FI94355B - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten syklosporiinijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

94355

MENETELMÄ FARMASEUTTISESTI KÄYTTÖKELPOISTEN SYKLOSPO-RIINIJOHDANNAISTEN VALMISTAMISEKSI

Keksintö koskee menetelmää uusien, farmaseut-5 tisesti käyttökelpoisten syklosporiinien valmistamiseksi .

Syklosporiinit kuuluvat rakenteellisesti selvästi erottuvien, syklisten, poly-N-metyloitujen un-dekapeptidien luokkaan, ja niillä on tavallisesti far-10 makologista, erityisesti immunosuppressiivistä, anti ini lammatorista ja/tai antiparasiittista aktiivisuutta. Ensimmäinen eristetty syklosporiini oli luonnossa tavattava sienimetaboliitti Siklosporiini tai Syklosporiini, joka tunnetaan myös syklosporiini A:na, ja se on 15 kaupallisesti saatavilla rekisteröidyllä tavaramerk- kinimellä SANDIMMUN* tai SANDIMMUNE*. Siklosporiini on kaavan A mukainen syklosporiini, —MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal— 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (A) 25 jossa MeBmt tarkoittaa N-metyyli-(4R)-4-but-2E-en-l- yyli-4-metyyli-(L)treonyylitähdettä, jolla on kaava B, ch3 x 30 l

X

ch2

HO v (R) CH

\ / \ CH (R) CH3 <B)

Jo I

-N-CH-CO- I (S) ..... ch3 2 Q Λ τ jz c

y ^ O \J

jossa -x-y- on -CH=CH- (trans).

Ensimmäisenä löytyneen Siklosporiinin jälkeen suuri joukko muita luonnossa tavattavia syklosporiineja on eristetty ja identifioitu sekä lukuisia muita ei-5 luonnosta peräisin olevia syklosporiineja on valmistettu kokonais- tai puolisynteettisillä menetelmillä tai soveltamalla modifioituja viljelymenetelmiä. Syklospo-riineista muodostuva luokka on siten nykyisin merkittävä ja se sisältää esimerkiksi luonnossa tavattavat syk-10 losporiinit A-Z [ks. Traber et ai; 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber et ai; 2, Helv. Chim.

Acta, 65, 1655-1667 (1982); Kobel et ai, Europ. J.

Applied Microbiology and Biotechnology, 1A, 273-240 (1982); ja von Wartburg et ai, Progress in allergy, 38, 15 28-45, (1986)], sekä erilaisia ei-luonnosta peräisin olevia syklosporiinijohdannaisia ja keinotekoisia tai synteettisiä syklosporiineja mukaanlukien dihydro-syk-losporiinit [joissa MeBmt tähteen (edellä kaava B) -x-y- yksikkö on tyydytetty ollen -x-y- = -CH2~CH2-]; joh-20 dettuja syklosporiineja (esim. joissa 3'-O-atomi MeBmt tähteessä on asyloitu tai sarkosyylitähteen 3-aseman orhilleen on viety muu substituentti); syklosporiineja, joissa MeBmt tähde on isomeerisessä muodossa (esim. jossa MeBmt tähteen paikkojen 6'ja 7’välinen konfigu-25 raatio on cis trans-muodon sijasta); ja syklosporiine-ja, joissa aminohappomuunnoksia on saatettu peptidisek-venssin spesifisiin paikkoihin, esim. käyttämällä Wen-gerin kehittämää kokonaissynteesimenetelmää syklospo-riinien valmistamiseksi - ks. Traber et ai . 1, Traber 30 et ai, 2 ja Kobel et ai., loc. cit.; US patenttijulkaisut 4 108 985, 4 220 641, 4 288 431, 4 554 351, 4 : 396 542 ja 4 798 823; EP patenttijulkaisut 34 567A, 56 782A, 300 784A ja 300 785A; Kansainvälinen patenttijulkaisu W0 86/02080 ja UK patenttijulkaisut 2 206 119 ja 35 2 207 678; Wenger 1, Transpl. Proc., 1J> Suppl. 1:2230 ( 1983); Wenger 2., Angew. Chem. Int. Ed. 24^ 77 (1985) ja Wenger 3., Progress in the Chemistry of Organic I: 3 94355

Natural Products, 50, 123 (1986).

Syklosporiinien muodostama luokka on siten nykyisin hyvin laaja ja se sisältää esim. [Thr]2-, [Vai]2-, [Nva]2- ja [Nva]2-[Nva]5-Siklosporiinit (jotka 5 tunnetaan myös syklosporiineina C, D, G ja M, vastaavasti), [3-0-asetyyli-MeBmt]1-Siklosporiinin (tunnetaan myös syklosporiini A asetaattina), [dihydro-MeBmt]1-[Val]2-Siklosporiinin (tunnetaan myös dihydro-syklospo-riini D:nä), [ (D)Ser]8-Siklosporiinin, [Melle]n-Sik-10 losporiinin, [(D)MeVal]11-Siklosporiinin (tunnetaan myös syklosporiini H:na), [MeAla]6-Siklosporiini, [(D)Pro]3-Siklosporiinin jne. [Ks. esim. julkaisut SE 461 334 ja FI 851 120.]

Syklosporiinien konventionaalisen nimeämista-15 van mukaisesti syklosporiinit on määritelty esillä olevassa selitysosassa ja vaatimuksissa viittaamalla Siklosporiinin (so. Syklosporiini A) rakenteeseen. Tämä tapahtuu nimeämänä ensin ne tähteet molekyylissä, jotka eroavat Siklosporiinissa olevista tähteistä, ja 20 sitten lisäämällä sana "Siklosporiini" jäljelle jäävien, Siklosporiinille identtisten tähteiden karakte-risoimiseksi. "Dihydro"-etuliitettä käytetään tällöin sellaisten syklosporiinien tunnistamiseksi, joissa MeBmt tähde on hydrattu (dihydro-MeBmt), so., jossa -x-25 y- kaavassa B on -CHj-CH2-. Siten [Thr]2-Siklosporiini on syklosporiini, jolla on kaavan A mukainen sekvenssi muuten, mutta ctAbu 2-asemassa on korvattu Thr:11a, ja [Dihydro-MeBmtJ1-[Vai]2-Siklosporiini on syklosporiini, jolla on kaavan 30 A mukainen sekvenssi muuten, mutta MeBmt tähde asemassa 1 on hydrattu ja aAbu 2-asemassa on korvattu Vai :11a.

; Lisäksi, lyhennyksin viitatuilla aminohappo tähteillä, esim. Ala, MeVal, aAbu jne., on, konventionaalisen tavan mukaisesti, (L)-konfiguraatio, ellei 35 toisin mainita, kuten "(D)Ala" tapauksessa. Tähdelyhen-teet, joita edeltää "Me", kuten "MeLeu" tapauksessa, tarkoittavat a-N-metyloituja tähteitä. Syklosporiinimo- • · 4 94355 lekyylin yksittäiset tähteet on numeroitu alalla tunnetun tavan mukaisesti myötäpäivään ja alkaen MeBmt- tai dihydro-MeBmt tähteestä asemassa 1. Samaa numeerista sekvenssiä käytetään kaikkialla esillä olevassa seli-5 tysosassa ja vaatimuksissa.

Keksinnön mukaisesti, nyt on havaittu, että syklosporiineilla, joissa tähde 8-asemassa on hydrok-sisubstituoitu (D)seriinitähde, on erityisen mielenkiintoisia farmaseuttisia ominaisuuksia, so. niillä on 10 havaittu yllättäen erittäin korkea farmaseuttinen ak-tiivisuustaso, joka on osoitettu farmakologisilla kokeilla (ks. Esimerkkiosa).

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavilla syklosporiineilla on kaava II, 15 —X-Y-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-Q-MeLeu-MeLeu-MeVal— 123 4 5 6 789 10 11 (II) 20 jossa X on MeBmt tai dihydro-MeBmt, Y on aAbu, Vai, Thr tai Nva, ja Q on tähde, jolla on kaava I,

(0) CH2-0-CH2-CH2-0R

25 * (I) -NH-CH-CO- • · (D) jossa R on vety tai fysiologisesti hydrolysoituva ja 30 hyväksyttävä asyyli.

R on edullisesti vety. Kun R on asyyli, niin i* se on fysiologisesti hydrolysoituva ja hyväksyttävä asyylitähde, mikä tarkoittaa tähdettä, joka on lohkeava fysiologisissa olosuhteissa tuottaen happoa (RÖH), joka 35 puolestaan on itsessään fysiologisesti siedettävä annettavina annoksina. Sopiviin R asyyliryhmiin kuuluu (C: 4alkyyli)karbonyyli, kuten asetyyli, ja monosyklinen • · m 5 94355 aryylikarbonyyli, kuten bentsoyyli ja salisyyli.

Erityisen edullinen keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava yhdiste on [0-(2-hydroksietyy-li) (D)Ser]8-Siklosporiini/ so. kaavan II mukainen syk-5 losporiini, jossa X on MeBmt, Y on aAbu, ja Q on kaavan I mukainen tähde, jossa R on vety.

Keksintö koskee siten menetelmää edellä määriteltyjen kaavan II mukaisten syklosporiinien, valmistamiseksi, jolloin: 10 i) sellaisen kaavan II mukaisen syklosporiinin valmistamiseksi, jonka 8-asemassa olevalla tähteellä on edellä kuvattu kaava I, jossa R on vety, pelkistetään vastaava syklosporiini, jonka 8-asemassa olevalla tähteellä on kaava III, 15 CH2-0-CH2-C0-0-R' (III) -NH-CH-CO- (0) 20 jossa R'on C13 alkyyli, so. pelkistetään syklosporiini, jolla on kaava IV, 2 5 p-X-Y-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-Q'-MeLeu-MeLeu-MeVal— 1 2 3 A 5 6 7 8 9 10 11 (IV) 30 jossa X ja Y tarkoittavat samaa kuin kaavan II yhteydessä ja QOn edellä kuvattu kaavan III mukainen * * · tähde; tai < · · ii) sellaisen kaavan II mukaisen syklosporiinin valmistamiseksi, jonka 8-asemassa olevalla tähteel-35 lä on edellä kuvattu kaava I, jossa R on asyyli, este-röidään vastaava syklosporiini, jossa R on vety.

Menetelmävaihtoehdon i) mukainen pelkistys • ·.

6

O A 7 C C

y · D u voidaan toteuttaa käyttämällä konventionaalisia menetelmiä esteriryhmän pelkistämiseksi hydroksimetyyliryh-miksi, esim. käsittelemällä litiumborohydridillä iner-tissä atmosfäärissä, sopivassa liuottimessa tai laimen-5 nosaineessa, vallitsevassa tai kohtalaisesti kohotetussa lämpötilassa. Litiumborohydridi voidaan sopivasti korvata natriumborohydridillä litiumhalidin läsnäollessa .

Menetelmävaihtoehdon ii) mukainen esteröinti 10 voidaan toteuttaa konventionaalisten menetelmien mukaisesti, esim. reaktiolla happohalidien tai -anhydridien, kuten (C4alkyyli)karbonyylihalidien, kanssa, happoa sitovan aineen läsnä ollessa.

Menetelmävaihtoehdon i) lähtöaineet voidaan 15 valmistaa seuraavan reaktiokaavion mukaisesti (mukavuussyistä on esitetty ainoastaan 8-aseman muunnettu tähde): 002"0H CH2-0-CH2-C0-0-R' I Hal-CH2-C0-0R' | 20 -NH-CH-CO- -S. -JIH-Ca-CO- (» (D) <v> (VI) (III) 25 > jossa R'on sama kuin edellä, ja se on edullisesti C - alkyyli, erityisesti isopropyyli; ja Hai on bromi tai jodi. Reaktio suoritetaan edullisesti esimerkin 1 yleisten menetelmien mukaisesti tai analogisesti niiden 30 kanssa.

Syklosporiinit, joiden 8-asemassa olevalla Γ tähteellä on kaava V (so. (D)Ser), esim. [ (D)Ser]8-Sik- # losporiini, ovat tunnettuja ja ne on kuvattu valmistus-menetelmineen esim. EP patenttijulkaisussa 56 782 A ja 35 englantilaisessa patenttijulkaisussa 2155936 A.

Keksinnön mukaisesti valmistetut syklosporiinit voivat olla kiinteässä tilassa amorfisessa muodossa - · · 7 94355 tai yhdessä tai useammassa kiteisessä muodossa. Myöhemmin esitettävän esimerkin 2 mukainen yhdiste on esimerkiksi amorfisessa muodossa tai ainakin kolmessa kiteisessä muodossa, jotka ovat erotettavissa röntgensäde-5 diffraktion avulla ja joita merkitään: A, B ja C modifikaatiot. Näistä B muoto, joka on hydraatti ollen saatavissa uudelleenkiteytyksellä asetoni/vedestä, on kaikkein stabiilein ja tämän vuoksi edullisin muoto.

Syklosporiinit, joiden 8-asemassa olevalla 10 tähteellä on edellä kuvattu kaava III, ovat uusia ja ne ovat siten myös osa keksintöä.

Seuraavat esimerkit, joissa kaikki lämpötilat on annettu °C, havainnollistavat keksintöä.

15 ESIMERKKI 1: Γ 0~(isopropyylioksikarbonyylimetyyli)- (D) Ser 18-Siklosporiini [ (D)Ser]8-Siklosporiinia (21.89 g 88,7 % puhdasta materiaalia fermentointiliuoksen kromatografises-20 ta fraktiosta, = 19.42 g, 15.93 mMol 100 % materiaalia) liuotetaan tolueeniin (160 ml) ja joukkoon lisätään tetra-N-butyyliammoniumbromidia (1.03 g, 3.2 mMol). Liuokseen lisätään bromietikkahapon isopropyyliesteriä (14.41 g, 79.7 mMol) 5 min kuluessa 20-25°, ja seosta 25 sekoitetaan 30 min ajan 20-25° samalla lisäten tipoit- tain 30 % natriumhydroksidin vesiliuosta (53.1 g, = 15.93 g puhdasta NaOH, 398 mMol). Vielä 30 min lisäse-koituksen 20-25° jälkeen vesifaasi erotetaan ja sitä uutetaan tolueenilla (63 ml). Tolueenifaasit yhdiste-30 tään ja pestään kyllästetyllä ammoniumkloridin vesili-. uoksella (80 ml), sitten vedellä (48 ml) , jonka jäl- .· . keen tolueenifaasit kuivataan alumiinioksidilla, suoda tetaan ja haihdutetaan saaden kiinteää keltaista vaahtoa (22-32 g).

35 Jäännös liuotetaan tolueeniin (31 ml) ja li uosta lämmitetään 65-68°. Lämpimään liuokseen lisätään tipoittain 90 min aikana 125 ml n-heksaania ja seos 8 94355 jäähdytetään 20-25° 4 h aikana, sekoitetaan 10 h huoneenlämpötilassa ja lopuksi jäähdytetään 3 h aikana 0-3°:seen sekä sekoitetaan tässä lämpötilassa 2 h ajan. Saadut kiteet suodatetaan, pestään jääkylmällä toluee-5 ni/heksaanilla 1:4 (42 ml) ja kuivataan 60° vakuumissa jolloin saadaan otsikon mukaista yhdistettä (19.2 g) beigen värisinä kiteinä, puhtauden ollessa 87.9 % (korkeapaineisella nestekromatografiällä, HPLC). Yhdistettä voidaan käyttää seuraavassa vaiheessa ilman lisäpuhdis-10 tusta.

Vaihtoehtoisesti, lisäuudelleenkiteytys tuottaa puhdasta otsikon mukaista yhdistettä valkoisina kiteinä, sp. 168-170°; [a]z°D= -162.4° (metanoli, c= 0.37).

15 ESIMERKKI 2: f O- (2-hydroksi etyyli ) (D)Ser )a-Siklosporiini Vaihe a): Raakatuote

Esimerkin 1 raakatuote (14.1 g, 87.9 % puh-taus= 12.39 g, 9.4 mMol, puhdasta materiaalia) liuote-20 taan absoluuttiseen etanoliin (315 ml) ja lämmitetään 30-35° typpiatmosfäärissä. Liuokseen lisätään 7 osassa litiumborohydridiä (kaikkiaan 1.29 g, 95 % puhtaus = 1.225 g, 56.3 mMol, 6 ekvivalenttia, puhdasta materiaalia) 6 h aikana. Jokainen lisäys aiheuttaa hieman ekso-25 termisen reaktion sekä kaasun muodostuksen. Saatua bei-* gen väristä suspensiota sekoitetaan 14 h ajan 30 - 35°:ssa, jäähdytetään 20-25°:een ja käsitellään 23 ml :11a 20 % risen etikkahapon vesiliuosta. Kirkasta vaaleankeltaista liuosta (pH 5-6) sekoitetaan 30 min 30 ajan, jonka jälkeen suoritetaan haihdutus jolloin ssa-daan n. 30 ml öljyistä jäännöstä.

Jäännös uutetaan isopropyyliasetaattiin (IPA) (130 ml) ja veteen (80 ml) ja vesifaasia uutetaan vielä IPArlla (40 ml). Yhdistettyjä IPA kerroksia pestään 25 35 ml :11a kyllästettyä natriumbikarbonaatti vesi liuoksesta, sitten 30 ml:11a vettä ja liuos haihdutetaan jolloi saadaan otsikon mukaista raakatuotetta beigenä vaahtona

II

9 94355 (13.44 g, puhtaus 81.8 % HPLC määritettynä).

Vaihe b): puhdistus 5 Vaiheen a) raakatuote (36.2 g) liuotetaan metyyli-isobutyyliketoniin (MIBK), joka on kyllästetty vedellä, ja suoritetaan kromatografointi Kieselgeliä 0.04- 0.063 mm (885 g) käyttäen, pylvään dimensioiden ollessa 460 x 70 mm halkaisija ja vesikyllästeisen MIBK:n toimies-10 sa eluenttina. 2 1 alkuajon jälkeen fraktiot, jotka sisältävät > 95 % puhtauden omaavaa materiaalia HPLC avulla määritettynä, kerätään saaden n. 11.5 1 liuosta, joka haihdutetaan kuiviin vakuumissa jolloin saadaan 24.3 g otsikon mukaista tuotetta amorfisena, beigen värisenä 15 vaahtona; HPLC avulla määritetty puhtaus = 95.2 %.

Kiinteä tuote liuotetaan asetoniin (40 ml) ja vaaleankeltainen liuos suodatetaan sintteröidyn lasisup-pilon läpi, jota huuhdellaan asetonilla suodatuksen jälkeen (21 ml). Yhdistettyyn asetoni liuokseen tiputetaan 20 vettä (61 ml) 90 min kuluessa, jona aikana ilmestyy kiteitä. Hienojakoista suspensiota sekoitetaan 16 h ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen liuos jäähdytetään 0-3° läpötilaan 1 h aikana, sekoitetaan vielä 4 h , sitten suodatetaan, pestään jääkylmällä asetoni/vedellä 1:1 ja 25 märät kiteet kuivataan 14 h ajan 60° osittaisessa vakuu- ’ missä jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (20.76 g) valkoisina B modifikaatiokiteinä, HPLC:llä määritetty puhtaus on 98 %, sp. n. 130° (haj.).

Uudelleenkiteytys asetoni /vedestä tuottaa vielä 30 puhtaampaa materiaalia.

Edellä kuvatun mukaisesti saadusta amorfisesta , materiaalista saadaan A modifikaatio uudelleenkiteyt- tämällä polyetyleeniglykoli/vedestä; ja kiteinen C modifikaatio saadaan uudelleenkiteyttämällä etanoli/-35 vedestä tai amorfisen muodon suspension ultraäänikäsit- telyllä etanoli/vedestä. Sulamispisteet: A modifikaatio: n. 148°C; C modifikaatio: n. 120°C.

10 94355 ESIMERKKI 3: fO-(2-asetyylioksietyyli)(D) Ser ] 8-Siklospo-riini

Esimerkin 2 vaiheen a) tuote (600 mg, 0.47 mMol) 5 liuotetaan pyridiiniin (30 ml) ja sekoitetaan etikka-anhydridillä (30 ml). Seos pidetään huoneenlämpötilassa 2.5 h ajan, jonka jälkeen pyridiini ja ylimääräinen etikka-anhydridi haihdutetaan alipaineessa ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä eetteri/etyyliasetaatin 10 4:1 toimiessa eluenttina saaden otsikon mukaista yhdistet tä (430 mg). [a]2°D= -175.8 (c= 0.25, metanolissa) .

Edellä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut, 8-asemassa olevan kaavan I mukaisen tähteen omaavat syklosporiinit, joilla on edellä kuvattu kaava 15 II (käytetään myöhemmin nimitystä "Syklosporiinituot-teet"), ovat hyödynnettävissä farmaseuttisesti, kuten voidaan osoittaa esim. seuraavien koemenetelmien avulla: 1. Rotan paikallistettu siirrännäinen-versus-isäntä- 20 (Graft-versus-Host, GvH) reaktio [Ford et ai.. TRANSPL. PROC. 10 (1970) 258].

6 viikkoa vanhoista naaraspuolisista Wistar/Furth (WF) rotista saatuja pernasoluja injektoidaan subkutaani-25 sesti päivänä 0 (F344 x WF)F -naarasrottien, jotka paina-*- vat n. 100 g, vasempaan takakäpälään. Eläimille annetaan hoitokäsittely 4 seuraavana päivänä, ja päivänä 7 polvitaipeen imusolmukkeet poistetaan ja punnitaan. Kahden imusolmukkeen välinen painoero otetaan parametriksi 30 reaktion arviointia varten.

Syklosporiinituotteet inhiboivat GvH reaktiota edellä kuvatussa koemenetelmässä annettaessa 4 x n. 10-30 mg/kg p.o., tai 4 x n. 1.5-5 mg/kg s.c., annoksina.

35 2. Rotan munuaisensiirtoreaktio 11 94355

Fisher 344-naarasrotan yksi munuainen siirretään WF-vastaanottajarotan, jolle on suoritettu toispuoleinen (vasen puoli) munuaisenpoisto, munuaistiehyeeseen käyttäen päästä-päähän anastomosiaa (yhdyshaara). Ureteerinen 5 anastomosia on myös päästä-päähän. Hoitokäsittely aloitetaan siirtopäivänä ja sitä jatketaan 14 päivän ajan. Vastapuolinen munuaisenpoisto suoritetaan seitsemän päivän kuluttua siirrosta, jolloin vastaanottaja jää luovuttajan munuaisen toiminnasta riippuvaiseksi. Siirrännäisen 10 selviytyminen otetaan parametriksi toiminnalliselle siirrännäiselle.

Syklosporiinituotteet ovat tehokkaita ylläpitämään siirrännäisen selviytymistä edellä esitetyssä koemenetelmässä annettaessa n. 2-5 mg/kg/päivä p.o.

15 suuruisia annoksia.

3. Rotan kokeellisesti indusoitu allerginen aivo-selkä-ydintulehdus (Experimentally Induced Allergic Encephalomyelitis, EAE) [Levine et al., AM. J. PATH. 47 (1965) 61; 20 McFarlin et al., J. IMMUNOL. 113 (1974) 712; Borel, TRANSPLANT & CLIN. IMMUNOL. 13 (1981) 3].

Urospuolisiin Wistar-rottiin injektoidaan takakäpäliin naudan selkäytimen ja täydellisen Freundin 25 adjuvantin seosta. Taudin oireet (hännän ja molempien * takakäpälien halvaantuminen) kehittyvät yleensä 16 päivän kuluessa. Sairastuneiden eläimien lukumäärä sekä taudin puhkeamisajankohta merkitään muistiin.

Syklosporiinituotteet inhiboivat taudin puh-30 keamista edellä kuvatussa koemallissa n. 12.5-25 mg/kg/päivä p.o. suuruisina annoksina.

4. Freundin adjuvantti-artriitti (niveltulehdus) [Winter & Nuss, ARTHRITIS AND RHEUMATISM 9 (1966) 394; 35 Billingharn & Davies, HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOL (Vane & Ferreira toim., Springer-Verlag, Berliini) 50/11, (1979) 108-144] 12 94355 OFA- ja Wistar-rottiin (uros tai naaras, 150 g painoisia) injektoidaan i.c. hännän tyveen tai takakäpä-lään 0.1 ml mineraaliöljyä, joka sisältää 0.6 mg lyofi-lisoitua kuumatapettua Mycobacterium smegmatis'ta.

5 Kehittyvässä artriittimallissa hoitokäsittely aloitetaan välittömästi adjuvantti-injektion jälkeen (päivinä 1-18); puhjenneessa artriittimallissa hoitokäsittely aloitetaan päivänä 14 sekundäärisen inflammaation ollessa selvästi puhjenneena (päivät 14-20). Kokeen lopussa nivelten 10 turpoaminen mitataan mikrokaliiberilaitteella.

Syklosporiinituotteet ovat tehokkaita estämään tai inhiboimaan taudin etenemistä kummassakin, kehittyvässä ja puhjenneessa, koemallissa annettaessa n. 3-20 mg/kg/päivä p.o. suuruisina annoksina.

15 Syklosporiinituotteilla on myös edullisemmat toksisuus-, esim. maksatoksisuus- ja/tai munuaistoksisuus-, profiilit verrattuna tunnettuihin syklosporiineihin, esim. Siklosporiiniin, mikä voidaan osoittaa määrittämällä niiden vaikutus relevantteihin parametreihin, esim. veren 20 kreatiiniin; kerästen suodatusnopeuteen; urea-, bilirubii-ni- ja sappihappotasoihin, rotille kohdistetun pitkäaikaisen, immunosuppressiivisesti vaikuttavien annosmäärien annon jälkeen. Syklosporiinituotteille on siten tunnusomaista parantunut terapeuttinen suhde verrattuna 25 tunnettuihin syklosporiineihin.

Syklosporiinituotteet ovat siten hyödyllisiä farmaseuttisina aineina, esim. immunosuppressiivisina aineina, kuin myös anti-inflammatorisina aineina.

Syklosporiinituotteet ovat erityisen hyödyllisiä 30 estämään elin- tai kudossiirrännäisen hylkimistä, esim. sydän-, keuhko-, yhdistetty sydän-keuhko-, maksa-, munuais-, haima-, iho- tai sarveiskalvosiirrännäisen vastaanottajien hoidossa. Niitä voidaan myös käyttää siirrännäinen-versus-isäntä-taudin, joka voi esiintyä 35 luuydinsiirron jälkeen, estossa.

Syklosporiinituotteet ovat myös hyödyllisiä hoidettaessa autoimmuunitauteja ja inflammatorisia 13 94355 tiloja, jotka ovat erityisesti sellaisia, joiden etiologiaan kuuluu autoimmuunikomponentti, kuten artriitti (esim. nivelreuma, arthritis chronica progrediente ja nivelrikko) ja reumaattiset taudit. Spesifisiin autoim-5 muunitauteihin, joissa voidaan käyttää syklosporiini-tuotteita, kuuluu autoimmuuniset hematologiset häiriötilat (kuten hemolyyttinen anemia, aplastinen anemia, puhdas punasoluanemia ja idiopaattinen trombosytope-nia), systeeminen lupus erytematosus, monirustotuleh-10 dus, sklerodooma, Wegnerin granulamatoosi, dermatomy-osiitti, krooninen aktiivinen hepatiitti, myastenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrooma, idiopaattinen spruutauti, autoimmuuninen inflammatorinen suoli-tauti (kuten haavainen paksunsuolentulehdus ja Crohn'n 15 tauti), endokriininen oftalmopatia, Gravesin tauti, sarkoidoosi, multippeli skleroosi, primäärinen biliaa-rinen kirroosi, nuoruusiän diabetes (diabetes mellitus tyyppi i)/ silmän keskikalvon tulehdus (etu- ja taka-puoleinen), keratokonjunktiviitti sicca ja vernaali 20 keratokonjunktiviitti, välikeuhkofibroosi, psoriaat-tinen artriitti ja keräsnefriitti (nefroottisella syndroomalla tai ilman nefroottista syndroomaa, esim. sisältäen idiopaattisen nefroottisen syndrooman tai minimaalimuutoksellisen munuaissairauden).

25 Syklosporiinituotteet soveltuvat edelleen käy- * tettäväksi muiden tautien tai tilojen hoitoon, joihin käytetään tai ehdotetaan käytettäväksi syklosporiinia, esim. Siklosporiinia, kuten hiustenlähtöön/hiustenkas-vun edistämiseen, ja astman hoitoon esim. annettavaksi 30 inhalaationa. Niitä ehdotetaan myös käytettäväksi anti-parasiittisina aineina, esim. alkueläin-, sieni- tai matoinfektioiden tai tunkeutumisien, esim. rihmamato-taudin, skistosomiaasi-, kokkidiomykoosi- tai plasmodi-aali-infektion, kuten malarian, hoitoon. Edelleen niitä 35 on ehdotettu käytettäväksi kumoamaan pahanlaatuisen tilan kehittämää resistenssiä muulle kemoterapialle, kuin myös haavan parantumisen edistämiseen.

14 94355

Edellä esitettyjä käyttötarkoituksia varten sopiva annos luonnollisesti vaihtelee riippuen esim. käytetystä syklosporiinituotteesta, käsiteltävästä kohteesta, antotavasta ja käsiteltävän tilan luonteesta 5 ja vakavuudesta. Yleisesti kuitenkin eläimille saadaan tyydyttäviä tuloksia n. 1-10 mg/kg/päivä p.o. päiväannoksilla. Suurempien nisäkkäiden tapauksessa, esim. ihmisen, ehdotettu päiväannos on n. 50-800 mg syklospo-riinituotetta annettuna oraalisesti kerran tai, edulli-10 semmin, jaettuina annoksina 2-4 kertaa/päivä.

Ihmisten elimensiirtotapauksissa ehdotetaan alkuyksikköannosta 10-15 mg/kg syklosporiinituotetta 4-12 h ennen leikkausta. Tämä päiväannos annetaan vielä yhden tai kahden viikon ajan leikkauksesta, ennenkuin 15 se pienennetään vähitellen veritasojen mukaan, kunnes saavutetaan ylläpitoannos n. 2-6 mg/kg/päivä. Kun syklosporiinituotetta annetaan yhdessä muiden immunosup-pressanttien kanssa (esim. kortikosteroidien kanssa osana kolmois- tai nelinkertaislääketerapiaa), niin 20 pienempiä annoksia (esim. 1 mg/kg/päivä i.v.; 6 mg/kg/ päivä oraalisesti, aluksi) voidaan käyttää.

Syklosporiinituotteita voidaan antaa mitä tahansa konventionaalista tietä, erityisesti enteraali-sesti, kuten oraalisesti, esim. juotavien liuosten 25 muodossa, tabletteina tai kapseleina, tai parenteraali-* sesti, kuten injektoitavien liuoksien tai suspensioiden muodossa. Oraaliset muodot ovat tavallisesti edullisempia systeemistä antoa varten, vaikkakin eräissä tiloissa, esim. maksasiirrännäisten hylkimisen estämiseksi, 30 laskimonsisäisesti injektoitava muoto on edullisempi.

. . Syklosporiinituotteet voidaan antaa myös topikaalisesti (ulkoisesti) tai dermaalisesti, esim. ihokremorin tai -geelin tai vastaavan muodossa, silmään saattamisen tapauksessa silmärasvan, -geelin tai -tippojen muodos-35 sa. Sopivat yksikköannosmuodot oraalista antoa varten sisältävät esim. 25-200 mg syklosporiinituotetta per annos.

15 94355

Edullisiin galeenisiin muotoihin syklospo-riinituotteille kuuluvat tuotteet, jotka perustuvat englantilaisessa patenttihakemusjulkaisussa GB 2 222 770A kuvattuihin mikroemulsioihin, joihin kuuluu sekä 5 topikaaliset, että oraaliset muodot; sekä oraaliset ja injektoitavat muodot, jotka saadaan rasvahapon sakkari-dimonoesteriä, kuten sakkaroosimonolauraattia, sisältävistä kiinteistä liuoksista englantilaisessa patenttihakemuksessa 2 209 67IA kuvatun mukaisesti.

10 Esimerkkeinä erityisen edullisista formulaati- oista, jotka sopivat pehmeiden liivatekapseleiden täyttöön oraalista antoa varten, mainittakoon; Formulaatioesimerkki A;

Esimerkin 2 tuote 50.0 mg 15 Glycofurol 75 180.0 mg

Miglyol 812 90.0 mg

Cremophor RH40 180.0 mg alfa-tokoferoli 0.5 mg 20 Formulaatioesimerkki B:

Esimerkin 2 tuote 100.0 mg

Tetraglykoli 20.0 mg

Captex 800 20.0 mg

Nikkol HCO-40 860.0 mg 25 Butyylihydroksitolueeni(BHT) 1.0 mg

Formulaatioesimerkki C:

Esimerkin 2 tuote 25.0 mg

Glycofurol 75 100.0 mg 30 Miglyol 812 35.0 mg

Cremophor RH 40 90.0 mg . . Butyylihydroksianisoli(BHA) 0.2 mg

Formulaatioesimerkki D: 35 Esimerkin 2 tuote 10.0 mg

Tetraglykoli 10.0 mg

Myritoli 5.0 mg 16 94355

Cremophor RH 40 75.0 mg alfa-tokoferoli 0.1 mg Näiden formulaatioiden yksittäiset komponen-5 tit, kuin myös menetelmät niiden valmistamiseksi, on kuvattu täysin englantilaisessa patenttihakemuksessa GB 2 222 770, jonka sisältö on liitetty tämän hakemuksen viitteeksi.

Määritetyt ED arvot edellä kuvatuissa koemene-10 telmissä 1-4 esimerkin 2 mukaiselle syklosporiinille ovat:

Koe- ED = tarvittava annos...

mene- 15 telmä mg/kg 1 25 ... solmukeparin välisen painoeron (ED50) vähentämiseksi keskimäärin 50 % ver rattuna käsittelemättömiin kontrolleihin.

2 2.5 ... selviytymisen pitkittämiseksi >100 päivää 100 % käsitellyistä rotista.

3 25 ... taudin oireiden vähentämiseksi ? . 100 % verrattuna käsittelmättömiin kontrolleihin.

4 20 ... turvotuksen vähetämiseksi käsit telemättömien kontrollien turvotukseen verrattuna.

20 • - Edellä esitetyn mukaisesti, esillä olevaan keksintöön liittyy vielä: A. Menetelmä immunosuppression aikaansaamiseksi tällaista hoitoa tarvitsevassa kohteessa, jolloin maini-25 tulle kohteelle annetaan vaikuttava määrä syklospo- 17 94355 riinituotetta.

B. Menetelmä: 1) elimensiirrännäisen hylkimisen estämiseksi, esim. jonkin edellä kuvatun tyyppisen elimensiirränäi- 5 sen vastaanottajan hoitamiseksi; tai 2) siirrännäinen-versus-isäntä taudin estämiseksi esim. luuydinsiirtovastaanottajissa; tai 3) autoimmuunitaudin hoitamiseksi tai inflammatoristen tilojen hoitamiseksi, esim. minkä tahansa 10 edellä luetteloidun taudin tai tilan hoitamiseksi; tai 4) hiusten lähdön estämiseksi tai hiusten kasvun edistämiseksi; tai 5) parasiittisen infektion tai tunkeutumisen hoitamiseksi, esim. alkueläin-, sieni- tai matoinfek- 15 tion tai tunkeutumisen hoitamiseksi, esim. kokkidiomy-koosin tai malarian hoitamiseksi; tai 6) pahanlaatuisissa tiloissa kemoterapialle heikentyneen resistenssin kumoamiseksi, haavan parantumisen edistämiseksi tai astman hoitamiseksi; 20 tälläistä hoitoa tarvitsevissa kohteissa, jolloin mainitulle kohteelle annetaan vaikuttava määrä syklosporiinituotetta.

C. Syklosporiinituote käytettäväksi lääkeaineena, esim. käytettäväksi immunosuppressanttina tai käytettäväksi 25 minkä tahansa edellä, kohdassa B esitetyn taudin tai - tilan hoitoon.

D. Farmaseuttinen ainekokoomus, joka sisältää syklosporiinituotetta yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän laimennusaineen tai kantajan kanssa.

a

Claims (5)

94355

1. Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen syklosporiinin valmistamiseksi, jolla syklosporiinilla 5 on kaava II, —X-Y-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-O-MeLeu-MeLeu-MeVal—, 123 4 5 6 789 10 11 (II) 10 -—------ jossa X on MeBmt tai dihydro-MeBmt, Y on aAbu, Vai, Thr tai Nva ja Q on tähde, jolla on kaava I,

15 CH2-0-CH2-CH2-0R I (I) -NH-CH-CO- (D) 20 jossa R on vety tai fysiologisesti hydrolysoituva ja hyväksyttävä asyylitähde, tunnettu siitä, että menetelmässä i) sellaisen syklosporiinin valmistamiseksi, 25 jonka 8-asemassa olevalla tähteellä on kaava I, jossa R on vety, pelkistetään vastaava syklosporiini, jonka 8-asemassa olevalla tähteellä on kaava III,

30 CH2-0-CH2-C0-0-R' (III) -NH-CH-CO- (D) 35 jossa R’ on C1_3alkyyli, tai ii) sellaisen syklosporiinin valmistamiseksi, jonka 8-asemassa olevalla tähteellä on kaava I, jossa R 94355 on asyyli, esteröidään vastaava syklosporiini, jossa R on vety.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan syklosporii- 5 ni, jossa R on vety.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan [O-(2-hydrok-sietyyli)(D)Ser ]8-Siklosporiini.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan syklosporiini, jossa R on asetyyli.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan [O-(2-asetyy-lioksietyyli) (D)Ser]e-Siklosporiini. 15 m « ► ·« 94355