ES2685790T3 - Ratones humanizados con M-CSF - Google Patents

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ES2685790T3 ES12746594.6T ES12746594T ES2685790T3 ES 2685790 T3 ES2685790 T3 ES 2685790T3 ES 12746594 T ES12746594 T ES 12746594T ES 2685790 T3 ES2685790 T3 ES 2685790T3
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Andrew J. Murphy
Sean Stevens
Chozhavendan RATHINAM
Elizabeth Eynon
Markus G. Manz
Richard Flavell
George D. Yancopoulos
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Yale University
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Institute for Research in Biomedicine IRB
Yale University
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un raton humanizado con M-CSF, que comprende: un bloqueo del gen Rag2; un bloqueo del gen IL2rg; y una secuencia de acido nucleico incorporada en el genoma del raton humanizado con M-CSF, secuencia que codifica una proteina del factor estimulante de colonias de macrofagos humano (hM-CSF) y esta unida operativamente al promotor endogeno del gen del M-CSF de raton en el locus M-CSF de raton, en donde el raton expresa ARN del M-CSF codificado por la secuencia de acido nucleico en medula osea, bazo, sangre, higado, cerebro, pulmon, testiculos y rinones.

Description

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locus M-CSF de ratón, la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano puede reemplazar algunos o todos las secuencias de ratón, por ejemplo, exones y/o intrones, al locus M-CSF. En algunos de dichos casos, la secuencia de ácido nucleico M-CSF humano está integrada en el locus M-CSF de ratón de manera que la expresión de la secuencia del M-CSF humano está regulada por las secuencias reguladoras nativas o endógenas en el locus M-CSF
5 de ratón. En otras palabras, la(s) secuencia(s) reguladora(s) a la que la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano está unida operativamente son las secuencias reguladoras del M-CSF nativas en el locus M-CSF de ratón.
En algunos casos, la integración de la secuencia del M-CSF humano no afecta la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia del M-CSF humano. Por ejemplo, si la secuencia del M-CSF humano se integra en la secuencia codificante como una inteína, o la secuencia del M-CSF humano comprende un péptido 2A, la secuencia del M-CSF humano se transcribirá y traducirá simultáneamente con el gen en el que se ha integrado la secuencia del M-CSF humano. En otros casos, la integración de la secuencia del M-CSF humano interrumpe la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia del M-CSF humano. Por ejemplo, tras la integración de la secuencia del
15 M-CSF humano mediante recombinación homóloga, se puede eliminar parte o la totalidad de la secuencia codificante en el locus de integración, de modo que la secuencia del M-CSF humano se transcribe en su locus. En algunos de dichos casos, la integración de la secuencia del M-CSF humano crea una mutación nula, y por lo tanto, un alelo nulo. Un alelo nulo es una copia mutante de un gen que carece por completo de la función normal de ese gen. Esto puede ser el resultado de la ausencia completa del producto génico (proteína, ARN) a nivel molecular, o la expresión de un producto génico no funcional. En el nivel fenotípico, un alelo nulo es indistinguible de una deleción del locus completo.
En algunos casos, el ratón humanizado con M-CSF comprende una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano. Por ejemplo, el ratón puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido 25 nucleico. En otras palabras, un alelo en un locus comprenderá la secuencia de ácido nucleico, mientras que el otro será el alelo endógeno. Por ejemplo, tal como se ha tratado anteriormente, en algunos casos, la secuencia de ácido nucleico del M-CSF humano está integrada en el locus M-CSF de ratón de manera que crea un alelo nulo para el M-CSF de ratón. En algunas de dichas realizaciones, el ratón humanizado con M-CSF puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico que codifica, es decir, el ratón humanizado con M-CSF comprende un alelo nulo para el M-CSF de ratón (el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico) y un alelo M-CSF endógeno (tipo silvestre
o de otro modo). En otras palabras, el ratón es un ratón M-CSFh/m, donde "h" representa el alelo que comprende la secuencia humana y "m" representa el alelo endógeno. En otros casos, el humanizado con M-CSF comprende dos copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del M-CSF humano. Por ejemplo, el ratón puede ser homocigoto para la secuencia de ácido nucleico, es decir, ambos alelos para un locus en el genoma diploide
35 comprenderán la secuencia de ácido nucleico, es decir, el ratón humanizado con M-CSF comprende dos alelos nulos para el M-CSF de ratón (el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico). En otras palabras, el ratón es un ratón M-CSFh/h.
Sorprendentemente, ratones humanizados con M-CSF, por ejemplo, tal como los descritos anteriormente, por ejemplo, ratones M-CSFh/h y M-CSFh/m, exhiben desarrollo y funciones normales o de tipo silvestre de los macrófagos y monocitos y tejidos que se desarrollan a partir de células del linaje de los macrófagos, por ejemplo, hueso. Por ejemplo, los ratones humanizados exhiben propiedades dentales y óseas normales así como un contenido de médula ósea, frecuencias de células mieloides en la médula ósea, bazo y sangre periférica y frecuencias de macrófagos en la médula ósea y el bazo normales.
45 En algunos casos, el ratón humanizado con M-CSF comprende otras modificaciones genéticas. Por ejemplo, el ratón humanizado con M-CSF puede comprender al menos un alelo nulo para el gen Rag2 ("gen 2 activador de la recombinación", cuya secuencia codificante puede encontrarse en el número de acceso Genbank 1.NM_009020.3). En algunas realizaciones, el ratón humanizado con M-CSF comprende dos alelos nulos para Rag2. En otras palabras, el ratón humanizado con M-CSF es homocigoto nulo para Rag2. Como otro ejemplo, el ratón humanizado con M-CSF comprende al menos un alelo nulo para el gen IL2rg ("receptor gamma de interleuquina 2", también conocido como cadena gamma común o yC, cuya secuencia codificante puede encontrarse en el número de acceso Genbank 1.NM_013563.3). En algunas realizaciones, el ratón humanizado con M-CSF comprende dos alelos nulos para IL2rg. En otras palabras, el ratón humanizado con M-CSF es homocigoto nulo para IL2rg. En algunas
55 realizaciones, el ratón comprende un alelo nulo para Rag2 e IL2rg, es decir, es Rag2-/-IL2RG-/-. También se contemplan otras modificaciones genéticas. Por ejemplo, el ratón humanizado con M-CSF puede comprender modificaciones en otros genes asociados con el desarrollo y/o función de las células hematopoyéticas y el sistema inmune, por ejemplo, el reemplazo de uno u otros genes de ratón con una secuencia de ácido nucleico que codifica el ortólogo humano. Además o como alternativa, el ratón humanizado con M-CSF puede comprender modificaciones en genes asociados con el desarrollo y/o función de otras células y tejidos, por ejemplo, genes asociados con trastornos o enfermedades humanas o genes que, cuando se modifican en ratones, proporcionan modelos de ratón de trastornos o enfermedades humanas.
En algunos aspectos de la invención, el ratón humanizado con M-CSF, por ejemplo, un ratón Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSF ,
65 se injerta o trasplanta, con células. Las células pueden ser células mitóticas o células post-mitóticas, e incluyen células de interés tales como células madre pluripotentes, por ejemplo, células ME, células MPi y células germinales
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son capaces de modular (es decir, promover o suprimir) el desarrollo y/o actividad de células hematopoyéticas, por ejemplo, la actividad de linfocitos B, linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, etc., por ejemplo, en un estado saludable o enfermo, por ejemplo, para identificar nuevas terapias y/o desarrollar una mejor comprensión de las bases moleculares del desarrollo y la función del sistema inmune; para agentes que son tóxicos
5 para las células hematopoyéticas, por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, etc., y progenitores de las mismas; y para agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de agentes tóxicos en células hematopoyéticas, por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, etc., y combinaciones de las mismas; etc. Como otro ejemplo adicional, los ratones modificados genéticamente descritos en el presente documento proporcionan un sistema útil para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a una terapia de enfermedad, por ejemplo, proporcionando una plataforma in vivo para cribar la capacidad de respuesta del sistema inmune de un individuo a un agente, por ejemplo, un agente terapéutico, para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a ese agente.
En ensayos de cribado para agentes biológicamente activos, ratones humanizados con M-CSF, por ejemplo, ratones
15 Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSF, que se han injertado con células hematopoyéticas humanas y, en algunos casos, infectadas con patógenos humanos, o células que se injertan en un ratón humanizado con M-CSF, se ponen en contacto con un agente candidato de interés y se evalúa el efecto del agente candidato mediante el control de uno o más parámetros de salida. Estos parámetros de salida pueden reflejar la viabilidad de las células, por ejemplo, el número total de células hematopoyéticas o el número de células de un tipo de células hematopoyéticas particular, o del estado apoptótico de las células, por ejemplo, la cantidad de fragmentación del ADN, la cantidad de zeiosis celular, la cantidad de fosfatidilserina en la superficie de la célula y similares mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Como alternativa o además, estos parámetros de salida pueden reflejar la capacidad de diferenciación de las células, por ejemplo, las proporciones de células diferenciadas y tipos de células diferenciadas. Como alternativa
o además, estos parámetros de salida pueden reflejar la función de las células, por ejemplo, las citoquinas y
25 quimioquinas producidas por las células, la capacidad de las células para llegar a casa y extravasarse a un sitio de desafío, la capacidad de las células para modular, es decir, promover o suprimir, la actividad de otras células in vitro
o in vivo, etc. Otros parámetros de salida pueden reflejar la extensión de la infección de patógenos en el animal, por ejemplo, el título de patógeno en el ratón, la presencia de granulomas en el ratón, etc.
Los parámetros son componentes cuantificables de las células, particularmente componentes que se pueden medir con precisión, deseablemente en un sistema de alto rendimiento. Un parámetro puede ser cualquier componente celular o producto celular, incluido el determinante de la superficie celular, receptor, proteína o modificación conformacional o postraduccional de los mismos, lípido, hidrato de carbono, molécula orgánica o inorgánica, ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADN, etc. o una porción que procede de dicho componente celular o combinaciones
35 de los mismos. Si bien la mayoría de los parámetros proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos será aceptable un resultado semicuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir un solo valor determinado, o pueden incluir la media, el valor de la media o la varianza, etc. Característicamente, se obtendrá un intervalo de valores de lectura de parámetros para cada parámetro a partir de una multiplicidad de los mismos ensayos. Se espera una variabilidad y se obtendrá un intervalo de valores para cada uno de los conjuntos de parámetros de prueba utilizando métodos estadísticos estándar con un método estadístico común utilizado para proporcionar valores únicos.
Los agentes candidatos de interés para el cribado incluyen compuestos conocidos y desconocidos que abarcan numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, que pueden incluir moléculas organometálicas,
45 moléculas inorgánicas, secuencias genéticas, vacunas, antibióticos u otros agentes sospechosos de tener propiedades antibióticas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, agentes que han sido aprobados como productos farmacéuticos para su uso en seres humanos, etc. Un importante aspecto de la invención es evaluar los fármacos candidatos, que incluyen controles de toxicidad; y similares.
Los agentes candidatos incluyen moléculas orgánicas que comprenden grupos funcionales necesarios para las interacciones estructurales, particularmente enlaces de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente, al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos, a menudo, comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos
55 también se encuentran entre las biomoléculas, incluyendo péptidos, polinucleótidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Se incluyen fármacos farmacológicamente activos, moléculas genéticamente activas, etc. Los compuestos de interés incluyen agentes quimioterapéuticos, hormonas o antagonistas de hormonas, etc. Los ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados para la invención son los descritos en, "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y., (1996), novena edición. También se incluyen toxinas y agentes de guerra biológicos y químicos, por ejemplo, véase Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, Nueva York, 1992).
Los agentes candidatos de interés para el cribado también incluyen ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos
65 que codifican ARNip, ARNhc, moléculas antisentido o ARNmi o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos. Se encuentran disponibles muchos vectores útiles para transferir ácidos nucleicos a células diana. Los vectores pueden
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Además de los componentes anteriores, los presentes kits incluirán adicionalmente instrucciones para poner en práctica los presentes métodos. Estas instrucciones pueden estar presentes en los presentes kits en diversas de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que pueden estar presentes estas instrucciones es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, uno o más trozos de
5 papel en los que se imprime la información, en el empaquetado del kit, en un prospecto, etc. Sin embargo, otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, etc., en el que se ha registrado la información. Otro medio que puede estar presente es la dirección de un sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y una descripción completas de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo 15 que los inventores consideran como su invención ni tienen la intención de representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la
20 atmosférica o próxima a esta.
El factor 1 estimulante de colonias (CSF-1) o el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, del inglés "Macrophage Colony Stimulating Factor") es una de las primeras citoquinas que se descubrió para promover la hematopoyesis. En el sistema hematopoyético, se cree que el M-CSF actúa específicamente sobre los progenitores 25 mieloides, a partir de la etapa del progenitor mieloide común (PMC) y para favorecer la diferenciación de los PMC en el linaje monocito/macrófago (Sherr, C.J. et al. (1988) Macrophage colony-stimulating factor, CSF-1, and its protooncogene-encoded receptor, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 53 Pt 1:521-530). Además, el M-CSF es necesario para la supervivencia, la adhesión y la motilidad de los macrófagos (Pixley, F.J., and Stanley, E.R. (2004) CSF-1 regulation of the wandering macrophage: complexity in action, Trends Cell Biol. 14:628-638; Socolovsky, M. et 30 al. (1998) Cytokines in hematopoiesis: specificity and redundancy in receptor function, Adv. Protein Chem. 52:141198; Stanley, E.R. et al. (1997) Biology and action of colony--stimulating factor-1, Mol. Reprod. Dev. 1997, 46, 4-10). Además de su papel clave en la diferenciación mieloide, el M-CSF es vital para la diferenciación de osteoclastos, para la diferenciación, supervivencia y proliferación de las células del tracto reproductivo femenino, y para la formación de placenta (Pixley et al. (2004); Socolovsky et al. (1998); Stanley et al. (1997)). El M-CSF lo producen 35 varias células que incluyen fibroblastos, células del estroma de médula ósea (MO), macrófagos y linfocitos T activados y células epiteliales secretoras. Las señales del M-CSF a través del receptor del M-CSF (Fms; CD115) y la ligadura de su receptor por el M-CSF dan como resultado la fosforilación de tirosina de Fms y la posterior fosforilación de varias proteínas de células hospedadoras, tales como Grb2, Shc, Sos1 y p85 (Pixley et al. (2004); Stanley et al. (1997); Rohrschneider, L.R. et al. (1997) Growth and differentiation signals regulated by the M-CSF
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Los inventores plantearon la hipótesis de que la diferenciación mieloide humana defectuosa en los ratones humanizados podría deberse a la falta de señales específicas que promuevan la diferenciación mieloide. Para 45 validar esto, los inventores diseñaron una nueva generación de ratones humanizados para secretar el M-CSF humano a niveles fisiológicos a partir de los tejidos apropiados. El análisis de estos ratones humanizados con M-CSF reveló una expresión normal, tanto cualitativa como cuantitativamente, del M-CSF humano. El análisis de ratones humanizados con M-CSF injertados con células CD34+ humanas indicó frecuencias aumentadas de monocitos/macrófagos humanos en diversos tejidos. Además, los monocitos/macrófagos humanos obtenidos a partir
50 de estos ratones exhibieron propiedades funcionales mejoradas.
Los ratones humanizados con M-CSF descritos en el presente documento muestran frecuencias y funciones aumentadas de células mieloides humanas. La inserción del M-CSF humano en el locus M-CSF de ratón de ratones Balb/c deficientes en la recombinación que activa el gen 2 (Rag2; número de acceso Genbank 1.NM_009020.3) y la 55 cadena gamma (γc, también conocida como "cadena gamma del receptor de interleuquina 2" o IL2RG; número de acceso Genbank 1.NM_013563.3) (ratones Balb/c Rag2-/-γc-/-) dieron como resultado la expresión fiel del M-CSF humano en estos ratones tanto cualitativa como cuantitativamente. La transferencia intrahepática de células madre y progenitoras hematopoyéticas derivadas del hígado fetal humano (CD34+) en ratones recién nacidos humanizados con M-CSF (M-CSFh/h) da como resultado una diferenciación más eficaz y frecuencias mejoradas de 60 monocitos/macrófagos humanos en la médula ósea, bazo y sangre periférica. Además, los ratones M-CSFh/h exhibieron habilidades sostenidas para apoyar la diferenciación de monocitos/macrófagos humanos incluso después de 20 semanas del trasplante. Además, Los ratones M-CSFh/h contienen monocitos/macrófagos humanos residentes dentro de diversos tejidos, incluyendo hígado y pulmones, a diferencia de los ratones control no modificados. Los monocitos/macrófagos humanos obtenidos de los ratones humanizados con M-CSF también muestran propiedades
65 funcionales aumentadas tales como migración, fagocitosis, activación y repuestas al LPS.
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Mantenimiento del ratón. Los ratones Balb/c-Rag2-/-γc-/-M-CSFm/m, Balb/c-Rag2-/-γc-/-M-CSFh/m y Balb/c-Rag2-/-γc-/M-CSFh/h se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en las instalaciones de cuidados de animales de la Universidad de Yale. Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Yale.
5 Fabricación de ratones humanizados con M-CSF. Para validar si la expresión fisiológica del M-CSF humano en un ratón da como resultado una diferenciación mejorada de macrófagos humanos en los ratones humanizados, los ratones Balb/c Rag2-/-γc-/-se diseñaron para expresar el M-CSF humano. La cepa Balb/c con deficiencia de Rag2-/γc-/-sirve como sistema modelo exitoso para el estudio del sistema inmune humano en ratones (Traggiai E et al. (2004) Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science 304:104107). Con el fin de evitar la expresión supra-fisiológica del M-CSF humano en estos ratones, se adoptó una estrategia para reemplazar la secuencia de codificación del M-CSF de ratón con la contraparte humana. Una construcción (Figura 8) para reemplazar, en una única etapa de direccionamiento, se construyó la mayoría del marco de lectura abierto del M-CSF con secuencia de codificación del M-CSF humano (Identificación de Alelo
15 VELOCIGENE® Número 5093), utilizando la tecnología VELOCIGENE® como se descrió previamente (Valenzuela et al., (2003)). Cabe destacar que, el promotor y otros elementos reguladores (tales como 5’UTR) del ratón se conservaron en este vector. El vector de direccionamiento linealizado se sometió a electroporación en las células madre embrionarias Balb/c x 129 Rag2+/-γc-/-. Las células ME correctamente dirigidas se electroporaron adicionalmente con un vector transitorio que expresa Cre para eliminar el casete de selección de fármaco. Se introdujeron clones de células ME dirigidas sin casete de fármaco en un embrión de ratón de fase celular 8 mediante el método VELOCIMOUSE® (Poueymirou et al., (2007)). Se identificaron VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ME donante) que portaban el gen M-CSF humanizado (VG 5093) por genotipado para la pérdida del alelo de ratón y ganancia del alelo humano utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al. 2003)). A través del entrecruzamiento secuencial de progenies, se generaron ratones
25 quiméricos Balb/c Rag2-/-γc-/-y ratones transmitidos por línea germinal con el M-CSF de ratón y humano (M-CSFm/h; knockin heterocigoto) y solo el M-CSF humano (M-CSFh/h; knockin homocigoto).
Caracterización de ratones humanizados con M-CSF. Se evaluó la expresión del M-CSF humano en los ratones humanizados con M-CSF. Se recogieron y se analizaron los órganos de ratones M-CSFm/m o M-CSFh/h para la expresión del ARNm del M-CSF murino y humano utilizando cebadores que son específicos de especie. Tal como se muestra en las figuras 1A y 1B, el M-CSF se expresa en la mayoría de los órganos analizados, incluido MO, bazo, sangre, hígado, cerebro, pulmón, testículos y riñones. Sin embargo, el timo y la piel no mostraron expresión detectable del M-CSF. Cabe destacar que, el patrón de expresión del M-CSF de ratón y humano fue comparable entre ratones M-CSFm/m y M-CSFh/h, respectivamente. A continuación, se cuantificaron los niveles de expresión del
35 M-CSF de ratón y humano en ratones M-CSFm/m, M-CSFm/h, y M-CSFh/h. Se aislaron células del estroma mesenquimales de médula ósea (CEM) y se cuantificaron los niveles de expresión de ARNm del M-CSF utilizando PCR en tiempo real (Figura 1C) y se cuantificó la proteína del M-CSF (secretada) utilizando ELISA (Figura 1D). Los ratones M-CSFm/m expresaron solo el M-CSF de ratón, los ratones M-CSFm/h expresaron el M-CSF de ratón y humano y los ratones M-CSFh/h expresaron solo el M-CSF humano. Los niveles de expresión del M-CSF humano fueron comparables con el M-CSF de ratón. De acuerdo con estos datos, el análisis del CSF-1 en suero reveló niveles de expresión comparables de proteína del CSF-1 en ratones m/m, h/m y h/h (Figura 1E). La hemicigosidad no conduce a la disminución de los niveles de expresión de genes y proteínas, lo que indica que los niveles de dosificación de genes parecen no ser limitantes para esta citoquina.
45 Para investigar si la sustitución del M-CSF de ratón con el M-CSF humano da como resultado efectos perjudiciales, especialmente sobre el hueso y la hematopoyesis, se analizaron ratones M-CSFh/h a diversas edades. Estudios previos han documentado que los ratones con señalización defectuosa del M-CSF (Csf1op/op y Csf1r-/-) presentan insuficiencia de erupción dental y defectos óseos (Dai, X.M. et al. (2002) Targeted disruption of the mouse colonystimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects, Blood 99:111-120; Felix, R. et al. (1990) Macrophage colony stimulating factor restores in vivo bone resorption in the op/op osteopetrotic mouse, Endocrinology 127:2592-2594; Wiktor-Jedrzejczak, W. et al. (1990) Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:4828-4832; Yoshida, H. et al. (1990) The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene, Nature 345:442-444). Por el
55 contrario, ratones M-CSFh/h revelaron dientes y propiedades óseas normales. Además, a diferencia de los ratones Csf1op/op and Csf1r-/-, el contenido celular total de la MO (Figura 2A), las frecuencias de células mieloides en la MO, bazo (BA) y sangre periférica (SP) (Figura 2B) y las frecuencias de macrófagos en la MO y BA (Figura 2C) fueron comparables entre ratones M-CSFm/m, M-CSFh/m y M-CSFh/h. En línea con esta observación, las frecuencias del compartimento de CMH (incluyendo CMH a largo plazo, CMH a corto plazo y progenitores multipotentes) y el compartimento progenitor mieloide (incluyendo progenitores mieloides comunes, progenitores de monocitos de granulocitos y progenitores de eritrocitos megacariocitos) fueron comparables entre ratones M-CSFm/m, M-CSFh/m y M-CSFh/h (Figura 9).
Una posible explicación para la hematopoyesis normal y el desarrollo óseo en los ratones M-CSFh/h podría ser que el
65 M-CSF humano es reactivo de forma cruzada con células de ratón. Para validar esto, se aislaron las células de MO totales del M-CSFm/m y se cultivaron en presencia del M-CSF murino recombinante o el M-CSF humano
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