KR100316604B1

KR100316604B1 - 모발 성장 효과를 갖는 비면역억제 사이클로스포린 에이유도체

Info

Publication number: KR100316604B1
Application number: KR1020000014837A
Authority: KR
Inventors: 김상년; 안호정; 김명기; 김종일; 김정훈; 이창우; 이민호; 김창덕; 조호성; 김현식; 정민환; 김승진
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지씨아이
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2001-12-12
Also published as: KR20010049236A

Abstract

본 발명은 사이클로스포린(cyclosporin) A 유도체를 유효성분으로 하는 면역 억제력은 매우 낮으며 발모력은 우수한 사이클로스포린(Cyclosporin) A 유도체를 주성분으로 하는 모발 성장 촉진제에 관한 것이다.

이를 위하여 본 발명은 사이클로스포린 A의 4 번 메틸루신의 감마 탄소 위치에 미생물 대사 과정에 의해 수산기가 첨가된 화학식 1로 나타내는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 유효성분으로 하는 모발 성장 촉진제를 제공한다.

본 발명의 사이클로스포린 A 유도체를 유효성분으로 하는 모발 성장 촉진제는 면역 억제력이 변형 전의 사이클로스포린 A에 비하여 매우 약하면서도 탁월한 모발 성장 효과를 유지하여 우수한 발모효과를 나타낸다.

Description

모발 성장 효과를 갖는 비면역억제 사이클로스포린 에이 유도체{Use of a nonimmunosuppressive cyclosporin A derivative for hair growth}

[산업상 이용분야]

본 발명은 사이클로스포린(cyclosporin) A 유도체를 유효성분으로 하는 면역 억제력은 매우 낮으며 발모력이 우수한 유지되는 모발 성장 촉진제에 관한 것이다.

[종래 기술]

인체의 모발은 약 10 만 내지 15 만 개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)를 거쳐 성장, 탈락한다. 이러한 주기는 3∼6 년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 일일 평균 50 내지 100 개의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다. 일반적으로 탈모증이라 함은 이러한 주기 중에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지는 것을 일컫는다.

탈모의 원인으로는 혈액순환 불량설, 남성호르몬 작용 과잉설, 피지 분비 과잉설, 과산화물, 세균 등에 의한 두피 기능 저하설, 유전적 요인, 노화, 스트레스 등이 논의되어 왔었다. 그러나 현재까지 탈모에 관한 명확한 원인은 밝혀져 있지 않으며, 최근 들어 식생활의 변화, 사회환경 등에 의한 스트레스의 증가 등으로 탈모로 고민하는 인구가 늘어나고 있는 추세이고 그 연령 또한 낮아지고 있으며, 여성의 탈모 인구도 늘어나고 있는 실정이다.

이러한 탈모증의 치료나 예방에 있어서 현재까지 가장 널리 사용되는 제제는 미녹시딜 함유 제제로서, 현재까지 미국 FDA의 승인을 받은 두 가지 발모제 성분중의 하나이다. 미녹시딜은 혈압강하의 목적으로 개발된 고혈압 치료제이었지만 사용상의 부작용으로 발모 현상이 나타나면서 현재에는 발모제로 더 유명한 약물이 되었다. 미녹시딜의 발모 작용 기전에 대해서는 정확히 밝혀져 있지는 않지만, 혈관 확장 효과를 통한 혈류량 증가로 모근에 영양을 공급하여 모발 성장을 촉진하는 것으로 생각되고 있다.

이러한 혈류량 증가 모델은 미녹시딜이 모근을 구성하는 주요세포인 모유두(dermal papilla)에서 혈관 확장에 관련된 성장 인자인 혈관내피성장 인자(VEGF; vascular endothelial growth factor)의 발현을 증가시킨다는 최근의 보고(Br. J. of Dermatol., 1998; 138; 407∼411)에 의해서 간접적으로 증명된다. 또한 미녹시딜의 발모효과 기전에 있어 혈관 확장 효과 이외에도 체외 배양 중인 모근의 모유두 세포 활성화(Skin Pharmacol., 1996; 9; 3∼8) 및 모낭 조직 배양에서 모낭의 성장을 촉진한다는 연구 보고(J. Invest. Dermatol., 1989; 92; 315∼320) 등은 미녹시딜이 모근에 직접적인 성장 인자로 작용함을 시사하고 있다.

이밖에 최근에 발매가 시작된 머크(Merck)사의 프로페시아(Propecia) 주성분인 피나스테라이드(finasteride)는 남성호르몬 테스토스테론이 더 강력한 형태의 남성호르몬인 디히드로테스토스테론으로 전환되는 것을 억제한다. 1997년 12월 남성형 탈모증의 치료제로 1 ㎎ 타블렛이 FDA로부터 사용 승인을 받아 현재 시판 중으로, 임상결과 유의할 만한 효과를 나타내는 것으로 판명되었으나 일부 남성 기능 억제 부작용도 보고되고 있다(J. Am. Acad. Dermatol., 1998; 39; 578∼589). 그러나 이 약물 또한 미녹시딜과 같이 임상효과가 그다지 탁월하지 못하고 부작용에대한 우려 때문에 좀 더 우수한 발모제 탐색연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 사이클로스포린 류는 대표적인 면역 억제제인 동시에 바이러스, 진균, 원생동물을 억제하는 효과 및 부작용으로 신장독성, 간독성, 고혈압, 치주조직 비대, 발모효과 등 다양한 생리효과를 갖고 있다(Advances in Pharmacol., 1996; 35; 114∼246 및 Drug Safety, 1994; 10; 310∼317). 그 중 대표적인 사이클로스포린 A는 여러 개의 N-메틸아미노산(N-methyl amino acid)과 8번 위치에 D-알라닌(D-alanine)을 갖는 11 개 아미노산으로 구성된 환형의 펩타이드로 다음의 구조식 1로 나타낸다.

[구조식 1]

상기 식에서,

MeBmt는 N-메틸-(4R)-4-[(E)-2-뷰텐일]-4-메틸-L-트레오닌(N-methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine)이며,

Abu는 L-α아미노부티릭산(L-αaminobutyric acid)이며,

Sar은 살코신(Sarcosine)이며,

MeLeu는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine)이며,

Val은 L-발린(L-valine)이며, Ala는 L-알라닌(L-alanine)이며,

DAla는 D-알라닌(D-alanine)이며,

MeVal은 N-메틸-L-발린(N-methyl-L-Valine)이다.

또한 상기 사이클로스포린 A의 아미노산의 형태는 다른 언급이 없으면 L-배치(L-configuration)이다.

여러가지 부작용 중에서 모 과대 성장(발모) 부작용을 이용한 발모제로 개발 가능성이 그동안 여러 연구에 의해 수행되어 왔다. 그 중에는 동물 발모실험(Arch, Dermatol. Res., 1996; 288; 408∼410), 인간 원형 탈모증(J. Am. Acad. Dermatol., 1990; 22; 242∼250), 인간 남성형 탈모증(J. Am. Acad. Dermatol., 1990; 22; 251∼253 및 Skin Pharmacol., 1994; 7; 101∼104) 및 화학요법에 의한 탈모 동물 모델에서도 탈모억제 효과(Clin. Lab. Invest., 1995; 190; 192∼196 및 Am. J. Pathol., 1997; 150; 1433∼1441) 등 매우 광범위하게 연구되었고 마우스 등판 실험 결과로 비교한다면 미녹시딜 보다 약 100배 정도 우수한 효과를 보여주고 있다. 이런 결과를 토대로 사이클로스포린을 남성형 탈모증에 발모제로 활용하고자 하는 노력의 결과로 여러 특허가 출원되었다.

예를 들어 일본공개 특허공보 소60-243008호, 소62-19512호, 및 소62-19513호와 8 번 위치가 변형된 사이클로스포린 유도체(유럽특허 공개공보 제0414632B1호), 이소 사이클로스포린(세계 특허 공개공보 제93/17039호) 등에서는 이들 사이클로스포린 및 유도체를 이용한 발모제를 제공하고 있고, 미국특허 제5,807,820호 및 영국특허 2,218,334A호에서는 사이클로스포린의 경피 흡수가 우수한 제제를 통하여 발모제로 활용을 모색하고 있으나, 여기에 사용된 모든 사이클로스포린 류들은 강력한 면역 억제력을 갖고 있어서 일반 탈모 증상에 사용하기에는 비록 발모 효과가 우수하다고 하여도 면역억제라는 심각한 부작용을 갖고 있어서 사용에 많은한계가 있다.

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 고려하여, 사이클로스포린의 발모효과가 반드시 사이클로스포린 분자의 면역억제력이 필수조건이 아님이 밝혀지고 있음(Iwabuchi 등의 J. Dermatol. Sci., 1995; 9; 64∼69)에 착안하여 사이클로스포린의 다양한 분자변형을 통하여 발모효과는 유지되고, 면역억제력은 상실된 신규의 모발 성장 촉진제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이와 유사한 접근 방법으로 면역억제력은 감소하면서도, 후천성면역겹핍증(AIDS)원인 바이러스(HIV)억제력은 유지되는 유도체 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 4번 아미노산 변형 유도체인 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 ([γ-hydroxy-MeLeu⁴]cyclosporin)A, [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A([MeIle⁴] cyclosporin A), 및 [메틸발린⁴]사이클로스포린 A([MeVal⁴]cyclosporin A) 등 유도체가 신규 항 HIV 바이러스제로 특허(유럽특허484281 A2, 미국특허 5,767,069) 및 문헌(J. Virol., 1995;69:2451-2461, J. Antibiotics, 1996;49:781-787)에 보고되었다. 본 발명에서는 4번의 원래 아미노산인 메틸루신 대신 구조가 유사한 감마 히드록시메틸루신, 메틸이소루신, 메틸발린, 루신, 이소루신으로 치환된 유도체를 포함한 여러 유도체를 대상으로 발모실험 및 면역억제력을 평가하여 유일하게 발모효과는 유지되면서도 면역억제력은 상실된 신규 모발성장 촉진제인 [감마 히드록시메틸루신⁴] 사이클로스포린A([γ-hydroxy-MeLeu⁴] cyclosporin A)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 미생물에 의해 변환된 사이클로스포린 A 유도체와 변환되지 않은 사이클로스포린 A의 액체 크로마토그래피 결과.

도 2는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 분취 후 다시 주입하여 얻어진 액체 크로마토그래피의 결과.

도 3은 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 동시에 주입하여 분리한 액체 크로마토그래피의 결과.

도 4는 사이클로스포린 A의 전자분무이온화법(ESI; Electro-Spray Ionization)을 이용한 질량 스펙트럼(Mass Spectrum)의 결과로, m/z 1202.8에서 [M(사이클로스포린 유도체) + H]의 피크.

도 5는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 전자분무이온화법(ESI; Electro-Spray Ionization)을 이용한 LCQ 매스 스팩트로미터(Mass Spectrometer)의 결과로, 사이클로스포린에 비해 분자량이 16 증가한 m/z 1218.5에서 [M(사이클로스포린 유도체) + H]의 피크.

도 6은 사이클로스포린 A의 CID(Collision Induced Dissociation)의 실험결과.

도 7은 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 CID 실험 결과를 조각 이온질량 스펙트럼으로 비교한 표.

도 8은 사이클로스포린 A의¹³C-NMR 스팩트럼.

도 9는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의¹³C-NMR 스팩트럼.

도 10은 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A 분자의 새로운 69 ppm 피크 탄소에 대한 DEPT(Distortionless enhancement by polarization transfer) 실험결과로 수산기가 4급 탄소(quaternary carbon)에 붙어 있음.

도 11은 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의¹³C-NMR 스팩트럼을 나타낸 것으로, 미생물에 의해 없어진 피크가 25 ppm 근처에 있음.

도 12는 사이클로스포린 A 분자 중 사라진 피크 근처에 대한 DEPT 실험결과로, 4 개의 메틸루신 내의 메틴탄소 4 개를 나타낸 것.

도 13은 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A 분자의 DEPT 실험결과이며, 도 12와 비교할 때 사라진 피크가 메틸루신 내 메틴탄소임을 나타낸 것.

도 14는 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가실험한 사진으로 대조군을 나타낸 것.

도 15는 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가실험한 사진으로 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

도 16은 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가실험한 사진으로 사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

도 17은 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A, [메틸발린⁴]사이클로스포린 A, [루신⁴]사이클로스포린 A, [이소루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가한 사진으로 대조군을 나타낸 것.

도 18은 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A, [메틸발린⁴]사이클로스포린 A, [루신⁴]사이클로스포린 A, [이소루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가한 사진으로 사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

도 19는 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A, [메틸발린⁴]사이클로스포린 A, [루신⁴]사이클로스포린 A,[이소루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가한 사진으로 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

도 20은 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A, [메틸발린⁴]사이클로스포린 A, [루신⁴]사이클로스포린 A, [이소루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가한 사진으로 [메틸발린⁴]사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

도 21은 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A, [메틸발린⁴]사이클로스포린 A, [루신⁴]사이클로스포린 A, [이소루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가한 사진으로 [루신⁴]사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

도 22는 C57BL/6 마우스를 이용한 사이클로스포린 A와 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A, [메틸발린⁴]사이클로스포린 A, [루신⁴]사이클로스포린 A, [이소루신⁴]사이클로스포린 A의 발모 효과를 평가한 사진으로 [이소루신⁴]사이클로스포린 A를 적용한 군을 나타낸 것.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 사이클로스포린 A의 4 번 메틸루신의 감마탄소 위치에 미생물 대사 과정에 의해 수산기가 첨가된 하기 화학식 1로 나타내는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 유효성분으로 하는 모발 성장 촉진제를 제공한다.

[화학식 1]

상기 식에서,

Abu는 L-α아미노부티릭산(L-αaminobutyric acid)이며,

Sar은 살코신(Sarcosine)이며,

HMeLeu는 감마 히드록시메틸루신(γ-hydroxy-methylleucine)이며,

Val은 L-발린(L-valine)이며,

MeLeu는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine)이며,

Ala는 L-알라닌(L-alanine)이며, DAla는 D-알라닌(D-alanine)이며,

MeVal은 N-메틸-L-발린(N-methyl-L-Valine)이다.

또한 상기 조성물의 제형이 액상, 스프레이, 겔, 페이스트, 유제, 크림, 콘디셔너, 또는 샴푸인 모발성장 촉진제를 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.

[작 용]

발모 효과는 유지하면서 면역 억제력이 없는 유도체를 발굴하여 신규 발모성분으로 개발하고자 하기 참고예의 사이클로스포린 A의 유도체를 합성 및 변형 제조하여 발모 평가 실험을 실시한 결과, 변형 전 사이클로스포린 A에 비교하여 대부분 효과가 현격히 감소하는 것으로 관찰되었다.

그러나 사이클로스포린 A와 본 발명의 미생물에 의해 변형된 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 비교 실험한 결과 발모 효과가 그대로 유지되는 것을 발견하였다.

[참고예]

참고예 1

([메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A([MeIle⁴]cyclosporin A)의 제조)

데카펩타이드(H-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Ac) -Abu-Sar-OMe)를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate)와 디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyrid ine)을 축합시약으로 사용하여 박-메틸이소루신(Boc-MeIle-OH)과 축합한 후 얻은 운데카펩타이드를 소듐히드록시드(NaOH)와 트리플루오로아세틱에시드(TFA)로 보호기를 제거한 후 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dime thylamino)-phosphonium hexafluorophosphate)와 디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine)을 사용하여 고리화반응을 하여 치환된 사이클로스포린 A-아세테이트를 얻은 후 소듐메톡사이드(NaOMe)를 사용하여 아세틸을 제거하여 [메틸이소루신⁴]사이클로스포린 A을 얻었다.

참고예 2

([메틸발린⁴]사이클로스포린 A([MeVal⁴]cyclosporin A)의 제조)

참고예 1의 제조방법 중 박-메틸이소루신(Boc-MeIle-OH) 대신 박-메틸발린(Boc-MeVal-OH)을 사용하여 [메틸발린⁴]사이클로스포린 A([MeVal⁴] cyclosporin A)을 합성하였다.

참고예 3

([루신⁴]사이클로스포린 A([Leu⁴]cyclosporin A)의 제조)

참고예 1의 제조방법 중 박-메틸이소루신(Boc-MeIle-OH) 대신 박-루신(Boc-Leu-OH)을 사용하여 [루신⁴]사이클로스포린 A([Leu⁴] cyclosporin A)를 합성하였다.

참고예 4

([이소루신⁴]사이클로스포린 A([Ile⁴]cyclosporin A)의 제조)

참고예 1의 제조방법 중 박-메틸이소루신(Boc-MeIle-OH) 대신 박-이소루신(Boc-Ile-OH)을 사용하여 [이소루신⁴]사이클로스포린([Ile⁴] cyclosporin) A를 합성하였다.

참고예 5

(사이클로스포린 A-아세테이트의 제조)

3.6 g(30 m㏖)의 사이클로스포린A를 테트라하이드로퓨란 100 ㎖에 녹인 후 아세틱 엔하이드라이드 1.5 당량, 트리에틸아민 1.5 당량, 디메틸 아미노피리딘 0.3 g을 넣고 18 시간 환류한 후, 용매를 감압 증류한 후, 에틸아세테이트에 녹인 후 물로 씻어주고 유기층을 날린 후, 크로마토그래피로 정제하여 3.2 g의 사이클로스포린A-아세테이트를 얻었다.

참고예 6

(세코-사이클로스포린운데카펩타이드(H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe))

상기 사이클로스포린A-아세테이트 3.2 g을 디클로로메탄 30 ㎖에 녹인 후, 2.5 당량의 트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트((CH₃)₃O⁺BF₄ ^-)를 넣고 실온에서 20 시간 교반한 후, 1.2 g 당량의 메탄올에 녹아있는 나트륨메톡사이드를 첨가하여30 분간 교반하고, 1 몰 황산수용액 10 ㎖과 메탄올 10 ㎖을 넣고 15 분간 산 가수분해한 후, 용매를 감압증류하고 크로마토그래피로 정제하여 2.0 g의 세코-사이클로스포린 운데카펩타이드를 얻었다(Wenger, The European Peptide Society, 1998; 173∼177).

참고예 7

([데스-메틸루신⁴]사이클로스포린A-아세테이트([Des-MeLeu⁴]-cyclosporin A-acetate)의 제조)

상기 세코-사이클로스포린 운데카펩타이드를 에드만 방법(Eur. J. Biochem., 1967; 1; 80)으로 메틸루신을 제거한 후 고리화 반응으로 [데스-메틸루신⁴]사이클로스포린A-아세테이트를 얻었다.

참고예 8

([데스-메틸루신⁴]사이클로스포린A([Des-MeLeu⁴]-cyclosporin A)의 제조)

상기 [데스-메틸루신⁴]사이클로스포린A-아세테이트를 메탄올에 녹아있는 소듐메톡사이드(NaOCH₃)를 첨가하여 3시간 교반 후 아세트산으로 산성화한 후 용매를 감압증류하고 정제하여, [데스-메틸루신⁴]사이클로스포린A를 얻었다.

참고예 9

([데스-메틸루신⁴, 데스-발린⁵]사이클로스포린 A-아세테이트의 제조)

[데스-메틸루신⁴]사이클로스포린 A와 같은 합성방법으로 [데스-메틸루신⁴, 데스-발린⁵]사이클로스포린 A를 얻었다.

참고예 10

([Xaa1]-사이클로스포린 A의 제조)

MeBmt 대신에 다른 아미노산으로 치환된 6 종의 테트라펩타이드(Fmoc-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-OH)와 헵타펩타이드(H-Xaa-Abu-Sar-MeLeu- Val-MeLeu-Ala-Obzl)을 BOP시약을 축합시약으로 사용하여 4+7 조각 축합한다. 얻어진 운데카펩타이드에 가수분해로 C-말단의 벤질기를 제거하고 N-말단의 Fmoc- 그룹을 제거한 후 프로필포스포닉 안하이드라이드(propylphosphonic anhydride)와 4-(디메틸아미노)피리딘(4-(dimethyl amino)pyridine)을 사용하여 고리화 반응을 하고 필요한 경우 Xaa1의 곁사슬 보호기를 제거하여 최종 생성물을 얻었다.

이 반응은 다음의 반응식 1에 나타내었다.

[반응식 1]

상기 식에서,

Xaa1은 치환된 아미노산으로 Leu, Phe, MeLeu, Gly, Ala, 또는 MeVal이다.

이하의 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1

([감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 제조)

여기에서는 미생물에 의해 변형 후 발모효과가 유지되는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 제조를 기술한다.

먼저 사이클로스포린 유도체를 제조하기 위하여 사용된 균주는 Sebekia benihana KCTC 9173이며, 배양배지는 글루코즈(glucose) 0.7 , 효모 추출물(yeast extract) 0.45 , 멕아엑스(malt extract) 0.5 , 수용성 풀(soluble starch) 1.0 , 탄산칼슘(CaCO₃) 0.005 가 포함된 배지이며, 배양온도는 27 ℃였다(J. Antibiotics, 1996; 49; 781∼787).

발효기를 이용하여 균주를 배양할 때는 먼저 4 일간 삼각 플라스크를 이용하여 전배양 한 후, 4 ℓ발효기에서 상기 배지를 이용하여 배양하였다.

본 배양이 시작되고 24 시간이 지난 후 메탄올에 녹인 사이클로스포린을 배지에 100 ㎎/ℓ의 농도로 첨가하고 72 시간을 더 배양하였다.

배양이 끝난 후 시료의 회수를 위하여 전체 배양액을 배지와 같은 양의 에틸아세테이트로 추출한 후 유기 용매층을 농축하고 농축한 시료는 액체 크로마토그래피로 분리 및 분취하였다. 이 때의 사이클로스포린 A와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 유도체를 보여주는 액체 크로마토그래피 결과를 도 1에 나타내고, [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 분리한 액체 크로마토그래피의 결과를 도 2에 나타내고, 사이클로스포린 A와 분리된 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 동시에 주입하여 분리한 액체 크로마토그래피 결과를 도 3에 나타내었다.

이때 사용한 분리조건은 C-18 컬럼을 사용하였으며, 용매조건은 2 분까지 100 용매 A로 흘려주고 4 분까지 용매 A의 농도를 60 로 낮춘 후 60 분까지 용매 A의 농도를 39 까지 서서히 감소시켜 시료를 용출시킨 후 65 분까지 다시 원래의 조건인 100 용매 A로 변화시키는 조건을 사용하였다. 이때 용매 A는 25 메탄올 수용액이며, 용매 B는 100 아세토니트릴이다.

실시예 2

([감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 구조 확인)

분취된 사이클로스포린 A 유도체의 구조를 분석하기 위하여 전자분무 이온화법(ESI; electro-spray ionization)을 이용한 LCQ 질량분석기(Mass spectrometer, Finnigan, CA)를 이용하였다. 실험은 사이클로스포린 A와 사이클로스포린 유도체를 상호 비교하는 방법으로 행하였다.

각각의 분자량을 확인하기 위한 ESI-MS 실험에서 사이클로스포린 A 는 m/z1202.8에서 [M(사이클로스포린) + H] 피크(도 4)를 나타내었고 , 사이클로스포린 유도체는 사이클로스포린에 비하여 분자량이 16 증가한 m/z 1218.5에서 [M(사이클로스포린 유도체) + H] 피크(도 5)를 나타내었다. 또한 인위적으로 나트륨을 첨가하여 같은 실험을 반복한 결과 사이클로스포린은 m/z 1224.7에서 [M(사이클로스포린) + Na] 피크가 검출되었고, 사이클로스포린 유도체는 m/z 1240.7에서 [M(사이클로스포린 유도체) + Na] 피크가 관찰되었다. 이상의 결과로부터 사이클로스포린 A 유도체는 사이클로스포린 분자에 수산기가 첨가(hydroxylation)된 것으로 추정할 수 있었다.

사이클로스포린의 11 개 아미노산 중 변형(hydroxylation)이 일어난 아미노산의 위치를 확인하기 위하여 CID(collision induced dissociation)법을 이용하였다. CID법으로 조각 이온(fragment ion)을 형성시킨 후 사이클로스포린 A로부터 형성된 조각 이온 패턴(도 6)과 사이클로스포린 A 유도체로부터 생성된 조각 이온 패턴을 비교 분석하였다. 도 7의 조각 이온 패턴을 참조하면 다른 아미노산들의 조각 이온은 질량값의 변화가 없고 4 번 위치의 아미노산(leucine)이 포함된 조각 이온 피크들의 질량값들이 16 증가한 것으로 나타났다. 이로써, 4 번 위치의 아미노산에 변형이 일어났다는 것을 알 수 있었다.

상기 실험에서 밝혀진 4 번 아미노산에 첨가된 수산기의 위치를 확인하기 위하여 추가로 NMR(ARX 300 ㎒, Bruker, 독일) 실험을 수행하였다.

우선 사이클로스포린 A(도 8)와 사이클로스포린 A 유도체(도 9)의¹³C-NMR 스팩트럼을 비교한 결과 추가된 수산기를 포함하는 탄소의 화학적 이동(chemical shift)을 나타내는 새로운 피크(δ 69.00 ppm)가 확인되었다.

이 피크의 탄소위치를 알기 위하여 DEPT(distortionless enhancement by polarization transfer)(도 10) 실험 결과 수산기가 4급 탄소(quaternary carbon)에 붙어 있음을 알았고, 이 4급화는 4 번 아미노산의 감마탄소(γ-carbon) 위치에 수산기 첨가(hydroxylation)에 의해 되었음을 확인하였다. 만일 4급화가 4 번 아미노산의 환형을 이루는 α-탄소에 일어났다면 90 ppm 근처의 다운필드(down field)로 이동(shift) 되었을 것이다.

도 11은 미생물에 의해 없어진 피크가 25 ppm 근처에 있고, DEPT 실험결과 이는 사이클로스포린 A 분자 내 4 개 메틸루신의 감마탄소인 4 개의 메틴(methine) 탄소(도 12) 중 하나가 없어졌음을 알 수 있다(도 13).

종합하면, 전자분무이온화법과 CID를 이용한 메스 스펙트럼법 결과 4번 아미노산(methyl leucine)에 수산기가 첨가되었고, 그 위치는 NMR 실험결과 감마위치 탄소에 수산기가 첨가되었음을 알 수 있었다.

실시예 3

(사이클로스포린 A 유도체 함유 발모토닉의 제조)

표 1에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료를 혼합하고 교반하여 완전히 녹여서 발모토닉을 제조하였다.

구 분(중량)	제형 1	제형 2	제형 3
에탄올	40.0	40.0	40.0
[감마히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A	0.1	1.0	8.0
초산토코페롤	0.1	0.1	0.1
살리실산	0.3	0.3	0.3
엘-멘톨	0.3	0.3	0.3
트윈 20	0.5	0.5	0.5
향료	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량
물	나머지	나머지	나머지

실시예 4

(사이클로스포린 A 유도체 함유 헤어크림의 제조)

표 2에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80 ℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80 ℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합하여 헤어크림을 제조하였다. 물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량로 맞추어 첨가하였다.

구 분(중량)	제형 1	제형 2	제형 3
유상원료	파라핀	5.0	5.0	5.0
	세토스테아릴알코올	5.5	5.5	5.5
	페트로라튬	5.5	5.5	5.5
	글리세린모노스테아레이트	3.0	3.0	3.0
	폴리옥시에틸렌옥틸도데실에테르	3.0	3.0	3.0
	프로필파라벤	0.3	0.3	0.3
	[감마히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A	0.1	1.0	8.0
수상원료	글리세린	7.0	7.0	7.0
	디프로필렌글리콜	20.0	20.0	20.0
	폴리에틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0
	물	45.6	44.7	37.7
향료	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량

실시예 5

(사이클로스포린 A 유도체 함유 샴푸의 제조)

표 3에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 향료, 색소, 및 물을 제외한 원료들을 혼합한 후 가열하면서 교반하여 완전히 용해시키고, 상온으로 냉각한 후 향료와 색소를 첨가한 후 최종적으로 물을 첨가하여 100 중량로 맞추어 샴푸를 제조하였다.

구 분(중량)	제형 1	제형 2	제형 3
POE라우릴황산나트륨(30 중량수용액)	40.0	40.0	40.0
야자유지방산 디에탄올아미드	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	2.0	2.0	2.0
파라옥시안식향산메틸	0.2	0.2	0.2
에탄올	2.0	2.0	2.0
[감마히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A	1.0	3.0	10.0
살리실산	0.3	0.3	0.3
엘-멘톨	0.3	0.3	0.3
향료	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량
물	나머지	나머지	나머지

실시예 6

(사이클로스포린 A 유도체 함유 헤어컨디셔너의 제조)

표 4에 나타낸 3 가지 제형으로 각각의 원료 중 유상원료 및 수상원료를 각각 별도로 혼합하고 80 ℃까지 가열하여 완전히 녹였다. 제조된 80 ℃의 유상원료와 수상원료를 혼합하고 유화시킨다. 유화완료 후 상온까지 냉각한 후 향료와 색소를 첨가 혼합하여 헤어컨디셔너를 제조하였다.

물량은 유상원료와 수상원료의 합을 100 중량로 맞추어 첨가하였다.

구 분(중량)	제형 1	제형 2	제형 3
유상원료	세탄올	3.0	3.0	3.0
	자기유화형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0
	스쿠알렌	10.0	10.0	10.0
	[감마히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A	1.0	5.0	10.0
수상원료	프로필렌글리콜	2.0	2.0	2.0
	염화스테아릴디메틸벤질암모늄(25 중량수용액)	8.0	8.0	8.0
	파라옥시안식향산메틸	0.2	0.2	0.2
	살리실산	0.3	0.3	0.3
	엘-멘톨	0.3	0.3	0.3
	물	73.2	69.2	64.2
향 료	적량	적량	적량
색 소	적량	적량	적량

실험예 1

(사이클로스포린 A 유도체의 모발 성장 촉진 효과 시험)

모발 성장 촉진 효과 시험은 생후 42∼49 일이 된 마우스(C57BL/6, female)를 사용하였다.

먼저 등 부위의 털을 전기면도기로 제거하고, 각 마우스의 무게를 재서 몸무게를 고루 분산이 되도록 10 마리씩 나누었다. 하루 동안 적응 기간을 두고 다음날부터 제모 부위에 상기 실시예 1의 HPLC 분취액을 도포하였으며, 이때 개체 당 등 부위에 1 일 1 회, 100 ㎕(0.1 w/v)를 30 일간 도포하였다. 그 결과는 털이 자란 정도를 육안판정하고 사진 촬영하였다.

도 14 내지 도 16에서 보는 바와 같이 베히클(vehicle)만을 도포한 대조군에 비해 사이클로스포린 A와 그 유도체인 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A(실시예 1)를 도포한 경우 현저한 모발 성장 촉진 효과가 있었으며, 변형 전후의 차이는 매우 근소하였으나, 나머지 유도체(참고예 5∼10에 언급된 11종 유도체)의 효과는 거의 대조군 수준으로 효과없음을 알았다.

도 17내지 도 22에서는 발모효과가 증명된 [감마히드록시메틸루신⁴]과 유사한 변형체(참고예 1∼4)와 사이클로스포린 A와 비교실험으로 [메틸루신⁴](도 19), [메틸발린⁴](도 20), [루신⁴](도 21), [이소루신⁴](도 22)이 사이클로스포린 A(도 18)보다 현격히 떨어짐을 알 수 있었다. 즉 사이클로스포린 A 유도체 여러 종을 제조하여 발모 평가를 비교한 결과 단지 [감마히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A만 효과를 유지하였음을 관찰하였다.

30 일 실험과정 중 등판 상태를 비교한 결과 대조군 및 모든 처리군에서 특이한 피부자극 소견이 발견되지 않았다.

실험예 2

(사이클로스포린 A 유도체의 면역억제 시험)

면역 억제력 비교실험은 두 종의 다른 마우스 비장 세포를 혼합하여 측정하는 MLR법(mixed allogenic mixed lymphocyte reaction, J. Antibiotics, 1994; 47; 208∼215)을 사용하였다.

반응세포로 BALB/c 마우스 비장 세포와 자극 세포로 마이토마이신 처리된 C57BL/6 마우스 비장 세포를 동수로 혼합하고 여기에 다양한 사이클로스포린 A 와 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 처리하여 RPMI 배지(멀캅토에탄올과10 fetal bovine serum 함유)에 4 일간 배양하였다. 4 일 배양 후³H-thymidine을 첨가하여 4 시간 추가 배양한 후 세포로 유입된 티미딘(thymidine) 양을 측정(liquid scintillation counter)하여 각 물질의 IC₅₀(㎍/㎖)을 계산하였다.

그 결과 사이클로스포린 A의 IC₅₀(㎍/㎖)는 0.034, 0.05, 0.031인 반면에 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A의 IC₅₀(㎍/㎖)는 5.3, 6.8, 5.3을 보여 면역 억제력이 100 배 이상 감소한 것으로 나타났으며, 이는 문헌(J. Antibiotics, 1996, 49, 781∼787, 및 J. Virol., 1995; 69; 2451∼2461)과 유사한 수준이었다.

즉, 사이클로스포린의 4 번 메틸루신의 감마 탄소 위치에 미생물 대사 과정에 의해 수산기가 첨가된 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A{(γ-hydroxy-methyl-leucine⁴]cyclosporin A}은 면역 억제력이 변형 전의 사이클로스포린 A에 비하여 매우 약하면서도 탁월한 모발 성장 효과를 유지하는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과를 적용하여 액상, 스프레이, 겔, 페이스트, 유제, 크림, 콘디셔너, 샴푸 등의 다양한 제형이 가능하나 상업적으로 많이 이용되는 발모토닉, 헤어크림, 헤어콘디셔너, 헤어샴푸를 제조하였고, 상기 실험예 1의 동물 평가 시험을 통하여 본 발명의 처리군이 대조군보다 우수한 발모 효과가 있는 것을 확인하였다.

Claims

면역억제력은 없으며, 발모효과가 우수한 화학식 1로 나타내는 [감마 히드록시메틸루신⁴]사이클로스포린 A를 유효성분으로 하는 모발 성장 촉진제:

[화학식 1]

상기 식에서,

MeBmt는 N-메틸-(4R)-4-[(E)-2-뷰텐일]-4-메틸-L-트레오닌(N-methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine)이며,

Abu는 L-α아미노부티릭산(L-αaminobutyric acid)이며,

Sar은 살코신(Sarcosine)이며,

HMeLeu는 감마 히드록시메틸루신(γ-hydroxy-methylleucine)이며,

Val은 L-발린(L-valine)이며,

MeLeu는 N-메틸-L-루신(N-methyl-L-leucine)이며,

Ala는 L-알라닌(L-alanine)이며,

DAla는 D-알라닌(D-alanine)이며,

MeVal은 N-메틸-L-발린(N-methyl-L-Valine)이다.
제 1 항에 있어서,

상기 모발 성장 촉진제의 제형이 액상, 스프레이, 겔, 페이스트, 유제, 크림, 콘디셔너 및 샴푸로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 모발 성장 촉진제.