ES3050283T3 - Factor ix polypeptides and methods of use thereof - Google Patents

Factor ix polypeptides and methods of use thereof

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ES3050283T3
ES3050283T3 ES19156074T ES19156074T ES3050283T3 ES 3050283 T3 ES3050283 T3 ES 3050283T3 ES 19156074 T ES19156074 T ES 19156074T ES 19156074 T ES19156074 T ES 19156074T ES 3050283 T3 ES3050283 T3 ES 3050283T3
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Glenn Pierce
Samantha Truex
Robert Peters
Haiyan Jiang
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Abstract

La presente invención proporciona métodos para administrar Factor IX; métodos para administrar polipéptidos quiméricos e híbridos que comprenden Factor IX; polipéptidos quiméricos e híbridos que comprenden Factor IX; polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos quiméricos e híbridos; células que comprenden dichos polinucleótidos; y métodos para producir dichos polipéptidos quiméricos e híbridos utilizando dichas células. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Polipéptidos del factor IX y métodos de uso de los mismos
[0003] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0004] La presente invención se refiere en general al campo de los compuestos terapéuticos para trastornos hemostáticos.
[0005] Antecedentes de la técnica
[0006] La hemofilia B (también conocida como enfermedad de Navidad) es uno de los trastornos hemorrágicos hereditarios más comunes en el mundo. Da como resultado una disminución de la actividad de coagulación de la sangre in vivo e in vitro y requiere un control médico exhaustivo a lo largo de la vida del individuo afectado. En ausencia de intervención, el individuo afectado sufrirá de hemorragia espontánea en las articulaciones, que produce dolor intenso e inmovilidad debilitante; la hemorragia en los músculos da como resultado la acumulación de sangre en esos tejidos; la hemorragia espontánea en la garganta y el cuello puede causar asfixia si no se trata inmediatamente; también son predominantes la hemorragia renal; y la hemorragia grave después de la cirugía, lesiones accidentales menores o extracciones dentales.
[0007] La coagulación de la sangre in vivo normal requiere como mínimo los factores de serina proteasas II (protrombina), VII, IX, X y XI (proteínas plasmáticas solubles); cofactores que incluyen el factor tisular de la proteína transmembranaria y las proteínas plasmáticas factores V y VIII; fibrinógeno, el factor de transglutaminasa XIII, fosfolípido (incluidas las plaquetas activadas) y calcio. Se requieren proteínas adicionales, incluyendo la calicreína, cininógeno de alto peso molecular y factor XII, para algunas pruebas de coagulación in vitro, y pueden desempeñar un papel in vivo en condiciones patológicas.
[0008] En la hemofilia, la coagulación de la sangre se ve alterada por la falta de ciertos factores de coagulación de la sangre en plasma. La hemofilia B está causada por una deficiencia en el factor IX que puede dar como resultado la disminución de la síntesis de la proteína del factor IX o de una molécula defectuosa con actividad reducida. El tratamiento de la hemofilia se produce mediante la sustitución del factor de coagulación ausente por concentrados de factor exógeno altamente enriquecidos en factor IX. Sin embargo, la generación de dicho concentrado a partir de sangre está plagado de dificultades técnicas, como se describe a continuación.
[0009] La purificación del factor IX a partir del plasma (factor IX derivado del plasma; pdFIX) produce casi exclusivamente el factor IX activo. Sin embargo, dicha purificación del factor IX a partir de plasma es muy difícil debido a que el factor IX solo está presente en una concentración baja en plasma (5 ug/ml. Andersson, Thrombosis Research 7: 451459 (1975). Además, la purificación de la sangre requiere la eliminación o inactivación de agentes infecciosos, tales como VIH y VHC. Además, pdFIX tiene una semivida corta y, por lo tanto, requiere una administración frecuente. También está disponible el factor IX recombinante (rFIX), pero adolece de la misma semivida corta y necesidad de administración frecuente (por ejemplo, 2-3 veces por semana para la profilaxis) que pdFIX. rFIX también tiene una recuperación incremental menor (valor de K) en comparación con pdFIX, lo que requiere el uso de dosis más altas de rFIX que las de pdFIX. Peters et al. (Blood 2010, Vol. 115(10): 2057-2064) divulga proteínas de fusión de unión a FIX y FcRn y su administración en ratones y perros. Shapiro et al. (Haemophilia 2010, vol. 16(Supl. 4): 30) informan de la seguridad y la actividad prolongada de una dosis única de FIXFc recombinante administrada a pacientes adultos con hemofilia B. La reducción de la mortalidad, la prevención del daño articular y la mejora de la calidad de vida han sido logros importantes debido al desarrollo del factor IX recombinante y derivado del plasma. La protección prolongada contra la hemorragia representaría otro avance clave en el tratamiento de pacientes con hemofilia B. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado productos que permitan una protección prolongada. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de polipéptidos del factor IX mejorada que sean más tolerables y más eficaces que las terapias actuales.
[0010] BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0011] La presente invención proporciona la administración de polipéptidos del factor IX quiméricos para su uso en un método para tratar profilácticamente hemorragias o episodios hemorrágicos en un sujeto humano con hemofilia B como se define en las reivindicaciones adjuntas. Específicamente, la presente invención proporciona un polipéptido del factor IX quimérico ("FIX") que comprende FIX humano que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 1 a 415 de la SEQ ID NO: 2 y Fc humano como compañero de unión a FcRn, para su uso en un método para tratar profilácticamente hemorragias o episodios hemorrágicos en un sujeto humano con hemofilia B, que comprende administrar por vía intravenosa al sujeto humano múltiples dosis de 50 UI/kg a 100 UI/kg del polipéptido FIX quimérico a un intervalo de administración de 9 días a 18 días. Aspectos y realizaciones adicionales se divulgan en las reivindicaciones adjuntas.
[0012] En algunas realizaciones, el nivel plasmático del polipéptido quimérico alcanza un mínimo promedio de al menos aproximadamente 1 UI/dl después de al menos aproximadamente 6 días en al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de una población de pacientes o alcanza un mínimo de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 UI/dl después de al menos aproximadamente 6 días en un sujeto. En algunas realizaciones, el nivel plasmático de dicho polipéptido quimérico alcanza un mínimo promedio de aproximadamente 1-5 o 1-3 UI/dl. Dicho mínimo o mínimo promedio puede alcanzarse después de aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, o aproximadamente 40 días.
[0013] En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico tiene una fosforilación y sulfatación muy reducidas en comparación con el factor IX derivado del plasma. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico está menos del 25 % fosforilado y menos del 25 % sulfatado, por ejemplo, menos del 25 % totalmente fosforilado y sulfatado. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico está fosforilado menos de aproximadamente el 10 % y sulfatado menos de aproximadamente el 9 %. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico tiene un patrón/distribución de carboxilación gamma, un contenido de carboxilación gamma, un patrón/distribución de sialilación y/o un contenido de sialilación similar a (es decir, dentro del 10 % de) o el mismo que los del polipéptido quimérico Fc del factor IX en los Ejemplos 5-6.
[0015] En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico tiene una recuperación incremental superior a 0.7 o superior a 0.75 ug/ml (antígeno). En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico tiene una recuperación incremental media (valor de K) (actividad; observada) de al menos aproximadamente 0.8, al menos aproximadamente 0.9 o al menos aproximadamente 1 UI/dl por UI/kg.
[0017] En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico presenta uno o más parámetros farmacocinéticos, en dicha población de pacientes o en dicho sujeto, seleccionados del grupo que consiste en:
[0018] (a) un aclaramiento medio (CL) (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 3.36 ± 0.93 ml/hora/kg; un aclaramiento medio (CL) (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 3.0-3.72, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 o 3.72 ml/hora/kg; un aclaramiento medio (CL) (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente 2.5 veces inferior al aclaramiento de un polipéptido que comprende dicho factor IX sin dicho BP a FcRn; un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1.84-4.58 ml/hora/kg (b) un tiempo de residencia medio (MRT) (actividad) en dicha población de pacientes de al menos aproximadamente 68.05 ± 11.16 horas; un MRT medio (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 60-78, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78 horas; un MRT medio (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente 3 veces más largo que el MRT medio de un polipéptido que comprende dicho factor IX sin dicho BP a FcRn; un tiempo de residencia medio (MRT) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 53.1-85.8 horas; un tiempo de residencia medio (MRT) (actividad) en dicho sujeto de al menos aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85 o aproximadamente 90 horas;
[0019] (c) una t1/2beta media (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 52.5 ± 9.2 horas; una t1/2beta media (actividad) en dicha población de pacientes que es de aproximadamente 47-60 horas, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60 horas; una t1/2beta media (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente 3 veces mayor que la media de t1/2beta de un polipéptido que comprende dicho factor IX sin dicho BP a FcRn; una t1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 40-67.4, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70 o aproximadamente 75 horas;
[0020] (d) una recuperación incremental media (valor de K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes de aproximadamente 0.93 ± 0.18 UI/dl por UI/kg; una recuperación incremental media (valor de K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes de aproximadamente 0.85-1.0, aproximadamente 0.85, aproximadamente 0.86, aproximadamente 0.87, aproximadamente 0.88, aproximadamente 0.89, aproximadamente 0.90, aproximadamente 0.91, aproximadamente 0.92, aproximadamente 0.93, aproximadamente 0.94, aproximadamente 0.95, aproximadamente 0.96, aproximadamente 0.97, aproximadamente 0.98, aproximadamente 0.99, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.05, aproximadamente 1.10 o aproximadamente 1.15 UI/dl por UI/kg; una recuperación incremental media (valor de K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes que es aproximadamente un 24 % mejor que la recuperación incremental media de un polipéptido que comprende dicho factor IX sin dicho BP a FcRn; una recuperación incremental (valor de K) (actividad; observada) en dicho sujeto de aproximadamente 0.62­ 1.17 UI/dl por UI/kg;
[0021] (e) un Vss medio (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 226 ± 67.76 (corregido a 69.8) ml/kg; un Vss medio (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 200-300, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290, o aproximadamente 300 ml/kg; un Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 145-365 ml/kg;
[0022] (f) un ABC/dosis (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 32.44 ± 10.75 UI*h/dl por UI/kg; un ABC/dosis (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 26-40, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39 o aproximadamente 40 UI*h/dl por UI/kg; un ABC/dosis en dicho sujeto de aproximadamente 21.80-54.30 UI*h/dl por UI/kg.
[0023] En algunas realizaciones, la dosis de polipéptido quimérico contiene un nivel significativamente menor (10-100 veces) (0.01-0.001 %) de FIX activado (FIXa), que los productos de factor IX comercializados actualmente, tales como MONONINE™ (pdFIX; CSL Behring)) o BENEFIX™ (Wyeth; rFIX) (0.1 %). Dicho nivel puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces inferior al de los productos actualmente comercializados, o 0.01, 0.05, 0.0033, 0.0025, 0.002, 0.00167, 0.00142, 0.00125, 0.00111 o 0.001 %.
[0024] La dosis puede ser una dosis fija o una dosis individualizada.
[0025] En algunas realizaciones, en polipéptido quimérico se administra por vía intravenosa o por vía subcutánea.
[0026] El polipéptido quimérico puede estar en forma de un híbrido que comprende un segundo polipéptido en asociación con dicho polipéptido quimérico, en donde dicho segundo polipéptido comprende o consiste esencialmente en un BP a FcRn, por ejemplo, un Fc. El polipéptido quimérico puede ser al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntico a la secuencia del factor IX, la secuencia Fc o tanto el factor IX como la secuencia Fc en las Tablas 2A (SEQ ID NO:2) y/o 2B (SEQ ID NO:4), con o sin la secuencia o secuencias señalizadoras y el propéptido.
[0027] El polipéptido o híbrido quimérico puede administrarse como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente.
[0028] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS
[0030] FIG. 1. Esquema de un tipo de polipéptido quimérico del factor IX, un híbrido del factor IX-Fc.
[0031] FIG. 2. Concentración media de FIXFc por grupo frente a perfiles de tiempo; comparación de dosis nominales.
[0032] FIG. 3. Actividad media del FIXFc por grupo frente a los perfiles de tiempo; comparación de dosis nominales.
[0033] FIG. 4. Árbol de decisiones de resta del nivel basal.
[0034] FIG. 5. Aumento proporcional a la dosis en la Cmáx y el ABC para la actividad FIX.
[0035] FIG. 6. Duración terapéutica estimada de rFIXFc en 50 (A) y 100 (B) UI/kg.
[0036] FIG. 7. Aumento proporcional a la dosis en la Cmáx y el ABC para el antígeno FIX.
[0037] FIG. 8. Estimaciones farmacocinéticas para el antígeno rFIXFc en dosis nominales de 50 (A) y 100 (B) UI/kg.
[0038] FIG. 9. Excelente correlación entre la actividad de rFIXFc y los niveles de antígeno. Cabe señalar que, debido al nuevo cálculo de la actividad FC, como se analiza en el Ejemplo 11, R2 = 0.946.
[0039] FIG. 10. Estructura del dominio rFIX-Fc y modificaciones postraduccionales. PRO: Propéptido escindido mediante enzima de procesamiento. GLA: Contiene 12 y de residuos de ácido glutámico (GLA) carboxilado. PEP ACT: Péptido de activación escindido para producir proteasa activa. Otras modificaciones: N- y O- glucosilación, p-hidroxilación de Asp(64), sulfatación de Tyr, fosforilación de Ser.
[0040] FIG. 11. Gel de SDS-PAGE de productos intermedios de purificación y monómero FIXFc purificado. Las muestras de diferentes etapas en la purificación de FIXFc se analizaron mediante SDS-PAGE no reductora. Carril 1: Marcadores de peso molecular SeeBlue Plus (Invitrogen). Carril 2: Carril vacío. Carril 3: Carga de proteína A. Carril 4: Eluato de proteína A. Carril 5: Eluato de Fractogel DEAE. Carril 6: Eluato de Q Seph FF. Carril 7: FIXFc a granel final. Carril 8: Carril vacío. Carril 9: FIXFc reducido a granel final.
[0041] FIG. 12. Actividad funcional de FIXFc en ratones deficientes en FIX. A los ratones deficientes en FIX se les administró por vía intravenosa 219 UI/kg de FIXFc (3 o 4 por grupo, 6 grupos, n = 23) o 200 UI/kg de rFIX (3 o 4 por grupo, 5 grupos, n = 23) en el tiempo = 0. Se recogieron muestras de sangre en varios momentos después de la administración (de 0.25 h a 96 h) y se analizaron para determinar la actividad de coagulación usando el ensayo de actividad de FIX.
[0042] * La actividad de rFIX es indetectable en todos los ratones en puntos de tiempo posteriores a 48 h después de la administración.
[0044] FIG. 13. Tiempo de coagulación de la sangre completa de FIXFc frente a FIX recombinante en ratones deficientes en FIX. A los ratones deficientes en FIX (6 por grupo) se les administró por vía intravenosa 50 UI/kg de FIXFc o 50 UI/kg de rFIX. Se recogieron muestras de sangre antes de la administración y en varios momentos después de la administración. Las muestras de sangre se incubaron a 37 °C y se inspeccionaron visualmente para detectar la presencia de un coágulo de sangre una vez por minuto. Se registró el tiempo necesario para que se formara un coágulo y, una vez que la actividad de coagulación volvió al valor basal (es decir, sin formación de coágulo), no se obtuvieron muestras adicionales (muestras recogidas de 15 min a 144 h para FIXFc o de 15 min a 72 h para rFIX).
[0046] FIG. 14. Farmacodinámica de FIXFc en ratones deficientes en FIX. A los ratones deficientes en FIX se les administró 219 UI/kg de FIXFc (5 por grupo, 6 grupos, n = 30) o 200 UI/kg de rFIX (4 o 5 por grupo, 6 grupos, n = 28) el día 0, 4 y 8. Las muestras de plasma se recogieron mediante punción cardíaca a los 15 min y 96 h después de cada dosis y la actividad de coagulación se midió usando un ensayo de actividad de FIX. También se recogió plasma mediante sangrados de la cola a las 8, 24, 48 y 72 h después de cada dosis. Los niveles de FIXFc se midieron en todas las muestras usando un ELISA específico para FIXFc. (A) Actividad medida frente a calculada. La actividad de coagulación para FIXFc se midió usando el ensayo de actividad de FIX 15 min y 96 h después de tres dosis. Se determinó que la actividad de coagulación in vitro para FIXFc era de 43.8 ± 5.4 UI/mg. Basándose en esta actividad (UI/mg) y los niveles de proteína medidos, se determinó un nivel de actividad de coagulación plasmática calculado para los puntos de tiempo a los 15 min, 8, 24, 48, 72 y 96 h después de cada dosis. (B) En ratones deficientes en FIX tratados con hasta tres dosis de 200 UI/kg de rFIX, los niveles de FIX se midieron usando ELISA específico de FIX. Usando las actividades específicas medidas de FIXFc y rFIX, fue posible comparar la actividad de coagulación calculada para todas las muestras analizadas por ELISA.
[0048] FIG. 15. Farmacocinética y farmacodinámica de FIXFc en perros deficientes en FIX. Dos perros con hemofilia B se infundieron por vía intravenosa con 140 UI/kg de FIXFc. Se recogieron muestras de sangre a los 5, 15 y 30 min, y a las 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 27, 30, 48, 51, 54, 72, 80, 96, 126, 144 y 168 h. (A) Se usó un ELISA sándwich que utilizaba un anticuerpo de captura contra FIX y un anticuerpo de detección contra Fc-HRP para medir la concentración de FIXFc intacto en las muestras de plasma de perro con hemofilia B. (B) La actividad de coagulación de FIX se midió para todos los puntos de tiempo con respecto a una curva estándar generada con FIXFc. (C) La sangre recogida de animales se analizó inmediatamente durante el tiempo de coagulación de sangre completa. Las muestras de sangre se incubaron a 28 °C y se inspeccionaron visualmente para detectar la presencia de un coágulo una vez por minuto, y se registró el tiempo en el que se formó un coágulo.
[0050] FIG. 16. Farmacocinética de FIXFc en macacos cangrejeros. A los macacos se les administró una dosis única (0.5, 2 y 10 mg/kg, correspondiente a aproximadamente 25, 100 o 500 UI/kg) de FIXFc (n = 2, 3 y 3, respectivamente). Se recogieron muestras de sangre a las 0.25, 0.5, 1, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h después de la dosis y se preparó el plasma para el análisis de la concentración de proteína mediante ELISA específico de FIXFc.
[0052] FIG. 17. rFIXFc y BENEFIX™ muestran actividad y respuesta a la dosis comparables en sangre completa de ratones HemB. (A) Parámetros de ROTEM®. rFIX o BENEFIX™ se introdujeron en sangre de ratones HemB y los parámetros de coagulación se midieron mediante ROTEM®. (B)-(D) Respuesta a la dosis, midiendo (B) CT, (C) CFT y (D) ángulo alfa.
[0054] FIG. 18. Evaluación de la eficacia aguda en el modelo de sangrado con pinza en la cola de ratones hemofílicos.
[0055] FIG. 19. (A) Pérdida de sangre después de la pinza en la cola en ratones HemB individuales tratados con rFIXFc o BENEFIX™. (B) Respuesta a la dosis de rFIXFc y BENEFIX™ en la mediana de la pérdida de sangre después de la pinza en la cola en ratones HemB.
[0057] FIG. 20. Modelo de hemorragia por corte transversal de la vena de la cola (TVT) de ratones HemB: un modelo para la hemorragia venosa característica de pacientes con hemofilia grave.
[0059] FIG. 21. Actividad prolongada de rFIXFc con respecto a BENEFIX™ en ratones HemB tratados por ROTEM® de sangre completa. (A) CT, (B) CFT, (C) ángulo alfa y (D) correlación parcial entre la actividad de coagulación de sangre completa (CT) por ROTEM® frente a la actividad plasmática por aPTT.
[0061] FIG. 22. Eficacia prolongada de FIXFc con respecto a BENEFIX™ en el modelo de hemorragia por corte transversal de la vena de la cola (TVT) de ratones HemB. (A) Supervivencia: Las tasas de supervivencia fueron comparables en ratones que recibieron BENEFIX™ 24 horas antes del TVT como en ratones que recibieron rFIXFc 72 horas antes del TVT, y (B) Hemorragia recidivante: Las tasas de hemorragia fueron comparables en ratones que recibieron BENEFIX™ 24 horas antes del TVT como en ratones que recibieron rFIXFc 72 horas antes del TVT.
[0063] FIG. 23. Correlación entre la recuperación incremental de la actividad de rFIXFc frente al peso corporal en 12 sujetos que recibieron una dosis única de 12.5 a 100 UI/kg de rFIXFc.
[0064] FIG. 24. Simulación de Monte Cario usando el modelo FC estructural de la actividad de rFIXFc para construir los perfiles de actividad-tiempo para lograr un mínimo de 1 Ul/dl por encima del valor basal después de las pautas posológicas (C) semanales (A), cada 10 días (B) o cada dos semanas. La mediana de los parámetros FC de la población y las variabilidades interindividuales e intraindividuales relevantes se adoptaron a partir del estudio clínico de fase 1/2a. Se simularon 1000 sujetos por pauta posológica con 14 a 16 puntos de muestreo para cada sujeto, y la media ± DE de los perfiles de actividad-tiempo de los 1000 sujetos se construyó gráficamente para diferentes pautas posológicas.
[0066] FIG. 25. Simulación de Monte Carlo para dosis de rFIXFc para lograr un mínimo de 1 Ul/dl (1 %), basándose en datos farmacocinéticos recalculados. (A) una vez por semana, (B) cada 10 días y (C) cada dos semanas.
[0068] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0070] La presente invención proporciona un polipéptido quimérico del factor IX para su uso como se define en las reivindicaciones adjuntas. También se divulga, pero que no forma parte de la invención, un método para tratar la deficiencia del factor IX, por ejemplo, hemofilia B, con el factor IX usando un intervalo de administración más largo y/o parámetros farmacocinéticos mejorados de lo que es posible con los productos del factor IX actualmente conocidos.
[0071] "Administrar", como se usa en el presente documento, significa proporcionar un polipéptido del factor IX farmacéuticamente aceptable de la invención a un sujeto a través de una vía farmacéuticamente aceptable. Las vías de administración preferidas son intravenosas, por ejemplo, inyección intravenosa e infusión intravenosa, por ejemplo, a través de acceso venoso central. Las vías de administración adicionales incluyen administración subcutánea, intramuscular, oral, nasal y pulmonar, preferiblemente subcutánea. Los polipéptidos quiméricos del factor IX y las proteínas híbridas pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente. Las ventajas de la presente invención incluyen: cumplimiento mejorado de la pauta; reducción de las hemorragias intercurrentes; mayor protección de las articulaciones contra hemorragias; prevención del daño articular; reducción de la morbilidad; reducción de la mortalidad; protección prolongada contra hemorragias; disminución de los acontecimientos trombóticos; y mejora de la calidad de vida.
[0073] "Polipéptido quimérico", como se usa en el presente documento, significa un polipéptido que incluye dentro de él al menos dos polipéptidos (o porciones de los mismos, tales como subsecuencias o péptidos) de diferentes fuentes. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más polipéptidos o partes de los mismos de diferentes fuentes, tales como diferentes genes, diferentes ADNc o diferentes especies de animales u otras especies. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir uno o más conectores que unen los diferentes polipéptidos o partes de los mismos. Por lo tanto, los polipéptidos o partes de los mismos pueden unirse directamente o pueden unirse indirectamente, a través de conectores, o ambos, dentro de un único polipéptido quimérico. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir péptidos adicionales, tales como secuencias señalizadoras y secuencias tales como 6His y FLAG, que ayudan en la purificación o detección de proteínas. Además, los polipéptidos quiméricos pueden tener adiciones de aminoácidos o péptidos a los extremos N y/o C. Los polipéptidos quiméricos a modo de ejemplo de la invención son los polipéptidos quiméricos del factor IX-BP a FcRn, por ejemplo, polipéptidos quiméricos del factor IX-Fc tales como el FIXFc en la Figura 1, la SEQ ID NO:2 (Tabla 2) y los Ejemplos 1-4, con o sin su secuencia señalizadora y propéptido. Otros polipéptidos quiméricos a modo de ejemplo de la invención incluyen, pero no están limitado a, polipéptidos quiméricos del factor IX-XTEN. El factor IX puede fusionarse en cualquiera del extremo N o extremo C de XTEN.
[0075] El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia al menos un 90 % o al menos 95 % o 100 % idéntica al factor IX y BP a FcRn, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos Fc mostrada en la Tabla 2A sin una secuencia señalizadora y secuencia propeptídica (aminoácidos 1 a 642 de la SEQ ID NO:2), o como alternativa, con una secuencia propeptídica, o como alternativa con una secuencia señalizadora y una secuencia propeptídica.
[0077] "Cultivo", "cultivar" y "que cultiva", como se usan en el presente documento, significa incubar células en condiciones in vitro que permiten el crecimiento o la división celular o mantener las células en un estado vivo. "Células cultivadas", como se usa en el presente documento, significa células que se propagan in vitro.
[0079] "Factor IX" y "FIX", como se usa en este documento, significa polipéptido del factor IX funcional en su función normal en la coagulación, a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, el término factor IX incluye polipéptidos variantes que son funcionales. Las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de longitud completa del factor IX son conocidas, como lo son muchas variantes funcionales, por ejemplo, fragmentos, mutantes y versiones modificadas. El factor IX se prepara preferiblemente mediante medios recombinantes ("factor IX recombinante" o "rFIX"), es decir, no se produce de forma natural o deriva de plasma. El factor IX en la proteína quimérica según la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 1 a 415 de SEQ ID NO: 2.
[0081] Se conoce una gran cantidad de variantes funcionales del factor IX. La publicación internacional número WO 02/040544 A3 divulga mutantes que muestran resistencia aumentada a la inhibición por heparina en la página 4, líneas 9-30 y página 15, líneas 6-31. La publicación internacional número WO 03/020764 A2 divulga mutantes del factor IX con inmunogenia reducida de linfocitos T en las Tablas 2 y 3 (en las páginas 14-24) y en la página 12, líneas 1-27. La publicación internacional número WO 2007/149406 A2 divulga moléculas mutantes funcionales del factor IX que muestran un aumento de la estabilidad de las proteínas, un aumento de la semivida in vivo e in vitro, y aumento de la resistencia a proteasas en la página 4, línea 1 a página 19, línea 11. El documento de patente WO 2007/149406 A2 también divulga moléculas quiméricas del factor IX y otras variantes en la página 19, línea 12 a página 20, línea 9. La publicación internacional número WO 08/118507 A2 divulga mutantes del factor IX que muestran un aumento de la actividad coagulante en la página 5, línea 14 a página 6, línea 5. La publicación internacional número WO 09/051717 A2 divulga mutantes del factor IX que tienen un número elevado de sitios de glucosilación ligados a N y/o ligados a O, lo que da como resultado un aumento de la semivida y/o recuperación en la página 9, línea 11 a página 20, línea 2. La publicación internacional número WO 09/137254 A2 también divulga mutantes del factor IX con números elevados de sitios de glucosilación en la página 2, párrafo [006] a página 5, párrafo [011] y página 16, párrafo [044] a página 24, párrafo [057]. La publicación internacional número WO 09/130198 A2 divulga moléculas mutantes funcionales del factor IX que tienen un número elevado de sitios de glucosilación, lo que da como resultado un aumento de la semivida, en la página 4, línea 26 a la página 12, línea 6. La publicación internacional número WO 09/140015 A2 divulga mutantes funcionales del factor IX que tienen un número elevado de residuos de Cys, que pueden usarse para la conjugación polimérica (por ejemplo, PEG), en la página 11, párrafo a página 13, párrafo .
[0083] Además, se han identificado cientos de mutaciones no funcionales en el factor IX en pacientes con hemofilia, muchas de las cuales se divulgan en la Tabla 1, en las páginas 11-14 de la publicación Internacional número WO 09/137254 A2. Dichas mutaciones no funcionales no se incluyen en la invención, pero proporcionan orientación adicional para qué mutaciones son más o menos probables que den como resultado un polipéptido funcional del factor IX.
[0085] El factor IX (o parte del factor IX de un polipéptido quimérico) tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Tabla 2A sin una secuencia señalizadora y una secuencia propeptídica (aminoácidos 1 a 415 de la SEQ ID NO:2).
[0086] La actividad coagulante del factor IX se expresa como unidad o unidades internacionales (UI). Una UI de actividad del factor IX corresponde aproximadamente a la cantidad de factor IX en un mililitro de plasma humano normal. Hay varios ensayos disponibles para medir la actividad del factor IX, incluido el ensayo de coagulación en una etapa (tiempo de tromboplastina parcial activado; aPTT), tiempo de generación de trombina (TGA) y tromboelastometría rotacional (ROTEM®). Véase, por ejemplo, el Ejemplo 3.
[0088] El "compañero de unión a FcRn" o "BP a FcRn" como se usa en el presente documento, del polipéptido del factor IX quimérico es Fc humano. Un compañero de unión a FcRn puede unirse específicamente por el receptor FcRn con transporte activo consiguiente por el receptor FcRn del compañero de unión a FcRn. La región de la parte Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito en función de la cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). El área de contacto principal de Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos de Fc - FcRn están todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos aminoacídicos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos aminoacídicos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias hechas a numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos o regiones de inmunoglobulina se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. (El receptor FcRn se ha aislado de varias especies de mamífero incluyendo seres humanos. Las secuencias del FcRn humano, FcRn de rata y FcRn de ratón son conocidas (véase, por ejemplo, Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2377).) .
[0090] El BP a FcRn (o parte de BP a FcRn de un polipéptido quimérico) puede contener una o más mutaciones y combinaciones de mutaciones.
[0092] BP a FcRn (o parte BP a FcRn de un polipéptido quimérico) puede contener mutaciones que confieren un aumento de la semivida, tales como M252Y, S254T, T256E y combinaciones de las mismas, como se divulga en Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46:1750 (2009); H433K, N434F y combinaciones de las mismas, como se divulgan en Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005); y mutantes divulgados en las páginas 1-2, párrafo , y Ejemplos 9 y 10 del documento de patente U.S. 2009/0264627 A1; y los mutantes divulgados en la página 2, párrafos a del documento de patente U.S. 20090163699 A1.
[0094] BP a FcRn (o parte de BP a FcRn de un polipéptido quimérico) también puede incluir las siguientes mutaciones: La región Fc de IgG puede modificarse según procedimientos bien reconocidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para producir IgG modificada o fragmentos Fc o partes de los mismos que se unirán por FcRn. Dichas modificaciones incluyen modificaciones lejos de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que conservan o incluso potencian la unión al FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos aminoacídicos individuales en Fc de IgG1 humana (Fcy1) pueden sustituirse sin pérdida significativa de afinidad de unión de Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A y K447A, donde, por ejemplo, P238A representa prolina natural sustituida por alanina en el número de posición 238. Además de alanina, pueden sustituirse otros aminoácidos por los aminoácidos naturales en las posiciones especificadas anteriormente. Pueden introducirse mutaciones individualmente en Fc dando lugar a más de cien compañeros de unión a FcRn distintos de Fc nativa. Además, pueden introducirse conjuntamente combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales, dando lugar a cientos más de compañeros de unión a FcRn. Ciertas de estas mutaciones pueden conferir nueva funcionalidad en el compañero de unión a FcRn. Por ejemplo, N297A elimina un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenia, potenciando de ese modo la semivida en circulación del compañero de unión a FcRn, y hacer que el compañero de unión a FcRn sea incapaz de unirse a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al.
[0095] 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Además, al menos tres receptores de Fc gamma humanos parecen reconocer un sitio de unión en IgG dentro de la región de bisagra inferior, en general los aminoácidos 234-237. Por lo tanto, otro ejemplo de la nueva funcionalidad y la posible inmunogenia disminuida puede surgir de mutaciones en esta región, como, por ejemplo, remplazando los aminoácidos 233-236 de IgG1 humana "ELLG" en la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con eliminación de un aminoácido). Se ha mostrado que FcyRI, FcyRIl y F<cy>RIII, que median diversas funciones efectoras, no se unirán a IgG1 cuando se hayan introducido dichas mutaciones (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77; y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Como ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge de las mutaciones descritas anteriormente, puede aumentarse la afinidad por FcRn más allá de la natural en algunos casos. Esta afinidad aumentada puede reflejar una tasa de "asociación" aumentada, una tasa de "disociación" disminuida, o tanto una tasa de "asociación" aumentada como una tasa de "disociación" disminuida. Las mutaciones que se cree que confieren una afinidad aumentada por FcRn incluyen T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
[0097] Polipéptidos y proteínas "híbridos", como se usan en el presente documento, significa una combinación de un polipéptido quimérico con un segundo polipéptido. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido pueden estar asociados entre sí a través de interacciones proteína-proteína no covalentes, tales como interacciones carga-carga o hidrófobas. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido pueden estar asociados entre sí a través de enlace o enlaces covalentes, tales como enlaces disulfuro. El péptido quimérico y el segundo péptido pueden estar asociados entre sí a través de más de un tipo de enlace, tal como enlaces no covalentes y disulfuro. Los híbridos se describen en los documentos de patente W<o>2004/101740, WO2005/001025, la patente de EE. UU. n.° 7.404.956, la patente de EE. UU. n.° 7.348.004 y el documento de patente WO 2006/074199. El segundo polipéptido puede ser una segunda copia del mismo polipéptido quimérico o puede ser un polipéptido quimérico no idéntico. El segundo polipéptido es opcionalmente un polipéptido que comprende un BP a FcRn, por ejemplo, Fc. El polipéptido quimérico es polipéptido quimérico del factor IX-Fc, y el segundo polipéptido opcional consiste esencialmente en Fc. Véanse, por ejemplo, la Figura 1, Ejemplos 1-3, y la Tabla 2 (SEQ iD NO:2 y 4). Véase, por ejemplo, el documento de patente US 7404956.
[0099] El segundo polipéptido en un híbrido puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia al menos 90 % o al menos 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2B sin una secuencia señalizadora (aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO:4), o como alternativa, con una secuencia señalizadora.
[0101] El polipéptido para el uso de la presente invención también incluye el factor IX fusionado con uno o más polipéptidos X<t>E<n>. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009). El factor IX se puede fusionar con el extremo aminoterminal del polipéptido XTEN o con el extremo carboxiterminal del polipéptido XTEN. Los polipéptidos XTEN incluyen, pero no están limitados a, los divulgados en los documentos de patente W o 2009/023270, w O 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682 y US 2009/0092582.
[0103] "Intervalo de administración", como se usa en el presente documento, significa la cantidad de tiempo que transcurre entre múltiples dosis que se administran a un sujeto. El intervalo de administración del BP a FIX-FcRn quimérico, por ejemplo, un FIX-Fc quimérico, puede ser al menos aproximadamente de una y media a ocho veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente (en UI/kg) de dicho factor IX sin la parte de BP a FcRn, por ejemplo, Fc (es decir, un polipéptido que consiste en dicho FIX). El intervalo de administración al administrar, por ejemplo, un polipéptido quimérico del factor IX-Fc (o un híbrido) de la invención puede ser al menos aproximadamente una vez y media más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor IX sin la parte de BP a BP a FcRn, por ejemplo, Fc, (es decir, un polipéptido que consiste en dicho factor IX). El intervalo de administración puede ser al menos aproximadamente de una y media a ocho veces más largo que el intervalo de administración requerido para una cantidad equivalente de dicho factor IX sin, por ejemplo, la parte Fc (o un polipéptido que consiste en dicho factor IX).
[0105] El intervalo de administración es de 9-18 días, por ejemplo, aproximadamente 9-17, aproximadamente 9-16, aproximadamente 9-15, aproximadamente 9-14, aproximadamente 9-13, aproximadamente 9-12, aproximadamente 9-11, aproximadamente 9-10 días, aproximadamente 10-18, aproximadamente 11-18, aproximadamente 12-18, aproximadamente 13-18, aproximadamente 14-18, aproximadamente 15-18, aproximadamente 16-18, aproximadamente 17-18 días, aproximadamente 10-11, aproximadamente 11-12, aproximadamente 12-13, aproximadamente 13-14, aproximadamente 14-15, aproximadamente 15-16, y aproximadamente 16-17 días, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17 o aproximadamente 18 días. El intervalo de administración puede ser aproximadamente de 10-14 días. El intervalo de administración puede ser aproximadamente cada dos semanas o dos veces al mes. El intervalo de administración puede ser un intervalo fijo, por ejemplo, 10-13 días para 50-100 UI/kg. El intervalo y la dosis fijos se determinan de manera que la combinación de intervalo y dosis den como resultado un mínimo de al menos aproximadamente 1-5 o al menos aproximadamente 1-3, o al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2 o al menos aproximadamente 3 UI/dl de actividad de FIX en una población de sujetos o en un sujeto individual. El intervalo de administración fijo también puede ser de 10-14 días para 50-100 UI/kg. El intervalo de administración fijo también puede ser de 15 días para 50-150 UI/kg.
[0106] El intervalo de administración puede ser, como alternativa, un intervalo individualizado que se determina para cada sujeto basándose en datos farmacocinéticos u otra información sobre ese sujeto. La combinación de dosis/intervalo de administración individualizada puede ser la misma que la de las pautas de intervalos fijos en los párrafos anteriores, o puede diferir, como se ilustra en los Ejemplos. La pauta puede estar inicialmente en un intervalo de administración fijo y después puede cambiar a un intervalo de administración individualizado.
[0108] "Tratamiento a demanda", como se usa en el presente documento, significa tratamiento que se pretende que tenga lugar en un corto periodo de tiempo y es en respuesta a una afección existente, tal como un episodio hemorrágico, o una necesidad percibida a corto plazo, tal como una cirugía planificada. Las afecciones que pueden requerir tratamiento a demanda incluyen un episodio hemorrágico, hemartrosis, hemorragia muscular, hemorragia bucal, hemorragia muscular, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, hemorragia gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intrabdominal, hemorragia intratorácica, fractura ósea, hemorragia del sistema nervioso central, hemorragia en el espacio retrofaríngeo hemorragia en el espacio retroperitoneal o hemorragia en la cubiertas del psoas ilíaco. También se incluyen episodios hemorrágicos distintos de estos. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, tratamiento perioperatorio o tratamiento para la cirugía. Dichas cirugías incluyen cirugía menor, cirugía mayor, extracción dental, amigdalectomía, otras cirugías dentales/toraco-faciales, herniotomía inguinal, sinovectomía, artroplastia total de la rodilla, otra prótesis articular, craneotomía, osteosíntesis, cirugía de urgencias, cirugía intracraneal, cirugía intrabdominal, cirugía intratorácica. También se incluyen cirugías distintas de estas. Las afecciones adicionales que pueden requerir tratamiento a demanda incluyen las enumeradas en la Tabla 26.
[0110] Afecciones adicionales que pueden requerir tratamiento a demanda incluyen hemorragias leves, hemartrosis, hemorragias musculares superficiales, hemorragias en tejidos blandos, hemorragias moderadas, hemorragias intramusculares o en tejidos blandos con disección, hemorragias en membranas mucosas, hematuria, hemorragias graves, hemorragias en la faringe, hemorragias en la retrofaringe, hemorragia del retroperitoneo, hemorragia del sistema nervioso central, contusiones, cortes, rasguños, hemorragia articular, hemorragia nasal, hemorragia bucal, hemorragia gingival, hemorragia intracraneal, hemorragia intraperitoneal, hemorragia espontánea leve, hemorragia tras un traumatismo grave, contusiones cutáneas moderadas o hemorragia espontánea en articulaciones, músculos, órganos internos o el cerebro. Las razones adicionales para el tratamiento a demanda incluyen la necesidad de tratamiento perioperatorio para cirugía o extracción dental, cirugía mayor, cirugía bucal extensa, cirugía urológica, cirugía de hernia, cirugía ortopédica, tal como artroplastia de rodilla, cadera u otra articulación importante.
[0112] Abreviaturas:
[0114] ABC<inf>
[0115] Área bajo la curva de concentración-tiempo de cero a infinito
[0116] ABCa
[0117] Área bajo la curva de concentración-tiempo durante la fase de distribución
[0118] ABCp
[0119] Área bajo la curva de concentración-tiempo durante la fase de eliminación
[0120] HL-alfa
[0121] Semivida en la fase de distribución
[0122] HL-beta
[0123] Semivida en la fase de eliminación; también denominada t1/2
[0124] C168
[0125] Actividad estimada de FIXFc por encima del valor basal aproximadamente 168 h después de la dosis
[0126] Cmáx
[0127] Concentración máxima, que se produce a Tmáx
[0128] % CV
[0129] Porcentaje del coeficiente de variación
[0130] CL
[0131] Aclaramiento
[0132] IVR
[0133] Recuperaciónin vivo(%)
[0134] Valor de K
[0135] Recuperación incremental
[0136] MRT
[0137] Tiempo de residencia medio
[0138] N
[0139] Número
[0140] NC
[0141] No calculable
[0142] NR
[0143] No informado
[0144] DE
[0145] Desviación estándar
[0146] EE
[0147] Error estándar
[0148] TBLP1
[0149] Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FIXFc ha disminuido a aproximadamente 1 UI/dl por encima del valor basal
[0150] TBLP3
[0151] Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FIXFc ha disminuido a aproximadamente 3 UI/dl por encima del valor basal
[0152] TBLP5
[0153] Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FIXFc ha disminuido a aproximadamente 5 UI/dl por encima del valor basal
[0154] V<ss>
[0155] Volumen de distribución en estado estacionario
[0156] V1
[0157] Volumen de distribución del compartimento central
[0159] Los parámetros farmacocinéticos (FC) incluyen los términos anteriores y los siguientes términos, que tienen su significado habitual en la técnica, a menos que se indique lo contrario. Algunos de los términos se explican con más detalle en los Ejemplos. Los parámetros FC pueden basarse en el nivel de antígeno de FIX (a menudo indicado entre paréntesis en el presente documento como "antígeno") o el nivel de actividad de FIX (a menudo indicado entre paréntesis en el presente documento como "actividad"). En la bibliografía, los parámetros FC a menudo se basan en el nivel de actividad de FIX debido a la presencia en el plasma de algunos pacientes de FIX endógeno e inactivo, que interfiere con la capacidad de medir FIX administrado (es decir, exógeno) usando anticuerpo contra FIX. Sin embargo, cuando FIX se administra como parte de una proteína de fusión que contiene un polipéptido heterólogo tal como un BP a FcRn, el antígeno FIX administrado (es decir, exógeno) puede medirse con precisión usando anticuerpo contra el polipéptido heterólogo. Además, ciertos parámetros FC pueden basarse en datos predichos del modelo (a menudo indicados entre paréntesis en el presente documento como "predicho por el modelo") o en datos observados (a menudo indicados entre paréntesis en el presente documento como "observados"), y preferiblemente se basan en datos observados.
[0161] "Valor basal", como se usa en el presente documento, es el nivel del factor IX plasmático medido más bajo en un sujeto antes de administrar una dosis. En el primer estudio en humanos descrito en el Ejemplo 1, los niveles plasmáticos del factor IX se midieron en dos puntos de tiempo antes de la administración: en una visita de selección e inmediatamente antes de la administración. Los tiempos predosis se trataron como cero (valor basal) a los efectos de los cálculos, es decir, para generar datos "restados del valor basal". Véase, por ejemplo, la Figura 4. Como alternativa, (a) el valor basal en pacientes cuya actividad de FIX pretratamiento es <1 %, que no tienen antígeno FIX detectable y que tienen genotipos finalizadores se define como 0 %, (b) el valor basal para pacientes con actividad de FIX pretratamiento <1 % y que tienen antígeno FIX detectable se establece en el 0.5 %, (c) el valor basal para pacientes cuya actividad FIX pretratamiento es entre el 1 - 2 % es Cmín (la actividad más baja a lo largo del estudio FC) y (d) el valor basal para pacientes cuya actividad de FIX pretratamiento es ≥2 % es 2 %. La actividad por encima del valor basal antes de la administración se considera fármaco residual del tratamiento previo, y decayó al valor basal y se restó de los datos FC después de la administración de rFIXFc. Véase el Ejemplo 11.
[0163] "Área bajo la curva de concentración plasmática frente al tiempo" ("ABC"), que, como se usa en el presente documento, se basa en la tasa y el grado de eliminación del factor IX después de la administración. El ABC se determina durante un período de tiempo especificado, tal como 12, 18, 24, 36, 48 o 72 horas, o para el infinito usando extrapolación basada en la pendiente de la curva. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, el ABC se determina para el infinito (ABC<inf>). El ABC también puede calcularse basándose en la dosis. Al igual que con muchos de los otros parámetros FC, la determinación del ABC puede llevarse a cabo en un único sujeto, o en una población de sujetos para la que se calcula el promedio. En el Ejemplo 1, el ABC/dosis media en la población de pacientes fue de 32.44 UI*h/dl por Ul/kg y el intervalo para sujetos individuales fue de 21.80-54.30 UI*h/dl por Ul/kg. (Véase la Tabla 13 para el ABC/dosis media basada en la actividad). Por lo tanto, el ABC/dosis media en una población de pacientes puede ser de aproximadamente 26-40, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39 o aproximadamente 40 UI*h/dl por Ul/kg. Véase la Tabla 14 para ABC/dosis y otros parámetros ABC basados en antígeno.
[0165] La "recuperación in vivo" ("IVR") se representa por la recuperación incremental (valor de K), que es la actividad máxima observada menos el nivel previo a la dosis y después se divide por la dosis. La IVR también se puede calcular en función del porcentaje, como se describe en los Ejemplos. Para mayor claridad, en el presente documento se usan las unidades (valor de K o UI/dl por UI/kg frente al %). La IVR media se puede determinar en una población de pacientes, o la IVR individual se puede determinar en un único sujeto. El FIXFc usado en el primer estudio en humanos descrito en el Ejemplo 1 presentó una IVR media de aproximadamente 0.93 UI/dl por UI/kg en la población de pacientes; y una IVR en cada sujeto que varió de 0.62 a 1.17 UI/dl por UI/kg (Tabla 13). Por lo tanto, el polipéptido quimérico para el uso de la invención presenta una IVR media en una población de pacientes de 0.85-1.15 (por ejemplo, aproximadamente 0.85, aproximadamente 0.86, aproximadamente 0.87, aproximadamente 0.88, aproximadamente 0.89, aproximadamente 0.90, aproximadamente 0.91, aproximadamente 0.92, aproximadamente 0.93, aproximadamente 0.94, aproximadamente 0.95, aproximadamente 0.96, aproximadamente 0.97, aproximadamente 0.98, aproximadamente 0.99, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.05, aproximadamente 1.10, aproximadamente 1.15) y una IVR en un sujeto de al menos aproximadamente 0.6, aproximadamente 0.7, 0.8, aproximadamente 0.9, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.1, o aproximadamente 1.2 UI/dl por UI/kg.
[0167] La "tasa de aclaramiento" ("CL"), como se usa en el presente documento, es una medida de la capacidad del cuerpo para eliminar un fármaco, y se expresa como el volumen de plasma eliminado del fármaco a lo largo del tiempo. El FIXFc utilizado en el estudio descrito en el Ejemplo 1 presentó una CL media de aproximadamente 3.36 ml/hora/kg (véase la Tabla 13), que es aproximadamente 2.5 veces menor que el CL (8.2 ml/hora/kg) de un polipéptido que consiste en factor IX (BENEFIX™); el intervalo de valores de CL en sujetos individuales fue de 1.84-4.58 ml/h/kg. Por lo tanto, un polipéptido quimérico para el uso de la invención presenta una CL media en una población de 3.0-3.72, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 o 3.72 ml/hora/kg para CL basada en antígeno, véase la Tabla 14.
[0169] El "tiempo de residencia medio" ("MRT"), como se usa en el presente documento, es una medida de la vida promedio de las moléculas de fármaco en el cuerpo. El FIXFc usado en el estudio descrito en el Ejemplo 1 presentó un MRT medio de aproximadamente 68.05 horas (véase la Tabla 13); el intervalo de valores de MRT fue de 53.1-85.8 horas en sujetos individuales. Por lo tanto, un polipéptido quimérico para el uso de la invención presenta un MRT medio en una población de 60-78, aproximadamente 60, aproximadamente 62, aproximadamente 64, aproximadamente 66, aproximadamente 68, aproximadamente 70, aproximadamente 72, aproximadamente 74, aproximadamente 76 o aproximadamente 78 horas y un MRT en un sujeto de al menos aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85 o aproximadamente 90 horas. Para el MRT basado en antígeno, véase la Tabla 14.
[0171] "t1/2p," o t1/2 beta" o "beta-HL", como se usa en el presente documento, es la semivida asociada con la fase de eliminación, t1/2p=(ln2)/constante de la velocidad de eliminación asociada con la fase terminal. En el estudio descrito en el Ejemplo 1, el FIXFc usado presentó una media de t1/2z en una población de pacientes que fue de aproximadamente 52.5 horas (véase la Tabla 13) y el intervalo de valores de t1/2 p en sujetos individuales fue de 47-60 horas. Por lo tanto, un polipéptido quimérico para el uso de la invención presenta una t1/2p promedio mayor que aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59 o aproximadamente 60 horas. Para t1/2p basada en antígeno, véase la Tabla 14.
[0173] "Mínimo", como se usa en el presente documento, es el nivel de actividad plasmática del factor IX más bajo alcanzado después de administrar una dosis de polipéptido quimérico para el uso de la invención u otra molécula de factor IX y antes de administrar la siguiente dosis, si la hay. En el presente documento, "mínimo" se utiliza indistintamente con "umbral". Los niveles basales del factor IX se restan de los niveles medidos del factor IX para calcular el nivel mínimo.
[0174] En algunas realizaciones, el mínimo es de 1-5 o 1-3 UI/dl después de aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13 o aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, el nivel plasmático del polipéptido quimérico alcanza un mínimo promedio de al menos aproximadamente 1 UI/dl después de al menos aproximadamente 6 días en al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de una población de pacientes o alcanza un mínimo de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 UI/dl después de al menos aproximadamente 6 días en un sujeto. En algunas realizaciones, el nivel plasmático de dicho polipéptido quimérico alcanza un mínimo promedio de aproximadamente 1-5 o 1-3 UI/dl. Dicho mínimo o mínimo promedio puede alcanzarse después de aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15 aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20; aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25; aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30 aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35; aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, o aproximadamente 40 días.
[0175] "Volumen de distribución en estado estacionario (Vss)", como se usa en el presente documento, es el espacio aparente (volumen) en el que se distribuye un fármaco. Vss = la cantidad de fármaco en el cuerpo dividida por la concentración plasmática en estado estacionario. En el Ejemplo 1, el Vss medio encontrado en la población fue de aproximadamente 226 ml/kg y el intervalo para los sujetos fue de aproximadamente 145-365 ml/kg. (Véase la Tabla 13). Por lo tanto, el Vss en una población de pacientes puede ser 200-300, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290 o aproximadamente 300 ml/kg. El Vss para los sujetos individuales puede ser de aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290, aproximadamente 300, aproximadamente 310, aproximadamente 320, aproximadamente 330, aproximadamente 340, aproximadamente 350, aproximadamente 360 o aproximadamente 370 ml/kg. Para Vss basado en antígeno, véase la Tabla 14.
[0177] "Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico comprendido por residuos de aminoácidos unidos covalentemente.
[0179] "Polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico comprendido por residuos de nucleótidos unidos covalentemente. Los polinucleótidos pueden ser ADN, ADNc, ARN, monocatenario o bicatenario, vectores, plásmidos, fagos o virus. Los polinucleótidos incluyen los de la Tabla 1, que codifican los polipéptidos de la Tabla 2 (véase la Tabla 1). Los polinucleótidos también incluyen fragmentos de los polinucleótidos de la Tabla 1, por ejemplo, aquellos que codifican fragmentos de los polipéptidos de la Tabla 2, tales como el factor IX, Fc, secuencia señalizadora, propéptido, 6His y otros fragmentos de los polipéptidos de la Tabla 2.
[0181] "Tratamiento profiláctico", como se usa en el presente documento, significa administrar un polipéptido del factor IX en múltiples dosis a un sujeto durante un transcurso de tiempo para aumentar el nivel de actividad del factor IX en el plasma de un sujeto. Preferiblemente, el aumento del nivel es suficiente para disminuir la incidencia de hemorragias espontáneas o para prevenir hemorragias en caso de una lesión imprevista. El tratamiento profiláctico disminuye o previene episodios hemorrágicos, por ejemplo, los descritos en el tratamiento a demanda. El tratamiento profiláctico puede ser fijo o puede individualizarse, como se analiza en "Intervalo de administración", por ejemplo, para compensar la variabilidad interindividual.
[0183] "Sujeto", como se usa en el presente documento, significa un ser humano. Los sujetos también incluyen seres humanos pediátricos. Los sujetos humanos pediátricos son desde el nacimiento hasta los 20 años, preferiblemente desde el nacimiento hasta los 18 años, desde el nacimiento hasta los 16 años, desde el nacimiento hasta los 15 años, desde el nacimiento hasta los 12 años, desde el nacimiento hasta los 11 años, desde el nacimiento hasta los 6 años, desde el nacimiento hasta los 5 años, desde el nacimiento hasta los 2 años y de 2 a 11 años.
[0185] Los usos descritos en el presente documento se pueden poner en práctica en un sujeto que necesita control o prevención de hemorragias o episodios hemorrágicos. Dichos sujetos incluyen aquellos que necesitan control o prevención de hemorragia en hemorragias leves, hemartrosis, hemorragias musculares superficiales, hemorragias en tejidos blandos, hemorragias moderadas, hemorragias intramusculares o en tejidos blandos con disección, hemorragias en membranas mucosas, hematuria, hemorragias graves, hemorragias en la faringe, hemorragias en la retrofaringe, hemorragia del retroperitoneo, hemorragia del sistema nervioso central, contusiones, cortes, rasguños, hemorragia articular, hemorragia nasal, hemorragia bucal, hemorragia gingival, hemorragia intracraneal, hemorragia intraperitoneal, hemorragia espontánea leve, hemorragia tras un traumatismo grave, contusiones cutáneas moderadas o hemorragia espontánea en articulaciones, músculos, órganos internos o el cerebro. Dichos sujetos también incluyen aquello que necesitan tratamiento perioperatorio, tal como el tratamiento de hemorragias asociadas con cirugía o extracción dental.
[0187] "Dosis terapéutica", como se usa en el presente documento, significa una dosis que logra un objetivo terapéutico, como se describe en el presente documento. El cálculo de la dosis requerida del factor IX derivado del plasma (pdFIX) se basa en el hallazgo empírico de que, en promedio, 1 UI de pdFIX por kg de peso corporal aumenta la actividad del factor IX plasmático en aproximadamente 1 UI/dl (1 %). Sobre esa base, la dosis necesaria se determina usando la siguiente fórmula:
[0188] Unidades requeridas = peso corporal (kg) * aumento deseado del factor IX (UI/dl o % de la normalidad) * 1 (UI/kg por UI/dl)
[0190] Debido a que FIXFc, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos y en la Figura 1, tiene una recuperación incremental similar a pdFIX (diferente de la de BENEFIX™), la dosis requerida se determina usando la fórmula anterior, o ajustándola ligeramente. Véase también la Tabla 26 para las dosis recomendadas específicas para diversas necesidades de tratamiento a demanda. Para los sujetos pediátricos que usan pdFIX, la guía posológica es la misma que para los adultos. Sin embargo, los pacientes pediátricos pueden tener una recuperación incremental inferior y, por lo tanto, la dosis puede tener que ajustarse hacia arriba.
[0191] La dosis terapéutica es de 50-100, 50, y 100 Ul/kg.
[0193] Las combinaciones adicionales de dosis e intervalo de dosis incluyen: una dosis de al menos aproximadamente 100 UI/kg y un intervalo de administración de al menos aproximadamente 9 días, una dosis de al menos aproximadamente 100 UI/kg y un intervalo de administración de al menos aproximadamente 12 días, o una dosis de 50-100 UI/kg y un intervalo de administración de 10-14 días
[0195] "Variante", como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido original, pero que conserva propiedades esenciales del mismo, por ejemplo, actividad coagulante del factor IX o actividad de Fc (de unión a FcRn). Generalmente, las variantes son en general muy similares y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido original. Las variantes incluyen fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos, eliminaciones, inserciones y versiones modificadas de polipéptidos originales.
[0197] Los polinucleótidos variantes pueden comprender, o alternativamente consistir en, una secuencia de nucleótidos que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia codificante de nucleótidos en la SEQ ID NO:1 o 3 (la parte del factor IX, la parte de Fc, individualmente o juntos) o la cadena complementaria a la misma, la secuencia codificante de nucleótidos del factor IX o Fc mutante y recombinante conocido, como las divulgadas en las publicaciones y patentes citadas en el presente documento o la cadena complementaria de las mismas, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2 o 4 (la parte del factor IX, la parte Fc, individualmente o juntas), y/o fragmentos de nucleótidos de cualquiera de estas moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, aquellos fragmentos descritos en el presente documento). Los polinucleótidos que se hibridan con estas moléculas de ácido nucleico en condiciones de hibridación rigurosas o condiciones de rigurosidad inferior también se incluyen como variantes, al igual que los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos siempre que sean funcionales.
[0199] Los polipéptidos variantes pueden comprender, o alternativamente consistir en, una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia de polipéptidos mostrada en SEQ ID NO:2 o 4 (la parte del factor IX, la parte Fc, individualmente o juntos), y/o fragmentos de polipéptidos de cualquiera de estos polipéptidos (por ejemplo, los fragmentos descritos en el presente documento).
[0201] Por un ácido nucleico que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico en cuestión sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto por que la secuencia de nucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 aminoácidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede eliminarse o sustituirse con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta el 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser, por ejemplo, la secuencia completa mostrada en SEQ ID NO:1 o 3, el ORF (marco de lectura abierto) o cualquier fragmento especificado como se describe en el presente documento.
[0203] Como cuestión práctica, si una molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos o polipéptido de la presente invención se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia de consulta (secuencia de referencia u original) y una secuencia en cuestión, también denominada alineación de secuencias global, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencias, las secuencias de consulta y en cuestión son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN se puede comparar convirtiendo U en T El resultado de dicha alineación de secuencias global es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=unitaria, k-tuple=4, penalización por emparejamiento erróneo=1, penalización por unión=30, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco 0.05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos en cuestión, lo que sea más corto.
[0205] Si la secuencia en cuestión es más corta que la secuencia de consulta debido a eliminaciones en 5' o 3', no debido a eliminaciones internas, se debe realizar una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta las truncaciones en 5' y 3' de la secuencia en cuestión al calcular el porcentaje de identidad. Para secuencias en cuestión truncadas en los extremos 5' o 3', con respecto a la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia de consulta que están en 5' y 3' de la secuencia en cuestión, que no están emparejadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un nucleótido está emparejado/alineado se determina por los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación corregida es la que se usa a los efectos de la presente invención. Solo se calculan las bases fuera de las bases de 5' y 3' de la secuencia en cuestión, como se muestra por la alineación FASTDB, que no coinciden/alinean con la secuencia de consulta, a los efectos de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.
[0207] Por ejemplo, una secuencia en cuestión de 90 bases se alinea con una secuencia de consulta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las eliminaciones se producen en el extremo 5' de la secuencia en cuestión y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no emparejadas representan el 10 % de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no emparejados/número total de bases en la secuencia de consulta), por lo que el 10 % se resta de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes estuvieran perfectamente emparejadas, el porcentaje de identidad final sería del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia en cuestión de base 90 se compara con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de modo que no hay bases en 5' o 3' de la secuencia en cuestión que no estén emparejadas/alineadas con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo se corrigen manualmente las bases en 5' y 3' de la secuencia en cuestión que no están emparejadas/alineadas con la secuencia de consulta. No se realizarán otras correcciones manuales a los efectos de la presente invención.
[0209] Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de consulta, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión sea idéntica a la secuencia de consulta, excepto por que la secuencia de polipéptidos en cuestión puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta el 5 % de los residuos de aminoácidos de la secuencia en cuestión pueden insertarse, eliminarse (indeles) o sustituirse por otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones del extremo amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
[0211] Como cuestión práctica, si cualquier polipéptido particular es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 (la parte del factor IX, la parte Fc, individualmente o juntos) o 4, o una secuencia de polipéptidos del factor IX o Fc conocida, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia de consulta (secuencia de referencia u original) y una secuencia en cuestión, también denominada alineación de secuencias global, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990). En una alineación de secuencias, las secuencias de consulta y en cuestión son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación de secuencias global es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación de aminoácidos FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, penalización por emparejamiento erróneo=1, penalización por unión=20, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, tamaño de ventana=longitud de secuencia, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco=0.05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos en cuestión, lo que sea más corto.
[0213] Si la secuencia en cuestión es más corta que la secuencia de consulta debido a eliminaciones aminoterminales o carboxiterminales, no debido a eliminaciones internas, se debe realizar una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta las truncaciones aminoterminales y carboxiterminales de la secuencia en cuestión al calcular el porcentaje de identidad global. Para secuencias en cuestión truncadas en los extremos amino y carboxi, con respecto a la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de residuos de la secuencia de consulta que están aminoterminales y carboxiterminales de la secuencia en cuestión, que no están emparejadas/alineadas con un residuo en cuestión correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un residuo está emparejado/alineado se determina por los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación del porcentaje de identidad final es la que se usa a los efectos de la presente invención. Solo se considera los residuos de los extremos amino y carboxi de la secuencia en cuestión, que no coinciden/alinean con la secuencia de consulta, a los efectos de ajustar manualmente la puntuación del porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de los residuos de consulta fuera de los residuos aminoterminales y carboxiterminales más lejanos de la secuencia en cuestión.
[0215] Por ejemplo, una secuencia en cuestión de 90 restos de aminoácidos se alinea con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La eliminación se produce en el extremo N de la secuencia en cuestión y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N. Los 10 residuos no emparejados representan el 10 % de la secuencia (número de residuos en los extremos N y C no emparejados/número total de residuos en la secuencia de consulta), por lo que el 10 % se resta de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes se ajustaran perfectamente, el porcentaje de identidad final sería del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia en cuestión de 90 residuos se compara con una secuencia de consulta de 100 residuos. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas, por lo que no hay residuos en los extremo N o C de la secuencia en cuestión que no estén emparejados/alineados con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo se corrigen manualmente las posiciones de los residuos fuera de los extremos aminoterminales y carboxiterminales de la secuencia en cuestión, como se muestra en la alineación FASTDB, que no coinciden/alinean con la secuencia de consulta. No se realizarán otras correcciones manuales a los efectos de la presente invención.
[0217] Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. Se prefieren especialmente variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o eliminaciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren variantes de nucleótidos producidas por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Además, también se prefieren variantes en las que se sustituyen, eliminan o añaden 5-10, 1-5 o 1-2 aminoácidos en cualquier combinación. Las variantes de polinucleótidos se pueden producir por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (cambio de codones en el ARNm humano a los preferidos por un hospedador bacteriano, tal como E. coli).
[0219] Las variantes de origen natural se denominan "variantes alélicas" y se refieren a una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar a nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos. Como alternativa, las variantes de origen no natural pueden producirse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
[0221] Usando métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden eliminarse del extremo N o extremo C de la proteína secretada sin pérdida sustancial de la función biológica. Los autores de Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), informaron proteínas de KGF variantes que tenían actividad de unión a la heparina incluso después de eliminar 3, 8 o 27 restos de aminoácidos aminoterminales. Del mismo modo, el interferón gamma presentó una actividad hasta diez veces mayor después de eliminar 8-10 residuos de aminoácidos del extremo carboxi de esta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988).)
[0222] Además, hay una amplia evidencia que demuestra que las variantes a menudo conservan una actividad biológica similar a la de la proteína de origen natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993)) realizaron un extenso análisis mutacional de la citocina humana IL-1 a. Usaron mutagénesis aleatoria para generar más de 3,500 mutantes de IL-1 a individuales que promediaron 2.5 cambios de aminoácidos por variante a lo largo de toda la longitud de la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posición de aminoácidos posible. Los investigadores descubrieron que "la mayor parte de la molécula podría alterarse con poco efecto sobre [la unión o la actividad biológica]". (Véase el resumen). De hecho, solo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3,500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que difirió significativamente en actividad de la natural.
[0224] Como se ha indicado anteriormente, las variantes polipeptídicas incluyen polipéptidos modificados. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glucosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación, y ubiquitinación.
[0226] El término "aproximadamente" se usa en el presente documento para significar de manera aproximada, cerca de, alrededor de o en las regiones de. Cuando la expresión "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término "aproximadamente" se usa en el presente documento para modificar un valor numérico por arriba y por debajo del valor señalado por una variación de, por ejemplo, un 10 por ciento, arriba o abajo (mayor o menor).
[0227] Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen únicamente a efectos ilustrativos y no pretenden ser limitantes de la invención.
[0229] Ejemplo 1. Primer ensayo en seres humanos (FiH)
[0231] El primer estudio en humanos fue un estudio de fase 1/2 de aumento de dosis abierto para determinar los parámetros de seguridad, tolerabilidad y farmacocinética (FC) de FIXFc (proteína de fusión del factor IX de coagulación humana recombinante). FIXFc es una proteína de fusión recombinante que comprende el factor IX de coagulación humano acoplado al dominio Fc de IgG1 humana. La proteína de fusión se expresa en células renales embrionarias humanas (HEK 293). Véase el Ejemplo 3.
[0232] FIXFc se está desarrollando para el control y la prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B (deficiencia congénita del factor IX o enfermedad de Navidad), incluido el control y la prevención de hemorragias en entornos quirúrgicos.
[0234] FIXFc es una proteína de fusión recombinante comprendida por el factor IX de coagulación (FIX) y un dominio Fc de un anticuerpo humano (isotipo IgG1). La molécula de FIXFc es heterodimérica con una cadena única de FIXFc (FIXFcsc) y una cadena única de Fc (Fc-sc) unidas entre sí a través de dos enlaces disulfuro en la región bisagra de Fc. Véanse la Fig. 1 y la Tabla 2.
[0236] El producto farmacéutico rFIXFc es una disolución transparente incolora destinada a la administración intravenosa (IV). rFIXFc se suministra como 1000 UI por un volumen de 5 ml en un vial de un solo uso de 10 ml. El producto farmacéutico se envasa en viales de vidrio USP de tipo I con tapones de bromobutilo y sellos de aluminio liso desprendible. El producto farmacéutico rFIXFc contiene 200 UI/ml en tampón de fosfato de sodio 10 mM pH 7.0 con adición de NaCl 145 mM y polisorbato 20 al 0.1 %. La disolución de rFIXFc no debe diluirse.
[0238] Diseño del estudio. Un total de 14 pacientes tratados previamente con hemofilia B grave se inscribieron y se trataron con FIXFc como una infusión intravenosa (IV) durante aproximadamente 10 minutos. En el estudio se evaluaron seis niveles de dosis, 1, 5, 12.5, 25, 50 y 100 UI/kg. Se inscribió un paciente por nivel de dosis a los niveles de dosis 1, 5, 12.5 y 25 UI/kg, y se inscribieron al menos tres pacientes evaluables por nivel de dosis a 50 y 100 UI/kg.
[0240] Después de la selección (programada en los 14 días posteriores a la dosis de FIXFc), comenzó el período de tratamiento para los pacientes. El período de tratamiento para cada nivel de dosis incluyó una dosis única de FIXFc (Día 1) hasta la finalización del período de observación de seguridad de 72 horas (3 días) para los niveles de dosis 1 y 5 UI/kg o hasta que se tomó la última muestra de FC para pacientes en los niveles de dosis 12.5 a 100 UI/kg (aproximadamente 10 días). Los pacientes tratados con 1, 5, 12.5 o 25 UI/kg se inscribieron y se trataron de manera secuencial a partir de 1 UI/kg. Los pacientes que recibieron 50 UI/kg no se trataron el mismo día y se separó la administración al menos un día. Después del tratamiento de los pacientes de 50 UI/kg, comenzó el tratamiento de los pacientes de 100 UI/kg.
[0242] El período posterior al tratamiento fue un período de observación de seguridad de 30 días a partir del día en que el paciente recibió la dosis de FIXFc y se solapó con el período de tratamiento ya que los pacientes se sometieron a las evaluaciones requeridas del estudio, tales como muestreo FC, durante este tiempo.
[0244] A los pacientes asignados a niveles de dosis de 12.5 a 100 UI/kg se les extrajeron muestras de sangre para evaluar la actividad de FIX y la concentración de FIXFc. Las muestras de sangre debían extraerse justo antes de la administración de FIXFc; 15 minutos después del final de la infusión; y 1,3, 6, 9, 24, 48, 72, 96, 120, 168 y 240 horas después del final de la infusión o hasta que se alcanzaran los niveles basales de FIX. Si un paciente continuó teniendo niveles de FIX por encima del valor basal en el punto de tiempo de 240 horas (día de estudio 11), se tomaron muestras a las 288 horas (día de estudio 13) y de nuevo a las 336 horas (día de estudio 15) si el nivel de FIX estaba por encima del valor basal en el día de estudio 13.
[0246] El paciente 10 recibió tratamiento con BENEFIX™ para una hemorragia antes del muestreo de FIXFc programado 216 horas después de la administración. En consecuencia, se excluyeron del análisis la actividad de FIXFc y los datos de antígeno para las 216 h y los siguientes puntos de tiempo. No se produjeron desviaciones adicionales que se sienta que hayan afectado a los resultados del análisis provisional de este estudio.
[0248] Para el antígeno del factor IX, se realizaron análisis farmacocinéticos en la concentración observada de FIXFc de pacientes individuales frente a los datos de tiempo después de la infusión IV de FIXFc. El análisis principal se realizó usando metodología dependiente del modelo. Los datos de concentración de FIXFc se ajustaron por ordenador a un modelo abierto de dos compartimentos con eliminación del compartimento central usando estimaciones de parámetros iniciales definidas por el usuario para el cálculo de los valores de los parámetros iniciales. Se generaron constantes de velocidad microscópica estimada por WinNonlin y los datos de concentración de FIXFc se ponderaron con la función de 1/(Y-circunflej° * Y-circunflej°). Los datos observados para dos sujetos (por ejemplo, los pacientes 5 y 6) se describieron inadecuadamente mediante el modelo de dos compartimentos. En consecuencia, se realizó un análisis independiente del modelo en estos dos pacientes usando el análisis no compartimental WinNonlin del modelo de entrada de infusión IV (regla trapezoidal lineal para el cálculo de ABC). Para el análisis no compartimental, la semivida se calculó a partir de la fase beta usando los puntos de datos que describen la disminución logarítmica-lineal terminal en la regresión. Se usó un mínimo de tres puntos para describir la fase de eliminación. Esto ocurrió aproximadamente entre 4 y 14 días. Para el análisis FC del antígeno, se utilizaron los equivalentes de dosis "mg/kg". Estos valores se determinaron basándose en una actividad específica para FIXFc de 60.2 UI/mg. Para los cálculos se usaron los tiempos reales de muestreo, las dosis y las duraciones de infusión. Se usaron tiempos y dosis nominales de muestreo para la creación de tablas y figuras de concentración-tiempo. Se presentan parámetros FC individuales y medios y estadísticas descriptivas. No se realizó un análisis estadístico formal porque el intervalo de dosis y el número de sujetos en cada cohorte eran demasiado pequeños para un análisis significativo.
[0249] Para la actividad del factor IX, se aplicó un método de resta del nivel basal al perfil de actividad frente al tiempo según el árbol de decisiones de resta del nivel basal (Figura 4). Se definieron valores de actividad < 1 % a 1 UI/dl para el decaimiento basal. Los tiempos predosis se trataron como cero a los efectos de cálculos. Además, los datos de actividad corregidos basales se truncaron en puntos de tiempo que representaban un retorno a los niveles basales. Los análisis farmacocinéticos se realizaron en los datos de actividad de FIX restada del valor basal frente al tiempo obtenidos después de la administración por infusión IV de FIXFc. Se utilizó una evaluación dependiente del modelo para el análisis de los grupos de dosis de infusión IV. Los datos restados del valor basal se ajustaron por ordenador a un modelo abierto de dos compartimentos con eliminación del compartimento central usando límites de parámetros definidos por WinNonlin para el cálculo de los valores de los parámetros iniciales. Se generaron constantes de velocidad microscópica estimada por WinNonlin y los datos de actividad de FIXFc se ponderaron con la función de 1 /(Y-circunflejo * Y-circunflejo). Para los cálculos se usaron los tiempos reales de muestreo, las dosis y las duraciones de infusión. Se usaron tiempos y dosis nominales de muestreo para la creación de tablas y figuras de concentracióntiempo.
[0251] Cuando no estaba disponible a partir de los datos reales, la actividad a las 168 h después de la administración (C168) y el tiempo hasta 1 UI/dl por encima del valor basal (TBLP1) de rFIXFc se obtuvieron usando las constantes de velocidad microscópicas generadas por WinNonlin para simular el nivel de actividad de FIXFc frente a los datos de tiempo. En este ejemplo se presentan parámetros FC individuales y medios y estadísticas descriptivas. No se realizó un análisis estadístico formal, porque el intervalo de dosis y el número de sujetos en cada cohorte eran demasiado pequeños para un análisis significativo.
[0253] Los resultados de la farmacocinética del antígeno de FIXFc mostraron que las concentraciones plasmáticas de FIXFc aumentaron drásticamente después de la infusión IV corta de FIXFc, con valores de Cmáx medios (± DE) de 1670 (n=1), 2730 (n=1), 7510 ± 2480 y 15400 ± 3960 ng/ml para los niveles de dosis nominales de 12.5, 25, 50 y 100 UI/kg, respectivamente, y se alcanzaron en la primera media hora para todos los pacientes. Todos los pacientes tratados con FIXFc tuvieron aumentos relacionados con la dosis en la exposición plasmática sistemática a FIXFc (como se evalúa por Cmáx y ABC<inf>). Aunque se limitó a un único paciente evaluable con la dosis nominal de 12.5 y 25 UI/kg, el aumento observado tanto en Cmáx como en ABC<inf>fue razonablemente proporcional a la dosis en el intervalo de dosis evaluado. (La Tabla 3 muestra la concentración media del antígeno FIXFc de pacientes individuales y del grupo frente a los datos de tiempo; clasificados por dosis nominal, dosis real, duración de la infusión y número de pacientes. La Tabla 4 muestra los datos del resumen FC del antígeno FIXFc medio de pacientes individuales y del grupo; clasificados por dosis nominal, dosis real, dosis equivalente de "mg/kg" y número de pacientes, muestra los datos del resumen FC del antígeno FIXFc medio de pacientes individuales y del grupo; clasificados por dosis nominal, dosis real, dosis equivalente de "mg/kg" y número de pacientes, y véase la Tabla 11).
[0255] Las concentraciones plasmáticas de FIXFc disminuyeron de manera biexponencial después de la infusión IV corta. Tanto los valores de semivida de distribución (alfa) como de eliminación (beta) parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado con valores de semivida alfa y beta de pacientes individuales que variaban de 9.79 a 21.2 horas y de 71.0 a 140 horas, respectivamente. Los valores medios de semivida alfa (±DE) para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron de 13.1 ± 4.77 y 12.1 ± 2.33 horas, respectivamente. Los valores medios de semivida beta (±DE) para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron de 110 ± 26.5 y 95.8 ± 11.1 horas, respectivamente. Además, se determinaron los valores de los parámetros FC primarios para CL, V<ss>y MRT y, en general, todos parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado. Como se indica, esta evaluación está limitada por los datos de un solo paciente a los niveles de dosis nominales de 12.5 y 25 UI/kg. (Tabla 12 y Figuras 2, 7 y 8).
[0257] Además, los valores medios de CL fueron de 2.28 ± 0.374 y 2.11 ± 0.464 ml/h/kg para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg, respectivamente. Los valores medios de V<ss>fueron de 259 ± 78.5 y 238 ± 52.2 ml/kg para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg, respectivamente. Además, los valores medios de TMR fueron de 112 ± 21.5 y 114 ± 17.1 h para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg.
[0259] Los resultados de la farmacocinética de la actividad de FIXFc corregida con el valor basal mostraron que la actividad plasmática de FIXFc aumentaron drásticamente después de la infusión IV corta de FIXFc, con valores de Cmáx medios (± DE) predichos por el modelo de 11.9 (n=1), 19.9 (n=1), 41.6 ± 8.97 y 98.2 ± 8.21 ng/ml para los niveles de dosis nominales de 12.5, 25, 50 y 100 UI/dl, respectivamente, y se alcanzaron en la primera media hora para todos los pacientes. (La Tabla 5 muestra la actividad media de FIXFc corregida de pacientes individuales y del grupo frente a los datos de tiempo; clasificados por dosis nominal, dosis real, duración de la infusión y número de pacientes y. La Tabla 6 muestra los datos resumidos de FC de la actividad media de FIXFc de pacientes individuales y del grupo; clasificados por dosis nominal, dosis real, dosis equivalente de "mg/kg" y número de pacientes).
[0261] Todos los pacientes tratados con FIXFc tuvieron aumentos relacionados con la dosis en la actividad de FIX (con respecto a la respuesta basal antes de la dosis). Aunque se limitó a un único paciente evaluable con niveles de dosis nominal de 12.5 y 25 UI/kg, el aumento observado tanto en Cmáx como en ABC<inf>fue razonablemente proporcional a la dosis en el intervalo de dosis evaluado. (Tablas 6, 9 y 13 y Figuras 3 y 5).
[0262] Después del final de la infusión, la disminución en la actividad de FIX corregida basal presentó decaimiento biexponencial; caracterizado por una fase de distribución rápida (alfa) seguida de una fase de eliminación logarítmicalineal (beta). Durante la fase alfa, la tasa de disminución en la actividad de FIXFc fue variable con valores de semivida alfa de los pacientes individuales que variaron de 0.140 a 16.6 horas. El aumento aparentemente dependiente de la dosis en los valores medios de semivida alfa se vio confundido por un solo paciente en los niveles de dosis nominales de 12.5 y 25 UI/kg. Por el contrario, los valores de semivida de eliminación (beta) parecían ser independientes de la dosis en todo el intervalo de dosis, con valores de semivida beta de pacientes individuales que variaban de 42.1 a 67.4 horas en el intervalo de dosis de 25 a 100 UI/kg. Aunque se estima y se notifica, la semivida de eliminación para el paciente 1 tratado con 12.5 UI/kg de rFIXFc no se incluye en la evaluación del resumen debido a que los niveles de FIX de este paciente son detectables solo durante un máximo de 96 horas, lo que da como resultado una fase terminal truncada y que contribuye a una subestimación de la semivida de eliminación terminal. Los valores medios de la semivida beta (±DE) para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron de 52.1 ± 10.4 y 52.5 ± 10.1 horas, respectivamente, y de 52.5 ± 9.2 (intervalo 40-67.4) horas para las dosis nominales combinadas de 25, 50 y 100 UI/kg. (Tablas 6, 8 y 13).
[0264] Además, se determinaron los valores de los parámetros FC primarios para Cl, V1, V<ss>y MRT y, en general, todos parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado.
[0266] Además, los valores medios de Cl fueron de 3.77 ± 1.12 y 2.89 ± 0.615 ml/h/kg para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg, respectivamente, y de 3.36 ±0.928 ml/h/kg para las dosis nominales combinadas de 25, 50 y 100 UI/kg. (Tablas 6, 8 y 13.)
[0268] Los valores medios de V<ss>fueron de 264 ± 77.6 y 179 ± 31.1 ml/kg para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg, respectivamente, y de 226 ± 69.8 ml/kg para las dosis nominales combinadas de 25, 50 y 100 UI/kg. (Tablas 6, 8 y 13.) Además, los valores medios de la MRT fueron de 71.7 ± 13.0 y 62.8 ± 8.82 h para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg, respectivamente, y de 68.05 ± 11.16 h para las dosis nominales combinadas de 25, 50 y 100 UI/kg. (Tablas 6, 8 y 13.)
[0270] Además de los parámetros FC primarios, se determinaron parámetros FC secundarios (por ejemplo, C168, valores de K, IVR, etc.) para evaluar la duración del efecto de FIXFc. Como se anticipó, se observaron aumentos dependientes de la dosis en los valores de C168, TBLP1, TBLP3 y TBLP5. Por el contrario, los valores de K y los valores de IVR parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado. A lo largo del intervalo de dosis completo, los valores de K predichos y observados por el modelo de pacientes individuales variaron de 0.61 a 1.02 y de 0.62 a 1.17 UI/dl por UI/kg, respectivamente. Los valores de K medios previstos por el modelo para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron de 0.76 y 0.90 UI/dl por UI/kg, respectivamente, y de 0.821 ± 0.1387 (intervalo 0.61-1.02) UI/dl por 1 UI/kg para las dosis nominales combinadas de 25, 50 y 100 UI/kg. Los valores medios de IVR predichos por el modelo para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron del 34.5 y el 35.1 %, respectivamente. Los valores de K medios observados para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron de 0.86 y 1.02 UI/dl por UI/kg, respectivamente, y de 0.926 ± 0.1787 (intervalo 0.97-1.17) UI/dl por 1 UI/kg para las dosis nominales combinadas de 25, 50 y 100 UI/kg. Los valores medios de IVR observados para los niveles de dosis nominales de 50 y 100 UI/kg fueron del 39.2 y el 39.8 %, respectivamente. (Tablas 6, 7, 8 y 13). La presentación de la Tabla 7A-7B muestra los datos resumidos de FC secundaria de la actividad de FIXFc de pacientes individuales y del grupo; clasificados por dosis nominal, dosis real y número de pacientes.
[0272] Cada 1 UI/kg de rFIXFc infundido aumentó la actividad de FIX plasmática en promedio en 0.93 ± 0.18 UI/dl, y esta recuperación incremental (valor de K) mostró una correlación positiva débil con el peso corporal (R2= 0.336, p = 0.048) (Figura 23).
[0274] Las estimaciones farmacocinéticas de la actividad de FIXFc fueron coherentes con las del antígeno rFIXFc (por ejemplo, véanse las Tablas 13 y 14). Además, hubo una excelente correlación entre la actividad de rFIXFc y los niveles de antígeno, lo que indica la conservación de la actividad in vivo de rFIXFc. (Figura 9). Además, con respecto a los datos históricos para BENEFIX™ (Wyeth), rFIXFc demostró (Tabla 8) lo siguiente:
[0275] Linealidad de dosis de 25-100 UI/kg
[0276] Aumento de 3 veces en t1/2beta
[0277] Aumento de 3 veces en el tiempo de residencia medio
[0278] Mejora del 24 % de la recuperación incremental
[0279] Reducción de 2.5 veces en el aclaramiento
[0281] FIXFc es una proteína de fusión recombinante comprendida por FIX unido al dominio Fc de IgG1 humana. FIXFc se ha diseñado para ser una versión de acción prolongada de FIX. Los estudios preclínicos con FIXFc han mostrado una prolongación de la semivida de la actividad de FIX en comparación con BENEFIX™, el producto de FIX recombinante disponible comercialmente. El fundamento de este estudio fue evaluar la seguridad y Fc de FIXFc en pacientes con hemofilia B grave. Para este estudio, 12 sujetos evaluables de 18 a 76 años estaban disponibles para la evaluación FC. Cada sujeto recibió una administración única de FIXFc en una dosis nominal de 12.5, 25, 50 o 100 UI/kg de peso corporal, administrada por vía intravenosa durante aproximadamente 10 minutos. Se obtuvieron muestras de plasma para las evaluaciones Fc de la actividad de FIXFc y las concentraciones de antígeno antes de la infusión, así como hasta 14 días después de la administración. La FC tanto del antígeno como de la actividad de FIXFc se caracterizaron independientemente en este estudio usando métodos dependientes del modelo e independientes del modelo.
[0283] FIXFc se toleró bien después de la administración de dosis IV únicas de 12.5, 25, 50 y 100 UI/kg de peso corporal. No hubo evidencia de acontecimientos adversos graves relacionados con el fármaco en este estudio. No se detectaron anticuerpos neutralizantes o de unión a rFIXFc en ningún sujeto.
[0285] Se observaron aumentos proporcionales a la dosis aproximados en Cmáx y ABC<inf>tanto para el antígeno como para la actividad de FIXFc después de la administración de dosis de 12.5 a 100 UI/kg, pero V y Cl fueron similares en todas las dosis. Estos resultados indican que el antígeno y la actividad de FIXFc presentaron FC lineal a lo largo del intervalo de dosis evaluado. Los valores del parámetro V relativamente pequeños pueden indicar que FIXFc entra en el fluido intersticial pero no cruza la membrana celular hacia los fluidos intracelulares.
[0287] Los niveles plasmáticos máximos del antígeno y la actividad de FIXFc se observaron en las 0.5 h posteriores al final de la infusión y se mantuvieron detectables durante varios días después de la administración. Se observó evidencia de un aclaramiento reducido y una semivida prolongada tanto para el antígeno como para la actividad de FIXFc.
[0288] Los valores medios de aclaramiento y semivida de eliminación terminal asociados con las concentraciones de antígeno FIXFc para los niveles de dosis de 50 y 100 UI/kg fueron de 2.28 y 2.11 ml/h/kg y de 110 y 95.8 horas, respectivamente. De manera similar, los valores medios de aclaramiento y semivida de eliminación terminal asociados con los niveles de actividad de FIXFc en el mismo intervalo de dosis fueron de 3.77 y 2.89 ml/h/kg y 52.1 y 52.5 horas, respectivamente. Comparación de los resultados FC de la actividad de FIXFc observados en el presente estudio con la Fc notificada para la actividad de BENEFIX™ (Resumen de las características del producto de BENEFIX™; 18 de noviembre de 2009) reveló una reducción aproximada de 3 veces en el aclaramiento de FIXFc y un aumento aproximado de 3 veces en la semivida de eliminación terminal de FIXFc y el tiempo de residencia medio con respecto a BENEFIX™.
[0290] Con las mejoras observadas en la FC, FIXFc proporcionará una protección prolongada contra la hemorragia, lo que permitirá inyecciones menos frecuentes para los individuos con hemofilia B. Basándose en los resultados de este ensayo, rFIXFc puede administrarse cada dos semanas o dos veces al mes usando dosis de 100 UI/kg y al menos una vez a la semana usando dosis más bajas. Una pauta de este tipo requiere menos inyecciones. Además, el uso de rFIXFc tendrá otros impactos clínicos potenciales, tales como: acceso venoso central; cumplimiento mejorado de la pauta; reducción de las hemorragias intercurrentes; y mayor protección de las articulaciones contra hemorragias.
[0291] Ejemplo 2. Ensayo B-LONG de fase 1/2/3
[0293] Este será una evaluación multicéntrica y abierta de la seguridad, la farmacocinética y la eficacia de la fusión factor IX-Fc coagulante recombinante de acción prolongada (rFIXFc) en la prevención y el tratamiento de hemorragias en sujetos tratados previamente con hemofilia B. El tratamiento con productos de FIX actualmente en el mercado requiere administración de 2-3 veces por semana. La comunidad médica consideraría que un producto con una semivida prolongada que prolonga el intervalo de administración requerido hasta una vez a la semana o más tiempo sería una mejora significativa para el tratamiento de pacientes con hemofilia grave.
[0295] Los niveles de dosis varían ampliamente para los productos de rFIX en estudios de profilaxis clínica: las dosis notificadas varían de 10 a 171 UI/kg (Roth et al., Blood 98:3600 (2001)) o de 40 a 100 UI/kg (Recomendación 177 de MASAC, Fundación Nacional de Hemofilia (octubre de 2006)). Además, se predice que los niveles mínimos de actividad de FIX durante el tratamiento profiláctico en sujetos sin signos clínicos de hemorragia varían entre 0.2 y 3.8 UI/dl (Carlsson et al., Hemophilia 4:83 (1998)). Teniendo en cuenta la variabilidad interindividual del paciente, las pautas posológicas individualizadas basadas en el estado clínico de un paciente son una práctica común.
[0297] Los resultados de un estudio de fase 1/2a (Ejemplo 1) que evalúa la seguridad y la farmacocinética de una dosis única de una formulación líquida congelada de rFIXFc han demostrado que el fármaco es bien tolerado en dosis que varían de 1 a 100 UI/kg y la caracterización FC sugiere varias ventajas sobre los tratamientos disponibles actualmente, concretamente una semivida y MRT que son 3 veces más largas que las notificadas previamente para BENEFIX™ (61 horas frente a 19 horas). El propósito de este estudio es determinar prospectivamente las estimaciones de los parámetros FC de rFIXFc liofilizado en seres humanos, compararlas con las estimaciones de los parámetros FC de BENEFIX™ en seres humanos y demostrar la eficacia de rFIXFc liofilizado en la prevención y el tratamiento de la hemorragia y la seguridad de su dosis repetida para sujetos tratados previamente con hemofilia B grave.
[0299] El estudio implicará cuatro grupos: una pauta profiláctica a dosis bajas (n=25), una pauta profiláctica a dosis altas (n=25), una pauta a demanda (n=20) y una pauta quirúrgica mayor (n=5). El grupo de pauta de dosis bajas incluirá un subgrupo FC (n=16) administrado con BENEFIX™, seguido de cruce a rFIXFc.
[0301] Los objetivos principales del estudio son: evaluar la seguridad y tolerabilidad de rFIXFc en todos los grupos de tratamiento; evaluar la eficacia de rFIXFc en todos los grupos de tratamiento; y evaluar la eficacia de la profilaxis con respecto al tratamiento a demanda (comparación del número anualizado de episodios hemorrágicos entre los grupos 1 y 2 frente al régimen a demanda del grupo 3).
[0303] Los objetivos secundarios del estudio son: comparar las estimaciones de los parámetros FC de rFIXFc y BENEFIX™; evaluar la eficacia de rFIXFc en los brazos quirúrgicos y a demanda; evaluar y comparar las estimaciones de los parámetros FC de rFIXFc en el nivel basal y en la semana 26 (± 1 semana) en el subgrupo FC; evaluar la respuesta de los sujetos al tratamiento en todos los grupos; y evaluar el consumo de rFIXFc en todos los brazos.
[0305] Criterios de inclusión principales:
[0307] Varón y de 12 años de edad y más y pesar al menos 40 kg
[0308] Diagnosticado con hemofilia B (nivel basal del factor IX igual o mayor que el 2 %)
[0309] Antecedentes de al menos 100 días de exposición a cualquier producto de factor IX
[0310] Recuento de plaquetas ≥100,000 células/pl
[0311] INR (relación internacional normalizada) < 1.40 como se define por el intervalo normal del laboratorio de ensayo Recuento de CD4 ≥ 200 células/pl
[0313] Criterios de exclusión principales:
[0315] Antecedentes de inhibidores del factor IX
[0316] Disfunción renal o hepática
[0317] Diagnosticado con otro defecto de coagulación distinto de la hemofilia B
[0318] Antecedentes previos de anafilaxia asociada con cualquier administración de FIX o inmunoglobulina IV
[0319] Tomar fármacos inmunosupresores sistémicos (por ejemplo, corticosteroides sistémicos; sin embargo, se permite HAART (terapia antirretrovírica altamente activa))
[0321] Ejemplo 3. Productividad de FIXFc en células HEK293
[0323] FIXFc se produjo en células HEK293 transfectadas de manera estable que contenían un casete de expresión para FIXFc (FIX nativo fusionado directamente a la región Fc) y un casete de expresión para Fc solo. Las células también se transfectaron con un casete de expresión para PC5, que es una enzima de procesamiento que permite el procesamiento completo del propéptido FIX. Las células transfectadas se cultivaron en medios de suspensión sin suero que contenían vitamina K y secretaron tres proteínas: dímero de FIXFc, monómero de FIXFc (una cadena de FIXFc y una cadena de Fc) y dímero de Fc. El monómero de FIXFc ("FIXFc") se purificó mediante cromatografía en columna (elución de pseudoafinidad con proteína A, Fractogel DEAE y Q Sepharose con CaCh de baja fuerza iónica), y se inactivó y filtró el virus para su administración a sujetos humanos. Véase también Peters et al., Blood. 11 de marzo de 2010;115(10):2057-64 (publicación electrónica 7 de enero de 2010); y patente de EE. UU. n.° 7,566,565.
[0325] La actividad coagulante de FIXFc se midió cuantificando su capacidad para restaurar la actividad de coagulación del plasma deficiente en FIX usando un MLA Electra 1600C (Medical Laboratory Automation/Instrument Labs, Pleasantville, NY). Los resultados se compararon con una curva de calibración generada usando diluciones en serie de un patrón de FIX de la Organización Mundial de la Salud.
[0327] Se cree que la fosforilación de serina y la sulfatación de tirosina del factor IX son importantes para la recuperación in vivo. Se ha informado que MONONINE™ (factor IX purificado plasmático (pdFIX) comercializado por CSL Berhing) tiene una mejor recuperación in vivo que BENEFIX™ (FIX recombinante (rFIX) comercializado por Wyeth) debido al mayor nivel de fosforilación/sulfatación de MONONINE™ (>90 %/>90 % frente a <10 %/5 %). Sin embargo, FIXFc producido en células HEK293 casi no tiene fosforilación/sulfatación (<10 %/4 %, que es muy similar a BENEFIX™), y muestra una mejor IVR (1.0 UI/dl por UI/kg) que BENEFIX™ (0.7).
[0329] Además, FIXFc producido como se ha descrito anteriormente tenía un nivel significativamente menor (10-100 veces) (0.01-0.001 %) de FIX activado (FIXa), una impureza relacionada con el producto, que MONONiNe ™ (pdFIX) o BENEFIX™ (rFIX) (0.1 %). El FIXFc resultante tendrá menos acontecimientos trombóticos no deseados tras la administración que MONONINE™ o BENEFIX™.
[0331] Ejemplo 4. Estudios pediátricos: Extrapolación e interrelación entre el desarrollo en poblaciones de adultos y pediátricas
[0333] Las características de los pacientes que muestran relaciones con la farmacocinética de FIX incluyen cambios fisiológicos dependientes de la edad (Bjorkman y Berntorp, Clin. Pharmacokinetics 40:815-32 (2001); y Bjorkman, Hemophilia 9(supl 1 ):101-10 (2003)) y tamaño y composición corporal (Shapiro, Hemophilia 11:571-82 (2005)). Por lo tanto, se ha descubierto que el aclaramiento ajustado al peso (CL) de FIX generalmente disminuye con la edad y/o el peso corporal durante el crecimiento desde la infancia hasta la edad adulta, con un aumento correspondiente de la semivida terminal (t1/2). Para el producto de rFIX (BENEFIX™), el CL y la distribución del volumen en estado estacionario (Vss) aumentan en los niños y después permanecen constantes durante la edad adulta; por lo tanto, estos parámetros se supervisarán de cerca en los estudios pediátricos.
[0335] Los niveles máximos de actividad procoagulante de FIX (FIX:C) dependen del volumen inicial de distribución de FIX:C después de dosis únicas y/o repetidas de FIX. La distribución inicial de FIX es rápida. Sin embargo, se ha demostrado que la recuperación in vivo (recuperación incremental media) para BENEFIX™ fue normalmente un 30 % menor que la de un factor de coagulación derivado del plasma purificado con anticuerpos monoclonales (pdFIX) (Roth et al., Blood 98:3600-3606 (2001)). Además, los estudios con pdFIX han demostrado que los sujetos de 15 años y menores tienen una recuperación significativamente menor que los que son mayores (White et al., Thromb. Haemost. 73:779-84 (1995)). Por lo tanto, el control de los niveles mínimos y máximos también se realizará en los estudios pediátricos.
[0336] Dado que los estudios han demostrado que los niños pueden responder de manera diferente en comparación con los adultos, se realizarán evaluaciones farmacocinéticas en el nivel basal con 50 UI/kg de rFIXFc en niños con muestreo farmacocinético abreviado.
[0338] El estudio de fase 1/2a (SYN-FIXFc-07-001) que evalúa el perfil de seguridad y farmacocinética de una única administración intravenosa de rFIXFc en PTP de 18 años o más con hemofilia B grave se completó recientemente. Los resultados preliminares de esta exploración inicial en seres humanos demuestran un aumento de aproximadamente 3 veces en los parámetros farmacocinéticos (semivida terminal media, MRT y ABC) de rFIXFc en comparación con lo que se ha informado en la bibliografía para BENEFIX™ (véase más arriba). Además, rFIXFc fue bien tolerado y no hubo signos de reacciones en el lugar de inyección, así como no se desarrollaron inhibidores. Juntos, estos resultados de seguridad y farmacocinética respaldan el inicio de un estudio de registro de fase 1/2/3 (estudio 998HB102 (B-LONG), véase anteriormente) que evalúa la seguridad, farmacocinética y eficacia de rFIXFc en la prevención y el tratamiento de la hemorragia en 104 PTP (con al menos 100 ED de tratamiento a productos anteriores) de 12 años o más con hemofilia B grave (<2 %). Una vez que se disponga de suficientes datos de seguridad del estudio de registro, se iniciará un programa de pediatría para investigar más a fondo la seguridad y eficacia de rFIXFc en niños. La demostración de la semivida prolongada de rFIX en seres humanos significará que se necesitarán inyecciones menos frecuentes para la prevención y el tratamiento de la hemorragia en individuos con hemofilia B.
[0340] Estudio de PTP pediátricos de fase 2/3 en niños tratados previamente (<12 años)
[0342] Una vez que los datos estén disponibles sobre 10 PTP (≥12 años) para 26 ED del estudio de registro (estudio 998HB 102), se iniciará un estudio pediátrico, fase 3. Este estudio pediátrico de fase 2/3, en PTP que tenían al menos 50 ED a productos de FIX antes de la inscripción, se realizará a nivel mundial en aproximadamente 25 centros clínicos. Aproximadamente 25 PTP (para garantizar 20 sujetos evaluables), de 2-11 años de edad con hemofilia B grave (<2 UI/dl [<2 %] de FIX endógeno), se seleccionarán de acuerdo con los criterios predefinidos. Todos los sujetos evaluables completarán la parte farmacocinética del estudio (FC con producto de FIX previo al estudio y después FC con rFIXFc) y recibirán una administración semanal de rFIXFc durante 52 semanas. Este estudio registrará la recuperación incremental, la semivida in vivo, el ABC y el aclaramiento de rFIXFc. Todos los sujetos se someterán a una evaluación farmacocinética en el nivel basal con FIX y rFIXFc previos al estudio y la duración del estudio para cada sujeto será de aproximadamente 69 semanas, incluidos la selección y el seguimiento.
[0344] Cada sujeto recibirá 50 UI/kg de rFIXFc en el nivel basal para la evaluación farmacocinética seguida de una administración semanal repetida con 50-60 UI/kg de rFIXFc. Con respecto al cumplimiento del paciente, se empleará un muestreo farmacocinético abreviado para el producto previo al estudio y para rFIXFc de la siguiente manera: antes de la dosis, final de la inyección, 30 10 minutos, 3 ± 1 horas, 24 ± 3 (día 1), 72 ± 3 (día 3), 120 ± 3 (día 5) y 168 ± 3 horas (día 7) después del final de la inyección. Para abordar la inmunogenia, todos los sujetos se tratarán con rFIXFc semanalmente durante un mínimo de 50 ED. Se incluirán parámetros de seguridad para una evaluación inmediata de la seguridad y la tolerabilidad, tales como: (a) signos vitales (pulso, presión arterial, frecuencia respiratoria, temperatura) en la inyección previa a rFIXFc y 30 minutos después de la inyección; (b) parámetros de hematología y coagulación; (c) bioquímica clínica; (d) determinaciones de inhibidores de FIX frecuentes usando el ensayo Bethesda modificado con Nijmegen (inmediatamente antes de la primera exposición, ED4 [semana 4], ED12, e D24, ED36 y ED50); y (e) acontecimientos adversos.
[0346] La eficacia se evaluará mediante la evaluación del número de episodios hemorrágicos, los intervalos hemorrágicos y el número de tratamientos y el consumo de FIX por año anualizado y por evento.
[0348] Estudio de PUP pediátricos de fase 2/3 en niños no tratados previamente (0 - 11 años)
[0350] Una vez que los datos de 10 niños tratados previamente (2-11 años) con farmacocinética completa y 50 ED estén disponibles en el estudio anterior, se iniciará un estudio de PUP pediátricos de fase 2/3. Este estudio se realizará a nivel mundial en aproximadamente 60 centros clínicos. Se seleccionarán y evaluarán hasta 30 PUP (para garantizar 20 sujetos evaluables) de 0 años y más con hemofilia B grave (<2 UI/dl [<2 %] de FIX endógeno) de acuerdo con los criterios predefinidos.
[0351] La participación en el estudio variará ya que el tratamiento de inicio puede comenzar usando rFIXFc como pauta profiláctica modificada. Se espera que la participación por paciente en el estudio sea de aproximadamente cuatro años, incluidos la selección y el seguimiento. Durante este tiempo, se espera que la mayoría de los pacientes alcancen 50 ED a rFIXFc. Para abordar la inmunogenia, todos los sujetos se tratarán con aproximadamente 50 ED de rFIXFc o durante un máximo de 4 años. Se incluirán parámetros de seguridad para la evaluación inmediata de la seguridad y la tolerabilidad: (a) determinaciones de inhibidores de FIX frecuentes usando el ensayo Bethesda modificado con Nijmegen; y (b) acontecimientos adversos.
[0353] La eficacia se evaluará mediante la evaluación del número de episodios hemorrágicos, los intervalos hemorrágicos y el número de tratamientos y el consumo de FIX por año anualizado y por evento.
[0355] Ejemplo 5. Caracterización bioquímica, actividad y análisis FC en animales no humanos
[0357] El rFIXFc producido en el Ejemplo 3 se caracterizó por su modificación postraduccional y se obtuvieron los siguientes resultados (véanse la Tabla 15 y la Figura 11). El propéptido de rFIXFc se procesó adecuadamente durante la producción. El patrón de gamma-carboxilación de rFIXFc fue similar al de rFIX. Además, Gla/molécula total (11.2 ± 0.7) de rFIXFc fue comparable a rFIX. Debido a que la gamma-carboxilación en ciertos residuos es esencial para la actividad de FIX, estos son resultados importantes. Además, la fosforilación de Ser 158 y la sulfatación de Tyr 155 de rFIXFc fueron comparables a rFIX. Los glucanos ligados a N en FIX no están completamente sialilados, similar a rFIX. La glucosilación ligada a O rFIXFc en el primer dominio EGF fue la misma que FIX, aunque en diferentes relaciones relativas. Asp 64 de rFIXFc tuvo un grado más alto de beta-hidroxilación que rFIX o FIX derivado del plasma (pdFIX). FIX activado estuvo presente a un nivel mucho menor en la preparación de rFIXFc que en las preparaciones de rFIX o pdFIX, como se analiza en detalle en el Ejemplo 3.
[0359] Además, se administró rFIXFc a diversas especies animales para determinar su actividad y parámetros FC. Los resultados se muestran en la Tabla 16 y las Figuras 12-16.
[0361] Ejemplo 6. Gamma-carboxilación
[0363] Los objetivos de este estudio fueron analizar y caracterizar la Y-carboxilación de los ácidos glutámicos (Gla) en un lote preclínico de material de FIXFc y productos de FIX disponibles comercialmente, caracterizar el contenido de Gla de una fracción "pico" enriquecida y una fracción de "arrastre" por elución con alto contenido de sal originada a partir de una etapa de intercambio iónico de cromatografía de pseudoafinidad, y separar adicionalmente un "pico" enriquecido y una fracción de "arrastre" por elución con alto contenido de sal por HPLC de intercambio aniónico y caracterizar aún más las especies separadas.
[0365] Para lograr estos objetivos, se desarrollaron una serie de métodos analíticos complementarios. Estos incluyen análisis de aminoácidos (AAA) usando hidrólisis básica para determinar el contenido (total) de Gla, mapa peptídico (LC/MS) usando péptidos Lys-C para determinar la distribución de Gla, HPLC de intercambio aniónico analítico de moléculas intactas para separar isoformas y tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) para determinar la actividad biológica.
[0367] Los dos péptidos que contienen Gla (E) son:
[0368] • K1K2: YNSGKL7£ 8£FVQGNL15£R17£CM20£ 21£K
[0369] o [M+H]+6 Gla = 2953.9
[0370] o [M+H]+5 Gla = 2909.9
[0371] • K3: CSF26£ 27£AR30£VF33£NT36£RTT40£FWK
[0372] o [M+H]+6 Gla = 2959.9
[0373] o [M+H]+5 Gla = 2915.9
[0374] o [M+H]+4 Gla = 2871.9
[0376] Treinta microgramos de muestra (procedentes de la fracción de pico enriquecida, fracción de arrastre con alto contenido en sal y cada especie de la HPLC analítica de intercambio aniónico) se desnaturalizaron, se redujeron, alquilaron y se digirieron con Lys-C (1:20, E:S). La digestión se inactivó con TFA al 2 % y se inyectó en una columna de Phenomenex Jupiter C18 (2.0 * 250 mm). La separación se realizó en un sistema Agilent 1100. La columna se mantuvo a 25 °C y los péptidos se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo de varias etapas. La espectrometría de masas (Thermo-Fisher LCQ) se realizó en modo "Triple Play".
[0378] Se desarrollaron métodos complementarios para analizar y caracterizar el contenido de Gla y la distribución del material de rFIXFc preclínico. Se realizó la Y-carboxilación del contenido y distribución de ácidos glutámicos (Gla) en un lote preclínico de rFIXFc (fracción máxima enriquecida) y se comparó con productos comercialmente disponibles. El análisis demostró un contenido y distribución de Gla similares con respecto a productos comercialmente disponibles. Se analizó una fracción de "arrastre" por elución con alto contenido de sal y se comparó con la fracción de pico enriquecida. El análisis indicó un nivel reducido de Y-carboxilación.
[0379] FIXFc (fracción de pico enriquecido) se aisló de la etapa de intercambio iónico de cromatografía de pseudoafinidad y se separó adicionalmente en 3 isotermas mediante HPLC analítica de intercambio aniónico. La carga en columna de AEX y las especies separadas estuvieron altamente carboxiladas en<y>. (La carga en la columna de AEX es la fracción de arrastre recogida durante una etapa de elución con alto contenido de sal de la etapa de intercambio iónico de la cromatografía de pseudoafinidad). La carga en la columna de AEX y las especies separadas fueron biológicamente activas. El contenido y distribución de Gla fue similar al de rFIX. El mapa peptídico indica la distribución de 4/5/6 Gla en el péptido K3. El mapa peptídico indica una población alta de 6 Gla en el péptido K1K2 y un nivel de trazas de 5 Gla.
[0381] FIXFc (fracción de pico de arrastre) se aisló de la etapa de intercambio iónico de la cromatografía de pseudoafinidad y se separó adicionalmente en 2 isoformas mediante HPLC analítica de intercambio aniónico. La carga en la columna de AEX y las especies separadas se redujeron en el nivel de Y-carboxilación. Se redujo el contenido de Gla con respecto a la fracción de pico enriquecida con FIXFc. Se observó una disminución del nivel de actividad biológica. El mapa peptídico indica un aumento de la población de 5 Gla en K1K2 con respecto a la fracción de pico enriquecida y puede sugerir un impacto en la actividad biológica.
[0383] Referencias: Dumont JA, et al., Monomeric Fc Fusion Molecules in Therapeutic Abs-From Bench to Clinic, Ch. 33 p779-795; Gillis S, et al., Protein Science (1997) 6:185; White GC, et al., J. Thrombosis and Haemostasis (1997) 78:261; Hansson K, y Stenflo J, Journal Thrombosis and Haemostasis (2005) 3:2633; y Peters RT, et al., Blood (2010) 115:2057.
[0385] Ejemplo 7. Evaluación de la actividad procoagulante de rFIXFc en modelos de hemorragia de ratones HemB
[0386] Se demostró una potencia comparable de rFIXFc y BENEFIX™ en ROTEM de sangre completa de ratón HemB in vitro y en un modelo de hemorragia con pinza en la cola de ratones HemB in vivo.
[0388] La capacidad de rFIXFc para formar coágulos firmes y estables se evaluó mediante tromboelastometría de rotación (ROTE<m>®, Pentapharm GmbH, Múnich, Alemania) con cloruro de calcio como activador (NATEM). La sangre completa agrupada recogida a través de la vena cava de ratones HemB se dividió en siete alícuotas, que se enriquecieron con rFIXFc a una concentración final del 7.4 %, 0.74 % y 0.074 % de la actividad normal de FIX plasmático, o BENEFIX™ al 10 %, 1 %, 0.1 % de la actividad normal. Como control negativo, una muestra de sangre se enriqueció con tampón de formulación de FIX. Se generaron un total de 10 conjuntos de sangre de 5 ratones HemB para completar la evaluación. La reacción con NATEM se inició mediante la adición de CaCh. Se evaluaron los parámetros de coagulación, incluido el tiempo de coagulación (CT), el tiempo de formación de coágulos (CFT) y el ángulo alfa. La media y la DE de CT, CFT y el ángulo alfa se resumen en la Tabla 17. Las respuestas a la dosis para los tres parámetros se representan en la Figura 17. Los tres parámetros son comparables entre rFIXFc y BENEFIX™ en el intervalo de dosis probado (p>0.05 mediante análisis ANOVA unidireccional (Kruskal-Wallis)).
[0390] También se evaluó la eficacia aguda de rFIXFc en el modelo de hemorragia con pinza de la cola de ratones HemB. (Figura 18). Los ratones HemB macho se estratificaron para una presentación igual del peso corporal y la edad en diferentes grupos de tratamiento. Antes de la lesión por pinza de la cola, los ratones se anestesiaron con una mezcla de 50 mg/kg de ketamina y 0.5 mg/kg de dexmedetomidina y se colocaron en una almohadilla térmica para ayudar a mantener la temperatura corporal. A continuación, las colas de los ratones se sumergieron en agua a 37 °C durante 10 minutos para dilatar la vena lateral. Después de la dilatación de la vena, rFIXFc, BENEFIX™ o vehículo se inyectaron a través de la vena de la cola y 5 min más tarde, los 4 mm distales de la cola se cortaron después usando un bisturí n.° 11 con borde recto. La sangre derramada se recogió en 13 ml de solución salina caliente durante 30 minutos y la pérdida de sangre se cuantificó gravimétricamente. Se evaluaron seis grupos de tratamiento con rFIXFc (720, 360, 240, 120, 80, 40 UI/kg, n=15) y tres grupos de tratamiento BENEFIX™ (360, 120, 40 UI/kg, n=15). El valor de pérdida de sangre del animal individual y la curva de respuesta a la dosis de la mediana de la pérdida de sangre se muestran en la Figura 19(A), y la mediana del volumen de pérdida de sangre de cada grupo de tratamiento se resume en la Tabla 18. La respuesta a la dosis en la mediana del volumen de pérdida de sangre tanto para rFIXFc como para BENEFIX™ son comparables (p = 0.9315 mediante la prueba de latpara datos independientes con corrección de Welch).
[0392] Para determinar si la semivida prolongada tres veces de rFIXFc con respecto a BENEFIX™ dio como resultado una eficacia prolongada de rFIXFc, los presentes inventores evaluaron la eficacia de rFIXFc y BENEFIX™ tanto en el ensayo ROTEM® ex vivo como en el modelo de hemorragia por corte transversal de la vena de la cola (TVT) en ratones HemB. Figura 20.
[0394] Para ROTEM® ex vivo, los ratones HemB macho recibieron 50 UI/kg de rFIXFc o 100 UI/kg de BENEFIX™ mediante inyección intravenosa. Se recogió sangre completa de la vena cava de animales tratados a los 5 min, 24, 72, 96, 120, 168 y 216 horas después de la administración de rFIXFc (n = 8 ratones en cada punto de tiempo) o a los 5 min, 24, 48, 72 y 96 horas después de la administración de BENEFIX™ (n = 4 ratones/punto de tiempo). Las muestras de sangre se analizaron inmediatamente por NATEM. La media y la DE para CT, CFT y el ángulo alfa se muestran en la Tabla 19, y las curvas de CT, CFT y el ángulo alfa frente al tiempo se muestran en la Figura 21. En comparación con BENEFIX™, rFIXFc mostró CT, CFT y ángulo alfa comparables a los 5 min, pero CT, CFT y el ángulo alfa mejoraron significativamente después de 72 h a pesar de una dosis 2 veces menor con respecto a BENEFIX™.
[0396] Para evaluar la eficacia profiláctica de rFIXFc y BENEFIX™, los ratones HemB macho se estratificaron para una representación igual del peso corporal y la edad en 9 grupos de tratamiento diferentes. rFIXFc se administró mediante inyección iv a una dosis de 4 UI/kg, 13 UI/kg, 40 UI/kg y 120 UI/kg a las 72 horas antes de la transacción de la vena de la cola, mientras que las mismas dosis de BENEFIX™ se administraron 24 horas antes de la lesión. Antes del corte transversal de la vena de la cola, los ratones se anestesiaron con una mezcla de 50 mg/kg de ketamina/0.125 mg/kg de dexmedetomidina/ 0.1 mg/kg de Buprenex. Para permitir que los ratones mantuvieran una actividad normal después del corte transversal de la vena de la cola, se administró una disolución de atipamezol 1 mg/kg para invertir el efecto de la dexmedetomidina, lo que siguió inmediatamente del corte transversal de la vena de la cola lateral con una cuchilla quirúrgica número 11 de bordes rectos en un área donde el diámetro de la cola es de aproximadamente 3 mm. La sangre derramada se lavó con solución salina caliente para garantizar una observación clara de la herida y, a continuación, el ratón se alojó solo en una jaula limpia con lecho de papel blanco durante las siguientes 24 horas. La nueva hemorragia y la actividad física se observaron y registraron cada hora hasta 12 horas después de la lesión. Los ratones moribundos se sacrificaron inmediatamente después de la identificación, y se realizó una revisión 24 horas después de la lesión para completar el estudio. La curva de Kaplan-Meier para el tiempo hasta la eutanasia y el gráfico de las tasas de supervivencia 24 horas después del TVT se mostraron en la Figura 22. La prueba del orden logarítmico determinó que todos los grupos de tratamiento con dosis superior a 4 UI/kg son significativamente mejores que el grupo vehículo (p<0.001). Además, la supervivencia es comparable entre los ratones que recibieron la misma dosis de rFIXFc a las 72 h antes de la lesión que la de BENEFIX™ a las 24 h antes de la lesión (p= 0.4886, 0.9268, 0.7279 y 0.5209 para grupos de dosis de 4, 13, 40 y 120 UI/kg, respectivamente). Se representaron las tasas de supervivencia 24 horas después del TVT y se extrapoló el valor de DE50 para cada molécula de la curva, la DE50 para los dos tratamientos son similares con 17.8 UI/kg para rFIXFc y 15.4 UI/kg para rFIX. Por lo tanto, rFIXFc proporcionó una duración 3 veces mayor de la protección en ratones HemB en relación con una dosis comparable de BENEFIX™ medida por supervivencia y la nueva hemorragia después de una lesión por corte transversal de la vena de la cola. Por lo tanto, rFIXFc proporcionó una duración 3 veces mayor de la protección en ratones HemB en relación con una dosis comparable de BENEFIX™ medida por supervivencia y la nueva hemorragia después de una lesión por corte transversal de la vena de la cola.
[0398] En conclusión, como muestran los datos, mientras que 15.4 UI/kg de BENEFIX™ dieron como resultado que el 50 % de los ratones HemB sobrevivieran al corte transversal de la vena de la cola 24 h después de la administración, 17.8 UI/kg de rFIXFc lograron una supervivencia del 50 % en animales que se lesionaron a las 72 h después de la administración. Por lo tanto, rFIXFc demuestra una eficacia profiláctica 3 veces más larga en correlación con su prolongación de la semivida con respecto a BENEFIX™. Los resultados de los modelos de hemorragia se corroboran además mediante análisis ex vivo ROTEM® de sangre completa de ratones HemB tratados con 100 UI/kg de BENEFIX™ o 50 UI/kg de rFIXFc. A los 5 min después de la administración, se observó una mejora comparable en la formación de coágulos en ambos grupos de tratamiento. Sin embargo, los principales parámetros de ROTEM®, tales como el tiempo de coagulación, el tiempo de formación de coágulos y el ángulo alfa, mejoraron significativamente en ratones tratados con rFIXFc a las 72 a 216 horas después de la administración, a pesar de una dosis 2 veces menor de rFIXFc con respecto a BENEFIX™.
[0400] En resumen, la potencia aguda de rFIXFc es comparable a la de BENEFIX™ como se muestra tanto en ROTEM® de sangre completa in vitro como en el modelo de hemorragia por pinza de la cola en ratones HemB. La eficacia profiláctica prolongada de rFIXFc se mostró en ROTEM® de sangre completa ex vivo de ratones HemB tratados y se determinó que era aproximadamente 3 veces más larga en comparación con BENEFIX™ en el modelo de hemorragia por corte transversal de la vena de la cola en ratones HemB. La eficacia prolongada de rFIXFc se correlaciona bien con la T1/2 3 veces más larga de rFIXFc con respecto a BENEFIX™ demostrada previamente en un estudio farmacocinético en ratones HemB. Por lo tanto, rFIXFc es totalmente activo para el tratamiento a demanda al tiempo que logra una protección profiláctica significativamente prolongada con el potencial de reducir la frecuencia de administración, que están en investigación en el estudio de fase 3.
[0402] Ejemplo 8. Análisis farmacocinético y farmacodinámico de rFIXFc y BENEFIX™ después de una dosis subcutánea única en ratones deficientes en FIX
[0404] Los perfiles farmacocinéticos (FC) y farmacodinámicos (FD) del factor IX-Fc recombinante (rFIXFc) y BENEFIX™ (rFIX) se determinaron después de una única inyección intravenosa o subcutánea de 200 o 400 UI/kg en ratones deficientes en FIX. Se recogió sangre completa a través de la vena cava (n = 4 ratones/punto de tiempo/tratamiento). Las concentraciones de rFIXFc y BENEFIX™ en plasma se determinaron usando un ELISA específico de FIX humano. Las actividades de FIX y BENEFIX™ se determinaron usando un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT). Los análisis FC se realizaron usando metodología dependiente del modelo usando WinNonLin. Los resultados se muestran en las Tablas 22 y 23.
[0406] Para FIXFc, la biodisponibilidad en ratones deficientes en FIX fue del 38 % para la dosis de 200 UI/kg y del 38-46 % para la dosis combinada (ELISA de antígeno) y del 29 % para la dosis de 200 UI/kg y del 29-39 % para la dosis combinada (ensayo de actividad de aPTT) en comparación con rFIX, el 23 % y el 19 %, respectivamente. El rFIXFc tuvo una biodisponibilidad mejorada de 1.5-1.7 veces (200 Ul/kg de dosis) y 1.5-2.5 veces (dosis combinadas) en comparación con BENEFIX™.
[0408] Para rFIXFc, la semivida terminal (ELISA de antígeno) fue de 62 h para la dosis de 200 UI/kg y de 51-62 h para las dosis combinadas y la semivida terminal (ensayo de actividad de aPTT) fue de 42 h para la dosis de 200 UI/kg y de 40-42 h para las dosis combinadas, mientras que para BENEFIX™, la semivida terminal fue de 24 h (ELISA de antígeno) para la dosis de 200 UI/kg y de 17 h (ensayo de actividad de aPTT) para la dosis de 200 UI/kg. Esto indica una mejora de 2.5-2.6 veces (dosis de 200 UI/kg y dosis combinada) en la semivida con rFIXFc.
[0410] Además, como muestran las Tablas 22 y 23, rFIXFc tuvo un aumento de 4.5-5.6 veces en el ABC/dosis y un aumento de 1.9-3.7 veces en la Cmáx/dosis frente a BENEFIX™.
[0412] La proteína de fusión factor IX recombinante-Fc (rFIXFc) es una forma de acción prolongada de FIX recombinante (rFIX) que proporcionará una administración menos frecuente de rFIX para el tratamiento de la hemofilia B. De ratones a primates no humanos y en pacientes con hemofilia B, rFIXFc tiene una semivida aproximadamente 3 veces más larga frente a rFIX (BENEFIX™). Para el tratamiento profiláctico, la administración intravenosa de rFIX sigue siendo un método de administración engorroso, especialmente para niños y en pacientes con venas poco accesibles. La administración subcutánea de rFIX se presenta como una vía de administración más atractiva que es menos invasiva y con una administración menos frecuente. Como tal, la administración subcutánea de rFIXFc causará menos dolor y molestias que la administración intravenosa y dará como resultado un mejor cumplimiento debido a que es más fácil de administrar y se administra en menos tiempo que una vía intravenosa. Las pautas profilácticas también mejorarán la calidad de vida y los resultados clínicos incluirán una disminución de las incidencias hemorrágicas.
[0414] La concentración de rFIXFc en plasma de ratón se midió usando un ELISA específico de FIX humano que midió la parte de FIX de la molécula y en el análisis se usó la dosis nominal de mg/kg. En la Tabla 20 (ELISA de antígeno) y en la Tabla 21 (ensayo de actividad de aPTT) se muestra un resumen de los parámetros FC para rFIXFc y BENEFIX™ para n=4/grupo. Tanto el análisis por antígeno como la actividad mostraron que la Cmáx y el ABC mejoraron significativamente para rFIXFc frente a BENEFIX™. Usando el ELISA de antígeno, la biodisponibilidad (% de F) fue del 38 % para rFIXFc frente al 23 % para BENEFIX™. De manera similar, usando el ensayo de actividad de aPTT, la biodisponibilidad fue del 29 % para rFIXFc frente al 19 % para BENEFIX™. Por lo tanto, rFIXFc demostró un aumento en la biodisponibilidad sobre BENEFIX™ de 1.5 a 1.6 veces. Las mediciones de la semivida de eliminación mostraron que rFIXFc aumentó notablemente la semivida, ya sea medida mediante ensayos de antígeno (rFIXFc 62 h frente a BENEFIX™ 24 h) o actividad (rFIXFc 42 h frente a BENEFIX™ 17 h). Estos datos muestran que rFIXFc tuvo una semivida prolongada en comparación con BENEFIX™ de 2.6 a 2.5 veces.
[0416] El rFIXFc administrado por vía subcutánea a ratones deficientes en FIX demostró un perfil FC y FD con aumentos en la Cmáx y el ABC para rFIXFc en comparación con BENEFIX™. En general, la biodisponibilidad para rFIXFc varió del 29 % (actividad) al 38 % (antígeno) con una semivida de 42 h (actividad) a 62 h (antígeno) en comparación con BENEFIX™, que tenía biodisponibilidad del 19-23 % y semivida del 17-24 %, respectivamente. Por lo tanto, la semivida de rFIXFc administrado por vía subcutánea en ratones deficientes en FIX demostró un aumento de aproximadamente 2.2 (antígeno) a 3.3 (actividad) veces con respecto a los productos de rFIX comercializados actualmente administrados por vía intravenosa. En general, estos datos respaldan la idea de que rFIXFc administrado por vía subcutánea será de beneficio clínico para el tratamiento profiláctico en pacientes con hemofilia B.
[0418] Ejemplo 9. Análisis farmacocinético de rFIXFc después de una dosis subcutánea única en macacos cangrejeros
[0420] El perfil farmacocinético (FC) del factor IX-Fc recombinante (rFIXFc) se estudió después de una dosis subcutánea única de 50 UI/kg, 100 UI/kg o 200 UI/kg en macacos cangrejeros. La concentración de rFIXFc en plasma se midió utilizando un ELISA específico de FIX. El análisis primario se realizó usando metodología dependiente del modelo usando WinNonLin. Véanse las Tablas 22-25.
[0422] El análisis farmacocinético de la concentración plasmática frente a los datos de tiempo (medidos mediante ELISA específico de FIX) demostró que la biodisponibilidad y la semivida terminal eran similares entre las dosis. Las biodisponibilidades para rFIXFc fueron del 40 % (50 UI/kg), el 34 % (100 UI/kg), el 36 % (200 UI/kg) y el 36-45 % (dosis combinadas). Las semividas terminales para rFIXFc fueron de 61 h (50 UI/kg), 45 h (100 UI/kg), 49 h (200 UI/kg) y 44­ 58 h (dosis combinadas).
[0424] La concentración de rFIXFc en plasma de macaco se midió usando un ELISA específico de FIX que midió la parte de FIX de la molécula y en el análisis se usó la dosis nominal de mg/kg. El análisis de picos y recuperación demostró la precisión de este ensayo ELISA específico de FIX para detectar rFIXFc en el intervalo de concentraciones plasmáticas evaluadas. Se muestra un resumen de los parámetros FC para rFIXFc en la Tabla 22 (50 UI/kg), la Tabla 23 (100 UI/kg) y la Tabla 24 (200 UI/kg) para n=3/grupo. Para rFIXFc SC, las medias geométricas y el % CV de la media geométrica para la Cmáx fueron de 860 22 (50 UI/kg), 1630 97 (100 UI/kg) y 3,750 26 (200 UI/kg), lo que indica, respectivamente, un aumento dependiente de la dosis. Se observaron aumentos similares para ABC. Las medias geométricas para la biodisponibilidad (% F) fueron 40 16 (50 UI/kg), 30 75 (100 UI/kg) y 36 27 (200 UI/kg), lo que demuestra que la biodisponibilidad fue similar entre las dosis. Las mediciones de la semivida terminal mostraron que la semivida fue similar entre las dosis a 58 39 h (50 Ul/kg), 45 13 h (100 Ul/kg) y 46 44 h (200 Ul/kg).
[0425] El rFIXFc administrado por vía subcutánea a macacos cangrejeros demostró un perfil FC con aumentos dependientes de la dosis en Cmáx y ABC. En general, la biodisponibilidad varió del 30-40% con una semivida de 45-58 h. Por lo tanto, la semivida de rFIXFc administrada por vía subcutánea en macacos demostró un aumento de aproximadamente 2.8 veces con respecto a los productos de rFIX comercializados actualmente administrados por vía intravenosa. En general, estos datos respaldan la idea de que rFIXFc administrado por vía subcutánea será de beneficio clínico para el tratamiento profiláctico en pacientes con hemofilia B.
[0427] Ejemplo 10. Pautas posológicas profilácticas previstas
[0429] En comparación con la pauta posológica recomendada estándar de 25 a 40 UI/kg de FIX dos o tres veces a la semana, los resultados FC de la mediana de la actividad de rFIXFc del estudio de fase 1/2a descrito anteriormente sugieren que la administración de rFIXFc aproximadamente una vez a la semana a aproximadamente 22.5 UI/kg, o aproximadamente cada 10 días a aproximadamente 45 UI/kg, o aproximadamente cada 2 semanas a aproximadamente 120 UI/kg, es suficiente para mantener un mínimo del 1 % por encima del valor basal (Figura 24). Estas estimaciones simuladas del modelo se validan mediante los datos disponibles del ensayo de fase 1/2a, que están completamente dentro del intervalo de confianza del 95 % de la curva de actividad simulada a lo largo del tiempo. Estas pautas a menudo servirán al comienzo de la terapia. Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los acontecimientos hemorrágicos intercurrentes notificados en relación con el nivel mínimo de actividad de FIX plasmático, las dosis de mantenimiento deberán ajustarse individualmente.
[0431] Después del recálculo de los resultados FC del estudio de fase 1/2 (véase el Ejemplo 11), la nueva pauta posológica prevista, por ejemplo, para la profilaxis, es de 20 UI/kg una vez a la semana, de 40 UI/kg cada 10 días o de 100 UI/kg cada dos semanas (dos veces al mes). Véanse también la Tabla 27 y la Figura 25.
[0433] Ejemplo 11. Recálculo de los datos farmacocinéticos del primer estudio en seres humanos (FiH) (Ejemplo 1)
[0434] Se incluyeron sujetos con una variedad de genotipos de hemofilia B, tales como mutaciones de codón de parada/finalizadoras y de sentido alterado, en el estudio FiH analizado en el Ejemplo 1. Varios sujetos tenían niveles de antígeno FIX endógeno marcadamente reducidos que se correlacionaban con una actividad de FIX marcadamente reducida, mientras que algunos sujetos con genotipos de sentido alterado tenían más antígeno que actividad medida, lo que indica una proteína circulante disfuncional. La actividad de FIX previa al tratamiento en 2 sujetos excedió 2 UI/dl, probablemente debido a un lavado incompleto de su última infusión de concentrado de FIX basado en pruebas históricas y fenotipo de la enfermedad. Basándose en esta información, los datos FC del Ejemplo 1 se recalcularon sin resta del valor basal, como se describe a continuación en detalle. Véase la Tabla 27.
[0436] A diferencia de los cálculos FC (basados en la actividad) en el Ejemplo 1, si la FC de la actividad de rFIXFc se modela sin resta del valor basal, como se informó recientemente para el análisis FC de un rFIX glucoPEGilado (Negrier et al., Blood DOI 10.1182/Blood 2011 02 335596 (2011)), las estimaciones resultantes de la semivida de eliminación y el MRT son mucho más largas que las estimaciones del Ejemplo 1, en 82.2 ± 21.6 y 96.8 ± 22.0 horas (media ± De ), respectivamente. Sin embargo, con el conocimiento de que no todos los pacientes con hemofilia B grave tienen una actividad de FIX endógeno del 0 %, y teniendo en cuenta el genotipo y el nivel de antígeno FIX endógeno del paciente, los presentes inventores adoptaron un método de análisis de resta del valor basal en su modelado FC. Específicamente, (a) el valor basal en dos pacientes se definió como 0 % porque su actividad de FIX previa al tratamiento era <1 %, no tenían antígeno FIX detectable y tenían genotipos de sentido alterado, (b) el valor basal para tres pacientes se estableció en el 0.5 % porque su actividad de FIX previa al tratamiento era <1 % y tenían antígeno FIX detectable, (c) para pacientes cuya actividad de FIX previa al tratamiento estaba entre el 1 - 2 %, Cmín (la actividad más baja a lo largo del estudio FC) se definió como valor basal, y (d) para pacientes cuya actividad de FIX previa al tratamiento fue ≥2 %, el 2 % (que era el límite superior para la inscripción en el ensayo) fue el valor basal. La actividad por encima del valor basal antes de la administración se consideró fármaco residual del tratamiento previo, y decayó al valor basal y se restó de los datos FC después de la administración de rFIXFc.
[0438] La semivida terminal media resultante (56.7 ± 10.9 horas, intervalo de 42.4 - 74.5 horas) y el MRT (71.8 ± 10 horas, intervalo de 53.2 - 85.9 horas) de rFIXFc son aproximadamente 3 veces más largas que la notificada para rFIX. La semivida terminal notificada de rFIX es de 19.3 ± 4.97 horas (intervalo de 11.1 - 36.4 horas) y el MRT de 26.0 ± 6.07 horas (intervalo de 15.8 - 46.1 horas). Roth et al., Blood 98:3600-3606 (2001); y Summary of Product Characteristics for BENEFIX™, Electronic Medicines Compendium (2010) (http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20376/SPC/BENEFIX™/#PHARMACODYNA MIC_PROPS). Por lo tanto, los intervalos para rFIXFc no se solapan con los intervalos para rFIX. Del mismo modo, el CL medio de la actividad de rFIXFc (3.18 ± 0.78 ml/h/kg, intervalo de 2.05 - 4.18 ml/h/kg) es aproximadamente 2.6 veces menor que el notificado para rFIX (8.40 ± 2.01 ml/h/kg, intervalo de 4.66 - 13.64 ml/h/kg), mientras que el Vss de ambas proteínas son comparables a 4-5 veces el volumen plasmático.
[0439] Aunque se observó la misma tendencia hacia la mejora en la FC del antígeno rFIXFc, tanto Ti/2a como T1/2P del antígeno rFIXFc fueron significativamente más largas que las derivadas de las mediciones de la actividad de FIX. La Ti/2a estimada para el antígeno rFIXFc se desvía claramente de la normalmente asociada con FIX (2 - 3 horas). Además, el probable lavado incompleto de la terapia de reemplazo previa al estudio antes de la infusión de rFIXFc a veces dio como resultado un valor basal más alto, lo que a su vez podría conducir a una subestimación de la T1/2P de rFIXFc, medida por actividad de FIX. Varios sujetos tuvieron una actividad de aPTT de hasta 3 UI/dl, muy por encima del límite de cuantificación (1 UI/dl) para el ensayo de aPTT, en puntos de tiempo hasta 336 h (14 días) después de la dosis. Sin embargo, estos puntos de tiempo se excluyeron de la estimación de la semivida terminal porque los valores estaban en o solo ligeramente por encima de los valores basales previos al tratamiento, por lo que se considera que han vuelto al valor basal. Por el contrario, los niveles terminales bajos pero detectables de rFIXFc pueden desenmascararse mediante el ELISA del antígeno rFIXFc específico y altamente sensible, que detecta tan bajo como 0.1 UI/dl en comparación con el límite inferior de aPTT de 1.0 UI/dl.
[0441] Los parámetros FC restantes (actividad) cambiaron una pequeña cantidad con respecto a la semivida de eliminación y el MRT. Véase la Tabla 27(B). Se observó un aumento lineal proporcional a la dosis en la actividad de FIX basado en Cmáx que se produjo inmediatamente después de la infusión y ABC<inf>(Tabla 4). La actividad de FIX presentó decaimiento biexponencial después de la infusión de rFIXFc, y se caracterizó por una fase de distribución rápida (alfa) seguida de una fase de eliminación logarítmica-lineal (beta). La semivida de distribución media (T1/2a) fue altamente variable para sujetos individuales (media de 3.4 y 10.3 horas para los dos grupos de dosis más altas) (Tabla 27(B)). La semivida de eliminación media (T1/2P) fue independiente de la dosis con respecto al intervalo de dosis terapéutico probado, es decir, 53.5 horas, 57.5 ± 8.2 horas y 56.5 ± 14.1 horas a 25 Ul/kg, 50 Ul/kg y 100 Ul/kg, respectivamente. El tiempo hasta el 1 % (1 UI/dl) por encima del valor basal, una evaluación de la actividad de rFIXFc, mostró un aumento proporcional a la dosis. Fue de 7.3, 10.1 ± 1.5 y 12.3 ± 2.5 días para dosis de 25, 50 y 100 Ul/kg, respectivamente. A las 168 horas (1 semana) después de la dosis, la actividad de FIX plasmático se mantuvo a 1.1 UI/dl, 2.5 ± 0.9 UI/dl y 4.6 ± 1.7 Ul/dl por encima del valor basal para los grupos de dosis de 25, 50 y 100 Ul/kg, respectivamente. También fueron independientes de la dosis MRT, CL y Vss en el intervalo de dosis de 25 a 100 Ul/kg. Además, cada 1 Ul/kg de rFIXFc infundido aumentó la actividad de FIX plasmático en promedio en 0.93 ± 0.18 Ul/dl (Tabla 27(B)), y esta recuperación incremental (K) mostró una correlación positiva débil con el peso corporal (R2= 0.336, p=0.048)
[0443] La experiencia clínica empírica a largo plazo ha sugerido que una actividad de factor plasmático sostenida de tan solo 1 a 2 Ul/dl será adecuada para prevenir acontecimientos hemorrágicos espontáneos en pacientes con hemofilia A y B grave (Nilsson et al., J. Intern. Med. 232:25-32 (1992)), y el aumento de los acontecimientos hemorrágicos está asociado con la cantidad de tiempo bajo el 1 % de la actividad normal de FVIII. Collins et al., Thromb Haemost 7:413-420 (2009). Por lo tanto, los análisis FC proporcionan un medio para optimizar el tratamiento profiláctico con modelos de dosis individualizados para lograr niveles mínimos sostenidos por encima del 1 % (1 Ul/dl) del valor basal, reducir la variación máxima/mínima y mejorar la rentabilidad del tratamiento. Carlsson et al., Haemophilia 4:83-88 (1998); Kisker et al., Haemophilia 9:279-284 (2003).
[0445] Para construir los perfiles de concentración-tiempo siguiendo diferentes pautas posológicas, se realizó una simulación de Monte Carlo usando el modelo FC poblacional de rFIXFc. Las estimaciones medias de los parámetros del modelo (CL, volumen de distribución, aclaramiento intercompartimental y volumen del segundo compartimento) en la población probada, la varianza interindividual y la variabilidad residual se adoptaron para este estudio de fase 1/2a. Wang et al., J. Clin. Pharmacol. 49:1012-1024 (2009). Se simularon mil sujetos por pauta posológica con 14 a 16 puntos de muestreo para cada sujeto. Hubo 14 puntos de muestreo para la administración semanal, 15 para cada administración de 10 días y 16 para la administración cada dos semanas. El peso corporal (BW) se generó de acuerdo con el método publicado, Wanget al.(2009), es decir, basado en una ecuación de potencia de Z = BW-0.5. Se supuso que la mediana del BW en 1000 sujetos era de 75 kg. Basándose en los perfiles de concentración-tiempo simulados, la media ± desviación estándar (DE) de los perfiles de concentración-tiempo del fármaco de los 1000 sujetos se construyó gráficamente para diferentes pautas posológicas. Figura 25.
[0447] En comparación con la pauta posológica recomendada estándar de 25 a 40 Ul/kg de FIX dos veces a la semana, los resultados del modelado FC de la mediana de la actividad de rFIXFc de este estudio muestran que la administración una vez por semana de rFIXFc a 20 Ul/kg, o cada 10 días a 40 Ul/kg, o cada 2 semanas a 100 Ul/kg, es suficiente para mantener un mínimo del 1 % por encima del valor basal. Figura 25. Estas estimaciones simuladas del modelo se validan mediante los datos disponibles de este estudio de fase 1/2a, que están completamente dentro del intervalo de confianza del 95 % de la curva de actividad simulada a lo largo del tiempo. Sin embargo, teniendo en cuenta la heterogeneidad de los acontecimientos hemorrágicos intercurrentes notificados en relación con el nivel mínimo de actividad de FIX plasmático (Bjorkman, Haemophilia 9:101-110 (2003); Ahnstrom et al., Haemophilia 10:689-697 (2004)), la dosis de mantenimiento probablemente requeriría un ajuste individual.
[0449] Tablas
[0451] Tabla 1: Secuencias de polinucleótidos: FIX-Fc
[0452] A. Secuencia de ADN de la cadena de FIX-Fc (SEQ ID NO:1, que codifica SEQ ID NO:2) Secuencia de nucleótidos de pSYN-FIX-030 (nt 1 a 7583):
[0453] Exón 1 de FIX (péptido señalizador, propéptido del 1.er aminoácido); nt 690-777
[0454] Mini intrón de FIX: nt 778-1076
[0455] Secuencia del propéptido de FIX: nt 1077-1126
[0456] Secuencia de FIX maduro: nt 1127-2371
[0457] Fc: nt 2372-3052
[0458] gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagtteatagcccatata tggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgt caataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggt aaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtca tcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttc caagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgta acaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggc taactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttcgcgac gtacggccgceaceatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcateaceatetgccttttag gatatctactcagtgctgaatgtacaggtttgtttccttttttaaaatacattgagtatgcttgccttttagata tagaaatatctgatgctgtcttcttcactaaattttgattacatgatttgacagcaatattgaagagtctaacag ccagcacgcaggttggtaagtactgtgggaacatcacagattttggctccatgccctaaagagaaattggctttc agattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatgt.aaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaac taaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagag gtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaatctagagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttt tgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatca gtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctt tggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaa aaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtga accagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttt tcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatt taatgacttcactcgggttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatgg taaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaac tggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgt gattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaact ggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcct caaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagta ccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctg tgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagg gaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaa ggtgtcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactgacaaaactcacacatgcccaccgtgccc agctccggaactcctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagceacgaagaccctgaggteaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgt cctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagc GCCGatcgagaaaaccatctGGaaagccaaagggcagccGcgagaacGacaggtgtacaccctgccGccatcccg ggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgga gtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttctt cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattcagacatgataagat acattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgcta ttgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccg cgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaa tcgaaatctcgtagcacgtgtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagg A. Secuencia de ADN de la cadena de FIX-Fc (SEQ ID NO:1, que codifica SEQ ID NO:2) gcgaactcccgcccccacggctgctcgccgatGtcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggac acgacctccgaccactcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccggcacc acctggtcctggaccgcgctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtcctccacgaag tcccgggagaacccgagccggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcggtgagcaccggaacg gcactggtcaacttggccatggtttagttcctcaccttgtcgtattatactatgccgatatactatgccgatgat taattgtcaacacgtgctgatcagatccgaaaatggatatacaagctcccgggagctttttgcaaaagcctaggc ctccaaaaaagcctcctcactacttctggaatagctcagaggcagaggcggcctcggcctctgcatañataaaaa aaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcg ggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccac acctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgectgctggggagcctggggactttecacace ctcgtcgagctagcttcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaag ttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtg tactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttcttttt cgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttat ggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctccagtacgtgattcttgatcccgagctggagccaggggcg ggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgc gaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctg ctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttg gggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcceagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccac cgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccc cgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctc cagggggctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaggggcct ttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctgga gcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtgg agactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggt tcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcytgaacacgtggtcgcggcc gcgccgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgaca aaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaac ccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctg aggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaca acagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctGaGGgtGGtgcaGGaggactggctgaatggcaaggagtaGaagtgGa aggtetecaaczaaajccr.tcccagr.ccr.catr.gagaaaaccatctccaaagccaaagggr.agccr.cgagaaceag aggtgtacacoctgcccccatoccgcgatgagotgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggct tctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccg tgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacg tcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggta aatgactcgagagatctggccggctgggcccgtttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgat tctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagt tgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcc taataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggac agcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagtggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggcca gcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatca caaaaatcgaogctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctagaag ctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgt ggGgctttctcatagGtGaGgGtgtaggtatctcagttGggtgtaggtGgttGgGtGGaagctgggctgtgtgGa cgaaccccccgttcagcccgaccgctgGgccttatccggtaactatcgtcttgagtGcaacccggtaagacacga cttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttctt gaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttacctt cggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagca gcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaa cgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtct cgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagc ggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgc ggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaa taccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgcta ttacgcca
[0460] B. Secuencia de ADN de Fc (péptido señalizador de IgK de ratón subrayado) (SEQ ID NO:3, que codifica SEQ ID NO:4) Este es el casete Fc de PSYN-FIX-030. Además, hay un casete de expresión Fc separado que se transfectó en la línea celular en el plásmido PSYN-Fc-015 que codifica la misma secuencia de aminoácidos, pero contiene algunos cambios no codificantes. La segunda copia de la secuencia codificante de Fc permite una mejor relación monómero: dímero.
[0461] A. Secuencia de ADN de la cadena de FIX-Fc (SEQ ID NO:1, que codifica SEQ ID NO:2)atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacaaaactcacacat gcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgl acaccctgcccccatcccgcgatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatc ccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgtl ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtctl ctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466] Tabla 3. Concentración de antígeno FIXFc del paciente individual frente a datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de la infusión y número de paciente
[0467]
[0469] Tabla 3. Concentración de antígeno FIXFc del paciente individual frente a datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de la infusión y número de paciente (continuación)
[0470]
[0471]
[0473] Tabla 3. Concentración de antígeno FIXFc del paciente individual frente a datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de la infusión y número de paciente (continuación)
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0480]  Tabla 5. Actividad media de FIXFc de pacientes individuales y del grupo y actividad de FIXFc corregida con el valor basal frente a los datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de infusión y número de paciente
[0482]
[0485] Tabla 5. Actividad media de FIXFc de pacientes individuales y del grupo y actividad de FIXFc corregida con el valor basal frente a los datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de infusión y número de paciente (continuación)
[0487]
[0488]
[0490] Tabla 5. Actividad media de FIXFc de pacientes individuales y del grupo y actividad de FIXFc corregida con el valor basal frente a los datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de infusión y número de paciente (continuación)
[0491]
[0492]
[0494] Tabla 5. Actividad media de FIXFc de pacientes individuales y del grupo y actividad de FIXFc corregida con el valor basal frente a los datos de tiempo; ordenados por dosis nominal, dosis real, duración de infusión y número de paciente (continuación)
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500] Tabla 8. Estudio de fase 1/2a: Comparación de los parámetros FC para rFIXFc y BENEFIX™
[0502]
[0505] Con respecto a los datos históricos para BENEFIX™, rFIX-Fc demostró:
[0506] • aumento de 3 veces en la semivida y el tiempo de residencia medio
[0507] • mejora del 24% en la recuperación incremental relativa
[0508] • reducción de 2.5x en la eliminación
[0510] Tabla 9. Estudio de fase 1/2a: Aumento proporcional a la dosis en Cmáx y ABC de rFIXFc (actividad)
[0512]
[0515] Tabla 10A-10B. Duración terapéutica estimada de rFIXFc en dosis de 50 y 100 UI/kg.
[0517]
[0520] Véase también la Figura 6A-6B.
[0522] Tabla 11. Aumento proporcional a la dosis en Cmáx y ABC para el antígeno rFIXFc.
[0524]
[0525]
[0527] Tabla 12. Estimaciones farmacocinéticas para el antígeno rFIXFc
[0528]
[0529]
[0530]
[0533] 
[0534]
[0535] Tabla 15: Caracterización bioquímica del factor IX
[0537]
[0539] Tabla 16: Resumen de las semividas terminales de FIXFc y BENEFIX™ después de una única dosis intravenosa.
[0541]
[0543] Tabla 17. Resumen de los parámetros ROTEM® in vitro para rFIXFc y BENEFIX™ enriquecidos en sangre completa de ratón HemB agrupada
[0545]
[0546]
[0548] Tabla 18. Mediana de la pérdida de sangre después de la pinza en la cola en ratones HemB tratados con rFIXFc o BENEFIX™
[0550]
[0552] Tabla 19. Parámetro ROTEM® ex vivo en ratones HemB tratados con rFIXFc y BENEFIX™
[0554]
[0555]
[0556]
[0557] Tabla 21. Análisis FC y FD de rFIXFc y BENEFIX™ después de una dosis subcutánea única en ratones deficientes en FIX.
[0558]
[0559]
[0560]
[0561]
[0562] Tabla 25. Análisis FC de rFIXFc después de una dosis subcutánea única en macacos cangrejeros
[0563]
[0565] Tabla 26. Directrices de dosificación para la terapia con rFIXFc en hemofilia B
[0566]
[0567]
[0568]
[0571] 
[0572]
[0575] 

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido del factor IX quimérico ("FIX") que comprende FIX humano que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 1 a 415 de la SEQ ID NO: 2 y Fc humano como compañero de unión a FcRn, para su uso en un método para tratar profilácticamente hemorragias o episodios hemorrágicos en un sujeto humano con hemofilia B, que comprende administrar por vía intravenosa al sujeto humano múltiples dosis de 50 UI/kg a 100 UI/kg del polipéptido FIX quimérico a un intervalo de administración de 9 días a 18 días.
2. El polipéptido FIX quimérico para uso según la reivindicación 1, en donde el nivel plasmático del polipéptido quimérico alcanza un mínimo de al menos aproximadamente 1 UI/dl después de al menos aproximadamente 6 días en el sujeto.
3. El polipéptido FIX quimérico para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde cada una de las dosis múltiples es 50 UI/kg o 100 UI/kg.
4. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el intervalo de administración es de 9 a 17 días.
5. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el intervalo de administración es de 9 a 16 días.
6. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el intervalo de administración es de 9 a 15 días.
7. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el intervalo de administración es de 9 a 14 días.
8. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el intervalo de administración es de 10 a 14 días.
9. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el polipéptido FIX quimérico comprende FIX humano que tiene una secuencia de aminoácidos 1 a 415 de SEQ ID NO: 2 y Fc humano.
10. El polipéptido FIX quimérico para su uso según la reivindicación 9, en donde el Fc humano comprende los aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO: 4.
11. El polipéptido FIX quimérico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la actividad de FIX plasmática se mide mediante un ensayo de coagulación de una etapa que determina el tiempo de tromboplastina parcial.
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