ES3040596T3 - Humanized m-csf mice and uses thereof - Google Patents

Humanized m-csf mice and uses thereof

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ES3040596T3
ES3040596T3 ES23161285T ES23161285T ES3040596T3 ES 3040596 T3 ES3040596 T3 ES 3040596T3 ES 23161285 T ES23161285 T ES 23161285T ES 23161285 T ES23161285 T ES 23161285T ES 3040596 T3 ES3040596 T3 ES 3040596T3
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Andrew J Murphy
Sean Stevens
Chozhavendan Rathinam
Elizabeth Eynon
Markus G Manz
Richard Flavell
George D Yancopoulos
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Yale University
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Institute for Research in Biomedicine IRB
Yale University
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Se proporcionan ratones genéticamente modificados que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína M-CSF humana. También se proporcionan ratones genéticamente modificados que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína M-CSF humana y que han sido injertados con células humanas, como células hematopoyéticas humanas, así como métodos para generar dichos ratones injertados. Estos ratones se utilizan en diversas aplicaciones, como la modelización de enfermedades inmunitarias humanas e infecciones por patógenos; en cribados in vivo de agentes que modulan el desarrollo y/o la actividad de las células hematopoyéticas, por ejemplo, en un estado sano o enfermo; en cribados in vivo de agentes tóxicos para las células hematopoyéticas; en cribados in vivo de agentes que previenen, mitigan o revierten los efectos tóxicos de agentes tóxicos sobre las células hematopoyéticas; en cribados in vivo de células hematopoyéticas humanas de un individuo para predecir su respuesta a una terapia, etc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ratones humanizados con M-CSF y uso de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a una célula madre embrionaria de ratón genéticamente modificada, un embrión o una construcción de direccionamiento que comprende un gen que codifica una proteína del M-CSF humano y un método para fabricar un ratón humanizado con M-CSF usando la construcción de direccionamiento.
Antecedentes
El desarrollo de modelos animales para estudiar enfermedades humanas ha avanzado significativamente en la comprensión de los mecanismos subyacentes de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer. Hasta la fecha, modelos animales, particularmente ratones, han demostrado ser excelentes candidatos para la evaluación de la eficiencia y eficacia de fármacos y opciones terapéuticas. Mientras que la utilización de estos modelos sustitutos para estudiar la biología y las enfermedades humanas se puede justificar en gran medida (debido a limitaciones éticas y técnicas en la realización de terapias experimentales en seres humanos) los estudios han puesto de manifiesto posibles limitaciones de extrapolar datos de ratones a seres humanos (Mestas J, Hughes CC. (2004) Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172:2731-2738).
Para superar estos problemas, ha existido un interés permanente en desarrollar modelos de ratones humanizados. El intenso trabajo de diversos grupos ha demostrado con éxito la viabilidad del estudio de la biología y las enfermedades humanas en ratones. Dado que tener un sistema inmune funcional y eficaz en los receptores dará como resultado la eliminación de los tejidos/células trasplantados de origen humano, el uso de mutantes genéticos que carecen de células del sistema inmune adaptativo tales como células T, B y NK ha contribuido significativamente al éxito del modelo murino humanizado. Por consiguiente, los candidatos más eficaces de los modelos de ratón humanizado incluyen las cepas NOD-SCID y Balb/c que carecen de genes que incluyen genes activadores de la recombinación (RAG, del inglés"recombination activating genes"),cadena gamma común (yC, también conocida como "receptor de interleuquina 2 gamma" o IL2rg), beta 2 microglobulina (B2M) y perforina 1 (Prf1) (Shultz LD,et al.(2007) Humanized mice in translational biomedical research, Nat. Rev. Immunol. 7:118-130). Diversos estudios en las últimas décadas han demostrado la viabilidad de trasplantar diversos tipos de tejidos humanos, incluidos leucocitos de sangre periférica, células hepáticas fetales, hueso fetal, timo fetal, ganglios linfáticos fetales, piel vascularizada, segmentos arteriales y células madre hematopoyéticas (CMH) movilizadas o de sangre del cordón umbilical, en ciertos ratones humanizados (Macchiarini F.,et al.(2005) Humanized mice: are we there yet? J. Exp. Med. 202:1307-1311). Se cree que este enfoque proporciona mejores sistemas de modelos ya que los datos obtenidos de células humanas en estos ratones podrían reflejar la fisiología del sistema humano. Una gran vía de investigación en el campo es la generación de ratones con un sistema hematopoyético completo y un sistema inmune funcional de origen humano. Si bien se ha logrado un progreso significativo en la generación de ratones inmunocomprometidos con linfocitos T, linfocitos B, células NK y células dendríticas (CD), aún existen diversos desafíos en el campo, uno de los cuales es la diferenciación mieloide pobre en los ratones humanizados.
Curiosamente, ha habido mucho progreso en la generación de linfocitos T, linfocitos B, células NK y células dendríticas (CD) humanas a partir de células madre hematopoyéticas (CMH) en ratones humanizados. Además del compartimento hematopoyético individual, la inyección de CMH humanas en estos ratones dio como resultado la reconstitución de órganos linfoides tales como el timo y el bazo. No obstante, las frecuencias de células mieloides, particularmente, granulocitos, macrófagos, eritrocitos y megacariocitos, son muy bajas, un resultado que probablemente se deba a la mielopoyesis ineficaz de las CMH humanas en estos ratones (Shultzet al.(2007); Macchiariniet al.(2005)). En vista del hecho de que las células de origen mieloide (tales como los eritrocitos y los megacariocitos) son vitales para el funcionamiento normal del sistema sanguíneo y que los granulocitos y los macrófagos son fundamentales para el desarrollo del sistema inmune adaptativo, la generación de ratones humanizados con una mielopoyesis humana eficaz es de suma importancia.
Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de ratones genéticamente modificados que sean capaces de mejorar la mielopoyesis humana tras el injerto con CMH humanas (Manz MG. Human-hemato-lymphoid-system mice: opportunities and challenges. Immunity. Mayo de 2007; 26(5):537-41). Chenet al.,PNAS, 106 (51) 21783 21788, 2009 describe un ratón humanizado con M-CSF, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano liberada hidrodinámicamente mediante una inyección en la vena de la cola de un plásmido. Willinger,et al.,PNAS 108 (6) 2390-2395, 2011 describe un ratón de inserción génica con IL-3/GM-CSF humano.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Se proporciona una célula madre embrionaria (ES) de ratón de acuerdo con la reivindicación 1. También se proporciona un embrión de ratón de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano y métodos para fabricar un ratón humanizado con M-CSF de acuerdo con la reivindicación 9. Estos ratones encuentran utilidad en una serie de aplicaciones, tales como en el modelado de la enfermedad inmune humana y la infección por patógenos; en cribasin vivopara agentes que modulan el desarrollo y/o actividad de las células hematopoyéticas,por ejemplo,en un estado saludable o enfermo; en cribasin vivopara agentes que son tóxicos para las células hematopoyéticas; en cribasin vivopara agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de agentes tóxicos en las células hematopoyéticas; en cribasin vivode las células hematopoyéticas humanas de un individuo para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a una terapia para una enfermedad,etc.
En algunas realizaciones, la célula ME de ratón comprende dos copias de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico está localizada en el genoma de ratón dentro del locus M-CSF de ratón. La secuencia de ácido nucleico está operativamente unida al promotor del M-CSF de ratón endógeno en el locus M-CSF de ratón, es decir, el ratón es un ratónM-CSFh/m.En algunas realizaciones, la célula ME de ratón comprende dos alelos en que la secuencia de ácido nucleico se localiza en el genoma del ratón dentro del locus M-CSF de ratón. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de ambos alelos está unida operativamente al promotor del M-CSF de ratón endógeno en el locus M-CSF de ratón, es decir, el ratón es un ratónM-CSFh/h.En algunas realizaciones, la célula ME de ratón humanizado con M-CSF comprende una mutación nula en al menos un alelo del M-CSF de ratón. En algunas realizaciones, la célula ME de ratón humanizado con M-CSF comprende una mutación nula en ambos alelos del M-CSF de ratón. En algunas de dichas realizaciones, la mutación nula es una deleción de los exones 2-9 del M-CSF de ratón.
En algunas realizaciones, la cantidad del M-CSF humano expresada es sustancialmente la misma que la cantidad del M-CSF de ratón expresada en un ratón de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la célula ME de ratón expresa el M-CSF de ratón y el M-CSF humano. En otras realizaciones, el único M-CSF expresado por la célula ME de ratón es el M-CSF humano.
En algunas realizaciones, el control transcripcional y traduccional del M-CSF humano en la célula ME de ratón modificado genéticamente es idéntico o sustancialmente idéntico al control transcripcional y traduccional del M-CSF de ratón en una célula ME de ratón que carece de una modificación de su gen del M-CSF de ratón endógeno.
En algunas realizaciones, la célula ME de ratón expresa una isoforma del M-CSF humano seleccionada a partir del proteoglicano del M-CSF, glicoproteína del M-CSF y M-CSF de superficie celular y una combinación de los mismos. En una realización, la célula ME de ratón expresa al menos dos de las isoformas en un patrón de desarrollo y tejido específico normal. En una realización específica, la célula ME de ratón expresa el proteoglicano del CSF-1 humano y la de glicoproteína del M-CSF humano y el M-CSF de superficie celular humano.
En algunas realizaciones, la célula ME de ratón es homocigota nula para Rag2. En algunas realizaciones, la célula ME de ratón es homocigota nula para IL2rg. En algunas realizaciones, la célula ME de ratón es homocigota nula para Rag2 y para IL2rg.
En algunos aspectos de la invención, se proporciona un embrión de ratón, de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano unida operativamente al promotor del gen del M-CSF de ratón.
En algunos aspectos de la invención, se proporciona una construcción de direccionamiento para dirigirse a una secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano al locus del M-CSF de ratón de tal manera que la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano esté unida operativamente al promotor endógeno del gen M-CSF de ratón en el locus del M-CSF de ratón, que comprende (a) brazos de direccionamiento en dirección 5' y en dirección 3' que son complementarios o sustancialmente complementarios a las secuencias de nucleótidos en dirección 5' y en dirección 3' de cualquiera de (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína M-CSF de ratón, o (ii) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína M-CSF de ratón; (b) una secuencia de ácido nucleico humana que codifica una proteína del M-CSF humano o fragmento de la misma, o una secuencia de ácido nucleico humana que codifica el complemento de una proteína del M-CSF humano o fragmento de la misma; y (c) un marcador y/o casete de selección.
En algunos aspectos de la invención, se proporciona un método para crear un ratón humanizado con M-CSF que exprese M-CSF humano biológicamente activo de acuerdo con la reivindicación 9. El método comprende poner en contacto una célula ME de ratón con la construcción de direccionamiento de la reivindicación 8 y cultivar la célula ME para integrar la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del M-CSF humano biológicamente activa; crear un ratón a partir de la célula ME de ratón que comprende en su genoma la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína del M-CSF humano biológicamente activa. La secuencia de ácido nucleico se integra en un locus diana. El locus diana es el locus M-CSF de ratón endógeno, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante para una proteína del M-CSF humano está flanqueada por secuencias que son homólogas al locus M-CSF de ratón endógeno y la secuencia de ácido nucleico se integra en el locus M-CSF de ratón endógeno por recombinación homóloga. En algunas realizaciones, el ratón es homocigoto nulo para Rag2. En algunas realizaciones, el ratón es homocigoto nulo para IL2rg. En algunas realizaciones, el ratón es homocigoto nulo para Rag2 e IL2rg, es decir, esRag2~liL2rg~l~
Breve descripción de las figuras
LaFigura 1ilustra, para células del estroma mesenquimales de médula ósea,(A)la expresión del M-CSF; se aislaron los órganos indicados de M-CSFm/m y M-CSFh/h, se extrajo el ARN y se realizó análisis de PCR de transcripción inversa (TI) utilizando cebadores específicos del M-CSF de ratón (superior) o M-CSF humano (medio); se utilizó el nivel de HPRT (inferior) como control para el ADNc de entrada; los datos son representativos de 2 experimentos independientes.(B)Se aislaron los órganos indicados de M-CSFh/m, se extrajo el ARN y se realizó análisis de TI-PCR utilizando cebadores específicos del M-CSF de ratón (superior) o M-CSF humano (inferior). El ARN extraído del hígado de ratón o del hígado fetal humano sirvió como controles positivos para pares de cebadores de ratón y humanos, respectivamente, sin TI y las reacciones de PCR sin plantilla sirvieron como controles negativos. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.
(C)Se aislaron y cultivaronin vitrodurante 10 días células del estroma asociadas al hueso de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h, se lisaron las células y se extrajo el ARN y se realizó análisis de PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos del M-CSF de ratón (blanco) o M-CSF humano (negro); se muestran los valores medios de las muestras duplicadas; las barras de error indican ± EEM; la cantidad de ADNc de entrada se normalizó de acuerdo con los niveles de expresión de HPRT (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa); los datos son representativos de 2 experimentos independientes; y,(D)se aislaron y cultivaronin vitrodurante 10 días células del estroma asociadas al hueso de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h; se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se cuantificaron los niveles secretados del M-CSF de ratón (blanco) y humano (negro) utilizando kits ELISA del M-CSF específicos de especie; se muestran los valores medios de las muestras triplicadas; las barras de error indican ± e EM; los datos son representativos de 2 experimentos independientes.
(E)Se sangraron ratones M-CSFm/m,M-CSFh/my M-CSFh/h y se cuantificaron los niveles séricos del M-CSF humano y de ratón a través de ELISA. Se muestran los valores medios de las muestras por triplicado. Las barras de error indican ± EEM.
LaFigura 2Ailustra números absolutos de células de médula ósea (MO) de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h, como promedio por animal (dos tibia y peroné); cada grupo contiene n = 5 ratones, de 4 semanas de edad; las barras de error indican ± EEM; los datos son representativos de 3 experimentos independientes.
LaFigura 2Bilustra el análisis de citometría de flujo de una suspensión de células individuales teñidas de MO (superior), bazo (central) y sangre periférica (SP) de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h; teñidos con anticuerpos Gr1 y CD11b.
LaFigura 2Cilustra el análisis de citometría de flujo de una suspensión de células individuales teñidas de MO (superior) y bazo (central) de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h; teñidos con anticuerpos F4/80 y CD11b. LaFigura 2Dilustra el análisis de citometría de flujo de células de MO que se aislaron y cultivaron en presencia del M-CSF de ratón (izquierda) o M-CSF humano (derecha) recombinante durante 7 días; se tiñeron las células con anticuerpos F4/80 y CD11b.
LaFigura 2Eilustra el análisis de citometría de flujo de células de MO que se aislaron y cultivaron en presencia del M-CSF de ratón (relleno) o M-CSF humano (abierto) recombinante durante 7 días; se tiñeron las células con los marcadores de superficie indicados.
LaFigura 3Ailustra la citometría de flujo de suspensiones de células individuales teñidas de MO (superior), bazo (central) y sangre peritoneal (SP) de células CD34+ humanas injertadas en ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h; se tiñen con anticuerpos humanos CD45, CD14 y CD33; las células que son CD45+ humanas se bloquearon previamente y se discriminaron basándose en la expresión de CD14 y CD33.
LaFigura 3Bilustra frecuencias relativas de células CD45+ CD14+CD33+ humanas de MO (arriba), bazo (central) y sangre periférica (SP); se determinó el número absoluto de células de MO como promedio por animal (dos tibias y peroné) y de la sangre peritoneal se determinó por ml de volumen de sangre; cada grupo contiene n = 20 ratones; cada símbolo representa un ratón individual, las barras horizontales indican los valores medios; los datos son representativos de 5 experimentos independientes
LaFigura3<c>ilustra frecuencias absolutas de células CD45+ CD14+CD33+ humanas de MO (arriba), bazo (central) y sangre periférica (SP); se determinó el número absoluto de células de MO como promedio por animal (dos tibias y peroné) y de la sangre peritoneal se determinó por ml de volumen de sangre; cada grupo contiene n = 20 ratones; cada símbolo representa un ratón individual, las barras horizontales indican los valores medios; los datos son representativos de 5 experimentos independientes.
LaFigura 4Ailustra el análisis de citometría de flujo de células teñidas a partir de células CD34+ humanas injertadas en ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h sangrados después de 12, 16 y 20 semanas del trasplante; las células se tiñeron con anticuerpos CD45, CD14 y CD33 humanos; las células que son CD45+ humanas se bloquearon previamente y se discriminaron basándose en la expresión de CD14 y CD33.
LaFigura 4Bilustra frecuencias relativas de células CD45+ CD14+CD33+ humanas; cada grupo contiene n = 10 ratones; cada símbolo representa un ratón individual, las barras horizontales indican los valores medios; los datos son representativos de 3 experimentos independientes.
LaFigura 5ilustra el análisis de citometría de flujo que resulta de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h injertados con células CD34+ humanas y 12 semanas después del trasplante, cuando se sacrificaron los ratones y se perfusieron con PBS; se recogieron el hígado(A), los pulmones(B)y la piel(C)y se prepararon suspensiones de células individuales; se recogieron células de la cavidad peritoneal(D)mediante aspiración con PBS; se tiñeron las células con anticuerpos CD45, CD14 y CD33 humanos y se analizaron mediante citometría de flujo; cada símbolo representa un ratón individual, las barras horizontales indican los valores medios; los datos son representativos de 3 experimentos independientes.
LaFigura 6ilustra los resultados de la estimulación con LPS.(A)Se injertaron ratones M-CSFm/m y M-CSFm/h con células CD34+ humanas y 12 semanas después del trasplante, se inyectó LPS i.p. y 48 horas más tarde se sacrificaron los ratones y se determinaron las frecuencias de células CD45+CD14+CD33+ humanas en el bazo; los ratones inyectados con PBS sirvieron como controles; cada símbolo representa un ratón individual, las barras horizontales indican los valores medios.(B), (C)Se injertaron ratones M-CSFm/m y M-CSFm/h con células CD34+ humanas y 12 semanas después del trasplante, se inyectó LPS i.p. Seis horas después, se sangraron los ratones y se cuantificaron los niveles de suero de IL-6 y TNF-a humano (derecha) y de ratón (izquierda) mediante ELISA; los ratones inyectados con PBS sirvieron como controles; se muestran los valores medios de las muestras triplicadas; las barras de error indican ± EEM.
LaFigura 7A(para hTNFa) y7B(para hIL-6) ilustran la capacidad de los monocitos/macrófagos para secretarin vitrocitoquinas proinflamatorias después de la estimulación con LPS. Se aislaron las células CD45+CD14+CD33+ humanas de los bazos de ratones M-CSFm/m y M-CSFh/h injertados en células CD34+ humanas después de 12 semanas del trasplante; las células CD45+CD14+CD33+ obtenidas del hígado fetal sirvieron como controles; se estimularon las célulasin vitrocon LPS durante 24 y 48 horas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se cuantificaron los niveles de TNF-a(A)e IL-6(B)humanos mediante ELISA; se muestran los valores medios de las muestras triplicadas; las barras de error indican ± EEM.
LaFigura 7Cilustra los niveles de ARNm del interferón-a y -p en respuesta a la estimulación con poli I:C. Se estimularon las células CD45+CD14+CD33+ humanas con poli I:C durante 6 y 12 horas y se cuantificaron los niveles de ARNm de IFNa (izquierda) e IFNp (derecha) mediante PCR en tiempo real; se muestran los valores medios de las muestras duplicadas; las barras de error indican ± EEM
LaFigura 7Dilustra propiedades de fagocitosis, migración y activación de células de ratones injertados. Se aislaron las células CD45+CD14+CD33+ humanas a partir de ratones humanizados y se incubaron con bacterias marcadas con FITC a 37 °C durante 30 y 60 minutos y se midió mediante citometría de flujo; las células incubadas con bacterias marcadas con FITC en hielo sirvieron como controles. Los histogramas abiertos representan células de ratones M-CSFm/m, los histogramas punteados representas células de ratones M-CSFh/h y los histogramas rellenos representan células de hígado fetal humano.
LaFigura 7Eilustra la quimiotaxis de células en respuesta a MIP3p. Las células CD45+CD14+CD33+ humanas aisladas a partir de ratones M-CSFm/m, ratones M-CSFh/h e hígado fetal humano se mantuvieron en los pocillos superiores y se añadió medio que contenía MIP3p en los pocillos inferiores; se incubaron las células durante 30 o 60 minutos y se calculó y representó el número de células que migraron de los pocillos superiores a los pocillos inferiores; se muestran los valores medios de las muestras duplicadas; las barras de error indican ± EEM LaFigura 7Filustra la activación mejorada de monocitos/macrófagos humanos de ratones injertados basándose en la regulación positiva de hCD40, hCD80, hCD86y hHLA-DR después de la estimulaciónin vitrocon LPS. Las células CD45+CD14+CD33+ humanas aisladas a partir de ratones M-CSFm/m, ratones M-CSFh/h e hígado fetal humano se cultivaron en presencia o en ausencia de LPS; después de 24 horas de la estimulación, se tiñeron las células con los marcadores de superficie indicados y se midieron mediante citometría de flujo. Los histogramas abiertos representan células de ratones M-CSFm/m, los histogramas punteados representas células de ratones M-CSFh/h y los histogramas rellenos representan células de hígado fetal humano.
LaFigura 8proporciona una representación esquemática del locus M-CSF de ratón que indica la localización relativa de los exones 1-9 y el alelo diana final con el gen del M-CSF humano.
LasFiguras 9 A, Bilustran las frecuencias del compartimento de CMH y el compartimento progenitor mieloide en ratones M-CSFm/m, M-CSFh/m y M-CSFh/h. Se tiñeron las células de MO de ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h con anticuerpos c-Kit, Sca1, CD150, CD48, CD16/32 y CD34 de linaje y se analizaron mediante citometría de flujo.(A)Las células de linaje' (superior) se bloquearon y se discriminaron basándose en la expresión de Sca1 y c-Kit (central). Las células Sca1+c-Kit+ de linaje- (LSK) se bloquearon y se discriminaron adicionalmente basándose en la expresión de CD150 y CD48 (inferior).(B)Las células de linaje- se bloquearon previamente y se discriminaron basándose en la expresión de Sca1 y c-Kit (superior). Las células c-Kit+Sca1- de linaje- se bloquearon y se discriminaron adicionalmente basándose en la expresión de CD16/32 y CD34 (inferior).
Descripción detallada
Antes de describir los métodos y composiciones actuales, debe entenderse que esta invención no se limita al método o composición particular descrita, ya que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque pueden utilizarse en la puesta en práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales particulares.
Tal como será evidente para los expertos en la técnica tras la lectura de la presente divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene características y componentes discretos que fácilmente pueden separarse o combinarse con las características de cualquiera de las otras realizaciones. Cualquier método citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea posible lógicamente.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos,por ejemplo,polipéptidos, conocido por los expertos en la técnica y así sucesivamente.
Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe interpretarse que nada en el presente documento constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer dicha publicación por virtud de una invención anterior.
Se describen en el presente documento ratones genéticamente modificados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano. También se describen ratones genéticamente modificados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano que se ha injertado con células humanas tales como células hematopoyéticas humanas y métodos para fabricar dichos ratones injertados. Estos ratones encuentran utilidad en una serie de aplicaciones, tales como en el modelado de la enfermedad inmune humana y la infección por patógenos; en cribasin vivopara agentes que modulan el desarrollo y/o actividad de las células hematopoyéticas,por ejemplo,en un estado saludable o enfermo; en cribasin vivopara agentes que son tóxicos para las células hematopoyéticas; en cribasin vivopara agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de agentes tóxicos en las células hematopoyéticas; en cribasin vivode las células hematopoyéticas humanas de un individuo para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a una terapia de enfermedad,etc.
RATONES HUMANIZADOS CON M-CSF
Por un ratón humanizado con M-CSF, o "ratónhM-CSF',se entiende un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano. Por una proteína del M-CSF humano, se entiende una proteína que es el M-CSF humano o es sustancialmente idéntica al M-CSF humano,por ejemplo,es 80 % o más idéntica, 85 % o más idéntica, 90 % o más idéntica o 95 % o más idéntica al M-CSF humano, por ejemplo, un 97 %, 98 % o 99 % idéntica al M-CSF humano. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano es, por lo tanto, un polinucleótido que comprende una secuencia codificante para una proteína del M-CSF humano,es decir,el M-CSF humano o una proteína que es sustancialmente idéntica al M-CSF humano. El M-CSF (también conocido como CSF-1 (del inglés"colony stimulating factor1"), por "factor 1 estimulante de colonias") es una citoquina que controla la producción, diferenciación y función de los macrófagos. La secuencia polipeptídica para el M-CSF humano y la secuencia de ácido nucleico que codifica para el M-CSF humano puede encontrarse en los N.° de Acceso Genbank NM_000757.5 (variante 1), NM_172210.2 (variante 2) y NM_172212.2 (variante 4). El locus genómico que codifica la proteína del M-CSF humano puede encontrarse en el genoma humano en el cromosoma 1; NC_000001.10 (110453233-110472355). La secuencia de proteínas está codificada por los exones 1 a 8 en este locus, mientras el exón 9 comprende una secuencia no traducida. Como tal, una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia codificante para el M-CSF humano comprende uno o más exones 1-8 del gen del M-CSF humano. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico también comprende aspectos del locus genómico M-CSF humano,por ejemplo,intrones, secuencia no traducida 3' y/o 5' (UTR). En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico comprende regiones enteras del locus genómico M-CSF humano. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico comprende el exón 2 del locus genómico M-CSF humano a 633 nt cadena abajo del exón 9 no codificante.
En los ratones humanizados con M-CSF de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano está unida operativamente a una o más secuencias reguladoras del gen del M-CSF de ratón. Las secuencias reguladoras del M-CSF de ratón son aquellas secuencias del locus genómico M-CSF de ratón que regulan la expresión del M-CSF de ratón, por ejemplo, secuencia reguladora 5',por ejemplo,el promotor M-CSF, la región no traducida 5' M-CSF (UTR),etc.;secuencia reguladora 3',por ejemplo,la 3'UTR; y potenciadores,etc.El M-CSF de ratón se localiza en el cromosoma 3 en aproximadamente las posiciones 107.543.966-107.563.387 y la secuencia de codificación del M-CSF de ratón puede encontrarse en los N.° de Acceso Genbank NM_007778.4 (isoforma 1), NM_001113529.1 (isoforma 2) y NM_001113530.1 (isoforma 3). Las secuencias reguladoras del M-CSF de ratón están bien definidas en la técnica y pueden identificarse fácilmente utilizando métodosin silico,por ejemplo, haciendo referencia a los números de acceso Genbank anteriores en el navegador UCSC Genome, en la web mundial en genome.ucsc.edu, o mediante métodos experimentales como se describe a continuación y en la técnica,por ejemplo,Abboudet al.(2003) Analysis of the Mouse CSF-1 Gene Promoter in a Transgenic Mouse Model. J. Histochemistry y Cytochemistry 51(7):941-949. En algunos casos,por ejemplo,cuando la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano se localiza en el locus genómico M-CSF de ratón, las secuencias reguladoras unidas operativamente a la secuencia codificante CSF humana son endógenas o nativas, del genoma de ratón,es decir, se presentaron en el genoma de ratón antes de la integración de las secuencias de ácido nucleico humanas.
En algunos casos, el ratón con M-CSF humanizado se genera mediante la integración aleatoria o inserción de una secuencia de ácido nucleico humana que codifica la proteína del M-CSF humano o un fragmento de la misma, es decir, "secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano" o "secuencia del M-CSF humano", en el genoma. Normalmente, en dichos ejemplos, la ubicación de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano en el genoma es desconocida. En otros casos, el ratón humanizado con M-CSF se genera mediante la integración dirigida o inserción, de la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano en el genoma, mediante recombinación homóloga. En la recombinación homóloga, un polinucleótido se inserta en el genoma hospedador en un locus diana mientras, simultáneamente, se elimina material genómico hospedador,por ejemplo,50 pares de bases (pb) o más, 100 pb o más, 200 pb o más, 500 pb o más, 1 kB o más, 2 kB o más, 5 kB o más, 10 kB o más, 15 kB o más, 20 kB o más o 50 kB o más de material genómico, a partir del locus diana. Por lo tanto, por ejemplo, en un ratón humanizado con M-CSF que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano mediante el direccionamiento de la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano al locus M-CSF de ratón, la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano puede reemplazar algunos o todas las secuencias de ratón, por ejemplo, exones y/o intrones, al locus M-CSF. En algunos de dichos casos, la secuencia de ácido nucleico M-CSF humano está integrada en el locus M-CSF de ratón de manera que la expresión de la secuencia del M-CSF humano está regulada por las secuencias reguladoras nativas o endógenas en el locus M-CSF de ratón. En otras palabras, la(s) secuencia(s) reguladora(s) a la que la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano está unida operativamente son las secuencias reguladoras del M-CSF nativas en el locus M-CSF de ratón.
En algunos casos, la integración de la secuencia del M-CSF humano no afecta la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia del M-CSF humano. Por ejemplo, si la secuencia del M-CSF humano se integra en la secuencia codificante como una inteína, o la secuencia del M-CSF humano comprende un péptido 2A, la secuencia del M-CSF humano se transcribirá y traducirá simultáneamente con el gen en el que se ha integrado la secuencia del M-CSF humano. En otros casos, la integración de la secuencia del M-CSF humano interrumpe la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia del M-CSF humano. Por ejemplo, tras la integración de la secuencia del M-CSF humano mediante recombinación homóloga, se puede eliminar parte o la totalidad de la secuencia codificante en el locus de integración, de modo que la secuencia del M-CSF humano se transcribe en su locus. En algunos de dichos casos, la integración de la secuencia del M-CSF humano crea una mutación nula, y, por lo tanto, un alelo nulo. Un alelo nulo es una copia mutante de un gen que carece por completo de la función normal de ese gen. Esto puede ser el resultado de la ausencia completa del producto génico (proteína, ARN) a nivel molecular, o la expresión de un producto génico no funcional. En el nivel fenotípico, un alelo nulo es indistinguible de una deleción del locus completo.
En algunos casos, el ratón humanizado con M-CSF comprende una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano. Por ejemplo, el ratón puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico. En otras palabras, un alelo en un locus comprenderá la secuencia de ácido nucleico, mientras que el otro será el alelo endógeno. Por ejemplo, tal como se ha tratado anteriormente, en algunos casos, la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano está integrada en el locus M-CSF de ratón de manera que crea un alelo nulo para el M-CSF de ratón. En algunos de dichos ejemplos, el ratón humanizado con M-CSF puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico que codifica,es decir,el ratón humanizado con M-CSF comprende un alelo nulo para el M-CSF de ratón (el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico) y un alelo del M-CSF endógeno (tipo silvestre o de otro modo). En otras palabras, el ratón es un ratón M-CSFh/m, donde "h" representa el alelo que comprende la secuencia humana y "m" representa el alelo endógeno. En otros casos, el humanizado con M-CSF comprende dos copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano. Por ejemplo, el ratón puede ser homocigoto para la secuencia de ácido nucleico,es decir,ambos alelos para un locus en el genoma diploide comprenderán la secuencia de ácido nucleico,es decir,el ratón humanizado con M-CSF comprende dos alelos nulos para el M-CSF de ratón (el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico). En otras palabras, el ratón es un ratónM-CSFh/h.
Sorprendentemente, ratones humanizados con M-CSF,por ejemplo,tal como los descritos anteriormente,por ejemplo,ratonesM-CSFh/hy M-CSFh/m, exhiben desarrollo y funciones normales o de tipo silvestre de los macrófagos y monocitos y tejidos que se desarrollan a partir de células del linaje de los macrófagos,por ejemplo,hueso. Por ejemplo, los ratones humanizados exhiben propiedades dentales y óseas normales, así como un contenido de médula ósea, frecuencias de células mieloides en la médula ósea, bazo y sangre periférica y frecuencias de macrófagos en la médula ósea y el bazo normales.
En algunos casos, el ratón con M-CSF humanizado comprende otras modificaciones genéticas. Por ejemplo, el ratón con M-CSF humanizado puede comprender al menos un alelo nulo para el genRag2("gen de activación de la recombinación 2", la secuencia codificante del cual puede encontrarse en el N.° de Registro de Genbank 1.NM_009020.3). En algunos ejemplos, el ratón con M-CSf humanizado comprende dos alelos nulos paraRag2.En otras palabras, el ratón con M-CSF humanizado es homocigoto nulo paraRag2.Como otro ejemplo, el ratón con M-CSF humanizado comprende al menos un alelo nulo para el genIL2rg(“receptor de interleucina 2, gamma”, también conocido como la cadena gamma común, o yC, la secuencia codificante del cual puede encontrarse en el N.° de Registro de Genbank 1.NM_013563.3). En algunos ejemplos, el ratón con M-CSF humanizado comprende dos alelos nulos paraIL2rg.En otras palabras, el ratón con M-CSF humanizado es homocigoto nulo paraIL2rg.En algunos ejemplos, el ratón comprende un alelo nulo para ambos deRag2eIL2rg,es decir, esRag2-/-IL2RG-/-.También se contemplan otras modificaciones genéticas. Por ejemplo, el ratón humanizado con M-CSF puede comprender modificaciones en otros genes asociados al desarrollo y/o función de las células hematopoyéticas y el sistema inmune,por ejemplo,el reemplazo de uno u otros genes de ratón con una secuencia de ácido nucleico que codifica el ortólogo humano. Además, o como alternativa, el ratón humanizado con M-CSF puede comprender modificaciones en genes asociados al desarrollo y/o función de otras células y tejidos,por ejemplo,genes asociados a trastornos o enfermedades humanas o genes que, cuando se modifican en ratones, proporcionan modelos de ratón de trastornos o enfermedades humanas.
El ratón con M-CSF humanizado, por ejemplo, un ratónRag2liL2rg~l~ hM-CSFo un ratón con hM-CSF subletalmente irradiado, puede injertarse o trasplantarse con células. Las células pueden ser células mitóticas o células postmitóticas e incluyen dichas células de interés como células madre pluripotentes, por ejemplo, células ME, células jPS y células germinales embrionarias; y células somáticas, por ejemplo, fibroblastos, células hematopoyéticas, neuronas, células musculares, células óseas, células endoteliales vasculares, células intestinales y similares, y sus progenitores y precursores restringidos al linaje. Las poblaciones de células de interés particular incluyen aquellas que comprenden células hematopoyéticas progenitoras, que contribuirán o reconstituirán el sistema hematopoyético del ratón humanizado con M-CS<f>, por ejemplo, leucocitos de sangre periférica, células hepáticas fetales, hueso fetal, timo fetal, ganglios linfáticos fetales, piel vascularizada, segmentos arteriales y células madre hematopoyéticas purificadas, por ejemplo, HSC movilizadas o HSC de sangre del cordón. Las células pueden ser de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, murino, roedor, canino, felino, equino, bovino, ovino, primate, ser humano, etc. Las células pueden ser de líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a células y cultivos celulares que han derivado de un sujeto y permitido el crecimientoin vitrodurante un número limitado de pasajes,es decir,divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber sido pasados 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no suficientes veces pasan por la etapa de crisis. Por lo general, las líneas celulares primarias se mantienen durante menos de 10 pasesin vitro.
Si las células son células primarias, pueden cosecharse de un individuo por cualquier método conveniente. Por ejemplo, células,por ejemplo,células de sangre,por ejemplo,leucocitos, pueden cosecharse mediante aféresis, leucocitaféresis, separación por gradiente de densidad,etc.Como otro ejemplo, células,por ejemplo,piel, músculo, médula ósea, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, tejido estomacal,etc.pueden cosecharse mediante biopsia. Puede utilizarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células cosechadas. Dicha solución generalmente será una solución de sal equilibrada,por ejemplo,solución salina normal, PBS, solución de sal equilibrada de Hank,etc.,convenientemente complementada con suero de ternera fetal u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato,etc.
En algunas realizaciones, una población heterogénea de células se trasplantará en el ratón humanizado. En otros casos, una población de células que se enriquece para un tipo particular de célula, por ejemplo, una célula progenitora, por ejemplo, una célula progenitora hematopoyética, se injertará en el ratón humanizado. El enriquecimiento de una población de células de interés puede ser mediante cualquier técnica de separación conveniente. Por ejemplo, las células de interés pueden enriquecerse mediante métodos de cultivo. En dichos métodos de cultivo, normalmente, se añaden factores de crecimiento y nutrientes particulares a un cultivo que promueven la supervivencia y/o proliferación de una población de células sobre otras. Otras condiciones de cultivo que afectan la supervivencia y/o proliferación incluyen crecimiento en sustratos adherentes o no adherentes, cultivo durante periodos de tiempo particulares, etc. Tales condiciones de cultivo son bien conocidas en la técnica. Como otro ejemplo, las células de interés pueden enriquecerse mediante separación de las células de interés de la población inicial mediante técnicas de separación por afinidad. Las técnicas para la separación por afinidad pueden incluir separación magnética que utiliza perlas magnéticas recubiertas con un reactivo de afinidad, cromatografía de afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida,por ejemplo,una placa, agentes citotóxicos unidos a un reactivo de afinidad o utilizado junto con un reactivo de afinidad,por ejemplo,complemento o citotoxinas u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de sofisticación, como canales de color múltiples, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, canales de independencia,etc.Las células pueden seleccionarse contra células muertas mediante el empleo de colorantes asociados a células muertas(por ejemplo,yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células de interés.
Por ejemplo, utilizando técnicas de separación por afinidad, las células que no son las células de interés para el trasplante pueden agotarse de la población al poner en contacto la población con reactivos de afinidad que reconocen específicamente y unen selectivamente marcadores que no se expresan en las células de interés. Por ejemplo, para enriquecer a una población de células progenitoras hematopoyéticas, se podrían agotar las células que expresan marcadores de células hematopoyéticas maduras. Además, o como alternativa, la selección positiva y la separación se pueden realizar mediante el contacto de la población con reactivos de afinidad que reconocen específicamente y unen selectivamente marcadores asociados a células progenitoras hematopoyéticas,por ejemplo,CD34, CD133,etc.Por "unión selectiva" se entiende que la molécula se une preferentemente a la diana de interés o se une con mayor afinidad a la diana que a otras moléculas. Por ejemplo, un anticuerpo se unirá a una molécula que comprende un epítopo para el que es específico y no a epítopos no relacionados. En algunos ejemplos, el reactivo de afinidad puede ser un anticuerpo,es decir,un anticuerpo que es específico para CD34, CD133, etc. En algunos ejemplos, el reactivo de afinidad puede ser un receptor o ligando específico para CD34, CD133,etc.,por ejemplo, un ligando y receptor peptídico; moléculas efectoras y receptoras, un receptor de linfocitos T específico para CD34, CD133,etc.,y similares. En algunos ejemplos, pueden utilizarse reactivos de afinidad múltiple específicos para el marcador de interés.
Los anticuerpos y los receptores de linfocitos T que se utilizan como reactivos de afinidad pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden ser producidos por animales transgénicos, animales inmunizados, linfocitos B humanos o de animal inmortalizados, células transfectadas con vectores de ADN que codifica el anticuerpo o el receptor de linfocitos T,etc.Los detalles de la preparación de anticuerpos y su idoneidad para su uso como miembros de unión específica son bien conocidos por los expertos en la técnica. De particular interés es la utilización de anticuerpos marcados como reactivos de afinidad. De manera conveniente, estos anticuerpos están conjugados con una etiqueta para utilizar en la separación. Las etiquetas incluyen perlas magnéticas, que permiten la separación directa; biotina, que se puede eliminar con avidina o estreptavidina unida a un soporte; fluorocromos, que pueden utilizarse con un clasificador celular activado por fluorescencia; o similares, para permitir la facilidad de separación del tipo de célula particular. Los fluorocromos que encuentran utilidad incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína y rojo Texas. Con frecuencia, cada anticuerpo se marca con un fluorocromo diferente, para permitir la clasificación independiente para cada marcador.
La población inicial de células se pone en contacto con el (los) reactivo(s) de afinidad y se incuba durante un período de tiempo suficiente para unir los antígenos de superficie celular disponibles. La incubación generalmente será de al menos aproximadamente 5 minutos y generalmente de menos de aproximadamente 60 minutos. Es deseable tener una concentración suficiente de anticuerpos en la mezcla de reacción, de modo que la eficacia de la separación no está limitada por la falta de anticuerpos. La concentración apropiada se determina mediante titulación, pero normalmente será una dilución de anticuerpo en el volumen de la suspensión celular que es aproximadamente 1:50 (es decir, 1 parte de anticuerpo frente a 50 partes de volumen de reacción), aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:150, aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:250, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:1000, aproximadamente 1:2000, o aproximadamente 1:5000. El medio en el que se suspenderán las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las células. Un medio preferido es solución salina tamponada con fosfato que contiene de 0,1 a 0,5 % de BSA o 1-4 % de suero de cabra. Varios medios están disponibles comercialmente y pueden utilizarse de acuerdo con la naturaleza de las células, incluyendo medio Eagle modificado por Dulbecco (dMEM), solución salina equilibrada de Hank (HBSS), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove, PBS con EDTA 5 mM,etc.,frecuentemente complementado con suero de ternera fetal, BSA, HSA, suero de cabra,etc.
Las células en la población contactada que se etiquetan por el reactivo de afinidad se seleccionan mediante cualquier técnica de separación por afinidad conveniente,por ejemplo, como se describe anteriormente o como se conoce en la técnica. Después de la separación, las células separadas pueden recogerse en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad de las células, que generalmente tienen un cojín de suero en el fondo del tubo de recogida. Varios medios están disponibles comercialmente y pueden utilizarse de acuerdo con la naturaleza de las células, que incluyen dMEM, HBSs , dPBS, RPMI, medio de Iscove,etc.,frecuentemente complementado con suero de ternera fetal.
Se logran de esta manera composiciones altamente enriquecidas para un tipo celular de interés, por ejemplo, células hematopoyéticas. Las células serán aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 % o más de la composición celular, aproximadamente 95 % o más de la composición celular enriquecida y, preferentemente, serán aproximadamente 95 % o más de la composición celular enriquecida. En otras palabras, la composición será una composición sustancialmente pura de las células de interés.
Las células a trasplantar en un ratón humanizado con M-CSF, sea una población heterogénea de células o una población enriquecida de células, pueden trasplantarse inmediatamente. Como alternativa, las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, descongelarse y reutilizarse. En tales casos, las células usualmente se congelarán en DMSO al 10 %, suero al 50 %, medio tamponado al 40 % o alguna otra solución similar como se utiliza comúnmente en la técnica para preservar las células a tales temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera comúnmente conocida en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas. Además, o como alternativa, las células pueden cultivarsein vitroen diversas condiciones de cultivo. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido,por ejemplo, que contenga agar, metilcelulosa,etc.La población celular puede suspenderse convenientemente en un medio nutriente apropiado, tal como DMEM o RPMI-1640 modificado de Iscove, normalmente complementado con suero de ternera fetal (aproximadamente al 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol y antibióticos,por ejemplo,penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células son sensibles. Los factores de crecimiento, como se definen en el presente documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, crecimiento y/o diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptídicos y no polipeptídicos.
Las células pueden modificarse genéticamente antes de trasplantarse a un ratón humanizado con M-CSF,por ejemplo,para proporcionar un marcador seleccionable o trazable, para inducir un defecto genético en las células(por ejemplo,para el modelado de enfermedades), para reparar un defecto genético o expresar ectópicamente un gen en las células(porejemplo,para determinar si dichas modificaciones afectarán el curso de la enfermedad),etc.Las células pueden modificarse genéticamente mediante transfección o traducción con un vector adecuado, recombinación homóloga u otra técnica apropiada, para que expresen un gen de interés, o con un ARNm antisentido, ARNip o ribozimas para bloquear la expresión de un gen no deseado. Se conocen diversas técnicas en la técnica para la introducción de ácidos nucleicos en células diana. Para demostrar que se ha modificado genéticamente las células, se pueden emplear diversas técnicas. El genoma de las células puede restringirse y utilizarse con o sin amplificación. Puede emplearse la reacción en cadena de la polimerasa; electroforesis en gel; análisis de restricción; transferencias de Southern, Northern y Western; secuenciación; o similares. Los métodos generales en bioquímica molecular y celular para estos y otros propósitos divulgados en esta aplicación se pueden encontrar en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrooket al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubelet al.eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollaget al.,John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagneret al.eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta divulgación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.
Las células pueden trasplantarse en el ratón humanizado con M-CSF por cualquier método conveniente, incluyendo, por ejemplo, inyección intrahepática, inyección de vena caudal, inyección retroorbital y similares. Por lo general, se trasplantan aproximadamente 0,5x105-2x106 células pluripotentes o progenitoras, por ejemplo, aproximadamente 1x105-1x106 células, o aproximadamente 2x105-5x105 células. En algunos casos, el ratón se irradia subletalmente antes de trasplantar las células humanas. En otras palabras, el ratón se expone a una dosis subletal de radiación, por ejemplo, como se describe en la sección de ejemplos a continuación y como es bien conocido en la técnica. El ratón humanizado con M-CSF injertado se mantiene en condiciones de laboratorio de cría de animales durante al menos 1 semana,por ejemplo, 1 semana o más o dos semanas o más, a veces 4 semanas o más y en algunos casos 6 semanas o más, para permitir una reconstitución suficiente del sistema inmune con las células injertadas.
Como se demuestra en la sección de ejemplos siguientes, los ratones humanizados con M-CSF demuestran una capacidad significativamente aumentada para injertar y mantener células hematopoyéticas humanas en comparación con otras cepas de ratón que se han desarrollado para este fin y otros ratones transgénicos con M-CSF. Por ejemplo, la transferencia intrahepática de células madre y progenitoras hematopoyéticas derivadas del hígado fetal humano (CD34+) a ratones recién nacidos da como resultado una diferenciación más eficaz y frecuencias mejoradas de monocitos/macrófagos humanos en la médula ósea, bazo, sangre periférica, pulmones, hígado y la cavidad peritoneal. Se observan proporciones significativas de células humanas CD14+CD33+ a las 16-20 semanas. Específicamente, los ratones humanizados con M-CSF injertados con células hematopoyéticas demuestran una o más, en algunos casos, dos o más, en algunos casos, tres o más, en algunos casos cuatro o más, en algunos casos todas las características siguientes: expresan el M-CSF humano en la médula ósea, bazo, sangre, hígado, cerebro, pulmón, testículos y riñones a un nivel comparable a la expresión del M-CSF de ratón en un ratón de tipo silvestre; exhiben una frecuencia de células hCD14+CD33+ del bazo que es de 2 a 6 veces mayor que hCD14+CD33+ en un ratón injertado que no expresa hM-CSF; exhiben una frecuencia en células hCD14+CD33+ de la sangre periférica que es de 2 a 8 veces mayor que hCD14+CD33+ en un ratón injertado que no expresa hM-CSF; exhiben un nivel de células del linaje monocito/macrófago hCD14+CD33+ en sangre de aproximadamente 15 a aproximadamente el 40 %; exhiben un nivel de células de linaje monocito/macrófago hCD14+CD33+ en sangre de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 semanas de edad; exhiben una respuesta a la inyección de LPS que es aproximadamente 1,5 a aproximadamente 6 veces mayor con respecto al porcentaje de células hCD14+CD33+ en el hígado que los ratones que carecen del M-CSF humano; exhiben una producción mejorada de células hCD14+CD33+hCD45+ en el bazo aproximadamente 48 horas después de la inyección de LPS, en donde la mejora es aproximadamente de 2 a aproximadamente 5 veces frente a un ratón injertado que carece del hM-CSF; exhiben una producción mejorada de IL-6 humana en suero en respuesta a LPS, en donde el nivel de hIL-6 aproximadamente 6 horas después de la inyección de LPS mejora aproximadamente de 2 a aproximadamente 5 veces en un ratón injertado que carece de hM-CSF; exhiben secreciónin vitropor un monocito y/o un macrófago tras la estimulación con LPS que es aproximadamente de 2 a 3 veces mayor con respecto al hTNFa que un ratón injertado que carece de un gen del hM-CSF; exhiben secreciónin vitropor un monocito y/o un macrófago tras la estimulación con LPS que es aproximadamente de 2 a 4 veces mayor con respecto al hIL-6 que un ratón injertado que carece de un gen del hM-CSF; exhiben secreciónin vitropor un monocito y/o un macrófago tras la estimulación con I:C que es aproximadamente de 3 a 6 veces mayor con respecto al hINFa que un ratón injertado que carece de un gen del hM-CSF; exhiben secreciónin vitropor un monocito y/o un macrófago tras la estimulación con I:C que es aproximadamente de 2 a 3 veces mayor con respecto al hINFp que un ratón injertado que carece de un gen del hM-CSF; exhiben una fagocitosis mejorada en comparación con un ratón genéticamente modificado e injertado que carece de un gen del hM-CSF; exhiben una quimiotaxisin vitromejorada en respuesta a Mip3p en comparación con un ratón genéticamente modificado e injertado que carece de un gen del hM-CSF; y; exhiben regulación positivain vitrode una molécula coestimuladora en respuesta a la estimulación con LPS, en donde la molécula coestimuladora se selecciona de CD40 humano, CD80 humano, CD86 humano, HLA-DR humano y una combinación de las mismas.
UTILIDAD
Los ratones humanizados con M-CSF y los ratones humanizados con M-CSF injertados con células hematopoyéticas humanas,por ejemplo,ratonesRag2~liL2rg~l~ hM-CSFinjertados y, opcionalmente, otras modificaciones genéticas son útiles en muchas aplicaciones. Por ejemplo, estos ratones proporcionan un sistema útil para modelar enfermedades inmunes humanas y patógenos humanos. Por ejemplo, los ratones diana son útiles para modelar una malignidad hematopoyética humana que se origina a partir de una célula hematopoyética humana temprana,por ejemplo,de una célula progenitora o madre hematopoyética humana. Como otro ejemplo, los ratones sujetos son útiles para estudiar patógenos humanos,por ejemplo, virus, hongos y bacterias, que normalmente no infectan ratones.
Un ejemplo de un patógeno humano que normalmente no infecta a los ratones es el agente causante de la fiebre tifoidea, S.typhi.La fiebre tifoidea afecta a más de 21 millones de personas en todo el mundo, principalmente en el mundo en desarrollo, incluyendo alrededor de 400 casos/año en los Estados Unidos. La fiebre tifoidea se ha tratado con los fármacos amoxicilina, ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cloranfenicol, ciprofloxacino, cotrimoxazol, ertapenem, imipenem, fluoroquinolonas(por ejemplo,ciprofloxacina, gatifloxacina, ofloxacina), estreptomicina, sulfadiazina, sulfametoxazol, tetraciclina y combinaciones de los mismos. Las infecciones recurrentes son comunes, lo que limita el manejo de la enfermedad mediante la terapia con antibióticos. Además, la resistencia a múltiples fármacos también prevalece con las infecciones por S.typhi.
Se necesitan nuevas terapias, nuevas vacunas y nuevas formas de probar la eficacia de terapias y vacunas. Un ratón capaz de ser infectado por S.typhi,por ejemplo, sería útil para identificar nuevas terapias y nuevas vacunas. Las nuevas terapias y nuevas vacunas podrían probarse en un ratón de este tipo,por ejemplo,determinando la cantidad de S.typhien el ratón (en sangre o en un tejido dado) en respuesta al tratamiento con un supuesto agente anti-S.typhi,o inoculando el ratón con una supuesta vacuna seguida por la exposición a una administración infecciosa de S.typhi, y observando cualquier cambio en la infectividad debido a la inoculación por la supuesta vacuna en comparación con un control no inoculado con la vacuna pero infectado con S.typhi.
Un ratón humanizado con M-CSF injertado con células hematopoyéticas humanas,por ejemplo,un ratónRagZ1' IL2rg¡/- hM-CSF,es útil para el estudio de patógenos humanos,es decir,patógenos que infectan seres humanos; la respuesta del sistema inmune humano a la infección por patógenos humanos; y la eficacia de los agentes para proteger y/o tratar la infección por patógenos humanos. El patógeno puede ser un virus, un hongo, una bacteria,etc.Los ejemplos no limitantes de patógenos virales incluyen el virus de la gripe humana o porcina o aviar. Los ejemplos no limitantes de patógenos bacterianos incluyen micobacterias, por ejemplo,Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)y enterobacterias, por ejemplo,Salmonella typhi (S. typhi).
Por ejemplo, ratones humanizados con M-CSF injertados son útiles como modelo animal no humano de infección por S.typhi.Por el contrario, ratones de tipo silvestre y otros ratones inmunodeprimidos conocidos(por ejemplo,ratones knock-out para el gen RAG1/RAG2), no son capaces de ser infectados por S.typhi.Como se analiza anteriormente, los ratones humanizados con M-CSF injertados como se describe en el presente documento muestran un injerto mejorado de células humanas en comparación con ratones injertados que no comprenden una proteína del M-CSF humano. Esta mejora es suficiente para mantener una infección productiva de S.typhi,es decir, S.typhies capaz de reproducirse en el ratón, es decir, el ratón infectado es capaz de albergar y reproducir S.typhien una o más de sus células. En un ejemplo específico, el ratón es capaz de reproducir S.typhial menos una semana, 10 días, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después de una introducción inicial o exposición infecciosa de S.typhi. En otras palabras, el ratón es capaz de mantener un título o nivel de S.typhien su sangre o en al menos un tejido durante al menos una semana, 10 días, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después de una exposición infecciosa a S.typhi.Se pueden encontrar ejemplos de métodos para infectar ratones con S.typhiy para evaluar la infección en, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2011/0200982.
Como otro ejemplo, ratones humanizados con M-CSF,por ejemplo,ratonesRag2~liL2rg~l~ hM-CSFinjertados, son útiles como modelo animal no humano de infección porM. tuberculosis.El injerto mejorado de células hematopoyéticas humanas en ratones que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína del M-CSF humano es suficiente para mantener una infección productiva deM. tuberculosis, es decir,M. tuberculosises capaz de reproducirse en el ratón,es decir, el ratón infectado es capaz de albergar y reproducirM. tuberculosisen una o más de sus células. En algunos de dichos ejemplos, el ratón produce una respuesta inmune antimicobacteriana a una micobacteria patógena humana, en donde la respuesta comprende la formación de un granuloma mediado por células inmunes humanas y que comprende una célula inmune humana. En algunos de dichos ejemplos, el granuloma es un granuloma de pulmón. En algunos de dichos ejemplos, el granuloma es un granuloma bien definido. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para infectar ratones conM. tuberculosisy para evaluar la infección en, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2011/0200982.
Otros ejemplos de patógenos humanos que no infectan a un ratón que expresa el M-CSF humano y, en algunos casos, una o más modificaciones genéticas,por ejemplo,como se describe en el presente documento o que infectan ratones de tipo silvestre, en el que el ratón de tipo silvestre después de la infección no modela una respuesta inmune que un ser humano produce en respuesta al patógeno, será bien conocido por el experto en la materia.
Dichos modelos de ratón de infección por patógenos son útiles en la investigación,por ejemplo,para comprender mejor la progresión de la infección humana. Dichos modelos de infección de ratón también son útiles en el descubrimiento de fármacos,por ejemplo,para identificar agentes candidatos que protegen o tratan la infección.
Los ratones humanizados con M-CSF injertados con células hematopoyéticas humanas proporcionan un sistema útil para cribar agentes candidatos para otras actividades deseadasin vivo,así como,por ejemplo,para agentes que son capaces de modular(es decir,promover o suprimir) el desarrollo y/o actividad de células hematopoyéticas,por ejemplo,la actividad de linfocitos B, linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos,etc., por ejemplo,en un estado saludable o enfermo,por ejemplo,para identificar nuevas terapias y/o desarrollar una mejor comprensión de las bases moleculares del desarrollo y la función del sistema inmune; para agentes que son tóxicos para las células hematopoyéticas,por ejemplo,linfocitos B, linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos,etc.,y progenitores de las mismas; y para agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de agentes tóxicos en células hematopoyéticas,por ejemplo,linfocitos B, linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos,etc.,y combinaciones de las mismas;etc.Como otro ejemplo adicional, los ratones genéticamente modificados descritos en el presente documento proporcionan un sistema útil para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a una terapia de enfermedad,por ejemplo, proporcionando una plataformain vivopara cribar la capacidad de respuesta del sistema inmune de un individuo a un agente,por ejemplo, un agente terapéutico, para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a ese agente.
En ensayos de cribado para agentes biológicamente activos, ratones humanizados con M-CSF,por ejemplo,ratonesRag2'l'IL2rg'1' hM-CSF,que se han injertado con células hematopoyéticas humanas y, en algunos casos, infectadas con patógenos humanos, o células que se injertan en un ratón humanizado con M-CSF, se ponen en contacto con un agente candidato de interés y se evalúa el efecto del agente candidato mediante el control de uno o más parámetros de salida. Estos parámetros de salida pueden reflejar la viabilidad de las células,por ejemplo,el número total de células hematopoyéticas o el número de células de un tipo de células hematopoyéticas particular, o del estado apoptótico de las células,por ejemplo,la cantidad de fragmentación del ADN, la cantidad de zeiosis celular, la cantidad de fosfatidilserina en la superficie de la célula y similares mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Como alternativa o, además, estos parámetros de salida pueden reflejar la capacidad de diferenciación de las células,por ejemplo,las proporciones de células diferenciadas y tipos de células diferenciadas. Como alternativa o, además, estos parámetros de salida pueden reflejar la función de las células,por ejemplo,las citoquinas y quimioquinas producidas por las células, la capacidad de las células para llegar a casa y extravasarse a un sitio de desafío, la capacidad de las células para modular,es decir,promover o suprimir, la actividad de otras célulasin vitrooin vivo, etc.Otros parámetros de salida pueden reflejar la extensión de la infección de patógenos en el animal,por ejemplo,el título de patógeno en el ratón, la presencia de granulomas en el ratón,etc.
Los parámetros son componentes cuantificables de las células, particularmente componentes que se pueden medir con precisión, deseablemente en un sistema de alto rendimiento. Un parámetro puede ser cualquier componente celular o producto celular, incluido el determinante de la superficie celular, receptor, proteína o modificación conformacional o postraduccional de los mismos, lípido, hidrato de carbono, molécula orgánica o inorgánica, ácido nucleico,por ejemplo,ARNm, ADN,etc.o una porción que procede de dicho componente celular o combinaciones de los mismos. Si bien la mayoría de los parámetros proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos será aceptable un resultado semicuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir un solo valor determinado, o pueden incluir la media, el valor de la media o la varianza,etc.Característicamente, se obtendrá un intervalo de valores de lectura de parámetros para cada parámetro a partir de una multiplicidad de los mismos ensayos. Se espera una variabilidad y se obtendrá un intervalo de valores para cada uno de los conjuntos de parámetros de prueba utilizando métodos estadísticos estándar con un método estadístico común utilizado para proporcionar valores únicos.
Los agentes candidatos de interés para el cribado incluyen compuestos conocidos y desconocidos que abarcan numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, que pueden incluir moléculas organometálicas, moléculas inorgánicas, secuencias genéticas, vacunas, antibióticos u otros agentes sospechosos de tener propiedades antibióticas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, agentes que han sido aprobados como productos farmacéuticos para su uso en seres humanos,etc.
Los agentes candidatos incluyen moléculas orgánicas que comprenden grupos funcionales necesarios para las interacciones estructurales, particularmente enlaces de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente, al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos, a menudo, comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, incluyendo péptidos, polinucleótidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Se incluyen fármacos farmacológicamente activos, moléculas genéticamente activas,etc.Los compuestos de interés incluyen agentes quimioterapéuticos, hormonas o antagonistas de hormonas,etc.Los ejemplos de agentes farmacéuticos son los descritos en, "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y., (1996), novena edición. También se incluyen toxinas y agentes de guerra biológicos y químicos, por ejemplo, véase Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, Nueva York, 1992).
Los agentes candidatos de interés para el cribado también incluyen ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican ARNip, ARNhc, moléculas antisentido o ARNmi o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos. Se encuentran disponibles muchos vectores útiles para transferir ácidos nucleicos a células diana. Los vectores pueden mantenerse episomalmente,por ejemplo,como plásmidos, ADN de minicírculos, vectores derivados de virus tales como citomegalovirus, adenovirus,etc.o pueden estar integrados en el genoma de la célula diana, a través de recombinación homóloga o integración aleatoria,por ejemplo,vectores derivados de retrovirus tales como MMLV, HIV-1, ALV,etc.Los vectores se pueden proporcionar directamente a las células sujeto. En otras palabras, las células pluripotentes se ponen en contacto con vectores que comprenden el ácido nucleico de interés de manera que los vectores son captados por las células.
Los métodos para poner en contacto las células,por ejemplo,células en cultivo o células en un ratón, con vectores de ácidos nucleicos, tales como electroporación, transfección con cloruro de calcio y lipofección, son bien conocidos en la técnica. Como alternativa, el ácido nucleico de interés puede proporcionarse a las células a través de un virus. En otras palabras, las células se ponen en contacto con partículas virales que comprenden el ácido nucleico de interés. Los retrovirus, por ejemplo, lentivirus, son particularmente adecuados. Los vectores retrovirales utilizados comúnmente son "defectuosos",es decir,incapaces de producir proteínas virales requeridas para una infección productiva. Más bien, la replicación del vector requiere crecimiento en una línea celular de empaquetamiento. Para generar partículas víricas que comprenden ácidos nucleicos de interés, los ácidos nucleicos retrovirales que comprenden el ácido nucleico se empaquetan en cápsides virales mediante una línea celular de empaquetamiento. Las diferentes líneas celulares de empaquetamiento proporcionan una proteína de envoltura diferente para ser incorporada en la cápside, esta proteína de envoltura determina la especificidad de la partícula viral para las células. Las proteínas de envoltura son de al menos tres tipos, ecotrópicas, anfotrópicas y xenotrópicas. Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura ecotrópica,por ejemplo,MMLV, son capaces de infectar la mayoría de los tipos de células murinas y de rata, y se generan mediante la utilización de líneas celulares de empaquetamiento ecotrópico como BOSC23 (Pearet al.(1993) P.N.A.S. 90:8392-8396). Los retrovirus que llevan proteína de envoltura anfotrópica,por ejemplo,4070A (Danoset al, citado anteriormente),son capaces de infectar la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, incluyendo seres humanos, perros, y ratones, y se generan mediante la utilización de líneas celulares de empaquetamiento anfotrópico tales como PA12 (Milleret al.(1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Milleret al.(1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); GRIP (Danoset al.(1988) PNAS 85:6460-6464). Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura xenotrópica,por ejemplo,AKR env, son capaces de infectar la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, excepto las células murinas. La línea celular de empaquetamiento apropiada puede utilizarse para asegurar que las células de interés, en algún caso, las células injertadas, en algún caso, la célula del hospedador,es decir,las humanizadas con M-CSF son la diana de las partículas virales empaquetadas.
Los vectores utilizados para proporcionar el ácido nucleico de interés para las células sujeto comprenderán normalmente promotores adecuados para dirigir la expresión, es decir, la activación transcripcional, del ácido nucleico de interés. Esto puede incluir promotores de actuación ubicua, por ejemplo, el promotor CMV-b-actina, o promotores inducibles, tales como promotores que son activos en poblaciones celulares particulares o que responden a la presencia de fármacos tales como tetraciclina. Por activación transcripcional, se pretende que la transcripción se incremente por encima de los niveles basales en la célula diana en al menos aproximadamente 10 veces, en al menos aproximadamente 100 veces, más generalmente en al menos aproximadamente 1000 veces. Además, los vectores utilizados para proporcionar factores de reprogramación a las células sujeto pueden incluir genes que luego deben eliminarse,por ejemplo,utilizando un sistema recombinasa tal como Cre/Lox, o las células que los expresan destruidos,por ejemplo,incluyendo genes que permiten toxicidad selectiva como TK herpesvirus, bcl-xs, etc.
Los agentes candidatos de interés para el cribado también incluyen polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden fusionarse opcionalmente a un dominio polipeptídico que aumenta la solubilidad del producto. El dominio puede unirse al polipéptido a través de un sitio de escisión de proteasa definido,por ejemplo,una secuencia TEV, que se escinde mediante la proteasa TEV. El enlazador también puede incluir una o más secuencias flexibles,por ejemplo,de 1 a 10 restos de glicina. En algunos ejemplos, la escisión de la proteína de fusión se realiza en un tampón que mantiene la solubilidad del producto,por ejemplo,en presencia de 0,5 a 2 M de urea, en presencia de polipéptidos y/o polinucleótidos que aumentan la solubilidad, y similares. Los dominios de interés incluyen dominios endosomolíticos,por ejemplo,el dominio HA de la gripe; y otros polipéptidos que ayudan en la producción,por ejemplo,el dominio IF2, dominio GST, dominio GRPE y similares. Además, o como alternativa, dichos polipéptidos pueden formularse para una estabilidad mejorada. Por ejemplo, los péptidos pueden ser PEGilados, donde el grupo polietilenoxi proporciona una vida útil mejorada en el torrente sanguíneo. El polipéptido puede fusionarse a otro polipéptido para proporcionar funcionalidad adicional,por ejemplo, paraaumentar la estabilidadin vivo.En general, dichas parejas de fusión son una proteína plasmática estable, que puede, por ejemplo, extender la semivida plasmáticain vivodel polipéptido cuando está presente como una fusión, en particular, en donde dicha proteína plasmática estable es un dominio constante de inmunoglobulina. En la mayoría de los casos en que la proteína plasmática estable se encuentra normalmente en una forma multimérica, por ejemplo, inmunoglobulinas o lipoproteínas, en el que las mismas o diferentes cadenas polipeptídicas están unidas normalmente por enlaces disulfuro y/o no covalentemente para formar un polipéptido multicadena ensamblado, en el presente documento, las fusiones que contienen el polipéptido también se producirán y emplearán como un multímero que tiene sustancialmente la misma estructura que el precursor de la proteína plasmática estable. Estos multímeros serán homogéneos con respecto al agente polipeptídico que comprenden, o pueden contener más de un agente polipeptídico.
El agente polipeptídico candidato puede producirse a partir de células eucariotas, o puede producirse mediante células procariotas. Puede procesarse adicionalmente desplegándose,por ejemplo,por desnaturalización térmica, reducción de DTT,etc.y puede volverse a plegar, utilizando métodos conocidos en la técnica. Las modificaciones de interés que no alteran la secuencia primaria incluyen derivatización química de polipéptidos,por ejemplo,acilación, acetilación, carboxilación, amidación,etc.También se incluyen modificaciones de glicosilación,por ejemplo,las realizadas mediante la modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales;por ejemplo,al exponer el polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, tales como enzimas glucosilantes o desglucosilantes de mamífero. También se incluyen secuencias que tienen restos de aminoácidos fosforilados,por ejemplo,fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Los polipéptidos pueden haberse modificado utilizando técnicas biológicas moleculares ordinarias y química sintética para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlas más adecuadas como agente terapéutico. Los análogos de tales polipéptidos incluyen aquellos que contienen restos distintos de los L-aminoácidos de origen natural,por ejemplo,D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos de origen no natural. Los D-aminoácidos pueden ser sustituidos por algunos o todos los restos de aminoácidos.
El agente polipeptídico candidato puede prepararse por síntesisin vitro, utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica. Hay disponibles varios aparatos de síntesis comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados por Applied Biosystems, Inc., Beckman,etc.Mediante la utilización de sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden sustituirse por aminoácidos no naturales. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida y similares. Como alternativa, el agente polipeptídico candidato puede aislarse y purificarse de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del hospedador de expresión y el lisado purificado utilizando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otras técnicas de purificación. En su mayoría, las composiciones que se utilizan comprenderán al menos el 20 % en peso del producto deseado, más normalmente al menos aproximadamente el 75 % en peso, preferentemente al menos aproximadamente el 95 % en peso y, para fines terapéuticos, normalmente al menos aproximadamente el 99,5 % en peso, en relación con los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.
En algunos casos, los agentes polipeptídicos candidatos a cribar son anticuerpos. El término "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contenga cadenas polipeptídicas con una forma específica que se ajuste y reconozca un epítopo, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. El ajuste específico o selectivo de una estructura dada y su epítopo específico a veces se denomina ajuste de "bloqueo y clave". La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD,etc.,de todas las fuentes,por ejemplo,ser humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollo, otras aves,etc.,se consideran "anticuerpos". Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se proporcionan normalmente en los medios en los que se cultivan las células.
Los agentes candidatos pueden obtenerse a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, numerosos medios están disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos, incluyendo biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Como alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles o se producen fácilmente. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos naturales o sintéticamente producidos se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden utilizarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación,etc.para producir análogos estructurales.
Los agentes candidatos se criban para la actividad biológica mediante la administración del agente a al menos una y, normalmente, una pluralidad de muestras, a veces junto con muestras que carecen del agente. Se mide el cambio en los parámetros en respuesta al agente y se evalúa el resultado en comparación con los cultivos de referencia,por ejemplo,en presencia y ausencia del agente, obtenido con otros agentes,etc.En los casos en los que se realiza un cribado para identificar los agentes candidatos que evitarán, mitigarán o revertirán los efectos de un agente tóxico, el cribado, generalmente, se realiza en presencia del agente tóxico, donde el agente tóxico se añade en el momento más apropiado para los resultados a determinar. Por ejemplo, en los casos en los que se prueba la capacidad protectora/preventiva del agente candidato, el agente candidato se puede añadir antes del agente tóxico, simultáneamente con el agente candidato, o después del tratamiento con el agente candidato. Como otro ejemplo, en los casos en que se prueba la capacidad del agente candidato para revertir los efectos de un agente tóxico, el agente candidato se puede añadir antes del tratamiento con el agente candidato. Como se ha mencionado anteriormente, en algunos casos, la muestra es el ratón humanizado con M-CSF que se ha injertado con células,es decir,el agente candidato se proporciona al ratón humanizado con M-CSF que se ha injertado con células. En algunos casos, la muestra son las células a injertar,es decir,el agente candidato se proporciona a las células antes del trasplante.
Si el agente candidato se va a administrar directamente al ratón, el agente se puede administrar mediante cualquiera de una serie de métodos bien conocidos en la técnica para la administración de péptidos, moléculas pequeñas y ácidos nucleicos a ratones. Por ejemplo, el agente puede administrarse por vía oral, por vía mucosa, por vía tópica, intradérmica, o por inyección,por ejemplo,intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa o inyección intracraneal y similares. El agente puede administrarse en un tampón, o puede incorporarse en cualquiera de varias formulaciones,por ejemplo,por combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado. "Vehículos farmacéuticamente aceptables" pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerados en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en mamíferos, tales como seres humanos. El término "vehículo " se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o transportador con el que un compuesto se formula para la administración a un mamífero. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos,por ejemplo,liposomas,por ejemplo,dendrímeros liposómicos; líquidos, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma de acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Se pueden formular las composiciones farmacéuticas en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. El agente puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse mediante la utilización de administración regional, administración intramural o la utilización de un implante que actúa para retener la dosis activa en el sitio de la implantación. El agente activo puede formularse para actividad inmediata o puede formularse para liberación sostenida. Para algunas afecciones, particularmente las afecciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular agentes para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Una estrategia para el suministro de fármacos a través de la barrera del cerebro (BHE) implica la interrupción de la BHE, ya sea por medios osmóticos como el manitol o los leucotrienos, o bioquímicamente mediante la utilización de sustancias vasoactivas como la bradicinina. Un agente disruptivo de la BHE puede coadministrarse con el agente cuando las composiciones se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para pasar por la BHE pueden implicar la utilización de sistemas de transporte endógenos, que incluyen transcitosis mediada por Caveolin-1, transportadores mediados por portadores como portadores de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptor para insulina o transferrina, y transportadores de eflujo activo tales como p-glicoproteína. Las fracciones de transporte activo también se pueden conjugar con los compuestos terapéuticos para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Como alternativa, la liberación de fármacos por detrás de la BHE puede realizarse mediante liberación local,por ejemplo,mediante liberación intratecal,por ejemplo,través de un depósito de Ommaya (véanse,por ejemplo,las patentes de los Estados Unidos números 5.222.982 y 5385582); mediante inyección en bolo,por ejemplo,mediante una jeringa,por ejemplo,intravítreal o intracranealmente; mediante infusión,por ejemplo,mediante canulación,por ejemplo,con convección (véase,por ejemplo,la Solicitud de Estados Unidos N.° 20070254842); o mediante implantación de un dispositivo sobre el cual el agente se ha fijado de manera reversible (véanse,por ejemplo,las solicitudes de los Estados Unidos Nos. 20080081064 y 20090196903).
Si el agente(s) candidato se proporciona a las células antes del trasplante, los agentes se añaden convenientemente en la solución o en forma fácilmente soluble, al medio de las células en cultivo. Los agentes se pueden añadir en un sistema de flujo continuo, como una corriente, intermitente o continua o, alternativamente, añadiendo un bolo del compuesto, de manera individual o incremental, a una solución de otra manera estática. En un sistema de flujo continuo, se utilizan dos fluidos, donde uno es una solución fisiológicamente neutral, y el otro es la misma solución con el compuesto de prueba añadido. El primer fluido pasa sobre las células, seguido por el segundo. En un único método de solución, se añade un bolo del compuesto de prueba al volumen del medio que rodea las células. Las concentraciones globales de los componentes del medio de cultivo no deberían cambiar significativamente con la adición del bolo, o entre las dos soluciones en un método de flujo continuo.
Se puede realizar una pluralidad de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Como se conoce en la técnica, la determinación de la concentración eficaz de un agente normalmente utiliza un intervalo de concentraciones resultantes de diluciones 1:10 u otras escalas logarítmicas. Las concentraciones pueden refinarse aún más con una segunda serie de diluciones, si es necesario. Por lo general, una de estas concentraciones sirve como un control negativo,es decir, a una concentración cero o por debajo del nivel de detección del agente o a o por debajo de la concentración del agente que no produce un cambio detectable en el fenotipo.
Puede realizarse un análisis de la respuesta de las células en el ratón humanizado con M-CSF al agente candidato en cualquier momento después del tratamiento con el agente. Por ejemplo, las células pueden analizarse 1, 2, o 3 días, a veces 4, 5 o 6 días, a veces 8, 9 o 10 días, a veces 14 días, a veces 21 días, a veces 28 días, a veces 1 mes o más después del contacto con el agente candidato, por ejemplo, 2 meses, 4 meses, 6 meses o más. En algunos ejemplos, el análisis comprende análisis en múltiples puntos de tiempo. La selección del punto(s) de tiempo para el análisis se basará en el tipo de análisis que se realizará, tal como entenderá fácilmente el experto en la técnica. El análisis puede comprender medir cualquiera de los parámetros descritos en el presente documento o conocidos en la técnica para medir la viabilidad celular, proliferación celular, identidad celular, morfología celular y función celular, particularmente porque pueden pertenecer a células de las células inmunitarias. Por ejemplo, la citometría de flujo puede utilizarse para determinar el número total de células hematopoyéticas o el número de células de un tipo de célula hematopoyética particular. Puede realizarse histoquímica o inmunohistoquímica para determinar el estado apoptótico de las células,por ejemplo,marcado del extremo libre por desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP (TUNEL, del inglés,"transferase dUTP nick end labeling") para medir la fragmentación del ADN o inmunohistoquímica para detectar anexina V que se une a la fosfatidilserina en la superficie celular. La citometría de flujo también puede emplearse para evaluar las proporciones de células diferenciadas y tipos de células diferenciadas,por ejemplo,para determinar la capacidad de las células hematopoyéticas para diferenciarse en presencia del agente. Se pueden realizar ELISA, transferencias de Western y Northern para determinar los niveles de citoquinas, quimiocinas, inmunoglobulinas,etc.expresadas en los ratones humanizados con M-CSF injertados,por ejemplo,para evaluar la función de las células injertadas. También pueden realizarse ensayosin vivopara probar la función de las células inmunitarias, así como ensayos relevantes para enfermedades particulares o trastornos de interés tales como diabetes, enfermedad autoinmune, enfermedad de injerto contra huésped, AMD, etc. Véase,por ejemplo,Current Protocols in Immunology (Richard Coico, ed. John Wiley & Sons, Inc. 2012) y Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997).
Por lo tanto, por ejemplo, se describe un método para determinar el efecto de un agente en un patógeno humano, que comprende la exposición de un ratón humanizado con M-CSF injertado,por ejemplo,un ratónRag2~liL2rg~l~ hM-CSFinjertado, a una cantidad eficaz de un patógeno humano, siendo la cantidad eficaz de un patógeno la cantidad de patógeno requerida para producir una infección en el ratón; que permite al patógeno infectar al ratón; que mide un parámetro de la infección a lo largo del tiempo en presencia del agente; y que compara esa medida con la medida de un ratón humanizado con M-CSF injertado no expuesto al agente. Se determina que el agente es antipatógeno,por ejemplo,anti-S.typhi,si el agente reduce la cantidad del agente en sangre o un tejido del ratón al menos la mitad después de una sola administración o dos o más administraciones del agente durante un período de tiempo seleccionado.
Como otro ejemplo, se describe un método para determinar si un aislado o cepa de patógeno de interés es resistente a fármacos, por ejemplo, resistente a múltiples fármacos. En estos métodos, un ratón con M-CSF humanizado injertado, por ejemplo, un ratónRag2-/-IL2rg-l- hM-CSFinjertado, se expone a una cantidad eficaz de un aislado o cepa de patógeno humano de interés, siendo la cantidad eficaz del patógeno la cantidad de patógeno requerida para producir una infección en el ratón; se permite al patógeno infectar al ratón; un parámetro de la infección, por ejemplo, el título del aislado o cepa de interés en la sangre o el tejido del ratón, la capacidad del aislado o cepa de interés de mantener una infección en el ratón o la capacidad del aislado o cepa de interés de reproducirse en el ratón en un punto en el tiempo después de la administración del fármaco se mide en presencia del fármaco; y esa medición se compara con la medición de un ratón con M-CSF humanizado injertado con infectado con patógeno no expuesto al agente. Algunos ejemplos de fármacos de interés incluyen amoxicilina, ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cloranfenicol, ciprofloxacina, co-trimoxazol, ertapenem, imipenem, fluoroquinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, gatifloxacina, ofloxacina), estreptomicina, sulfadiazina, sulfametoxazol, tetraciclina y una combinación de los mismos. En ejemplos específicos, la administración del fármaco o combinación de fármacos es al menos una semana, 10 días, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después de la exposición que produce infección al aislado o la cepa de interés.
Aplicaciones adicionales de los ratones genéticamente modificados e injertados descritos en esta divulgación serán evidentes para los expertos en la técnica tras leer esta divulgación.
REACTIVOS, DISPOSITIVOS Y KITS
También se describen reactivos, dispositivos y kits de los mismos para practicar uno o más de los métodos descritos anteriormente. Los reactivos, dispositivos y kits objeto de los mismos pueden variar enormemente.
En algunos ejemplos, los reactivos o kits comprenderán uno o más agentes para su uso en los métodos descritos. Por ejemplo, el kit puede comprender un ratón con M-CSF humanizado. El kit puede comprender reactivos para cruzar ratones con M-CSF humanizados, por ejemplo, cebadores y, en algunos casos, reactivos para genotipar ratones con M-CSF humanizados. El kit puede comprender células hematopoyéticas humanas o una población enriquecida de células progenitoras hematopoyéticas humanas para su trasplante en el ratón con M-CSF humanizado, o reactivos para preparar una población de células hematopoyéticas o una población enriquecida de células hematopoyéticas de un ser humano para su trasplante en un ratón M-CSF humanizado. Otros reactivos pueden incluir reactivos para determinar la viabilidad y/o la función de las células hematopoyéticas, por ejemplo, en presencia/ausencia de agente candidato, por ejemplo, uno o más anticuerpos que son específicos para marcadores expresados por diferentes tipos de células hematopoyéticas, o reactivos para detectar citocinas particulares, quimiocina, etc. Otros reactivos pueden incluir medios de cultivo, suplementos de cultivo, composiciones de matriz y similares.
Además de los componentes anteriores, los kits objeto incluirán además instrucciones para practicar los métodos objeto. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits objeto en una diversidad de formas, una o más de las cuales puede estar presente en el kit. Una forma en que estas instrucciones pueden presentarse es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, un trozo o trozos de papel sobre los cuales se imprime la información, en el envase del kit, en un inserto del envase, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, etc., sobre el cual se ha registrado la información. Otro medio más que puede estar presente es una dirección de un sitio web que puede usarse a través de internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y una descripción completas de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni tienen la intención de representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura,etc.)pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o próxima a esta.
El factor 1 estimulante de colonias (CSF-1) o el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, del inglés"Macrophage Colony Stimulating Factor')es una de las primeras citoquinas que se descubrió para promover la hematopoyesis. En el sistema hematopoyético, se cree que el M-CSF actúa específicamente sobre los progenitores mieloides, a partir de la etapa del progenitor mieloide común (PMC) y para favorecer la diferenciación de los PMC en el linaje monocito/macrófago (Sherr, C.J.et al.(1988) Macrophage colony-stimulating factor, CSF-1, and its protooncogene-encoded receptor, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 53 Pt 1:521-530). Además, el M-CSF es necesario para la supervivencia, la adhesión y la motilidad de los macrófagos (Pixley, F.J., and Stanley, E.R. (2004) CSF-1 regulation of the wandering macrophage: complexity in action, Trends Cell Biol. 14:628-638; Socolovsky, M.et al.(1998) Cytokines in hematopoiesis: specificity and redundancy in receptor function, Adv. Protein Chem. 52:141-198; Stanley, E.R.et al.(1997) Biology and action of colony-stimulating factor-1, Mol. Reprod. Dev. 1997, 46, 4-10). Además de su papel clave en la diferenciación mieloide, el M-CSF es vital para la diferenciación de osteoclastos, para la diferenciación, supervivencia y proliferación de las células del tracto reproductivo femenino, y para la formación de placenta (Pixleyet al.(2004); Socolovskyet al.(1998); Stanleyet al.(1997)). El M-CSF lo producen varias células que incluyen fibroblastos, células del estroma de médula ósea (MO), macrófagos y linfocitos T activados y células epiteliales secretoras. Las señales del M-CSF a través del receptor del M-CSF (Fms; CD115) y la ligadura de su receptor por el M-CSF dan como resultado la fosforilación de tirosina de Fms y la posterior fosforilación de varias proteínas de células hospedadoras, tales como Grb2, Shc, Sos1 y p85 (Pixleyet al.(2004); Stanleyet al.(1997); Rohrschneider, L.R.et al.(1997) Growth and differentiation signals regulated by the M-CSF receptor, Mol. Reprod. Dev. 46:96-103; Yeung, Y.G. y Stanley, E.R. (2003) Proteomic approaches to the analysis of early events in colony-stimulating factor-1 signal transduction, Mol. Cell. Proteomics 2: 1143-1155).
Los inventores plantearon la hipótesis de que la diferenciación mieloide humana defectuosa en los ratones humanizados podría deberse a la falta de señales específicas que promuevan la diferenciación mieloide. Para validar esto, los inventores diseñaron una nueva generación de ratones humanizados para secretar el M-CSF humano a niveles fisiológicos a partir de los tejidos apropiados. El análisis de estos ratones humanizados con M-CSF reveló una expresión normal, tanto cualitativa como cuantitativamente, del M-CSF humano. El análisis de ratones humanizados con M-CSF injertados con células CD34+ humanas indicó frecuencias aumentadas de monocitos/macrófagos humanos en diversos tejidos. Además, los monocitos/macrófagos humanos obtenidos a partir de estos ratones exhibieron propiedades funcionales mejoradas.
Los ratones humanizados con M-CSF descritos en el presente documento muestran frecuencias y funciones aumentadas de células mieloides humanas. La inserción del M-CSF humano en el locus M-CSF de ratón de ratones Balb/c deficientes en la recombinación que activa el gen 2 (Rag2; número de acceso Genbank 1.NM_009020.3) y la cadena gamma (<yc>, también conocida como "cadena gamma del receptor de interleuquina 2" o IL2RG; número de acceso Genbank 1.NM_013563.3) (ratones Balb/cRagZ1' yc1')dieron como resultado la expresión fiel del M-CSF humano en estos ratones tanto cualitativa como cuantitativamente. La transferencia intrahepática de células madre y progenitoras hematopoyéticas derivadas del hígado fetal humano (CD34+) en ratones recién nacidos humanizados con M-CSF (M-CSFh/h) da como resultado una diferenciación más eficaz y frecuencias mejoradas de monocitos/macrófagos humanos en la médula ósea, bazo y sangre periférica. Además, los ratones M-CSFh/h exhibieron habilidades sostenidas para apoyar la diferenciación de monocitos/macrófagos humanos incluso después de 20 semanas del trasplante. Además, Los ratones M-CSFh/h contienen monocitos/macrófagos humanos residentes dentro de diversos tejidos, incluyendo hígado y pulmones, a diferencia de los ratones control no modificados. Los monocitos/macrófagos humanos obtenidos de los ratones humanizados con M-CSF también muestran propiedades funcionales aumentadas tales como migración, fagocitosis, activación y repuestas al LPS.
Ejemplo 1: Preparaciones celulares, métodos analíticos y ensayos
de aislamiento y trasplante de células CD34+.Se obtuvieron muestras de hígado fetal humano del depósito de tejido hepático fetal humano en la Facultad de Medicina Albert Einstein, Bronx, NY y de los recursos de Advance Biosciences, Inc., Alameda, CA. Todos los experimentos con tejidos humanos se realizaron con la aprobación del Comité de Investigaciones Humanas de Yale.
Para aislar células CD34+ humanas, se enjuagaron las muestras de hígado fetal una vez con PBS y se cortaron en trozos pequeños, se trataron con colagenasa D (100 ng/ml) a 37 °C durante 45 minutos. Se prepararon suspensiones de células individuales y se aislaron las células mononucleares utilizando centrifugación en gradiente de densidad (medio de separación de linfocitos, MP biomédicas). Se aislaron las células CD34+ después de tratar las células con microperlas antiCD34 humanas seguido de la técnica MACS™ (Miltenyi Biotech).
Para el trasplante, se irradiaron subletalmente los cachorros recién nacidos (de 1 día de edad) con dos dosis separadas (2x150 cGy) con 4 horas de separación y se inyectaron 1x105 a 2x105 células CD34+ humanas purificadas en 20 ul de PBS en el hígado utilizando una aguja de calibre 22 (Hamilton Company, Reno, NV).
Aislamiento y cultivo de células del estroma mesenquimales (CEM).Se aislaron los huesos largos de los ratones y se eliminaron las células de la MO. Se cortaron los huesos en trozos y se digirieron con un cóctel de colagenasa D y P (25 ng/ml) durante 45 minutos a 37 °C. Se aislaron las células en suspensión y se colocaron en placas en presencia de medio de cultivo de CEM (Stem Cell Technologies). Después de 2 semanas del cultivo, se aislaron y cultivaron las células CD45'Sca1+CD90+.
Anticuerpos y citometría de flujo.Se analizaron las suspensiones de células individuales mediante citometría de flujo utilizando el software FACS Calibur o LSRII y CELL<q>U<e>ST™, el software FACS DIVA™ (BD Biosciences, San José, CA) o el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc., Ashland, OR), respectivamente. Se realizó la clasificación celular de subpoblaciones definidas utilizando un clasificador de células FACS ARIA™ (BD Biosciences, San José, CA).
Los siguientes anticuerpos humanos se utilizaron en el estudio: CD11b, CD14, CD33, CD34, CD38, CD40, CD45, CD80, CD86, CD90 y HLA-DR.
Los siguientes anticuerpos de ratón se utilizaron en este estudio: CD11b, CD40, CD45, CD80, CD86, F4/80, Gr1, H2Kd y IAd.
Cultivo celular.Para la diferenciación de macrófagos murinos, se sembraron las células de MO en placas de 6 pocillos en presencia de DMEM con FCS al 10 % y complementos necesarios (L-glutamina 2 mM, penicilinaestreptomicina al 1 % y aminoácidos no esenciales 1 mM). Se trataron las células con el M-CSF murino recombinante (10 ng/ml) o el M-CSF humano recombinante (10 ng/ml) durante 7 días. Se eliminó el sobrenadante del cultivo celular cada tres días y se reemplazó el cultivo por medio nuevo y citoquinas.
Para estudios de macrófagos humanos, tales como activación, fagocitosis y migración, se clasificaron y cultivaronin vitro2x105 células CD45+CD14+CD33+ del bazo en el DMEM con suero AB humano al 15%y complementos necesarios (L-glutamina 2 mM, penicilina-estreptomicina al 1 % y aminoácidos no esenciales 1 mM).
Ensayos de activación, fagocitosis y migración.Para la estimulaciónin vivocon LPS, se inyectó a los ratonesi.p.con LPS (100 ng/g de peso corporal). Para la estimulaciónin vitrocon LPS, se añadió LPS (10 ng/ml) a las células y se cultivaron durante 1 o 2 días. Para la estimulaciónin vitrocon poli I:C, se cultivaron las células en presencia de poli I: C (10 |jg/ml) durante 6 o 12 horas.
El ensayo de fagocitosis se realizó utilizando el kit de ensayo de fagocitosis VYBRANT™ disponible comercialmente (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los ensayos de migración se realizaron utilizando un kit de ensayo de migración celular de quimiotaxis QCM™ comercialmente disponible (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Extracción de ARN y PCR en tiempo real.Se aisló el ARN total utilizando sistemas de kit comercialmente disponibles (RNEASY™ Mini kit, Qiagen). Se sintetizó ADNc utilizando el cebador oligo dT y se expandió la transcriptasa inversa (Roche). La reacción de PCR se realizó por duplicado utilizando sistemas de PCR 7500 en tiempo real y mezcla maestra de PCR power SYBR™ Green (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando los siguientes pares de cebadores específicos de genes: CSF1 humano (en sentido: 5'-TACTGTAGCCACATGATTGGGA-3' (SEQ ID NO:1) y antisentido: 5'-CCTGTGTCAGTCAAAGGAAC -3' (SEQ ID NO:2)), CSF1 de ratón (en sentido: 5'-CGACATGGCTGGGCTCCC-3' (SEQ ID NO:3) y antisentido: 5'-CGCATGGTCTCATCTATTAT-3' (SEQ ID NO:4), IFNa humano (en sentido:5'-GTACTGCAGAATCTCTCCTTTCTCCTG-3' (SEQ ID NO:5) y antisentido: 5'-GTGTCTAGATCTGACAACCTCCCAGGCACA-3' (SEQ ID NO:6)), IFNb humano (en sentido:5'-TTGTGCTTCTCCACTACAGC-3' (SEQ ID NO:7) y antisentido: 5'-CTGTAAGTCTGTTAATGAAG-3' (SEQ ID NO:8)), Cebadores HPRT de ratón (en sentido: 5'-AAGGACCTCTCGAAGTGTTGGATA (SEQ ID NO:9) y antisentido: 5'-CATTTAAAAGGAACTGTTGACAACG-3' (SEQ ID NO:10)) cebadores HPRT humanos (en sentido: 5'-CTTCCTCCTCCTGAGGAGTC-3' (SEQ ID NO:11) y antisentido: 5'-CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3' (SEQ ID NO:12)). Para PCR normal, se extrajo el ADN de las células diana utilizando un kit comercialmente disponible (kit de sangre y tejido DNEASY™, Qiagen) y se realizó el análisis de PCR utilizando pares de cebadores específicos de genes.
ELISA.Para estudios de cuantificación de citoquinas, se recogieron sobrenadantes de suero sanguíneo o de cultivo celular y se sometieron a ELISA utilizando kits de TNF ELISA humano e IL6 humano comercialmente disponibles (Ray Biotech, Inc., GA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Histología.Se fijaron los órganos sólidos en PFA al 4%. Se incluyeron los órganos fijos en parafina (Blue RiBbon; Surgipath Medical Industries). Se seccionaron los bloques y se tiñeron las secciones de 5 pm con tinción H&E, seguido de la colocación de cubreobjetos por métodos rutinarios. Se mantuvieron las secciones sin ningún medio. Se registraron imágenes microscópicas de luz digital, a temperatura ambiente, con un microscopio Zeiss Axio Imager.AI (con lentes de objetivo 2x y 10x), cámara AxioCam MRc5 y software de imágenes AxioVision 4.7.1 (Carl Zeiss Microimaging LLC).
Análisis estadístico.Los datos se presentan como la media ± EEM. Se evaluó la significancia estadística utilizando una pruebatde Student de 2 lados. Los valores P > 0,05 se consideraron no significativos y los valores P < 0,05 se representaron como *.
Ejemplo 2: Ratones genéticamente modificados para injerto
Estrategia Knockin del M-CSF humano.Se preparó una construcción dirigida para reemplazar la secuencia de ácido nucleico del M-CSF de ratón con la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano (identificación de alelo VELOCIGENE® número 5093) en una única etapa de direccionamiento utilizando tecnología VELOCIGENE® como se describió previamente (Valenzuelaet al.(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Se obtuvieron ADN del M-CSF de ratón y humano a partir del cromosoma artificial bacteriano (BAC) RPCI-23, clon 373B18 y de BAC RPCI-11, clon 101M23, respectivamente. En resumen, una construcción de dirección linealizada generada por clonación de reparación de huecos que contiene grupos de homología cadena arriba y abajo del M-CSF de ratón que flanquean una secuencia del M-CSF humano de 17,5 kb que se extiende desde el exón 2 hasta 633nt cadena abajo del exón 9 no codificante, y se electropora un casete de selección de fármaco flojo en células madre embrionarias (ME) de ratón RAG2+/_<yc>_/', que se crearon a partir de una línea celular ME V17 comercialmente disponible (BALB/c x 129 F1). Las células ME de ratón que portaban una deleción heterocigótica del gen del M-CSF se identificaron mediante el cribado de pérdida de alelo con 2 ensayos de qPCR TaqMan que reconocían las secuencias en el intrón 2 (cebador TUF, 5'-CCAGGAATGTCCACTATGGATTC-3 '(SEQ ID NO: 13); sonda TUP, 5' ACTGCTCCTTGACCCTGCTCTGACTCA-3 ' (SEQ ID NO:14); cebador TUR, 5'-TGGGCTGACTTCCCAAAGG-3' (SEQ ID NO:15)) y en la secuencia flanqueante 3' (cebador TDF, 5'-TTAGGTGCTAGTAGGCTGGAAAGTG-3' (SEQ ID NO:16); sonda TDP, 5'-TGCAATCGCAGCTTCTCTCCTTACTAGGCT-3 (SEQ ID NO:17)'; cebador TDR, 5'-AATAGGAAGAACGAACAGGTCTAATACC-3' (SEQ<i>D NO:18)) del gen Csf1 de ratón. La sustitución simultánea del gen de ratón con el gen del M-CSF humano se confirmó mediante ensayos TaqMan de ganancia de alelo que detectaron una copia de una secuencia en el intrón 2 del M-CSF (cebador directo, 5'-GCTGCTTGCCTGGGTTAGTG-3 '(SEQ ID NO: 19); sonda, 5'-TGCCCAGGAACATCAACCACTGATTCTG-3' (SEQ ID NO:20); cebador inverso, 5'-GAGGGACAGCAGACCTCAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 21)) y una copia del casete de resistencia a neomicina (neor) (cebador directo, 5'-GGTGGAGAGGCTATTCGGC-3' (SEQ ID NO: 22); sonda, 5'-TGGGCACAACAGACAATCGGCTG-3' (SEQ ID NO:23); cebador inverso, 5'-GAACACGGCGGCATCAG-3' (SEQ ID NO:24); véase la figura 8. El ensayo qPCR que reconoce la secuencia del M-CSF no amplifica el ADN del genoma del ratón. Se utilizaron los mismos ensayos para confirmar los genotipos de ratones derivados de las células ME diana. La escisión mediada por cre del casete de selección de fármacos se confirmó con el ensayoneorTaqMan. Todos los conjuntos de cebador-sonda fueron suministrados por Biosearch Technologies. Las sondas se marcaron con 6-carboxi-fluoresceína (FAM) en sus extremos 5' y BHQ-1 en sus extremos 3'.
Las células ME correctamente dirigidas se electroporaron adicionalmente con un vector transitorio que expresa Cre para eliminar el casete de selección de fármaco. Se introdujeron clones de células ME dirigidas sin casete de fármaco en un embrión de ratón de fase celular 8 mediante el método VELOCIMOUSE® (Poueymirouet al.,(2007)). Se identificaron VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ME donante) que portaban el gen del M-CSF humanizado (VG 5093) por genotipado para pérdida de alelo de ratón y ganancia de alelo humano utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuelaet al.2003)).
Mantenimiento del ratón.Los ratones Balb/c-Rag2'/_ Yc-/"M-CSFm/m, Balb/c-Rag2'/_ Yc-/'M-CSFWm y Balb/c-Rag2'/_<yc>-/" M-CSFh/h se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en las instalaciones de cuidados de animales de la Universidad de Yale. Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Yale.
Fabricación de ratones humanizados con M-CSF.Para validar si la expresión fisiológica del M-CSF humano en un ratón da como resultado una diferenciación mejorada de macrófagos humanos en los ratones humanizados, los ratones Balb/cRagZ1' yc1'se diseñaron para expresar el M-CSF humano. La cepa Balb/c con deficiencia deRagZ1' Ye1'sirve como sistema modelo exitoso para el estudio del sistema inmune humano en ratones (Traggiai Eet al.(2004) Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science 304:104-107). Con el fin de evitar la expresión supra-fisiológica del M-CSF humano en estos ratones, se adoptó una estrategia para reemplazar la secuencia de codificación del M-CSF de ratón con la contraparte humana. Una construcción (Figura 8) para reemplazar, en una única etapa de direccionamiento, se construyó la mayoría del marco de lectura abierto del M-CSF con secuencia de codificación del M-CSF humano (Identificación de Alelo VELOCIGENE® Número 5093), utilizando la tecnología VELOCIGENE® como se descrió previamente (Valenzuelaet al.,(2003)). Cabe destacar que, el promotor y otros elementos reguladores (tales como 5'UTR) del ratón se conservaron en este vector. El vector de direccionamiento linealizado se sometió a electroporación en las células madre embrionarias Balb/c x 129 Rag2+/_ yc_/'. Las células ME correctamente dirigidas se electroporaron adicionalmente con un vector transitorio que expresa Cre para eliminar el casete de selección de fármaco. Se introdujeron clones de células ME dirigidas sin casete de fármaco en un embrión de ratón de fase celular 8 mediante el método VELOCIMOUSE® (Poueymirouet al.,(2007)). Se identificaron VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ME donante) que portaban el gen del M-CSF humanizado (VG 5093) por genotipado para la pérdida del alelo de ratón y ganancia del alelo humano utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuelaet al.2003)). A través del entrecruzamiento secuencial de progenies, se generaron ratones quiméricos Balb/cRagZ1'Yc'/_y ratones transmitidos por línea germinal con el M-CSF de ratón y humano(M-CSFm/h;knockin heterocigoto) y solo el M-CSF humano(M-CSFh/h;knockin homocigoto).
Caracterización de ratones humanizados con M-CSF.Se evaluó la expresión del M-CSF humano en los ratones humanizados con M-CSF. Se recogieron y se analizaron los órganos de ratones M-CSFm/m o M-CSFh/h para la expresión del ARNm del M-CSF murino y humano utilizando cebadores que son específicos de especie. Tal como se muestra en lasfiguras 1A y 1B, el M-CSF se expresa en la mayoría de los órganos analizados, incluido MO, bazo, sangre, hígado, cerebro, pulmón, testículos y riñones. Sin embargo, el timo y la piel no mostraron expresión detectable del M-CSF. Cabe destacar que, el patrón de expresión del M-CSF de ratón y humano fue comparable entre ratones M-CSFm/m y M-CSFh/h, respectivamente. A continuación, se cuantificaron los niveles de expresión del M-CSF de ratón y humano en ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h, y M-CSFh/h. Se aislaron células del estroma mesenquimales de médula ósea (CEM) y se cuantificaron los niveles de expresión de ARNm del M-CSF utilizando PCR en tiempo real (Figura 1C) y se cuantificó la proteína del M-CSF (secretada) utilizando ELISA (Figura 1D). Los ratones M-CSFm/m expresaron solo el M-CSF de ratón, los ratones M-CSFm/h expresaron el M-CSF de ratón y humano y los ratones M-CSFh/h expresaron solo el M-CSF humano. Los niveles de expresión del M-CSF humano fueron comparables con el M-CSF de ratón. De acuerdo con estos datos, el análisis del M-CSF en suero reveló niveles de expresión comparables de proteína del M-CSF en ratones m/m, h/m y h/h (Figura 1E). La hemicigosidad no conduce a la disminución de los niveles de expresión de genes y proteínas, lo que indica que los niveles de dosificación de genes parecen no ser limitantes para esta citoquina.
Para investigar si la sustitución del M-CSF de ratón con el M-CSF humano da como resultado efectos perjudiciales, especialmente sobre el hueso y la hematopoyesis, se analizaron ratones M-CSFh/h a diversas edades. Estudios previos han documentado que los ratones con señalización defectuosa del M-CSF(Csf1op/opyCsfír1')presentan insuficiencia de erupción dental y defectos óseos (Dai, X.M.et al.(2002) Targeted disruption of the mouse colonystimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects, Blood 99:111-120; Felix, R.et al.(1990) Macrophage colony stimulating factor restores in vivo bone resorption in the op/op osteopetrotic mouse, Endocrinology 127:2592-2594; Wiktor-Jedrzejczak, W.et al.(1990) Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:4828-4832; Yoshida, H.et al.(1990) The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene, Nature 345:442-444). Por el contrario, ratones M-CSFh/h revelaron dientes y propiedades óseas normales. Además, a diferencia de los ratonesCsf1op/opandCsfír1',el contenido celular total de la MO (Figura 2A), las frecuencias de células mieloides en la MO, bazo (BA) y sangre periférica (SP) (Figura 2B) y las frecuencias de macrófagos en la MO y BA (Figura 2C) fueron comparables entre ratones M-CSFm/m, M-CSFh/m y M-CSFh/h. En línea con esta observación, las frecuencias del compartimento de CMH (incluyendo CMH a largo plazo, CMH a corto plazo y progenitores multipotentes) y el compartimento progenitor mieloide (incluyendo progenitores mieloides comunes, progenitores de monocitos de granulocitos y progenitores de eritrocitos megacariocitos) fueron comparables entre ratones M-CSFm/m, M-CSFh/m y M-CSFh/h (Figura 9).
Una posible explicación para la hematopoyesis normal y el desarrollo óseo en los ratones M-CSFh/h podría ser que el M-CSF humano es reactivo de forma cruzada con células de ratón. Para validar esto, se aislaron las células de MO totales del M-CSFm/m y se cultivaron en presencia del M-CSF murino recombinante o el M-CSF humano recombinante. Mientras que las células de MO cultivadas en ausencia de citoquina no lograron sobrevivir, las células cultivadas en presencia del M-CSF humano o de ratón mostraron niveles comparables de diferenciaciónin vitro(Figura 2D). El análisis de estos macrófagos diferenciadosin vitropara la expresión de moléculas coestimuladoras y MHC indicó niveles comparables de estas moléculas en presencia del M-CSF humano o de ratón (Figura 2E). De acuerdo con estos hallazgos, estudios previos documentaron que el M-CSF humano es activo en células diana de ratón, mientras que el M-CSF de ratón no tiene reactividad cruzada con células humanas (Sieff, C.A. (1987) Hematopoietic growth factors, J. Clin. Invest. 79:1549-1557).
Ejemplo 3: Diferenciación de monocitos/macrófagos humanos en ratones humanizados con M-CSF
Para evaluar el impacto de la humanización del M-CSF, se trasplantaron intrahepáticamente(i.h)cachorros Rag2'/_ Yc'/'M-CSFm/m, Rag2'/'Yc'/'M-CSFh/m y Rag2'/'Yc'/'M-CSFh/h recién nacidos irradiados subletalmente con ~ 2x105 células CD34+ de hígado fetal humano purificadas. Los receptores se sangraron a las 8 semanas después del trasplante para confirmar las células de origen del donante (basándose en la expresión de CD45 humanas). Doce semanas después del trasplante, se sacrificaron los receptores y se recogieron su MO, BA y SP. El análisis reveló el aumento de las frecuencias relativas y absolutas de células de linaje de monocitos/macrófagos CD14+CD33+ en la MO, BA y SP en ratones M-CSFh/m y M-CSFh/h en comparación con ratones M-CSFm/m (Figuras 3A-C). Aunque los ratones M-CSFh/m exhibieron frecuencias aumentadas de células CD14+CD33+, se encontraron las frecuencias máximas de células CD14+CD33+ en los ratones M-CSFh/h. Curiosamente, además de este aumento, las frecuencias de células CD14'CD33+ también se incrementaron en la MO, BA y SP en ratones M-CSFh/m y M-CSFh/h (Figura 3A).
Para analizar si los ratones knockin M-CSF humanos apoyan la mielopoyesis humana sostenida, se analizaron los receptores a las 12, 16 y 20 semanas después del trasplante. Mientras que las células de linaje de monocitos/macrófagos CD14+CD33+ humanas se redujeron ligeramente a las 16 semanas y se redujeron altamente después de 20 semanas del trasplante en los ratones M-CSFm/m, se observaron proporciones significativas de células CD14+CD33+ humanas en ratones M-CSFh/m y M-CSFh/h incluso a las 16 y 20 semanas. No obstante, se observaron las frecuencias máximas de células CD14+CD33+ humanas en los ratones M-CSFh/h (Figuras 4A y 4B).
A continuación, se evaluó si los ratones humanizados con M-CSF soportan la diferenciación eficaz de los macrófagos de tejido humano. Para este fin, se perfundieron ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h y M-CSFh/h con PBS y se recogieron sus órganos (incluyendo hígado, pulmones y piel). Se obtuvieron las células del peritoneo lavando la cavidad peritoneal con PBS. Se prepararon suspensiones de células individuales y se calcularon las frecuencias de células CD14+CD33+ humanas. Como cabía esperar, las frecuencias de células CD14+CD33+ humanas se incrementaron significativamente en el hígado, pulmones y peritoneo en ratones M-CSFm/h y M-CSFh/h. Sin embargo, el análisis de explantes de piel reveló frecuencias comparables de células CD14+CD33+ humanas entre ratones M-CSFm/m y M-CSFm/h, aunque se observó un aumento significativo de estas células en explantes de piel de ratones M-CSFh/h (Figura 5). En conjunto, estos datos sugieren que la expresión del M-CSF humano en ratones mejora la diferenciación del linaje mieloide/macrófago de las CMH humanas.
Ejemplo 4: Función de monocitos/macrófagos humanos en ratones humanizados con M-CSF
Para investigar si los monocitos/macrófagos CD14+CD33+ humanos en los ratones humanizados con M-CSF funcionaban normalmente, se realizaron estudios funcionales tantoin vivocomoin vitro.Se inyectaron cachorros M-CSFm/m y M-CSFm/h irradiados subletalmente con células CD34+ de hígado fetal y 12 semanas después del trasplante, se evaluó la hematopoyesis derivada del donante y los ratones receptores se inyectaron con LPS o PBS. Dos días después de la inyección de LPS, se analizaron los receptores para las frecuencias de las células CD14+CD33+ humanas en el bazo. Mientras que la inyección de LPS inducía solo un modesto aumento de las células del linaje monocito/macrófago en los ratones M-CSFm/m, cuando se comparaba con los grupos inyectados con PBS, los ratones M-CSFm/h inyectados con LPS mostraban un aumento de varias veces de células CD14+CD33+ humanas en el bazo (Figura 6A). A continuación, se examinaron las capacidades de estas células para producir citoquinas proinflamatorias en respuesta a la estimulaciónin vivode LPS.
Se inyectaron ratones M-CSFm/m y M-CSFm/h injertados con células CD34+ humanas con LPS. Seis horas después de la inyección, se sangraron los ratones y se determinaron los niveles de suero de IL6 y TNF-a humano y de ratón mediante ELISA. De acuerdo con las frecuencias incrementadas de monocitos/macrófagos en los ratones humanizados con M-CSF, se detectaron niveles elevados de IL6 y TNFa humanos en los ratones M-CSFm/h. Aunque los niveles basales de estas citoquinas fueron mayores en los ratones M-CSFm/h, la estimulación con LPS dio como resultado niveles aumentados de IL6 y TNFa humanos en el suero (Figuras 6By6C). A continuación, se analizó la capacidad de monocitos/macrófagos (obtenidos a partir de ratones humanizados con M-CSF) para secretar citoquinas proinflamatoriasin vitro.Se aislaron células CD14+CD33+ humanas de los bazos de ratones M-CSFm/m o M-CSFh/h, después de 12 semanas de reconstitución con células CD34+ humanas, y se estimularon con LPSin vitrodurante 24 o 48 horas. Se evaluaron los niveles de citoquinas IL-6 y TNFa en los sobrenadantes del cultivo celular mediante ELISA. En línea con los datosin vivo,las células CD14+CD33+ purificadas a partir de ratones M-CSFh/h secretaron niveles aumentados de estas citoquinas en respuesta a LPS (Figuras 7Ay7B). De manera similar, las células CD14+CD33+ humanas aisladas de ratones humanizados con M-CSF expresaron niveles aumentados de ARNm de interferón-a e interferón-p en respuesta a la estimulación con poli I:C (Figura 7C). Finalmente, se analizaron las propiedades de fagocitosis, migración y activación de monocitos/macrófagos humanos obtenidos a partir de ratones humanizados con M-CSF. Las células humanas CD14+CD33+ purificadas a partir de ratones M-CSFh/h reconstituidos con CD34+ humanas exhibieron propiedades fagocíticas aumentadas (Figura 7D) y exhibieron quimiotaxis aumentada en respuesta a la quimioquina Mip3p (Figura 7E). Como cabía esperar, los monocitos/macrófagos humanos obtenidos de los ratones M-CSFh/h mostraron propiedades de activación mejoradas según se evaluó basándose en la regulación positiva de moléculas coestimuladoras que incluyen CD40, CD80 y CD86, y HLA-DR en respuesta a la estimulación de LPSin-vitro(Figura7f ). En su conjunto, los monocitos/macrófagos humanos diferenciados en presencia del M-CSF humano en los ratones humanizados exhiben propiedades funcionales aumentadas.
Generar un ratón con un sistema hematopoyético/inmunológico completamente funcional y reconstituido de origen humano ha sido un gran desafío en el campo. Hasta la fecha, se han desarrollado 3 cepas de ratón (NOD-sc/d<yc>_/', [NSG], NOD/Shi-sc/dyc1'[NOG] y Balb/c-Rag2'/_<yc>-/-). A pesar de las ventajas conferidas por cada una de estas cepas, la hematopoyesis humana es incompleta en estos ratones.
Para superar este desafío técnico principal, el gen del M-CSF de ratón se reemplazó por su equivalente humano. Esto dio como resultado una diferenciación eficaz de macrófagos humanos en ratones que se reconstituyeron con células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas. El análisis de los ratones humanizados con M-CSF indicó una diferenciación eficaz de monocitos/macrófagos humanos en la MO, bazo y sangre periférica. Además, los macrófagos humanos se detectaron en varios tejidos diferentes, incluidos, pulmones e hígado, en estos ratones, lo que indica que la presencia del M-CSF en ratones humanizados es suficiente para promover la diferenciación de los macrófagos del tejido humano. Adicionalmente, los estudios funcionales descritos en el presente documento que implican monocitos/macrófagos humanos, aislados de los ratones M-CSFm/m y M-CSFh/h indican que las células de los ratones M-CSFh/h fueron mejores en la realización de funciones tales como fagocitosis, migración, activación y secreción de citoquinas. Basándose en estos hallazgos, se puede inferir que los monocitos/macrófagos que se diferencian en presencia del M-CSF humano funcionan mejor.
La tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® se utilizó para generar una nueva línea de ratones Balb/c-Rag2'/_<yc>_/' que expresan el M-CSF humano. Por consiguiente, la región codificante del M-CSF de ratón se reemplazó por la contraparte humana sin alterar los elementos reguladores, tales como el promotor, del gencsflde ratón. Esto dio como resultado un gen quimérico que contenía los elementos reguladores del ratón y la región codificante del M-CSF humano. Los estudios de expresión de estos ratones indicaron que este gen quimérico se expresa fielmente tanto de manera cualitativa como cuantitativa.
El papel del M-CSF en la diferenciación de los macrófagos de ratón ha sido bien establecido. Los ratones que son deficientes para M-CSF(Csf1op/op)o su receptor(C sflr1')exhiben una reducción severa en las frecuencias de macrófagos y osteoclastos, osteopetrosis, fallo en la erupción dental, defectos de desarrollo en diversos tejidos, incluyendo el sistema nervioso, fertilidad masculina y femenina, la dermis y las membranas sinoviales. Si bien estos estudios han proporcionado ideas muy importantes sobre los roles del M-CSF en ratones, la importancia del M-CSF en la hematopoyesis humana sigue siendo en gran parte desconocida. A este respecto, los ratones descritos en el presente documento servirán como una herramienta valiosa, porque permitirán una mejor comprensión de la fisiología y las funciones de las citoquinas en la hematopoyesis humana y la función de las células hematopoyéticas. Adicionalmente, este ratón puede utilizarse para modelar enfermedades y evaluar los efectos de los agentes sobre el sistema inmune humano. Este modelo murino es una herramienta valiosa para comprender la fisiopatología y el tratamiento de varios trastornos y enfermedades en humanos.
Lo anterior simplemente ilustra los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la técnica podrán diseñar diversas disposiciones que, aunque no se describen explícitamente o se muestran en el presente documento, incorporan los principios de la invención y se incluyen dentro de su alcance. Además, todos los ejemplos y el lenguaje condicional citados en el presente documento pretenden principalmente servir de ayuda al lector en la comprensión de los principios de la invención y los conceptos aportados por los inventores para fomentar la técnica, y deben interpretarse sin limitación a tales ejemplos y condiciones específicamente citados. Además, todas las afirmaciones contenidas en el presente documento que recojan principios, aspectos y realizaciones de la invención, así como ejemplos específicos de los mismos, pretenden abarcar equivalentes estructurales y funcionales de los mismos. Además, se pretende que dichos equivalentes incluyan tanto equivalentes conocidos actualmente como equivalentes desarrollados en el futuro, es decir, cualquier elemento desarrollado que realice la misma función, independientemente de su estructura. El alcance de la presente invención, por lo tanto, no pretende limitarse a las realizaciones a modo de ejemplo mostradas y descritas en el presente documento. Más bien, el alcance de la presente invención se incorpora en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una célula madre embrionaria (ME) de ratón, que comprende:
una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma de la célula ME de ratón, secuencia que codifica una proteína del Factor Estimulante de Colonias de Macrófagos humano (hM-CSF) biológicamente activa y está unida operativamente al promotor endógeno del gen del M-CSF de ratón en el locus del M-CSF de ratón.
2. La célula ME de ratón de la reivindicación 1, en donde la célula ME de ratón comprende dos copias de la secuencia de ácido nucleico.
3. La célula ME de ratón de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la célula ME de ratón comprende una mutación nula en al menos un alelo del M-CSF de ratón.
4. La célula ME de ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la mutación nula es una deleción de los exones 2-9 del M-CSF de ratón.
5. La célula ME de ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula ME de ratón es homocigota nula para Rag2.
6. La célula ME de ratón de la reivindicación 5, en donde la célula ME de ratón es homocigota nula para IL2rg.
7. Un embrión de ratón que comprende la célula ME de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Una construcción de direccionamiento para dirigir una secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano al locus del M-CSF de ratón de tal manera que la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano esté unida operativamente al promotor endógeno del gen del M-CSF de ratón en el locus del M-CSF de ratón, comprendiendo la construcción de direccionamiento:
(a) brazos de direccionamiento en dirección 5' y en dirección 3' que son complementarios o sustancialmente complementarios a las secuencias de nucleótidos en dirección 5' y en dirección 3' de cualquiera de (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína M-CSF de ratón, o (ii) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína M-CSF de ratón;
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del M-CSF humano, o un complemento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del M-CSF humano biológicamente activa; y
(c) un marcador y/o casete de selección.
9. Un método para fabricar un ratón con M-CSF humanizado, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una célula ME de ratón con la construcción de direccionamiento de la reivindicación 8; (b) cultivar la célula ME para integrar la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína del M-CSF humano biológicamente activa en el locus endógeno del M-CSF de ratón de la célula ME por recombinación homóloga de tal manera que la secuencia codificante está unida operativamente al promotor endógeno del gen del M-CSF de ratón en el locus del M-CSF de ratón; y
(C) crear un ratón a partir de la célula ME de ratón, en donde el ratón con M-CSF humanizado comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína del M-CSF humano biológicamente activa.
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Country Status (17)

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US (5) US8847004B2 (es)
EP (3) EP2675271B1 (es)
JP (5) JP5834097B2 (es)
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SG (3) SG192606A1 (es)
WO (1) WO2012112544A2 (es)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011002988A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid)
EP3417701B1 (en) 2009-10-06 2021-12-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
RU2577978C2 (ru) 2011-02-15 2016-03-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Гуманизированные m-csf мыши
RU2751240C2 (ru) 2011-10-28 2021-07-12 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Гуманизированные il-6 и рецептор il-6
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
NZ746089A (en) 2012-09-07 2020-05-29 Institute For Res In Biomedicine Irb Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
ES2748662T3 (es) 2012-11-05 2020-03-17 Institute For Res In Biomedicine Irb Roedores inmunodeficientes modificados genéticamente y métodos de uso de los mismos
JP6475172B2 (ja) 2013-02-20 2019-02-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ラットの遺伝子組換え
CN103409468B (zh) * 2013-03-20 2015-08-12 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种免疫缺陷小鼠模型的建立方法
EP3456831B1 (en) 2013-04-16 2021-07-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
EP3461811A1 (en) 2013-06-17 2019-04-03 3M Innovative Properties Co. Process for preparing guanidino-functional monomers
SMT202500280T1 (it) 2013-09-23 2025-09-12 Regeneron Pharma Animali non umani aventi un gene umanizzato della proteina regolatrice del segnale
TR201904342T4 (tr) 2013-10-15 2019-05-21 Regeneron Pharma Hümani̇ze il-15 hayvanlar
EP3071024B1 (en) * 2013-11-19 2018-09-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
EP3430898A1 (en) * 2013-11-19 2019-01-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
US9795121B2 (en) 2014-05-05 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized C3 animals
NO2785538T3 (es) 2014-05-07 2018-08-04
KR102821645B1 (ko) 2014-05-19 2025-06-19 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
BR112016026245A2 (pt) * 2014-05-30 2018-02-20 Regeneron Pharma ?roedor, e, métodos para fazer um roedor humanizado, para fazer um camundongo com dpp4 humanizado, para fazer um roedor transgênico humanizado e para determinar a eficácia terapêutica in vivo de um antagonista da dpp4 específica para humanos no roedor?
ES2969389T3 (es) 2014-12-05 2024-05-17 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 47 humanizado
EP4399969A3 (en) * 2014-12-09 2024-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
SG10202103445QA (en) 2015-04-13 2021-05-28 Regeneron Pharma Humanized sirpa-il15 knockin mice and methods of use thereof
CN105994125B (zh) * 2015-04-15 2019-05-17 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种评价免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法
US20180289840A1 (en) * 2015-05-24 2018-10-11 Central Institute For Experimental Animals Method for Evaluating Hematological Toxicity of Drug Under Evaluation, and Model for Evaluating Hematological Toxicity of Drug Under Evaluation
TWI810145B (zh) 2015-06-23 2023-08-01 杰克森實驗室 具有病患衍生之異種移植物之非ｈｌａ配對的人源化ｎｓｇ小鼠模式
CN105145486A (zh) * 2015-07-22 2015-12-16 中国医学科学院医学实验动物研究所 Rag2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用
PT3376857T (pt) 2015-11-20 2021-05-27 Regeneron Pharma Animais não humanos com um gene humanizado 3 de ativação de linfócitos
US10582702B2 (en) 2016-02-04 2020-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered ANGPTL8 gene
KR101887051B1 (ko) * 2016-02-12 2018-08-10 한국과학기술원 오브젝트 탐닉행동을 활용한 동물행동 조절 방법
CA3014645C (en) 2016-02-29 2022-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents having a humanized tmprss gene
JP7458185B2 (ja) 2016-11-30 2024-03-29 ザ ジャクソン ラボラトリー 改善されたヒト自然免疫細胞の発生を有するヒト化マウスモデル
EP4361637A3 (en) 2017-04-17 2024-07-17 The Jackson Laboratory Method of determining toxicity of an immunomodulatory drug for use in humans
EP3585162B1 (en) 2017-09-29 2023-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use
HUE067361T2 (hu) 2018-07-16 2024-10-28 Regeneron Pharma Ditra betegség rágcsáló modelljei és alkalmazásaik
WO2020041174A1 (en) * 2018-08-20 2020-02-27 The Jackson Laboratory Method of determining toxicity of an immunomodulatory drug
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CN111073907B (zh) * 2018-12-25 2025-07-29 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化细胞因子csf1基因改造非人动物的构建方法及应用
AU2020253532B2 (en) 2019-04-04 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
WO2020247452A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
SG11202111256XA (en) 2019-06-07 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized albumin locus
WO2021011853A2 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 Yale University Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
CN114829882B (zh) 2019-11-05 2023-02-28 阿比尔技术公司 植物产品中感染的预测
JP2023511626A (ja) * 2020-01-28 2023-03-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法
JP2023542539A (ja) 2020-09-24 2023-10-10 ザ ジャクソン ラボラトリー 免疫細胞療法を評価するためのヒト化マウスモデル
CN113100175B (zh) * 2021-03-08 2022-07-12 北京大学人民医院 一种巨细胞病毒感染的人源化小鼠模型及其构建方法
CN114853871B (zh) * 2021-04-20 2024-04-05 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Csf1和/或csf1r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
WO2024020057A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified animal model and its use to model the human immune system
US20250255282A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same
WO2025212991A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent models of disease

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US5573930A (en) * 1985-02-05 1996-11-12 Cetus Oncology Corporation DNA encoding various forms of colony stimulating factor-1
HU215241B (hu) 1986-10-24 1998-11-30 Cetus Corp. Eljárás telepstimuláló faktor-1 új formáinak előállítására, valamint az eljárásban alkalmazható expressziós kazetta, vektor és rekombináns gazdasejtek előállítására
ES2071620T3 (es) 1987-12-23 1995-07-01 Univ Leland Stanford Junior Mamiferos inmunodeficientes quimericos y su utilizacion.
JP2981486B2 (ja) 1988-06-14 1999-11-22 メディカル・バイオロジー・インスティチュート 哺乳動物の免疫系研究方法
US5849288A (en) 1990-01-15 1998-12-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for production of monoclonal antibodies in chimeric mice or rats having xenogeneic antibody-producing cells
DE69131331T2 (de) 1990-01-15 2000-03-02 Yeda Research And Development Co., Ltd. Dauerhafte Verpflanzung und Entwicklung menschlicher hämatopoietischer Zellinien bei normalen Säugetieren
US5652373A (en) 1990-01-15 1997-07-29 Yeda Research And Development Co. Ltd. Engraftment and development of xenogeneic cells in normal mammals having reconstituted hematopoetic deficient immune systems
DK0481058T3 (da) 1990-05-03 1996-12-02 Systemix Inc Humant, lymfatisk væv i en immunokompromitteret vært
US5633426A (en) 1990-05-25 1997-05-27 Systemix, Inc. In vivo use of human bone marrow for investigation and production
JPH05500617A (ja) 1990-05-25 1993-02-12 システミックス，インコーポレイティド 免疫処理された宿主におけるヒト末梢血液細胞
CA2103705C (en) 1991-02-11 1996-01-30 Ayub K. Ommaya Spinal fluid driven artificial organ
US5222982A (en) 1991-02-11 1993-06-29 Ommaya Ayub K Spinal fluid driven artificial organ
EP0517199A1 (en) 1991-06-04 1992-12-09 Yeda Research And Development Company, Ltd. Durable engraftment of human tissue and cells in normal mammals
WO1993005796A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 The Scripps Research Institute Method for producing human antibodies in a non-human animal, and animals therefor
EP0539970B1 (en) 1991-10-30 1999-05-26 Idemitsu Kosan Company Limited Methods for producing human lymphocytes and human monoclonal antibodies, and human monoclonal antibodies produced thereby
US6353150B1 (en) 1991-11-22 2002-03-05 Hsc Research And Development Limited Partnership Chimeric mammals with human hematopoietic cells
WO1993018144A1 (en) 1992-03-05 1993-09-16 The Trustees Of Columbia University Of The City Of New York Recombination activating gene deficient animal
US5866757A (en) 1992-06-02 1999-02-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. Engraftment and development of xenogeneic cells in normal mammals having reconstituted hematopoetic deficient immune systems
US6018096A (en) 1993-05-03 2000-01-25 Surrogen, Inc. Animal model for engraftment, proliferation and differentiation of human hematopoietic stem cells
CA2103693A1 (en) 1993-08-06 1995-02-07 Steven Gallinger Animal model of the human immune system
WO1996003495A1 (en) 1994-07-27 1996-02-08 Merck & Co., Inc. Bradykinin b2 receptor modified transgenic non-human animals
US6455756B1 (en) 1994-08-12 2002-09-24 Novartis Ag Long term xenogeneic myeloid and lymphoid cell production in chimeric immunocompromised mice
US7273753B2 (en) * 1996-08-02 2007-09-25 Center Of Blood Research Purification and uses of dendritic cells and monocytes
US6248721B1 (en) 1997-04-09 2001-06-19 Lung-Ji Chang Method of using mouse model for evaluation of HIV vaccines
EP0973381B1 (en) 1997-04-09 2010-03-03 AMDL, Inc. Animal model for evaluation of vaccines
US20030028911A1 (en) 1999-08-31 2003-02-06 Manley Huang Transgenic mammal capable of facilitating production of donor-specific functional immunity
CA2382383A1 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Genencor International, Inc. Transgenic mammal capable of facilitating production of donor-specific functional immunity
JP2004500810A (ja) 1999-12-09 2004-01-15 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド Ｉｌ−６様ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体
WO2002022786A1 (en) 2000-09-14 2002-03-21 Genetrol Biotherapeutics, Inc. Method and cell composition for screening compounds for anti-inflammatory activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2002363322A1 (en) 2001-10-26 2003-05-19 Large Scale Biology Corporation Endothelial cell derived hemotopoietic growth factor
JP4087338B2 (ja) 2001-11-15 2008-05-21 キリンファーマ株式会社 キメラ非ヒト動物
JPWO2004005496A1 (ja) 2002-07-05 2005-11-04 麒麟麦酒株式会社 臍帯血、骨髄、末梢血等に含まれる新規な未分化幹細胞集団
CN101250553A (zh) 2002-07-13 2008-08-27 上海医学遗传研究所 一种促人血小板生成素表达载体及其构建方法
AU2003278790A1 (en) 2002-09-09 2004-03-29 California Institute Of Technology Methods and compositions for the generation of humanized mice
EP1418185A1 (en) * 2002-11-11 2004-05-12 Aventis Pharma Deutschland GmbH Use of EDG2 receptor in an animal model of heart failure
EP1573314B1 (en) 2002-12-16 2008-07-23 Genentech, Inc. Transgenic mice expressing human cd20
CN1751236A (zh) * 2002-12-16 2006-03-22 健泰科生物技术公司 表达人cd20的转基因小鼠
EP1802193B1 (en) 2004-10-19 2014-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating a mouse homozygous for a genetic modification
US7759541B2 (en) 2004-12-13 2010-07-20 Iti Life Sciences Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity
GB2434578A (en) 2006-01-26 2007-08-01 Univ Basel Transgenic animals
SI2019683T2 (sl) 2006-04-25 2022-10-28 The Regents Of The University Of California Dajanje rastnih faktorjev za zdravljenje motenj CŽS
EP1878342A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 Institut Pasteur Immunodeficient mice transgenic for HLA class I and HLA class II molecules and their uses
WO2008060360A2 (en) 2006-09-28 2008-05-22 Surmodics, Inc. Implantable medical device with apertures for delivery of bioactive agents
WO2008069659A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Improved xenogenic immune system in a non-human mammal
CA2687688C (en) * 2007-05-23 2017-03-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increased transgene expression in t cells
GB0718029D0 (en) * 2007-09-14 2007-10-24 Iti Scotland Ltd Two step cluster deletion and humanisation
US20110118446A1 (en) 2007-09-28 2011-05-19 The General Hospital Corporation Methods and compositions for antibody production
EP2257250A2 (en) 2008-01-29 2010-12-08 Gilbert H. Kliman Drug delivery devices, kits and methods therefor
AU2013204613A1 (en) 2008-12-24 2013-05-16 The Kingdom of The Netherlands, Represented by The Minister of Health, Welfare and Sport Modified Streptococcus pneumonia pneumolysin (PLY) polypeptides
CN102725400A (zh) 2009-06-29 2012-10-10 麻省理工学院 制造人源化的非人类哺乳动物的方法
JP2012531894A (ja) 2009-06-29 2012-12-13 レスコフ，イリヤ，ビー． ヒト血液癌の非ヒト哺乳動物モデル
RU2425880C2 (ru) 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
EP3417701B1 (en) 2009-10-06 2021-12-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
EP2618656B1 (en) 2010-09-20 2018-06-20 Yale University, Inc. HUMAN SIRPalpha TRANSGENIC ANIMALS AND THEIR METHODS OF USE
WO2012051572A1 (en) 2010-10-15 2012-04-19 Massachusetts Institute Of Technology A humanized non-human mammal model of malaria and uses thereof
RU2577978C2 (ru) 2011-02-15 2016-03-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Гуманизированные m-csf мыши
RU2751240C2 (ru) 2011-10-28 2021-07-12 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Гуманизированные il-6 и рецептор il-6
NZ746089A (en) 2012-09-07 2020-05-29 Institute For Res In Biomedicine Irb Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
ES2748662T3 (es) 2012-11-05 2020-03-17 Institute For Res In Biomedicine Irb Roedores inmunodeficientes modificados genéticamente y métodos de uso de los mismos
SMT202500280T1 (it) 2013-09-23 2025-09-12 Regeneron Pharma Animali non umani aventi un gene umanizzato della proteina regolatrice del segnale
TR201904342T4 (tr) 2013-10-15 2019-05-21 Regeneron Pharma Hümani̇ze il-15 hayvanlar
KR102821645B1 (ko) 2014-05-19 2025-06-19 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
SG10202103445QA (en) 2015-04-13 2021-05-28 Regeneron Pharma Humanized sirpa-il15 knockin mice and methods of use thereof
AU2017290710A1 (en) 2016-06-29 2019-01-24 Menlo Therapeutics Inc. Use of neurokinin-1 antagonists to treat a variety of pruritic conditions

Also Published As

Publication number Publication date
IL253743B (en) 2019-05-30
DK3375284T3 (da) 2023-06-12
NZ613948A (en) 2015-06-26
CN111808879A (zh) 2020-10-23
JP5834097B2 (ja) 2015-12-16
KR102256316B1 (ko) 2021-05-28
JP6505786B2 (ja) 2019-04-24
FI3375284T3 (fi) 2023-06-15
US20130042330A1 (en) 2013-02-14
EP2675271B1 (en) 2018-06-13
JP2014510520A (ja) 2014-05-01
KR102390850B1 (ko) 2022-04-26
IL253743A0 (en) 2017-09-28
WO2012112544A3 (en) 2012-11-15
MY162984A (en) 2017-07-31
IL239350A (en) 2017-12-31
CN111808879B (zh) 2024-12-31
CN103547148B (zh) 2016-06-08
RU2016104468A (ru) 2018-11-22
US20210112791A1 (en) 2021-04-22
MX380588B (es) 2025-03-12
CA2826714C (en) 2022-11-08
RU2577978C2 (ru) 2016-03-20
DK4233537T3 (da) 2025-08-25
EP2675271A4 (en) 2015-03-18
IL227704A0 (en) 2013-09-30
KR20230145500A (ko) 2023-10-17
RU2020126649A (ru) 2022-02-10
KR20200003241A (ko) 2020-01-08
CA2826714A1 (en) 2012-08-23
KR20200054323A (ko) 2020-05-19
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