KR102390850B1 - 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스 - Google Patents

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Abstract

사람 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또한 사람 조혈 세포와 같은 사람 세포와 생착되는 사람 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 및 이러한 생착된 마우스를 만드는 방법이 제공된다. 이들 마우스는 많은 적용에서, 예를 들어, 인간 면역 질환 및 병원체 감염의 모델링; 예들 들어, 건강한 또는 병에 걸린 상태에서 조혈 세포 발달 및/또는 활성을 조절하는 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 조혈 세포에 독성인 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 조혈 세포에 대한 유독 물질의 독성 효과를 방지하거나, 완화시키거나, 반전시키는 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 질환 치료에 대한 개개의 반응성을 예측하기 위한, 개개의 인간 조혈 세포의 생체 내 스크리닝, 등에서 용도를 찾는다.

Description

인간화된 Ｍ－ＣＳＦ 마우스{HUMANIZED M-CSF MICE}
본 발명은 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 및 인간 조혈 세포의 생착 (engraftment)을 지지하는 추가의 변형을 포함하는 마우스와 관련된다.
인간 질환을 연구하기 위한 동물 모델의 개발은 암을 포함하는 여러 질환의 근본적인 메카니즘의 이해를 크게 향상시켰다. 지금까지, 동물 모델, 특히 마우스는 약물의 효율 및 효능 및 치료 옵션의 평가를 위한 훌륭한 후보물질인 것으로 입증되었다. 인간 생물학 및 질환을 연구하기 위해 이들 대리 모델의 이용은 대부분 정당화될 수 있는 한편 (인간의 실험적 치료의 행위에 대한 윤리적 및 기술적 제약으로 인해), 연구는 마우스에서 인간의 추정 데이터의 잠재적 한계를 강조하였다 (Mestas J, Hughes CC. (2004) Of mice and not men: differences between mice and human immunology. J Immunol. 172: 2731-2738).
이들 이슈를 극복하기 위해, 인간화된 마우스 모델을 개발하는데 오랫동안 관심이 있었다. 여러 그룹에 의한 집중적인 작업은 마우스에서 인간 생물학 질환의 연구의 실행 가능성을 성공적으로 입증하였다. 수령체에서 기능적 및 효과적 면역계를 갖는 것은 인간 기원의 이식된 조직/세포의 제거를 일으키기 때문에, T, B 및 NK 세포와 같은 적응 면역계 (adaptive immune system)의 세포가 없는 유전적 돌연변이체를 사용하는 것은 인간화된 마우스 모델의 성공에 크게 기여하였다. 따라서, 인간화된 마우스 모델의 가장 효과적인 후보는 NOD-SCID 및 재조합 활성화 유전자 (recombination activating gene; RAG), 공통 감마 체인 (γC, "인터류킨 2 수용체, 감마", 또는 IL2rg로도 알려짐), 베타2 미크로글로빈 (B2M) 및 퍼포린 1 (Prf 1)을 포함하는 유전자가 없는 Balb/c 종을 포함한다 (Shultz LD, et al. (2007) Humanized mice in translational biomedical research, Nat. Rev. Immunol. 7: 118-130). 지난 수십 년 동안 여러 연구는 말초 혈액 백혈구, 태아 간 세포, 태아 뼈, 태아 흉선, 태아 림프절, 혈관이 발달한 피부, 동맥 세그먼트 및 결집피 (mobilized blood) 또는 제대혈 (cord blood) 조혈 줄기 세포 (HSC)를 포함하는, 여러 타입의 인간 조직의, 특정 인간화된 마우스로 이식의 실행 가능성을 입증하였다 (Macchiarini F., et al. (2005) Humanized mice: are we there yet? J. Exp. Med. 202: 1307-1311). 이들 마우스의 인간 세포로부터 얻어진 데이터가 인간 시스템의 생리를 반영할 수도 있기 때문에 이 접근법은 더 나은 모델 시스템을 제공하는 것으로 생각된다. 본 분야에서 조사의 주요 방법은 인간 기원의 완벽한 조혈계 및 기능성 면역계를 갖는 마우스를 생성하는 것이다. 인간 T 림프구, B 림프구, NK 세포 및 수지상 세포 (DC)를 갖는 면역 손상 마우스의 생성에서 상당한 진전이 이루어지는 한편, 본 분야에서는 여러 시도가 있었고, 이것들 중 하나는 인간화된 마우스의 불량한 골수성 분화이다.
흥미롭게도, 인간화된 마우스의 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 인간 T 세포, B 세포, NK 세포 및 수지상 세포의 생성에 많은 진전이 있었다. 개개의 조혈성 구획 외에도, 이들 마우스에서 인간 HSC의 주사는 흉선 및 비장과 같은 림프 기관의 재구성을 일으켰다. 그러나, 골수 세포, 특히 과립구, 마크로파지, 적혈구 및 거핵구의 빈도는 매우 낮다-아마 이들 마우스에서 인간 HSC의 비효율적 골수 발생 (myelopoiesis)으로 인한 결과 (Shultz ei al. (2007); Macchiarini ei al. (2005)). 골수 기원의 세포 (예를 들어, 적혈구 및 거핵구)는 혈관계의 정상적인 기능에 필수적이고, 과립구 및 마크로파지는 적응 면역계의 발달에 중요하기 때문에, 효율적인 인간 골수 발생의 인간화된 마우스를 발생시키는 것은 가장 중요하다.
따라서, 업계에는 인간 HSC에 생착시 개선된 인간 골수 발생 가능한 유전적으로 변형된 마우스가 필요하다 (Manz MG. Human-hemato-lymphoid-system mice: opportunities and challenges. Immunity. 2007 May;26(5): 537-41).
인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또한 인간 조혈 세포와 같은 인간 세포에 생착된, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 및 이러한 생착된 마우스를 만드는 방법이 제공된다. 이들 마우스는 많은 적용에서, 예를 들어, 인간 면역 질환 및 병원체 감염의 모델링; 예들 들어, 건강한 또는 병에 걸린 상태에서 조혈 세포 발달 및/또는 활성을 조절하는 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 조혈 세포에 독성인 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 조혈 세포에 대한 유독 물질의 독성 효과를 방지하거나, 완화시키거나, 반전시키는 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 질환 치료에 대한 개개의 반응성을 예측하기 위한, 개개의 인간 조혈 세포의 생체 내 스크리닝, 등에서 용도를 찾는다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간화된 M-CSF 마우스가 제공되며, 인간화된 M-CSF가 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 마우스 M-CSF 구조 유전자 자리의 조절 서열 5', 마우스 M-CSF 프로모터, 5'UTR, 등에 작동 가능하게 결합되는다. 일부 구체예에서, 마우스는 핵산 서열의 2개의 카피를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 M-CSF 자리 내의 마우스 게놈에 위치한다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 M-CSF 자리에서 내인성 마우스 M-CSF 프로모터에 작동 가능하게 결합되는다, 즉, 마우스는 M-CSFh/m 마우스이다. 일부 구체예에서, 마우스는 핵산 서열이 마우스 M-CSF 자리 내에 마우스 게놈에 위치한 2개의 대립 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 대립유전자 둘 다의 핵산 서열은 마우스 M-CSF 자리에서 내인성 마우스 M-CSF 프로모터에 작동 가능하게 결합되는다, 즉, 마우스는 M-CSFh/h 마우스이다. 일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 적어도 하나의 마우스 M-CSF 대립유전자에서 눌 (null) 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 마우스 M-CSF 대립유전자 둘 다에서 눌 돌연변이를 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, 눌 돌연변이는 마우스 M-CSF 엑손 2-9의 결실이다.
일부 구체예에서, 마우스는 골수, 비장, 혈액, 간, 뇌, 폐, 고환, 및 신장에서 인간 M-CSF를 발현한다. 일부 구체예에서, 발현된 인간 M-CSF의 양은 야생형 마우스에서 발현된 마우스 M-CSF의 양과 실질적으로 같다. 일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스의 골수 중간엽 기질 세포는 야생형 마우스 골수 중간엽 기질 세포에 의해 발현된 마우스 M-CSF의 양과 실질적으로 같은 인간 M-CSF의 양을 발현한다. 일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 혈액 및/또는 조직에서 M-CSF의 생리학적 농도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 마우스는 마우스 M-CSF 및 인간 M-CSF 둘 다를 발현한다. 다른 구체예에서, 마우스에 의해 발현되는 유일한 M-CSF는 인간 M-CSF이다.
일부 구체예에서, 마우스는 인간 단핵세포, 인간 마크로파지, 및 인간 파골세포와 생착된 인간 조혈 줄기 세포를 분화시키기 위해 충분한 인간 M-CSF를 분비한다. 일부 구체예에서, 마우스는 인간 조혈 줄기 세포의 마우스에 생착으로부터 발생하는 인간 단핵세포로부터 인간 마크로파지의 발달을 자극하는 M-CSF의 유효량을 분비한다. 일부 구체예에서, 마우스는, 인간 조혈 줄기 세포와 생착된 마우스에서, 인간 조혈 줄기 세포의 단핵모세포로, 단핵모세포의 인간 전단핵세포 (promonocyte)로, 인간 전단핵세포의 인간 단핵세포로, 및 인간 단핵세포의 인간 마크로파지로 발달을 자극하는 M-CSF의 유효량을 분비한다. 일부 구체예에서, 마우스에서 분비된 인간 M-CSF의 유효량은 해당 결과 (예를 들어, 마우스 단핵세포로부터 마우스 마크로파지의 발달을 자극하는 마우스 M-CSF의 유효량)를 얻기 위해 야생형 마우스에 의해 분비된 마우스 M-CSF의 실질적으로 같은 양이다.
일부 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스에서 인간 M-CSF의 전사 및 번역 조절은 그것의 내인성 마우스 M-CSF 유전자의 변형이 없는 마우스에서 마우스 M-CSF의 전사 및 번역 조절과 동일하거나 실질적으로 동일하다.
일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스에서 인간 M-CSF의 생리학적 농도는 마우스 M-CSF 유전자를 갖고 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산이 없는 야생형 마우스에서 마우스 M-CSF를 분비하는 같은 세포 타입으로부터 인간 M-CSF의 분비로부터 발생한다. 다시 말해서, 하나 이상의 M-CSF 이소폼 (isoform)은 정상 조직-특이적 및 발달 패턴으로 발현된다.
일부 구체예에서, 마우스는 인간 프로테오글리칸 M-CSF, 당단백질 M-CSF, 및 세포 표면 M-CSF, 및 이들의 조합으로부터 선택된 M-CSF 이소폼을 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 정상적인 조직-특이적 및 발달 패턴의 이소폼 중 적어도 둘을 발현한다. 특정 구체예에서, 마우스는 인간 프로테오글리칸 CSF-1 및 인간 당단백질 M-CSF 및 인간 세포 표면 M-CSF를 발현한다.
일부 구체예에서, 마우스는 흉선 T 세포-유도 마크로파지가 아닌 인간 마크로파지를 포함한다. 일부 구체예에서, 마우스는 마우스에서 발현된 인간 M-CSF에 의해 자극된 M-CSF-의존적 포도솜 (podosome) 형성을 나타내는 인간 마크로파지를 포함한다.
일부 구체예에서, 마우스는 Rag2에 대하여 눌인 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 마우스는 IL2rg에 대하여 눌인 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 마우스는 Rag2 및 IL2rg에 대하여 눌인 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 마우스는 인간 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 세포는 조혈 세포이다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 면역계의 마우스 모델이 제공되며, 마우스 모델은 Rag2에 대한 2개의 눌 대립유전자, IL2rg에 대한 2개의 눌 대립유전자, 마우스 M-CSF 유전자의 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 및 인간 조혈 세포를 포함한다. 다시 말해서, 마우스는 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스이며, hM-CSF는 마우스가 인간 M-CSF 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다는 것을 나타낸다. 일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 이들 유전적 변형을 포함하는 BALB/c 종 마우스이다. 일부 구체예에서, 마우스는 또한 다른 유전적 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 약 12주령에서 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌 인간 조혈 세포를 포함하는 마우스와 비교하여 골수, 비장, 및 말초 혈액에서 인간 CD14+CD33+ (hCD14+CD33+) 세포의 증가된 빈도를 나타낸다. 특정 구체예에서, 마우스 M-CSF만을 발현하는 마우스를 통해 골수의 hCD14+CD33+ 세포의 증가량은 약 5 내지 약 15배이고, 한 구체예에서, 약 12 내지 약 14배이다. 특정 구체예에서, 마우스 M-CSF만을 발현하는 인간 조혈 세포를 포함하는 마우스를 통해 비장의 골수의 hCD14+CD33+ 세포의 증가량은 약 2 내지 약 6배이고, 한 구체예에서, 약 5 내지 약 6배이다. 특정 구체예에서, 마우스 M-CSF만을 발현하는 인간 조혈 세포를 포함하는 마우스를 통해 말초 혈액의 hCD14+CD33+ 세포의 증가량은 약 2 내지 약 8배이고, 한 구체예에서, 약 5 내지 약 7배이다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 약 12주령에서 혈액에서 hCD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 수준이 약 15 내지 약 40%, 한 구체예에서, 약 30%를 나타낸다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 생착된 마우스는 약 16주령에서 혈액에서 hCD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 수준이 약 15 내지 약 30%, 한 구체예에서, 약 22%를 나타낸다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 생착된 마우스는 약 20주령에서 혈액에서 hCD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 수준이 약 5 내지 약 15%, 한 구체예에서, 약 10%를 나타낸다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 생착된 마우스는 약 20주령에서 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스의 수준보다 약 4 내지 8배 더 높은, 한 구체예에서, 약 6배 더 높은, 혈액에서 hCD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 수준을 나타낸다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 약 12주령에서 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 1.5 내지 약 6배 더 높은, 간에서 hCD14+CD33+CD45+ 세포의 수준을 나타낸다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 생착된 마우스는 약 12주령에서 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 1.5 내지 약 10배 더 높은, 폐에서 hCD14+CD33+CD45+ 세포의 수준을 나타낸다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 생착된 마우스는 약 12주령에서 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 2 내지 약 3배 더 높은, 복막에서 또는 피부에서 hCD14+CD33+CD45+ 세포의 수준을 나타낸다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 간에서 hCD14+CD33+ 세포의 퍼센트에 관하여 인간 M-CSF가 없는 마우스보다 약 1.5 내지 약 6배, 한 구체예에서 약 2 내지 약 4배 더 큰 LPS 주입에 대한 반응을 나타낸다; 폐에서 LPS 반응은 hCD14+CD33+ 세포에 관하여 약 1.5 내지 10배, 한 구체예에서, 약 2 내지 3배이다; 피부에서 LPS 반응은 hCD14+CD33+에 관하여 약 2 내지 약 5배, 한 구체예에서, 약 3 내지 약 4배이다; 복막에서 LPS 반응은 hCD14+CD33+ 세포에 관하여 약 2 내지 약 5배, 한 구체예에서, 약 3 내지 약 4배이다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 LPS 자극에 대하여 반응시 향상된 염증 전 시토킨 반응을 나타내며, 향상은 염증 전 시토킨에 대하여 반응성인 세포 타입의 활성화 및/또는 분화의 수준에 관하여 hM-CSF 유전자가 없는, 유전적으로 변형된 및 생착된 마우스보다 약 2 내지 적어도 약 5배이다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 LPS 주입 약 48시간 후 비장에서 hCD14+CD33+hCD45+ 세포의 향상된 생산을 나타내며, 향상은 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 2 내지 약 5배, 한 구체예에서, 4 내지 약 5배이다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 LPS에 반응하여 혈청 인간 IL-6의 향상된 생산을 나타내며, LPS 주입 약 6시간 후 hIL-6의 수준은 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 2 내지 약 5배, 한 구체예에서, 약 3 내지 약 4배 향상된다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 LPS에 반응하여 혈청 인간 TNFα의 향상된 생산을 나타내며, LPS 주입 약 6시간 후 hTNFα의 수준은 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 2 내지 약 4배, 한 구체예에서, 약 2 내지 약 3배 향상된다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 hIL-6에 관하여 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 2 내지 4배 더 높은 LPS 자극시 시험관 내 분비를 나타낸다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 hTNFα에 관하여 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 3 내지 6배 더 높은 폴리 I:C 자극시 시험관 내 분비를 나타낸다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 hIFNα에 관하여 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 3 내지 6배 더 높은 폴리 I:C 자극시 시험관 내 분비를 나타낸다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 hIFNβ에 관하여 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 3 내지 6배 더 높은 폴리 I:C 자극시 시험관 내 분비를 나타낸다.
일부 구체예에서, 인간 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스와 비교하여 향상된 식균작용 (phagocytosis)을 나타낸다. 한 구체예에서, 향상은 37 ℃에서 60분 기간 동안 라벨링 (labeling)된 박테리아의 통합에 의해 측정된 바와 같이, 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스의 인간 세포와 비교하여, 식균작용의 속도의 약 2배이다. 한 구체예에서, 상기 측정된 바와 같이 식균작용 속도는 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스의 인간 세포의 속도의 2배 이상, 예를 들어, 2배, 3배, 또는 4배 이상이다.
일부 구체예에서, 인간 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스와 비교하여 Mip3β에 반응하여 향상된 시험관 내 주화성 (chemotaxis)을 나타낸다. 한 구체예에서, 향상은 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스의 인간 단핵세포 및/또는 마크로파지와 비교하여, Mip3β 노출 30 또는 60분 후, 이동 세포의 수로 측정된 바와 같이 약 1.5배 내지 3배 이상, 예를 들어, 약 1.5배, 2배, 3배, 4배 이상이다.
일부 구체예에서, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 인간 단핵세포 및/또는 마크로파지는 hIFNα에 관하여 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌, 생착된 마우스보다 약 3 내지 6배 더 높은 폴리 I:C 자극시 시험관 내 분비를 나타낸다.
일부 구체예에서, 인간 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스로부터 분리된 단핵세포 및/또는 마크로파지는 LPS 자극에 반응하여 동시 자극 분자의 시험관 내 상향 조절을 나타낸다. 한 구체예에서, 동시 자극 분자는 인간 CD40, 인간 CD80, 인간 CD86, 인간 HLA-DR, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 양태에서, 유전적으로 변형된, 생착된 마우스가 제공되며, 마우스는 인간 조혈 세포의 생착을 포함하고, Rag2-/-IL2rg-/-이고, 마우스 M-CSF에 대한 눌 대립유전자를 포함하고, 내인성 M-CSF 자리에서 인간 M-CSF를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 마우스는 마우스 M-CSF를 발현하지만 인간 M-CSF는 아닌 것과 비교하여 인간 골수 세포의 향상, 또는 증가된 수를 나타낸다.
일부 구체예에서, 향상은 골수, 비장, 및 말초 혈액으로부터 선택된 마우스의 일부에서 hCD14+CD33+ 세포의 수의 적어도 2배 증가를 포함한다. 특정 구체예에서, 향상은 hCD14+CD33+ 세포의 3배 증가를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 향상은 hCD14+CD33+ 세포의 수의 4 내지 5배 이상의 증가를 포함한다.
일부 구체예에서, 향상은 피부 및 복막으로부터 선택된 마우스의 구획에서 hCD14+CD33+hCD45+ 세포의 수의 2 내지 3배 증가를 포함한다.
일부 구체예에서, 향상은 간 및 폐로부터 선택된 마우스의 구획에서 hCD14+CD33+hCD45+ 세포의 수의 1.5 내지 10배 증가를 포함한다.
일부 구체예에서, 향상은 LPS 자극 약 48시간 후 hCD14+CD33+hCD45+ 비장 세포의 수의 4 내지 5배 증가를 포함한다.
일부 구체예에서, 향상은 LPS-자극된 혈청 hIL-6 또는 LPS-자극된 혈청 hTNFα의 2 내지 4배 증가를 포함한다.
일부 구체예에서, 향상은 hCD14+CD33+ 세포의 인간 MIP3β-자극된 시험관 내 이동의 2 내지 3배 증가를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 병원체에 대한 마우스 모델이 제공되며, 마우스 모델은 Rag2에 대한 2개의 눌 대립유전자, IL2rg에 대한 2개의 눌 대립유전자, 마우스 M-CSF 유전자의 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 인간 조혈 세포, 및 인간 병원체에 의한 감염을 포함한다. 다시 말해서, 마우스는 인간 병원체로 감염된, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스이다. 일부 구체예에서, 병원체는 바이러스, 균류, 또는 박테리움이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 인간 또는 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스이다. 일부 구체예에서, 박테리움은 미코박테리움 (mycobacterium), 예를 들어, 미코박테리움 튜버쿨로시스 (mycobacterium tuberculosis; 엠. 튜버쿨로시스)이다. 일부 구체예에서, 박테리움은 엔테로박테리움 (enterobacterium), 예를 들어, 살모넬라 티피 (Salmonella typhi; 에스. 티피)이다.
본 발명의 일부 양태에서, 만능 (pluripotent), 유발된 만능, 또는 전능 (totipotent) 마우스 세포가 제공되며, 마우스 M-CSF 유전자의 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스 세포는 마우스 ES 세포이다.
본 발명의 일부 양태에서, 마우스 배아가 제공되며, 마우스 M-CSF 유전자의 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 마우스 M-CSF 유전자를 표적화하는 표적화 구조가 제공되며, (a) (i) 마우스 M-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는, (ii) 마우스 M-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열의 업스트림 및 다운스트림 뉴클레오티드 서열에 상보성 또는 실질적으로 상보성인 업스트림 및 다운스트림 표적화 팔; (b) 인간 M-CSF 단백질 또는 이들의 단편을 암호화하는 인간 핵산 서열, 또는 인간 M-CSF 단백질 또는 이들의 단편의 보체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및, (c) 마커 및/또는 선택 카세트를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 인간 면역 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 인간 면역 세포는 인간 단핵세포 및 인간 마크로파지로부터 선택된다. 한 구체예에서, 인간 면역 세포는 인간 NK 세포, 인간 B 세포, 및 인간 T 세포로부터 선택된다.
본 발명의 일부 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 인간 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 항체가 제공된다. 한 구체예에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 IgG 이소타입 항체로부터 선택된다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 생착된 인간화된 M-CSF 마우스로부터 얻어진다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 면역글로불린 유전자 또는 이들의 단편의 인간 가변 영역을 암호화한다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 TCR 가변 영역 또는 이들의 단편을 암호화한다.
본 발명의 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 발현하는 인간화된 M-CSF 마우스를 만드는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 마우스 만능 줄기 세포, 예를 들어, ES 세포 또는 iPS 세포를 인간 M-CSF 단백질 또는 이들의 단편에 대한 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열과 접촉시키는 단계 및 핵산 서열의 마우스 게놈으로 통합을 촉진하는 조건 하에 만능 줄기 세포를 배양하는 단계; 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 ES 세포로 마우스를 만드는 단계; 및 마우스가 인간 M-CSF 유전자로부터 인간 M-CSF를 발현하는데 충분한 조건 하에 마우스를 유지하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 무작위로 게놈으로 통합된다. 다른 구체예에서, 핵산 서열은 표적 자리로 통합된다. 이러한 일부 구체예에서, 표적 자리는 내인성 마우스 M-CSF 자리이다, 예를 들어, 인간 M-CSF 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열은 내인성 마우스 M-CSF 자리에 대하여 상동성인 서열에 의해 플랭킹되고 (flanked), 핵산 서열은 내인성 마우스 M-CSF 자리 by 상동 재조합에 의해 내인성 마우스 M-CSF 자리로 통합된다. 일부 구체예에서, 마우스는 Rag2에 대하여 눌인 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 마우스는 IL2rg에 대하여 눌인 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 마우스는 Rag2 및 IL2rg에 대하여 눌인 동형접합성이다, 즉, 그것은 Rag2-/-IL2rg-/-이다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 조혈계를 포함하는 인간화된 M-CSF 마우스를 만드는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 인간 조혈 전구 세포 (human hematopoietic progenitor cell)를 포함하는 세포의 개체군을 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스로 이식하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포이다. 일부 구체예에서, 인간 조혈 전구 세포는 CD133+이다. 일부 구체예에서, 인간 조혈 전구 세포는 만능 줄기 세포, 예를 들어, ES 세포 또는 iPS 세포이다. 일부 구체예에서, 인간 조혈 전구 세포를 포함하는 세포의 개체군의 공급원은 태아 간이다. 일부 구체예에서, 세포의 공급원은 골수이다. 일부 구체예에서, 세포의 공급원은 말초 혈액이다. 일부 구체예에서, 세포의 공급원은 시험관 내 세포의 개체군이다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 병원체로 감염된 마우스를 만드는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 인간 조혈 세포를 포함하는 인간화된 M-CSF, 예를 들어 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 생착된, 반치사로 조사된 마우스를 인간 병원체에 노출하는 단계, 및 마우스를 인간 병원체가 마우스를 감염시키는데 충분한 조건 하에 유지하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 병원체는 여기에 설명된 유전적 변형 중 하나 이상이 없는 마우스를 감염시키지 않는 인간 병원체이다. 일부 구체예에서, 인간 병원체는 여기에 설명된 유전적 변형 중 하나 이상이 없는 마우스에서 병원성이 아닌 인간 병원체이다.
본 발명의 일부 양태에서, 마우스에서 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 만드는 방법이 제공되며, 방법은 상기 및 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 발현하는 인간화된 M-CSF 마우스를 만드는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 마우스의 혈액, 예를 들어, 혈청, 또는 조직으로부터 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 정제하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 마우스로부터 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 발현하는 세포를 얻는 단계, 세포가 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 발현하고 분비하는데 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 단계, 및 분비된 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF를 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이 양태에서, 마우스는 어떤 다른 유전적 변형을 가질 필요가 없고 마우스는 특정 인간 면역 세포의 조제물을 만드는데 유용한 것으로 나타난다. 이와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 형질전환 마우스로부터 얻은, 분리된 생물학적으로 활성인 인간 M-CSF가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에서, 마우스에서 활성화된 인간 단핵세포 또는 활성화된 인간 마크로파지를 만드는 방법이 제공되며, 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스를 면역 자극물에 노출하는 단계, 마우스에서 인간 단핵세포 또는 마크로파지가 활성화되는 것을 허용하는 단계, 및 마우스 인간 단핵세포 또는 인간 마크로파지로부터 분리하는 단계를 포함하며, 활성화된 단핵세포 또는 활성화된 마크로파지의 분획은 인간화된 M-CSF 마우스가 아닌, 즉, 인간 M-CSF 유전자가 없는, 생착된 마우스로부터 얻는 것보다 약 2배 내지 5배 더 높다. 일부 구체예에서, 면역 자극물은 내독소이다. 특정 구체예에서, 내독소는 LPS이다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 조혈 세포 기능을 조절하는 활성에 대하여 후보 약제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 생착된, 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스를 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및 후보 약제와 접촉된 마우스 모델에서 조혈 세포의 기능을 후보 약제와 접촉되지 않은 마우스 모델에서 조혈 세포의 기능에 비교하는 단계를 포함하며; 후보 약제와 접촉된 마우스에서 조혈 세포의 기능의 조절은 후보 약제가 조혈 세포 기능을 조절한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일부 양태에서, 약제의 인간 병원체에 대한 효과를 결정하는 방법이 제공되며, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 생착된, 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스를 인간 병원체의 유효량, 마우스에서 감염을 생산하는데 필요한 병원체의 양이 되는 병원체의 유효량에 노출하는 단계; 병워체가 마우스를 감염시키는 것을 허용하는 단계; 및 측정값을 약제에 노출되지 않은, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스의 측정값에 비교하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 약제는, 예를 들어, 보호적 효과를 결정하기 위해, 마우스를 인간 병원체에 노출하기 전에 제공된다. 일부 구체예에서, 약제는, 예를 들어, 보호적 또는 치료적 효과를 결정하기 위해, 마우스를 인간 병원체에 노출과 동시에 제공된다. 일부 구체예에서, 약제는, 예를 들어, 치료적 효과를 결정하기 위해, 마우스를 인간 병원체에 노출시킨 후 제공된다. 일부 구체예에서, 인간 병원체에 노출시 마우스는 병원체에 노출된 인간의 감염을 모델링하는 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 인간 병원체는 여기에 설명된 유전적 변형 중 하나 이상이 없는 마우스를 감염시키지 않는 병원체이다. 일부 구체예에서, 인간 병원체는 야생형 마우스를 감염시키는 병원체이며, 감염 후 야생형 마우스는 인간이 병원체에 반응하여 증가시키는 면역 반응을 모델링하지 않는다. 일부 구체예에서, 바이러스는 인간 또는 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스이다. 일부 구체예에서, 박테리움은 미코박테리움, 예를 들어, 미코박테리움 튜버쿨로시스 (엠. 튜버쿨로시스)이다. 일부 구체예에서, 박테리움은 엔테로박테리움, 예를 들어, 살모넬라 티피 (에스. 티피)이다. 일부 구체예에서, 마우스는 인간 병원체의 감염성 유닛의 알려진 수에 노출되고, 감염의 파라미터는 마우스의 유동체 또는 조직에서 인간 병원체의 감염성 유닛의 수이다. 일부 구체예에서, 감염의 파라미터는 마우스의 체액의 역가이다. 일부 구체예에서, 감염의 파라미터는 육아종 (granuloma)의 형성이다. 일부 이러한 구체예에서, 육아종은 폐 육아종이다. 일부 이러한 구체예에서, 육아종은 명확한 육아종이다.
본 발명의 일부 양태에서, 약제의 인간 병원체에 대한 효과를 결정하는 방법이 제공되며, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 생착된, 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스를 인간 병원체의 항원의 유효량, 마우스에서 세포성 및/또는 체액성 반응을 촉진하는데 필요한 항원의 양이 되는 항원의 유효량에 노출시키는 단계; 세포성 및/또는 체액성 반응이 발달하는 것을 허용하는 단계; 약제의 존재하는 기간 동안 세포성 및/또는 체액성 반응의 파라미터를 측정하는 단계; 및 측정값을 약제에 노출되지 않은, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스의 측정값에 비교하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 약제는, 예를 들어, 약제의 보호적 효과를 결정하기 위해 마우스를 인간 병원체의 항원에 노출시키기 전에 제공된다. 일부 구체예에서, 약제는, 예를 들어, 약제의 보호적 또는 치료적 효과를 결정하기 위해 마우스를 인간 병원체의 항원에 노출과 동시에 제공된다. 일부 구체예에서, 약제는, 예를 들어, 약제의 치료적 효과를 결정하기 위해 마우스를 인간 병원체의 항원에 노출시킨 후 제공된다. 일부 구체예에서, 인간 병원체에 노출시 마우스는 병원체에 노출된 인간의 감염을 모델링하는 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 항원은 여기에 설명된 유전적 변형 중 하나 이상이 없는 마우스를 감염시키지 않는 인간 병원체의 것이다. 다른 구체예에서, 항원은 야생형 마우스를 감염시키는 인간 병원체의 것이며, 감염 후 야생형 마우스는 인간이 병원체에 반응하여 증가시키는 면역 반응을 모델링하지 않는다. 일부 구체예에서, 병원체는 바이러스, 균류, 또는 박테리움이다. 일부 구체예에서, 바이러스는 인간 또는 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스이다. 일부 구체예에서, 박테리움은 미코박테리움, 예를 들어, 미코박테리움 튜버쿨로시스 (엠. 튜버쿨로시스)이다. 일부 구체예에서, 박테리움은 엔테로박테리움, 예를 들어, 살모넬라 티피 (에스. 티피)이다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 조혈 세포에 대한 독성에 대하여 후보 약제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스와 후보 약제를 접촉시키는 단계; 및 후보 약제와 접촉된 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능을 후보 약제와 접촉되지 않은, 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능에 비교하는 단계를 포함하며; 후보 약제와 접촉된 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능의 감소는 후보 약제가 조혈 세포에 독성이다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간 조혈 세포를 유독 물질로부터 보호하거나, 유독 물질의 인간 조혈 세포에 대한 효과를 완화시키거나, 유독 물질의 인간 조혈 세포에 대한 효과를 반전시키는 능력에 대하여 후보 약제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 생착된, 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스를 유독 물질과 접촉시키는 단계; 마우스를 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및 후보 약제와 접촉된 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능을 후보 약제와 접촉되지 않은, 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능에 비교하는 단계를 포함하며, 후보 약제와 접촉된 마우스 모델에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능의 향상은 후보 약제가 조혈 세포를 유독물질로부터 보호한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일부 양태에서, 개개의 치료제의 처리에 대한 반응성을 예측하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 개개의 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 생착된, 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스를 치료제와 접촉시키는 단계; 및 후보 약제와 접촉된 마우스 모델에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능을 후보 약제와 접촉되지 않은, 인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능에 비교하는 단계를 포함하며; 후보 약제와 접촉된 마우스에서 조혈 세포의 생존 및/또는 기능의 조절은 개개가 치료제의 처리에 대한 반응을 가질 것이라는 것을 나타낸다.
도 1은, 골수 중간엽 기질 세포에 대하여, 다음을 도시한다: (a) M-CSF의 발현; 표시된 기관은 M-CSFm/m 및 M-CSFh/h로부터 분리되었고, RNA가 추출되었고 마우스 M-CSF (상단) 또는 인간 M-CSF (중단) 특이적 프라이머를 사용하여 역전사 (reverse transcription; RT)-PCR 분석이 수행되었다; HPRT 수준 (하단)은 입력 cDNA에 대한 대조군으로서 사용되었다; 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. (b) 표시된 기관은 M-CSFh/m으로부터 분리되었고, RNA가 추출되었고 마우스 M-CSF (상단) 또는 인간 M-CSF (하단) 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석이 수행되었다. 마우스 간 또는 인간 태아 간으로부터 추출된 RNA는 각각 마우스 및 인간 프라이머 쌍에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였고, RT, 및 주형 PCR 반응물은 음성 대조군으로서 역할을 하지 않았다. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. (c) 뼈 관련 기질 세포는 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스로부터 분리되었고 시험관 내에서 10일 동안 배양되었고, 세포는 용해되었고, RNA가 추출되었고 마우스 M-CSF (흰색) 또는 인간 M-CSF (검은색) 특이적 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 분석이 수행되었다; 2배수의 샘플의 평균값이 나타난다; 에러 바 (error bar)는 ± SEM을 나타낸다; 입력 cDNA 양은 HPRT (히폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제; hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) 발현 수준에 따라 표준화되었다; 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타내고, (d) 뼈 관련 기질 세포는 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스로부터 분리되었고 시험관 내에서 10일 동안 배양되었다; 세포 배양물 상층액은 수거되었고 마우스 (흰색) 및 인간 (검은색) M-CSF의 분비된 수준은 종-특이적 M-CSF ELISA 키트를 사용하여 정량되었다; 3배수의 샘플의 평균값이 나타난다; 에러 바는 ± SEM을 나타낸다; 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. (e) M-CSFm/m, M-CSFh/m, 및 M-CSFh/h 마우스를 채혈하였고 인간 및 마우스 M-CSF의 혈청 수준은 ELISA를 통해 정량되었다. 3배수의 샘플의 평균값이 나타난다. 에러 바는 ± SEM을 나타낸다.
도 2a는 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스의 골수 (BM) 세포의 무명수 (absolute number)를 동물 (2개의 정강이뼈 및 종아리뼈) 당 평균으로서 도시한다; 각 그룹은 n=5 4주령 마우스를 함유한다; 에러 바는 ± SEM을 나타낸다; 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2b는 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스의 BM (상단), 비장 (중단) 및 말초 혈액 (PB)의 염색된 단일 세포 현탁액의 유동 세포 분석을 도시한다; Gr1 및 CD11b 항체로 염색됨.
도 2c는 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스의 BM (상단) 및 비장 (중단)의 염색된 단일 세포 현탁액의 유동 세포 분석을 도시한다; F4/80 및 CD11b 항체로 염색됨.
도 2d는 분리되고 재조합 마우스 M-CSF (왼쪽) 또는 인간 M-CSF (오른쪽)의 존재시 7일 동안 배양된 BM 세포의 유동 세포 분석을 도시하였다; 세포는 F4/80 및 CD11b 항체로 염색되었다.
도 2e는 분리되고 재조합 마우스 M-CSF (채워짐) 또는 인간 M-CSF (열림)의 존재시 7일 동안 배양된 BM 세포의 유동 세포 분석을 도시하였다; 세포는 표시된 표면 마커로 염색되었다.
도 3a는 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스에서 생착된 인간 CD34+ 세포의 BM (상단), 비장 (중단) 및 말초 혈액 (PB)의 단일 세포 현탁액의 유동 세포분석법을 도시한다; 염색은 CD45, CD14 및 CD33 인간 항체로 된다; 인간 CD45+인 세포는 사전 통제되고 CD14 및 CD33 발현에 기초하여 식별되었다.
도 3b는 BM (상단), 비장 (중단) 및 말초 혈액 (PB)의 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포의 상대적 빈도를 도시한다; BM 세포의 무명수는 동물 (2개의 정강이뼈 및 종아리뼈) 당 평균으로서 결정되었고 말초 혈액의 것은 혈액의 ml 부피로서 결정되었다; 각 그룹은 n=20 마우스를 함유한다; 각 기호는 개개의 마우스를 나타내고, 수평 막대는 평균값을 나타낸다; 데이터는 5개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 3c는 BM (상단), 비장 (중단) 및 말초 혈액 (PB)의 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포의 절대 빈도를 도시한다; BM 세포의 무명수는 동물 (2개의 정강이뼈 및 종아리뼈) 당 평균으로서 결정되었고 말초 혈액의 것은 혈액의 ml 부피로서 결정되었다; 각 그룹은 n=20 마우스를 함유한다; 각 기호는 개개의 마우스를 나타내고, 수평 막대는 평균값을 나타낸다;
도 4a는 이식의 12, 16 및 20주 후 채혈된, 인간 CD34+ 세포가 생착된 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스의 염색된 세포의 유동 세포 분석을 도시한다; 세포는 CD45, CD14 및 CD33 인간 항체로 염색된다; 인간 CD45+인 세포는 사전 통제되고 CD14 및 CD33 발현에 기초하여 식별되었다.
도 4b는 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포의 절대 빈도를 도시한다; 각 그룹은 n=10 마우스를 함유한다; 각 기호는 각 기호는 개개의 마우스를 나타내고, 수평 막대는 평균값을 나타낸다; 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5는 인간 CD34+ 세포에 생착된 M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스의 유동 세포 분석 결과의 분석을 도시하고, 이식 12주 후, 마우스를 희생시켰고 PBS로 관류되었다; 간 (a), 폐 (b) 및 피부 (c)는 수확되었고 단일 세포 현탁액이 제조되었다; 복강 세포 (d)는 PBS와 함께 흡입함으로써 수거되었다; 세포는 인간 CD45, CD14 및 CD33 항체로 염색되었고, 유동 세포분석법에 의해 분석되었다; 각 기호는 개개의 마우스를 나타내고, 수평 막대는 평균값을 나타낸다; 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 6은 LPS 자극의 결과를 도시한다. (a) M-CSFm/m 및 M-CSFm/h 마우스는 인간 CD34+ 세포와 생착되었고 이식 12주 후, LPS는 복강 내 주입되었고 48시간 후 마우스를 희생시켰고 비장에서 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포의 빈도가 결정되었다; PBS-주입된 마우스는 대조군의 역할을 하였다; 각 기호는 개개의 마우스를 나타내고, 수평 막대는 평균값을 나타낸다. (b), (c) M-CSFm/m 및 M-CSFm/h 마우스는 인간 CD34+ 세포와 생착되었고 이식 12주 후, LPS는 복강 내 주입되었다. 6시간 후, 마우스를 채혈하였고 인간 (오른쪽) 및 마우스 (왼쪽) IL-6 및 TNFα의 혈청 수준은 ELISA에 의해 정량되었다; PBS-주입된 마우스는 대조군의 역할을 하였다; 3배수의 샘플의 평균값이 나타난다; 에러 바는 ± SEM을 나타낸다.
도 7a (hTNFα에 대하여) 및 7b (hIL-6에 대하여)는 LPS 자극 후 시험관 내에서 단핵세포/마크로파지의 염증 전 시토킨을 분비하는 능력을 도시한다. 인간 CD34+ 세포-생착된 M-CSFm/m 및 M-CSFh/h 마우스의 비장의 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포는 이식의 12주 후 분리되었다; 태아 간으로부터 얻은 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포는 대조군의 역할을 하였다; 세포는 시험관 내에서 LPS로 24 또는 48시간 동안 자극되었고, 세포 배양물 상층액은 수거되었고, 인간 TNFα (a) 및 IL-6 (b)의 수준은 ELISA를 통해 정량되었다; 3배수의 샘플의 평균값이 나타난다; 에러 바는 ± SEM을 나타낸다.
도 7c는 폴리 I:C 자극에 반응하는 인터페론-α 및 -β mRNA의 수준을 도시한다. 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포는 폴리 I:C로 6 또는 12시간 동안 자극되었고 IFNα (왼쪽) 및 IFNβ (오른쪽) mRNA 수준은 실시간 PCR에 의해 정량되었다; 2배수의 샘플의 평균값이 나타난다; 에러 바는 ± SEM을 나타낸다
도 7d는 생착된 마우스의 세포의 식균작용, 이동성, 및 활성화 성질을 도시한다. 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포는 인간화된 마우스로부터 분리되었고 37 ℃에서 30 또는 60분 동안 FITC-라벨링된 박테리아와 함께 배양되었고 유동 세포분석법에 의해 측정되었다; 얼음에서 FITC-라벨링된 박테리아와 함께 배양된 세포는 대조군의 역할을 하였다. 열린 히스토그램는 M-CSFm/m 마우스의 세포를 나타내고, 점 히스토그램은 M-CSFh/h 마우스의 세포를 나타내고, 채워진 히스토그램은 인간 태아 간의 세포를 나타낸다.
도 7e는 MIP3β에 반응하는 세포의 주화성을 도시한다. M-CSFm/m 마우스, M-CSFh/h 마우스 및 인간 태아 간으로부터 분리된 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포는 상단 웰에 유지되었고 MIP3β를 함유하는 배지가 하단 웰에 추가되었다; 세포는 30 또는 60분 동안 배양되었고 상단 웰에서 하단 웰로 이동된 세포의 수가 계산되고 플로팅되었다; 2배수의 샘플의 평균값이 나타난다; 에러 바는 ± SEM을 나타낸다
도 7f는 시험관 내 LPS 자극 후 hCD40, hCD80, hCD86, 및 hHLA-DR의 상향 조절에 기초한, 생착된 마우스의 인간 단핵세포/마크로파지의 향상된 활성화를 도시한다. M-CSFm/m 마우스, M-CSFh/h 마우스, 및 인간 태아 간으로부터 분리된 인간 CD45+CD14+CD33+ 세포는 LPS의 존재시 또는 부재시 배양되었다; 자극의 24시간 ㅎ후, 세포는 표시된 표면 마커로 염색되었고 유동 세포분석법에 의해 측정되었다. 열린 히스토그램은 M-CSFm/m 마우스의 세포를 나타내고, 점 히스토그램은 M-CSFh/h 마우스의 세포를 나타내고, 채워진 히스토그램은 인간 태아 간을 나타낸다.
도 8은 엑손 1-9의 상대적 위치를 나타내는 마우스 M-CSF 자리, 및 인간 M-CSF 유전자가 있는 최종 표적화된 대립유전자의 개략도를 제공한다
도 9a, b는 M-CSFm/m, M-CSFh/m, and M-CSFh/h 마우스에서 HSC 구획 및 골수 전구 구획의 빈도를 도시한다. M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스의 BM 세포는 Lineage, c-Kit, Seal, CD150, CD48, CD16/32, 및 CD34 항체로 염색되었고, 유동 세포분석법으로 분석되었다. (a) 계통- 세포 (상단)은 통제되고 Seal 및 c-Kit 발현 (중단)에 기초하여 식별된다. 계통-Sca1+c-Kit+ (LSK) 세포는 통제되고 CD150 및 CD48 발현 (하단)에 기초하여 식별된다. (b) 계통- 세포는 사전 통제되고 Seal 및 c-Kit 발현 (상단)에 기초하여 추가로 식별된다. 계통-c-Kit+Sca1- 세포는 통제되고 CD16/32 및 CD34 발현 (하단)에 기초하여 추가로 식별된다.
본 발명 및 조성물이 설명되기 전, 본 발명은 설명된 특정 방법 또는 조성물로 제한되지 않으며, 물론 다양할 수도 있다고 생각되어야 한다. 여기에 사용된 용어는 특정 구체예를 설명할 목적으로만 사용되고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한되기 때문에 제한하기 위한 것은 아니다.
달리 정의되지 않으면, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료도 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 이제 설명된다. 여기에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시 및 설명하기 위해 참고로 통합된다. 본 개시는 통합된 간행물의 어떤 개시도 모순이 있는 범위로 대체하는 것으로 생각된다.
본 개시의 판독시 당업자에게 명백한 바와 같이, 여기에 설명 및 도시된 개개의 구체예 각각은 본 발명의 범위 또는 사상에서 벗어나지 않는 다른 여러 구체예 중 어떤 것의 특징으로부터 쉽게 분리될 수도 있고 이와 결합될 수도 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 어떤 재인용된 방법도 재인용된 이벤트의 순서로 또는 논리적으로 가능한 어떤 다른 순서로도 수행될 수 있다.
여기에 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나의", "하나의", 및 "그"는 맥락이 달리 명확하게 기술되지 않으면, 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 명시되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 기재는 복수의 이러한 세포를 포함하고 "그 펩티드"에 대한 참조는 당업자에게 알려진 하나 이상의 펩티드 및 이들의 등가물, 예를 들어, 폴리펩티드, 등에 대한 기재를 포함한다.
여기에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에는 그것들의 개시를 위해서만 제공된다. 본 발명은 선행 발명의 장점에 의해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 부여되지 않는다는 입장으로서 해석되어서는 안 된다.
인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또한 인간 조혈 세포와 같은 인간 세포와 생착된, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 및 이러한 생착된 마우스를 만드는 방법이 제공된다. 이들 마우스는 많은 적용에서, 예를 들어, 인간 면역 질환 및 병원체 감염의 모델링; 예들 들어, 건강한 또는 병에 걸린 상태에서 조혈 세포 발달 및/또는 활성을 조절하는 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 조혈 세포에 독성인 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 조혈 세포에 대한 유독 물질의 독성 효과를 방지하거나, 완화시키거나, 반전시키는 약제에 대한 생체 내 스크리닝; 질환 치료에 대한 개개의 반응성을 예측하기 위한, 개개의 인간 조혈 세포의 생체 내 스크리닝, 등에서 용도를 찾는다.
인간화된 M-CSF 마우스
본 발명의 일부 양태에서, 인간화된 M-CSF 마우스가 제공된다. 인간화된 M-CSF 마우스, 또는 " hM-CSF 마우스"는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스를 의미한다. 인간 M-CSF 단백질은 인간 M-CSF이거나 인간 M-CSF와 실질적으로 동일한 단백질을 의미하며., 예를 들어, 그것은 인간 M-CSF에, 예를 들어, 80% 이상 동일, 85% 이상 동일, 90% 이상 동일, 또는 95% 이상 동일, 예를 들어, 인간 M-CSF에 97%, 98%, 99% 동일하다. 그러므로, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 인간 M-CSF 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 즉, 인간 M-CSF 또는 인간 M-CSF와 실질적으로 동일한 단백질이다. M-CSF ("콜로니 자극 인자 1"에 대하여, CSF-1로도 알려짐)는 미크로파지의 생산, 분화, 및 기능을 조절하는 시토킨이다. 인간 M-CSF에 대한 폴리펩티드 서열 및 인간 M-CSF를 암호화하는 핵산 서열은 Genbank 수납 번호 NM_000757.5 (변이체 1), NM_172210.2 (변이체 2), 및 NM_172212.2 (변이체 4)에서 발견될 수도 있다. 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 게놈의 자리는 염색체 1의 인간 게놈; NC_000001.10 (110453233-110472355)에서 발견될 수도 있다. 단백질 서열은 이 자리에서 엑손 1 내지 8에 의해 암호화되는 한편, 엑손 9는 비해석 서열을 포함한다. 이와 같이, 인간 M-CSF에 대한 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열은 인간 M-CSF 유전자의 엑손 1-8 중 하나 이상을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열은 또한 인간 M-CSF의 게놈의 자리의 양태, 예를 들어, 인트론, 3' 및/또는 5' 비해석 서열 (UTR)를 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열은 인간 M-CSF 게놈의 자리의 전체 영역을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열은 비암호화 엑손 9의 633 nt 다운스트림에 대한 인간 M-CSF 게놈의 자리의 엑손 2를 포함한다.
관련된 적용의 인간화된 M-CSF 마우스에서, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 마우스 M-CSF 유전자의 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 결합되는다. 마우스 M-CSF 조절 서열은 마우스 M-CSF 발현을 조절하는 마우스 M-CSF 게놈의 자리의 그 서열,예를 들어, 5' 조절 서열, 예를 들어, M-CSF 프로모터, M-CSF 5' 비해석 영역 (UTR), 등; 3' 조절 서열, 예를 들어, 3' UTR; 및 인핸서 (enhancer), 등이다. 마우스 M-CSF는 약 위치 107,543,966-107,563,387에서 염색체 3에 위치하고 마우스 M-CSF 암호화 서열은 Genbank 수납 번호 NM_007778.4 (이소폼 1), NM_0011 13529.1 (이소폼 2), 및 NM_001113530.1 (이소폼 3)에서 발견될 수도 있다. 마우스 M-CSF의 조절 서열은 업계에 잘 정의되어 있고, 실리코 방법을 사용하여, 예를 들어, UCSC Genome Browser 상에서, genome.ucsc.edu의 월드 와이드 웹 (world wide web) 상에서 상기 Genbank 수납 번호를 참조함으로써, 또는 하기 및 업계, 예를 들어, Abboud et al. (2003) Analysis of the Mouse CSF-1 Gene Promoter in a Transgenic Mouse Model. J. Histochemistry and Cytochemistry 51 (7): 941-949에 설명된 실험 방법, 예를 들어, 쉽게 확인될 수도 있으며, 이것의 개시는 본원에 참고로 포함된다. 일부 예에서, 예를 들어, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 마우스 M-CSF 게놈의 자리에 위치할 때, 인간 CSF 암호화 서열에 작동 가능하게 결합되는 조절 서열은 마우스 게놈에 대하여 내인성, 또는 네이티브이다, 즉, 그것들은 인간 핵산 서열의 통합 전에 마우스 게놈에 존재하였다.
일부 예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 인간 M-CSF 단백질 또는 이들의 단편을 암호화하는 인간 핵산 서열, 즉, "인간 M-CSF 핵산 서열", 또는 "인간 M-CSF 서열"의 게놈으로 무작위의 통합, 또는 삽입에 의해 발생된다. 전형적으로, 이런 구체예에서, 게놈에서 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 위치는 알려져 있지 않다. 다른 예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는, 예를 들어, 상동 재조합에 의해, 인간 M-CSF 핵산 서열의 게놈으로 표적화된 통합, 또는 삽입에 의해 발생된다. 상동 재조합에서, 폴리뉴클레오티드는 표적 자리에서 숙주 게놈에 삽입되는 한편, 표적 자리로부터 숙주 유전 물질, 예를 들어, 유전 물질의 50 염기쌍 (bp) 이상, 100 bp 이상, 200 bp 이상, 500 bp 이상, 1 kB 이상, 2 kB 이상, 5 kB 이상, 10 kB 이상, 15 kB 이상, 20 kB 이상, 또는 50 kB 이상을 동시에 제거한다. 그래서, 예를 들어, 인간 M-CSF 핵산 서열을 마우스 M-CSF 자리에 표적화함으로써 생성된, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 인간화된 M-CSF 마우스에서, 인간 M-CSF 핵산 서열은 M-CSF 자리의 마우스 서열, 예를 들어, 엑손 및/또는 인트론 중 일부 또는 모두를 대체할 수도 있다. 일부 이러한 예에서, 인간 M-CSF 핵산 서열은 인간 M-CSF 서열의 발현이 마우스 M-CSF 자리의 네이티브, 또는 내인성 조절 서열에 의해 조절되도록 마우스 M-CSF 자리에 통합된다. 다시 말해서, 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 작동 가능하게 결합되는 조절 서열(들)은 마우스 M-CSF 자리의 네이티브 M-CSF 조절 서열이다.
일부 예에서, 인간 M-CSF 서열의 통합은 인간 M-CSF 서열이 통합되는 유전자의 전사에 영향을 미치지 않는다., 예를 들어, 인간 M-CSF 서열이 인테인으로서 암호화 서열에 통합되거나, 인간 M-CSF 서열이 2A 펩티드를 포함하면, 인간 M-CSF 서열은 인간 M-CSF 서열이 통합되는 유전자와 동시에 전사되고 번역될 것이다. 다른 예에서, 인간 M-CSF 서열의 통합은 인간 M-CSF 서열이 통합되는 유전자의 전사를 방해한다., 예를 들어, 상동 재조합에 의한 인간 M-CSF 서열의 통합시, 통합 자리의 암호화 서열 중 일부 또는 모두는 인간 M-CSF 서열이 대신 전사되도록 제거될 수도 있다. 일부 이러한 예에서, 인간 M-CSF 서열의 통합은 눌 돌연변이 및, 이로 인해, 눌 대립유전자를 생성한다. 눌 대립유전자는 유전자의 정상 기능이 완전히 없는 유전자의 돌연변이체 카피이다. 이것은 분자 수준에서 유전자 산물 (단백질, RNA)의 완벽한 부재, 또는 비-기능성 유전자 산물의 발현의 결과일 수도 있다. 표현형의 수준에서, 눌 대립유전자는 전체 자리의 결실과 구별할 수 없다.
일부 예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 하나의 카피를 포함한다., 예를 들어, 마우스는 핵산 서열에 대하여 이형접합성일 수도 있다. 다시 말해서, 자리에서 하나의 대립유전자는 핵산 서열을 포함할 수도 있는 한편, 다른 것은 내인성 대립유전자일 것이다., 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 일부 예에서, 인간 M-CSF 핵산 서열은 그것이 마우스 M-CSF에 대한 눌 대립유전자를 생성하도록 마우스 M-CSF 자리에 통합된다. 일부 이러한 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 핵산 서열 암호화에 대하여 이형접합성일 수도 있다, 즉, 인간화된 M-CSF 마우스는 마우스 M-CSF에 대한 하나의 눌 대립유전자 (핵산 서열을 포함하는 대립유전자) 및 하나의 내인성 M-CSF 대립유전자 (야생형 또는 그 반대)를 포함한다. 다시 말해서, 마우스는 M-CSFh/m 마우스이며, "h"는 인간 서열을 포함하는 대립유전자를 나타내고 "m"은 내인성 대립 유전자를 나타낸다. 다른 예에서, 인간화된 M-CSF는 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산 서열 중 2개의 카피를 포함한다., 예를 들어, 마우스는 핵산 서열에 대하여 동형접합성일 수도 있다, 즉, 이배체의 게놈의 자리에 대한 대립유전자 둘 다는 핵산 서열을 포함할 것이다, 즉, 인간화된 M-CSF 마우스는 마우스 M-CSF에 대한 2개의 눌 대립유전자 (핵산 서열을 포함하는 대립 유전자)를 포함한다. 다시 말해서, 마우스는 M-CSPh/h 마우스이다.
두드러지게, 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 상기 설명된 것들, 예를 들어, M-CSPh/h 및 M-CSFh/m 마우스는 마크로파지 및 단핵세포의, 정상적, 또는 야생형 발달 및 기능 및 마크로파지 계통의 세포로부터 발달하는 조직, 예를 들어, 뼈를 나타낸다., 예를 들어, 인간화된 마우스 정상 치아 및 뼈 특징뿐만 아니라 정상 골수 함량, 골수, 비장 및 말초 혈액에서 골수 세포 빈도, 및 골수 및 비장에서 마크로파지 빈도의 세포로부터 발달하는 조직.
일부 예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 다른 유전적 변형을 포함한다., 예를 들어, 인간화된 M-CSF 마우스는 Rag2 유전자 ("재조합 활성화 유전자 2", Genbank 수납 번호 1.NM_009020.3에서 발견될 수도 있는 암호화 서열)에 대하여 적어도 하나의 눌 대립유전자를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 Rag2에 대한 2개의 대립유전자를 포함한다. 다시 말해서, 인간화된 M-CSF 마우스는 Rag2에 대하여 눌인 동형접합성이다. 또 다른 예로서, 인간화된 M-CSF 마우스는 IL2rg 유전자 ("인터류킨 2 수용체, 감마", 공통 감마 체인, 또는 C로도 알려짐, Genbank 수납 번호 1.NM_013563.3에서 발견될 수도 있는 암호화 서열)에 대하여 적어도 하나의 눌 대립유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화된 M-CSF 마우스는 IL2rg에 대하여 2개의 눌 대립유전자를 포함한다. 다시 말해서, 인간화된 M-CSF 마우스는 IL2rg에 대하여 눌인 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 마우스는 Rag2 및 IL2rg 둘 다에 대하여 눌 대립유전자를 포함한다, 즉, 그것은 Rag2-/-IL2RG-/-이다. 다른 유전적 변형이 또한 고려된다., 예를 들어, 인간화된 M-CSF 마우스는 조혈 세포 및 면역계의 발달 및/또는 기능과 연관된 다른 유전자의 변형, 예를 들어, 하나 또는 다른 마우스 유전자의 인간 오솔로그를 암호화하는 핵산 서열로 대체를 포함할 수도 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 인간화된 M-CSF 마우스는 다른 세포 및 조직의 발달 및/또는 기능과 연관된 유전자, 예를 들어, 인간 장애 또는 질환과 연관된 유전자, 또는 마우스에서 변형될 때, 인간 장애 및 질환의 마우스 모델을 제공하는 유전자의 변형을 포함할 수도 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스 또는 반치사로 조사된 hM-CSF 마우스는 세포에 생착되거나, 이식된다. 세포는 유사분열 세포 또는 유사분열 후 세포일 수도 있고, 만능 줄기 세포, 예를 들어, ES 세포, iPS 세포, 및 배아 생식 세포; 및 체세포, 예를 들어, 섬유아세포, 조혈 세포, 뉴런, 근육 세포, 뼈 세포, 혈관 내피 세포, 장 세포, 등, 및 그것들의 계통-제한된 전구 세포 (progenitor) 및 전구체 (precursor)와 같은, 원하는 세포를 포함한다. 특히 원하는 세포 개체군은 조혈 줄기 또는 전구 세포를 포함하는 것들을 포함하며, 이것들은 인간화된 M-CSF 마우스의 조혈계, 예를 들어, 말초 혈액 백혈구, 태아 간 세포, 태아 뼈, 태아 흉선, 태아 림프절, 혈관화 피부, 동맥 세그먼트, 및 정제된 조혈 줄기 세포, 예를 들어, 동원된 HSC 또는 제대혈 HSC에 기여하거나 이를 재구성할 것이다. 세포는 어떤 포유동물 종, 예를 들어, 쥐, 설치류, 개, 고양이, 말, 소, 양, 영장류, 인간, 등의 것일 수도 있다. 세포는 확립된 세포주의 것일 수도 있거나 그것들은 1차 세포일 수도 있으며, "1차 세포", "1차 세포주", 및 "1차 배양물"은 대상체로부터 유도되고 제한된 수의 계대 배양, 즉, 배양물의 분할을 위해 시험관 내에서 성장하는 것이 허용된 세포 및 세포 배양물을 나타내기 위해 여기에서 교체 가능하게 사용된다., 예를 들어, 1차 배양물은 0 번, 1 번, 2 번, 4 번, 5 번, 10 번, 또는 15 번 계대 배양될 수도 있지만, 위기 단계를 통과하기에 충분하지 않은 횟수인 배양물이다. 전형적으로, 본 발명의 1차 세포주는 10번 미만의 시험관 내 계대 배양 동안 유지된다.
세포가 1차 세포이면, 그것들은 어떤 편리한 방법으로도 개개로부터 수확될 수 있다., 예를 들어, 세포, 예를 들어, 혈액 세포, 예를 들어, 백혈구는 성분 채집술 (apheresis), 백혈구 성분 채집술 (leukocytapheresis), 밀도 구배 분리 (density gradient separation), 등에 의해 수확될 수도 있다. 또 다른 예로서, 세포, 예를 들어, 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 췌장, 폐, 장, 위 조직, 등은 생검으로부터 수확될 수도 있다. 수확된 세포의 분산 또는 현탁을 위해 적절한 용액이 사용될 수도 있다. 이러한 용액은 일반적으로 낮은 농도, 일반적으로 5-25 mM에서 허용 가능한 버퍼와 함께, 태아 소 혈청 또는 다른 자연 발생 인자가 편리하게 보충된 평형 염 용액, 예를 들어, 생리식염수, PBS, 행크 평형 염 용액 (Hank's balanced salt solution), 등일 것이다. 편리한 버퍼는 HEPES, 포스페이트 버퍼, 락테이트 버퍼, 등을 포함한다.
일부 예에서, 세포의 이질적 개체군이 인간화된 마우스에 이식될 것이다. 다른 예에서, 세포, 예를 들어, 전구 세포, 예를 들어, 조혈 전구 세포 중 특정 타입이 풍부한 세포의 개체군은 인간화된 마우스에 생착될 것이다. 원하는 세포 개체군의 풍부함은 어떤 편리한 분리 기술에 의한 것일 수도 있다., 예를 들어, 원하는 세포는 배양 방법에 의해 풍부해질 수도 있다. 이러한 배양 방법에서, 다른 것보다 하나의 세포 개체군의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 특정 성장 인자 및 영양소가 전형적으로 배양물에 추가된다. 생존 및/또는 증식에 영향을 미치는 다른 배양 조건은 부착성 또는 비-부착성 기질 상에서 성장, 특정 길이의 시간 동안 배양, 등을 포함한다. 이러한 배양 조건은 업계에 잘 알려져 있다. 또 다른 예로서, 원하는 세포는 친화도 분리 기술에 의해 처음의 개체군으로부터 원하는 세포의 분리에 의해 풍부해질 수도 있다. 친화도 분리를 위한 기술은 친화도 시약으로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하는 마그네틱 분리, 친화도 크로마토그래피, 고체 매트릭스, 예를 들어, 플레이트에 부착된 친화도 시약, 친화도 시약에 결합된 또는 친화도 시약과 함께 사용된 세포 독성 약제, 예를 들어, 보체 및 세포 독소로 "패닝 (panning)", 또는 다른 편리한 기술을 포함할 수도 있다. 정밀한 분리를 제공하는 기술은 형광 발광 활성화된 세포 분류기를 포함하며, 이것은 다양한 정도의 정교함, 예를 들어, 다중 색깔 채널, 저각 및 둔각 빛 산란 검출 채널, 임피던스 (impedance) 채널 등을 가질 수도 있다. 세포는 죽은 세포와 연관된 염료 (예를 들어, 프로피듐 이오디드)를 이용함으로써 죽은 세포에 대하여 선택될 수도 있다. 원하는 세포의 생존에 지나치게 해롭지 않은 어떤 기술도 이용될 수 있다.
예를 들어, 친화도 분리 기술을 사용하여, 이식을 위해 원하는 세포가 아닌 세포는 개체군을 원하는 세포에서 발현되지 않는 마커를 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합하는 친화도 시약과 접촉시킴으로써 개체군으로부터 고갈될 수도 있다., 예를 들어, 조혈 전구 세포의 개체군을 풍부하게 하기 위해, 성숙한 조혈 세포 마커를 발현하는 세포가 고갈될 수도 있다. 추가적으로 또는 대안으로 추가적으로 또는 대안으로, 양성 선택 및 분리는 개체군을 조혈 전구 세포와 연관된 마커, 예를 들어, CD34, CD133, 등을 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합하는 친화도 시약과 접촉시킴으로써 수행될 수도 있다. "선택적으로 결합"은 분자가 우선적으로 원하는 표적에 결합하거나 다른 분자보다 더 큰 친화도로 표적에 결합한다는 것을 의미한다., 예를 들어, 항체는 그것이 특이적인 에피토프를 포함하는 분자에 결합하지만 관련없는 에피토프에는 결합하지 않을 것이다. 일부 구체예에서, 친화도 시약은 항체, 즉, CD34, CD133, 등에 특이적인 항체일 수도 있다. 일부 구체예에서, 친화도 시약은 CD34, CD133, 등에 대하여 특이적 수용체 또는 리간드, 예를 들어, 펩티드 리간드 및 수용체; 효과기 및 수용체 분자, CD34, CD133, 등에 특이적인 T-세포 수용체, 등일 수도 있다. 일부 구체예에서, 원하는 마커에 대하여 특이적인 다중 친화도 시약이 사용될 수도 있다.
친화도 시약으로서 용도를 찾는 항체 및 T 세포 수용체는 단클론성 또는 다클론성일 수도 있고, 형질전환 동물, 면역화된 동물, 불멸화된 인간 또는 동물 B-t세포, 항체 또는 T 세포 수용체를 암호화하는 DNA 벡터로 트랜스펙션된 세포, 등에 의해 생산될 수도 있다. 항체의 제조 및 특이적 결합 멤버로서 사용에 대한 그것들의 적합성의 상세한 설명은 당업자에게 잘 알려져 있다. 친화도 시약으로 라벨링된 항체의 사용은 특히 흥미롭다. 편리하게도, 이들 항체는 분리에 사용되는 라벨과 접합된다. 라벨은 특정 세포 타입의 분리의 용이함을 허용하기 위해, 직접 분리를 허용하는 마그네틱 비드; 지지물에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘과 함께 제거될 수 있는 비오틴; 형광 발광 활성화된 세포 분류기와 함께 사용될 수 있는 플루오로크롬; 등을 포함한다. 용도를 찾은 플루오로크롬은 피코빌리단백질, 예를 들어, 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레세인 및 텍사스 레드 (Texas red)를 포함한다. 흔히 각각의 항체는 각각의 마커에 대한 독립적인 분류를 허용하기 위해, 다른 플루오로크롬으로 라벨링된다.
세포의 처음 개체군은 친화도 시약(들)과 접촉되고 이용 가능한 세포 표면 항원에 결합하는데 충분한 기간 동안 배양된다. 배양은 보통 적어도 약 5분이고 보통 약 60분 미만일 것이다. 분리의 효율이 항체의 부족에 의해 제한되지 않도록, 반응 혼합물에서 항체의 충분한 농도를 갖는 것이 바람직하다. 적절한 농도는 적정에 의해 결정되지만, 전형적으로 항체는 약 1:50 (즉, 50 비율 반응 부피에 대한 1 비율 항체), 약 1:100, 약 1:150, 약 1:200, 약 1:250, 약 1:500, 약 1:1000, 약 1:2000, 또는 약 1:5000인 세포 현탁액의 부피로 희석될 것이다. 세포가 현탁되는 배지는 세포의 생존을 유지하는 어떤 배지도 될 것이다. 바람직한 배지는 0.1 내지 0.5% BSA 또는 1-4% 염소 혈청을 함유하는 포스페이트 완충된 식염수이다. 흔히 태아 소 혈청, BSA, HSA, 염소 혈청, 등이 보충된, Dulbecco's Modified Eagle Medium (dMEM), 행크 염기성 염 용액 (Hank's Basic Salt Solution; HBSS), Dulbecco's 포스페이트 완충된 식염수 (dPBS), RPMI, Iscove's 배지, 5 mM EDTA가 들어있는 PBS, 등을 포함하는, 다양한 배지가 상업적으로 이용 가능하고 세포의 특성에 따라 사용될 수도 있다.
친화도 시약에 의해 라벨링된 접촉된 개체군의 세포는, 예를 들어, 상기 설명되거나 업계에 알려진 바와 같이 어떤 편리한 친화도 분리 기술에 의해서도 선택된다. 분리 후에, 분리된 세포는 세포의 생존을 유지하는 어떤 적절한 배지에도 수거될 수 있으며, 보통 수거 튜브의 하단에 혈청의 쿠션을 갖는다. 흔히 태아 소 혈청이 보충된, dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, Iscove's 배지, 등을 포함하는, 다양한 배지가 상업적으로 이용 가능하고 세포의 특성에 따라 사용될 수도 있다.
원하는 세포 타입, 예를 들어, 조혈 세포가 매우 풍부한 조성물은 이 방식으로 얻어진다. 세포는 세포 조성물의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 약 90% 이상일 것이고, 바람직하게 풍부한 세포 조성물의 약 95% 이상일 것이다. 다시 말해서, 조성물은 실질적으로 순수한, 원하는 세포의 조성물일 것이다.
인간화된 M-CSF 마우스에 이식되고, 세포의 이질적 개체군 또는 세포의 풍부한 개체군인 세포는 즉시 이식될 수 있다. 대안으로, 세포는 액체 질소에서 동결되고 장기간 동안 저장될 수도 있으며, 녹여서 재사용될 수 있다. 이러한 경우에서, 세포는 보통 10% DMSO, 50% 혈청, 40% 완충된 배지, 또는 보통 업계에서 이러한 동결 온도에 세포를 보존하기 위해 사용되는 일부 다른 이러한 용액에서 동결되고, 동결된 배양된 세포를 녹이기 위해 일반적으로 업계에 알려진 방식으로 녹을 수도 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 세포는 다양한 배양 조건 하에 시험관 내에서 배양될 수도 있다. 배양 배지는 액체 또는, 예를 들어, 아가 (agar), 메틸셀룰로스, 등을 함유하는 반-고체일 수도 있다. 세포 개체군은 편리하게 적절한 영양 배지, 예를 들어, 보통 태아 소 혈청 (약 5-10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-메르캅토에탄올, 및 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 Iscove's 변형된 DMEM 또는 RPMI-1640에 현탁될 수도 있다. 배양물은 세포가 반응하는 성장 인자를 함유할 수도 있다. 여기에 정의된 바와 같이, 성장 인자는 막관통 수용체에 대한 특정 효과를 통해, 배양물 또는 온전한 조직에서 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 인자를 포함한다.
세포는 인간화된 M-CSF 마우스에 이식되기 전에, 예를 들어, 선택 가능한 또는 추적 가능한 마커의 제공, 세포에서 유전적 결함의 유발 (예를 들어, 질환 모델에 대하여), 세포에서 유전적 결함의 수리 또는 다른 위치에서 유전자의 발현, 등을 위해 (예를 들어, 이러한 변형이 질환의 경로에 영향을 주는지를 결정하기 위해) 유전적으로 변형될 수도 있다. 세포는 적합한 벡터로 트랜스펙션 또는 형질 도입, 상동 재조합, 또는 다른 적절한 기술에 의해 유전적으로 변형되어서, 그것들이 원하는 유전자를 발현하거나, 원하지 않는 유전자의 발현을 차단하기 위해 안티센스 mRNA, siRNA 또는 리보자임을 가질 수도 있다. 핵산의 표적 세포에 도입을 위한 다양한 기술이 업계에 알려져 있다. 하나가 세포를 유전적으로 변형시킨다는 것을 입증하기 위해, 다양한 기술이 이용될 수도 있다. 세포의 게놈은 제한될 수도 있고 증폭이 있거나 없이 사용될 수도 있다. 폴리머라제 연쇄 반응; 겔 전기 영동; 제한 분석; 서던, 노던, 및 웨스턴 블롯; 시퀀싱; 등 모두가 이용될 수도 있다. 본 출원에 개시된 이들 및 다른 목적을 위한 분자 및 세포 생화학의 일반적인 방법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)와 같은 표준 교과서에서 발견될 수 있으며, 이것의 개시는 본원에 참고로 포함된다. 본 개시에 나타난, 유전적 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트는, 예를 들어, BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech와 같은 상업적 판매사로부터 이용 가능하다는 것을 나타낸다.
세포는, 예를 들어, 간 내 주사, 꼬리-정맥 주사, 레트로 오비탈 주사, 등을 포함하는, 어떤 편리한 방법에 의해서도 인간화된 M-CSF 마우스에서 이식될 수 있다. 전형적으로, 약 0.5 x 105 - 2 x 106개의 만능 또는 전구 세포, 예를 들어, 약 1 x 105 - 1 x 106개의 세포, 또는 약 2 x 105 - 5 x 105개의 세포가 이식된다. 일부 예에서, 마우스는 인간 세포를 이식하기 전에 반치사로 조사된다. 다시 말해서, 마우스는, 예를 들어, 실시예 섹션에 설명된 바와 같이 및 업계에 잘 알려진 바와 같이 방사선의 반치사량에 노출된다. 생착된 인간화된 M-CSF 마우스는 생착된 세포로 면역계의 충분한 재구성을 허용하기 위해, 실험실 동물 사육 조건 하에서 적어도 1주, 예를 들어, 1주 이상, 또는 2주 이상, 가끔 4주 이상, 및 일부 예에서 6주 이상 동안 유지된다.
하기 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이,인간화된 M-CSF 마우스는 이 목적을 위해 개발된 다른 마우스 종 및 다른 M-CSF 형질전환 마우스와 비교하여 크게 증가된, 인간 조혈 세포에 생착되고 이를 유지하는 능력을 입증한다., 예를 들어, 인간 태아 간-유도 조혈 줄기 및 전구 세포 (CD34+)의 신생의 마우스로 간 내 전이는 골수, 비장, 말초 혈액, 폐, 간 및 복강에서 인간 단핵세포/마크로파지의 더 효율적인 분화 및 향상된 빈도를 발생시킨다. 큰 비율의 인간 CD14+CD33+ 세포가 16-20주에 관찰된다. 특히, 조혈 세포와 생착된 인간화된 M-CSF 마우스는 다음 특징 중 하나 이상, 일부 예에서 둘 이상, 일부 예에서, 셋 이상, 일부 예에서, 넷 이상, 일부 예에서, 모두를 입증한다: 그것들은 골수, 비장, 혈액, 간, 뇌, 폐, 고환 및 신장에서 야생형 마우스에서 마우스 M-CSF의 발현에 비교 가능한 수준으로 인간 M-CSF를 발현하고; hM-CSF를 발현하지 않는 생착된 마우스의 hCD14+CD33+보다 2 내지 6배 더 높은, 비장의 hCD14+CD33+ 세포의 빈도를 나타내고; hM-CSF를 발현하지 않는 생착된 마우스의 hCD14+CD33+보다 2 내지 8배 더 높은 말초 혈액의 hCD14+CD33+ 세포의 빈도를 나타내고; 혈액에서 hCD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 수준이 약 15 내지 약 40%를 나타내고; 약 20주령에서 혈액에서 hCD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 수준이 약 5 내지 약 15%를 나타내고; 간에서 hCD14+CD33+ 세포의 퍼센트에 관하여 인간 M-CSF가 없는 마우스보다 약 1.5 내지 약 6배 더 높은 LPS 주입에 대한 반응을 나타내고; LPS 주입 약 48시간 후에 비장에서 hCD14+CD33+hCD45+ 세포의 향상된 생산을 나타내며, 향상은 hM-CSF이 없는 생착된 마우스의 약 2 내지 약 5배이고; LPS에 반응하여 향상된 혈청 인간 IL-6의 생산을 나타내며, LPS 주입 약 6시간 후 hIL-6의 수준은 hM-CSF가 없는 생착된 마우스의 약 2 내지 약 5배이고; hTNFα에 관하여 hM-CSF가 없는 생착된 마우스 유전자보다 약 2 내지 3배 더 높은 LPS 자극시 단핵세포 및/또는 마크로파지에 의한 시험관 내 분비를 나타내고; hIL-6에 관하여 hM-CSF가 없는 생착된 마우스 유전자보다 약 2 내지 4배 더 높은 LPS 자극시 단핵세포 및/또는 마크로파지에 의한 시험관 내 분비를 나타내고; hIFNα에 관하여 hM-CSF가 없는 생착된 마우스 유전자보다 약 3 내지 6배 더 높은 I:C 자극시 단핵세포 및/또는 마크로파지에 의한 시험관 내 분비를 나타내고; hIFNβ에 관하여 hM-CSF가 없는 생착된 마우스 유전자보다 약 2 내지 3배 더 높은 I:C 자극시 단핵세포 및/또는 마크로파지에 의한 시험관 내 분비를 나타내고; 유전적으로 변형되고 hM-CSF가 없는 생착된 마우스 유전자와 비교하여 향상된 식균작용을 나타내고; 유전적으로 변형된, hM-CSF가 없는 생착된 마우스 유전자와 비교하여 Mip3β에 반응하여 시험관 내에서 향상된 주화성을 나타내고; LPS에 반응하여 시험관 내에서 동시 자극 분자의 상향 조절을 나타내며, 동시 자극 분자는 인간 CD40, 인간 CD80, 인간 CD86, 인간 HLA-DR, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
유틸리티
인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스 및 인간화 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스, 및 선택적으로 다른 유전적 변형은 많은 적용에 유용하다., 예를 들어, 이들 마우스는 인간 면역 질환 및 인간 병원체의 모델링에 유용한 시스템을 제공한다., 예를 들어, 대상체 마우스는 초기 인간 조혈 세포, 예를 들어, 인간 조혈 줄기 또는 전구 세포로부터 유도된 인간 조혈 악성 종양의 모델링에 유용하다. 또 다른 예로서, 대상체 마우스는 보통 마우스를 감염시키지 않는 인간 병원체, 예를 들어, 바이러스, 균류, 및 박테리아의 연구에 유용하다.
보통 마우스를 감염시키지 않는 인간 병원체의 하나의 이러한 예는 장티푸스 (typhoid fever)의 원인 인자, 에스. 티피이다. 장티푸스는 미국에서 약 400 건/년을 포함하여 전 세계-원칙적으로 개발 도상국에서-2100만 명 이상을 괴롭힌다. 장티푸스는 약물 아목시실린, 앰피실린, 세포탁심, 세프트리악손, 세프타지딤, 클로람페니콜, 시프로프록사신, 코-트리목사졸, 에르타페넴, 이미페넴, 플로오로퀴놀론 (예를 들어, 시프로프록사신, 가티플록사신, 오플록사신), 스트렙토마이신, 술파디아진, 술파메톡사졸, 테트라시클린, 및 이들의 조합으로 치료되었다. 재발되는 감염이 일반적이며, 이것은 항생제 치료에 의한 질환 관리를 제한한다. 게다가, 다중 약물 내성은 또한 에스. 티피 감염과 함께 널리 퍼져있다.
새로운 치료법, 새로운 백신, 및 치료법 및 백신의 효능을 테스트하는 새로운 방법이 필요하다. 에스. 티피에 의해 감염될 수 있는 마우스는, 예를 들어, 새로운 치료법 및 새로운 백신을 확인하는데 유용할 것이다. 새로운 치료법 및 새로운 백신은, 예를 들어, 마우스에서 (혈액 또는 특정 조직에서) 추정상 항-에스. 티피 약제의 처리에 반응하는 에스. 티피의 양을 결정하거나 마우스를 추정 백신으로 접종한 후 이어서 에스. 티피의 감염성 투여에 노출하고 백신이 접종되지 않지만 에스. 티피로 감염되는 대조군과 비교하여 추정 백신의 접종으로 인한 감염성의 어떤 변화도 관찰함으로써 이러한 마우스에서 테스트될 수 있다.
인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 인간 병원체, 즉 인간을 감염시키는 병원체; 인간 면역계의 인간 병원체에 의한 감염에 대한 반응; 및 인간 병원체에 의한 감염에 대하여 보호하고 및/또는 이를 치료하는 약제의 효과의 연구에 유용하다. 병원체는 바이러스, 균류, 박테리움, 등일 수도 있다. 바이러스성 병원체의 비-제한 예는 인간 또는 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 박테리아성 병원체의 비-제한 예는 미코박테리움, 예를 들어, 미코박테리움 튜버쿨로시스 (엠. 튜버쿨로시스), 및 엔테로박테리움, 예를 들어, 살모넬라 티피 (에스. 티피)를 포함한다.
예를 들어, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스는 에스. 티피 감염의 비-인간 동물 모델로서 유용하다. 대조적으로, 야생형 마우스, 및 다른 알려진 면역 반응하지 않는 마우스 (예를 들어, RAG1/RAG2 유전자 넉아웃 (knockout) 마우스)는 에스. 티피에 의해 감염될 수 없다. 상기 논의된 바와 같이, 생착된 인간 M-CSF 마우스는 여기에 설명된 바와 같이 인간 M-CSF 단백질을 포함하지 않는 생착된 마우스와 비교하여 인간 세포의 향상된 생착을 나타낸다. 이 향상은 생산적 에스. 티피 감염을 유지하는데 충분하고, 즉, 에스. 티피는 마우스, 즉, 그것의 세포 중 하나 이상에 서 에스. 티피를 번식하고 재생할 수 있는 감염된 마우스에서 재생할 수 있다. 특정 구체예에서, 마우스는 에스. 티피의 처음 도입 또는 감염성 노출 후 적어도 1주, 10일, 2주, 3주, 또는 4주에 에스. 티피를 번식시킬 수 있다. 다시 말해서, 에스. 티피에 감염성 노출 후 적어도 1주, 10일, 2주, 3주, 또는 4주 동안 그것의 혈액에서 또는 적어도 하나의 조직에서 에스. 티피 역가 또는 수준을 유지할 수 있다. 마우스를 에스. 티피로 감염시키고 감염을 평가하는 방법의 예는, 예를 들어, US 공개된 출원 번호 2011/0200982에서 발견될 수도 있으며, 이것의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 예로서, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 엠. 튜버쿨로시스에 의한 감염의 비-인간 동물 모델로서 유용하다. 인간 M-CSF 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 마우스에서 인간 조혈 세포의 향상된 생착은 생산적 엠. 튜버쿨로시스 감염을 유지하는데 충분하다, 즉, 엠. 튜버쿨로시스는 마우스에서 재생할 수 있다, 즉, 감염된 마우스는 그것의 세포 중 하나 이상에서 엠. 튜버쿨로시스가 살고 이를 번식시킬 수 있다. 일부 이러한 구체예에서, 마우스는 인간 병원성 미코박테리움에 대하여 테리아성 면역 반응을 증가시키며, 반응은 인간 면역 세포에 의해 매개되고 인간 면역 세포를 포함하는 육아종의 형성을 포함한다. 일부 이러한 구체예에서, 육아종은 폐 육아종이다. 일부 이러한 구체예에서, 육아종은 명확한 육아종이다. 마우스를 엠. 튜버쿨로시스로 감염시키고 감염을 평가하는 방법의 예는, 예를 들어, US 공개된 출원 번호 2011/0200982에서 발견될 수도 있으며, 이것의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
인간 M-CSF 및 일부 예에서, 예를 들어, 여기에 설명된 바와 같이, 하나 이상의 다른 유전적 변형을 발현하는 마우스를 감염시키지 않거나, 야생형 마우스를 감염시키는 인간 병원체의 다른 예로서, 감염 후 야생형 마우스는 인간이 병원체에 반응하여 증가하는 면역 반응을 모델링하지 않고, 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
병원체 감염의 이러한 마우스 모델은, 예를 들어, 인간 감염의 진행을 더 잘 이해하기 위한 연구에 유용하다. 감염의 이러한 마우스 모델은 또한, 예를 들어, 감염에 대하여 보호하거나 이를 치료하는 후보 약제를 확인하는 약물 발견에 유용하다.
인간 조혈 세포에 생착된 인간화된 M-CSF 마우스는, 예를 들어, 새로운 치료법을 확인하고 및/또는 면역계의 발달 및 기능의 분자적 근거를 더 잘 이해하기 위해, 예를 들어, 건강하거나 병에 걸린 상태에서, 생체 내에서 다른 원하는 활성에 대하여, 예를 들어, 조혈 세포 발달 및/또는 활성, 예를 들어, B 세포, T 세포, NK 세포, 마크로파지, 호중구, 호산구, 호염기구, 등의 활성을 조절 (즉, 촉진 또는 억제)할 수 있는 약제에 대하여; 조혈 세포, 예를 들어, B 세포, T 세포, NK 세포, 마크로파지, 호중구, 호산구, 호염기구, 등, 및 이들의 전구 세포에 대하여 독성인 약제에 대하여; 및 조혈 세포, 예를 들어, B 세포, T 세포, NK 세포, 마크로파지, 호중구, 호산구, 호염기구, 등, 및 이들의 전구 세포에 대한 유독 물질의 독성 효과에 대하여 방지하고, 이를 완화시키거나 반전시키는 약제에 대하여 후보 약제를 스크리닝하는 유용한 시스템을 제공한다. 또 다른 예로서, 여기에 설명된 유전적으로 변형된 마우스는 그 약제에 대한 개개의 반응성을 예측하기 위해, 예를 들어, 약제, 예를 들어, 치료제에 대한 개개의 면역계의 반응성을 스크리닝하는 생체 내 플랫폼을 제공함으로써, 질환 치료에 대한 개인의 반응성을 예측하는 유용한 시스템을 제공한다.
생물학적 활성제에 대한 스크리닝 검정에서, 인간 조혈 세포와 생착되고 일부 예에서, 인간 병원체, 또는 인간화된 M-CSF 마우스에 생착된 세포로 감염된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 원하는 후보 약제와 접촉되고 후보 약제의 효과는 하나 이상의 결과 파라미터를 관찰함으로써 평가된다. 이들 결과 파라미터, 예를 들어, 조혈 세포의 총 수 또는 특정 조혈 세포 타입, 또는 세포의 아폽토시스성 상태의 수, 예를 들어, DNA 단편화의 양, 세포 수포 형성의 양, 세포 표면에서 포스파티딜세린의 양, 등은 업계에 잘 알려진 방법에 의해 세포의 생존을 반영할 수도 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 결과 파라미터는 세포의 분화 능력, 예를 들어, 분화된 세포 및 분화된 세포 타입의 비율을 반영할 수도 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 결과 파라미터는 세포의 기능, 예를 들어, 세포에 의해 생산된 시토킨 및 케모킨, 세포의 문제의 부위로 유도하고 이를 분출하는 능력, 세포의 시험관 내 또는 생체 내에서 다른 세포의 활성을 조절, 즉, 촉진 또는 억제하는 능력, 등을 반영할 수도 있다. 다른 결과 파라미터는 동물에서 병원체 감염의 정도, 예를 들어, 마우스에서 병원체의 역가, 마우스에서 육가종의 존재, 등을 반영할 수도 있다.
파라미터는 바람직하게 고 처리량 시스템 (high throughput system)에서, 세포의 정량화 가능한 구성 요소, 특히 정확히 측정될 수 있는 구성 요소이다. 파라미터는 세포 표면 결정 요인, 수용체, 단백질 또는 이들의 형태적 또는 번역 후 변형, 지질, 탄수화물, 유기 또는 무기 분자, 핵산, 예를 들어, mRNA, DNA, 등 또는 이러한 세포 구성 요소 또는 이들의 조합으로부터 유도된 부분을 포함하는 어떤 세포 구성 요소 또는 세포 산물일 수 있다. 대부분의 파라미터가 정량적인 판독값을 제공하는 한편, 일부 예에서, 반정량적 또는 반성질적 결과가 허용 가능할 것이다. 판독값은 단일 측정값을 포함할 수도 있거나, 평균, 중간값 또는 분산, 등을 포함할 수도 있다. 특징으로서, 다양한 파라미터 판독값은 다양한, 같은 검정으로부터 각각의 파라미터에 대하여 얻어질 것이다. 가변성은 예측되고 테스트 파라미터의 각각의 세트에 대한 다양한 값은 단일 값을 제공하기 위해 사용된 일반적인 통계 방법과 함께 표준 통계적 방법을 사용하여 얻어질 것이다.
스크리닝을 위해 원하는 후보 약제는 많은 화학 등급, 주로 유기 분자를 포함하는 알려진 및 알려지지 않은 화합물을 포함하며, 이것은 유기 금속 분자, 무기 분자, 유전적 서열, 백신, 항생제 또는 항생제 성질을 갖는 것으로 의심되는 다른 약제, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 인간에 사용을 위해 승인된 조제약인 약제, 등을 포함할 수도 있다. 본 발명의 중요한 양태는 독성 테스트 등을 포함하는 후보물질 약제를 평가하는 것이다.
후보 약제는 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필수적인 작용기를 포함하는 유기 분자를 포함하고, 전형적으로 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실 기, 흔히 화학적 작용기 중 적어도 둘을 포함한다. 후보 약제는 종종 순환 탄소 또는 헤테로고리 구조 및/또는 상기 작용기 중 하나 이상으로 치환된 방향족 또는 다중방향족 구조를 포함한다. 후보 약제는 또한 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 생체 분자 중에서 발견된다. 약학적으로 활성인 약물, 유전적으로 활성인 분자, 등이 포함된다. 원하는 화합물은 화학치료제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 등을 포함한다. 본 발명에 적합한 약품의 예는 "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition에 설명된 것들이다. 독소, 및 생물학적 및 화학적 작용제가 포함되며, 예컨대 Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992).
스크리닝을 위해 원하는 후보 약제는 또한 핵산, 예를 들어, siRNA, shRNA, 안티센스 분자, 또는 miRNA를 암호화하는 핵산, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 핵산을 표적 세포로 옮기는데 유용한 많은 벡터가 이용 가능하다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 미니서클 (minicircle) DNA, 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 등과 같은 바이러스-유도 벡터로서 에피솜에 의해 유지될 수도 있거나, 예를 들어, MMLV, HIV-1, ALV, 등과 같은 레트로바이러스 (retrovirus) 유도 벡터는 상동 재조합 또는 무작위의 통합을 통해, 표적 세포 게놈에 통합될 수도 있다. 다시 말해서, 만능 세포는 벡터가 세포에 의해 흡수되도록 원하는 핵산을 포함하는 벡터와 접촉된다.
세포, 예를 들어, 배양물의 세포 또는 마우스의 세포를 핵산 벡터, 예를 들어, 전기천공, 칼슘 클로라이드 트랜스펙션, 및 리포펙틴과 접촉시키는 방법은 업계에 잘 알려져 있다. 대안으로, 원하는 핵산은 바이러스를 통해 세포에 제공될 수도 있다. 다시 말해서, 세포는 원하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자와 접촉된다. 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 (lentivirus)는 특히 본 발명의 방법에 적합하다. 일반적으로 사용된 레트로바이러스 벡터는 "결함이 있다", 즉, 생산적 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생산할 수 없다. 오히려, 벡터의 복제는 포장 세포주의 성장을 필요로 한다. 원하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자를 발생시키기 위해, 핵산을 포함하는 레트로바이러스 핵산은 포장 세포주에 의해 바이러스 캡시드 (capsid)에 포장된다. 다른 포장 세포주는 캡시드에 통합되는 다른 외피 단백질을 제공하며, 이 외피 단백질은 세포에 대한 바이러스 입자의 특이성을 결정한다. 외피 단백질은 적어도 3개의 타입, 동종 지향성 (ecotropic), 암포트로픽 (amphotropic) 및 이종 지향성 (xenotropic)이다. 동종 지향성 외피 단백질에 포장된 레트로바이러스, 예를 들어, MMLV는 대부분의 쥐 및 래트 세포 타입을 감염시킬 수 있고, BOSC23 (Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90: 8392-8396)과 같은 동종 지향성 포장 세포주를 사용하여 발생된다. 암포트로픽 외피 단백질을 함유하는 레트로바이러스, 예를 들어, 4070A (Danos et al, 상기)는 인간, 개 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유동물 세포 타입을 감염시킬 수 있고, PA12 (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 431-437); PA317 (Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902); GRIP (Danos et al. (1988) PNAS 85: 6460-6464)과 같은 암포트로픽 포장 세포주를 사용하여 발생된다. 이종 지향성 외피 단백질로 포장된 레트로바이러스, 예를 들어, AKR env는 쥐 세포를 제외한 대부분의 포유동물 세포 타입을 감염시킬 수 있다. 적절한 포장 세포주는 원하는 세포, 일부 예에서, 생착된 세포, 일부 예에서, 숙주의 세포, 즉 인간화된 M-CSF-/-가 포장된 바이러스 입자에 의해 표적화된다는 것을 확인하기 위해 사용될 수도 있다.
대상 세포에 원하는 핵산을 제공하는데 사용된 벡터는 전형적으로 원하는 핵산의 발현, 즉, 전사 활성화를 구동하는데 적합한 프로모터를 포함할 것이다. 이것은 보편적으로 작용 프로모터, 예를 들어, CMV-b-액틴 프로모터, 또는 유발성 프로모터, 예를 들어, 특정 세포 개체군에서 활성이거나 테트라시클린과 같은 약물의 존재에 반응하는 프로모터를 포함한다. 전사 활성화에 의해, 전사가 표적 세포에서 기저 수준 이상으로 적어도 약 10배, 적어도 약 100배, 보통 적어도 약 1000배 이상 증가될 것이다. 게다가, 대상 세포에 리프로그래밍 (reprogramming) 인자를 제공하는데 사용된 벡터는, 예를 들어, Cre/Lox와 같은 리콤비나제 시스템, 또는, 예를 들어, 헤르페스바이러스 (herpesvirus) TK, bcl-xs, 등과 같은 선택적 독성을 허용하는 유전자를 포함함으로써, 파괴된 그것들을 발현하는 세포를 사용하여 나중에 제거되어야 하는 유전자를 포함할 수도 있다.
스크리닝을 위해 원하는 후보 약제는 또한 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 산물의 용해도를 증가시키는 폴리펩티드 도메인에 융합될 수도 있다. 도메인은 한정된 프로테아제 분열 부위, 예를 들어, TEV 서열을 통해 폴리펩티드에 결합될 수도 있으며, 이것은 TEV 프로테아제에 의해 분열된다. 결합자는 또한 하나 이상의 플렉시블 (flexible) 서열, 예를 들어, 1 내지 10개의 글리신 잔기를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질의 분열은 0.5 내지 2 M 우레아의 존재시, 용해도를 증가시키는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 존재시 산물의 용해도를 유지하는 버퍼에서 수행된다. 원하는 도메인은 엔도소몰리틱 (endosomolytic) 도메인, 예를 들어, 인플루엔자 HA 도메인; 및 생산을 돕는 다른 폴리펩티드, 예를 들어, IF2 도메인, GST 도메인, GRPE 도메인, 등을 포함한다. 추가적으로 또는 대안으로, 이러한 폴리펩티드는 개선된 안정성에 대하여 생성될 수도 있다., 예를 들어, 펩티드는 PEG화될 수도 있으며, 폴리에틸렌옥시 기는 혈류의 향상된 수명을 제공한다. 폴리펩티드는 추가된 기능성을 제공하기 위해, 예를 들어, 생체 내 안정성을 증가시키기 위해 또 다른 폴리펩티드에 융합될 수도 있다. 일반적으로 이러한 융합 파트너는 안정한 혈장 단백질이며, 이것은, 예를 들어, 융합체로서 존재할 때 폴리펩티드의 생체 내 혈장 반감기를 연장시킬 수도 있으며, 특히 이러한 안정한 혈장 단백질은 면역글로불린 불변 도메인이다. 대부분의 경우에서, 안정한 혈장 단백질이 멀티머 형태, 예를 들어, 면역글로불린 또는 지질 단백질로 발견되는 경우, 이것에서 같은 또는 다른 폴리펩티드 사슬은 정상적으로 조립된 다중사슬 (multichain) 폴리펩티드를 형성하기 위해 이황화 및/또는 비공유결합되며, 폴리펩티드를 함유하는 본원의 융합체가 또한 생산되고 안정한 혈장 단백질 전구체와 실질적으로 같은 구조를 갖는 멀티머로서 이용될 것이다. 이들 멀티머는 그것들이 포함하는 폴리펩티드 약제에 관하여 균질하거나, 그것들은 하나 이상의 폴리펩티드 약제를 함유할 수도 있다.
후보 폴리펩티드 약제는 진핵 세포로부터 생산될 수도 있거나, 원핵 세포로부터 생산될 수도 있다. 그것은 언폴딩 (unfold), 예를 들어, 열 변성, DTT 환원, 등에 의해 추가로 가공될 수도 있고, 업계에 알려진 방법을 사용하여, 추가로 리폴딩 (refold)될 수도 있다. 1차 서열을 변화시키지 않는 원하는 변형은 폴리펩티드의 화학적 유도체화, 예를 들어, 아실화, 아세틸화, 카르복실화, 아미드화, 등을 포함한다. 또한 글리코실화의 변형, 예를 들어, 그것의 합성 및 가공 중에 또는 추가의 가공 단계에서 폴리펩티드의 글리코실화 패턴의 변형에 의해;, 예를 들어, 폴리펩티드를 글리코실화, 예를 들어, 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 영향을 미치는 효소에 노출함으로써 만들어지는 것들이 포함된다. 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들어, 포스포티로신, 포스포세린, 또는 포스포트레오닌을 갖는 서열이 또한 수용된다. 폴리펩티드는 단백질 가수 분해의 변성에 대한 그것들의 내성을 개선하기 위해 또는 용해도 성질을 최적화하기 위해 또는 그것들을 치료제로서 더 적합하게 만들기 위해 보통의 분자 생물학 기술 및 합성 화학 반응을 사용하여 변형될 수도 있다. 이러한 폴리펩티드의 유사체는 자연 발생한 L-아미노산 외에 잔기를 함유하는 것들, 예를 들어, D-아미노산 또는 비-자연 발생한 합성 아미노산을 포함한다. D-아미노산은 아미노산 잔기의 일부 또는 모두에 대하여 치환될 수도 있다.
후보 폴리펩티드 약제는 업계에 알려진 통상적인 방법을 사용하는 시험관 내 합성에 의해 제조될 수도 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들어, Applied Biosystems, Inc., Beckman, 등에 의한 자동화 합성기가 이용 가능하다. 합성기를 이용함으로써, 자연 발생한 아미노산은 비자연적 아미노산으로 치환될 수도 있다. 특정 서열 및 조제의 방식은 편의성, 경제성, 필요한 순도, 등에 의해 결정될 것이다. 대안으로, 후보 폴리펩티드 약제는 통상적인 재조합 합성의 방법에 따라 분리되고 정제될 수도 있다. 발현 숙주의 용해물이 제조될 수도 있고 용해물은 HPLC, 배제 크로마토그래피 (exclusion chromatography), 겔 전기 영동, 친화도 크로마토그래피 (affinity chromatography), 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제된다. 대부분의 경우, 사용되는 조성물은 생성물의 제조 및 그것의 정제 방법과 관련된 오염물질에 관하여, 원하는 산물의 적어도 20 중량%, 더 보통은 적어도 약 75 중량%, 바람직하게 적어도 약 95 중량%, 및 치료의 목적을 위해, 보통 적어도 약 99.5 중량%을 포함할 것이다. 보통, 퍼센트는 총 단백질을 기반으로 할 것이다.
일부 경우에서, 스크리닝되는 후보 폴리펩티드 약제는 항체이다. 용어 "항체" 또는 "항체 모이어티"는 에피토프에 맞고 이를 인식하는 특이적 모양을 갖는 어떤 폴리펩티드 사슬-함유 분자 구조도 포함하며, 하나 이상의 비공유 결합 상호작용은 분자 구조 및 에피토프 사이에서 복합체를 안정화시킨다. 특정 구조의 특이적 또는 선택적 맞춤 및 그것의 특이적 에피토프는 가끔 "자물쇠 및 열쇠" 맞춤으로서 나타난다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이고, 모든 공급원, 예를 들어, 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 다른 포유동물, 닭, 다른 조류, 등의 면역글로불린의 모든 타입, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 등이 "항체"인 것으로 생각된다. 본 발명에서 이용된 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수도 있다. 항체는 전형적으로 세포가 배양되는 배지에 제공된다.
후보 약제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어질 수도 있다., 예를 들어, 많은 방법이 무작위로 추출된 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하는, 생체 분자를 포함하는, 다양한 유기 화합물의 무작위의 및 지시된 합성에 이용 가능하다. 대안으로, 박테리아, 균류, 식물 및 동물 추출물의 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 이용 가능하거나 수비게 생산된다. 추가적으로, 천연 또느 합성에 의해 생산된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리학적, 생화학적 방법을 통해 쉽게 변형되고, 조합 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 알려진 약리학제는 구조적 유사체를 생산하기 위해, 지시된 또는 무작위의 화학적 변형, 예를 들어, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화, 등을 받을 수도 있다.
후보 약제는 가끔 약제가 없는 샘플과 함께, 적어도 하나의 및 보통 복수의 샘플에 약제를 투여함으로써 생물학적 활성에 대하여 스크리닝된다. 약제에 반응하는 파라미터의 변화가 측정되고, 결과는, 예를 들어, 약제의 존재시 및 부재시 다른 약제, 등으로 얻어진 참고 배양물과 비교에 의해 평가된다. 유독 물질의 효과를 방지하거나, 완화시키거나 반전시키는 후보 약제를 확인하기 위해 스크리닝이 수행된 예에서, 스크리닝은 전형적으로 유독 물질의 존재시 수행되며, 유독 물질은 결과가 결정되기 위해 가장 적절한 시간에 추가된다., 예를 들어, 후보 약제의 보호/방지 능력이 테스트되는 경우에서, 후보 약제는 유독 물질 전에, 후보 약제와 동시에, 또는 후보 약제의 처리 이후에 추가될 수도 있다. 또 다른 예로서, 유독 물질의 효과를 반전시키는 후보 약제의 능력이 테스트되는 경우, 후보 약제는 후보 약제의 처리 이후에 추가될 수도 있다. 상기 언급된 바와 같이, 샘플은 세포와 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 즉, 세포와 생착된 인간화된 M-CSF 마우스에게 제공된 후보 약제이다. 일부 예에서, 새믈은 생착되는 세포이다, 즉, 후보 약제는 이식 전에 세포에 제공된다.
후보 약제가 마우스에게 직접 투여되면, 약제는 마우스에 펩티드, 작은 분자 및 핵산의 투여를 위해 업계에 잘 알려진 많은 방법 중 어떤 것에 의해서도 투여될 수 있다., 예를 들어, 약제는 구강으로, 점막으로, 국부적으로, 피부 내로, 또는 주사, 예를 들어, 예를 들어, 복강 내, 피하, 근육 내, 정맥 내, 또는 두개 내 주사, 등에 의해 투여될 수도 있다. 약제는 버퍼에서 투여될 수도 있거나, 그것은, 예를 들어, 적절한 약학적으로 허용 가능한 비히클과 조합에 의해 다양한 제형 중 어떤 것으로 통합될 수도 있다. "약학적으로 허용 가능한 비히클"은 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 사용되는 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열된 비히클일 수도 있다. 용어 "비히클"은 본 발명의 화합물이 포유동물에 투여를 위해 함께 제조되는 희석제, 보조제, 첨가제, 또는 담체를 나타낸다. 이러한 약학적 비히클은 지질, 예를 들어, 리포솜, 예를 들어, 리포솜 덴드리머; 액체, 예를 들어, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참기름 등, 식염수; 검 아카시아, 젤라틴, 녹말풀, 탈크 (talc), 케라틴, 콜로이드 실리카, 요소, 등을 포함하는 물 및 오일일 수 있다. 추가로, 보제, 안정화제, 농후화제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수도 있다. 약학적 조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들어, 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 미소구체, 및 에어로졸의 조제물로 조제될 수도 있다. 약제는 투여 후 전신성일 수도 있거나 영역 투여, 교내 투여의 사용, 또는 임플란트 (implant)의 투여, 또는 임플란트화 (implantation) 부위에서 활성 투여량을 유지하는 작용을 하는 임플란트의 사용에 의해 국부화될 수도 있다. 활성제는 즉각적인 활성을 위해 조제될 수도 있거나 지속되는 방출을 위해 조제될 수도 있다. 일부 조건, 특히 중추신경계 조건에 대하여, 혈액-뇌 장막 (BBB)을 통과하는 약제를 조제하는 것이 필요할 수도 있다. 혈액-뇌 장막 (BBB)을 통한 약물 전달에 대한 하나의 계획은 만니톨 또는 류코트리엔과 같은 삼투의 방법에 의해, 또는 브래디키닌과 같은 혈관 작용 물질의 사용에 의해 생화학적으로, BBB의 분열을 수반한다. BBB 분열 작용제는 조성물이 정맥 내 주사에 의해 투여될 때 약제와 함께 동시 투여될 수 있다. BBB를 통과하기 위한 다른 계획은 카베올린-1 매개 통과 세포 외 배출 (transcytosis), 글루코스 및 아미노산 담체와 같은 담체 매개 수송자, 인슐린 또는 트랜스페린에 대한 수용체-매개 트랜스시토시스, 및 p-당단백질과 같은 활성 유출 수송자를 포함하는, 내인성 수송 시스템의 사용을 수반할 수도 있다. 활성 수송 모이어티는 또한 혈관의 내벽을 통한 수송을 가능하게 하기 위해 본 발명에 사용되는 치료적 화합물에 접합될 수도 있다. 대안으로, BBB를 통한 약제의 약물 전달은, 예를 들어, Ommaya 레저버 (reservoir)를 통한 국부적 전달에 의해, 예를 들어, 척수 내 전달에 의해 (예컨대, 미국 특허 번호 5,222,982 및 5385582, 본원에 참고로 포함됨);, 예를 들어, 유리체 내 (intravitreally) 또는 두개 내 (intracranially)에 볼루스 (bolus) 주사에 의해, 예를 들어, 주사기에 의해;, 예를 들어, 대류와 함께 연속적 주입에 의해, 예를 들어, 캐뉼라 삽입 (cannulation)에 의해 (예컨대, 미국 출원 번호 20070254842, 본원에 참고로 포함됨); 또는 약제가 반전 가능하게 부착된 장체를 이식함으로써 (예컨대, 미국 출원 번호 20080081064 및 20090196903, 본원에 참고로 포함됨) 될 수도 있다.
약제(들)이 이식 전에 세포에 제공되면, 약제는 편리하게 용액, 또는 쉽게 녹는 형태로 배양의 세포의 배지에 추가된다. 약제는, 단속적 또는 연속적 스트림으로서, 플로-스루 (flow-through) 시스템에 추가될 수도 있거나, 대안으로, 화합무르이 볼루스를, 개별적으로 또는 점진적으로, 다른 정적인 용액에 추가한다. 플로-스루 시스템에서, 2개의 유동체가 사용되며, 하나는 생리학적 중성 용액이고, 다른 것은 테스트 화합물이 추가된 같은 용액이다. 첫 번째 유동체가 세포를 통과한 후, 이어서 두 번째가 통과한다. 단일 용액 방법에서, 테스트 화합물의 볼루스는 세포를 둘러싼 배지의 부피에 추가된다. 배양 배지의 성분의 전체 농도는 볼루스의 추가로, 또는 플로 스루 방법에서 2개의 용액 사이에서 크게 변화해서는 안된다.
복수의 검정이 다양한 농도에 대한 차별적 반응을 얻기 위해 다른 약제 농도로 동시에 수행될 수도 있다. 업계에 알려진 바와 같이, 약제의 효과적인 농도의 결정은 전형적으로 1:10, 또는 다양한 로그 스케일 희석으로부터 발생하는 다양한 농도를 사용한다. 농도는 2차 일련의 희석으로 추가로 정제될 수도 있다. 필요하면, 전형적으로, 이들 농도 중 하나는 음성 대조군의 역할을 한다, 즉, 0 농도 또는 약제의 검출의 수준 이하 또는 표현형의 검출 가능한 변화를 제공하지 않는 약제의 농도 이하이다.
후보 약제에 대한 인간화된 M-CSF 마우스의 세포의 반응의 분석은 약제의 처리 후 어떤 시점에서도 수행될 수 있다., 예를 들어, 세포는 후보 약제와 접촉한 후 1, 2, 또는 3일, 가끔 4, 5, 또는 6일, 가끔 8, 9, 또는 10일, 가끔 14일, 가끔 21일, 가끔 28일, 가끔 1개월 이상, 예를 들어, 2개월, 4개월, 6개월 이상 후에 분석될 수도 있다. 일부 구체예에서, 분석은 다양한 시점에서 분석을 포함한다. 분석을 위한 시점(들)의 선택은 당업자에게 쉽게 이해되기 때문에, 수행되는 분석의 타입에 기초할 것이다.
분석은 세포 생존, 세포 증식, 세포 정체성, 세포 형태, 및 세포 기능을 측정하기 위해 여기에 설명된 또는 업계에 알려진 파라미터 중 어떤 것을 측정하는 단계를 포함할 수도 있는데, 특히 그것들이 면역 세포의 세포에 적용될 수도 있기 때문이다., 예를 들어, 유동 세포분석법이 조혈 세포의 총 수 또는 특정 조혈 세포 타입의 세포의 수를 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 조직 화학법 또는 면역 조직 화학법, 예를 들어, DNA 단편화를 측정하기 위해 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 표지법 (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling; TUNEL), 또는 세포 표면에서 포스파티딜세린에 결합하는 Annexin V를 검출하기 위해 면역 조직 화학법이 세포의 아폽토시스성 상태를 결정하기 위해 수행될 수도 있다. 유동 세포분석법은 또한 분화된 세포 및 분화된 세포 타입의 비율을 평가하기 위해, 예를 들어, 조혈 세포의 약제의 존재시 분화하는 능력을 결정하기 위해 이용될 수도 있다. ELISA, 웨스턴, 및 노던 블롯이 생착된 인간화된 M-CSF 마우스에서 발현된 시토킨, 케모킨, 면역글로불린, 등의 수준을 결정하기 위해, 예를 들어, 생착된 세포의 기능을 평가하기 위해 수행될 수도 있다. 면역 세포의 기능을 테스트하기 위한 생체 내 검정, 뿐만 아니라 당뇨병, 자가 면역 질환, 이식편대 숙주 질환 (graft vs host disease), AMD, 등과 같이 원하는, 특정 질환 또는 장애와 관련된 검정이 또한 수행될 수도 있다. 예컨대, Current Protocols in Immunology (Richard Coico, ed. John Wiley & Sons, Inc. 2012) 및 Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997), 이것의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
그래서, 예를 들어, 인간 병원체에 대한 약제의 효과를 결정하는 방법이 제공되며, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스를 인간 병원체의 유효량, 마우스에서 감염을 생산하기 위해 필요한 병원체의 양인, 병원체의 유효량에 노출시키는 단계; 병원체가 마우스를 감염시키는 것을 허용하는 단계; 약제의 존재시 시간이 흐름떼 따라 감염의 파라미터를 측정하는 단계; 및 측정값을 약제에 노출되지 않은 생착된 인간화된 M-CSF 마우스의 측정값에 비교하는 단계를 포함한다. 약제는 항병원성, 예를 들어, 항-에스. 티피, 선택된 기간 동안 약제의 단일 투여 도는 둘 이상 투여 후 이어서 마우스의 혈액 또는 조직에서 약제의 양을 적어도 절반으로 감소시키는 약제인 것으로 결정된다.
또 다른 예로서, 원하는 병원성 분리체 또는 균주가 약물 내성, 예를 들어, 다중 약물 내성인지 결정하는 방법이 제공된다. 이들 방법에서, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스, 예를 들어, 생착된 Rag2-/-IL2rg-/- hM-CSF 마우스는 원하는 인간 병원성 분리체 또는 균주에 노출되며, 병원체의 유효량은 마우스에서 감염을 생산하기 위해 필요한 병원체의 양이다; 병원체는 마우스를 감염시키는 것이 허용된다.
감염의 파라미터, 예를 들어, 마우스의 혈액 또는 조직에서 원하는 분리체 또는 균주의 역가, 원하는 분리체 또는 균주의 마우스에서 감염을 유지하는 능력, 또는 약물의 투여 후 시점에서 원하는 분리체 또는 균주의 마우스에서 번식하는 능력이 약물의 존재시 측정되고; 그 측정값은 약제에 노출되지 않은 병원체로 감염된, 생착된 인간화된 M-CSF 마우스의 측정값에 비교된다. 원하는 약물의 예는 아목시실린, 앰피실린, 세포탁심, 세프트리악손, 세프타지딤, 클로람페니콜, 시프로프록사신, 코-트리목사졸, 에르타페넴, 이미페넴, 플로오로퀴놀론 (예를 들어, 시프로프록사신, 가티플록사신, 오플록사신), 스트렙토마이신, 술파디아진, 술파메톡사졸, 테트라시클린, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 약물 또는 약물의 조합은 감염을 생산하는, 원하는 분리체 또는 균주에 노출 후 적어도 1주, 10일, 2주, 3주, 또는 4주 후에 투여된다.
대상체 마우스의 사용의 다른 예는 본원의 다른 곳에서 제공된다. 본 개시에 설명된 유전적으로 변형된 및 생착된 마우스의 추가적 적용은 본 개시의 판독시 당업자에게 명백할 것이다.
시약, 장치 및 키트
상기 설명된 방법 중 하나 이상을 실행하기 위한 이들의 시약, 장치 및 키트가 또한 제공된다. 이들의 대상 시약, 장치 및 키트는 크게 다를 수도 있다.
일부 구체예에서, 시약 또는 키트는 설명된 방법에 사용되는 하나 이상의 약제를 포함할 것이다., 예를 들어, 키트는 인간화된 M-CSF 마우스를 포함할 수도 있다. 키트는 인간화된 M-CSF 마우스를 사육하기 위한 시약, 예를 들어, 프라이머를 포함할 수도 있고, 일부 예에서, 인간화된 M-CSF 마우스를 유전자형 분석하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 인간화된 M-CSF 마우스에 이식을 위해 인간 조혈 세포 또는 인간 조혈 전구 세포의 풍부한 개체군, 또는 인간화된 M-CSF 마우스에 이식을 위해 조혈 세포의 개체군 또는 인간의 조혈 세포의 풍부한 개체군을 제조하기 위한 시약을 포함할 수도 있다. 다른 시약은, 예를 들어, 후보 약제, 예를 들어, 조혈 세포의 다른 타입에 의해 발현된 마커, 또는 특정 시토킨, 케모킨, 등을 검출하기 위한 시약에 특이적인 하나 이상의 항체의 존재/부재시, 조혈 세포의 생존 및/또는 기능을 결정하는 시약을 포함할 수도 있다. 다른 시약은 배양 배지, 배양 보충물, 매트릭스 조성물, 등을 포함할 수도 있다.
상기 성분에 더하여, 대상 키트는 대상 방법을 실행하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 이들 설명서는 다양한 형태로 대상 키트에 존재할 수도 있으며, 이것들 중 하나 이상이 키트에 존재할 수도 있다. 이들 설명서가 존재할 수도 있는 하나의 형태는 키트의 포장, 패키지 삽입물, 등에 적합한 매체 또는 기질, 정보가 인쇄된 종이의 조각 또는 조각들에 대하여 인쇄된 정보와 같다. 또 다른 방법은 컴퓨터로 판독 가능한 매체, 예를 들어, 정보가 기록되는 디스켓, CD, 등일 수도 있다. 존재할 수도 있는 또 다른 방법은 제거된 부위의 정보에 접근하기 위해 인터넷을 통해 사용될 수도 있는 웹사이트 주소이다. 어떤 편리한 방법도 키트에 존재할 수 있다.
실시예
다음 실시예는 당업자들에게 본 발명을 만들고 사용하는 방법의 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제안되고, 발명자가 그들의 발명으로 생각되는 것들의 범위를 제한하지 않고 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험인 것을 나타내지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험적 오차 및 편차가 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 성분은 중량 성분고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 정도이다.
콜로니 자극 인자-1 (CSF-1) 또는 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF)는 혈액 생성 (hematopoiesis)을 촉진하는 것으로 발견된 초기 시토킨 중 하나이다. 조혈계에서, M-CSF는 일반 골수성 전구체 (common myeloid progenitor; CMP) 단계에서 출발하여, 골수성 전구체에서 특이적으로 작용하며, 단핵세포/마크로파지 계통으로 CMP의 분화를 선호하는 것으로 생각된다 (Sherr, C.J. et al. (1988) Macrophage colony-stimulating factor, CSF-1, and its proto-oncogene-encoded receptor, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 53 Pt 1: 521-530). 게다가, M-CSF는 마크로파지의 생존, 부착 및 운동성에 필수적이다 (Pixley, F.J., and Stanley, E.R. (2004) CSF-1 regulation of the wandering macrophage: complexity in action, Trends Cell Biol. 14: 628-638; Socolovsky, M. et al. (1998) Cytokines in hematopoiesis: specificity and redundancy in receptor function, Adv. Protein Chem 52: 141-198; Stanley, E.R. et al. (1997) Biology and action of colony-stimulating factor-1, Mol. Reprod. Dev. 1997;46: 4-10). 골수성 분화에서 그것의 주요한 역할 외에, M-CSF는 파골세포의 분화, 자성 생식관 (female reproductive tract)의 세포의 분화, 생존 및 증식, 및 태반의 형성에 필수적이다 (Pixley et al. (2004); Socolovsky et al. (1998); Stanley et al. (1997)). M-CSF는 섬유아세포, 골수 (BM) 기질 세포, 활성화된 T 세포 및 마크로파지, 및 분비 상피 세포를 포함하는 다양한 세포에 의해 생산된다. M-CSF는 M-CSF 수용체 (Fms; CD1 15)를 통해 신호 전달하고 그것의 수용체의 M-CSF에 의한 결찰은 Fms의 티로신 인산화 및 여러 숙주 세포 단백질, 예를 들어, Grb2, Shc, Sos1 및 p85의 티로신 인산화를 일으킨다 (Pixley et al. (2004); Stanley et al. (1997); Rohrschneider, L.R. et al. (1997) Growth and differentiation signals regulated by the M-CSF receptor, Mol. Reprod. Dev. 46: 96-103; Yeung, Y.G. and Stanley, E.R. (2003) Proteomic approaches to the analysis of early events in colony-stimulating factor-1 signal transduction, Mol. Cell. Proteomics 2: 1143-1155).
발명자는 인간화된 마우스에서 결함이 있는 인간 골수 분화가 골수성 분화를 촉진하는 특이적 신호의 결핍 때문일 수도 있다는 것을 가정하였다. 이것을 입증하기 위해, 발명자는 적절한 조직으로부터 생리적 수준으로 인간 M-CSF를 분비하는 인간화된 마우스의 새로운 세대를 조작하였다. 이들 인간화된 M-CSF 마우스의 분석은 인간 M-CSF의 질적으로 및 양적으로 둘 다 정상적인 발현을 나타냈다. 인간 CD34+ 세포와 생착된 인간화된 M-CSF 마우스의 분석은 다양한 조직에서 인간 단핵세포/마크로파지의 증가된 빈도를 나타냈다. 게다가, 이들 마우스로부터 얻어진 인간 단핵세포/마크로파지는 향상된 기능적 성질을 나타냈다.
여기에 설명된 인간화된 M-CSF 마우스는 인간 골수 세포의 증가된 빈도 및 기능을 나타낸다. 재조합 활성화 유전자 2 (Rag2; Genbank 수납 번호 1.NM_009020.3) 및 감마 사슬 (γc, "인터류킨 2 수용체, 감마 사슬" 또는 IL2RG로도 알려짐; Genbank 수납 번호 1.NM_013563.3) (Balb/c Rag2-/- γc-/- 마우스)이 없는 마우스 M-CSF 자리에 인간 M-CSF의 삽입은 질적으로 및 양적으로 둘 다 이들 마우스의 인간 M-CSF의 충실한 발현을 일으켰다. 인간화된 M-CSF (M-CSFh/h) 신생의 새끼에서 인간 태아 간-유도 조혈 줄기 및 전구 세포 (CD34+)의 간 내 이동은 골수, 비장, 및 말초 혈액에서 인간 단핵세포/마크로파지의 더 효율적인 분화 및 향상된 빈도를 일으켰다. 게다가, M-CSF 마우스는 이식의 20주 후에도 인간 단핵세포/마크로파지 분화를 지지하는, 지속적인 능력을 나타냈다. 게다가, M-CSFh/h 마우스는 대조군 변형되지 않은 마우스와 달리, 간 및 폐를 포함하는 다양한 조직 내에 상주하는 인간 단핵세포/마크로파지를 함유한다. 인간화된 M-CSF 마우스로부터 얻어진 인간 단핵세포/마크로파지는 또한 이동, 식균작용, 활성화 및 LPS에 대한 반응과 같은, 증가된 기능적 성질을 나타낸다.
실시예 1: 세포 제조, 분석 방법, 및 검정
CD34 + 세포 분리 및 이식. 인간 태아 간 샘플은 Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY의 인간 태아 간 조직 보관소 및 Advance Biosciences Resources, Inc., Alameda, CA로부터 얻어졌다. 인간 조직을 수반하는 모든 실험을 Yale Human Investigations Committee의 승인 하에 수행하였다.
인간 CD34+ 세포를 분리하기 위해, 태아 간 샘플을 PBS로 한 번 헹궜고 작은 조각으로 잘랐고, 37 ℃에서 45분 동안 콜라게나제 D (100 ng/mL)를 처리하였다. 단일 세포 현탁액을 제조하였고 단핵 세포를 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리하였다 (림프구 분리 배지, MP biomedicals). CD34+ 세포를 세포에 항-인간 CD34 미크로비드를 처리한 후 이어서 MACS™ 기술 (Miltenyi Biotech)로 분리하였다.
이식을 위해, 신생의 새끼 (출생 1일)를 4시간 이상 2번의 별도의 조사 (2 x 150 cGy)로 반치사로 조사하였고 PBS의 20 μL 중의 1 x 105 내지 2 x 105 정제된 인간 CD34+ 세포를 22-게이지 바늘 (Hamilton Company, Reno, NV)을 사용하여 간에 주사하였다.
중간엽 기질 세포 (MSC) 분리 및 배양. 마우스의 긴 뼈를 분리하였고 작은 조각으로 잘랐고 37 ℃에서 45분 동안 콜라게나제 D 및 P (25 ng/mL)의 칵테일로 분해하였다. 현탁 세포를 분리하였고 MSC 배양 배지 (Stem Cell Technologies)의 존재시 도말하였다. 배양의 2주 후, CD45+Sca1+CD90+ 세포를 분리하였고 배양하였다.
항체 및 유동 세포분석법. 단일 세포 현탁액을 각각 FACS Calibur 또는 LSRII 및 CELLQUEST™ 소프트웨어, FACS DIVA™ 소프트웨어 (BD Biosciences, San Jose, CA) 또는 FLOWJO™ 소프트웨어 (Tree Star, Inc., Ashland, OR)를 사용하여 유동 세포분석법에 의해 분석하였다. FACS ARIA™ 세포 분류기 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 한정된 하위 개체군의 세포 분류를 수행하였다.
다음 인간항체를 연구에 사용하였다: CD11b, CD14, CD33, CD34, CD38, CD40, CD45, CD80, CD86, CD90 및 HLA-DR.
다음 마우스 항체를 본 연구에 사용하였다: CD11b, CD40, CD45, CD80, CD86, F4/80, Gr1, H2Kd 및 IAd.
세포 배양. 쥐 마크로파지 분화를 위해, BM 세포를 10% FCS 및 필수 보충물 (2mM L-글루타민, 1 % 페니실린-스트렙토마이신 및 1 mM 비필수 아미노산)이 들어있는 DMEM의 존재시 6 웰 플레이트에 도말하였다. 세포에 재조합 쥐 M-CSF (10 ng/mL) 또는 재조합 인간 M-CSF (10 ng/mL)를 7일 동안 처리하였다. 세포 배양물 상층액을 3일마다 제거하였고 배양물을 신선한 배지 및 시토킨으로 대체하였다.
활성화, 식균작용 및 이동과 같은, 인간 마크로파지 연구를 위해, 비장의 2 x 105 CD45+CD14+CD33+ 세포를 분리하였고 15% 인간 AB 혈청 및 필수 보충물 (2mM L-글루타민, 1 % 페니실린-스트렙토마이신 및 1 mM 비필수 아미노산)이 들어있는 DMEM에서 시험관 내에서 배양하였다.
활성화, 식균작용 및 이동 검정. 생체 내에서 LPS 자극을 위해, 마우스에 LPS (100 ng/g 체중)를 복강 내 주사하였다. 시험관 내에서 LPS 자극을 위해, LPS (10 ng/mL)를 세포에 추가하였고 1 또는 2일 동안 배양하였다. 시험관 내에서 폴리 I:C 자극을 위해, 세포를 폴리 I:C (10 μg/mL)의 존재시 6 또는 12시간 동안 배양하였다.
식균작용 검정을 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용 가능한 VYBRANT™ 식균작용 검정 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다.
이동 검정을 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용 가능한 QCM™ 주화성 세포 이동 검정 키트 (Millipore)를 사용하여 수행하였다.
RNA 추출 및 실시간 PCR. 전체 RNA를 상업적으로 이용 가능 키트 시스템 (RNEASY™ Mini 키트, Qiagen)을 사용하여 분리하였다. cDNA를 올리고 dT 프라이머 및 확장 역전사효소 (Roche)를 사용하여 합성하였다. PCR 반응을 제조사의 지시에 따라 다음 유전자 특이적 프라이머 쌍을 사용하는 7500 실시간 PCR 시스템 및 파워 SYBR™ Green PCR 마스터 믹스 (Applied Biosystems)를 사용하여 2배수로 수행하였다: 인간 CSF1 (센스: 5'-TACTGTAGCCACATGATTGGGA-3' (SEQ ID NO: 1) 및 안티센스: 5'-CCTGTGTCAGTCAAAGGAAC-3' (SEQ ID NO: 2)), 마우스 csf 1 (센스: 5'-CGACATGGCTGGGCTCCC-3' (SEQ ID NO: 3) 및 안티센스: 5'-CGCATGGTCTCATCTATTAT-3' (SEQ ID N0: 4), 인간 IFNα (센스: 5'-GTACTGCAGAATCTCTCCTTTCTCCTG-3' (SEQ ID N0: 5) 및 안티센스: 5'-GTGTCTAGATCTGACAACCTCCCAGGCACA-3' (SEQ ID N0: 6)), 인간 IFNb (센스: 5'-TTGTGCTTCTCCACTACAGC-3' (SEQ ID N0: 7) 및 안티센스: 5'-CTGTAAGTCTGTTAATGAAG-3' (SEQ ID N0: 8)), 마우스 hprt 프라이머 (센스: 5'-AAGGACCTCTCGAAGTGTTGGATA-3' (SEQ ID N0: 9) 및 안티센스: 5'-CATTTAAAAGGAACTGTTGACAACG-3' (SEQ ID NO: 10)) 및 인간 HPRT 프라이머 (센스: 5'-CTTCCTCCTCCTGAGGAGTC-3' (SEQ ID N0: 11) 및 안티센스: 5'-CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3' (SEQ ID N0: 12)). 정상적인 PCR을 위해, 표적 세포의 DNA를 상업적으로 이용 가능 키트 (DNEASY™ 혈액 및 조직 키트, Qiagen)를 사용하여 추출하였고 PCR 분석을 유전자 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다.
ELISA. 시토킨 정량 연구를 위해, 혈액 혈청 또는 세포 배양물 상층액을 수거하였고 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용 가능 인간 IL6 및 인간 TNF ELISA 키트 (Ray Biotech, Inc., GA)를 사용하는 ELISA를 받았다.
조직학. 고체 기관을 4% PFA로 고정하였다. 고정된 기관을 파라핀에 임베딩 (embed) 하였다 (Blue RiBbon; Surgipath Medical Industries). 블록을 절단하였고 5 μm 박편을 H&E 염색으로 염색한 후 이어서, 통상적인 방법에 의해 커버슬립 (coverslip)을 놓았다. 박편을 어떤 배지도 없이 유지하였다. 디지털 광학 현미경 이미지를 상온에서, Zeiss Axio Imager.A1 현미경 (2x 및 10x 대물 렌즈), AxioCam MRc5 카메라, 및 AxioVision 4.7.1 이미징 소프트웨어 (Carl Zeiss Microimaging LLC)로 기록하였다.
통계 분석. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타난다. 통계적 유의성을 양측 스튜던트 t 테스트 (2-sided Student t test)를 사용하여 평가하였다. P 값 > 0.05을 *로 나타냈다.
실시예 2: 생착을 위해 유전적으로 변형된 마우스
인간 M-CSF 녹인 (Knockin) 계획. 단일 표적화 단계에서 마우스 M-CSF 핵산 서열을 인간 M-CSF 핵산 서열로 대체하기 위한 표적화 건물 (VELOCIGENE® Allele Identification Number 5093)을 전술된 바와 같이 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 구성하였다 (Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotechnol. 21: 652-659).
마우스 및 인간 M-CSF DNA을 각각 박테리아 인공 염색체 (BAC) RPCI-23, 클론 373B18 및 BAC RPCI-11, 클론 101M23으로부터 얻었다. 간단히 말해서, 엑손 2에서 비암호화 엑손 9의 633nt 다운스트림으로 연장된 17.5 kb 인간 M-CSF 서열, 및 플록스트 (floxed) 약물 선택 카세트를 플랭킹하는 마우스 M-CSF 업스트림 및 다운스트림 상동성 팔을 함유하는 간극 회복 (gap repair) 클로닝에 의해 발생한 선형화된 표적화 구조를 Rag2+/- γc-/- 마우스 배아 줄기 (ES) 세포로 전기천공하였으며, 이것은 상업적으로 이용 가능 V17 ES 세포주 (BALB/c x 129 F1)로 만들어졌다. M-CSF 유전자의 이형접합성 결실을 갖는 마우스 ES 세포를 마우스 Csf1 유전자의 인트론 2 (TUF 프라이머, 5'-CCAGGAATGTCCACTATGGATTC-3' (SEQ ID NO: 13); TUP 프로브, 5' ACTGCTCCTTGACCCTGCTCTGACTCA-3' (SEQ ID NO: 14); TUR 프라이머, 5'-TGGGCTGACTTCCCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 15)) 및 3' 플랭킹 서열 (TDF 프라이머, 5'-TTAGGTGCTAGTAGGCTGGAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 16); TDP 프로브, 5'-TGCAATCGCAGCTTCTCTCCTTACTAGGCT-3 (SEQ ID NO: 17); TDR 프라이머, 5'-AATAGGAAGAACGAACAGGTCTAATACC-3' (SEQ ID NO: 18))에서 서열을 인식하는 2개의 TaqMan qPCR 검정으로 대립유전자 손실 (Loss-of-Allele) 스크리닝에 의해 확인하였다. 마우스 유전자의 인간 CSF1 유전자로 동시 대체를 CSF1의 인트론 2 (정방향 프라이머, 5'-GCTGCTTGCCTGGGTTAGTG-3' (SEQ ID NO: 19); 프로브, 5'-TGCCCAGGAACATCAACCACTGATTCTG-3' (SEQ ID NO: 20); 역방향 프라이머, 5'-GAGGGACAGCAGACCTCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 21)) 및 네오마이신 저항 (neor) 카세트 중 하나의 카피 (정방향 프라이머, 5'-GGTGGAGAGGCTATTCGGC-3' (SEQ ID NO: 22); 프로브, 5'-TGGGCACAACAGACAATCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 23); 역방향 프라이머, 5'-GAACACGGCGGCATCAG-3' (SEQ ID NO: 24)의 서열 중 하나의 카피를 검출하는 대립유전자의 획득 (Gain-of-Allele) TaqMan 검정에 의해 확인하였다; 도 8 참조. CSF1 서열을 인식하는 qPCR 검정은 마우스 게놈으로부터 DNA를 증폭시키지 않는다. 표적화 ES 세포로부터 유도된 마우스의 유전형을 확인하기 위해 같은 검정이 사용되었다. 약물 선택 카세트의 Cre-매개 절제를 neor TaqMan 검정으로 확인하였다. 모든 프라이머-프로브 세트는 Biosearch Technologies에 의해 공급되었다. 프로브는 그것들의 5' 엔드에 6-카르복시-플루오레세인 (FAM) 및 그것들의 3' 엔드에 BHQ-1로 라벨링되었다.
약물 선택 카세트를 제거하기 위해 정확하게 표적화된 ES 세포를 추가로 일시적인 Cre-발현 벡터로 전기천공하였다. 약물 카세트 없이, 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIMICE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아에 도입하였다 (Poueymirou et al. (2007)). 인간화된 M-CSF 유전자 (VG 5093)를 함유하는 VELOCIMICE® (기증자 ES 세포로부터 완전히 유도된 F0 마우스)을 대립유전자 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립유전자의 획득에 대하여 유전자형을 확인함으로써 확인하였다 (Valenzuela et al. (2003)).
마우스 유지. Balb/c-Rag-/- γc-/- M-CSFm/m, Balb/c-Rag-/- γc-/- M-CSFh/m 및 Balb/c-Rag-/- γc-/- M-CSFh/h 마우스를 Yale University의 동물 관리 시설에서 특정 병원체가 없는 조건 하에 유지하였다. 모든 마우스 실험은 Yale University의 Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.
인간화된 M-CSF 마우스 만들기. 마우스의 인간 M-CSF의 생리학적 발현이 인간화된 마우스에서 인간 마크로파지의 개선된 분화를 일으키는지 입증하기 위해, Balb/c Rag-/- γc-/- 마우스를 인간 M-CSF를 발현하도록 조작하였다. Rag-/- γc-/- 결함이 있는 Balb/c 종은 마우스의 인간 면역계의 연구를 위한 성공적인 모델 시스템의 역할을 한다 (Traggiai E et al. (2004) Development of a human immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science 304: 104-107). 이들 마우스에서 인간 M-CSF의 상기-생리학적 발현을 막기 위해서, 마우스 M-CSF 암호화 서열을 인간 대응물로 대체하는 계획을 이용하였다. 단일 표적화 단계에서, M-CSF 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)의 대부분을 인간 M-CSF 암호화 서열 (VELOCIGENE® Allele Identification Number 5093)로 대체하는 구조 (도 8)를 상기 설명된 바와 같이 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 구성하였다 (Valenzuela et al. (2003)). 참고로, 마우스의 프로모터 및 다른 조절 요소 (예를 들어, 5'UTR)를 이 벡터에 보존하였다. 선형화된 표적화 벡터를 Balb/c x 129 Rag+/- γc-/- 배아 줄기 세포로 전기천공하였다. 정확하게 표적화된 ES 세포를 약물 선택 카세트를 제거하기 위해 일시적 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공하였다. 약물 카세트 없이, 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIMICE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아에 도입하였다 (Poueymirou et al. (2007)). 인간화된 M-CSF 유전자 (VG 5093)을 함유하는 VELOCIMICE® (기증자 ES 세포로부터 완전히 유도된 F0 마우스)을 대립유전자 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립유전자의 획득에 대하여 유전자형을 확인함으로써 확인하였다 (Valenzuela et al. (2003)). 자손을 순차적 상호교배하여, 마우스 및 인간 M-CSF (M-CSFm/h; 이형접합성 녹인)로 생식계열 전송된 마우스 및 인간 M-CSF (M-CSFh/h; 동형접합성 녹인)만으로 생식계열 전송된 마우스를 발생시켰다.
인간화된 M-CSF 마우스의 특성화. 인간화된 M-CSF 마우스에서 인간 M-CSF의 발현을 평가하였다. M-CSFm/m 또는 M-CSFh/h 마우스의 장기를 수확하였고 종 특이적인 프라이머를 사용하여 쥐 및 인간 M-CSF mRNA 발현에 대하여 분석하였다. 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, M-CSF는 BM, 비장, 혈액, 간, 뇌, 폐, 고환 및 신장을 포함하는, 분석된 장기 중 대부분에서 발현된다. 하지만, 흉선 및 피부는 M-CSF의 검출 가능한 발현을 나타내지 않았다. 그중에서도, 마우스 및 인간 M-CSF의 발현 패턴은 각각 M-CSFm/m 및 M-CSFh/h 마우스 사이에서 비슷했다. 그 다음, M-CSFm/m, M-CSFm/h, 및 M-CSFh/h 마우스에서 마우스 및 인간 M-CSF의 발현 수준을 정량화하였다. 골수 중간엽 기질 세포 (MSC)를 분리하였고 M-CSF mRNA의 발현 수준을 실시간-PCR을 사용하여 정량하였고 (도 1c) 및 (분비된) M-CSF 단백질을 ELISA (도 1d)를 사용하여 정량하였다. M-CSFm/m 마우스는 마우스 M-CSF만을 발현하였고, M-CSFm/h 마우스는 마우스 및 인간 M-CSF 둘 다를 발현하였고 M-CSFh/h 마우스는 인간 M-CSF만을 발현하였다. 인간 M-CSF의 발현 수준은 마우스 M-CSF와 비슷했다. 이들 데이터에 따라, 혈청의 CSF-1의 분석은 m/m, h/m, 및 h/h 마우스에서 CSF-1 단백질의 비슷한 발현 수준을 나타냈다 (도 1e). 반접합 (hemizygocity)은 감소된 유전자 및 단백질 발현 수준으로 이어지지 않으며, 유전자-투약 수준은 이 시토킨을 제한하지 않는 것으로 보인다.
특히 뼈 및 혈액 생성에서, 마우스 M-CSF를 인간 마우스 M-CSF로 대체하는 것이 유해한 효과를 일으키는지 조사하기 위해, M-CSFh/h 마우스를 다양한 나이에서 분석하였다. 초기 연구는 결함이 있는 M-CSF를 신호 전달 (Csf1op/op 및 Csflr-/-)을 가진 마우스가 치아 맹출 장애 (tooth eruption failure) 및 뼈 장애를 나타낸다는 것이 기록되었다. (Dai, X.M. et al. (2002) Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in 골석화증, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects, Blood 99: 111-120; Felix, R. et al. (1990) Macrophage colony stimulating factor restores in vivo bone resorption in the op/op osteopetrotic mouse, Endocrinology 127: 2592-2594; Wiktor-Jedrzejczak, W. et al. (1990) Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) moouse, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 4828-4832; Yoshida, H. et al. (1990) The murine mutation 골석화증 is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene, Nature 345: 442-444). 반대로, M-CSFh/h 마우스는 정상 치아 및 뼈 성질을 나타냈다. 게다가, Csf1op/op 및 Csf1r-/- 마우스와 달리, BM의 전체 세포 함량 (도 2a), BM, 비장 (SP) 및 말초 혈액 (PB)에서 골수 세포의 빈도 (도 2b) 및 BM 및 SP에서 마크로파지의 빈도는 M-CSFm/m, M-CSFh/m 및 M-CSFh/h 마우스에서 비슷했다. 이 관찰에 따라, HSC 구획 (including long term-HSC, short term-HSCs and multipotent 전구체) 및 골수 전구세포 구획 (일반 골수성 전구체, 과립구 단핵 전구 세포 거핵구 적혈구 전구체)의 빈도는 M-CSFm/m, M-CSFh/m 및 M-CSFh/h 마우스에서 비슷했다 (도 9). M-CSFh/h 마우스에서 정상적인 혈액 생성 및 뼈 발달에 대한 가능한 설명은 인간 M-CSF가 마우스 세포와 교차 반응성이다는 것일 수도 있다. 이것을 입증하기 위해서, 전체 BM 세포를 M-CSFm/m로부터 분리하였고 재조합 쥐 M-CSF 또는 재조합 인간 M-CSF의 존재시 배양하였다. 시토킨의 부재시 배양된 BM 세포가 생존에 실패한 반면에, 인간 또는 마우스 M-CSF의 존재시 배양된 세포는 시험관 내 분화의 비슷한 수준을 나타냈다 (도 2d). 이들 시험관 내 분화된 마크로파지의 동시 자극 분자 및 MHC의 발현에 대한 분석은 인간 또는 마우스 M-CSF의 존재시 이들 분자의 비슷한 수준을 나타냈다 (도 2e). 우리의 발견과 일치하게, 이전의 연구는 인간 M-CSF가 마우스 표적 세포에서 활성인 반면에, 마우스 M-CSF는 인간 세포와 교차 반응성이 아니다는 것을 입증하였다 (Sieff, C.A. (1987) Hematopoietic growth factor, J. Clin. Invest. 79: 1549-1557).
실시예 3: 인간화된 M-CSF 마우스에서 인간 단핵세포/마크로파지의 분화
M-CSF 인간화의 영향을 평가하기 위해서, 반치사로 조사된 신생의 Rag-/- γc-/- M-CSFm/m, Rag-/- γc-/- M-CSFh/m 및 Rag-/- γc-/- M-CSFh/h 새끼를 ~ 2 x 105 정제된 인간 태아 간 CD34+ 세포로 간 내 (i.h.) 이식하였다. 기증자 (인간 CD45 발현에 기반) 기원의 세포를 확인하기 위해 이식 8주 후에 수령체를 채혈하였다. 이식 12주 후, 수령체를 희생시켰고 그것들의 BM, SP 및 PB를 수확하였다. 분석은 M-CSFm/m 마우스와 비교하여 M-CSFh/m 및 M-CSFh/h 마우스의 BM, SP 및 PB에서 CD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 상대적 및 절대적 빈도의 증가를 나타냈다 (도 3a-c). M-CSFh/m 마우스가 CD14+CD33+ 세포의 증가된 빈도를 나타내지만, CD14+CD33+ 세포의 최대 빈도는 M-CSFh/h 마우스에서 발견되었다. 흥미롭게도, 이 증가에 더하여, CD14+CD33+ 세포의 빈도는 또한 M-CSFh/m 및 M-CSFh/h 마우스의 BM, SP 및 PB에서 증가하였다 (도 3a).
인간 M-CSF 녹인 마우스가 지속적인 인간 골수 발생을 지지하는지 분석하기 위해서, 수령체를 이식 12, 16 및 20주 후 분석하였다. 인간 CD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지 계통 세포는 M-CSFm/m 마우스에서 이식 16주에 약간 감소하였고 20주 후 크게 감소되었지만, 16 및 20주에도 M-CSFh/m 및 M-CSFh/h 마우스에서 많은 수의 인간 CD14+CD33+ 세포가 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 인간 CD14+CD33+ 세포의 최대 빈도는 M-CSFh/h 마우스에서 나타났다 (도 4a 및 4b).
그 다음, 인간화된 M-CSF 마우스가 인간 조직 마크로파지의 효과적인 분화를 지지하는지를 평가하였다. 이것을 위하여, M-CSFm/m, M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스를 PBS로 관류하였고 그것들의 장기 (간, 폐 및 피부 등)을 수확하였다. 복막의 세포를 복강을 PBS로 세척함으로써 얻었다. 단일 세포 현탁액을 제조하였고 인간 CD14+CD33+ 세포의 빈도를 계산하였다. 예상된 바와 같이, 인간 CD14+CD33+ 세포의 빈도는 M-CSFm/h 및 M-CSFh/h 마우스 둘 다의 간, 폐 및 복막에서 크게 증가되었다. 하지만, 피부 외식편 (explant)의 분석은 M-CSFm/m 및 M-CSFm/h 마우스 사이의 인간 CD14+CD33+ 세포의 비슷한 빈도를 나타냈지만, 이들 세포의 큰 증가가 M-CSFh/h 마우스의 피부 외식편에서 관찰되었다 (도 5). 종합해보면, 이들 데이터는 마우스에서 인간 M-CSF의 발현이 인간 HSC의 골수/마크로파지 계통 분화를 개선한다는 것을 제안한다.
실시예 4: 인간화된 M-CSF 마우스에서 인간 단핵세포/마크로파지 기능
인간화된 M-CSF 마우스에서 인간 CD14+CD33+ 단핵세포/마크로파지가 정상적으로 기능하는지 평가하기 위해서, 생체 내 및 시험관 내 둘 다의 기능적 연구를 수행하였다. 반치사로 조사된 M-CSFm/m 및 M-CSFm/h 새끼에 태아 간 CD34+ 세포를 주입하였고 이식 12주 후, 기증자 유도 혈액 생성을 평가하였고 수령체 마우스에 LPS 또는 PBS를 주입하였다. LPS 주입 2일 후, 수령체를 비장에서 인간 CD14+CD33+ 세포의 빈도에 대하여 분석하였다. PBS 주입된 그룹과 비교할 때, LPS 주입이 M-CSFm/m 마우스에서 단핵세포/마크로파지 계통 세포의 적당한 증가만을 유발하는 한편, LPS 주입된 M-CSFm/h 마우스는 비장에서 인간 CD14+CD33+ 세포의 여러 배 증가를 나타냈다 (도 6a). 그 다음, 이들 세포의 LPS에 반응하여 염증 전 시토킨을 생산하는 능력을 검사하였다.
인간 CD34+ 세포와 생착된 M-CSFm/m 및 M-CSFm/h 마우스 인간 CD34+ 세포에 LPS를 주입하였다. 주입 6시간 후, 마우스를 채혈하였고 인간 및 마우스 IL6 및 TNFα의 혈청 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. 인간화된 M-CSF 마우스에서 단핵세포/마크로파지의 증가된 빈도와 일치하게도, 인간 IL6 및 TNFα의 증가된 수준을 M-CSFm/h 마우스에서 검출하였다. 이들 시토킨의 기저 수준이 M-CSFm/h 마우스에서 더 높지만, LPS 자극은 혈청에서 증가된 수준의 인간 IL6 및 TNFα를 발생시켰다 (도 6b 및 6c). 그 다음, 단핵세포/마크로파지 (인간화된 M-CSF 마우스로부터 얻음)의 시험관 내에서 염증 전 시토킨을 분비하는 능력을 분석하였다. 인간 CD34+ 세포로 재구성의 12주 후, 인간 CD14+CD33+ 세포를 M-CSFm/m 또는 M-CSFh/h 마우스의 비장으로부터 분리하였고, 24 또는 48시간 동안 시험관 내에서 LPS로 자극하였다. 세포 배양물 상층액에서 IL-6 및 TNFα 시토킨의 수준을 ELISA에 의해 평가하였다. 생체 내 데이터에 따라, M-CSFh/h 마우스로부터 정제된 CD14+CD33+ 세포는 LPS에 반응하여 이들 시토킨의 증가된 수준을 분비하였다 (도 7a 및 7b). 유사하게는, 인간화된 M-CSF 마우스로부터 분리된 인간 CD14+CD33+ 세포는 폴리 I:C 자극에 반응하여 인터페론-a and 인터페론-β mRNA의 증가된 수준을 발현하였다 (도 7c). 최종적으로, 인간화된 M-CSF 마우스로부터 얻은 인간 단핵세포/마크로파지의 식균작용, 이동 및 활성화 성질을 분석하였다. 인간 CD34+로부터 정제된 인간 CD14+CD33+ 세포는 재구성되었고, M-CSFh/h 마우스는 식균작용 성질을 나타내고 (도 7d) 케모킨 Mip3β에 반응하여 증가된 주화성을 나타냈다 (도 7e). 예상된 바와 같이, M-CSFh/h 마우스로부터 얻은 인간 단핵세포/마크로파지는 시험관 내에서 LPS 자극에 반응하여, CD40, CD80 및 CD86, 및 HLA-DR을 포함하는, 동시 자극 분자의 상향 조절에 기초하여 평가된 바와 같이 향상된 활성화 성질은 향상된 활성화 성질을 나타냈다 (도 7f). 전체적으로, 인간 M-CSF in the 인간화된 마우스의 존재시 분화된 인간 단핵세포/마크로파지는 증가된 기능적 성질을 나타낸다.
인간 기원의 완벽히 재구성된 및 기능적 혈액 형성/ 면역계를 가진 마우스를 발생시키는 것은 분야에서 큰 도전이었다. 지금까지, 3개의 마우스 종 (NOD-scid γc-/-, [NSG], NOD/Shi-scid YC-/- [NOG], 및 Balb/c-Rag-/- γc-/-")이 개발되었다. 이들 각각의 종에 의해 수여된 이점에도 불구하고, 이들 마우스에서 인간 혈액 생성은 불완전하다.
이 주요 기술적 도전을 극복하기 위해, 마우스 CSF-1 유전자를 그것의 인간 대응물로 대체하였다. 이것은 인간 조혈 줄기 및 전구 세포로 재구성된 마우스에서 효율적인 인간 마크로파지 분화를 일으켰다. 인간화된 CSF-1 마우스의 분석은 BM, 비장 및 말초 혈액에서 인간 단핵세포/마크로파지의 효율적인 분화를 나타냈다. 게다가, 인간 마크로파지는 이들 마우스에서 폐 및 간을 포함하는 여러 다른 조직에서 검출되었으며, 인간화된 마우스에서 CSF-1의 존재는 인간 조직 마크로파지의 분화를 촉진하는데 충분하다는 것을 나타낸다. 추가적으로, CSF1m/m 및 CSF1h/h 마우스로부터 분리된 인간 단핵세포/마크로파지를 수반하는, 여기에 설명된 기능적 연구는 CSF1h/h 마우스의 세포가 식균작용, 이동, 활성화 및 시토킨 분비와 같은 기능을 수행하는데 더 좋다는 것을 나타낸다. 이들 발견에 기초하여, 인간 CSF-1의 존재시 분화하는 단핵세포/마크로파지는 더 잘 기능한다는 것으로 생각될 수도 있다.
인간 CSF-1을 발현하는 Balb/c-Rag-/- γc-/- 마우스의 새로운 라인을 발생시키기 위해 VELOCIGENE® 유전적 조작 기술을 사용하였다. 따라서, 마우스 CSF-1 암호화 영역을 조절 요소, 예를 들어, 마우스 csf1 유전자의 프로모터를 방해하지 않는 인간 대응물로 대체하였다. 이것은 마우스 조절 요소 및 인간 CSF-1 암호화 영역을 함유하는 키메라 유전자를 발생시켰다. 이들 마우스의 발현 연구는 이 키메라 유전자가 질적인 및 양적인 방식 둘 다에서 충실하게 발현된다는 것을 나타냈다.
마우스 마크로파지의 분화시 CSF-1의 역할은 잘 확립되어있다. CSF-1 (Csf1op/op) 또는 그것의 수용체 (Csf1r-/-)가 없는 마우스는 마크로파지 및 파골세포 빈도의 심각한 감소, 골석화증 (osteopetrosis), 치아 맹출 장애, 신경계, 남녀 생식력, 피부 및 활막을 포함하는, 다양한 조직의 발달 결함을 나타낸다. 이들 연구가 마우스에서 CSF-1의 역할에 매우 중요한 통찰력을 제공하는 한편, 인간 혈액 형성시 CSF-1의 중요성은 크게 알려지지 않은 채로 남아있다. 이 점에서, 여기에 설명된 마우스는 그것이 인간 혈액 형성 및 조혈 세포 기능에서 시토킨의 생리학 및 기능의 개선된 이해를 가능하게 할 것이기 때문에, 유용한 도구의 역할을 할 것이다. 추가적으로, 이 마우스는 질환을 모델링하고 인간 면역계에 대한 약제의 효과를 테스트하기 위해 사용될 수도 있다. 이 마우스 모델은 여러 인간 장애 및 질환의 병리생리학의 이해 및 치료에 유용한 도구이다.
전술된 내용은 단지 본 발명의 원칙을 설명한다. 당업자들이 다양한 배열을 고안할 수 있을 것이며, 여기에 명백하게 설명되거나 나타나지 않지만, 본 발명의 원칙을 구현하고 그것의 사상 및 범위 내에 포함된다. 게다가, 여기에 인용된 모든 예시 및 조건부 언어는 원칙적으로 본 발명의 원칙을 이해하는데 있어서 독자를 돕기 위한 것이고 그 개념은 발명자에 의해 업계의 발전에 기여하였고, 이러한 특이적으로 인용된 예시 및 조건에 대하여 제한하지 않는 것으로 해석될 수 있다. 게다가, 여기에서 본 발명의 원칙, 양태, 및 구체예뿐만 아니라 이들의 특정 예시를 인용하는 모든 진술은 이들의 구조적 및 기능적 등가물을 포함하기 위한 것이다. 추가적으로, 이러한 등가물은 현재 알려진 등가물 및 미래에 개발되는 등가물 둘 다, 즉, 구조에 상관없이, 같은 기능을 수행하도록 개발된 어떤 요소도 포함한다. 그러므로, 본 발명의 범위는 여기에 나타나고 설명된 전형적인 구체예를 제한하기 위한 것이 아니다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구항에 의해 구현된다.
SEQUENCE LISTING <110> Murphy, Andrew J. Stevens, Sean Rathinam, Chozhavendan Eynon, Elizabeth Manz, Markus Flavell, Richard <120> Humanized M-CSF Mice <130> REGN-002WO <150> 61/442,946 <151> 2011-02-15 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 tactgtagcc acatgattgg ga 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cctgtgtcag tcaaaggaac 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 cgacatggct gggctccc 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 cgcatggtct catctattat 20 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 gtactgcaga atctctcctt tctcctg 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 gtgtctagat ctgacaacct cccaggcaca 30 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 ttgtgcttct ccactacagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 ctgtaagtct gttaatgaag 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 aaggacctct cgaagtgttg gata 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 catttaaaag gaactgttga caacg 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 cttcctcctc ctgaggagtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 cctgaccaag gaaagcaaag 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 ccaggaatgt ccactatgga ttc 23 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 actgctcctt gaccctgctc tgactca 27 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 tgggctgact tcccaaagg 19 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 ttaggtgcta gtaggctgga aagtg 25 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 tgcaatcgca gcttctctcc ttactaggct 30 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 aataggaaga acgaacaggt ctaatacc 28 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 gctgcttgcc tgggttagtg 20 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 tgcccaggaa catcaaccac tgattctg 28 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 gagggacagc agacctcaga ag 22 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 ggtggagagg ctattcggc 19 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 tgggcacaac agacaatcgg ctg 23 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 gaacacggcg gcatcag 17

Claims (23)

  1. 인간 조혈 세포에 대한 독성에 관하여 후보 약제를 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 제1 인간화된 M-CSF 마우스를 후보 약제와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 인간화된 M-CSF 마우스는 인간 조혈 세포와 생착된, 단계; 및
    (b) 상기 약제와 접촉한 제1 인간화된 M-CSF 마우스 내 인간 조혈 세포의 생존 및/또는 기능을 인간 조혈 세포와 생착되고 상기 약제와 접촉하지 않은 제2 인간화된 M-CSF 마우스 내 인간 조혈 세포의 생존 및/또는 기능과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 인간화된 M-CSF 마우스의 게놈 내로 통합된 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 인간 M-CSF 단백질을 암호화 하고 마우스 M-CSF 유전자 자리에서 마우스 M-CSF 유전자의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되며,
    제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 Rag2 유전자 넉아웃(knockout) 및 IL2rg 유전자 넉아웃을 포함하거나, 또는 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 모두는 NOD-scid γc-/- 마우스, NOD/Shi-scid γc-/- 마우스 또는 Balb/c Rag2-/- γc-/- 마우스이고,
    후보 약제와 접촉한 제1 마우스 내 조혈 세포의 생존 및/또는 기능의 감소는 후보 약제가 조혈 세포에 대해 독성이라는 것을 나타내는,
    후보 약제를 스크리닝하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 상기 핵산 서열의 2개의 카피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 적어도 하나의 마우스 M-CSF 대립유전자에서 같은 눌(null) 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3 항에 있어서, 눌(null) 돌연변이는 마우스 M-CSF 엑손 2 내지 9의 결실인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 적어도 하나의 마우스 M-CSF 대립유전자에서 같은 눌(null) 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5 항에 있어서, 눌(null) 돌연변이는 마우스 M-CSF 엑손 2 내지 9의 결실인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 골수, 비장, 혈액, 간, 뇌, 폐, 고환 및 신장에서 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 M-CSF RNA를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 Rag2 유전자 넉아웃(knock-out) 및 IL2rg 유전자 넉아웃(knock-out)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 NOD-scid γc-/- 마우스, NOD/Shi-scid γc-/- 마우스, 또는 Balb/c Rag2-/- γc-/- 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 Rag2 유전자 넉아웃 및 IL2rg 유전자 넉아웃을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 모두는 NOD-scid γc-/- 마우스, NOD/Shi-scid γc-/- 마우스 또는 Balb/c Rag2-/- γc-/- 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 독성 약제로부터 인간 조혈 세포를 보호하거나, 인간 조혈 세포에 대한 독성 약제의 영향을 완화을 완화시키거나, 또는 인간 조혈 세포에 대한 독성 약제의 영향을 반전시키는 능력에 관하여 후보 약제를 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 인간 조혈 세포와 생착된 제1 인간화된 M-CSF 마우스를 독성 약제와 접촉시키는 단계;
    (b) 인간 조혈 세포와 생착된 제2 인간화된 M-CSF 마우스를 독성 약제와 접촉시키는 단계;
    (c) 제1 인간화된 M-CSF 마우스를 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 후보 약제와 접촉한 제1 인간화된 M-CSF 마우스 내 인간 조혈 세포의 생존 및/또는 기능을 후보 약제와 접촉하지 않은 제2 인간화된 M-CSF 마우스 내 인간 조혈 세포의 생존 및/또는 기능과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 인간화된 M-CSF 마우스의 게놈 내로 통합된 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 인간 M-CSF 단백질을 암호화 하고 마우스 M-CSF 유전자 자리에서 마우스 M-CSF 유전자의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되며,
    제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 Rag2 유전자 넉아웃(knockout) 및 IL2rg 유전자 넉아웃을 포함하거나, 또는 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 모두는 NOD-scid γc-/- 마우스, NOD/Shi-scid γc-/- 마우스 또는 Balb/c Rag2-/- γc-/- 마우스이고,
    후보 약제와 접촉한 제1 마우스 내 조혈 세포의 생존 및/또는 기능의 증가는 후보 약제가 독성 약제로부터 조혈 세포를 보호하거나, 인간 조혈 세포에 대한 독성 약제의 영향을 완화시키거나, 또는 인간 조혈 세포에 대한 독성 약제의 영향을 반전시키는 것을 나타내는,
    후보 약제를 스크리닝하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 상기 핵산 서열의 2개의 카피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 적어도 하나의 마우스 M-CSF 대립유전자에서 같은 눌(null) 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 눌(null) 돌연변이는 마우스 M-CSF 엑손 2 내지 9의 결실인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 적어도 하나의 마우스 M-CSF 대립유전자에서 같은 눌(null) 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 눌(null) 돌연변이는 마우스 M-CSF 엑손 2 내지 9의 결실인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 마우스와 독성 약제를 접촉시키는 단계는 제1 마우스와 후보 약제와 접촉시키는 단계 후에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 마우스와 독성 약제를 접촉시키는 단계는 제1 마우스와 후보 약제를 접촉시키는 단계 전에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 마우스와 독성 약제를 접촉시키는 단계는 제1 마우스와 후보 약제를 접촉시키는 단계와 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 골수, 비장, 혈액, 간, 뇌, 폐, 고환 및 신장에서 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 M-CSF RNA를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 각각은 Rag2 유전자 넉아웃(knock-out) 및 IL2rg 유전자 넉아웃(knock-out)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인간화된 M-CSF 마우스 모두는 NOD-scid γc-/- 마우스, NOD/Shi-scid γc-/- 마우스 또는 Balb/c Rag2-/- γc-/- 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
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