kan na verdunning tot de vereiste concentratie met behulp van een fysiologische zoutoplossing, die gebufferd is tot een pH-waarde van 6,8-7, met 25 behulp van een fosfaatoplossing, worden toegediend.

Het voordeel van de onderhavige werkwijze ligt daarin, dat de geadsorbeerde en gevriesdroogde meervoudige vaccins, bereid volgens de onderhavige uitvinding, in staat zijn hun activiteit gedurende een aanzienlijk langere periode 30 te behouden dan de thans commercieel beschikbare vaccins. Het volgens de onderhavige werkwijze bereide Di-Te-Pe-vaccin kan op basis van de uitgevoerde proeven bewaard worden gedurende tenminste 4 weken bij 56°C en gedurende tenminste 1 jaar bij 37°C zonder enige afname van hun activiteit.

35 De uitvinding zal aan de hand van de volgende voorbeelden nader worden toegelicht, zonder de uitvinding 84 0 05 1 1 »► - 8 - echter daartoe te beperken.

VOORBEELD I

Bordatella pertussis-suspensies, gekweekt in een fermentatie-inrichting, werden geconcentreerd door zure preci-5 pitatie onder gebruikmaking van 1 N zoutzuur bij een pH-waarde van ca. 4, waarna de verkregen suspensies gedurende 48 uur bij 4°C werden bewaard. Na decanteren van het supernatant werd het sediment opnieuw gesuspendeerd in een isotonische zoutoplossing/ die gebufferd werd tot een pH van 7,2, zodanig dat 10. de ondoorschijnendheid van de suspensie werd ingesteld op 300 IOE/ml (internationale ondoorschijnendheidseenheid). De suspensies werden geïnactiveerd met 0,02 gew.% thiomersal en door een hittebehandeling van 56°C gedurende 30 min, waarna de suspensies bij 4°C werden bewaard.

15 VOORBEELD II

Er werden vaccins bereid uitgaande van de volgende ingrediënten (de hoeveelheden hebben betrekking op 10 dosés in een totaal volume van 3 ml).

1 2 3 4 5 6 7 20 difterietoxoide(Lf)* 250 250 250 250 300 300 300 pertussiscelsuspen- sie (IOÜ)* 150 150 150 150 150 150 150 tetanustoxoide (BE)* 50 50 100 100 100 100 100 9

Salmonellatyfi (cellen)- 5x10 - 25 aluminiumfosfaatgel (mg) 30 30 30 30 30 30 30 thiomersal (gew.%) 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 saccharose (gew.%) 9 9 9 - 9- 4,5 lactose (gew.%) ---9--- 30 dextraan (gew.%) - - - - - 5 2,5 φ

Opmerking: Lf: "Limes flocculans" IOU: Internationale eenheid van ondoorschijnendheid Bü: bindingseenheid.

De afzonderlijke antigenen zijn afzonderlijk ge-35 adsorbeerd aan aluminiumfosfaat, waarna het beschermende materiaal en thiomersal aan de gecombineerde oplossing werden toegevoegd, gevolgd door instelling van de pH-waarde van de oplossing op 5-5,8, waarna telkens 3 ml van de oplossing werd 8400511 ·,► - 9- overgebracht, in ampullen, waarin de oplossing tenslotte werd gevriesdroogd. De temperatuur van het materiaal werd in de eerste 10 uur van het vriesdrogen beneden -35°C gehouden, terwijl tijdens de daarop volgende 8 uur de temperatuur -35 5 tot +20°C bedroeg en tenslotte gedurende de laatste 10 uur werd gewerkt bij een temperatuur van -20 tot -35°C.

VOORBEELD III

Studie van de warmtetolerantie van de vaccins.

activiteit van de pertus- 10 vaccin beschermend materiaal siscomponent na opslag (weken)

bij 56°C bij 37°C

5 9 % saccharose 1 26 6 5 % dextraan 4 53 15 4,5 % saccharose + ^ 2,5 % dextraan ^ ^

Daarentegen blijkt de activiteit van de pertus-siscomponent van het gewoonlijk geadsorbeerde Di-Te-Pe-vaccin significant af te nemen tijdens opslag bij 37°C gedurende 2 20 weken.

25 84 0 0 5 1 1

Claims (3)

1. Werkwijze voor de bereiding van gevriesdroogde, geadsorbeerde meervoudige vaccins, met het kenmerk, dat tetanus-, difterie-, pertussis- en even- 5 tueel tyfusantigenen worden geconcentreerd tot 5-15 doses/3 ml, gevolgd door adsorptie bij een pH-waarde van 3-6 aan een onoplosbare drager, die op dezelfde wijze is geconcentreerd als de antigenen, waarna de pH-waarde wordt ingesteld op een waarde van 5-6, gevolgd door vriesdrogen van het mengsel samen met IQ een beschermend materiaal, dat gewoonlijk bij vriesdrogen wordt gebruikt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk , dat als onoplosbare drager 1,75-3,5 mg/dosis aluminiumfosfaat of aluminiumhydroxidegel wordt gebruikt. 15

3. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk , dat 20-35 Lf/dosis difterietoxoide, 10-2Q IOE/dosis Bordatella pertussiscelsuspensie, 5-15 BE/dosis tetanustoxoide en eventueel een Salmonella tyficelsuspensie 8 9 met 10 -10 cellen/dosis worden gebruikt. 20 25 8400511