JP6971301B2

JP6971301B2 - ヒトにおける長時間作用性第ｉｘ因子の皮下投与

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Publication number: JP6971301B2
Application number: JP2019500420A
Authority: JP
Inventors: クリスティーヌ・フォークト; シルパ・プリ; ジョン・ロバーツ; マルク・ノルテ
Original assignee: ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2021-11-24
Anticipated expiration: 2037-07-07
Also published as: CA3029887A1; WO2018007601A1; EP3481416A1; DK3481416T3; EP3481416B1; PL3481416T3; AU2017294555A1; KR102446476B1; EP3733199A1; ES2832648T3; JP2019524089A; US20200093901A1; AU2017294555B2; CN109843319A; KR20190026863A

Description

本発明は、ヒト患者における長時間作用性第ＩＸ因子（すなわち、ヒトアルブミンと融合したヒトＦＩＸ）の予防的な皮下投与の臨床的に関連する投与計画に関する。

血友病Ｂは、血液凝固の過程に対し中心となる凝固因子である凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠乏の結果として生じるＸ連鎖劣性遺伝性出血障害である。血友病Ｂの徴候および症状は、ＦＩＸ欠乏の重症度および出血の場所により多様である。ほとんどの場合、出血は、関節、筋肉、および軟部組織への自然出血または外傷によって誘発された出血によって特徴づけられる。同じ場所における再発性の出血は、関節の永久的な損傷につながる場合もある。中枢神経系、咽頭、または胃腸管において、まれだが命に関わる出血が生じることもある。

すべての出血エピソードの発生率を低下させ、若年で始まる場合、関節症の発症も低下させるため、現在、予防が重症の血友病の患者に対する最適なケアと考えられている。

静脈内適用経路の臨床的調査において、長時間作用性のヒトアルブミンと融合したヒトＦＩＸ（「ｒＩＸ−ＦＰ」）は、静脈内投与された場合に長い半減期を有することが示され、完了した臨床試験は優れた安全性および効能を示している。ｒＩＸ−ＦＰによる７日、１０日または１４日毎の予防処置を受けた対象は、０．００の年間自然出血回数（ＡｓＢＲ）中央値を有した。１２歳未満の小児において、ＡｓＢＲの全体的な中央値は、週（７日）単位で予防を受けた対象につき１年当たり０．００の出血であった。出血エピソードは、１または２回のｒＩＸ−ＦＰの注射により首尾よく処置され；成人の試験（試験ＣＳＬ６５４＿３００１）における９８．６％の出血エピソードおよび小児の試験（ＣＳＬ６５４＿３００２）における９７．２％の血エピソードであった。この長時間作用性第ＩＸ因子は、ＦＩＸ単独よりも患者への静脈内投与の頻度を減らすことができるため、血友病管理における大幅な改善であった。

少なくとも２００ＩＵ／ｍｌの活性を有する第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子および皮下投与に対するそのバイオアベイラビリティーを増加させる添加物を含む医薬製剤ならびに血友病Ｂを処置するための薬物の製造に対するその使用が特許文献１に記載されているが、データは、第ＶＩＩＩ因子に関してのみ提供されている。特許文献２にＦＩＸを含む治療効果のあるキメラポリペプチドについて記載されており、これは、ＦｃなどのＦｃＲｎ結合パートナーと融合させることができる。この文献は、予防的治療のために、ＦＩＸＦｃを少なくとも約１０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に１回またはそれより長い間隔で投与することを提言している。この文献は、ＦＩＸＦｃ融合タンパク質に関するデータを開示しているにすぎず、これは、本発明において分析されるものとは異なる融合タンパク質であり、異なる薬物動態的特性を有するため、第ＩＸ因子活性の特定のトラフレベルを維持するためには異なる投与計画が必要とされる。

特許文献３は、長時間作用性第ＩＸ因子Ｆｃ融合ポリペプチドをヒト対象に約１０ＩＵ／ｋｇから約２００ＩＵ／ｋｇの用量でおよそ週に１回またはそれより長い投与間隔で投与するための処置の方法を開示している。特許文献４は、アルブミンと結合したＦＩＸ（「ｒＩＸ−ＦＰ」）を含む、長時間作用性第ＩＸ因子の予防的な静脈内投与計画に対するデータを開示している。少なくとも週に１回の間隔で投与される２５〜７５ＩＵ／ｋｇの用量が記載されている。ヒトにおける長時間作用性ＦＩＸの皮下投与に関するデータは、これらのいずれの文献においても開示されていない。

Ｌｉｌｅｓらは、１人の血友病Ｂ患者に対する血漿由来ＦＩＸの９．３Ｕ／ｋｇの単回皮下用量の投与の報告を公開したが（非特許文献１）、血友病Ｂ患者に対するＦＩＸの皮下投与に関する非常に限定された臨床データである。臨床前試験は、さまざまな動物モデルにおける著しく異なるバイオアベイラビリティーデータを示した。例えば、本発明における臨床前データは、皮下投与されたｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティーが動物種により約１３〜５０％であったことを示している。

ＵＳ５９２５７３９ＡＷＯ２０１２／００６６２４ＷＯ２０１４／０５２４９０ＷＯ２０１５／０９５９２５

Ｌｉｌｅｓら、ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１９９７年；７７（５）：９４４〜８ページ

血友病Ｂ患者への皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰのＰＫの第Ｉ相予備試験が行われた。本発明は、最初に、長時間作用性ＦＩＸのどの皮下投与計画がヒト患者において血友病Ｂを処置するために使用できるかを示す。皮下注射は、患者自身、または小児の場合は家での介護者のいずれかによって容易に施すことができるため、この結果は、血友病Ｂ管理の大幅な改善を可能にする。それは、皮下注射が、ＦＩＸのより使いやすく、より痛みの少ない注射を可能にするからである。皮下投与はまた、皮下投与でなければ一部の非常に幼い血友病の小児が適切なケアを受けるのを妨げる可能性のある静脈アクセスデバイスにおける汚染のリスクおよび凝血塊形成を回避する。

具体的には、本発明は、ヒトＦＩＸおよびヒトアルブミン（「ｒＩＸ−ＦＰ」）を含む融合タンパク質に関し、ヒトＦＩＸは、以下の例となる限定的な皮下投与計画による凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されており：１日に１回から週に１回の投与間隔で１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量、好ましくは、用量は、１日に１回、２日に１回または３日に１回の投与間隔で２５ＩＵ／ｋｇである。これらの皮下投与計画は、血友病患者において臨床的に重要なＦＩＸの定常状態レベルを維持するのに十分なバイオアベイラビリティーをもたらすことが示された。

患者が第ＩＸ因子を容易に自己投与できるようにすることによって、輸注および静脈注射を完全に回避することができるため、この進歩は、血友病Ｂ管理の改善において重要なさらなる一歩である。したがって、本発明は、汚染されているかもしれない注射および輸注装置による感染症のリスクを低下させ、静脈注射および輸注のために必要とされる病院および医師への訪問を回避することによって患者のコンプライアンスを高める。本発明はまた、静脈アクセスに問題がある患者に治療的選択肢を提供する。

本発明は、ｒＩＸ−ＦＰの皮下投与に関する臨床的に関連する投与計画を提供する。本投与計画は、処置期間にわたり出血を予防するのに十分なＦＩＸのトラフレベルを実現する。本発明による実施形態は、特許請求の範囲に記載されている。

具体的には、本発明は、予防的投与計画においてヒト患者における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、および
ｂ）ヒトアルブミン
を含む融合タンパク質であって、ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されており、融合タンパク質は、約１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量で、およそ１日に１回からおよそ週に１回の投与間隔を使用して対象に皮下投与される、融合タンパク質に関する。用量は、約１０〜２０ＩＵ／ｋｇ、約２０〜３０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ、約４０〜約５０ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇまたは約５０ＩＵ／ｋｇが可能である。好適な実施形態において、用量は、約１０ＩＵ／ｋｇである。好適な別の実施形態において、用量は、約２０ＩＵ／ｋｇである。さらなる好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇである。よりさらなる好適な実施形態において、用量は、５０ＩＵ／ｋｇである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回が可能である。

好適な一実施形態において、用量は、約１０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回またはおよそ週に２回である。

好適な別の実施形態において、用量は、２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回である。

好適な別の実施形態において、用量は、５０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回である。

極めて好適な実施形態において、用量は、２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回である。別の極めて好適な実施形態において、用量は、２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ２日に１回である。さらに別の極めて好適な実施形態において、用量は、２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回である。

極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約８から約３４ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約１０から約３０ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約１５から約２５ＩＵ／ｄＬの間に維持される。さらに別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約１８から約２２ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約１７ＩＵ／ｄＬに維持される。

代替的な極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ２日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約４から約１７ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ２日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約６から約１５ＩＵ／ｄＬの間に維持される。さらに別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ２日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約７から約１２ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、投与間隔は、およそ２日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約８ＩＵ／ｄＬに維持される。

さらなる極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約２．５から約１２ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約３から約１２ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約４から約１１ＩＵ／ｄＬの間に維持される。さらに別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約４．５から約１０ＩＵ／ｄＬの間に維持される。別の極めて好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約５ＩＵ／ｄＬに維持される。

好適な実施形態において、ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１％超える、好ましくは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約３％超える、より好ましくは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約５％超える、さらにより好ましくは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１０％超える、最も好ましくは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１５％超えるトラフレベルを維持する。

好適な実施形態において、リンカーは、ＦＩＸａによっておよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である。特に好適な実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２から選択される配列を含む。
配列番号１
Pro Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val
1 5 10 15

配列番号２
Pro Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val
1 5 10 15

代替的な実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と９０％同一である。別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と８０％同一である。さらに別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と７０％同一である。さらに別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と６０％同一である。別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と５０％同一である。

好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号３に記載の配列と少なくとも７０％の同一性を有する。

配列番号３（成熟ｒＩＸ−ＦＰ）
ＦＩＸ（ａａ１〜４１６）
リンカー配列（太字と下線で示されるａａ４１６〜４３３）
アルブミン配列（ａａ４３４〜１０１８）

融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも８０％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも８５％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９０％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９５％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９８％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９９％の同一性パーセントを有することが可能である。さらに好適な実施形態において、融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列を有する。

本発明の好適な実施形態において、ヒト患者は、血友病Ｂを患っている。

本発明の任意の実施形態に関して、融合タンパク質は、投与のために、好ましくは、約１００から４００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは、約１００、２００または４００ＩＵ／ｍｌの濃度で提供される。融合タンパク質はまた、投与のために、６００ＩＵ／ｍｌまたは１２００ＩＵ／ｍｌの濃度で提供することができる。

本発明は、静脈内投与されたＦＩＸまたは静脈内投与された半減期が延長されたＦＩＸによる処置下のヒト患者における出血を予防する方法における使用のための半減期が延長されたＦＩＸ（３倍を超えるＦＩＸの終末相半減期を有する）を含む融合タンパク質も包含し、半減期が延長されたＦＩＸタンパク質は対象に皮下投与される。別の態様において、本発明は、ヒト患者における出血を予防する併用処置に使用するための半減期が延長されたＦＩＸ（３倍を超えるＦＩＸの終末相半減期を有する）を含む融合タンパク質を包含し、患者は、まず静脈内ＦＩＸまたは静脈内投与される半減期が延長されたＦＩＸにより処置され、融合タンパク質は、静脈内ＦＩＸ処置が開始された後に対象に皮下投与される。半減期が延長されたＦＩＸの静脈内投与については、ＷＯ２０１５／０９５９２５およびＷＯ２０１４／０５２４９０に記載されている。好ましくは、融合タンパク質は、ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）半減期延長ポリペプチド（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅｅｎｈａｎｃｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（ＨＬＥＰ）を含む。極めて好適な実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）ヒトアルブミンから構成され、ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されている。皮下用量は、好ましくは、約１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量で、およそ１日に１回からおよそ週に１回の投与間隔を使用して投与される。用量は、約１０〜２０ＩＵ／ｋｇ、約２０〜３０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ、約４０〜約５０ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇまたは約５０ＩＵ／ｋｇが可能である。好適な実施形態において、用量は、約１０ＩＵ／ｋｇである。好適な別の実施形態において、用量は、約２０ＩＵ／ｋｇである。さらなる好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇである。よりさらなる好適な実施形態において、用量は、５０ＩＵ／ｋｇである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回が可能である。極めて好適な実施形態において、用量は、２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回、およそ２日に１回、またはおよそ３日に１回である。好ましくは、本方法は、予防的投与計画を含む。別の極めて好適な実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）抗体のＦｃ部分から構成されるか、またはａ）ヒト第ＩＸ因子およびｂ）ＸＴＥＮから構成される。上記の融合タンパク質のすべてにおいて、ヒトＦＩＸとＨＥＬＰは、直接連結されていてもよいし、またはペプチド性リンカーを介して連結されていてもよい。好適な実施形態において、リンカーは、プロテアーゼによって切断可能であり、プロテアーゼは、好ましくは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼである。別の態様において、本発明は、ヒト患者における出血を予防する併用処置に使用するための半減期が延長された複合化ヒトＦＩＸ（３倍を超えるＦＩＸの終末相半減期を有する）を包含し、患者は、まず静脈内ＦＩＸまたは静脈内投与される半減期が延長された複合化ＦＩＸにより処置され、半減期が延長された複合化ヒトＦＩＸは、静脈内ＦＩＸ処置が開始された後に対象に皮下投与される。半減期延長をもたらす複合化は、非限定例としてペグ化またはポリシアル化を含む。好適な実施形態において、静脈内投与されるＦＩＸまたは半減期が延長されたＦＩＸの投与は、それに続く半減期が延長されたＦＩＸの皮下投与によって置き換えられることになる。好適な別の実施形態において、半減期が延長されたＦＩＸは、静脈内および皮下に並行して投与される。

予防的投与計画においてヒト患者における出血を予防する方法であって、対象に、
ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、および
ｂ）ヒトアルブミン
を含む融合タンパク質を、約１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量でおよそ１日に１回からおよそ週に１回の投与間隔で皮下投与することを含み、ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されている、方法も本発明に包含される。用量は、約１０〜２０ＩＵ／ｋｇ、約２０〜３０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ、約４０〜約５０ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇまたは約５０ＩＵ／ｋｇが可能である。好適な実施形態において、用量は、約１０ＩＵ／ｋｇである。好適な別の実施形態において、用量は、約２０ＩＵ／ｋｇである。さらなる好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇである。よりさらなる好適な実施形態において、用量は、約５０ＩＵ／ｋｇである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回が可能である。

好適な実施形態において、リンカーは、ＦＩＸａによっておよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である。特に好適な実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２から選択される配列を含む。別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と９０％同一である。別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と８０％同一である。さらに別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と７０％同一である。さらに別の実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と６０％同一である。さらなる実施形態において、リンカーは、配列番号１および配列番号２の一方と５０％同一である。

好ましくは、本発明の融合タンパク質は、配列番号３に記載の配列と少なくとも７０％の同一性を有する。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも８０％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも８５％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９０％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９５％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９８％の同一性パーセントを有することが可能である。融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも９９％の同一性パーセントを有することが可能である。さらに好適な実施形態において、融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列を有する。

本発明は、ヒト患者における出血を予防する方法であって、静脈内投与されるＦＩＸまたは静脈内投与される半減期が延長されたＦＩＸによる処置下のヒト患者において半減期が延長されたＦＩＸ（３倍を超えるＦＩＸの終末相半減期を有する）を含む融合タンパク質を対象に投与することを含み、融合タンパク質は、対象に皮下投与される、方法も包含する。別の態様において、本発明は、併用療法を含む、ヒト患者における出血を予防する方法であって、患者は、まず静脈内投与されるＦＩＸまたは静脈内投与される半減期が延長されたＦＩＸにより処置され、半減期が延長されたＦＩＸ（３倍を超えるＦＩＸの終末相半減期を有する）を含む融合タンパク質は、静脈内ＦＩＸ処置が開始された後に対象に皮下投与される、方法を包含する。半減期が延長されたＦＩＸの静脈内投与については、ＷＯ２０１５／０９５９２５およびＷＯ２０１４／０５２４９０に記載されている。好ましくは、融合タンパク質は、ａ）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）を含む。極めて好適な実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）ヒトアルブミンから構成され、ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されている。皮下用量は、好ましくは、約１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量で、およそ１日に１回からおよそ週に１回の投与間隔を使用して投与される。用量は、約１０〜２０ＩＵ／ｋｇ、約２０〜３０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ、約４０〜約５０ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇまたは約５０ＩＵ／ｋｇが可能である。好適な実施形態において、用量は、約１０ＩＵ／ｋｇである。好適な別の実施形態において、用量は、約２０ＩＵ／ｋｇである。さらなる好適な実施形態において、用量は、約２５ＩＵ／ｋｇである。よりさらなる好適な実施形態において、用量は、５０ＩＵ／ｋｇである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回が可能である。極めて好適な実施形態において、用量は、２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回、およそ２日に１回、またはおよそ３日に１回である。好ましくは、本方法は、予防的投与計画を含む。別の極めて好適な実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）抗体のＦｃ部分から構成されるか、またはａ）ヒト第ＩＸ因子およびｂ）ＸＴＥＮから構成される。上記の融合タンパク質のすべてにおいて、ヒトＦＩＸとＨＥＬＰは、直接連結されていてもよいし、またはペプチド性リンカーを介して連結されていてもよい。好適な実施形態において、リンカーは、プロテアーゼによって切断可能であり、プロテアーゼは、好ましくは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼである。別の態様において、本発明は、ヒト患者における出血を予防する併用処置に使用するための半減期が延長された複合化ヒトＦＩＸ（３倍を超えるＦＩＸの終末相半減期を有する）であって、患者は、まず静脈内ＦＩＸまたは静脈内投与される半減期が延長された複合化ＦＩＸにより処置され、半減期が延長された複合化ヒトＦＩＸは、静脈内ＦＩＸ処置が開始された後に対象に皮下投与される、複合した半減期が延長されたヒトＦＩＸを包含する。半減期延長をもたらす複合化は、非限定例としてペグ化またはポリシアル化を含む。好適な実施形態において、静脈内投与されるＦＩＸまたは半減期が延長されたＦＩＸの投与は、それに続く半減期が延長されたＦＩＸの皮下投与によって置き換えられることになる。好適な別の実施形態において、半減期が延長されたＦＩＸは、静脈内および皮下に並行して投与される。

ウサギにおけるヒトＦＩＸ抗原（ｒＩＸ−ＦＰ）の血漿レベル（平均値±ＳＤ、ｎ＝３／時点）を示す線形目盛りのグラフである。ブタにおけるヒトＦＩＸ（ｒＩＸ−ＦＰ）抗原の血漿レベル（平均値±ＳＤ、ｎ＝１〜３／時点）を示す線形目盛りのグラフである。１２５および５００ＩＵ／ｋｇの用量レベルでのカニクイザルへの静脈内および皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰの平均血漿中濃度を示すグラフである。５００ＩＵ／ｋｇの用量レベルでのカニクイザルへの皮下投与後のＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）およびｒＩＸ−ＦＰの平均血漿中濃度を示すグラフである。４人の異なるヒト患者（３８、３９、４０および５０）へのｒＩＸ−ＦＰのＩＤ皮下投与による未補正のＦＩＸ活性対時間プロット（コホート１−２５ＩＵ／ｋｇ）である。５人の異なるヒト患者（３８、３９、１６、１７および２１）へのｒＩＸ−ＦＰのＩＤ皮下投与による未補正のＦＩＸ活性対時間プロット（コホート２−５０ＩＵ／ｋｇ）である。４人の異なるヒト患者（３８、３９、４０および５０）へのｒＩＸ−ＦＰのＩＤ皮下投与による補正されたＦＩＸ活性対時間プロット（コホート１−２５ＩＵ／ｋｇ）である。投与前ＦＩＸレベルの指数関数的低下に関してＦＩＸ活性レベルを補正した。補正したら、いかなる負の値も０．０１と設定した。５人の異なるヒト対象（３８、３９、１６、１７および２１）へのｒＩＸ−ＦＰのＩＤ皮下投与による補正されたＦＩＸ活性対時間プロット（コホート２−５０ＩＵ／ｋｇ）である。投与前ＦＩＸレベルの指数関数的低下に関してＦＩＸ活性レベルを補正した。補正したら、いかなる負の値も０．０１と設定した。コホート３、２５ＩＵ／ｋｇの３日に１回の反復投与、３人の異なるヒト患者（３８、３９、４０）において観察されたＦＩＸ活性対時間プロットである。グレーの影付きは、最初の投与から最後の反復投与１５の間の時間間隔である。毎日の２５ＩＵ／ｋｇ関するＦＩＸ活性（ＩＵ／ｄＬ）対時間のシミュレートしたプロットである。２日に１回の２５ＩＵ／ｋｇに関するＦＩＸ活性（ＩＵ／ｄＬ）対時間のシミュレートしたプロットである。３日に１回の２５ＩＵ／ｋｇに関するＦＩＸ活性（ＩＵ／ｄＬ）対時間のシミュレートしたプロットである。コホート３（ｎ＝３）の１５回目の投与の投与後の観察されたＰＫデータを重ね合わせた、３日に１回の２５ＩＵ／ｋｇに関するＦＩＸ活性（ＩＵ／ｄＬ）対時間のシミュレートしたプロットである。

「予防的処置」、「予防的投与計画」、「出血の予防」または「出血を予防すること」は、本明細書中で使用される場合、患者の血漿中の第ＩＸ因子活性のレベルを増加させるために、経時的に第ＩＸ因子融合タンパク質を複数用量でヒト患者に投与することを意味する。好ましくは、増加したレベルは、自然出血の発生率を低下させるか、または予想外の損傷の場合に出血を予防するのに十分なものである。予防的処置は、出血エピソード、例えば、出血時処置下において示される出血エピソードを低減または予防する。「投与間隔」において述べられるとおり、例えば、患者間のばらつきを打ち消すために、予防的処置は固定化することも、または個別化することもできる。

「投与間隔」は、本明細書中で使用される場合、ヒト患者に投与される複数の用量間に経過する時間の量を意味する。ｒＩＸ−ＦＰを使用した本発明の方法における投与間隔は、同等量（ＩＵ／ｋｇ単位）のアルブミンを伴わない前記第ＩＸ因子（すなわち、前記ＦＩＸから成るポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１と１／２から８（１．５〜８）倍長い場合もある。本発明の第ＩＸ因子・アルブミン融合タンパク質を投与する場合、投与間隔は、同等量のアルブミンを伴わない前記第ＩＸ因子に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１と１／２から８（１．５〜８）倍長い場合もある。投与間隔は、同等量のアルブミンを伴わない前記第ＩＸ因子（または前記第ＩＸ因子から成るポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１と１／２から８（１．５〜８）倍長い場合もある。

「用量中央値」は、本明細書中で使用される場合、試験ヒト患者の半分がその用量よりも高い用量を使用し、試験ヒト患者の半分がその用量よりも低い用量を使用したことを意味する。「平均用量」は、（すべての用量を合計し、用量の総数で割ることによって算出される）平均用量を意味する。所与の用量に対する「約」は、示した用量の１、２、５、１０、１５もしくは２０％をプラス、またはマイナスした示した用量を意味する。あるいは、所与の用量に対する「約」は、プラスまたはマイナス１ＩＵ／ｋｇを意味する。およそ１日に１回の投与間隔に対する「約」は、プラスまたはマイナス６時間を意味する。およそ週に４回または２日に１回の投与間隔に対する「約」は、プラスまたはマイナス８時間を意味する。およそ週に２回または３日に１回の投与間隔に対する「約」は、プラスまたはマイナス１２時間を意味する。およそ５日に１回の投与間隔に対する「約」は、プラスまたはマイナス１５時間を意味する。およそ週に１回の投与間隔に対する「約」は、プラスまたはマイナス１８時間を意味する。

「総ＦＩＸ活性トラフレベル」は、ＩＵ／ｄＬ単位で測定されるＦＩＸ活性の血漿レベルのトラフレベルを意味する。これは、ａＰＴＴ、ＰＴ、またはトロンビン生成アッセイのような直接凝固アッセイを使用して測定することができる。しかしながら、例えば、特定の凝固因子に適用される発色アッセイのようなその他のアッセイも含まれる。そのようなアッセイまたは対応する試薬に関する例は、対応する凝固因子が不足した血漿（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）を用いたＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ（登録商標）ＳＬ（ａＰＴＴアッセイ、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）もしくはＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（登録商標）Ｓ（プロトロンビン時間アッセイ、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）、例えば、凝固因子が不足した血漿を使用したトロンビン生成アッセイキット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）、ＢｉｏｐｈｅｎＦａｃｔｏｒＩＸ（ＨｙｐｈｅｎＢｉｏＭｅｄ）、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）ＦＶＩＩａ−ｒＴＦ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ）、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ：Ｃ／４（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）のような発色アッセイ、またはその他である。ＦＩＸ活性は、好ましくは、活性化因子として使用されるＰａｔｈｒｏｍｔｉｎＳＬを用いた一段ａＰＴＴアッセイによって測定される。総ＦＩＸ活性トラフレベルに対する「約」は、プラスまたはマイナス１ＩＵ／ｄＬを意味する。

「ベースライン」は、１００ＩＵ／ｄＬまたは１００％であると定義される健康なヒトにおけるＦＩＸ活性のＩＵ／ｄＬまたは％単位で選択的に表される所与の患者におけるＦＩＸ活性レベルを意味する。重症の血友病Ｂでは、所与の患者のベースラインレベルはゼロまたはほぼゼロと非常に低いが、中等症血友病では、患者のベースラインは、健康なヒトにおけるＦＩＸ活性濃度を１％超、２％超または３％超または４％超など高い可能性があり、軽症の血友病では、患者のベースラインは、５％超の可能性がある。ｉ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分、およびｉｉ）ヒトアルブミンを含む融合タンパク質が本発明に従って投与される場合、まずＦＩＸ活性濃度が急激に増加し、ゆっくりと除去される、すなわち、個々のベースラインレベルに戻っていく。本試験において、ベースラインレベルは、事前のＩＶ投与から残存するＦＩＸレベルのために、より高かった。これは、予想される内因性レベルに達するよう、投与前レベルの指数関数的低下を引くことによって補正した。

「トラフレベル」は、ＦＩＸを必要とする患者の処置の間、投与計画全体をとおしての前記ＦＩＸ生物学的活性の最低レベルである。患者間のばらつきのため、トラフレベルは、一般に中央値を参照し、これは、試験患者の半分がそれより高いトラフレベルを有し、試験患者の半分がそれより低いトラフレベルを有したことを意味する。中央値を使用するのがより一般的であるが、すべての患者に関する値を合計し、患者の数で割ることによって求めた平均値としてＰＫデータからトラフレベルを算出することも可能あろう。トラフレベルは、好ましくは、１％超、より好ましくは、２％超、さらにより好ましくは、３％超、さらにより好ましくは、４％超、さらにより好ましくは、５％超、さらにより好ましくは、６％超、さらにより好ましくは、７％超、さらにより好ましくは、８％超、さらにより好ましくは、９％超、さらにより好ましくは、１０％超、さらにより好ましくは、１１％超、さらにより好ましくは、１２％超、さらにより好ましくは、１３％超、さらにより好ましくは、１４％超、さらにより好ましくは、１５％超である。さらに好ましいトラフレベルは、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超である。

総ＦＩＸ活性の血漿レベルを少なくとも「約」特定の濃度のトラフ値に維持することは、血漿中の総ＦＩＸ活性がＦＩＸを必要とする患者の特定の投与計画中に前記濃度未満に低下しないことを意味し、正常なヒト血漿中の総ＦＩＸ活性濃度は１ＩＵ／ｍｌまたは１００ＩＵ／ｄＬであり、ＦＩＸ活性は、好ましくは、実証された凝固一段法を使用して測定される。ＦＩＸ活性は、ＦＩＸ生物学的活性である。

ＦＩＸの血漿レベルを「約」特定の第１の濃度から「約」別の特定の第２の濃度の間のトラフ値に維持することは、血漿中のＦＩＸ活性が、ＦＩＸを必要とする患者の特定の投与計画中に前記第１の濃度未満に低下せず、前記第２の濃度を超えて上昇しないことを意味し、正常なヒト血漿中のＦＩＸ活性濃度は、１ＩＵ／ｍｌまたは１００ＩＵ／ｄＬであり、ＦＩＸ活性は、好ましくは、実証された凝固一段法を使用して測定される。ＦＩＸ活性は、ＦＩＸ生物学的活性である。

「約」特定のトラフレベルは、本明細書中で使用される場合、平均トラフレベルを意味する。所与のトラフレベルに対する「約」は、示したトラフレベルの１、２、５、１０、１５、２０もしくは３０％をプラスまたはマイナスした示したトラフレベルを意味する。あるいは、所与のトラフレベルに対する「約」は、プラスまたはマイナス１ＩＵ／ｄＬを意味する。

とりわけ、重症の血友病Ｂでは、出血を予防するためにＦＩＸ活性濃度が最低レベル未満に低下しないケアが行われなければならない。この最低レベルは所望のトラフレベルと呼ばれ、これは、内因性レベルプラス投与されたＦＩＸの最低の追加レベルから成る。重症の血友病Ｂ患者では、ベースラインが実質的にゼロの場合、ベースラインを１％超えるトラフレベルは、健康なヒトにおけるＦＩＸ活性濃度の約１％のＦＩＸ活性濃度を意味する。健康なヒトにおけるＦＩＸ活性濃度の３％のＦＩＸ活性のベースラインレベルを有する中等症血友病Ｂ患者において、ベースラインを１％超えるトラフレベルは、健康なヒトにおけるＦＩＸ活性濃度の約４％のＦＩＸ活性濃度を意味する。

本発明において、投与間隔は、およそ１日に１回、およそ週に４回、およそ２日に１回、およそ３日に１回、およそ週に２回、およそ５日に１回、またはおよそ週に１回が可能である。これは、間隔が約１日おき、およそ週に５回、およそ２〜４日に１回、およそ週に３回、およそ４〜６日に１回、およそ５日に１回、およそ６〜８日に１回、およそ７日に１回を含む、およそ１から７日に１回が可能であることを意味する。特に、およそ１日に１回、およそ週に４回、およそ２日に１回、およそ３日に１回、およそ週に２回、およそ５日に１回、およびおよそ週に１回の投与間隔が意図される。最も好適な投与間隔は、およそ１日に１回、２日に１回および３日に１回である。

あるいは、投与間隔は、薬物動態学的データまたはその患者についての他の情報に基づいてそれぞれの患者に対して決定される個別の間隔とすることもできる。個別の用量／投与間隔の組み合わせは、前の段落の固定された間隔の治療計画に関するものと同じでも、または異なることも可能である。治療計画は、最初に固定された投与間隔で、その後、個別の投与間隔に変えることができる。あるいは、治療計画は、最初に固定された用量（ＩＵ／ｋｇ）および投与間隔で、その後、固定された用量で個別の投与間隔に変えることができる。治療計画はまた、最初に固定された投与間隔および用量（ＩＵ／ｋｇ）で、その後、同じ固定された投与間隔で個別の用量に変えることができる。

およそ１日に１回、およそ週に４回、およそ２日に１回、およそ３日に１回、およびおよそ週に２回の投与スケジュールに関して、約１０〜１５ＩＵ／ｋｇ、約１５〜２０ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、および約２０ＩＵ／ｋｇの治療用量が予想される。

およそ１日に１回、週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、または週に２回、またはおよそ５日に１回、およびおよそ週に１回の投与スケジュールに関して、約２０〜２５ＩＵ／ｋｇ、約２５〜３０ＩＵ／ｋｇ、約３０〜３５ＩＵ／ｋｇ、約３５〜４０ＩＵ／ｋｇ、４０〜４５ＩＵ／ｋｇ、約４５〜５０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇ、および約５０ＩＵ／ｋｇの治療的用量が予想される。

本発明の好ましい用量および投与間隔は、以下のとおりである：
およそ１日に１回の約１０〜２５ＩＵ／ｋｇ、およそ週に４回の約１０〜２５ＩＵ／ｋｇ、およそ２日に１回の約１０〜２５ＩＵ／ｋｇ、およそ３日に１回の約１０〜２５ＩＵ／ｋｇ、およそ週に２回の約１０〜２５ＩＵ／ｋｇ、およそ１日に１回の約１０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に４回の約１０ＩＵ／ｋｇ、およそ２日に１回の約１０ＩＵ／ｋｇ、およそ３日に１回の約１０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に２回の約１０ＩＵ／ｋｇ、およそ１日に１回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に４回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ２日に１回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ３日に１回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に２回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ５日に１回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に１回の約２０ＩＵ／ｋｇ、およそ１日に１回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に４回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ２日に１回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ３日に１回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に２回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ５日に１回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に１回の約２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、およそ１日に１回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ週に４回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ２日に１回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ３日に１回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ週に２回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ５日に１回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ週に１回の約２５ＩＵ／ｋｇ、およそ１日に１回の約５０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に４回の約５０ＩＵ／ｋｇ、およそ２日に１回の約５０ＩＵ／ｋｇ、およそ３日に１回の約５０ＩＵ／ｋｇ、およそ週に２回の約５０ＩＵ／ｋｇ、およそ５日に１回の約５０ＩＵ／ｋｇ、およびおよそ週に１回の約５０ＩＵ／ｋｇ。

「およそ週に１回」は、およそ６から８日に１回およびおよそ７日に１回を含む。

１日に１回、２日に１回または３日に１回の投与間隔で２５ＩＵ／ｋｇの用量が最も好適な用量である。

実施例１に示されるとおり、皮下ｒＩＸ−ＦＰに関する前臨床のバイオアベイラビリティーデータは動物モデル間で広く変化した（例えば、サルにおいて５００ＩＵ／ｋｇおよび１２５ＩＵ／ｋｇに対してそれぞれ９．２９％および１７％、対ウサギにおいて５００ＩＵ／ｋｇおよび１５０ＩＵ／ｋｇに対してそれぞれ４３％および５５％）。実施例２の臨床データは、初めて、長時間作用性ＦＩＸのどの皮下用量がヒト患者の血友病Ｂを管理する際に有効であるかを示している。

１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量の投与後、１日に１回、週に４回、２日に１回または３日に１回、週に２回の投与間隔の全体にわたりＦＩＸ活性の血漿レベル中央値がベースラインを少なくとも約５％超えるトラフ値を維持する実施形態が、本発明に包含される。別の実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇまたは５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量の投与後、１日に１回、週に４回、２日に１回または３日に１回、週に２回、５日に１回、または週に１回の投与間隔の間にＦＩＸ活性の血漿レベル中央値がベースラインを少なくとも約５％超えるトラフ値を維持する。

１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ毎日、適用される場合に、ベースラインを少なくとも約７％超えるＦＩＸ活性の血漿レベル中央値が投与間隔の全体にわたり維持される実施形態も本発明に包含される。別の実施形態において、１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に４回適用される場合、ベースラインを少なくとも約４％超えるＦＩＸ活性の血漿レベル中央値が投与間隔の全体にわたり維持される。別の実施形態において、１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ２日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約３％超えるトラフ値を維持する。別の実施形態において、１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ３日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約２％超えるトラフ値を維持する。別の実施形態において、１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に２回適用される場合、ベースラインを少なくとも約２％超えるＦＩＸ活性の血漿レベル中央値が投与間隔の全体にわたり維持される。さらなる実施形態において、１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ５日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約１．５％超のトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、１０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に１回（例えば、７日に１回）適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１％超えるトラフ値を維持する。

別の実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ毎日適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１７％超えるトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に４回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１０％超えるトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ２日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約８％超のトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ３日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約５％超のトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に２回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約４％超えるトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ５日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約３％超のトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に１回（例えば、７日に１回）適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約２％超えるトラフ値を維持する。

よりさらなる実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ毎日適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約２０％超えるトラフ値を維持する。別の実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に４回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１２％超えるトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ２日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約１０％超のトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ３日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約６％超のトラフ値を維持する。よりさらなる実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週に２回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約５％超えるトラフ値を維持する。さらなる実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ５日に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、少なくとも約４％超のトラフ値を維持する。よりさらなる実施形態において、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰ用量がおよそ週（例えば、７日）に１回適用される場合、ＦＩＸ活性の血漿レベル中央値は、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約２％超えるトラフ値を維持する。

あるいは、これらの実施形態において、ＦＩＸ活性の血漿レベルが平均として算出されることもあろう。

特に、本発明は、ヒトＦＩＸおよびヒトアルブミンを含む融合タンパク質に関する予防的投与計画を提供し、ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）部分はヒトアルブミンと連結されており、ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されており、融合タンパク質は、約１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量で１日に１回からおよそ週に１回の投与間隔を使用して対象に皮下投与される。

ＦＩＸの活性化の前に切断を可能にするリンカーを伴うｒＩＸ−ＦＰ融合タンパク質は、アルブミンによりＦＩＸの半減期の延長を示すが、出血事象の前に切断が起こるため、活性化の前に活性化ＦＩＸの半減期が短縮される。他方で、ＦＩＸの活性化後に切断が起こる場合、アルブミンがＦＩＸの半減期を延長させるが、活性化ＦＩＸが依然としてアルブミンと融合しているため、活性が低い。

凝固関連の様式でのタンパク質分解切断は、本発明の意味では、少なくとも１つの凝固因子または凝固補助因子の活性化の結果として起こる任意のタンパク質分解切断である。凝固因子は、リンカーペプチドのタンパク質分解切断とほぼ同時に活性化される。活性化は、例えば、凝固因子のタンパク質分解切断によって、または補助因子との結合によって起こることもある。アルブミンは、出血事象が起こるまで血液中のＦＩＸの半減期を延長させ、出血事象は、同時にＦＩＸを活性化し、アルブミンからそれを切断する。切断は、アルブミンが原因となる、活性を損なう任意の立体障害からポリペプチドを遊離させ、それにより、融合タンパク質の生成を可能にし、これが、ＦＩＸの高モル特異的活性を保持する。切断されたＦＩＸは、その後、アルブミンの喪失のために血液から速やかに除去される。そのような融合タンパク質は、その切断不可能な同等物と比較して増加した、改善された半減期およびモル特異的活性を示す。したがって、ｒＩＸを含む切断不可能な融合タンパク質と比較して、ある治療効果をもたらすために必要とされるｒＩＸ−ＦＰが少ない。

本発明による好ましい融合タンパク質は、少なくとも１つの凝固関連アッセイにおいて、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号４）を有する切断不可能なリンカーを介して連結された治療効果のある融合タンパク質のものと比較して少なくとも２５％増加した治療効果のある融合タンパク質のモル特異的活性、特に、モル特異的凝固関連活性を有するものである。適用可能な少なくとも１つの異なる凝固関連アッセイにおいて、モル特異的活性が少なくとも５０％増加した融合タンパク質が、より好ましく、モル特異的活性が少なくとも１００％増加したものがさらにより好ましい。

さらなる実施形態において、リンカーペプチドは、２つ以上のプロテアーゼに対する切断部位を含む。これは、異なるプロテアーゼによって同じ位置で切断可能なリンカーペプチドによって、または２つまたはそれ以上の異なる切断部位を提供するリンカーペプチドによってのいずれかで達成することができる。治療効果のある融合タンパク質は、酵素活性を実現するためにタンパク質分解切断によって活性化されなければならない有利な状況、および異なるプロテアーゼがこの活性化段階に寄与することが可能な有利な状況が存在する場合もある。ＦＩＸの活性化は、ＦＸＩａによってまたはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によってのいずれかで達成することができる。好適な実施形態において、リンカーは、ＦＩＸａによっておよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である。

配列番号３に記載の配列を有するｒＩＸ−ＦＰ（ｒＦＩＸ・アルブミン融合タンパク質）がＷＯ２０１５／０９５９２５に記載されている。これは、ｒＦＩＸ（例えば、Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標））と比較して、５．３倍長い半減期（ｔ_１／２）、７倍低下したＣＬ、および７倍大きいＡＵＣによって示される血漿中の長期の循環を有する。さらに、ｒＩＸ−ＦＰの薬物動態学的パラメーターを、Ａｌｐｒｏｌｉｘ（登録商標）ＦＤＡ処方情報のＦＩＸ−Ｆｃの対応する薬物動態学的データと比較した場合、ｒＩＸ−ＦＰは、ｒＩＸ−Ｆｃ（ＡＬＰＲＯＬＩＸ（登録商標））と比較して、約３．８倍高いＡＵＣ０−ｉｎｆ、約３．７倍低下したＣＬ／ＢＷ、約２６％高い増分回収率（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｒｅｃｏｖｅｒｙ）、約３．２倍低い分布容積、および約１９％延長された薬物の平均滞留時間を有する。

予防は、予想される出血を予防するための因子濃縮物の注射による処置である。予防は、＞１ＩＵ／ｄｌ（＞１％）の凝固因子レベルを有する中等症血友病患者がめったに自然出血を経験せず、関節機能の維持がはるかに良好であるという観察から考え出された。したがって、出血および関節破壊を予防するために１％超に維持されるＦＩＸ活性による予防が正常な筋骨格機能を保護するための治療の目標であるべきである（ＧＵＩＤＥＬＩＮＥＳＦＯＲＴＨＥＭＡＮＡＧＥＭＥＮＴＯＦＨＥＭＯＰＨＩＬＩＡ、第２版、ＰｒｅｐａｒｅｄｂｙｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓＷｏｒｋｉｎｇＧｒｏｕｐ，ｏｎｂｅｈａｌｆｏｆｔｈｅＷｏｒｌｄＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｍｏｐｈｉｌｉａ（ＷＦＨ））。

本発明は、予防的投与計画においてヒト患者における出血を予防する方法における使用のためのヒトＦＩＸおよびヒトアルブミンを含む、融合タンパク質の臨床的に有効な皮下投与計画に関する。これらの発見は、それが病院または医師への訪問を必要とせず、血友病患者がＦＩＸを自己投与することを可能にするため、血友病の予防的処置をさらに改善する。

好適な実施形態において、ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％超える、好ましくは投与間隔の全体にわたりベースラインを８から３４％の間、または４から１７％の間または２．５から１２％の間超えるトラフ値に維持される。

ヒトＦＩＸ
ビタミンＫ依存性ポリペプチドのグループのメンバーの１つであるヒトＦＩＸは、分子量が５７ｋＤａの一本鎖の糖タンパク質であり、これは、４１５アミノ酸の不活性酵素前駆体として肝臓細胞によって血流に分泌される。これは、ポリペプチドのＮ末端Ｇｌａドメインに局在する１２のγ−カルボキシグルタミン酸残基を含む。Ｇｌａ残基は、その生合成のためにビタミンＫを必要とする。Ｇｌａドメインに続いて、２つの上皮増殖因子ドメイン、活性化ペプチド、およびトリプシン型セリンプロテアーゼドメインが存在する。ＦＩＸのさらなる翻訳後修飾は、ヒドロキシル化（Ａｓｐ６４）、Ｎ（Ａｓｎ１５７およびＡｓｎ１６７）およびＯ型グリコシル化（Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９、およびＴｈｒ１７２）、硫酸化（Ｔｙｒ１５５）、ならびにリン酸化（Ｓｅｒ１５８）を包含する。

ＦＩＸは、Ａｒｇ１４５〜Ａｌａ１４６およびＡｒｇ１８０〜Ｖａｌ１８１における活性化ペプチドのタンパク質分解によって、その活性型、第ＩＸａ因子に変換されて、２つのポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（１８ｋＤａ）およびＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）の形成に至り、これが、１つジスルフィド結合によって一緒にされる。第ＩＸ因子の活性化切断は、インビトロにおいて、例えば、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子／ＴＦによって実現することができる。第ＩＸ因子は、ヒト血漿中に５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。ヒトにおける第ＩＸ因子の終末相血漿中半減期は、約１５から１８時間であることが分かった（ＷｈｉｔｅＧＣら、１９９７年、ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．７８：２６１〜２６５ページ；ＥｗｅｎｓｔｅｉｎＢＭら、２００２年、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＦＩＸｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓｉｎｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｔｒｅａｔｅｄｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｏｄｅｒａｔｅｏｒｓｅｖｅｒｅｈｅｍｏｐｈｉｌｉａＢ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ４２：１９０〜１９７ページ）。

ヒトアルブミン
アルブミン、アルブミンファミリーメンバーおよび免疫グロブリンならびにそれらのフラグメントまたは誘導体を半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）の例として上に記載した。「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）という用語は、本出願において同義に使用される。

本明細書中で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンフラグメントもしくはアルブミンの１つまたはそれ以上の機能活性（例えば、生物学的活性）を有する変異体をまとめて指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント、とりわけ、成熟形態のヒトアルブミンを指す。例えば、アルブミンは、参照によってその全体を本明細書に組み入れるＵＳ２００８２６０７５５Ａ１に記載の配列またはその変異体を有することが可能である。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、完全長ＨＡ配列を含む場合もあり、または治療活性の安定化もしくは延長が可能な１つまたはそれ以上のそのフラグメントを含む場合もある。そのようなフラグメントは、１０またはそれ以上のアミノ酸長から成る場合もあり、またはＨＡ配列の約１５、２０、２５、３０、５０またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む場合もあり、またはＨＡの特定のドメインの一部もしくはすべてを含む場合もある。

本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、天然または人工のいずれかの正常なＨＡの変異体が可能である。本発明の融合タンパク質の治療効果のあるポリペプチド部分は、本明細書に記載されている対応する治療効果のあるポリペプチドの変異体も可能である。「変異体」という用語は、保存的または非保存的のいずれかで、天然または人工のいずれかの挿入、欠失、および置換を含み、その場合、参照によってその全体を本明細書に組み入れるＵＳ２００８２６０７５５Ａ１に記載されているとおり、そのような変化は、治療効果のあるポリペプチドの治療活性を与える活性部位、または活性ドメインを実質的に変えない。

本発明は、特に、ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびｂ）ヒトアルブミンを含む融合タンパク質であって、ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されている、融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、アルブミンと連結されていない凝固因子と比較して延長された生体内半減期を有し、融合タンパク質は、適用可能な少なくとも１つの異なる凝固関連アッセイにおいて、切断不可能なリンカーを伴う対応する融合タンパク質と比較して、少なくとも２５％高いモル特異的活性を有する。

上記定義内の「ヒト第ＩＸ因子」は、任意の自然多型を含む天然アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。これはまた、ポリペプチドが実質的にそれぞれの治療効果のあるポリペプチドの活性を保持する限り、わずかに改変されたアミノ酸配列、例えば、末端アミノ酸欠失もしくは付加を含む、改変されたＮ末端またはＣ末端を有するポリペプチドを含む。含まれる変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が野生型配列とは異なる。そのような差異の例としては、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、好ましくは１から３０アミノ酸残基）のＮ末端および／もしくはＣ末端の切断、またはＮ末端および／もしくはＣ末端における１つまたはそれ以上の追加の残基の付加、ならびに保存的アミノ酸置換、すなわち、類似の特徴を有するアミノ酸、例えば、（１）小さなアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、および（６）芳香族アミノ酸のグループ内で行われる置換を挙げることができる。そのような保存的置換の例が以下の表に示される。

一般に終末相半減期またはβ半減期として求められる本発明の融合タンパク質の生体内半減期は、通常、非融合ポリペプチドの生体内半減期よりも少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは１００％を超えて高い。

本発明の融合タンパク質は、切断可能なリンカーを伴わない対応する融合タンパク質と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％増加したモル特異的活性を有する。

この関連でモル特異的活性（またはここでは特に考慮されるモル特異的凝固関連活性）は、対象の治療効果のあるポリペプチドまたは治療効果のある融合タンパク質のモル（または、例えば、ｎｍｏｌｅ）で表される活性と定義される。モル特異的活性の計算は、試験されるポリペプチドのさまざまな分子量または光学密度の影響を受けない、さまざまなコンストラクトの活性の直接的な比較を可能にする。モル特異的活性は、ＦＩＸおよびｒＩＸ−ＦＰ融合タンパク質に関して下記表２に例示されているとおりに算出することができる。

モル特異的凝固関連活性を測定するために、凝固過程と関連した酵素または補助因子の活性を測定する任意のアッセイを使用することができる。

したがって、「凝固関連アッセイ」は、本発明の意味では、凝固過程に関連する酵素もしくは補助因子の活性を測定するか、または内因性もしくは外因性のいずれかの凝固カスケードが活性化されたことを判断することができる任意のアッセイである。したがって、「凝固関連」アッセイは、ａＰＴＴ、ＰＴ、またはトロンビン生成アッセイのような直接凝固アッセイである場合もある。しかしながら、例えば、特定の凝固因子に適用される発色アッセイのようなその他のアッセイも含まれる。そのようなアッセイまたは対応する試薬に関する例は、対応する凝固因子が不足した血漿（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）を用いたＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ（登録商標）ＳＬ（ａＰＴＴアッセイ、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）もしくはＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（登録商標）Ｓ（プロトロンビン時間アッセイ、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）、例えば、凝固因子が不足した血漿を使用したトロンビン生成アッセイキット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）、ＢｉｏｐｈｅｎＦａｃｔｏｒＩＸ（ＨｙｐｈｅｎＢｉｏＭｅｄ）、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）ＦＶＩＩａ−ｒＴＦ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ）、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ：Ｃ／４（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）のような発色アッセイ、またはその他である。

本発明の目的に関して、上記のアッセイまたは同等の凝固関連アッセイの任意の１つにおける増加は、モル特異的活性の増加を示すと考えられる。例えば、２５％の増加は、任意の上記アッセイまたは同等のアッセイにおける２５％の増加を指す。

治療効果のある融合タンパク質が本発明の範囲内にあるかどうかを判断するために、これらのタンパク質のモル特異的活性が比較される標準は、それぞれの凝固因子とヒトアルブミンがアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号４）を有する切断不可能なリンカーを介して連結されたコンストラクトである。

ＦＩＸに関して、ａＰＴＴアッセイが凝固活性の測定に使用されることが多い。しかしながら、その他の凝固関連アッセイまたはアッセイ原理もＦＩＸに関するモル特異的活性を測定するために適用することができる。

不活性化凝固因子に関して高いインビボ回収率および長い半減期を有することが望ましいが、血栓形成促進のリスクを回避するために、その活性化後またはその補助因子の活性化後には凝固因子の半減期を制限するのが有利である。したがって、凝固過程が開始した後で、活性凝固因子の半減期が再び短縮されるべきである。これは、凝固関連様式で不活性化を増大させることによってまたは凝固因子の除去によってのいずれかで達成することができる。

本発明による不活性化は、例えば、凝固因子と対応する凝固因子のインヒビターとの複合体形成によって、または例えば、ＦＶＩＩＩおよびＦＶの場合に知られている、さらなるタンパク質分解切断によって引き起こすことができる、治療効果のあるポリペプチドの活性の低下を意味する。

活性化された治療効果のある融合タンパク質の不活性化速度は、例えば、インヒビターとの反応によってまたはタンパク質分解不活性化によって活性が低下していく速度と定義される。不活性化速度は、生理学的な量のこの凝固因子のインヒビターの存在下において経時的に活性化凝固因子のモル特異的活性を追跡することによって測定することができる。

あるいは、不活性化速度は、活性化生成物を動物に投与し、それに続いて活性および抗原アッセイを使用して適切な時間枠で血漿サンプルを試験することによって求めることができる。

治療効果のある融合タンパク質に関して、これらのタンパク質が本発明の範囲内にあるかどうかを判断することが必要とされる場合、これらの治療効果のあるタンパク質の不活性化速度が比較される標準は、それぞれの凝固因子とヒトアルブミンがアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号４）を有する切断不可能なリンカーを介して一体化されたコンストラクトである。

活性化された治療効果のある融合タンパク質の排出速度は、ポリペプチドがヒトまたは動物の血液循環から排出される速度と定義される。排出速度は、皮下投与後の活性化された治療効果のある融合タンパク質の薬物動態を測定することによって求めることができる。抗原アッセイを使用して、血液循環からの直接的な除去により排出を求めることができる。不活性化速度を求めるために、活性アッセイをさらに使用することができる。

治療効果のある融合タンパク質に関して、これらのタンパク質が本発明の範囲内にあるかどうかを判断することが必要とされる場合、これらのタンパク質の排出速度が比較される標準は、それぞれの凝固因子とヒトアルブミンがアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＶ（配列番号４）を有する切断不可能なリンカーを介して一体化されたコンストラクトである。

本発明によると、融合タンパク質は、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、ヒトアルブミンのＮ末端と連結されたヒトＦＩＸを含む。リンカーは非免疫原性でなければならず、プロテアーゼによる切断を可能にするだけ十分に柔軟でなければならない。

切断可能なリンカーは、好ましくは、ａ）治療効果のあるポリペプチドの活性化の過程でタンパク質分解切断されるタンパク質分解切断部位を含む場合に、それ自体が投与される治療効果のあるポリペプチド、ｂ）この治療効果のあるポリペプチドの基質ポリペプチド、またはｃ）治療効果のあるポリペプチドの直接的もしくは間接的な関与によって活性化もしくは形成されるプロテアーゼによって切断される基質ポリペプチド由来の配列を含む。

さらに好適な実施形態におけるリンカー領域は、適用される治療効果のあるポリペプチドの配列を含み、これが、発現融合タンパク質のネオアンチゲン特性のリスクを低下させるはずである。

好適な実施形態において、リンカー配列は、ＦＩＸの活性化領域の配列由来、ＦＸもしくはＦＶＩＩのようなＦＩＸの任意の基質の切断領域由来、または活性化にＦＩＸａが関与するプロテアーゼによって切断される任意の基質ポリペプチドの切断領域由来のいずれかである。

極めて好適な実施形態において、リンカーペプチドは、ＦＩＸ自体に由来する。さらなる好適な実施形態において、リンカーペプチドは、ＦＸもしくはＦＶＩＩ由来である。よりさらなる好適な実施形態において、ＦＩＸの生理学的に関連した２つの活性化因子であるＦＸＩａまたはＦＶＩＩａ／ＴＦによって切断することができるリンカー配列は、２つの切断配列を含む。

リンカーが、リンカーを切断するプロテアーゼ（複数可）によって依然として切断可能な限り、記載されているリンカーの変異体およびフラグメントも本発明に包含される。「変異体」という用語は、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失および置換を含む。

医薬組成物および投与様式
本発明の融合タンパク質は、皮下投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、一般に本タンパク質および薬学的に許容される担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的な皮下投与に適合した任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｄｅｌａｙｉｎｇａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含むことが可能である：滅菌された希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張性の調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。適した担体は、参照によって本明細書に組み入れる本分野における標準的な参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好適な例としては、水、生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば、不揮発性油も使用することができる。薬学的に活性な物質に対する、そのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。従来のあらゆる媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合にだけ、組成物にその使用が考えられる。補足の活性化合物も組成物に組み込むことができる。酸または塩基；例えば、塩酸または水酸化ナトリウムによりｐＨを調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。皮下注射としての投与が、投与の好適な経路である。

注射用途に適した医薬組成物としては、（水溶性の場合）滅菌水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即席の調製のための滅菌された粉末が挙げられる。皮下投与に適した担体としては、生理的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。あらゆる場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、シリンジ操作が容易になる程度まで流体であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、および適したそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒が可能である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば、砂糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。

滅菌された注射可能な溶液は、必要に応じて、活性化合物（例えば、ｒＩＸ−ＦＰ）を必要量で、上で挙げられた成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込み、続くろ過滅菌によって製造することができる。一般に、分散液は、ベースの分散媒および上で挙げられたもののうち必要とされるその他の成分を含む滅菌されたビヒクルに活性化合物を組み込むことによって製造される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、製造の方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライである。

注射用製剤は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質（例えば、ｒＩＸ−ＦＰ）を治療有効量で含むことが可能であり、その量は、当業者が決定することができる。特に、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質（すなわち、ｒＩＸ−ＦＰ）は、約１００から２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で投与することができる。例えば、融合タンパク質は、投与のために、約１００から４００ＩＵ／ｍｌ、または約１００、２００または４００ＩＵ／ｍｌの濃度で提供することができる。融合タンパク質はまた、投与のために、約６００ＩＵ／ｍｌ、８００ＩＵ／ｍｌ、１０００ＩＵ／ｍｌ、１２００ＩＵ／ｍｌ、１４００ＩＵ／ｍｌ、１６００ＩＵ／ｍｌ、１８００ＩＵ／ｍｌまたは２０００ＩＵ／ｍｌで提供することができる。融合タンパク質はまた、投与のために、約２５００ＩＵ／ｍｌ、３０００ＩＵ／ｍｌ、３５００ＩＵ／ｍｌまたは４０００ＩＵ／ｍｌで提供することができる。

投与の容易さおよび投与量の均一性のために、注射用組成物などの医薬組成物を単位剤形に製剤化するのがとりわけ有利である。単位剤形は、本明細書中で使用される場合、処置される患者に対する単位投与量として適した物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連した所望の治療効果をもたらすよう算出された活性化合物の所定の量を含有する。単位剤形に関する仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果によって決定され、それに直接依存する。

医薬組成物は、投与のための説明書とともに容器、パック、またはディスペンサーに含めることが可能である。

本発明は、以下の実施例の参照によってさらに明確に理解されるであろう。実施例は、例示する目的で含まれるにすぎず、本発明を限定することは意図しない。本明細書において参照されるすべての特許および公報を、参照によって明白に組み入れる。

〔実施例１〕
前臨床試験
Ａ．ウサギへの単回皮下または静脈注射後のｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐの薬物動態
本試験の目的は、ウサギへの皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティーを調査し、さらに皮下の薬物動態プロフィールを販売されている血漿由来ヒト凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）製品（すなわちＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐ）と比較することであった。

それぞれが３匹の雌の動物から構成されるウサギの４つの群は、それぞれ１５０ＩＵ／ｋｇ（ｒＩＸ−ＦＰ）および５００ＩＵ／ｋｇ（ｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐ）の用量レベルでの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与、または１５０ＩＵ／ｋｇ（ｒＩＸ−ＦＰ）の用量レベルでの単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与のいずれかを受けた。その後、血液サンプルを最大１０日間採取した。ウサギの血漿サンプルにおけるヒトＦＩＸ抗原濃度の引き続く測定は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）技術を使用して行った。

この試験の結果は、ウサギではｒＩＸ−ＦＰが皮下注射後に血管系に輸送されることを示した。１５０および５００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後、ヒトＦＩＸ血漿レベルの用量依存的増加が観察され、投与後２４から３２時間の間にピーク血漿レベルに達した（図１）。それにより、ｓ．ｃ．適用後のｒＩＸ−ＦＰのそれぞれのバイオアベイラビリティーは、１５０ＩＵ／ｋｇに関して５５％および５００ＩＵ／ｋｇ群に関して４３％（４８％＝幾何平均値）であった。Ｂｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐのｓ．ｃ．適用と比較して、５００ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後のヒトＦＩＸ血漿レベルは高く、よりゆっくりと低下した。それにより、ｓ．ｃ．ｒＩＸ−ＦＰ投与（１．０１ＩＵ／ｍＬ）後のヒトの最大ＦＩＸ血漿レベルは、Ｂｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐ投与（０．１７ＩＵ／ｍＬ）後よりも約６倍高く、これは、約１０時間後に既にピーク血漿レベルに達した。さらに、ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後のＡＵＣは、Ｂｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐのものと比較して、約１３倍高かった（表３）。ｒＩＸ−ＦＰまたはＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐのいずれかのｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与後、処置の有害な影響は、観察されなかった。

まとめると、この試験は、ウサギへのｒＩＸ−ＦＰの皮下投与後に４３〜５５％のバイオアベイラビリティーを実証した。ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与は、忍容性が良好で、薬理学的に関連したバイオアベイラビリティーを有し、全曝露は、販売されている血漿由来ＦＩＸ製品、Ｂｅｒｉｎｉｎ（登録商標）Ｐよりも優れていた。

Ｂ．ブタへのｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．投与後のＣＳＬ６５４（ｒＩＸ−ＦＰ）の薬物動態
本試験の目的は、ブタへの静脈内および皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰの（皮下のバイオアベイラビリティーを含む）薬物動態学的特徴を調査することであった。

それぞれが３匹の雄の動物から構成されたブタの２つの群は、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与または２４１．５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与のいずれかを受けた。その後、投与後１７日間、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法を使用したＦＩＸ抗原濃度の測定に基づいて凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）血漿レベルを追跡した。

ブタへのｒＩＸ−ＦＰ投与は忍容性が良好であった、すなわち、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与後に処置の有害な影響は観察されなかった。

ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後、およそ２２時間後にピークＦＩＸ血漿レベルに達した（図２、表４）。ｓ．ｃ．適用後のｒＩＸ−ＦＰのそれぞれのバイオアベイラビリティーは２２％であった。ｓ．ｃ．（５３ｈ）およびｉ．ｖ．（４４ｈ）投与後の終末相半減期は、類似していた。

薬物動態調査は、ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後、２２％のバイオアベイラビリティーを示したが、終末相半減期はｉ．ｖ．投与と類似していた。

Ｃ．霊長類へのｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．投与後のｒＩＸ−ＦＰ／ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の薬物動態
この試験は、雄および雌のカニクイザルへの単回静脈内および皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰの薬物動態を評価するために設計した。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は販売されている製品であり、参照試験品として使用した。

それぞれが１匹の雄および１匹の雌の動物から構成されるカニクイザルの７つの群は、１２５ＩＵ／ｋｇおよび５００ＩＵ／ｋｇの範囲の用量レベルでのｒＩＸ−ＦＰまたはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の単回静脈内または皮下投与を受けた。血液サンプルは、１０日間の期間にわたってそれぞれのサルから採取した。群１、２および４の製剤の製造を間違えたため、群３、５、６および７の血漿サンプルのみ分析した。

サル血漿サンプル中のヒト第ＩＸ因子濃度の測定は、実証されたＥＬＩＳＡ法を使用して行った。

ｒＩＸ−ＦＰまたはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のいずれの投与後も局所的な不忍容性は観察されなかった。

ｒＩＸ−ＦＰの静脈内投与ならびにｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の皮下投与後の薬物動態学的濃度データは多様であり、サンプル中で検出される内因性第ＩＸ因子のレベルおよび個々の動物間の内因性第ＩＸ因子レベルの高いレベルのばらつきのため、いつバックグラウンドレベルに戻ったのかを確かめることが難しかった。したがって、これらのデータは、全薬物動態学的データ分析に適用できなかった。第ＩＸ因子の内因性レベルを明らかにするために、それぞれのサルに関する第ＩＸ因子の血漿中濃度は、各時点において測定された濃度から投与前の濃度を引くことによって補正した。ｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のＣｍａｘおよびＡＵＣｔ値、ならびにｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティーを算出するためにこれらのベースライン補正値を使用した。

静脈内および皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の平均血漿中濃度−時間曲線を図３および４に示す。これらのデータから導き出した薬物動態学的パラメーターを表５に示す。

まとめると、試験薬物の適用は忍容性が良好であったこと、ｒＩＸＦＰの皮下投与後のＣｍａｘおよびＡＵＣｔ値はＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の投与後のそれぞれの値よりも高かったこと、およびｒＩＸ−ＦＰの皮下投与後のバイオアベイラビリティーは、１２５ＩＵ／ｋｇおよび５００ＩＵ／ｋｇの用量レベルでそれぞれ１７．０％および９．２９％（平均値：１３％）であったことを結論づけることができる。

Ｄ．血友病Ｂマウスへの皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティー
本試験の目的は、血友病Ｂマウスへの皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティーを調査し、さらにその皮下の薬物動態プロフィールを、販売されている組換えヒト凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）製品（すなわちＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））のものと比較することであった。

それぞれが１２〜１５匹の雌または雄の動物を含む血友病Ｂマウスの５つの群は、それぞれ１２５ＩＵ／ｋｇ（ｒＩＸ−ＦＰ）および２５０ＩＵ／ｋｇ（ｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））の用量レベルでの単回皮下（ｓ．ｃ．）投与、または１２５ＩＵ／ｋｇ（ｒＩＸ−ＦＰ）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与のいずれかを受けた。その後、血液サンプルを最大４日間採取した。マウスの血漿サンプル中のヒトＦＩＸ活性および抗原濃度の引き続く測定は、それぞれ凝固アッセイおよび酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）技術を使用して行った。

この試験の一部において、ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与をそれぞれのｉ．ｖ．投与と比較した。この試験の第２の部分において、ｒＩＸ−ＦＰの２つの異なるｓ．ｃ．用量を比較し、最高用量を同等の用量のＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）とさらに比較した。

試験期間中ｒＩＸ−ＦＰまたはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のいずれかのｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与後、処置の局所または全身の有害な影響は観察されなかった。

この試験の結果は、血友病Ｂマウスでは皮下注射後にｒＩＸ−ＦＰが血管系に輸送されたことを示していた。

試験部分１：１２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後に、投与後１６時間（活性レベル）から２４時間（抗原レベル）の間にピーク血漿レベルに達した（表６および７）。それぞれのバイオアベイラビリティーは、ＦＩＸ活性レベルに関して５０％およびＦＩＸ抗原レベルに関して３１％であった。

活性および抗原ＦＩＸレベルから導出したＰＫ値の観察された差は、アッセイ感度の差によるものかもしれない。それは、ＥＬＩＳＡを使用した抗原測定値と比較して、ＦＩＸ活性アッセイに関して高かった。

試験部分２：１２５および２５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後、評価のための活性または抗原ＦＩＸ血漿レベルを使用したところ、薬物動態は用量に比例していた（表６および７）。１６から２４時間の間にこれもまたピーク血漿レベルに達した。

ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のｓ．ｃ．適用と比較して、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後のヒトＦＩＸ活性血漿レベルは高く、よりゆっくりと低下した（表６）。それにより、ｒＩＸ−ＦＰ（０．６９ＩＵ／ｍＬ）の最大血漿レベルは、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（０．１０ＩＵ／ｍＬ）に関するものより約７倍高かった。さらに、ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後のＡＵＣ（３８．６ｈ×ＩＵ／ｍＬ）は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（４．６ｈ×ＩＵ／ｍＬ）と比較して約８倍高かった。ＦＩＸ抗原レベル（表７）に基づいて、ｒＩＸ−ＦＰ投与後の最大ＦＩＸ血漿レベル（０．５４ＩＵ／ｍＬ）は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（０．１１ＩＵ／ｍＬ）後よりも約５倍高かったが、ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与後のＡＵＣ（２６．０ｈ×ＩＵ／ｍＬ）は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（１．７ｈ×ＩＵ／ｍＬ）と比較して約１５倍高かった。

まとめると、ｒＩＸ−ＦＰのｓ．ｃ．投与は、忍容性が良好で、薬理学的に関連したバイオアベイラビリティーを有しており、薬物動態は販売されている組換えＦＩＸ製品ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）より優れていた。

〔実施例２〕
臨床試験
血友病Ｂ患者への皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティーおよび投与シミュレーション
血友病Ｂ対象への２５または５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のｒＩＸ−ＦＰの薬物動態および安全性を評価するために、ｒＩＸ−ＦＰの皮下投与の第Ｉ相薬物動態試験を非盲検単回用量漸増試験として行った（それぞれコホート１および２）。３日に１回、１５用量与えられる２５ＩＵ／ｋｇの反復用量投与も評価した（コホート３）。

皮下の部分試験における対象に関する主要な適格性基準は、対象が、年齢が少なくとも１８歳で５０．０から１００．０ｋｇの間の体重を有し、現在、試験ＣＳＬ６５４＿３００３に登録されている血友病Ｂ（ＦＩＸ活性≦２％）で、ｒＩＸ−ＦＰを≧１００ＥＤ受けた男性とした。３か月の間に命に関わる出血エピソードを経験したか、または大規模な手術を受けた対象は、この試験には不適格とした。

部分試験に登録された対象をコホート（コホート１［２５ＩＵ／ｋｇ単回投与］、コホート２［５０ＩＵ／ｋｇ単回投与］、またはコホート３［２５ＩＵ／ｋｇの反復用量投与］）に順次割り当てた。

単回投与分析（２５ＩＵ／ｋｇおよび５０ＩＵ／ｋｇ）
コホート１および２に関して、ｒＩＸ−ＦＰの単回投与を先行するｒＩＸ−ＦＰ投与の少なくとも１４日後に投与し、ＰＫ分析のための血液サンプルを投与前、投与の３０分後、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０および３３６時間後に採取した。１５日目の３３６ｈｒの時点の最後のＳＣＰＫサンプルの採取後、５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの単回ＩＶ投与を施し、ＰＫ分析のための血液サンプルを選択した時点に採取した。中央研究室（ＣＳＬＢｅｈｒｉｎｇ）における一段ａＰＴＴアッセイによって測定したＦＩＸ活性を使用してＰＫを算出し、活性化因子としてＰａｔｈｒｏｍｔｉｎＳＬを使用した。

安全性を評価するための部分試験訪問の終了のために対象は、２週間（２８日）目に戻った。２８日目の部分試験訪問の終了後、対象は、主たる試験のＩＶｒＩＸ−ＦＰ予防治療計画に戻った。

皮下投与後のｒＩＸ−ＦＰの薬物動態を血漿中のＦＩＸ活性レベルの測定値に基づいて評価した。図５Ａおよび５Ｂは、各ヒト患者へのｒＩＸ−ＦＰの皮下投与（２５および５０ＩＵ／ｋｇ）における未補正のＦＩＸ活性対時間プロットを示している。特に、患者が事前の静脈内投与試験から来たという事実のために、ベースラインが予想される内因性レベルよりも高かったため、ＦＩＸ活性レベルを投与前ＦＩＸレベルの指数関数的低下に関して補正した。補正したら、ｘの負の値（合計３０のＰＫサンプルポイントのうちの４つ）を、モデルフィッティングを可能にするために０．０１％の閾値に設定した。図６Ａおよび６Ｂは、ヒト患者への２５および５０ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの皮下用量でのＩＤによる補正されたＦＩＸ活性対時間プロットを示している。これらのグラフは、ＳＣ投与前のＩＶキャリーオーバーの結果、高い投与前レベルが生じたこと、およびすべての用量レベルにわたって血漿レベルの増加が投与前レベルを２から８％超える範囲に及び、ＳＣ投与の２４〜４８時間後にピークになることを示している。

ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアにおけるノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）法を使用した濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）、およびバイオアベイラビリティーを含む、薬物動態学的パラメーターの分析のために、補正したＰＫ濃度を使用した。バイオアベイラビリティーを、ｓ．ｃ．およびＩＶ投与の両方に関する０〜３３６ｈｒの用量に正規化された部分的なＡＵＣを使用して算出したところ、コホート１に関してはベースラインを１４．１２％から１０２％の間およびコホート２に関しては１０．１から３５．５％（表８Ａ参照）超えていた。

薬物動態分析
ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用してモデリングおよびシミュレーションを行った。データ提示およびプロットの構築に対してＥｘｃｅｌおよびＲソフトウェアを使用した。

未処理群をプールするアプローチを使用して個々のそれぞれの対象に対してコンパートメント薬物動態分析を行った。最初の推定値をＮＣＡから得た。コンパートメントモデルフィッティングを使用して分布容積（Ｖ）、クリアランス（ＣＬ）および吸収速度定数（Ｋａ）を推定した。

ステップワイズモデル選択は、目的関数値（ＯＦＶ）の最小化に基づくものとした。モデル妥当性および性能は、観察値（ＤＶ）、個別予測値（ＩＰＲＥＤ）対時間などのさまざまな診断プロットによってチェックした。

最終的なモデルは１コンパートメント加法誤差モデルとし、これをシミュレーションにさらに利用した。各対象に対するパラメーター推定値を表８Ｂに示す。

３３６ｈｒまでと限定されたサンプル採取ウィンドウのため、ＩＶと類似したＦＩＸ活性レベルの指数関数的低下と想定する排出を推定するために３３６ｈｒ後に追加の４時点を加えた。この想定によると、吸収された実際のＳＣ割合は、現行のモデルフィット／シミュレーションにおいて推定されたものよりも大きい可能性もある。

反復用量分析（３日に１回の２５ＩＵ／ｋｇ）
コホート３に関して、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰの投与１を先行するｒＩＸ−ＦＰ投与後少なくとも１４日目および２４時間に投与し、血液サンプルは、投与前、投与の３０分後、３時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間後に血漿ＦＩＸ活性および凝固の活性化に関して分析した。

コホート３の対象は、２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのＳＣ投与２および３のために研究施設に戻った。ＳＣ投与３に先立って、血液サンプルを血漿ＦＩＸ活性に関して分析した。対象は、ＳＣ投与４から１２を家で３日に１回投与し、ＳＣ投与１３のために研究施設に戻った。ＳＣ投与１３に先立って、血漿ＦＩＸ活性に関する血液サンプルも採取した。研究施設で投与した各用量の後、治験責任医師は、局所忍容性を評価し（３０分の時点）、ＡＥおよびあらゆる併用療法を記録した。投与１４も家で投与した。

２５ＩＵ／ｋｇのｒＩＸ−ＦＰのＳＣ投与１５を研究施設で与え、血液サンプルを、投与前、投与の３０分後、３時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間後に血漿ＦＩＸ活性および凝固の活性化試験に関して評価した。局所忍容性ならびにＡＥおよびあらゆる併用療法の評価を研究施設で与えた各用量に関して評価した。

それぞれの患者に関する各時点のＦＩＸ活性を表９および図７に示す。

薬物動態分析
この分析にＮＯＮＭＥＭ（登録商標）プログラムバージョン７．３を使用した（ＩＣＯＮＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓ、エリコットシティー、メリーランド州、米国）［ＮＯＮＭＥＭユーザーガイド］。ＮＯＮＭＥＭインタフェースとしてＰｉｒａｎａ（バージョン２．８．１）を使用した。ＰＫパラメーターは、相互作用を考慮した条件付き一次近似法（Ｆｉｒｓｔ−ＯｒｄｅｒＣｏｎｄｉｔｉｏｎａｌＥｓｔｉｍａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｗｉｔｈＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（ＦＯＣＥＩ）を使用して推定した。ＮＯＮＭＥＭ実行およびＶＰＣのためにＰｅｒｌ−ｓｐｅａｋｓ−ＮＯＮＭＥＭ（ＰｓＮ、バージョン３．５．３）を使用した。後処理および結果のプロットのためにＲ（バージョン２．１４．１）（ｈｔｔｐ：／／ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用した。

試験、ＣＳＬ６５４＿２００１、ＣＳＬ６５４＿２００４、ＣＳＬ６５４＿３００１、ＣＳＬ６５４＿３００２からのデータを使用したＣＳＬ６５４（Ｉｄｅｌｖｉｏｎ最終モデル）のＦＩＸ活性に関する予め構築した静脈内投与ｒＩＸ−ＦＰ（２コンパートメント）集団ＰＫモデルを、本分析のための開始点として使用した。配置のパラメーターをクリアランスおよび分布容積パラメーターに関して表した。前のモデリングは、対数変換データを使用するのが有利である可能性があることを示し；したがって、対数変換ＦＩＸ活性を調査した。静脈内および皮下経路のｒＩＸ−ＦＰ投与後のＦＩＸ活性の同時フィッティングは、ＮＯＮＭＥＭ内のＡｄｖａｎ４Ｔｒａｎｓ４モデルライブラリーを使用して実施した。

ＦＩＸ活性ＰＫモデルに関して、真の内因性ＦＩＸ活性レベルを、ＦＩＸ活性≦２％の試験対象患者基準と一致した２％ＦＩＸ活性以下と推定した。したがって、対象が最初のｒＩＸ−ＦＰの投与前に２％を超える観察されたＦＩＸ活性値を有した場合、これは、真の内因性ＦＩＸ活性レベルに加えて事前のＦＩＸ製品の残りの寄与を反映していると推定した。したがって、観察されたＦＩＸ活性レベル（ＦＴＯＴ）を、以下の方程式として示すとおり、内因性ベースラインレベル（ＦＥＮＤ）、事前のＦＩＸ製品のあらゆる残りの寄与（ＦＰＰ）およびＣＳＬ６５４投与によるＦＩＸレベルの増加（ＦＥＸ）の合計と仮定した：
ＦＴＯＴ＝ＦＥＸ＋ＦＥＮＤ＋ＦＰＰ
式中：
ＦＰＰ＝ＢＳＥ×ＥＸＰ（−（ＣＬ／Ｖ１）×時間）であるが、ＢＳＥ＜２の場合は、ＦＰＰ＝０。
ＢＳＥ＝観察された投与前ＦＩＸ活性
ＦＰＰが以下のものの下限を下回る場合、ＦＰＰ＝０：ＢＳＥ、ＦＩＸ活性のスクリーニング、または２％である。
共変量モデリング：体重は、この分析において有意な共変量と考えられた。

モデル評価：モデルに関する適合度（ＧｏＦ）をさまざまなプロットおよび算出した測定規準によって評価した：
・観察値対集団および個々の予測濃度プロット；
・条件付き重み付き残差（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｗｅｉｇｈｔｅｄｒｅｓｉｄｕａｌｓ）（ＣＷＲＥＳ）対集団の予測濃度および対時間プロット；
最終モデルは、３００３試験のコホート１および３からのＳＣデータならびに２００１、２００４、３００１、３００２および３００３を含む、試験からのＩＶデータの同時フィッティングを用いた２コンパートメントモデルであった。体重および体重により調節された用量は、中心コンパートメント（ｃｅｎｔｒａｌｖｏｌｕｍｅ）に対する有意な共変量であり、体重は、クリアランスに対する有意な共変量であった。

シミュレーション：
最終的なＦＩＸ活性集団ＰＫモデルを、青年／成人集団における以下のＩＶ投与シナリオに関するＦＩＸ活性・時間プロフィール（ＦＴＯＴおよびＦＥＸの両方）をシミュレーションするために使用した：
・毎日の２５ＩＵ／ｋｇの定常状態投与
・２日に１回の２５ＩＵ／ｋｇの定常状態投与
・３日に１回の２５ＩＵ／ｋｇの定常状態投与

これらのシミュレーションに関して、集団ＰＫモデリングに含まれる青年／成人の個々の観察された投与前ＦＩＸ活性レベルおよび個々の体重をシミュレーションデータセットに使用し、１０分間の輸注期間を推定した。それぞれのシミュレーションシナリオに対してシミュレーションデータセットの１０００回の反復を行った。

シミュレーショントラフＦＩＸ活性レベルおよび観察されたトラフＦＩＸ活性レベルの概要を表１０に示す。

毎日、２日に１回および３日に１回の時間間隔の２５ＩＵ／ｋｇに関するＦＩＸ活性（ＩＵ／ｄＬ）対時間のシミュレートしたプロットを図８Ａ〜Ｃに示し、コホート３（ｎ＝３）の１５回目の投与における観察された反復ＰＫデータと重ね合わせた３日に１回の２５ＩＵ／ｋｇに関するＦＩＸ活性（ＩＵ／ｄＬ）対時間のシミュレートしたプロットを図８Ｄに示す。

まとめ：
３日に１回の２５ＩＵ／ｋｇの反復皮下ｒＩＸ−ＦＰ投与後の観察されたＦＩＸ活性データ（中央値６．２ＩＵ／ｄＬ）は、患者のＦＩＸ活性レベルを軽症の血友病患者下位区分（例えば、＞５ＩＵ／ｄＬのＦＩＸレベル）内に維持するｒＩＸ−ＦＰ投与のこの経路の能力を実証した。修正された集団ＦＩＸＰＫモデルは、ｒＩＸ−ＦＰ投与の皮下経路を含み、十分に特徴づけた。ｒＩＸ−ＦＰの単回および反復皮下投与後の個々の患者のＦＩＸＰＫの適合度は、最終モデルの有用性を実証している。シミュレーションは、観察された皮下ｒＩＸ−ＦＰＰＫデータが予測されたＰＫプロフィールと十分に整合することを確認した。

Claims

予防的投与計画においてヒト患者における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、および
ｂ）ヒトアルブミン
を含む融合タンパク質を含む医薬組成物であって、該ヒトＦＩＸは、凝固に関与するプロテアーゼまたは凝固酵素によって活性化されるプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して、該ヒトアルブミンのＮ末端と連結されており、該融合タンパク質は、約１０〜５０ＩＵ／ｋｇの用量で、およそ１日に１回からおよそ週に１回の投与間隔を使用して対象に皮下投与される、前記医薬組成物。
用量は、約１０ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約５０ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回である、請求項１に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回である、請求項２に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ週に１回である、請求項３に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ１日に１回、またはおよそ週に４回、またはおよそ２日に１回、またはおよそ３日に１回、またはおよそ週に２回、またはおよそ５日に１回、またはおよそ
週に１回である、請求項４に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ１日に１回である、請求項３に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ２日に１回である、請求項３に記載の医薬組成物。
投与間隔は、およそ３日に１回である、請求項３に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約８から約３４ＩＵ／ｄＬの間に維持される、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ１日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約１７ＩＵ／ｄＬに維持される、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ２日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約４から約１７ＩＵ／ｄＬの間に維持される、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ２日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約８ＩＵ／ｄＬに維持される、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約２．５から約１２ＩＵ／ｄＬの間に維持される、請求項１に記載の医薬組成物。
用量は、約２５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、およそ３日に１回であり、血漿中の総ＦＩＸ活性トラフレベルは、約５ＩＵ／ｄＬに維持される、請求項１に記載の医薬組成物。
ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１％超えるトラフレベルを維持する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約３％超えるトラフレベルを維持する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約５％超えるトラフレベルを維持する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１０％超えるトラフレベルを維持する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＦＩＸの血漿レベルは、投与間隔の全体にわたりベースラインを少なくとも約１５％超えるトラフレベルを維持する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
リンカーは、ＦＩＸａによっておよび／またはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）によって切断可能である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
リンカーは、配列番号１および配列番号２から選択される配列を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも７０％同一性を有する、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
融合タンパク質の配列は、配列番号３に記載の配列を有する、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
ヒト患者は、血友病Ｂを患っている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
投与のために、約１００から４００ＩＵ／ｍｌの濃度で提供される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
投与のために、約１００、２００または４００ＩＵ／ｍｌの濃度で提供される、請求項２８に記載の医薬組成物。