KR100865211B1

KR100865211B1 - 비면역 [감마 히드록시 엔-메틸 엘-루신4] 사이클로스포린 유도체를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 기인 탈모증상 억제제

Info

Publication number: KR100865211B1
Application number: KR1020010066374A
Authority: KR
Inventors: 김상년; 안호정; 이민호; 김종일; 이헌식; 조호성; 김승진; 이창우; 김정훈; 김형진
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2008-10-23
Also published as: KR20030034691A

Abstract

본 발명은 비면역 사이클로스포린(Cyclosporin) 유도체를 유효성분으로 하는 항암화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다. 이를 위하여 본 발명은 사이클로스포린류의 4 번 잔기인 N-메틸 L-루신의 유도체화 및 화학항암요법에 의한 탈모 증상 억제 평가실험을 통해 화학식 1의 탈모 억제제를 제공한다.

본 발명의 사이클로스포린류 유도체를 유효성분으로 하는 탈모 억제제는 면역 억제력이 변형 전의 사이클로스포린 A에 비하여 매우 약하면서도 항암화학요법 또는 방사 요법에 기인 하는 탈모증상 억제력은 변형전과 같이 탁월한 효과를 유지 한다.

사이클로스포린 유도체, 항암화학요법, 방사 요법, 탈모증상, [감마 히드록시메틸루신4] 사이클로스포린, 발모제, 모발 성장

Description

비면역 [감마 히드록시 엔-메틸 엘-루신4] 사이클로스포린 유도체를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 기인 탈모증상 억제제{NONIMMUNOSUPPRESSIVE [γ-HYDROXY-N-METHYL-L-LEUCINE4]CYCLOSPORIN DERIVATIVES FOR PROTECTION FROM ANTINEOPLASTIC CHEMOTHERAPY-INDUCED HAIR LOSS}

도 1은 시클로포스파미드(cyclophosphamide)에 의한 탈모증상을 억제하는 비면역 사이클로스포린 유도체의 탈모억제력을 평가하는 실험으로 대조군 즉 시클로포스파미드만 투여한 군을 나타낸 것이다.

도 2는 시클로포스파미드(cyclophosphamide)에 의한 탈모증상을 억제 하는 비면역 사이클로스포린 유도체의 탈모억제력을 평가하는 실험으로 시클로포스파미드와 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)를 처리한 군으로 본 발명의 탈모억제 효과를 보여 준다.

도 3은 무모생쥐의 자연적인 탈모현상 (좌측)과 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)를 처리한 군(우측)으로 본 발명에 의한 탈모억제 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명은 비면역성, 발모성분인 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 유도체([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin derivatives)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 및 방사요법 기인 탈모증상(antineoplastic chemotherapy or radiation therapy-induced hair loss) 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

인체의 모발은 약 10 만 내지 15 만 개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)를 거쳐 성장, 탈락한다. 이러한 주기는 3∼6 년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 일일 평균 50 내지 100 개의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다. 일반적으로 탈모증이라 함은 이러한 주기 중에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지는 것을 일컫는다.

탈모의 원인으로는 혈액순환 불량설, 남성호르몬 작용 과잉설, 피지 분비 과잉설, 과산화물, 세균 등에 의한 두피 기능 저하설, 유전적 요인, 노화, 스트레스 등이 논의되어 왔었다. 그러나 현재까지 탈모에 관한 명확한 원인은 밝혀져 있지 않으며, 최근 들어 식생활의 변화, 사회환경 등에 의한 스트레스의 증가 등으로 탈모로 고민하는 인구가 늘어나고 있는 추세이고 그 연령 또한 낮아지고 있으며, 여성의 탈모 인구도 늘어나고 있는 실정이다. 이 밖에 항암화학 요법에 의한 급격한 탈모현상이 있는데 이는 대부분의 암환자에게 발생 되며 환자에게는 심리적으로 매우 좋지 않은 영향 주므로 환자의 삶의 질에 커다란 장애 요인으로 작용 하고 있다.

사이클로스포린 A와 FK 506은 대표적인 면역억제제로 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 덱사메타손(dexamethasone)등 약물에 의한 탈모현상을 억제 할 수 있는 효능이 여러 논문에 발표 되었다(Am. J Pathol. ('94) 144:719~, Am. J Pathol. ('97)150:1433~, J. Invest.Dermatol.('94)103:143~, Dermatol.('95)190:192~, J. Dermatol. Sci.(2001)27:7~). 그러나 사이클로스포린 A와 FK 506은 강력한 면역억제력으로 인하여 효과가 있어도 항암치료를 받는 환자에게 사용 할 수 없어 비면역 유도체가 필요 하게 되었다. 최근 연구 결과에 의하면 비면역성 사이클로스포린 유도체 이면서 모발성장효과가 탁월한 다양한 유도체에 대한 특허가 발표 되었다 (KR출원 10-2000-014837, KR출원 10-2000-067585, KR출원 10-2001-0027022, WO01/35913A1, WO01/35914A1,WO00/51558A1 K).

본 발명은 KR출원 10-2000-014837, KR출원 10-2000-067585, KR출원 10-2001-0027022, WO01/35913A1, WO01/35914A1에서의 비면역성, 발모성분인 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 유도체([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin derivatives)을 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 등 약물에 의한 탈모현상 및 무모생쥐 이용 탈모 증상을 억제 할 수 있는 효능을 실험한 결과 탁월 한 효과를 발견하여 본 발명을 완성 하였다.

또한 최근에는 항암화학 요법에 의한 탈모를 억제 할 수 있는 CDK 억제제에 의한 효과 (Science(2001)291:134~)와 Parathyroid hormone관련 유도체등에 의한 효과(J. Invest.Dermatol.('01)117:173~)가 발표 되었다. 또한 항암화학 요법에 의한 탈모를 억제 할 수 있는 여러 특허가 발표되었다(US20010020038A1, US05605931, WO09705866A1, US05578640, EP01007036A1, US05962523, AU03106895A1).

항암 화학요법 (antineoplastic chemotherapy) 에 속하는 약물로는 암세포의 증식을 DNA복제 억제 및 암세포의 세포자살을 유도 하는 약물을 의미 하며 매우 다양하다. 예를 들어 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신 (doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 포스페이트 또는 테니포시드 (etoposide phosphate or teniposide), 카미노마이신(carminomycin), 다우노루비신 (daunorubicin),아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프테린( methopterin), 디크로로메토트렉세이트(dichloro-methotrexate), 마이토마이신 씨(mitomycin C), 탁센류(taxanes)인 파크리탁셀(paclitaxel, 또는 Taxol), 에포티론(epothilone), 포르피로마이신(porfiromycin), 5-프르오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토푸린(6-mercaptopurine), 겜시타빈(gemcitabine), 시토신아라비노사이드(cytosine arabinoside), 포도필로톡신 또는 유도체) (podophyllotoxin or podophyllotoxin derivatives)인 멜파란(melphalan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리tm틴(vincristine), 레우로시딘(leurosidine), 빈데신(vindesine), 레우로신(leurosine), 에스트라무스틴(estramustine), 시스플 라틴(cisplatin), 카르보프라틴(carboplatin), 블레오마이신(bleomycin), 테목시펜(tamoxifen), 이포스파미드(ifosfamide), 멜파란(melphalan), 헥사메틸 메라민(hexamethyl melamine), 티오테파(thiotepa), 시타라빈(cytarabin), 이다트렉세이트(idatrexate), 트리메트렉사이트(trimetrexate), 다카르바진(dacarbazine), 엘 아스파라기나제(L-asparaginase), 캄프토테신(camptothecin), 시피티-11(CPT-11),토포테칸(topotecan), 아라-씨(ara-C), 비칼루타미드(bicalutamide), 프루타미드(flutamide), 레우프로리드(leuprolide), 피리도벤조인돌 유도체 (pyridobenzoindole derivatives), 인테페론(interferons), 인터루킨 (interleukins)등의 물질을 의미 하며 Physician's Desk Reference 에 수재 되있다. 여기서 항암 치료로 사용 되는 방사요법( radiation therapy)은 암 조직의 사멸을 위한 x-rays or gamma rays 내지는 체내 방사능 물질을 삽입하는 형태의 치료 방법이다.

사이클로스포린 류는 대표적인 면역 억제제인 동시에 바이러스, 진균, 원생동물을 억제하는 효과 및 부작용으로 신장독성, 간독성, 고혈압, 치주조직 비대, 발모효과 등 다양한 생리효과를 갖고 있다(Advances in Pharmacol., 1996; 35; 114∼246 및 Drug Safety, 1994; 10; 310∼317). 그 중 대표적인 사이클로스포린 A는 여러개의 N-메틸아미노산(N-methyl amino acid)과 8번 위치에 D-알라닌(D-alanine)을 갖는 11 개 아미노산으로 구성된 환형의 펩타이드로 다음의 구조식 1로 나타낸다.

[구조식]

상기 식에서,

MeBmt는N-메틸-(4R)-4-[(E)-2-뷰텐일]-4-메틸-L-트레오닌(N-methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine)이며,

Abu는 L-α아미노부티릭산(L-αaminobutyric acid)이며,

Sar은 살코신(Sarcosine)이며,

MeLeu는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine)이며,

Val은 L-발린(L-valine)이며, Ala는 L-알라닌(L-alanine)이며,

DAla는 D-알라닌(D-alanine)이며,

MeVal은 N-메틸-L-발린(N-methyl-L-Valine)이다.

상기 사이클로스포린 A의 아미노산의 형태는 다른 언급이 없으면 L-배치(L-configuration)이며, 아미노산 잔기 번호는 구조식 1에서 보듯이 MeBmt를 1번으로 하고 시계방향 순서대로 마지막 MeVal (N-메틸-L-발린(N-methyl-L-Valine)를 11번 으로 지정 하였다. 사이클로스포린 A부터 사이클로스포린 Z의 다양한 유도체 명명법은 일반적으로 사용되는 방법을 따랐다 (Helv. Chim. Acta, 1987;70;13-36). 예를 들어 사이클로스포린 A의 2번 잔기인 Abu (L-α아미노부티릭산, L-αaminobutyric acid)만 각각 알라닌(L-alanine), 트레오닌(L-threonine), 발린(L-valine), 또는 노르발린(L-norvaline)으로 치환된 사이클로스포린 분자를 각각 사이클로스포린 B, C, D 및 G로 표시하였다. 또한, 사이클로스포린 유도체 잔기가 사이클로스포린 A분자와 틀린 경우 유도체의 명명은 치환된 잔기만 표시하였다. 예를 들어 사이클로스포린 A의 4번 잔기인 N-메틸-L-루신 의 감마탄소 위치에 미생물 대사 과정에 의해 히드록시기가 첨가되 감마 히드록시 N-메틸-L-루신으로 치환된 경우 유도체의 명명은 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)로, 사이클로스포린 B 의 경우 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 B ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin B), 사이클로스포린 C의 경우 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신 ⁴]사이클로스포린 C([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin C)등 으로 표시하였다.

사이클로스포린 A의 3번 잔기인 살코신이 [N-메틸-D-아미노부티릭산³] ([N-methyl-D-Abu³]) 및 [N-메틸-D-노르발린³]([N-methyl-D-Nva³])으로 치환된 경우 각각 [N-메틸-D-아미노부티릭산³] 사이클로스포린 A([N-methyl-D-Abu³]cyclosporin A와 [N-메틸-D-노르발린³] 사이클로스포린 A([N-methyl-D-Nva³]cyclosporin A)으로 명명 하였다. 또한 2군데 이상 아미노산 잔기가 치환된 경우도 유사하게 표현 하였다. 3번 잔기와 4번 잔기가 동시에 치환된 경우는 예를 들어 [N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine³] [γ-hydroxy- N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A) 으로, 4번 잔기와 9번 잔기가 치환된 경우예를 들어[감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁹] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [γ-hydroxy-N-methyl-L- leucine⁹] cyclosporin A) 으로, 4번 및 7번이 치환된 경우 예를들어 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine⁴] [alanine thioamide⁷, ⁷Ψ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 로 표시하였다.

펩토라이드는 8번 D-Alanine이 히드록시산 으로 치환되어 아미드결합이 에스테르 결합으로 바뀐 것을 의미한다. 여기서 히드록시기는 일반식이 -O-RCH-CO- 으로 여기서 R은 C1-4의 알킬그룹으로 가장 선호하는 것은 이소프로필기인 히드록시 이소발레릭산( hydroxyisovaleric acid Hiv로약함)이다. 대표적 펩토라이드인 [L-트레오닌²][L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신¹⁰] 사이클로스포린 A ([L-Threonine²] [L-Leucine⁵][D-2-hydroxyisovaleric acid⁸] [L-Leucine¹⁰] cyclosporin A)과 [L-트레오닌²] [D-히드록시이소발레릭산⁸] [루신¹⁰] 사이클로스포린 A ([L-Thr²] [D-Hiv⁸] [Leu¹⁰] cyclosporin A), [L-트레오닌²][이소루신 ⁵] [D-히드록시이소발레릭산⁸] [루신¹⁰]사이클로스포린 A ([L-Thr²] [Ile⁵][D-Hiv⁸] [Leu¹⁰] cyclosporin A), [L-트레오닌²] [루신⁴] [루신⁵] [D-히드록시이소발레릭산⁸][루신 ¹⁰]사이클로스포 린A ([L-Thr²][Leu⁴] [Leu⁵][D-Hiv⁸] [Leu¹⁰] cyclosporin A, [L-트레오닌²] [살코신³][루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸][루신¹⁰]사이클로스포린 A ([L-Thr²][Sar³] [Leu⁵][D-Hiv]⁸[Leu]¹⁰cyclosporin A) 등을 Cylindrotrichum Bonorden NRRL 18230을 이용하여 얻을 수 있다.

8번 위치의 D-alanine이 D-hydroxyisovaleric acid 로 치환되어 에스테르 결합을 이루는 펩토라이드의 4번 잔기인 N-메틸 L-루신 이 감마 히드록시 N-메틸 L-루신으로 전환된 경우 [L-트레오닌]²[L-루신]⁵[감마 히드록시 N-메틸-L-루신]⁴ [D-히드록시이소발레릭산]⁸ [L-루신]¹⁰ 사이클로스포린 A ([L-Threonine]²[L-Leucine] ⁵[γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine]⁴ [D-hydroxyisovaleric acid]⁸ [L-Leucine]¹⁰ cyclosporin A) 로 표현하였다. 또한 사이클로스포린 분자의 7번 아미노산 카르보닐 산소에 황(sulfur)이 치환된 유도체는 문헌에 따라서 각각 사이클로스포린 7-티오아미드(Cyclosporin 7-Thioamide, [⁷Ψ⁸ CS-NH]사이클로 스포린) (Helv. Chim. Acta 1991, 74; 1953-1990, J. Org. Chem. 1993, 58;673-677, J Org. Chem. 1994, 59;7249-7258)으로 명명하였다. 또 일반적으로 사용되는 아미노산 약어법 예를 들어 MeLeu은 N-메틸-L-루신을, MeIle는 N-메틸-L-이소루신을, MeVal는 N-메틸-L-발린을, MeAla는 N-메틸-L-알라닌을, MeNva는 N-메틸-L-노르발린을, Leu는 L-루신을, Ile는 L-이소루신을, Sar는 살코신을, Ser은 L-세린을, Val은 L-발린을, Ala는 L-알라닌을, DAla는 D-알라닌 을, Abu를 Ｌ－아미노부티릭산(Abu, L-aminobutyric acid), Thr는 L-트레오닌 또는 Nva는 L-노르발린( L-norvaline)이며, 의미 하는 것으로 사용 하였다. 일반적으로 사이클로스포린 유도체라고 함은 4번 잔기가 감마 히드록시 N-메틸 L-루신으로 치환된 비면역 발모성분인 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로 스포린 유도체([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin derivatives)를 의미한다.

여러가지 부작용 중에서 모 과대 성장(발모) 부작용을 이용한 발모제로 개발 가능성이 연구 되어 져 왔다. 그 중에는 동물 발모실험(Arch, Dermatol. Res., 1996; 288; 408∼410), 인간 원형 탈모증(J. Am. Acad. Dermatol., 1990; 22; 242∼250), 인간 남성형 탈모증(J. Am. Acad. Dermatol., 1990; 22; 251∼253 및 Skin Pharmacol., 1994; 7; 101∼104) 및 화학요법에 의한 탈모 동물 모델에서도 탈모억제 효과(Clin. Lab. Invest., 1995; 190; 192∼196 및 Am. J. Pathol., 1997; 150; 1433∼1441) 등 매우 광범위하게 연구되었고 마우스 등판 실험 결과로 비교한다면 미녹시딜 보다 약 100배 정도 우수한 효과를 보여주고 있다. 이런 결과를 토대로 사이클로스포린을 남성형 탈모증에 발모제로 활용하고자 하는 노력의 결과로 여러 특허가 출원되었다.

예를 들어 일본공개 특허공보 소60-243008호, 소62-19512호, 및 소62-19513호와 8 번 위치가 변형된 사이클로스포린 유도체(유럽특허 공개공보 제0414632B1호), 이소 사이클로스포린(세계 특허 공개공보 제93/17039호) 등에서는 이들 사이 클로스포린 및 유도체를 이용한 발모제를 제공하고 있고, 미국특허 제5,807,820호 및 영국특허 2,218,334A호에서는 사이클로스포린의 경피 흡수가 우수한 제제를 통하여 발모제로 활용을 모색하고 있다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점인 면역억제력 제거을 고려하여 KR출원 10-2000-014837, KR출원 10-2000-067585, KR출원 10-2001-0027022, WO01/35913A1, WO01/35914A1에서의 비면역성, 발모성분인 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 유도체([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin derivatives)을 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 등 약물에 의한 탈모현상 및 무모생쥐의 자연 탈모 증상을 억제 할 수 있는 효능을 실험한 결과 탁월한 효과를 발견하여 본 발명을 완성 하였다.

이와 유사한 접근 방법으로 면역억제력은 감소하면서도, 후천성면역겹핍증 (AIDS)원인 바이러스(HIV)억제력은 유지되는 유도체 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 4번 아미노산 변형 유도체인 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 ([γ-hydroxy-MeLeu⁴]cyclosporin)A, [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A([MeIle⁴] cyclo sporin A), 및 [메틸발린⁴]사이클로스포린 A([MeVal⁴]cyclosporin A) 등 유도체가 신규 항 HIV 바이러스제로 특허(유럽특허484281 A2, 미국특허 5,767,069) 및 문헌(J. Virol., 1995;69:2451-2461, J. Antibiotics, 1996;49:781-787)에 보고되 었다. 본 발명자들은 4번의 원래 아미노산인 메틸루신 대신 구조가 유사한 감마 히드록시메틸루신, 메틸이소루신, 메틸발린, 루신, 이소루신으로 치환된 유도체를 포함한 여러 유도체를 대상으로 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 등 약물에 의한 탈모현상 및 무모생쥐의 자연 탈모 증상을 억제 할 수 있는 효능 및 면역억제력을 평가하여 유일하게 탈모억제효과는 유지되면서도 면역억제력은 상실 된 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)를 발견하였다. 이 결과를 사이클로스포린 A 외 다른 유사체에 확장 적용하여 연구한 결과 유사한 효과 즉 예를 들어 3번 잔기인 살코신을 N-메틸-D-알라닌으로 합성 변형후 4번 잔기에 히드록시기를 추가한 [N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl-L -leucine⁴] cyclosporin A)의 경우도 면역억제력은 떨어지고 항암 화학요법 및 방사요법 기인 탈모증상 억제 효과가 유지되는 것을 발견 하였다. 본 발명은 비면역성 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 유도체([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin derivatives)를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법에 기인 탈모증상 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 면역억제력은 없고 화학식 1로 나타내는 [감마 히드록시 N-메틸- L-루신⁴]사이클로스포린유도체([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴] cyclosporin derivatives) 들을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제를 제공하는 것이다.

상기 식에서,

A는 N-메틸-(4R)-4-[(E)-2-뷰텐일]-4-메틸-L-트레오닌(MeBmt, N-methyl-(4R)-4- [(E)-2-butenyl]-4- methyl-L-threonine), (2S,3R,4R,6E)-3-설프히드릴-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노익산(2S,3R,4R,6E)-3-sulfhydryl-4-methyl-2-(methylamino)-6-octenoic acid 또는 (2S,4R,6E)-3-옥소-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노익산 (2S,4R,6E)-3-oxo-4-methyl-2-(methylamino)-6-octenoic acid이며,

Abu는Ｌ－아미노부티릭산(Abu, L-aminobutyric acid)이고,

B는 하기 일반식(1)으로 나타나는 D-아미노산으로

CH₃NH-CH(R)-COOH (1)

여기서 R은

하이드로겐(hydrogen), C1-C6 직쇄(straight) 또는 분기(branch)상의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl)탄소로 구성되고 이들 탄소에 하나 또는 하나 이상의 아미노(amino), 히드록시(hydroxy), 할로(halo), 할로알킬(haloalkyl), 에스터(ester), 알콕시(alkoxy), 시아노(cyano), 나이트로(nitro), 알킬아미노(alkylamino), 디알킬아미노(dialkylamino)등이 포함된다.

R은 또 하기식(2) -X-R'의 구조를 포함한다.

-X-R'(2)

X=산소(O) 또는 황(S)이며

R' 하이드로겐(hydrogen), C1-C6 직쇄(straight) 또는 분기(branch)상의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl)탄소로 구성되고 이들 탄소에 하나 또는 하나 이상의 아미노(amino), 히드록시(hydroxy), 할로(halo), 할로알킬(haloalkyl), 에스터(ester), 알콕시(alkoxy), 시아노(cyano), 나이트로(nitro), 알킬아미노(alkylamino), 디알킬아미노(dialkylamino)등이 포함된다.

HMeLeu는 감마 히드록시 N-메틸 L-루신(γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine)이며

C는 L-발린(L-valine) 또는 L-노르발린(L-norvaline)이며,

D는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine), 감마히드록시 N-메틸 L-루신(γ-hydroxy N- methyl L-leucine) 또는 L-루신(L-Leucine)이며,

E는 L-알라닌(L-alanine)또는 L-알라닌 티오아미드( L-alanine thioamide, [⁷Ψ⁸ CS-NH], NH-CHCH³-CS-)이며,

F는 이소발레릭산(D-hydroxyisovaleric acid) 내지는

하기 일반식(3)으로 나타나는 D-아미노산으로

-NH-CH(CH₂R)-COOH (3)

여기서 R은 하이드로겐(hydrogen)이고 또한 하기식(4) -X-R'을 포함한다.

-X-R'(4)

X=산소(O) 또는 황(S)이며

R'는 하이드로겐(hydrogen), C1-C6 직쇄(straight) 또는 분기(branch)상의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl)탄소로 구성되고 이들 탄소에 하나 또는 하나 이상의 아미노(amino), 히드록시(hydroxy), 할로(halo), 할로알킬(haloalkyl), 에스터(ester), 알콕시(alkoxy), 시아노(cyano), 나이트로(nitro), 알킬아미노(alkylamino), 디알킬아미노(dialkylamino)등이 포함된다.

G는 N-메틸 L-루신( N-methyl L-leucine), 감마히드록시 N-메틸- L-루신 (γ-hydroxy- N- methyl L-leucine) 또는 L-루신( L-leucine)이며,

H는 N-메틸 L-루신( N-methyl L-leucine), 감마히드록시 N-메틸 L-루신 (γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine) 또는 L-루신( L-leucine)이며,

I는 N-메틸-L-발린 (N-methyl-L-valine) 또는 L-발린(L-valine) 이다.

상기 화학식 1에 있어서 바람직 하기로는 화학식 2로 나타내는 면역억제력은 없으며 탈모억제 효과가 우수한 사이클로스포린 유도체인 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin)유도체를 이용한 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제를 제공하는 것이다.

상기 식에서,

MeBmt는N-메틸-(4R)-4-[(E)-2-뷰텐일]-4-메틸-L-트레오닌 N-methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4- methyl-L-threonine), 이며,

Abu는Ｌ－아미노부티릭산(Abu, L-aminobutyric acid)이고,

A' 는 N-메틸-D-알라닌 (N-methyl-D-alanine), D-2-(메틸아미노)펜트-4-에노일 {D-2-(methylamino)pent-4-enoy}, N-메틸-D-아미노부티릭산 (N-methyl-D- aminobutyric acid), N-메틸-D-노르발린(N-methyl-D-norvaline), D-2-(메틸아미노)헥사-4-이노일{D-2-(Methylamino)hexa-4-ynoyl}, D-2-(메틸아미노)펜트-4-이노일{D-2-(Methylamino)pent-4-ynoyl}, D-2-메틸티오살코신(D-2-methylthio-sarcosine), N-메틸-O-프로페닐-D-세린 (N-methyl-O-Propenyl-D-serine) 또는 N-메틸-D-세린 (N-methyl-D-serine)

이며,

Val은 L-발린(L-valine)이며,

MeLeu는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine)이며,

B' 는 L-알라닌(L-alanine)또는 L-알라닌 티오아미드(L-alanine thioamide, [⁷Ψ⁸ CS-NH] , NH-CHCH3-CS-)이며,

C'는 이소발레릭산(D-hydroxyisovaleric acid) 내지는 하기 일반식으로 나타나는 D-아미노산으로

-NH-CH(CH₂R)-COOH

여기서 R은 하이드로겐(hydrogen)이고 또한 하기식 -X-R'을 포함한다.

-X-R'

X=산소(O) 또는 황(S)이며

D'는 N-메틸 L-루신( N-methyl L-leucine), 감마히드록시 N-메틸- L-루신 (γ-hydroxy- N- methyl L-leucine) 또는 L-루신( L-leucine)이며,

MeVal은 N-메틸-L-발린( N-methyl-L-valine)이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명은 면역억제력은 없으며 탈모억제 효과가 우수한 화학식 3으로 나타내는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클 로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A) 유도체들을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제를 제공한다.

상기 식에서,

MeBmt는 N-메틸-(4R)-4-[(E)-2-뷰텐일]-4-메틸-L-트레오닌 N-methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4- methyl-L-threonine), 이며,

Abu는Ｌ－아미노부티릭산(Abu, L-aminobutyric acid)이고,

A" 는 N-메틸-D-알라닌 (N-methyl-D-alanine), D-2-(메틸아미노)펜트-4-에노일 {D-2-(methylamino)pent-4-enoy}, N-메틸-D-아미노부티릭산 (N-methyl-D- aminobutyric acid), N-메틸-D-노르발린(N-methyl-D-norvaline), D-2-(메틸아미노)헥사-4-이노일{D-2-(Methylamino)hexa-4-ynoyl}, D-2-(메틸아미노)펜트-4-이노일{D-2-(Methylamino)pent-4-ynoyl}, D-2-메틸티오살코신(D-2-methylthio-sarcosine), N-메틸-O-프로페닐-D-세린 (N-methyl-O-Propenyl-D-serine) 또는 N-메틸-D-세린 (N-methyl-D-serine)

이며,

Val은 L-발린(L-valine)이며,

MeLeu는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine)이며,

B" 는 L-알라닌(L-alanine)또는 L-알라닌 티오아미드(L-alanine thioamide, [⁷Ψ⁸ CS-NH] , NH-CHCH3-CS-)이며,

DAla는 D-알라닌(D-alanine)이며,

C"는 N-메틸 L-루신( N-methyl L-leucine), 감마히드록시 N-메틸- L-루신 (γ-hydroxy- N- methyl L-leucine) 또는 L-루신( L-leucine)이며,

MeVal은 N-메틸-L-발린( N-methyl-L-valine)이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 다른 형태는

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

[N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제를 제공하는 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [D-2-(메틸아미노)펜트-4-에노일³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([D-2-(methylamino)pent-4-enoy³] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [N-메틸-D-아미노부티릭산³][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-Abu³] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A 을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [N-메틸-D-노르발린³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]

사이틀로스포린 A ([N-methyl-D-Norvaline³] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A 을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [D-2-(메틸아미노)헥사-4-이노일³][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린A ([D-2-(Methylamino) hexa-4-ynoyl³] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [D-2-(메틸아미노)펜트-4-이노일³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([D-2-(Methylamino)pent-4-ynoyl³] [γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine⁴] cyclosporinA) 을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는[D-2-메틸티오살코신³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([D-2-methylthio-Sar³][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [N-메틸- O-프로페닐-D-세린³][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A [N-methyl-O-Propenyl-D-Serine³] [γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [N-메틸-D-세린 ³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ([N-methyl-D-Serine³] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [alanine thioamide⁷, ⁷ Ψ⁸ CS-NH] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁹] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁹] cyclosporin A) 을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][D-세린⁸] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [D-Serine⁸] cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에 있어서 좀더 바람직한 본 발명의 또 다른 형태는 4번 잔기인 N-메틸 L-루신 이 감마 히드록시 N-메틸 L-루신으로 전환된 펩토라이드인 [L-트레오닌]²[감마 히드록시 N-메틸-L-루신]⁴ [L-루신]⁵[D-히드록시이소발레릭산] ⁸ [L-루신]¹⁰ 사이클로스포린 A ([L-Threonine]²[γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine]⁴[L-Leucine]⁵ [D-hydroxyisovaleric acid]⁸ [L-Leucine]¹⁰ cyclosporin A)을 유효성분으로 하는 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제제에 관한 것이다.

또한 상기 조성물의 제형이 액상, 스프레이, 겔, 페이스트, 유제, 크림, 콘 디셔너, 또는 샴푸인 화학항암요법에 의한 탈모억제제를 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.

면역 억제력이 없고 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제 유도체를 개발 하고자 사이클로스포린의 유도체를 합성 및 변형 제조하여 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모 증상 억제력 평가 결과, 변형 전 사이클로스포린 에 비교하여 대부분 효과가 현격히 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나 사이클로스포린 과 본 발명의 미생물에 의해 변형된 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 유도체를 비교 실험한 결과 항암 화학요법 또는 방사요법 기인 탈모증상 억제 효과가 그대로 유지되는 것을 발견하였다.

여기서 사용된 실시예는 KR출원 10-2000-014837, KR출원 10-2000-067585, KR출원 10-2001-0027022, WO01/35913A1, WO01/35914A1에서 사용된 방법을 이용하였다.]

[실시예 1]

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclosporin A) 제조.

여기에서는 미생물에 의해 변형 후 탈모 억제 효과가 유지되는 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 A의 제조 방법을 기술한다. 먼저, 사이클로스포 린 유도체를 제조하기 위하여 사용된 균주는 Sebekia benihana KCTC 9173이며, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7%, 효모 추출물(yeast extract) 0.45%, 멕아엑스(malt extract) 0.5%, 수용성 풀(soluble starch) 1.0%, 탄산칼슘(CaCO3) 0.005 %가 포함된 배지이며, 배양온도는 27℃였다 (J. Antibiotics, 1996; 49; 781∼787). 발효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양 한 후, 4ℓ발효기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다.

본 배양이 시작되고 24시간이 지난 후 메탄올에 녹인 사이클로스포린 A (cyclosporin A)를 배지에 100㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 72시간을 더 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래피로 분리 및 분취 하였다. 이때 사용한 분리조건은 C-18컬럼을 사용하였으며, 용매조건은 2분까지 100% 용매 A로 흘려주고 4분까지 용매 A의 농도를 60%로 낮춘 후 60분까지 용매 A의 농도를 39%까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65분까지 다시 원래의 조건인 100% 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25% 메탄올 수용액이며, 용매 B는 100% 아세토니트릴이다. FAB MS(ZMS AX 505H)로부터 분자량을 확인하였고 구조 확인을 위해 핵자기공명법 ¹H-NMR(Bruker NMR 600㎒) 와 ¹³C-NMR(Bruker NMR 150 MHz)을 이용하였다 (KR출원 10-2000-014837).

[실시예 2]

[N-메틸-D-알라닌 ³ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine ³ ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclosporin A) 제조.

단계 1. 사이클로스포린 A(Cyclosporin A) 의 알킬화를 위한 일반적인 방법

질소하에 테트라 히드로 푸란(THF)에 디이소프로필 아민((i-Pr)₂NH)을 가하고 영하78⁰C 에서 핵산에 녹아있는 부틸리튬(BuLi)을 가하고 30분간 교반하였다. 이렇게 생성된 LDA 용액에 테트라 히드로 푸란(THF)에 녹인 사이클로스포린A (Cyclosporin A)을 가한후 1시간 교반한후 친전자체(electrophile)를 가하였다.

단계 2. [D-메틸알라닌³] 사이클로스포린 A ([D-MeAla³]cyclosporin A)의 합성.

일반적인 방법을 이용하여 테트라 히드로 푸란(THF)(120 mL), 디이소프로필 아민((i-Pr)₂NH)(1.74 mL), 부틸리튬(BuLi)(4.6 mL) 테트라 히드로 푸란(THF)(30 mL)에 녹아있는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A)(2.0 g), 메틸아이오다이드(MeI)(0.51 mL)을 사용하였다. 1시간 교반 시키면서 실온으로 만든 후 10 mL의 물을 가한후 농축하였다. 잔사에 에테르를 가한 후 물, 포화 염화 나트륨수로 순차적으로세척, 무수 황산 나트륨(MgSO₄)으로 건조 후, 농축했다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔 100 g, 디클로로메탄 : 메틸알코올 = 50:1 ~ 96:4) 에 정제한 후 HPLC 로 정제하여 표제 화합물(0.26 g)을 얻었다.

단계 3. [N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A) 제조.

여기에서는 미생물에 의해 변형 후 탈모 억제 효과가 유지되는 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 A의 제조 방법을 기술한다. 먼저, 사이클로스포린 유도체를 제조하기 위하여 사용된 균주는 Sebekia benihana KCTC 9173이며, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7%, 효모 추출물(yeast extract) 0.45%, 멕아엑스(malt extract) 0.5%, 수용성 풀(soluble starch) 1.0%, 탄산칼슘(CaCO3) 0.005 %가 포함된 배지이며, 배양온도는 27℃였다 (J. Antibiotics, 1996; 49; 781∼787). 발효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양 한 후, 4ℓ발효기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다.

본 배양이 시작되고 24시간이 지난 후 메탄올에 녹인 [D-메틸알라닌³] 사이클로스포린 A ([D-MeAla³]cyclosporin A) 사이클로스포린 A를 배지에 100㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 72시간을 더 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래피로 분리 및 분취 하였다. 이때의 [D-메틸알라닌³] 사이클로스포린 A ([D- MeAla³]cyclosporin A) 사이클로스포린 A와 [N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine⁴] cyclosporin A) 유도체 (18-20분사이)를 보여주는 액체 크로마토그래피 결과를 보였다. 이때 사용한 분리조건은 C-18컬럼을 사용하였으며, 용매조건은 2분까지 100% 용매 A로 흘려주고 4분까지 용매 A의 농도를 60%로 낮춘 후 60분까지 용매 A의 농도를 39%까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65분까지 다시 원래의 조건인 100% 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25% 메탄올 수용액이며, 용매 B는 100% 아세토니트릴이다. FAB MS(ZMS AX 505H)로부터 분자량을 확인하였고 구조 확인을 위해 핵자기공명법 ¹H-NMR(Bruker NMR 600㎒)와 ¹³C-NMR(Bruker NMR 150 MHz(KR출원 10-2001-0027022)을 이용하였다.

[실시예 3]

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ][알라닌 티오아미드 ⁷ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [alanine thioamide ⁷ , ⁷ Ψ ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 제조.

단계 1. 아세틸사이클로스포린 A (Acetylcyclosporin A)의 합성

사이클로스포린A(cyclosporin A)(2.4g, 2.0mmol)과 4-디메틸아미노피리딘(4- (dimethylamino)pyridine)(0.24g, 2.0mmol)을 20mL의 피리딘(pyridine)과 20mL의 아세틱언히드리드(acetic anhydride)에 넣고 실온에서 18시간 교반한후 감압증류하였다. 잔사에 100ml 염화메틸렌(methylene chloride)을 가하고 물로 세척한후 무수 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제한후 표제화합물 2.3g을 얻었다.

단계 2. 아세틸사이클로스포린 A 7-티오아미드(Acetylcyclosporin A 7-thioamide)의 합성

아세틸사이클로스포린 A(1.8g, 1.45mmol)을 자일렌(xylene)(50mL) 에 녹인 용액을 130℃로 가열한 후 로손시약(Lawesson reagent)(0.35g, 0.87mmol)을 조금씩 첨가하였다. 130℃에서 30분간 교반한 후 실온으로 식혔다. 용매를 감압증류한후 잔사에 100ml 염화메틸렌(methylene chloride) 을 가하고 물로 세척한후 무수 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조후 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물인 아세톡시 화합물(0.19g)을 얻었다.

단계3. 사이클로스포린 A 7-티오아미드 (Cyclosporin A 7-Thioamide)의 합성

아세톡시화합물인 아세틸사이클로스포린 A 7-티오아미드(Acetylcyclosporin A 7-thioamide) (0.2g, 0.16mmol)을 메틸 알코올(MeOH) (50mL)에 녹인후 0.5M 소듐메톡사이드(NaOMe in MeOH)(20mL, 10mmol)을 첨가한후 실온에서 4시간 교반하였다. 아세트산(Acetic acid)으로 중화시킨후 용매를 감압증류하였다. 잔사에 100ml 염화 메틸렌(methylene chloride)을 가하고 물로 세척한 후 무수 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후 HPLC로 정제하여 표제화합물 0.17g을 얻었다.

단계 4 . [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [alanine thioamide⁷, ⁷ Ψ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 의 제조 방법

먼저, 사이클로스포린 유도체를 제조하기 위하여 사용된 균주는 Sebekia benihana KCTC 9173이며, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7%, 효모 추출물(yeast extract) 0.45%, 멕아엑스(malt extract) 0.5%, 수용성 풀(soluble starch) 1.0%, 탄산칼슘(CaCO3) 0.005 %가 포함된 배지이며, 배양온도는 27℃였다 (J. Antibiotics, 1996; 49; 781∼787). 발효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양 한 후, 4ℓ발효기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다.

본 배양이 시작되고 24시간이 지난 후 메탄올에 녹인 사이클로스포린 A 7-티오아미드 (Cyclosporin A 7-Thioamide)를 배지에 100㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 72시간을 더 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래 피로 분리 및 분취하였다. 이때의 사이클로스포린 A 7-티오아미드 (Cyclosporin A 7-Thioamide)와 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [alanine thioamide⁷, ⁷ Ψ ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 유도체(16.2분 근처)를 보여주는 액체 크로마토그래피 결과를 도 4 에 나타내었다. 이때 사용한 분리조건은 C-18컬럼을 사용하였으며, 용매조건은 2분까지 100% 용매 A로 흘려주고 4분까지 용매 A의 농도를 60%로 낮춘 후 60분까지 용매 A의 농도를 39%까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65분까지 다시 원래의 조건인 100% 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25% 메탄올 수용액이며, 용매 B는 100% 아세토니트릴이다. FAB MS(ZMS AX 505H)로부터 분자량을 확인 하였고 구조 확인을 위해 핵자기공명법 ¹H-NMR(Bruker NMR 600㎒)와 ¹³C-NMR(Bruker NMR 150 MHz)(KR출원 10-2001-0027022)을 이용하였다.

[실시예 4]

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁹ ] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [γ-hydroxy-N- methyl-L-leucine ⁹ ] cyclosporin A) 제조

사이클로스포린 유도체를 제조하기 위하여 사용된 균주는 Pseudonocardia autotrophica KCTC 9441 이며, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7%, 효모 추출물(yeast extract) 0.45%, 멕아엑스 (malt extract) 0.5%, 수용성 풀(soluble starch) 1.0%, 탄산칼슘(CaCO₃) 0.005 %가 포함된 배지이며, 배양온도는 27℃였다 (J. Antibiotics, 1996 49 781∼787). 발효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양한 후, 4ℓ발효 기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다. 본 배양이 시작되고 24시간이 지난 후 메탄올에 녹인 사이클로스포린 A를 배지에 100 ㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 72시간을 더 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래피로 분리 및 분취하였다. 이때 사용한 분리조건은 C-18컬럼을 사용하 였으며, 용매조건은 2 분까지 100% 용매 A 로 흘려주고 4 분까지 용매 A 의 농도를 60% 로 낮춘 후 60분까지 용매 A의 농도를 39% 까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65분까지 다시 원래의 조건인 100% 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25% 메탄 올 수용액이며, 용매 B는 100% 아세토니트릴이다. FAB MS(ZMS AX 505H)로부터 분자량을 확인하였고 구조 확인을 위해 핵자기공명법 ¹H-NMR(Bruker NMR 600㎒) 와 ¹³C-NMR(Bruker NMR 150 MHz)(KR출원 10-2001-0027022)을 이용하였다.

이 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁹] 사이클 로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁹] cyclosporin A)는 또한 토끼간의 마이크로조말 효소를 이용하여 조제 할수 있다. 우선 뉴질랜드 흰토끼의 간을 떼어낸후 0.1M 인산칼륨염 완충액에 5분 담근다. 잘게 부순 간 조직을 호모게나이저로 갈아서 원심분리(9000g, 4도, 20분)하여 상층액만 따낸다. 이 상층액은 다시 원심분리(10,500g, 1시간)을 한뒤 상층액은 따라내버리고 남아있는 펠렛은 0.1 M 인산염완충생리식염수에 녹여서 효소원으로 사용 한다.(Transplant Proc 1988;17:633-6). 만들어진 마이크로조말 효소(50mg)과 사이클로스포린(1mg), NADPH(5mM)를 증류수를 섞어 적당양으로 맞춘후 37도 항온수조에서 1 시간 동안 반응시킨 반응물을 동량의 에칠아세테이트로 추출하여 분석하였다.

[실시예 5]

[L-트레오닌 ² ][감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [L-루신 ⁵ ][D-히드록시이소발레릭산 ⁸ ] [L-루신 ¹⁰ ] 사이클로스포린 A ([L-Threonine ² ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [L-Leucine ⁵ ][D-2-hydroxyisovaleric acid ⁸ ] [L-Leucine ¹⁰ ] cyclosporin A) 제조

단계 1. [L-트레오닌²][L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신¹⁰] 사이클로스포 린 A ([L-Threonine²] [L-Leucine⁵][D-2-hydroxyisovaleric acid⁸] [L-Leucine ¹⁰] cyclosporin A) 펩토라이드 제조.

먼저, Cylindrotrichum Bonorden NRRL 18230 (Biomed. Biochim. Acta, 50, (1991)10/11, S260-S263) 이용하였고, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7%, 효모 추출물(yeast extract) 0.45%, 멕아엑스(malt extract) 0.5%, 수용성 풀(soluble starch) 1.0%, 탄산칼슘(CaCO3) 0.005 %가 포함된 배지이며, 배양온도는 27℃ 였다. 발효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양 한 후, 4ℓ발효기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래피로 분리 및 분취 하였다. 이때 사용한 분리조건은 C-18컬럼을 사용하였으며, 용매조건은 2분까지 100% 용매 A로 흘려주고 4분까지 용매 A의 농도를 60%로 낮춘 후 60분까지 용매 A의 농도를 39%까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65분까지 다시 원래의 조건인 100% 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25% 메탄올 수용액이며, 용매 B는 100% 아세토니트릴이다.

단계 2. [L-트레오닌²][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신¹⁰] 사이클로스포린 A ([L-Threonine²][γ-hydroxy- N-methyl-L- leucine⁴] [L-Leucine⁵][D-2-hydroxyisovaleric acid⁸] [L-Leucine¹⁰] cyclosporin A) 제조

먼저, 사이클로스포린 유도체를 제조하기 위하여 사용된 균주는 Sebekia benihana KCTC 9173이며, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7%, 효모 추출물(yeast extract) 0.45%, 멕아엑스(malt extract) 0.5%, 수용성 풀(soluble starch) 1.0%, 탄산칼슘(CaCO3) 0.005 %가 포함된 배지이며, 배양온도는 27℃였다 (J. Antibiotics, 1996; 49; 781∼787). 효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양한 후, 4ℓ발효기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다.

본 배양이 시작되고 24시간이 지난 후 메탄올에 녹인 [L-트레오닌²][L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신¹⁰] 사이클로스포린 A ([L-Threonine²] [L-Leucine⁵][D-2-hydroxyisovaleric acid⁸] [L-Leucine ¹⁰] cyclosporin A) 를 배지에 100㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 72시간을 더 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래피로 분리 및 분취하였다. 이때 사용한 분리조건은 C-18컬럼을 사용하였으며, 용매조건은 2분까지 100% 용매 A로 흘려주고 4분까지 용매 A의 농도를 60%로 낮춘 후 60분까지 용매 A의 농도를 39%까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65분까지 다시 원래의 조건인 100% 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25% 메탄올 수용액이며, 용매 B는 100% 아세토니트릴이다. [ L-트레오닌²][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신¹⁰] 사이클로스포린 A ([L-Threonine²][γ-hydroxy- N-methyl-L-leucine⁴] [L-Leucine⁵][D-2- hydroxyisovaleric acid⁸] [L-Leucine¹⁰] cyclosporin A)의 분자량은 FAB MS(ZMS AX 505H)로부터 m/z 1286.0 에서 [M(펩토라이드유도체) + Na] 피크가 검출되었고(KR출원 10-2001-0027022) 구조 확인을 위해 핵자기공명법¹H-NMR(Bruker NMR 600㎒) 와 ¹³C-NMR(Bruker NMR 150 MHz)(KR출원 10-2001-0027022)을 이용하였다.

제제예 1 . 탈모억제토닉

제제예 1-1. [N-메틸-D-알라닌 ³ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine ³ ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclo sporin A) 함유 탈모억제토닉의 제조)

표 1에 나타난 3가지 제형으로 각각의 원료를 혼합하고 교반 하여 완전히 녹여서 탈모억제토닉을 제조하였다. 하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 1에 나오는 제형 1을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 탈모억제토닉과 비교해 본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 1-2

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ][알라닌 티오아미드 ⁷ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [alanine thioamide ⁷ , ⁷ Ψ ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 함유 탈모억제토닉의 제조)

표 2에 나타난 3 가지 제형으로 각각의 원료를 혼합하고 교반 하여 완전히 녹여서 탈모억제토닉을 제조 하였다. 하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 2에 나오는 제형 1 을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 탈모억제토닉과 비교해 본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 1-3

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁹ ] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁹ ] cyclosporin A) 함유 탈모억제토닉의 제조)

표 3에 나타난 3 가지 제형으로 각각의 원료를 혼합하고 교반 하여 완전히 녹여서 탈모억제토닉을 제조 하였다. 하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 3에 나오는 제형 1 을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 탈모억제토닉과 비교해 본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 1-4

[L-트레오닌 ² ][감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [L-루신 ⁵ ][D-히드록시이소 발레릭산 ⁸ ] [L-루신 ¹⁰ ] 사이클로스포린 A([L-Threonine ² ][γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine ⁴ ] [L-Leucine ⁵ ][D-2-hydroxyisovaleric acid ⁸ ] [L-Leucine ¹⁰ ] cyclosporin A) 함유 탈모억제토닉의 제조)

표 4에 나타난 3 가지 제형으로 각각의 원료를 혼합하고 교반 하여 완전히 녹여서 탈모억제토닉을 제조 하였다. 하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 4에 나오는 제형 1 을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 탈모억제토닉과 비교해 본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 1-5

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclosporin A)함유 탈모억제토닉의 제조)

표 5에 나타난 3 가지 제형으로 각각의 원료를 혼합하고 교반 하여 완전히 녹여서 탈모억제토닉을 제조 하였다. 하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 5에 나오는 제형 1 을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 탈모억제토닉과 비교해 본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 2. 헤어크림

제제예 2-1. [N-메틸-D-알라닌 ³ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine ³ ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclo sporin A) 함유 헤어크림의 제조

표 6에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어크림을 제조 하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가 하였다.

하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 6에 나오는 [N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A) 0.1% 함유 헤어크림을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 헤어크림과 비교해본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 2-2

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ][알라닌 티오아미드 ⁷ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [alanine thioamide ⁷ , ⁷ Ψ ⁸ CS-NH] cyclosporin A)함 유 헤어크림의 제조

표 7에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어크림을 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 7에 나오는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N- methyl-L-leucine⁴] [alanine thioamide⁷, ⁷Ψ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 0.1% 함유 헤어크림을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 헤어크림과 비교해본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 2-3.

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁹ ] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [γ-hydroxy-N -methyl-L-leucine ⁹ ] cyclosporin A) 함유 헤어크림의 제조

표 8에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어크림을 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 8에 나오는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁹] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁹] cyclosporin A) 0.1% 함유 헤어크림을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 헤어크림과 비교해본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 2-4.

[L-트레오닌 ² ][감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [L-루신 ⁵ ][D-히드록시이소 발레릭산 ⁸ ] [L-루신 ¹⁰ ] 사이클로스포린 A([L-Threonine ² ][γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine ⁴ ] [L-Leucine ⁵ ][D-2-hydroxyisovaleric acid ⁸ ] [L-Leucine ¹⁰ ] cyclosporin A) 함유 헤어크림의 제조

표 9에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어크림을 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 9에 나오는 [L-트레오닌²][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신 ¹⁰] 사이클로스포린 A ([L-Threonine²][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] [L-Leucine⁵][D-2- hydroxyisovaleric acid⁸] [L-Leucine¹⁰] cyclosporin A) 0.1% 함유 헤어크림을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 헤어크림과 비교해본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 2-5.

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A([γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine ⁴ ] cyclosporin A) 함유 헤어크림의 제조

표 10에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어크림을 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

하기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 표 10에 나오는 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A) 0.1% 함유 헤어크림을 0.1% 사이클로스포린 A 함유 헤어크림과 비교해본 결과 유사한 정도의 탈모 억제 효과를 확인하였다.

제제예 3. 샴푸

제제예 3-1 [N-메틸-D-알라닌 ³ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine ³ ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclosporin A) 함유 샴푸의 제조

표 11에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 향료, 색소, 및 물을 제외한 원료들을 혼합한 후 가열하면서 교반하여 완전히 용해시키고, 상온으로 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 후 최종적으로 물을 첨가하여 100 중량%로 맞추어 샴푸를 제조하였다.

제제예 3-2

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ][알라닌 티오아미드 ⁷ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [alanine thioamide ⁷ , ⁷ Ψ ⁸ CS-NH] cyclosporin A) 함유 샴푸의 제조

표 12에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 향료, 색소, 및 물을 제외 한 원료들을 혼합한 후 가열 하면서 교반하여 완전히 용해시키고, 상온으로 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 후 최종적으로 물을 첨가 하여 100 중량%로 맞추어 샴푸를 제조 하였다.

제제예 3-3

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁹ ] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁹ ] cyclosporin A) 함유 샴푸의 제조

표 13 에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 향료, 색소, 및 물을 제외한 원료들을 혼합한 후 가열하면서 교반하여 완전히 용해시키고, 상온으로 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 후 최종적으로 물을 첨가하여 100 중량%로 맞추어 샴푸를 제조하였다.

제제예 3-4

[L-트레오닌 ² ][감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [L-루신 ⁵ ] [D-히드록시이소발레릭산 ⁸ ] [L-루신 ¹⁰ ] 사이클로스포린 A ([L-Threonine ² ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [L-Leucine ⁵ ][D-2-hydroxyisovaleric acid ⁸ ] [L-Leucine ¹⁰ ] cyclosporin A) 함유 샴푸의 제조

표 14에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 향료, 색소, 및 물을 제외 한 원료들을 혼합한 후 가열하면서 교반하여 완전히 용해시키고, 상온으로 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 후 최종적으로 물을 첨가 하여 100 중량%로 맞추어 샴푸를 제조하였다.

제제예 3-5

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclosporin A) 함유 샴푸의 제조

표 15에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 향료, 색소, 및 물을 제외한 원료들을 혼합한 후 가열하면서 교반하여 완전히 용해시키고, 상온으로 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 후 최종적으로 물을 첨가 하여 100 중량%로 맞추어 샴푸를 제조하였다.

제제예 4. 헤어컨디셔너

제제예 4-1. [N-메틸-D-알라닌 ³ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] 사이클로스포린 A ([N-methyl-D-alanine ³ ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] cyclo sporin A)함유 헤어컨디셔너의 제조

표 16 에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소 를 첨가 혼합하여 헤어콘디셔너를 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

제제예 4-2.

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ][알라닌 티오아미드 ⁷ ] 사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [alanine thioamide ⁷ , ⁷ Ψ ⁸ CS-NH] cyclosporin A)함유 헤어컨디셔너의 제조

표 17 에 나타낸 3가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어콘디셔너를 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

제제예 4-3.

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁹ ] 사이클로스포린 A ( [γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [γ-hydroxy-N- methyl-L-leucine ⁹ ] cyclosporin A) 함유 헤어컨디셔너의 제조

표 18 에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어콘디셔너를 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가하였다.

제제예 4-4.

[L-트레오닌 ² ][감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ] [L-루신 ⁵ ] [D-히드록시이소발레릭산 ⁸ ] [L-루신 ¹⁰ ] 사이클로스포린 A ([L-Threonine ² ][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine ⁴ ] [L-Leucine ⁵ ][D-2-hydroxyisovaleric acid ⁸ ] [L- Leucine ¹⁰ ] cyclosporin A) 함유 헤어컨디셔너의 제조

표 19 에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열 하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어콘디셔너를 제조 하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가 하였다.

제제예 4-5.

[감마 히드록시 N-메틸-L-루신 ⁴ ]사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methyl-L- leucine ⁴ ] cyclosporin A) 함유 헤어컨디셔너의 제조

표 20 에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80℃까지 가열 하여 완전히 녹였다. 제조된 80℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합 하여 헤어콘디셔너를 제조 하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량%로 맞추어 첨가 하였다.

실험예 1

(본 발명의 사이클로스포린 유도체의 항암화학요법에 의한 탈모 증상 억제 효과 시험)

생후 42∼49 일된 마우스(C57BL/6, female)를 사용하였다. 휴지기의 마우스 등판에 녹인 왁스/로진(rosin)혼합물을 바르고 나서 굳은 뒤 뜯어 모든 휴지기모를 제거 하고 성장기를 유도 한다. 성장기 유도후 후 7일 부터 11일까지 비면역 유도체와 (0.5%)와 CsA(0.5%)를 150ul씩 도포 하였고 9일 째 시클로포스파미드(cyclophosphamide, 증류수)를 체중당 150mg/kg이 되도록 복강내 1회 투여 했다. 그 뒤 탈모 현상 및 약효제에 의한 탈모 억제 현상을 관찰 하였다. 도 2에서 보듯이 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A ([γ-hydroxy-N-methy l-L-leucine⁴] cyclosporin A)에 의해 탈모 증상이 억제되는 것을 볼 수 있으며 억제된 즉 털이 남아 있는 면적의 비율을 동물당 평균으로 구하여 여러 유도체 효과를 비교하였다 (표 21).

실험예 2

무모생쥐(SKH1 strain) 젖먹이 각 4마리에 생후 11,13,15 및 17일째 평가 유도체를 콘오일에 2.5mg/ml로 조제하여 생쥐당 0.05ml을 복강내 주입 후 생후 20일째 사진촬영 하여 털이 다 빠진 대조군 과 유도체를 투여한 군의 털이 빠지지 않은 개체당 평균 면적을 비교하여 탈모억제 효과를 비교 하였다 (표22). 도 3은 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴]사이클로스포린 A를 투여한 군으로 탈모 억제 효과를 보여준다.

실험예 3

(사이클로스포린 A 유도체의 면역억제 시험)

면역 억제력 비교실험은 두 종의 다른 마우스 비장 세포를 혼합하여 측정하는 MLR법(mixed allogenic mixed lymphocyte reaction, J. Antibiotics, 1994; 47; 208∼215)을 사용하였다.

반응세포로 BALB/c 마우스 비장 세포와 자극 세포로 마이토마이신 처리된 C57BL/6 마우스 비장 세포를 동수로 혼합하고 여기에 다양한 사이클로스포린 A 와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 유도체를 처리하여 RPMI 배지(멀캅토에탄 올과 10% fetal bovine serum 함유)에 4일간 배양하였다. 4일 배양 후 ³H-thymidine을 첨가하여 4 시간 추가 배양한 후 세포로 유입된 티미딘(thymidine) 양을 측정(liquid scintillation counter)하여 각 물질의 IC₅₀(㎍/㎖)을 계산하였다.

그 결과 사이클로스포린 A의 IC₅₀(㎍/㎖) 는 0.022, 0.042, 0.040인 반면에 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 ([γ-hydroxy-N-methyl -L-leucine⁴] cyclosporin A)의 IC₅₀(㎍/㎖)는 5.2, 9.4, 9.5, [N-메틸-D-알라닌³] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 ([N-methyl -D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)의 IC₅₀(㎍/㎖)는 8.2, 8.8, 9.3, [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A는 10.1, 13.2, 13.9를 [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁹] 사이클로스포린 A는 18.2, 19.2, 17.2 및 [L-트레오닌²][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] [L-루신⁵][D-히드록시이소발레릭산⁸] [L-루신¹⁰] 사이클로스포린 A는 30.1, 29.0, 19.2를 보여 면역 억제력이 100 배 이상 감소한 것으로 나타났다.

즉, 사이클로스포린의 4 번 메틸루신의 감마 탄소 위치에 미생물 대사 과정에 의해 수산기가 첨가된 [감마 히드록시 N-메틸 L-루신⁴]사이클로스포린 유도체([ γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin derivatives)은 면역 억제력이 변형 전의 사이클로스포린 A에 비하여 매우 약하면서도 탁월한 탈모 억제 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과를 적용하여 액상, 스프레이, 겔, 페이스트, 유제, 크림, 콘디셔너, 샴푸 등의 다양한 제형이 가능하나 상업적으로 많이 이용되는 탈모억제토닉, 헤어크림, 헤어콘디셔너, 헤어샴푸를 제조하였고, 상기 실험예 1 및 실험예 2의 동물 평가 시험을 통하여 본 발명의 처리군이 대조군보다 우수한 탈모 억제 효과가 있는 것을 확인하였다.

본 발명은 사이클로스포린 유도체를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 및 방사요법 기인 탈모 증상(antineoplastic chemotherapy or radiation therapy-induced hair loss) 억제제로 면역 억제력이 변형 전의 사이클로스포린 A에 비하여 매우 약하면서도 탁월한 탈모 억제 효과를 유지하여 우수한 효과를 나타낸다.

Claims

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[N-메틸-D-알라닌³][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴] 사이클로스포린 A([N-methyl-D-alanine³][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴] cyclosporin A)를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 기인 탈모증상 억제제.
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[감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][알라닌 티오아미드⁷] 사이클로스포린 A([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴][alanine thioamide⁷, ⁷Ψ⁸ CS-NH] cyclosporin A)를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 기인 탈모증상 억제제.
[감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁴][감마 히드록시 N-메틸-L-루신⁹] 사이클로스포린 A([γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁴][γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine⁹] cyclosporin A)를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 기인 탈모증상 억제제.
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[L-트레오닌]²[감마 히드록시 N-메틸-L-루신]⁴[L-루신]⁵[D-2-히드록시이소발레릭산]⁸[L-루신]¹⁰사이클로스포린 A([L-Threonine]²[γ-hydroxy-N-methyl-L-leucine]⁴[L-Leucine]⁵[D-2-hydroxyisovaleric acid]⁸[L-Leucine]¹⁰cyclosporin A)를 유효성분으로 하는 항암 화학요법 기인 탈모증상 억제제.
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