ES2933427T3 - Extracto líquido de propóleo, formulación y utilizaciones del mismo - Google Patents

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Abstract

La presente invención da a conocer un novedoso extracto de propóleo líquido estandarizado y una formulación farmacéutica basada en dicho extracto, sus métodos de fabricación y usos. El extracto líquido se produce por extracción de propóleo bruto con un disolvente de extracción a base de una mezcla de PEG 200-600 (96,5-99,9 % p/p) y lecitinas (0,1-3,5 % p/p). El extracto se caracteriza por un contenido estandarizado de ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y CAPE (4). Se utiliza como ingrediente activo en la fabricación de productos farmacéuticos, cosméticos, veterinarios, agroquímicos o alimentos funcionales. La formulación farmacéutica según la invención consiste en 5-95% p/p de dicho extracto de propóleo y hasta el 100% de los excipientes necesarios para la preparación de diversas formas farmacéuticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Extracto líquido de propóleo, formulación y utilizaciones del mismo
Sector técnico
La presente invención se refiere a un extracto líquido de propóleo estandarizado novedoso, al procedimiento para su preparación hasta una composición farmacéutica novedosa a base del extracto mencionado, y a su utilización. Problema técnico
En lo que respecta al hecho de que el propóleo es una mezcla de cera de abejas y un gran número de compuestos orgánicos naturales, los diferentes procedimientos de extracción producen extractos con una composición de sustancias activas muy diferente. Con la utilización de disolventes de extracción (ES, “extraction solvents”) quimioselectivos, que tienen una capacidad de extracción selectiva de, predominantemente, determinados grupos de compuestos orgánicos, junto con la utilización de procedimientos analíticos adecuados, teóricamente es posible conseguir una composición de extracto de propóleo homogénea y estandarizada.
En el problema técnico que soluciona la presente invención se incluye:
(i) un extracto líquido de propóleo no alcohólico, que estaría caracterizado por un contenido alto y estandarizado de ácidos fenólicos del propóleo, ácido para-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 2-feniletil éster del ácido cafeico, 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo (4; CAPE), para los cuales se conocen varias actividades farmacológicas beneficiosas, tanto sobre los organismos humanos como sobre los animales.
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(ii) el procedimiento para su producción;
(iii) su utilización para la producción de productos farmacéuticos, cosméticos, veterinarios, agroquímicos o alimentarios con un contenido conocido y estandarizado de las sustancias activas del propóleo 1-4; y especialmente,
(iv) una composición farmacéutica a base del extracto de propóleo mencionado, que sería eficaz en el tratamiento de enfermedades inflamatorias e infecciosas, así como de enfermedades y afecciones en las que la actividad antioxidante, antinflamatoria e inmunomoduladora de sustancias activas del propóleo particulares juega un papel importante en la etiología de su incidencia, tal y como sugieren determinadas referencias del estado de la técnica.
Dichos extractos exentos de alcohol, con un contenido insignificante de cera de abejas y otros compuestos de lastre del propóleo, con contenidos altos y estandarizados de ingredientes del propóleo muy bioactivos, representan una base para el desarrollo y la producción de productos farmacéuticos, veterinarios, agroquímicos, o productos alimentarios funcionales o suplementos alimentarios, muy valiosos. En cambio, la utilización de extractos estándar de propóleo a base de etanol, glicerol y 1,2-propilenglicol para este fin va acompañada de diversas dificultades, tales como contenidos desconocidos de las sustancias activas del propóleo mencionadas anteriormente o una composición cuantitativa baja de ácidos fenólicos valiosos y CAPE con respecto a los ingredientes flavonoides del propóleo.
La presente invención se basa en:
(i) la utilización de una formulación de un disolvente de extracción (ES) específico, que sirve para el procedimiento de extracción quimioselectiva de propóleo bruto;
(ii) un procedimiento para la determinación cuantitativa de los ingredientes activos del propóleo, entre los que se incluyen las sustancias activas clave 1-4;
(iii) la estandarización del extracto líquido de propóleo preparado de ese modo mediante dilución con una determinada cantidad del mismo disolvente de extracción, hasta el nivel deseado de las sustancias activas 1-4, según la presente invención; en la que dicho disolvente de extracción consiste en dos o más sustancias alimentarias y farmacéuticamente aceptables, y también en el producto final, un extracto líquido de propóleo estandarizado. Este mismo disolvente de extracción desempeña la función del portador o diluyente; y
(iv) la composición farmacéutica, que se basa en dicho extracto de propóleo estandarizado, según la presente invención, que demostró ser un agente eficaz para el tratamiento de enfermedades inflamatorias e infecciosas. Debido al amplio espectro de su actividad farmacológica, se puede utilizar para el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones, tales como: enfermedades inflamatorias, infecciones bacterianas y fúngicas, enfermedades víricas, enfermedades autoinmunitarias, para la regeneración de la mucosa, el tratamiento de quemaduras y heridas, y para neoplasias malignas.
Estado de la técnica anterior
El propóleo es un producto natural recolectado por las abejas, a las que les sirve como pegamento para cerrar las aberturas más pequeñas indeseadas en las colmenas. El propóleo contienen cera de abejas, como ingrediente principal, y un gran número de diversos compuestos orgánicos. Muchos de ellos presentan efectos farmacológicos beneficiosos significativos; véase, por ejemplo, la referencia 1 de la bibliografía:
1) S. Castaldo, F. Capasso: Propolis, and old remedy used in modern medicine, Fitoterapia 73 (2002) S1-6. Además de las sustancias activas 1-4 mencionadas, el propóleo contiene una serie completa de otros compuestos naturales, por ejemplo, entre los ácidos, contiene también ácido trans-cinámico (5), y una serie de flavonoides con una cantidad relativamente abundante de crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9) y canferol (10):
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Tradicionalmente, el propóleo bruto se extrae con etanol o mezclas de etanol y agua, produciendo las denominadas tinturas de propóleo. Dichos extractos líquidos de propóleo están caracterizados por varias desventajas:
(i) la presencia de un disolvente relativamente agresivo (etanol);
(ii) los productos a base de alcohol no son adecuados para los niños, las embarazadas y las mujeres en periodo de lactancia, ni para determinados pacientes; y,
(iii) un contenido relativamente alto de cera de abejas, que causa su desagregación durante la fase de mezcla con agua, durante la fabricación del producto farmacéutico y otros productos, en la que dicho extracto se emplea como ingrediente activo.
Aparte del etanol, se han utilizado glicerol, agua, mezclas de glicerol y agua, y otros disolventes orgánicos como disolvente de extracción.
De esta manera, Tsukada y colaboradores dieron a conocer la utilización de glicerol como disolvente de extracción, en la proporción de propóleo:disolvente de extracción 1:2 p/p, a 90-160 °C, con filtración posterior. Dichos extractos de glicerol son hidrosolubles y son adecuados como ingrediente farmacéutico activo (API, “active pharmaceutical ingredient”) para la producción de productos farmacéuticos; véase la referencia 2 de la bibliografía:
2) Patente JPH05957A; T. Tsukada, W. Kameda, M. Ide: Production of water-soluble propolis pharmaceutical preparation; Ogawa Koryo KK, Santapuron KK (Japón).
Los extractos acuosos de propóleo también están descritos en el estado de la técnica anterior. La extracción con agua como ES se puede realizar a temperaturas de 30-50 °C durante 6-8 minutos, la cual, después de la filtración, proporciona directamente un extracto líquido de propóleo. Este último se puede procesar adicionalmente en última instancia mediante microencapsulación con la tecnología de criodesecación sobre portadores adecuados, tales como maltodextrina y goma arábiga, para producir extractos sólidos; véase la referencia 3 de la bibliografía:
3) Patente CN103783349A; Z. Wang, S. Shao, H. Ma, S. Wang, L. Wang, C. Zhang, X. Ma: Process for preparing honeycomb polyphenol extractive microcapsule by adopting spray; Universidad de Jiangsu (China).
La utilización de agentes tensioactivos como componentes del disolvente de extracción (ES), entre los que se incluyen las lecitinas, es conocida, en general, en el estado de la técnica anterior. Por ejemplo, Paradkar y colaboradores describieron el procedimiento para la extracción de propóleo con la utilización de una solución acuosa de polisorbato a 40-90 °C durante 2-24 horas, produciendo un extracto líquido de propóleo; véase la referencia 4 de la bibliografía:
4) Patente WO2011092511A1; A. Paradkar, R. Dhumal, A. Kelly, S. Gilda: Propolis and process for the treatment thereof and end products formed therefrom; Natures Lab Ltd (Reino Unido).
Sosnowski dio a conocer el procedimiento para la extracción de propóleo con diferentes disolventes orgánicos, entre los que se incluyen 1,2-propilenglicol, polietilenglicol (PEG) y mezclas de estos disolventes con agua; véase la referencia 5 de la bibliografía:
5) Patente US4382886; Z. M. Sosnowski: Method for extracting propolis and water soluble dry propolis powder. Chun y colaboradores dieron a conocer la composición farmacéutica que, entre otros, se basa en un extracto líquido de propóleo en 1,3-butilenglicol como disolvente de extracción, que, mediante la utilización de lecitina hidrogenada, junto con otros emulsionantes, se convierte en una forma farmacéutica que contiene nanopartículas con este extracto de propóleo; véase la referencia 6 de la bibliografía:
6) KR20130134800A; Y. J. Chun, S. B. Shim, X. Ke: Composition of nano-vesicle containing propolis and manufacturing method of it; Universidad de Chungwoon IACF (República de Corea).
A pesar del hecho de que este documento no utiliza lecitina para facilitar la extracción de las sustancias activas del propóleo con 1,3-butilenglicol, ciertamente sugiere una posibilidad para su utilización como surfactante, que en última instancia puede mejorar la extracción y emulsificación de determinados ingredientes de ácidos grasos del propóleo en disolventes más polares.
En lo que respecta al análisis del propóleo, en el estado de la técnica anterior existe un gran número de procedimientos analíticos para la determinación cuantitativa de las sustancias activas del propóleo en extractos complejos de propóleo, que contienen un gran número de ingredientes. Como ejemplo, en el trabajo de los autores chinos Cui-Ping y colaboradores se da a conocer un procedimiento analítico similar al que se emplea en la presente invención. Estos autores describieron un procedimiento cuantitativo para la determinación de 12 flavonoides diferentes y 8 ácidos fenólicos del propóleo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, “high performance liquid chromatography”). Este procedimiento permite la determinación de, entre otros, ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2) y ácido cafeico (3), que se mencionan como marcadores cualitativos del propóleo; véase la referencia 7 de la bibliografía:
7) Z. Cui-ping, H. Shuai, W. Wen-ting, P. Shun, S. Xiao-ge, L. Yajing, H. Fu-liang: Development of high-performance liquid chromatographic for quality and authenticity control of Chinese propolis, J. Food Sci. 79 (2014) C1315-C1322. Debido al contenido de las sustancias activas 1-10 y otras, el propóleo y el extracto de propóleo presentan una serie de efectos farmacológicos muy valiosos y beneficiosos para la salud de los seres humanos, los animales y la plantas. En el estado de la técnica anterior existe un gran número de documentos científicos y de patente que respaldan la amplia gama de efectos beneficiosos, entre los cuales, los más significativos son los siguientes: antinflamatorios, antioxidantes, inmunomoduladores, hepatoprotectores, antimicrobianos, entre los que se incluyen antibacterianos, antivíricos, antifúngicos y antiprotozoicos; y antineoplásicos; véanse, por ejemplo, las referencias 8-12 de la bibliografía:
8) E. L. Ghisalberti: Propolis: A Review, Bee World 60 (1979) 59-84.
9) A. Banskota, Y. Tezuka, S. Kadota: Recent Progress in Pharmacological Research of Propolis, Phytother. Res.
15 (2001) 561-571.
10) G. A. Burdock: Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis (Propolis), Food Chem. Toxicol. 36 (1998) 347-363.
11) J. M. Sforcin: Propolis and the immune system: a review, J. Ethnopharmacol. 113 (2007) 1-14.
12) J. W. Dobrowolski, S. B. Vohora, K. Sharma, S. A. Shah, S. A. H. Naqvi, P. C. Dandiya: Antibacterial, antifungal, antiamoebic, antiinflammatory and antipyretic studies on propolis bee products, J. Ethnopharmacol. 35 (1991) 77-82.
Además de los extractos de propóleo, en el estado de la técnica anterior se describe una gama completa de efectos farmacológicos beneficiosos para determinadas sustancias activas del propóleo (puras) aisladas, por ejemplo:
(i) ácido p-cumárico (1); véanse las referencias 13 y 14 de la bibliografía;
(i) ácido trans-ferúlico (2); véanse las referencias 15 y 16 de la bibliografía;
(i) ácido cafeico (3); véanse las referencias 17 y 18 de la bibliografía; así como
(iv) 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE); véanse las referencias 19 y 20 de la bibliografía; los cuales presentan, entre otras, actividades inmunomoduladoras, antinflamatorias y antimicrobianas:
13) T. F. Bachiega, C. L. Orsatti, A. C. Pagliarone, J. M. Sforcin: The Effects of Propolis and its Isolated Compounds on Cytokine Production by Murine Macrophages, Phytother. Res. 26 (2012) 1308-1313.
14) K. Pei, J. Ou, J. Huang, S. Ou: p-Coumaric acid and its conjugates: dietary sources, pharmacokinetic properties and biological activities, J. Sci. Food Agric. 96 (2016) 2956-2962.
15) N. Kumar, V. Pruthi: Potential applications of ferulic acid from natural sources, Biotechnol. Rep. 4 (2014) 86-93.
16) C. Shi, X. Zhang, Y. Sun, M. Yang, K. Song, Z. Zheng, Y. Chen, X. Liu, Z. Jia, R. Dong, L. Cui, X. Xia: Antimicrobial activity of ferulic acid against Cronobacter sakazakii and possible mechanism of action, Foodborne Pathog. Dis. 13 (2016) 196-204.
17) H. G. Choi, P. T. Tran, J. H. Lee, B. S. Min, J. A. Kim: Antiinflammatory activity of caffeic acid derivatives isolated from the roots of Salvia miltiorrhiza Bunge, Arch. Pharm. Res. (2018) 64-70.
18) V. N. Lima, C. D. Oliveira-Tintino, E. S. Santos, L. P. Morais, S. R. Tintino, T. S. Freitas, Y. S. Geraldo, R. L. Pereira, R. P. Cruz, I. R. Menezes, H. D. Coutinho: Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol, Microb. Pathog. 99 (2016) 56-61.
19) K. Frenkel, H. Wei, R. Bhimani, J. Ye, J. A. Zadunaisky, M.-T. Huang, T. Ferraro, A. H. Conney, D. Grunberger: Inhibition of Tumor Promoter-mediated Processes in mouse Skin and Bovine Lens by Caffeic Acid Phenethyl Ester, Cancer Res. 53 (1993) 1255-1261.
20) A. Russo, R. Longo, A. Vanella: Antioxidant activity of propolis: role of caffeic acid phenethyl ester and galangin, Fitother. 73 (2002) S21-S29.
Además, las sustancias activas del propóleo son fungicidas, bactericidas, viricidas, insecticidas, nematicidas y se utilizan en la protección de las plantas. Debido a una fuerte actividad antioxidante, el propóleo fortalece las plantas, aumenta su resistencia contra el estrés abiótico y las ayuda a combatir las infecciones; véanse las referencias 21-25 de la bibliografía:
21) C. A. Guginski-Piva, I. dos Santos, A. W. Júnior, D. W. Heck, M. F. Flores, K. Pazolini: Propolis for the control of powdery mildew and the induction of phytoalexins in cucumber, IDESIA (Chile) 33 (2015) 39-47;
22) Z. Ararso, G. Legesse: Insecticidal action of honeybees propolis extract against larvae of lesser wax moth, Agric. Biol. J. North Am. (2015) doi:10.5251/abjna.2016.7.6.302.306.
23) L. Kumar, M. K. Mahatma, K. A. Kalariya, S. K. Bishi, A. Mann: Plant Phenolics: Important Bio-Weapon against Pathogens and Insect Herbivores, Popular Kheti 2 (2014) 149-152;
24) E. M. Noweer, M. G. Dawood: Efficiency of propolis extract on faba bean plants and its role against nematode infection, Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. 74 (2009) 593-603;
25) K. Kulbat: The role of phenolic compounds in plant resistance, Biotechnol. Food Sci. 80 (2016) 97-108.
Según nuestro leal saber y entender, no se ha descrito en el estado de la técnica anterior la utilización de un disolvente de extracción (ES) específico a base de polietilenglicol líquido, que contenga un contenido bajo de lecitina (0,1-3,5 % m/m), como potenciador de la quimioselectividad de la extracción de propóleo. La aplicación de dicho ES específico de la presente invención, permite el aumento de la quimioselectividad de la extracción de propóleo bruto, produciendo el extracto líquido correspondiente con un contenido significativamente mayor de las sustancias activas 1-4 correspondientes.
Asimismo, la utilización del extracto líquido de propóleo, estandarizado y específico, mencionado, como ingrediente farmacéutico activo (API) en la composición farmacéutica, según la presente invención, proporciona una mejora inesperada en una serie de diferentes indicaciones para su utilización; tal y como se describe en la descripción detallada de la presente invención.
Características de la invención
La presente invención se basa en una eficacia y quimioselectividad inesperadas de la extracción de propóleo bruto con un disolvente de extracción (ES) específico. Este último consiste en la mezcla de polietilenglicol (PEG) líquido, por ejemplo, PEG 400, y lecitina o lecitina hidrolizada en la proporción: 96,5-99,9:0,1-3,5 % p/p.
El disolvente de extracción (ES) extrae con eficacia y quimioselectividad las sustancias activas del propóleo ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo (4; CAPE). La utilización de un procedimiento analítico adecuado, a base de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), permite una determinación cuantitativa de las sustancias activas 1-4 en un extracto primario preparado de dicha manera. Este último se somete a estandarización posterior mediante dilución con el mismo ES que se empleó en la etapa de extracción, hasta el contenido deseado de las sustancias activas 1-4, según la presente invención. De esta manera, se obtiene un extracto líquido de propóleo con concentraciones conocidas y estandarizadas de las sustancias activas clave 1-4, según la presente invención. Este se utiliza además como ingrediente farmacéutico activo (API), ingrediente cosmético activo (ACI, “active cosmetic ingredient”), o como ingrediente alimentario para la fabricación de alimentos funcionales y suplementos alimentarios.
La composición de la presente invención, a base de dicho extracto líquido de propóleo, que contiene las sustancias activas clave ácido p-cumárico (1; 10-1.300 |xg/mL), ácido trans-ferúlico (2; 10-800 |xg/mL), ácido cafeico (3; 5-300 |xg/mL) y 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo (4; 5-400 |xg/mL), es un agente eficaz en la terapia de enfermedades inflamatorias, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, enfermedades víricas, enfermedades autoinmunitarias, trastornos gastrointestinales funcionales, para la regeneración de la mucosa, el tratamiento de quemaduras y heridas, así como en el tratamiento de neoplasias malignas.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra un cromatograma de HPLC típico de los ingredientes clave 1-4 del propóleo y los ingredientes adicionales 5-10.
La figura 2.1-2.4 muestra los resultados de la composición cuantitativa de las sustancias activas 1-4 del propóleo en extractos líquidos de propóleo obtenidos mediante extracción con etanol (96 %) y mezclas de etanol con diferentes clases y concentraciones de lecitinas.
La figura 2.5-2.10 muestra los resultados de la composición cuantitativa de sustancias adicionales 5-10 en extractos líquidos de propóleo obtenidos mediante extracción con etanol (96 %) y mezclas de etanol con diferentes clases y concentraciones de lecitinas.
La figura 3.1-3.4 muestra los resultados de la composición cuantitativa de las sustancias activas 1-4 del propóleo en extractos líquidos de propóleo obtenidos mediante extracción con polietilenglicol 400 y mezclas de polietilenglicol 400 con diferentes clases y concentraciones de lecitinas.
La figura 3.5-3.10 muestra los resultados de la composición cuantitativa de sustancias adicionales 5-10 en extractos líquidos de propóleo obtenidos mediante extracción con polietilenglicol 400 y mezclas de polietilenglicol 400 con diferentes clases y concentraciones de lecitinas.
La figura 4 muestra un diagrama de bloques del procedimiento para la producción de un extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención.
La figura 5 muestra un cromatograma de HPLC típico de un análisis cuantitativo de la formulación farmacéutica de la presente invención, el producto del ejemplo 11.
Abreviaturas
ES - disolvente de extracción
SL - lecitina de soja (Glycine max. L.)
RL - lecitina de colza (Brassica napus L.)
HRL - lecitina de soja hidrolizada
SUL - lecitina de girasol desaceitada
EtOH - etanol al 96 %
PEG - polietilenglicol
HPLC - cromatografía líquida de alta resolución
GC - cromatografía de gases
TLC - cromatografía en capa fina
MIC - concentración inhibidora mínima
RPMI - medio Roswell Park Memorial Institute
TTC - cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio, indicador redox
PBS - tampón de fosfato en solución salina
UFC - unidades formadoras de colonias; número de microorganismos vivos capaces de formar colonias
XTT - sal sódica de XTT; ion dipolar de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida, indicador redox
MRSA - Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
MSSA - Staphylococcus aureus sensible a la meticilina
CLSI - Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio, “Clinical and Laboratory Standards Institute”
EUCAST - Comité Europeo de Antibiogramas, “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” API - ingrediente farmacéutico activo/sustancia farmacéutica activa
DER - proporción en peso de fármaco respecto a extracto; medida de la potencia de los extractos expresada mediante la proporción en peso de un fármaco de partida y un extracto final
SCC - recuento de célula somáticas
i.mam. -(aplicación) intramamaria
ATCC - Colección Estadounidense de Cultivos Tipo, “American Type Culture Collection”; organización sin ánimo de lucro que recoge, almacena y distribuye microorganismos de referencia estándar
CNS - estafilococos coagulasa-negativos
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al extracto líquido de propóleo novedoso, estandarizado en el contenido de las sustancias activas clave, seleccionadas del grupo que consiste en: ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 2-feniletil éster del ácido cafeico, 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo (4), al procedimiento para su preparación y a su utilización.
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El extracto líquido de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, según la presente invención consiste en:
(A) un extracto seco de propóleo; 0,1-10,0 % p/p; y
(B) un disolvente de extracción; 90,0-99,9 % p/p;
en el que el disolvente de extracción consiste en:
(B.1) uno o más polietilenglicoles (PEG) líquidos 200-600; 96,5-99,9 % p/p; y
(B.2) lecitina o lecitina hidrolizada; 0,1-3,5 % p/p;
en el que dicho extracto líquido de propóleo está estandarizado mediante:
(I) la proporción en peso cuantitativa de propóleo bruto, como fármaco, y extracto final (DER) en la proporción de: 1:2-1:20 p/p; y
(II) el contenido cuantitativo de sustancias activas del propóleo, seleccionadas del grupo que consiste en ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 3,4-dihidroxicinamato de 2-feniletilo (4), en el que la composición cuantitativa de, como mínimo, dos de cuatro de dichas sustancias activas clave es tal y como se indica a continuación:
(i) ácido p-cumárico (1); 100-1.300 |xg/mL;
(ii) ácido trans-ferúlico (2); 75-800 |xg/mL;
(iii) ácido cafeico (3); 25-300 |xg/mL; y
(iv) 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE); 40-400 |xg/mL.
En la realización preferente de la presente invención, el polietilenglicol (PEG) líquido, como componente del disolvente de extracción (ES), se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol 200, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, o mezclas de estas sustancias.
Específicamente, el polietilenglicol (PEG) líquido, como componente del disolvente de extracción (ES), se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, o mezclas de estas sustancias.
Además, la lecitina, o la lecitina hidrolizada, se selecciona del grupo que consiste en los productos caracterizados por el factor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB, “hydrophilic-lipophilic balance”) de 2-12, y se selecciona del grupo que consiste en: lecitina de soja (SL; de Glycine max. L.); lecitina de girasol (SUL; de Helianthus annuus L.); lecitina de colza (RL; de Brassica napus L.); lecitina de canola (Brassica rapa L.); lecitina de huevos de gallina (Gallus gallus domesticus L.); productos desaceitados de dichas lecitinas; lecitinas hidrogenadas de dichas fuentes; lecitinas hidrolizadas de dichas fuentes; derivados de dichas lecitinas modificados con enzimas; o mezclas de estas sustancias.
Específicamente, como lecitina, en la presente invención se puede emplear lecitina natural, lecitina desaceitada, hidrogenada, hidrolizada o modificada con enzimas, de soja (Glycine max. L.), girasol (Helianthus annuus L.), colza (Brassica napus L.) o canola (Brassica rapa L.); o mezclas de estas sustancias.
En el término “lecitina modificada con enzimas” se incluye la lecitina hidrolizada, obtenida mediante la hidrólisis, catalizada por enzimas, de un resto de un ácido graso superior con generación de un monoéster de glicerol de los ácidos grasos superiores con un grupo fosfato y un grupo colina restantes de la molécula. Esto da lugar a un factor de HLB significativamente mayor de dicha lecitina hidrolizada.
Preferentemente, se puede utilizar como disolvente de extracción (ES) para la preparación del extracto líquido de propóleo, según la presente invención, la mezcla de:
(i) polietilenglicol (PEG) 200, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400 o sus mezclas; del 97-99 % p/p; y
(ii) lecitina natural, lecitina desaceitada o lecitina hidrolizada, de soja (Glycine max. L.), girasol (Helianthus annuus L.), colza (Brassica napus L.) o canola (Brassica rapa L.); o mezclas de estas sustancias; del 1 -3 % p/p.
En la realización preferente de la presente invención, el extracto líquido de propóleo, según la presente invención, se estandariza en:
(I) una proporción en peso cuantitativa de propóleo bruto, como fármaco, con respecto al extracto final (DER) en una proporción de:
1:3-1:5 p/p; y
(II) la composición cuantitativa de sustancias activas del propóleo, seleccionadas del grupo que consiste en ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 3,4-dihidroxi-cinamato de 2-feniletilo (4), en la que, como mínimo, dos de cuatro de dichas sustancias activas clave corresponden al siguiente contenido cuantitativo:
(i) ácido p-cumárico (1); 500-1.300 |xg/mL;
(ii) ácido trans-ferúlico (2); 300-800 |xg/mL;
(iii) ácido cafeico (3); 100-300 |xg/mL; y
(iv) 3,4-dihidroxi-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE); 100-400 ixg/mL.
Análisis de las sustancias activas del propóleo en extractos líquidos
Para el desarrollo de un extracto líquido de propóleo, estandarizado y novedoso, según la presente invención, el desarrollo de un procedimiento analítico para la determinación cuantitativa de:
(i) las sustancias activas clave del propóleo, seleccionadas del grupo que consiste en las mencionadas anteriormente: ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 3,4-dihidroxi-cinamato de 2-feniletilo (4); y
(ii) las sustancias activas adicionales, seleccionadas del grupo que consiste en: ácido trans-cinámico (5), crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9) y canferol (10)
fue esencial.
Figure imgf000008_0001
A efectos del estudio inicial de dicho procedimiento analítico, fue necesario preparar extractos líquidos de propóleo modelo. Se utilizaron los extractos líquidos de propóleo modelo en etanol (96 %) y polietilenglicol. Estos se prepararon mediante el procedimiento de extracción estándar, mediante maceración a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, el residuo no disuelto se separó mediante filtración y el filtrado limpio se empleó como un extracto líquido de propóleo modelo para el estudio posterior. Como polietilenglicol líquido modelo, se utilizó polietilenglicol 400 (PEG 400). Los procedimientos para la preparación de los extractos líquidos de propóleo modelo en disolventes de extracción clásicos, etanol (96 %) y polietilenglicol 400, se describen en el ejemplo 1 (etanol al 96 %) y el ejemplo 2 (PEG 400).
Se desarrolló un procedimiento analítico adecuado, a base de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), mediante el cual se logró una separación con éxito de los 10 compuestos 1-10 mencionados. El procedimiento se describe con precisión en el ejemplo 3.
En la figura 1 se muestra un cromatograma de HPLC típico, obtenido mediante el procedimiento analítico, según la presente invención. Los tiempos de retención (tR) de los compuestos 1-10 se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Tiempos de retención de las sustancias activas del propóleo 1-10 según el procedimiento de HPLC de la resente invención.3
Figure imgf000009_0001
Estudio de la influencia de la lecitina sobre la eficacia de extracción de las sustancias activas del propóleo 1-4 Como continuación de esta investigación, se estudió el efecto de diferentes disolventes de extracción (ES), con contenido de diversas clases (SL, RL, HRL) y concentraciones (1-30 % p/p) de lecitinas, sobre la eficacia de extracción de las sustancias activas del propóleo 1-4; véase la tabla 2.
Tabla 2. Sistemas de disolventes de extracción (ES) ensayados para la extracción de las sustancias activas 1-4 del ro óleo.
Figure imgf000009_0002
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Los extractos líquidos de propóleo preparados de ese modo se sometieron a un análisis cuantitativo con respecto al contenido de las sustancias activas clave 1-4 y las sustancias activas adicionales 5-10. Los resultados se presentan en las tablas 3-6.
En el caso de la utilización del disolvente de extracción (ES) a base de etanol (EtOH) al 96 % y mezclas de EtOH y diferentes clases (SL, RL, HRL) y concentraciones (1-30 % p/p en la composición del ES), los extractos líquidos de propóleo primarios contienen ácido p-cumárico (1; aproximadamente 800-1250 pg/mL), ácido frans-ferúlico (2; aproximadamente 485-770 pg/mL), ácido cafeico (3; aproximadamente 185-290 pg/mL) y 3,4-dihidroxifrans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE; aproximadamente 215-320 pg/mL) como ingredientes activos dominantes; véase la tabla 3.
Tabla 3. Composición cuantitativa de las sustancias activas 1-4 en extractos líquidos de propóleo obtenidos con disolventes de extracción ES a base de etanol.
Figure imgf000010_0002
En este caso, la concentración de las sustancias activas auxiliares 5-10 se encontraba al siguiente nivel: ácido frans-cinámico (5; aproximadamente 40-65 pg/mL), crisina (6; aproximadamente 500-690 pg/mL), pinocembrina (7; aproximadamente 440-670 pg/mL), galangina (8; aproximadamente 210-300 pg/mL), apigenina (9; aproximadamente 90-150 pg/mL) y canferol (10; aproximadamente 45-90 pg/mL); véase la tabla 4.
En el caso de la utilización del disolvente de extracción (ES) a base de polietilenglicol (PEG 400) y mezclas de PEG 400 y diversas clases (SL, RL, HRL) y concentraciones (1-10 % p/p en la composición del ES) de lecitinas, los extractos líquidos de propóleo primarios también contienen ácido p-cumárico (1; aproximadamente 750-1.300 |xg/mL), ácido trans-ferúlico (2; aproximadamente 400-800 |xg/mL), ácido cafeico (3; aproximadamente 140-300 |xg/mL) y 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE; aproximadamente 190-370 |xg/mL); véase la tabla 5.
Tabla 4. Composición cuantitativa de las sustancias activas adicionales 5-10 en extractos líquidos de propóleo obtenidos con disolventes de extracción ES a base de etanol.
Figure imgf000011_0001
Tabla 5. Composición cuantitativa de las sustancias activas 1-4 en extractos líquidos de propóleo obtenidos con i lv n xr i n E li il n li l 4 .
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
En este caso, la concentración de las sustancias activas auxiliares 5-10 se encontraba al nivel: ácido frans-cinámico (5; aproximadamente 30-70 |xg/mL), crisina (6; aproximadamente 400-830 |xg/mL), pinocembrina (7; aproximadamente 390-800 |xg/mL), galangina (8; aproximadamente 190-360 |xg/mL), apigenina (9; aproximadamente 0-170 |xg/mL) y canferol (10; aproximadamente 40-140 |xg/mL); véase la tabla 6.
Tabla 6. Composición cuantitativa de las sustancias activas adicionales 5-10 en extractos líquidos de propóleo
Figure imgf000012_0002
Como se puede observar a partir de los resultados, todas las lecitinas ensayadas (SL, RL, HRL), en combinación con cualquier disolvente puro, etanol al 96 % o polietilenglicol 400 (PEG 400), cuando se utilizan a concentraciones inferiores, del 1-3 % p/p, en la composición del disolvente de extracción (ES), contribuyen significativamente al aumento de la quimioselectividad de la extracción de las sustancias activas 1-4, en comparación con los disolventes puros.
Un efecto inesperado de la combinación de PEG 400 y lecitina (SL, RL, HRL), se revela en el hecho de que, mientras que el PEG 400, como disolvente puro, extrae las sustancias activas 1-4 de un modo significativamente más débil que el etanol al 96 % (tabla 3, fila 1, columna 2); cuando se emplea en combinación con lecitinas (SL, RL, HRL), en una concentración del 1-3 % p/p, extrae los compuestos 1-4 de una manera significativamente más eficaz, en comparación con combinaciones análogas de etanol al 96 % con las mismas lecitinas. Por ejemplo, aunque la concentración de ácido p-cumárico (1) lograda en el extracto obtenido con PEG 400 al 100 %, como disolvente de extracción, se encontraba en el intervalo de 750 |xg/mL (tabla 5; fila 1, columna 2), y con EtOH al 96 %, como ES, en el intervalo de 916 |xg/mL (tabla 3; fila 1, columna ), la utilización de SL al 3 % p/p en PEG 400 dio lugar a una concentración de 1.112 |xg/mL (tabla 5; fila 2, columna 2), en comparación con el nivel de 820 |xg/mL (tabla 3; fila 2, columna 2) en el caso de utilización de un ES a base de etanol al 96 % con SL al 3 % p/p.
A partir de este ejemplo típico, es claramente visible un efecto completamente inesperado de la combinación de polietilenglicol y lecitina, en una concentración del 1-3 % p/p, en el disolvente de extracción (ES). Un experto en la materia puede extrapolar esto hasta un intervalo aceptable de porcentaje en peso de lecitina óptimo del 0,1-3,5 % p/p en la composición del ES.
Con la utilización de porcentajes en peso de lecitina superiores en la composición del disolvente de extracción (ES), se pierde el efecto beneficioso de la lecitina sobre la quimioselectividad de la extracción de propóleo, en comparación con sistemas análogos a base de etanol. Por ejemplo, mediante el empleo de lecitinas en concentraciones de RL al 4 %, HRL al 7,7 % o SL al 10 %, en el ES, se registraron concentraciones inferiores de las sustancias activas clave 1-4, en comparación con la utilización de sistemas de ES a base de etanol análogos. Los resultados típicos para las dos sustancias activas más abundantes, ácido p-cumárico (1) y ácido trans-ferúlico (2), se muestran en las tablas 7 y 8.
Tabla 7. Composición cuantitativa de ácido p-cumárico (1) en extractos líquidos de propóleo obtenidos con if r n i lv n xr i n n l r n inv n i n.
Figure imgf000013_0001
En la tabla 7 se puede observar el resultado inesperado típico de la presente invención en la fila 8, columna 3, en el que se observó un aumento del 50 % de la concentración de ácido p-cumárico (1) cuando se utilizó el disolvente de extracción (ES) PEG 400 RL 98,9:1,1; p/p), en comparación con un ES a base de EtOH análogo (EtOH RL = 98,9:1,1; p/p).
Tabla 8. Composición cuantitativa de ácido frans-ferúlico (2) en extractos líquidos de propóleo obtenidos con if r n i lv n xr i n n l r n inv n i n.
Figure imgf000014_0001
Como ejemplo típico adicional del resultado inesperado, en la tabla 8, fila 12, columna 3 se presenta el dato en el que se registró un aumento del 53,5 % en la concentración de ácido frans-ferúlico (2) cuando se empleó el disolvente de extracción (ES) PEG 400 HRL 97,8:2,2; p/p), en comparación con un ES a base de etanol al 96 % análogo.
Procedimiento de producción de extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención
El procedimiento para la producción de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, incluye las siguientes etapas: (i)
(i) enfriamiento del propóleo bruto a -20 °C durante, como mínimo, 1 hora;
(ii) molienda del propóleo enfriado, con tamizado a través de poros de 1 -8 mm;
(iii) extracción del propóleo bruto con el disolvente de extracción en las siguientes condiciones:
(a) proporción en peso de propóleo bruto y disolvente de extracción = 1:2-1:20 p/p;
(b) temperatura de extracción de 10-150 °C; y
(c) tiempo de extracción de 5 minutos a 72 horas;
(iv) filtración de la mezcla obtenida de ese modo a través de una serie de filtros con poros de 100 pm a 5 pm, con generación de residuo no disuelto y el extracto líquido de propóleo;
(v) análisis cuantitativo de las sustancias activas clave 1-4 mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y
(vi) estandarización del extracto líquido de propóleo obtenido de ese modo con una determinada composición cuantitativa exacta de las sustancias activas clave 1-4 de la etapa (v), mediante dilución con un disolvente de extracción recién preparado que se ha utilizado en la etapa (iii), hasta el contenido deseado de las sustancias activas 1-4.
En la realización preferente de la ejecución del procedimiento para la preparación del extracto líquido de propóleo, según la presente invención, la etapa de extracción (iii) se realiza en las siguientes condiciones:
(a) proporción en peso de propóleo bruto y disolvente de extracción = 1:3-1:5 p/p;
(b) temperatura de extracción de 15-70 °C; y
(c) tiempo de extracción de 1-24 horas.
Asimismo, la etapa de determinación cuantitativa de las sustancias activas clave 1-4, y para la detección adicional de las sustancias activas auxiliares 5-10, el procedimiento analítico de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), desarrollado para este fin, se lleva a cabo tal y como se indica a continuación:
(i) columna cromatográfica: Ascentis express; C18; dimensiones: 15 cm x 3,0 mm; diámetro de las partículas de la columna: 2,7 pm;
(ii) fase móvil: A = solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 %, B = metanol; gradiente: 0 minutos, A al 80 %, B al 20 %; 3 minutos, A al 70 %, B al 30 %; 60 minutos, A al 20 %, B al 80 %; 90 minutos, A al 20 %, B al 80 %; 100 minutos, A al 70 %, B al 30 %; 105 minutos, A al 80 %, B al 20 %;
(iii) temperatura de la columna: 30 °C;
(iv) caudal: 0,25 mL/min;
(v) tiempo de análisis: 110 minutos;
(vi) longitud de onda en el detector UV-VIS: para detección: 370 nm, para integración: 290 nm;
(vii) volumen de inyección: 10 pL;
(viii) presión: 210-290 bar.
Los procedimientos experimentales para la preparación del extracto líquido de propóleo, según la presente invención, se dan a conocer en los ejemplos 4-9. En el ejemplo 9, se describe una versión optimizada del procedimiento de preparación para el extracto líquido estandarizado de potencia, expresada mediante el parámetro proporción de fármaco respecto a extracto (DER), 1:2 en porcentaje en peso, según la presente invención.
El procedimiento analítico para la determinación cuantitativa de las sustancias activas clave 1-4 y las sustancias activas auxiliares 5-10 se describe en el ejemplo 3.
Determinación de la eficacia antimicrobiana del extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención. Determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC) sobre los microorganismos patógenos modelo
La eficacia antimicrobiana de los extractos de propóleo se midió en el Departamento de Medicina Molecular del Instituto Rudjer Boskovic, Zagreb, Croacia. Las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) del extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención, se determinaron mediante las directrices del CLSI (“Clinical and Laboratory Standards Institute”) y los procedimientos del EUCAST (“European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing”), tal y como se describe en las referencias 26-29 de la bibliografía. Se utilizó el producto del ejemplo 9.
26) M. Balouiri, M. Sadiki, S. K. Ibnsouda: Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review, J. Pharm. Anal. 6 (2016) 71-79.
27) CLSI, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, Norma aprobada, 9.a edición, documento del CLSI M07-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pensilvania 19087, EE. UU., 2012.
28) CLSI, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Norma aprobada, 2.a edición, documento del CLSI, antiguamente conocido como NCCLS (Comité Nacional de Normas Clínicas y de Laboratorio, “National Committee for Clinical Laboratory Standards”) M27-A2. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pensilvania 19087-1898, EE. UU., 2002.
29) CLSI, Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents. Directriz aprobada, documento del CLSI M26-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pensilvania 19087, EE. UU., 1998.
La eficacia antimicrobiana se ensayó en condiciones in vitro sobre cepas del ATCC de los siguientes microorganismos patógenos modelo (M):
(i) Staphylococcus aureus ATCC 29293 (M1);
(ii) Staphylococcus aureus resistente a la meticilina; MRSA (colección del MFBF (Departamento de Microbiología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Zagreb, “Department of Microbiology, Faculty of Pharmacy and Biochemistry University of Zagreb”); M2);
(ii) Staphylococcus aureus sensible a la meticilina; Ms Sa (colección del MFBF; M3);
(iv) Enterococcus faecalis ATCC 9212 (M4);
(v) Enterococcus faecalis VRE (Enterococcus resistente a la vancomicina, “vancomycin-resistant Enterococcus’’) (colección del MFBF) (M5);
(vi) Escherichia coli ATCC 10536 (M6);
(vii) Acinetobacter baumanii ATCC 43498 (M7);
(viii) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (M8); y
(ix) Candida albicans ATCC 90028 (M9).
Se realizó un procedimiento de microdilución en serie con el fin de determinar las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de los extractos. Los valores de las MIC se determinaron como la concentración de extracto de propóleo a la que se producía una reducción del 80 % en el recuento de bacterias u hongos (MIC80). Las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC80) mostradas en la tabla 9 se muestran en forma de dilución (%) del extracto líquido correspondiente en un disolvente determinado. El extracto líquido de propóleo de partida se obtuvo en la proporción del propóleo bruto y el extracto final (DER) de 1:2; producto del ejemplo 9. Si la dilución del extracto líquido es mayor, lo que significa que la concentración de las sustancias activas 1-10 es inferior para la MIC, el efecto antimicrobiano resultante del extracto ensayado es superior.
La descripción detallada del procedimiento experimental para la determinación de la MIC se da a conocer en el ejemplo 10, y los resultados se presentan en la tabla 9.
Tabla 9. Resultados de la determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC; %) de extractos de propóleo diluidos, producto del ejemplo 9, en comparación con extractos líquidos obtenidos con etanol al 96 % (ejemplo 1) o olietilen licol 400 eem lo 2 como disolventes de extracción.
Figure imgf000016_0001
En las tablas 10-15, se presentan las concentraciones másicas de las sustancias activas 1-10 en diluciones eficaces de los extractos de propóleo, en cada uno de los tres sistemas de disolventes de extracción ensayados; estas se obtienen mediante la utilización de:
(i) etanol al 96 %; producto del ejemplo 1,
(ii) polietilenglicol 400 (PEG 400); producto del ejemplo 2; y
(iii) mezcla de PEG 400 (97 % p/p) y lecitina de soja (3 % p/p); producto del ejemplo 9;
o las concentraciones másicas de las sustancias activas 1-10 correspondientes a las que cada extracto líquido particular alcanzó la MIC. Esta se determinó a partir del extracto líquido primario en el que la DER es 1:2, dividida por la dilución a la que se alcanzó la MIC.
Tabla 10. Concentración másica (y) en [|xg/mL] para las sustancias activas del propóleo 1-4 en diluciones eficaces l xr lí i r l ni n nl l r l ml 1.
Figure imgf000017_0001
Tabla 11. Concentración másica (y) en [|xg/mL] para las sustancias activas del propóleo 5-10 en diluciones eficaces l xr lí i r l ni n nl l r l ml 1.
Figure imgf000017_0002
Tabla 12. Concentración másica (y) en [|xg/mL] para las sustancias activas del propóleo 1-4 en diluciones eficaces l xr lí i r l ni n li il nli l 4 PE 4 r l ml 2.
Figure imgf000018_0001
Tabla 13. Concentración másica (y) en [|xg/mL] para las sustancias activas del propóleo 5-10 en diluciones eficaces l xr lí i r l ni n li il nli l 4 PE 4 r l ml 2.
Figure imgf000018_0002
Tabla 14. Concentración másica (y) en [|xg/mL] para las sustancias activas del propóleo 1-4 en diluciones eficaces del extracto líquido de propóleo obtenido con la mezcla de polietilenglicol 400 (PEG 400; 97 % p/p) y lecitina de soja r l ml .
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Tabla 15. Concentración másica (y) en [|xg/mL] para las sustancias activas del propóleo 5-10 en diluciones eficaces del extracto líquido de propóleo obtenido con la mezcla de polietilenglicol 400 (PeG 400; 97 % p/p) y lecitina de soja r l m l .
Figure imgf000019_0002
El efecto antimicrobiano (MIC) global de cada uno de los extractos líquidos de propóleo ensayados se alcanza mediante un efecto sinérgico de varias sustancias activas 1-10. Un hecho interesante y completamente inesperado es que la mezcla de las sustancias activas 1-10 en concentraciones pequeñas es más eficaz que la de concentraciones muy superiores de determinadas sustancias activas 1-10 (puras).
La formulación de la presente invención es la más eficaz contra los microorganismos grampositivos, tales como Staphylococcus spp., pero, como se puede observar en la tabla 9, en una concentración superior también es eficaz contra algunas bacterias gramnegativas: E. coli y A. baumanii, así como hongos C. albicans.
Utilización del extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención
El extracto de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, según la presente invención, contiene concentraciones estandarizadas de sustancias muy bioactivas:
(i) ácido p-cumárico (1); 100-1.300 |xg/mL;
(ii) ácido trans-ferúlico (2); 75-800 |xg/mL;
(iii) ácido cafeico (3); 25-300 |xg/mL; y
(iv) 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE); 40-400 |xg/mL
Debido al contenido estandarizado de las sustancias activas clave 1-4, el extracto líquido de propóleo, según la presente invención, constituye un ingrediente farmacéutico activo (API) para utilización en seres humanos y animales, un ingrediente cosmético activo (ACI), o un ingrediente funcional para alimentos o piensos para animales, que está caracterizado por los siguientes efectos farmacológicos beneficiosos:
(i) antinflamatorios; véanse las referencias 1, 8, 9, 11, 12, 13, 17 de la bibliografía;
(i) antioxidantes; véanse las referencias 8, 9, 14, 15, 20 de la bibliografía;
(i) inmunomoduladores; véanse las referencias 1, 8, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20 de la bibliografía;
(iv) hepatoprotectores; véase la referencia 9 de la bibliografía;
(v) antimicrobianos; entre los que se incluyen también antibacterianos, antivíricos, antifúngicos y antiprotozoicos; véanse las referencias 9, 10, 12, 15, 16, 18 de la bibliografía;
(i) antitumorales; véanse las referencias 9, 10, 11, 14, 19 de la bibliografía; y
(vii) antineoplásicos; véanse las referencias 11, 14 de la bibliografía.
Otros efectos valiosos del extracto líquido de propóleo, según la presente invención, son los efectos fungicidas, bactericidas, viricidas, insecticidas y nematicidas en la protección de las plantas. Debido a la fuerte actividad antioxidante, el extracto líquido de propóleo, según la presente invención, fortalece indirectamente las plantas y su resistencia contra los factores del estrés abiótico, y las ayuda contra las infecciones. Debido a esto, se utiliza como agente fortificante para plantas, véanse las referencias 21-25 de la bibliografía.
El extracto líquido de propóleo, según la presente invención, se utiliza como:
(i) un ingrediente farmacéutico activo, o un excipiente, para la producción de productos farmacéuticos seleccionados del grupo que consiste en: fármacos, productos sanitarios o remedios;
(ii) un ingrediente cosmético activo, o un excipiente, para la producción de productos cosméticos;
(iii) un ingrediente alimentario para la producción de productos alimentarios funcionales, suplementos alimentarios, o alimentos con fines nutricionales especiales;
(iv) un ingrediente farmacéutico activo, o un excipiente, para la producción de productos veterinarios seleccionados del grupo que consiste en: medicamentos veterinarios; piensos para animales; suplementos para piensos para animales; o remedios para utilización en veterinaria; o
(v) un ingrediente agroquímico activo, o un excipiente, para la producción de productos agroquímicos seleccionados del grupo que consiste en: fungicidas, bactericidas, viricidas, insecticidas, nematicidas y fortificantes para plantas; que es especialmente adecuado para la agricultura ecológica.
Composición farmacéutica a base de dicho extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención Además, la presente invención da a conocer la composición farmacéutica que se basa en dicho extracto líquido de propóleo estandarizado como ingrediente farmacéutico activo (API). La composición farmacéutica, según la presente invención, consiste en:
(I) el extracto líquido de propóleo, según la presente invención; del 5-95 % p/p; y
(II) uno o más excipientes farmacéuticos, necesarios para la preparación de la forma farmacéutica final, seleccionados del grupo que consiste en: una solución, una suspensión, un gel, una crema, una pomada, un aerosol para aplicación oral o nasal; hasta el 100 % p/p de la composición final;
en la que dicha composición está caracterizada por contenidos cuantitativos de, como mínimo, dos de cuatro sustancias activas clave del propóleo, comprendidos en los siguientes valores:
(i) ácido p-cumárico (1); de 10-1.300 |xg/g;
(ii) ácido trans-ferúlico (2); de 10-800 |xg/g;
(iii) ácido cafeico (3); de 5-300 |xg/g; y
(iv) 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE); de 5-400 |xg/g.
De ese modo, los excipientes farmacéuticos (sustancias auxiliares) se seleccionan del grupo que consiste en: diluyentes, humectantes, conservantes, agentes quelantes, antioxidantes, espesantes, emolientes, emulsionantes, agentes de tonicidad y agentes para el control del pH.
El diluyente es un líquido farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en: agua purificada; etanol; 1,2-propilenglicol; polietilenglicoles (PEG) líquidos, tales como PEG 200, p Eg 400 o PEG 600; o mezclas de estas sustancias.
El humectante se selecciona del grupo que consiste en: glicerol, sorbitol, 1,2-propilenglicol, o mezclas de estas sustancias.
El conservante se selecciona del grupo que consiste en: parabenos, como 4-hidroxibenzoato de metilo, 4-hidroxibenzoato de etilo, 4-hidroxibenzoato de propilo, 4-hidroxibenzoato de butilo; 4-cloro-m-cresol; triclosán; alcohol bencílico; 2-fenoxietanol; ácido benzoico y sus sales, como benzoato de sodio; ácido sórbico o sus sales, tales como sorbato de potasio; ácido deshidroacético (3-acetil-2-hidroxi-6-metil-4H-piran-4-ona); clorhexidina y sus sales, como digluconato de clorhexidina; sales de amonio cuaternario, tales como cloruro de benzalconio o bromuro de cetrimonio; o mezclas de estas sustancias.
El agente quelante se selecciona del grupo que consiste en: sales de sodio o potasio del ácido etilendiaminotetracético (EDTA), ácido dietilentriaminopentacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA); sales de citrato solubles, como citrato de trisodio dihidratado (Na3C6^ O 7^ 2H2O); o mezclas de estas sustancias. Un agente quelante típico es el edetato de disodio dihidratado (Na2EDTA^2H2O).
El antioxidante se selecciona del grupo que consiste en: a-tocoferol y sus ésteres, tales como succinato de a-tocoferilo; ácido ascórbico y sus sales, como ascorbato de sodio; 2,6-di-ferc-butil-4-metilfenol (BHT); ferc-butil-anisol (BHA); o mezclas de estas sustancias.
El espesante se selecciona del grupo que consiste en: goma de celulosa, como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxietilcelulosa (HEC), metilcelulosa (MC), carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC); polímeros sintéticos, tales como alcohol polivinílico (PVA), ácido poliacrílico (PAA) y sus copolímeros, polivinilpirrolidona (PVP); diversas gomas, como goma arábiga, goma xantana, tragacanto; ácido algínico y sus sales, como alginato de sodio; sales metálicas de ácidos grasos superiores, tales como monoestearato de aluminio, diestearato de aluminio, triestearato de aluminio; o mezclas de estas sustancias.
El emoliente se selecciona del grupo que consiste en: vaselina; aceite mineral; aceites vegetales, como aceite de almendras, girasol u oliva; triglicéridos de cadena media; ésteres naturales o sintéticos de ácidos grasos superiores y alcoholes monovalentes, tales como miristato de isopropilo o aceite de jojoba; ceras, como cera de abejas; aceite de silicona; ácidos grasos superiores, como ácido oleico o ácido esteárico; alcoholes grasos superiores, tales como alcohol cetílico; o mezclas de estas sustancias.
El emulsionante se selecciona del grupo que consiste en: lanolina; lanolina etoxilada; alcoholes lanolínicos; alcoholes lanolínicos etoxilados; lecitina, lecitina hidrolizada; monoésteres y diésteres de glicerol y ácidos grasos superiores, tales como monoestearato de glicerol; ésteres de sorbitano de ácidos grasos superiores, como monoestearato de sorbitano; alcoholes grasos superiores etoxilados, tales como polioxietilen(23) lauril éter u oleato de polioxietileno(2), en los que el número 23 o 2 representa el número de unidades de óxido de etileno; ésteres de ésteres de sorbitano etoxilados, como polisorbato 60; jabones hidrosolubles, tales como estearato de sodio; sulfatos hidrosolubles de alcoholes grasos superiores, como laurilsulfato de sodio; fosfatos hidrosolubles de ácidos grasos, tales como cetilfosfato de potasio; o mezclas de estas sustancias.
El agente de tonicidad se emplea principalmente en las formas farmacéuticas que se aplican sobre la mucosa, por ejemplo, la mucosa nasal, y se selecciona del grupo que consiste en: cloruro de sodio (NaCl), glicerol 1,2-propilenglicol, o mezclas de estas sustancias.
En el agente para el control del pH se incluyen los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables para disminuir o aumentar el valor del pH, y los sistemas de tampones. Este se selecciona del grupo que consiste en: ácido clorhídrico (HCl), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido fosfórico (H3PO4), ácido cítrico, ácido acético, hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (Ko H), hidróxido de amonio (NH4OH), dihidrogenofosfato de sodio (NaH2PO4), hidrogenofosfato de sodio (Na2HPO4), dihidrogenocitrato de sodio (NaH2C6H5O7), hidrogenocitrato de sodio (Na2HC6H5O7), citrato de sodio (Na3C6H5O7), o mezclas de estas sustancias.
Preparación de la composición farmacéutica, según la presente invención
La composición farmacéutica de la presente invención se prepara mediante el procedimiento que incluye las siguientes etapas:
(i) adición de extracto líquido de propóleo estandarizado, según la presente invención, en el diluyente, y su homogeneización;
(ii) adición de uno o más excipientes diferentes, y su homogeneización;
en el que la etapas (i) e (ii) se llevan a cabo a una temperatura de 10-100 °C, preferentemente a una temperatura de 20-60 °C, durante 1 -5 minutos; seguidas de, en el caso de la preparación de la forma farmacéutica de:
(iii.a) una solución o una solución para aerosol; se realiza la filtración de la solución final, lo que incluye filtración estéril si es necesaria;
(iii.b) un gel o una suspensión; se lleva a cabo la adición de espesante y su homogeneización;
(iii.c) una crema; se lleva a cabo la preparación de la fase grasa mediante mezcla del emoliente y el emulsionante, y su homogeneización, a una temperatura de 50-80 °C, durante 1-15 minutos, y a continuación se lleva a cabo la adición de la solución de la etapa (ii) calentada hasta 50-80 °C, seguida de emulsificación, con la utilización de un homogeneizador de alta cizalladura o alta presión, a una temperatura de 50-80 °C, preferentemente de 55-65 °C, durante 1-30 minutos, con homogeneización posterior a una temperatura de 65-20 °C, durante 10-120 minutos; o
(iii.d) una pomada; se realiza la mezcla de la solución de la etapa (ii) con la mezcla previamente fundida de emoliente y, en última instancia, emulsionante a una temperatura de 50-70 °C, durante 5-30 minutos, seguida de homogeneización a una temperatura de 70-20 °C, durante 10-120 minutos.
Entre los procedimientos para la preparación de la composición farmacéutica de la presente invención también se pueden incluir diversos procedimientos tecnológicos habituales alternativos para la producción de dichas formas farmacéuticas, tal y como saben los expertos en la materia de la tecnología farmacéutica.
Los ejemplos representativos de la producción de la composición farmacéutica, según la presente invención, se describen en los ejemplos 11-16.
Como ejemplo especial, en la presente invención se presenta la forma farmacéutica final resumida de una solución para aplicación intramamaria, que se da a conocer en el ejemplo 11. En este caso, el extracto líquido de propóleo estandarizado primario, cuya preparación se describe en el ejemplo 9, tan solo se diluye con el disolvente de extracción, según la presente invención; en este caso, con la mezcla de polietilenglicol 400 (97 % p/p) y lecitina de soja (3 % p/p); que en la presente invención es en función del diluyente. La solución para aplicación intramamaria obtenida de ese modo proporciona el contenido cuantitativo de las sustancias activas clave 1-4 comprendido en los límites mencionados anteriormente; véase la tabla 16.
Tabla 16. Resultados del análisis cuantitativo de las sustancias activas 1-10 mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de la composición farmacéutica de la presente invención; la forma farmacéutica de una solución para aplicación intramamaria; el producto del ejemplo 11, caracterizada por la proporción en peso de fármaco r xr D R 1:2 il 1 x f l n li i m i n HPL .
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Un cromatograma de HPLC típico del análisis cuantitativo de la composición de la presente invención se muestra en la figura 5.
Estudios de los efectos farmacológicos de la composición farmacéutica de la presente invención
Los efectos farmacológicos de la composición de la presente invención, en la forma farmacéutica de la solución, el producto del ejemplo 11, seleccionados se estudiaron en estudios clínicos sobre la terapia de:
(i) la mastitis, inflamación de las ubres, en vacas;
(ii) la mastitis en cabras; y
(iii) la cicatrización de heridas en caballos.
Estudio de la terapia de la mastitis en vacas
El estudio del tratamiento de la mastitis en vacas se realizó en cinco granjas con ganado vacuno lechero de la raza Holstein. En el estudio participaron un total de 86 vacas, o 339 cuartos, en el que el cuarto de ubre se utilizó como unidad estadística. Los animales se mantuvieron libres en lechos profundos, y se alimentaron con premezcla estándar para ganado vacuno lechero, sin adición de antibióticos. El estudio fue autorizado por el comité de ética de medicina veterinaria. Se incluyeron animales y cuartos sanos, sin síntomas clínicos de mastitis y con un recuento de células somáticas (SCC) inferior a 200.000/mL, así como cuartos infectados, con un SCC superior a 200.000/mL. Se realizó un estudio clínico aleatorizado, con grupos cruzados, de la toxicidad y la eficacia con la aplicación intramamaria (i.mam.) de la composición de la presente invención, en forma de solución, en las condiciones de campo. La composición del ejemplo 11 de la presente invención se aplicó tres veces en los cuatro cuartos de ubre de las vacas: durante el ordeño matutino, el ordeño vespertino y al día siguiente, después del ordeño matutino. El procedimiento detallado se describe en el ejemplo 17, mientras que la tabla 17 representa la cura bacteriológica para cada patógeno identificado en un determinado número de cuartos antes de la primera aplicación intramamaria.
Tabla 17. Eficacia del tratamiento bacteriológico, o la cura bacteriológica, de la mastitis en vacas después de la a licación intramamaria de la formulación del eem lo 11 de la resente invención3.
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La pauta de administración de tres veces (dos días) de la composición del ejemplo 11 proporcionó una cura bacteriológica en el 100 % de los casos en un plazo de tan solo 7 días.
En comparación, el antibiótico de tipo cefalosporina ceftiofur logra una cura bacteriológica del 66 %, pero solo después de la aplicación intramamaria diaria durante 8 días, mientras que, después de 5 días, produce la cura en tan solo el 54 % de los casos; véase la referencia 30 de la bibliografía. En la mastitis subclínica causada por S. uberis, una terapia de dos días con pirlimicina condujo a la curación en el 58,1 % de los casos, mientras que las terapias durante 5 y 8 días proporcionaron la cura en el 68,8 % y 80 % de los casos; véase la referencia 30 de la bibliografía:
30) S. P. Oliver, B. E. Gillespie, S. J. Headrick, H. Moorehead, P. Lunn, H. H. Dowlen, D. J. Johnson, K. C. Lamar, S. T. Chester, W. M. Moseley: Efficacy of extended Ceftiofur intramammary therapy for treatment of subclinical mastitis in lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 87 (2004) 2393-2400.
Alternativamente, en la terapia de la mastitis en vacas, también se puede utilizar con éxito la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de una suspensión para aplicación intramamaria, tal y como se describe en el ejemplo 12.
Estudio de la terapia de la mastitis en cabras
El estudio del tratamiento de la mastitis en cabras se llevó a cabo en la granja de cabras alpinas OPG Matijasec, Sigetec Ludbreski, Croacia, sobre 25 cabras. Todas las cabras estaban diagnosticadas con mastitis subclínica en las mitades de ubre derecha e izquierda. Las cabras cuya leche obtuvo resultados positivos en un estudio microbiológico se dividieron en dos grupos: a un grupo se le aplicó la composición del ejemplo 11 de la presente invención, mientras que al otro grupo se le aplicó la suspensión intramamaria de amoxicilina y ácido clavulánico (Klavuxil®; Genera, Croacia); a todas mediante una pauta de aplicación de tres veces. La tolerabilidad y la cura bacteriológica de las mitades se supervisaron en paralelo después de la aplicación intramamaria de la composición del ejemplo 11. La aplicación de tres veces (dos días) de la formulación de la presente invención proporcionó una cura bacteriológica en el 75 % de las mitades infectadas, y en el 85 % después de 14 días. Esto demostró ser más eficaz que la administración intramamaria de antibióticos, que permitió la cura bacteriológica en el 73,3 % de los casos. Los resultados del estudio demuestran que el tratamiento de la mastitis en cabras con la composición del ejemplo 11 puede proporcionar una cura bacteriológica a tiempo, sin la utilización de antibióticos.
El procedimiento detallado del estudio se describe en el ejemplo 18, mientras que los resultados de la cura bacteriológica se presentan en la tabla 18.
Tabla 18. Eficacia del tratamiento bacteriológico, o la cura bacteriológica, de la mastitis en cabras después de la aplicación intramamaria de la formulación del ejemplo 11 de la presente invención, en comparación con un ni i i n m in i n fi m xi ilin i l v l ni .
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Comparando la actividad de la aplicación intramamaria de amoxicilina, como antibiótico de amplio espectro, que es adecuada para el tratamiento de la mastitis causada por los patógenos encontrados en las muestras de leche, y de la composición del ejemplo 11, se demostró una actividad más fuerte de esta última. Siete días después de la aplicación de amoxicilina, solo el 60 % de las mitades estaban curadas, mientras que el resultado para la composición del ejemplo 11 fue del 75 %. 14 días después de la primera aplicación, el porcentaje total de mitades bacteriológicamente curadas con la aplicación de antibiótico fue del 73,3 %, mientras que para la composición ensayada fue del 85 %.
A partir de dichos resultados, se puede observar una alta eficacia de la actividad antinflamatoria y antimicrobiana de la composición de la presente invención en el tratamiento de la mastitis. La eficacia es superior a la de la terapia clásica, como la terapia con una combinación fija de amoxicilina y ácido clavulánico, como antibiótico de amplio espectro.
Alternativamente, en la terapia de la mastitis en cabras, también se puede utilizar con éxito la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de una suspensión para aplicación intramamaria, tal y como se describe en el ejemplo 12.
Se puede concluir que la composición de la presente invención, además de otras propiedades, está caracterizada por una actividad antimicrobiana contra una serie de bacterias y hongos, en la que la eficacia antimicrobiana es, en comparación con los antibióticos clásicos, superior en condiciones in vivo que en condiciones in vitro. No solo es un agente antimicrobiano, sino también un agente antinflamatorio e inmunomodulador.
Los efectos inmunomoduladores del propóleo están estrechamente relacionados con sus efectos antioxidantes, y el estrés oxidativo es una parte integral de la patogénesis de la mastitis; véase, por ejemplo, la referencia 31 de la bibliografía:
31) O. Atakisi, H. Oral, E. Atakisi, O. Merhan, S. Metin Pancarci, A. Ozcan, S. Marasli, B. Polat, A. Colak, S. Kaya: Subclinical mastitis causes alterations in nitric oxide, total oxidant and antioxidant capacity in cow milk, Res. Vet. Sci.
89 (2010) 10-13.
Revisión del caso de cicatrización de heridas en caballos
Se describe el caso de la cicatrización de una herida en la pata delantera de una yegua. Era una herida profunda, en el área del espolón de la pata delantera, que surgió cuando la pata trasera rozó la pata delantera durante el aterrizaje. Antes de comenzar la administración de la composición del ejemplo 11, la herida se había tratado de manera conservadora, sin éxito, con diferentes preparados.
A continuación, se lavó la herida con una solución fisiológica, se secó y se trató con la composición del ejemplo 11 una vez al día durante 5 días. Se pudo observar la mejora, como epitelización, después de 48 horas, y la cicatrización total de la herida se produjo después de 96 horas. La yegua cojeó con intensidad durante varios días, mientras que después de ello, no se observaron signos de cojera. La recuperación fue completa. Una descripción detallada de este caso se describe en el ejemplo 19.
A pesar del hecho de que, para sacar conclusiones más precisas debe realizarse un estudio clínico detallado, es evidente para los expertos en la materia que la composición, según la presente invención, actúa eficazmente como un agente para la cicatrización de heridas. Dado que se sabe, a partir de la bibliografía, que las actividades antinflamatorias, antioxidantes y epitelizantes son importantes para el proceso de cicatrización de las heridas, la estimulación de la síntesis de colágeno, como con la composición de la presente invención, junto con la actividad antimicrobiana, es parte del espectro de efectos farmacológicos; para realizar una comparación, véase la referencia 32 de la bibliografía:
32) S. Marinotti, E. Ranzato: Propolis: a new frontier for wound healing, Burns Trauma (2015) 3:9, doi 10.1186/s41038-015-0010-z.
Utilización de la composición farmacéutica, según la presente invención
La composición farmacéutica de la presente invención se utiliza para el tratamiento de enfermedades y afecciones en los seres humanos y los animales, de los grupos de: enfermedades inflamatorias; infecciones bacterianas; infecciones fúngicas; enfermedades víricas; enfermedades autoinmunitarias, trastornos gastrointestinales funcionales; para la regeneración de la mucosa, el tratamiento de quemaduras y la cicatrización de heridas; así como neoplasias malignas.
Entre las enfermedades y afecciones inflamatorias incluidas están: gingivitis, periodontitis, laringitis, gastritis, colitis, hemorroides, dermatitis, inflamación del oído externo, sinusitis, rinitis, vaginitis y mastitis.
La composición farmacéutica de la presente invención se utiliza para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por bacterias de los grupos de:
(i) bacterias grampositivas: Staphylococcus spp.: Staphylococcus aureus, MRSA (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina), MSSA (Staphylococcus aureus sensible a la meticilina), Staphylococcus intermedius, Staphylococcus pseudintermedius; estafilococos coagulasa-negativos: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus; Streptococcus spp.: Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Streptococcus thermophilus; Peptostreptococcus spp.; Corynebacterium spp.: Corynebacterium bovis; Trueperella pyogenes; Nocardia spp.; Bacillus subtilis; Bacillus cereus; enterococos: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis; enterococos resistentes a la vancomicina (VRE): Enterococcus casseliflavus; y
(ii) bacterias gramnegativas: Escherichia coli; Acinetobacter baumani; Pseudomonas aeruginosa; Haemophilus influenzae; Salmonella choleraesuis; Yersinia enterocolitica; Enterobacter spp. (Enterobacter cioacae); Klebsiella spp.: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca; Shigella flexneri; Burkholderia cepacia; Proteus mirabilis; Proteus vulgaris; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinomyces israelii; Bacteroides fragilis; Helicobacter pylor; Campylobacter coii; Campylobacter jejuni; Porphyromonas gulae; Porphyromonas salivosa; Porphyromonas denticanis; Prevotella intermedia; Treponema spp.; Bacteroides splanchnicus.
Además, la presente composición farmacéutica se utiliza para el tratamiento de infecciones fúngicas causadas por hongos, tales como: Candida spp.: Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida kruzei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis; Aspergillus spp.: Aspergillus niger, Aspergillus versicolor; Penicillium pinophilum; Paecilomyces variotii; Trichoderma virens; Chaetomium globosum y Malassezia pachydermatis.
Asimismo, la composición de la presente invención se utiliza para el tratamiento de enfermedades víricas causadas por virus tales como: virus del herpes simple (HSV, “herpes simplex virus”); virus del papiloma humano (HPV, “human papillomavirus”); virus de Epstein-Barr (EBV, “Epstein-Barr virus”); citomegalovirus (CMV, “cytomegalovirus”); poliovirus; virus de la gripe A y la gripe B; retrovirus; virus de la variolovacuna; virus del resfriado común: rinovirus, picornavirus, virus paragripal humano (HPIV, “human parainfluenza virus”), metaneumovirus humano (HMPV, “human metapneumovirus”), coronavirus, adenovirus, virus respiratorio sincicial humano (HRSV, “human respiratory syncytial virus”), enterovirus.
Alternativamente, la composición farmacéutica, según la presente invención, se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como: psoriasis, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, celiaquía y esclerosis múltiple.
Adicionalmente, la composición farmacéutica de la presente invención se utiliza para el tratamiento de neoplasias malignas, tales como: neoplasias malignas de la piel y las mucosas, tumores gastrointestinales, carcinoma colorrectal.
La composición farmacéutica de la presente invención se utiliza para el tratamiento de trastornos gastrointestinales funcionales como los siguientes: trastornos del esófago, estómago, duodeno, intestino delgado y colon, dolor gastrointestinal de origen central, trastornos de la vesícula biliar y el esfínter de Oddi, trastornos anorrectales, trastornos gastrointestinales específicos de los niños y los adolescentes.
Específicamente, la composición de la presente invención se utiliza para el tratamiento de la mastitis en animales.
Ejemplos
Observaciones generales
Como propóleo primario, se utilizó el propóleo bruto de tipo álamo de Hedera Ltd. El etanol (96 %), el polietilenglicol 200, 400 y 600, y la lecitina de soja en polvo (SL) se adquirieron de Fagron Croatia Ltd (Croacia). La lecitina de colza (RL) y la lecitina de colza hidrolizada (HRL) se adquirieron de Pfannenschmidt (Alemania). La lecitina de girasol desaceitada (SUL) se adquirió de Barentz (Países Bajos). El diestearato de aluminio se adquirió de Sigma-Aldrich (Estados Unidos). Todos los demás materiales de partida se adquirieron de proveedores locales.
Las muestras de compuestos químicamente puros con fines analíticos: ácido p-cumárico (1; HPLC >98 %), ácido trans-ferúlico (2; 99 %), ácido cafeico (3; HPLC >98 %), 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo (CAPE; 4; HPLC
>97 %), ácido frans-cinámico (5; GC >96,5 %), crisina (6; HPLC >98 %), pinocembrina (7; TLC >95 %), HPLC >95 %), apigenina (9; HpLC >99 %) y canferol (10; HPLC >90 %), que sirvieron como estándares analíticos cuantitativos para la determinación de su contenido cuantitativo en los extractos líquidos de propóleo, se adquirieron de Sigma-Aldrich (Estados Unidos).
El término “temperatura ambiente” se refiere al intervalo de temperatura de 20-25 °C. La abreviatura “min” significa minutos. El rendimiento (% del rendimiento teórico) se expresa como el porcentaje en peso (% p/p) de extracto líquido de propóleo aislado con respecto a la masa de disolvente de extracción de partida (etanol, PEG, etanol lecitina, PEG lecitina). El contenido cuantitativo de las sustancias activas 1-10 en los extractos líquidos de propóleo se expresa como la concentración másica (y) en microgramos por mililitro [|xg/mL], mientras que su composición cuantitativa en la composición farmacéutica de la presente invención se expresa en microgramos por gramo del producto final (forma farmacéutica) [|xg/g].
Ejemplo 1. Preparación de extracto líquido de propóleo mediante la utilización de etanol al 96 % como disolvente de extracción
Pretratamiento del propóleo antes de la extracción: se enfrió la muestra de propóleo bruto (de tipo álamo; 1 kg) en un refrigerador a -20 °C durante, como mínimo, 1 hora. A continuación, se molió la muestra en el molino.
Extracción con etanol al 96 %: se añadió etanol (96 %; 70,00 g) al propóleo molido (30,00 g). Se permitió que la mezcla obtenida de ese modo reposara a temperatura ambiente durante 72 horas, con agitación periódica. A continuación, se filtró la mezcla a través de papel de filtro (banda negra), produciendo 60,00 g (85,7 %) de extracto líquido de propóleo en forma de una solución de color marrón oscuro con un olor ligeramente intenso a propóleo.
A efectos de ensayar la concentración inhibidora mínima (MIC) del extracto alcohólico de propóleo descrito en el ejemplo 10, se repitió el mismo procedimiento en la proporción de fármaco respecto a extracto (De R) de 1:2.
Ejemplo 2. Preparación de extracto líquido de propóleo mediante la utilización de polietilenglicol 400 como disolvente de extracción
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con polietilenglicol 400 (PEG 400; 70,00 g). Se permitió que la mezcla obtenida de ese modo reposara a temperatura ambiente durante 72 horas, con agitación periódica. A continuación, se filtró la mezcla a través del papel de filtro (banda negra). Esto produjo 55,00 g (78,6 %) de un extracto líquido de propóleo en forma de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor ligeramente intenso semejante al del propóleo.
A efectos de ensayar la concentración inhibidora mínima (MIC) del extracto de propóleo extraído con polietilenglicol descrito en el ejemplo 10, se repitió el mismo procedimiento en la proporción de fármaco respecto a extracto (DER) de 1:2.
Ejemplo 3. Procedimiento analítico de HPLC para la determinación cuantitativa de las sustancias activas 1-10 en extractos líquidos de propóleo
Los análisis cuantitativos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se realizaron con el procedimiento desarrollado especialmente a efectos de detectar las sustancias activas clave 1-4 y los ingredientes activos adicionales 5-10 del propóleo.
Las muestras de estándares disponibles en el mercado de las sustancias activas 1-10 se prepararon para el análisis mediante dilución con una mezcla de etanol:agua, 75:25, v/v, hasta la concentración de 100 |xg/mL.
Las muestras de extractos líquidos de propóleo (100 |j.L), según la presente invención, se diluyeron, antes del análisis, con una mezcla de etanol:agua, 75:25, v/v (900 |j.L), en la proporción 1:10 p/p (dilución de 10x).
Los análisis se llevaron a cabo en el instrumento Shimadzu LC201CHT, equipado con un inyector de muestras automático, una bomba, un desgasificador, un horno de columna y un detector UV-VIS, en las siguientes condiciones:
(i) columna cromatográfica: Ascentis express; C18; dimensiones: 15 cm x 3,0 mm; diámetro de las partículas de la columna: 2,7 |jm;
(ii) fase móvil: A = solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 %, B = metanol; gradiente: 0 minutos, A al 80 %, B al 20 %; 3 minutos, A al 70 %, B al 30 %; 60 minutos, A al 20 %, B al 80 %; 90 minutos, A al 20 %, B al 80 %; 100 minutos, A al 70 %, B al 30 %; 105 minutos, A al 80 %, B al 20 %;
(iii) temperatura de la columna: 30 °C;
(iv) caudal: 0,25 mL/min;
(v) tiempo de análisis: 110 minutos;
(vi) longitud de onda en el detector UV-VIS: para detección: 370 nm, para integración: 290 nm;
(vii) volumen de inyección: 10 |j.L;
(viii) presión: 210-290 bar.
En dichas condiciones, las sustancias activas clave 1-4 y los ingredientes adicionales 5-10 tienen los siguientes tiempos de retención (ír):
(i) ír [ácido p-cumárico (1)] = 14,13 min; ír [ácido frans-ferúlico (2)] = 15,31 min; ír [ácido cafeico (3)] = 10,57 min; ír [3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo; CAPE (4)] = 48,62 min;
(ii) ír [ácido frans-cinámico (5)] = 29,76 min; ír [crisina (6)] = 44,68 min; ír [pinocembrina (7)] = 47,39 min; ír [galangina (8)] = 49,94 min; ír [apigenina (9)] = 37,72 min; ír [canferol (10)] = 36,87 min.
Los tiempos de retención de las sustancias activas clave del propóleo 1-4 y los ingredientes activos adicionales 5-10 se presentan en la tabla 1.
Ejemplo 4. Preparación de extractos líquidos de propóleo estandarizados mediante la utilización del disolvente de extracción a base de una mezcla de etanol y lecitina
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con el disolvente de extracción de la siguiente composición (experimentos E1-8):
E1: etanol al 96 % (67,00 g; 95,7 %) y lecitina de soja (SL; 3,00 g; 4,3 %);
E2: etanol al 96 % (60,00 g; 85,7 %) y lecitina de soja (SL; 10,00 g; 14,3 %);
E3: etanol al 96 % (50,00 g; 71,4 %) y lecitina de soja (SL; 20,00 g; 28,6 %);
E4: etanol al 96 % (40,00 g; 57,1 %) y lecitina de soja (SL; 30,00 g; 42,9 %);
E5: etanol al 96 % (67,00 g; 98,9 %) y lecitina de colza (Rl ; 3,00 g de preparado al 25 %; 0,75 g de lecitina, 1,1 %); rendimiento teórico en E5 = 67 g de etanol 0,75 g de lecitina = 67,75 g;
E6: etanol al 96 % (60,00 g; 96,0 %) y lecitina de colza (RL; 10,00 g de preparado al 25 %; 2,50 g de lecitina, 4,0 %); rendimiento teórico en E6 = 60 g de etanol 2,50 g de lecitina = 62,50 g;
E7: etanol al 96 % (67,00 g; 97,8 %) y lecitina de colza hidrolizada (HRL; 3,00 g de preparado al 50 %; 1,50 g de lecitina de colza hidrolizada; 2,2 %); rendimiento teórico en E7 = 67 g de etanol 1,50 g de lecitina = 68,50 g;
E8: etanol al 96 % (60,00 g; 92,3 %) y lecitina de colza hidrolizada (HRL; 10,00 g de preparado al 50 %; 5,00 g de lecitina; 7,7 %); rendimiento teórico en E8 = 60 g de etanol 5,00 g de lecitina = 65,00 g.
Se agitó la mezcla obtenida de ese modo a temperatura ambiente durante 1 hora, y se permitió que reposara a temperatura ambiente durante 72 horas, con agitación periódica. A continuación, se filtró la mezcla a través del papel de filtro (banda negra). Esto produjo 50-60 g (71,0-85,7 %) de un extracto líquido de propóleo en forma de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor ligeramente intenso semejante al del propóleo.
El extracto líquido de propóleo primario preparado de ese modo se sometió a análisis cuantitativos del contenido de las sustancias activas clave 1-4, así como de los ingredientes adicionales 5-10, según el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 3. Los resultados se presentan en las tablas 3 y 4.
Los extractos líquidos de propóleo primarios preparados de tal modo en los disolventes de extracción (ES) descritos en los experimentos E1-E8, con contenidos cuantitativos conocidos de las sustancias activas 1-4, se estandarizaron, mediante dilución con el mismo ES que se empleó en la etapa de extracción, hasta el nivel deseado de la composición cuantitativa de sustancias activas 1-4, según la presente invención.
Ejemplo 5. Preparación de extractos líquidos de propóleo estandarizados mediante la utilización del disolvente de extracción a base de una mezcla de polietilenglicol 400 y lecitina
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con el disolvente de extracción de la siguiente composición (experimentos E1-E8):
E1: polietilenglicol 400 (PEG 400; 67,00 g; 97 %) y lecitina de soja (SL; 3,00 g; 3 %);
E2: polietilenglicol 400 (PEG 400; 60,00 g; 90 %) y lecitina de soja (SL; 10,00 g; 10 %);
E3: polietilenglicol 400 (PEG 400; 67,00 g; 98,9 %) y lecitina de colza (RL; 3,00 g; preparado al 25 %; 0,75 g de lecitina; 1,1 %); rendimiento teórico en E3 = 67 g de PEG 400 0,75 g de lecitina = 67,75 g;
E4: polietilenglicol 400 (PEG 400; 60,00 g; 96,0 %) y lecitina de colza (RL; 10,00 g; preparado al 25 %; 2,50 g de lecitina; 4,0 %);
rendimiento teórico en E4 = 60 g de PEG 400 2,50 g de lecitina = 62,50 g;
E5: polietilenglicol 400 (PEG 400; 67,00 g; 97,8 %) y lecitina de colza hidrolizada (HRL; 3,00 g; preparado al 50 %; 1,50 g de lecitina hidrolizada; 2,2 %); rendimiento teórico en E5 = 67 g de PEG 400 1,50 g de lecitina = 68,50 g; E6: polietilenglicol 400 (PEG 400; 60,00 g; 92,3 %) y lecitina de colza hidrolizada (HrL; 10,00 g; preparado al 50 %; 5,00 g de lecitina; 7,7 %); rendimiento teórico en E6 = 60 g de PEG 400 5,00 g de lecitina = 65,00 g.
Se agitó la mezcla obtenida de ese modo a temperatura ambiente durante 1 hora, y se permitió que reposara a temperatura ambiente durante 72 horas, con agitación periódica. A continuación, se filtró la mezcla a través del papel de filtro (banda negra). Esto produjo 45-55 g (69,0-78,6 %) de un extracto líquido de propóleo en forma de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor ligeramente intenso semejante al del propóleo.
El extracto líquido de propóleo primario preparado de ese modo se sometió a análisis cuantitativos del contenido de las sustancias activas clave 1-4, así como de los ingredientes adicionales 5-10, según el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 3. Los resultados se presentan en las tablas 5 y 6.
Los extractos líquidos de propóleo primarios preparados de tal modo en los disolventes de extracción (ES) descritos en los experimentos E1-E6, con contenidos cuantitativos conocidos de las sustancias activas 1-4, se estandarizaron, mediante dilución con el mismo ES que se empleó en la etapa de extracción, hasta el nivel deseado de la composición cuantitativa de sustancias activas 1-4, según la presente invención.
Ejemplo 6. Preparación de extractos líquidos de propóleo estandarizados mediante la utilización del disolvente de extracción a base de una mezcla de polietilenglicol 200 y lecitina de soja
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con el disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 200 (149,85 g; 99,9 %) y lecitina de soja (SL; 0,15 g; 0,1 %). Se agitó la mezcla obtenida de ese modo a temperatura ambiente durante 1 hora, y se permitió que reposara a temperatura ambiente durante 48 horas, con agitación periódica. A continuación, se filtró la mezcla a través del papel de filtro (banda negra). Esto produjo 137,00 g (91,3 %) de un extracto líquido de propóleo en forma de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor ligeramente intenso semejante al del propóleo.
A continuación, se realizó un análisis cuantitativo mediante HPLC, según el procedimiento descrito en el ejemplo 3, para obtener el contenido cuantitativo de las sustancias activas clave 1-4. El filtrado se diluyó con el mismo disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 200 y lecitina de soja (SL), 99,9:0,1 p/p, hasta el nivel total de contenido de las sustancias activas 1-4, según la especificación del extracto líquido de propóleo de la presente invención.
Ejemplo 7. Preparación de extractos líquidos de propóleo estandarizados mediante la utilización del disolvente de extracción a base de una mezcla de polietilenglicol 600 y lecitina de girasol desaceitada
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con el disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 600 (PEG 600; 297,00 g; 99 %) y lecitina de girasol desaceitada (SUL; 3,00 g; 1,0 %). La mezcla obtenida de ese modo se calentó hasta 70 °C y se agitó exhaustivamente durante 3 horas. A continuación, se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se filtró a través del papel de filtro (banda negra). Esto produjo 261,00 g (87,0 %) de un extracto líquido de propóleo en forma de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor ligeramente intenso semejante al del propóleo.
A continuación, se realizó un análisis cuantitativo mediante HPLC, según el procedimiento descrito en el ejemplo 3, mediante el cual se determinó el contenido cuantitativo de las sustancias activas clave 1-4. El filtrado se diluyó con el mismo disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 600 y lecitina de girasol desaceitada (SUL), 99:1 p/p, hasta el nivel total de contenido de las sustancias activas 1-4, según la especificación del extracto líquido de propóleo de la presente invención.
Ejemplo 8. Preparación de extractos líquidos de propóleo estandarizados mediante la utilización del disolvente de extracción a base de una mezcla de polietilenglicol 200, polietilenglicol 600 y lecitina de colza hidrolizada
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con el disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 200 (p Eg 200; 150,00 g; 50 %), polietilenglicol 600 (139,50 g; 46,5 %) y lecitina de colza hidrolizada (HRL; 10,50 g; 3,5 %). La mezcla obtenida de ese modo se calentó a 100 °C, con agitación exhaustiva, durante 3 horas. A continuación, se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se filtró a través del papel de filtro (banda negra). Esto produjo 245,00 g (81,7 %) de un extracto líquido de propóleo en forma de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor ligeramente intenso semejante al del propóleo. A continuación, se realizó un análisis cuantitativo mediante HPLC, según el procedimiento descrito en el ejemplo 3, mediante el cual se determinó el contenido cuantitativo de las sustancias activas clave 1-4. El filtrado se diluyó con el mismo disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 200, polietilenglicol 600 y lecitina de colza hidrolizada (HRL), 50:46,5:3,5, p/p/p, hasta el nivel total de contenido de las sustancias activas 1-4, según la especificación del extracto líquido de propóleo de la presente invención.
Ejemplo 9. Preparación de extractos líquidos de propóleo estandarizados mediante la utilización de una mezcla de polietilenglicol 400 y lecitina de soja
Se mezcló el propóleo molido (30,00 g), cuyo pretratamiento se describe en el ejemplo 1, con el disolvente de extracción, la mezcla de polietilenglicol 400 (PeG 400; 87,30 g; 97 % m/m) y lecitina de soja (SL; 2,70 g; 3 % p/p). Se permitió que la mezcla obtenida de ese modo reposara para macerar, con agitación periódica, durante 72 horas. A continuación, se filtró la mezcla a través del papel de filtro (800 poros/cm2). Esto proporcionó 50-55 g de un líquido viscoso marrón oscuro, con un olor intenso semejante al del propóleo. El producto obtenido de ese modo se diluyó con el mismo disolvente de extracción hasta la masa de 60,00 g. De esta manera, se obtuvo el extracto resultante de proporción de fármaco respecto a extracto (DER) 1:2, o dichos 60 g de extracto a partir de 30 g de propóleo de partida.
A efectos de la preparación de la composición farmacéutica de la presente invención, el extracto líquido de propóleo preparado de tal modo:
(I) se sometió a un análisis cuantitativo mediante HPLC, según el procedimiento descrito en el ejemplo 3, para la determinación de las sustancias activas 1-4 y, posteriormente, con respecto a la concentración másica real de las sustancias activas 1-4 en dicho extracto preparado,
(II) se estandarizó, mediante dilución con una mezcla de disolventes puros (recién preparados): polietilenglicol 400 (97 % p/p) y lecitina de soja (3 % p/p);
hasta la concentración másica de las sustancias activas 1-4:
(i) ácido p-cumárico (1); 10-1.300 |xg/mL;
(ii) ácido trans-ferúlico (2); 10-800 |xg/mL;
(iii) ácido cafeico (3); 5-300 |xg/mL; y
(iv) 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo (4; CAPE); 5-400 |xg/mL;
dividida por el factor X/100, en el que X = porcentaje en peso %, p/p, de dicho extracto líquido de propóleo estandarizado en la formulación de la composición farmacéutica.
Ejemplo 10. Determinación de la eficacia antimicrobiana de extractos líquidos de propóleo estandarizados, según la presente invención. Determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC) sobre microorganismos patógenos modelo
Se determinaron las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de los extractos líquidos de propóleo, según la presente invención, con la utilización del producto del ejemplo 9, en comparación con extractos líquidos de propóleo análogos obtenidos con etanol al 96 % (producto del ejemplo 1) o con PEG 400 (producto del ejemplo 2), según las directrices del CLSI y los procedimientos del EUCAST; véanse las referencias 26-29 de la bibliografía.
La eficacia antimicrobiana se ensayó en condiciones in vitro sobre cepas de la ATCC de los siguientes microorganismos patógenos modelo (M): Staphylococcus aureus ATCC 29293 (M1); Staphylococcus aureus resistente a la meticilina; MRSA (colección del MfBf ; M2); Staphylococcus aureus sensible a la meticilina; MSSA (colección del MFBF; M3); Enterococcus faecalis ATCC 9212 (M4); Enterococcus faecalis VRE (colección del MFBF) (M5); Escherichia coli ATCC 10536 (M6); Acinetobacter baumanii ATCC 43498 (M7); Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (M8) y Candida albicans ATCC 90028 (M9).
Se llevó a cabo el procedimiento de microdilución en serie con el fin de determinar las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de los extractos. Se prepararon suspensiones de células a partir del cultivo original en tampón PBS (pH 7,4), y estas se ajustaron hasta 0,5 unidades McFarland mediante nefelometría. El ensayo se realizó mediante dilución en serie en placas de microtitulación de 96 pocillos, en el intervalo de 100 a 0,7125 ug/mL, mediante la adición de 100 uL de la solución de extracto de propóleo disuelto en caldo de Mueller Hinton. Después de la inoculación, se ajustaron 100 uL de cada cultivo bacteriano hasta 105 ufc/mL, las placas se incubaron durante 24 horas a 37 °C. La MIC se determinó mediante la adición de 10 uL de solución de 0,5 mg/mL de cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC; indicador redox) por pocillo individual y, después de la incubación durante 4 horas a 30 °C, se determinó la absorbancia mediante espectrofotometría a 490 nm de longitud de onda.
Los valores de la MIC se determinaron como la concentración de extracto de propóleo a la que se producía una reducción del 80 % en las bacterias (MICbü).
Para las especies fúngicas, los valores de la MIC se determinaron en medio RPMI con glucosa adicional, mediante el mismo esquema que con las bacterias. Después de la incubación (48 horas, 37 °C, condiciones aerobias, en la oscuridad), se añadió XTT (indicador redox), en combinación con menadiona, y se determinó la absorbancia mediante espectrofotometría a 540 nm de longitud de onda.
Los valores de la MIC se determinaron como la concentración de extracto de propóleo a la que se producía una reducción del 80 % en las bacterias o los hongos (MICbü).
El control negativo solo contenía el medio y el disolvente (sin microorganismos ni propóleo añadidos), mientras que el control positivo se expuso a la influencia de agentes antibióticos o antifúngicos.
Las concentraciones inhibidoras mínimas (MICbü) se midieron mediante la determinación in vitro de la actividad antimicrobiana de la solución de propóleo, y se muestran en la tabla 9, en forma de una dilución (%) del extracto líquido en un disolvente determinado. El extracto líquido de propóleo de partida se obtuvo en la proporción en peso de fármaco respecto a extracto (DER) de 1:2; producto del ejemplo 9. Si la dilución del extracto líquido es mayor, lo que significa que la concentración de las sustancias activas 1-10 es inferior para la MIC, el efecto antimicrobiano resultante del extracto ensayado es superior.
Los resultados se presentan en la tabla 9.
En las tablas 10-15 se presentan los valores calculados de la concentración másica (y) en [ug/mL] para cada sustancia 1-10 particular (a partir de cada uno de los tres extractos líquidos de propóleo examinados) sobre la que cada extracto particular alcanzó la MIC. Los extractos de obtuvieron con los siguientes disolventes de extracción (ES): etanol al 96 % (producto del ejemplo 1), polietilenglicol 400 (PEG 400; producto del ejemplo 2), y una mezcla de PEG 400 (97 % p/p) y lecitina de soja (3 % p/p) (producto del ejemplo 9). Estas se determinaron a partir de los extractos líquidos primarios en los que la DER es 1:2; dividida por la dilución (el factor de dilución) a la que se alcanzó la MIC correspondiente.
Ejemplo 11. Preparación de la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de una solución para aplicación intramamaria con, como mínimo, 150 ug/g de las sustancias activas 1-4
Formulación (para 100 g de solución):
(1) 50,00 g (50,00 % p/p) de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, producto del ejemplo 9, estandarizado en, como mínimo, 300 ug/mL de las sustancias activas 1-4.
(2) 50,00 g (20,00 % p/p) de polietilenglicol 400
Preparación: se mezclaron los ingredientes (1) y (2), y se homogeneizaron mediante agitación, a temperatura ambiente, durante 5 minutos. La solución se filtró a través de papel de filtro y se rellenó en inyectores intramamarios de 4-8 g cada uno.
Composición de la solución: como mínimo, una concentración total de 150 ug/g de las sustancias activas 1-4. Los resultados del análisis cuantitativo mediante HPLC se presentan en la tabla 16, mientras que el cromatograma de HPLC típico correspondiente se presenta en la figura 5.
Ejemplo 12. Preparación de la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de una suspensión para aplicación intramamaria con, como mínimo, 100 ug/g de las sustancias activas 1-4
Formulación (para 100 g de suspensión):
(1) 77,00 g (77,00 % p/p) de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, producto del ejemplo 9, estandarizado en, como mínimo, 150 ug/mL de las sustancias activas 1-4.
(2) 20,00 g (20,00 % p/p) de polietilenglicol 4000
(3) 3,00 g (3,00 % p/p) de diestearato de aluminio
Preparación: se fundió el polietilenglicol (2) a 60 °C, se añadió el diestearato de aluminio (3), y se homogeneizó a esta temperatura durante 15 minutos. A continuación, se enfrió la mezcla, con agitación, y se añadió el extracto de propóleo (1) a 40-45 °C. La mezcla se enfrió posteriormente hasta temperatura ambiente, con agitación, y se homogeneizó adicionalmente a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se obtuvo una suspensión viscosa amarillo pálido, que se rellenó posteriormente en inyectores intramamarios de 4-8 g cada uno.
Composición de la suspensión: como mínimo, una concentración total de 100 ug/g de las sustancias activas 1-4.
Ejemplo 13. Preparación de la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de un gel con, como mínimo, 250 ug/g de las sustancias activas 1-4
Formulación (para 100 g de gel):
(1) 30,00 g (30,00 % p/p) de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, producto del ejemplo 9, estandarizado en, como mínimo, 850 ug/mL de las sustancias activas 1-4.
(2) 2,00 g (2,00 % p/p) de Carbopol 940
(3) 1,00 g (1,00 % p/p) de polisorbato 60
(4) 0,20 g (0,20 % p/p) de sorbato de potasio
(5) 0,30 g (0,30 % p/p) de benzoato de sodio
(6) 0,30 g (0,30 % p/p) de ácido cítrico, anhidro
(7) la cantidad suficiente de hidróxido de sodio (solución al 20 %)
(8) rellenar hasta el 100 % con agua purificada
Preparación: a 30 g de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, se añadió (2) y se homogeneizó mediante agitación, a temperatura ambiente, durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 50 g de agua purificada (8) y se homogeneizó mediante agitación, a temperatura ambiente, durante 5 minutos. Después de eso, se añadieron los ingredientes (3-6) y se disolvieron mediante agitación durante 10 minutos. A continuación, se ajustó el valor del pH hasta 5,5-6 con (7). Al gel obtenido de ese modo se añadió la cantidad restante de agua purificada, hasta una masa total de 100 g, y se homogeneizó mediante agitación, a temperatura ambiente, durante 15 minutos, con desaireación final del producto.
Composición del gel: como mínimo, una concentración total de 250 ug/g de las sustancias activas 1-4.
Ejemplo 14. Preparación de la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de una crema con, como mínimo, 100 ug/g de las sustancias activas 1-4
Formulación (para 100 g de crema):
(1) 20,00 g (20,00 % p/p) de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, producto del ejemplo 9, estandarizado en, como mínimo, 500 ug/mL de las sustancias activas 1-4.
(2) 5,00 g (5,00 % p/p) de polisorbato 60
(3) 5,00 g (5,00 % p/p) de lanolina, anhidra
(4) 2,00 g (2,00 % p/p) de cera de abejas, blanca
(5) 8,00 g (8,00 % p/p) de alcohol cetílico
(6) 8,00 g (8,00 % p/p) de vaselina, blanca
(7) 10,00 g (10,00 % p/p) de aceite mineral, espeso
(8) 0,20 g (0,20 % p/p) de 4-cloro-m-cresol
(9) rellenar hasta el 100 % con agua purificada
Preparación: la fase oleosa se preparó fundiendo la mezcla de los ingredientes (2-7) a 65-70 °C durante 15-20 minutos, hasta la formación de un líquido oleoso prácticamente incoloro. La fase acuosa se preparó mediante la disolución de (8) y (1) en agua purificada, con calentamiento posterior hasta 65-70 °C con agitación. A continuación, se añadió lentamente la fase acuosa a la fase oleosa, con mezcla exhaustiva, preferentemente con un homogeneizador que permitiera una homogeneización de alta cizalladura, de 1.000-3.000 revoluciones por minuto (r.p.m.), durante 15-20 minutos. Posteriormente, la emulsión obtenida de ese modo se agitó exhaustivamente, con enfriamiento gradual a temperaturas de 65-20 °C durante 30 minutos.
Composición de la crema: como mínimo, una concentración total de 100 de las sustancias activas 1-4.
Ejemplo 15. Preparación de la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de una pomada con, como mínimo, 500 ug/g de las sustancias activas 1-4
Formulación (para 100 g de pomada):
(1) 50,00 g (50,00 % p/p) de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, producto del ejemplo 9, estandarizado en, como mínimo, 1.000 ug/mL de las sustancias activas 1-4
(2) 10,00 g (10,00 % p/p) de polietilenglicol 400
(3) 40,00 g (40,00 % p/p) de polietilenglicol 4000
Preparación: se mezclaron minuciosamente los ingredientes (1-3) y se calentaron hasta 60 °C, se homogeneizaron mediante agitación durante 5 minutos y se enfriaron gradualmente hasta temperatura ambiente, con mezcla.
Composición de la pomada: como mínimo, una concentración total de 500 de las sustancias activas 1-4.
Ejemplo 16. Preparación de la composición de la presente invención en la forma farmacéutica de un aerosol nasal con, como mínimo, 50 ug/g de las sustancias activas 1-4
Formulación (para 100 g de solución para aerosol):
(1) 5,00 g (5,00 % p/p) de extracto líquido de propóleo, según la presente invención, producto del ejemplo 9, estandarizado en, como mínimo, 1.000 ug/mL de las sustancias activas 1-4
(2) 0,60 g (0,60 % p/p) de cloruro de sodio
(3) 0,10 g (0,10 % p/p) de polisorbato 60
(4) 0,10 g (0,10 % p/p) de sorbato de potasio
(5) 0,10 g (0,10 % p/p) de benzoato de sodio
(6) 0,20 g (0,20 % p/p) de ácido cítrico, anhidro
(7) 0,01 g (0,01 % p/p) de edetato de sodio (Na2EDTA^2H2O)
(8) rellenar hasta el 100 % con agua purificada
Preparación: a 90 g de agua purificada (1), se añadieron los ingredientes (2-7) y se disolvieron mediante agitación, a temperatura ambiente, durante 15 minutos. A continuación, se añadió (1) y la mezcla se homogeneizó, a temperatura ambiente, durante 15 minutos. Después de eso, la solución se filtró a través de un filtro estéril de 0,2 um y se rellenó en botellas estériles adecuadas, equipadas con cierre y bombas de aerosol para aplicación nasal.
Composición de la solución: como mínimo, una concentración total de 50 de las sustancias activas 1-4.
Ejemplo 17. Estudio de la actividad antinflamatoria de la composición de la presente invención, en forma de la solución intramamaria del ejemplo 11, en el tratamiento de la mastitis en vacas lecheras
El estudio del tratamiento de la mastitis en vacas se realizó en cinco granjas de ganado vacuno lechero de la raza Holstein. En el estudio participaron un total de 86 vacas, o 339 cuartos, en el que el cuarto de ubre se utilizó como unidad estadística. Los animales se mantuvieron libres en lechos profundos, y se alimentaron con premezcla estándar para ganado vacuno lechero, sin adición de antibióticos. El estudio fue autorizado por el comité de ética de medicina veterinaria. Se incluyeron animales y cuartos sanos, sin síntomas clínicos de mastitis y con un recuento de células somáticas (SCC) inferior a 200.000/mL, así como cuartos infectados, con un SCC superior a 200.000/mL. Se realizó un estudio clínico aleatorizado, con grupos cruzados, de la toxicidad y la eficacia con la aplicación intramamaria (i.mam.) de la composición de la presente invención, en forma de solución, en condiciones de campo. La composición del ejemplo 11 de la presente invención se aplicó tres veces en los cuatro cuartos de ubre de las vacas: durante el ordeño matutino, el ordeño vespertino y al día siguiente, después del ordeño matutino. Primero se ensayó la tolerabilidad de la composición en la aplicación intramamaria. Se supervisaron los cambios en la conducta de las vacas, así como el aspecto macroscópico de las ubres (edema y enrojecimiento), la leche y la sensibilidad al tacto de las ubres. Se supervisó el cambio del recuento de células somáticas (SCC) en la leche desde el periodo anterior a la primera aplicación intramamaria de la composición hasta el día 7 desde la primera aplicación. Las muestras de leche, así como los cuartos, se agruparon en función de si el recuento de SCC era elevado o era inferior a 200.000/mL, y en función de si las muestras presentaban resultados positivos o negativos en un estudio bacteriológico; véase la referencia 33 de la bibliografía:
33) European Medicines Agency (1992): Local Tolerance of Intramammary Preparations in Cows. Directiva 81/852/CEE.
A continuación, se llevaron a cabo los ensayos de eficacia de la cura bacteriológica con la composición de propóleo, según las directrices de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA, “European Medicinal Agency”), que es la única medida eficaz para las formulaciones intramamarias en el tratamiento de la mastitis subclínica. Esta se define como una ausencia de patógenos previamente confirmados en una muestra de leche recogida en determinados periodos de tiempo después de la aplicación intramamaria de una determinada formulación; véase la referencia 34 de la bibliografía:
34) European Medicines Agency (2017): Guideline on the conduct of efficacy studies for intramammary products for use in cattle. CVMP. EMA/CVMP/344/1999-Rev.2.
La toma de muestras de leche se realizó mediante la metodología estándar. El estudio microbiológico se llevó a cabo según las directrices estándar; véase la referencia 35 de la bibliografía:
35) J. W. Hogan: Laboratory handbook on bovine mastitis. National Mastitis Council (1999) Madison, Wisconsin, SAD.
Los resultados de la cura bacteriológica de la mastitis en vacas se presentan en la tabla 17.
Ejemplo 18. Estudio de la actividad antinflamatoria de la composición de la presente invención, en forma de la solución intramamaria del ejemplo 11, en el tratamiento de la mastitis en cabras
El estudio del tratamiento de la mastitis en cabras se llevó a cabo en 25 cabras con mastitis subclínica diagnosticada en las mitades de ubre derecha e izquierda. Las cabras cuya leche obtuvo resultados positivos en un estudio microbiológico se dividieron en dos grupos: a un grupo se le aplicó la composición del ejemplo 11 de la presente invención, mientras que al otro grupo se le aplicó la suspensión intramamaria de amoxicilina y ácido clavulánico (Klavuxil®; Genera, Croacia); a todas mediante una pauta de aplicación de tres veces.
La tolerabilidad y la cura bacteriológica de las mitades se supervisaron en paralelo después de la aplicación intramamaria de la composición del ejemplo 11. Los preparados se aplicaron mediante la pauta de tres veces (dos días) con dicho antibiótico o con la composición del ejemplo 11.
Durante el estudio, las cabras se mantuvieron en un establo de lecho profundo. Había 170 cabras en periodo de lactancia, con una producción promedio de 500-600 kg de leche por cabra durante un periodo de lactancia, que dura aproximadamente 300 días. Se alimentaron con heno según desearan, como mínimo, con 2 kg por cabra, y con la premezcla que contenía el 16 % de proteínas, aproximadamente 1 kg por cabra; dividida en dos porciones durante el ordeño matutino y vespertino. Se añadió un 2 % de la premezcla de vitaminas y minerales Ovisan® (Sano Company, Croacia) a la premezcla. Las cabras cuya leche obtuvo resultados positivos en el estudio microbiológico se dividieron en dos grupos: a un grupo (número de mitades tratadas, N = 20), se le aplicó la composición del ejemplo 11, mientras que al otro grupo (N = 15) se le aplicó la suspensión intramamaria de amoxicilina y ácido clavulánico (Klavuxil®; Genera Company, Croacia); a todas mediante una pauta de aplicación de tres veces.
Durante el ensayo de tolerabilidad de la composición del ejemplo 11, no se observaron cambios conductuales en ninguna cabra, ni cambios en el aspecto macroscópico de las ubres (edema y enrojecimiento) y la leche, ni sensibilidad al tacto en las ubres. Las muestras de leche de las mitades de ubre derecha e izquierda se tomaron en tubos de plástico, previamente marcados, después del ordeño de los primeros chorros. Las muestras se tomaron después de la primera aplicación de la formulación del ejemplo 11, 12 horas después de la primera aplicación, 24 horas después de la primera aplicación, y el día 7 después de la primera aplicación de la composición. Las muestras de leche se mantuvieron a 4 °C hasta el día siguiente y se analizaron en el laboratorio, en el Instituto Veterinario de Croacia, para determinar la presencia de mastitis y la calidad de la leche cruda.
El ensayo de la eficacia de la cura bacteriológica se realizó según las directrices de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA); véase la referencia 34 de la bibliografía. La toma de muestras de leche se llevó a cabo mediante la metodología estándar, mientras que el estudio microbiológico se llevó a cabo según los procedimientos estándar; véase el referencia 35 de la bibliografía.
Los resultados de la cura bacteriológica de la mastitis en cabras se presentan en la tabla 18.
Ejemplo 19. Revisión de la cicatrización con éxito de una herida en la pata de una yegua con la administración de la composición del ejemplo 11 de la presente invención en forma de solución
Se describe el caso de la cicatrización de una herida en la pata delantera de la yegua. Era una herida profunda, en el área del espolón de la pata delantera, que apareció cuando la pata trasera de la yegua rozó la pata delantera durante el aterrizaje. Antes de comenzar la administración de la composición del ejemplo 11, la herida se había tratado de manera conservadora, sin éxito, con diferentes preparados.
La herida se formó durante el galope de la yegua, cuando sufrió un “exceso de alcance” con las patas traseras. A continuación, la parte delantera de la pezuña y la herradura de la pata trasera lesionaron el área del menudillo de la pata delantera. Esto causó una herida de forma elíptica, con unas dimensiones de 2 x 4 cm. La yegua presentó signos de cojera inmediatamente después de la lesión, con una puntuación de 4/5 (Asociación Estadounidense de Veterinarios Equinos, “American Association of Equine Practitioners”). Inmediatamente después de la lesión, la herida se rasuró y se lavó con agua corriente fría, y después de eso, se trató con yodo (povidona yodada, 0,01 %) y se pulverizó con un aerosol de nitrato de plata. La herida se cerró para evitar la contaminación infecciosa. Dado que la yegua ya estaba vacunada contra el tétanos, no se aplicó el suero de antitoxina tetánica equina (TAT, “tetanus antitoxin”). Se permitió descansar a la yegua durante dos semanas, y la herida se trató diariamente mediante limpieza mecánica, y se mantuvo limpia y seca. La herida se trató con yodo y aerosol de nitrato de plata cada 48 horas. Después de 5 días, la herida comenzó a cicatrizar y a mejorar. A continuación, se comenzó a tratar la herida con una pomada de zinc y vitaminas. Después de dos semanas, se devolvió la yegua al trabajo. Sin embargo, la herida comenzaba a sangrar en cuanto la yegua comenzaba a galopar. Se volvió a desinfectar la herida con yodo y se aplicó un antibiótico tópico a base de cefalosporina en la formulación para aplicación intramamaria (Cobactan®). Junto con la limpieza mecánica de la herida, esta se trató localmente con un antibiótico durante otros 5 días. A continuación, se intentó volver a trabajar con la yegua, pero la herida comenzaba a sangrar de nuevo.
Después de eso, se lavó la herida con solución fisiológica, se secó y se trató con la composición del ejemplo 11, una vez al día, durante 5 días. Se pudo observar la mejora, visible mediante la epitelización, después de 48 horas, mientras que la cicatrización completa se produjo después de 96 horas. La yegua solo cojeó durante los primeros días, pero posteriormente no se observaron signos de cojera. La recuperación fue completa.
Conclusión
Los resultados experimentales demostraron que la mezcla específica de polietilenglicoles (PEG) líquidos, como el PEG 400, en combinación con lecitinas en una cantidad del 0,1-3,5 % en masa del disolvente de extracción (ES), de manera inesperada, extrae de forma eficaz y quimioselectiva las sustancias activas del propóleo ácido p-cumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) y 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-fenetilo (4), en comparación con disolventes puros como el etanol al 96 %, el PEG 400 o mezclas de EtOH y las mismas lecitinas.
La composición cuantitativa exacta de las sustancias activas clave 1-4 y los ingredientes adicionales 5-10 del extracto líquido de propóleo primario se determina mediante la utilización de un procedimiento analítico de HPLC adecuado desarrollado en la presente invención. A continuación, dicho extracto primario se estandariza con el mismo disolvente de extracción (ES) que se empleó en la etapa de extracción. Esto da lugar a un extracto líquido de propóleo, según la presente invención, con concentraciones conocidas y estandarizadas de las sustancias activas clave 1-4. El extracto líquido de propóleo preparado de ese modo se utiliza como ingrediente farmacéutico activo (API), ingrediente cosmético activo (ACI), o ingrediente alimentario para la fabricación de productos alimentarios funcionales y suplementos alimentarios.
La composición de la presente invención, a base de dicho extracto líquido de propóleo, que contiene las sustancias activas clave ácido p-cumárico (1; 10-1.300 |xg/g), ácido trans-ferúlico (2; 10-800 |xg/g), ácido cafeico (3; 5-300 |xg/g) y 3,4-dihidroxi-frans-cinamato de 2-fenetilo (4; 5-400 |xg/g), es un agente eficaz en la terapia de enfermedades inflamatorias, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, enfermedades víricas, enfermedades autoinmunitarias, trastornos gastrointestinales funcionales, para la regeneración de la mucosa, el tratamiento de quemaduras y la cicatrización de heridas, y para el tratamiento de neoplasias malignas.
Aplicabilidad industrial
Debido a la amplia utilización práctica del extracto líquido de propóleo y la composición farmacéutica a base del mismo, la aplicabilidad industrial de la presente invención es obvia.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Extracto líquido de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, que consiste en:
(A) un extracto seco de propóleo; 0,1-10,0 % p/p; y
(B) un disolvente de extracción; 90,0-99,9 % p/p;
en el que el disolvente de extracción consiste en:
(B.1) uno o más polietilenglicoles <PEG> líquidos 200-600; 96,5-99,9 % p/p; y
(b .2) lecitina o lecitina hidrolizada; 0,1-3,5 % p/p;
en el que dicho extracto líquido de propóleo está estandarizado mediante:
(I) una proporción en peso cuantitativa de propóleo bruto, como fármaco, y extracto final <DER> en la proporción de:
1:2-1:20 p/p; y
(II) un contenido cuantitativo de sustancias activas del propóleo seleccionadas del grupo que consiste en ácido p-cumárico <1>, ácido trans-ferúlico <2>, ácido cafeico <3> y 3,4-dihidroxicinamato de 2-feniletilo <4>:
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en el que la composición cuantitativa de, como mínimo, dos de dichas cuatro sustancias activas clave es tal y como se indica a continuación:
(i) ácido p-cumárico <1>; 100-1.300 |xg/mL;
(ii) ácido trans-ferúlico <2>; 75-800 |xg/mL;
(iii) ácido cafeico <3>; 25-300 |xg/mL; y
(iv) 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo <4; CAPE>; 40-400 |xg/mL.
2. Extracto líquido de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, según la reivindicación 1, en el que el polietilenglicol <PEG> líquido se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol 200, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, o mezclas de estas sustancias.
3. Extracto líquido de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, según las reivindicaciones 1-2, en el que la lecitina, o la lecitina hidrolizada, está caracterizada por un factor de equilibrio hidrófilo-lipófilo <HLB> de 2-12, y se selecciona del grupo que consiste en: lecitina de soja <Glycine max. L.>; lecitina de girasol <Helianthus annuus L.>; lecitina de colza <Brassica napus L.>; lecitina de canola <Brassica rapa L.>; lecitina de huevos de gallina <Gallus gallus domesticus L.>; productos desaceitados de dichas lecitinas; lecitinas hidrogenadas de dichas fuentes; lecitinas hidrolizadas de dichas fuentes; derivados de dichas lecitinas modificados con enzimas; o mezclas de estas sustancias.
4. Extracto líquido de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, según las reivindicaciones 1-3, en el que el disolvente de extracción consiste en:
(i) polietilenglicol <PEG> 200, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400 o sus mezclas; 97-99 % p/p; y
(ii) lecitina natural, lecitina desaceitada o lecitina hidrolizada, de soja <Glycine max. L.>, girasol <Helianthus annuus L.>, colza <Brassica napus L.> o canola <Brassica rapa L.>; o mezclas de estas sustancias; 1 -3 % p/p.
5. Extracto líquido de propóleo como ingrediente farmacéutico, cosmético o agroquímico, o ingrediente alimentario, según las reivindicaciones 1-2, en el que el dicho extracto líquido de propóleo está estandarizado en:
(I) una proporción cuantitativa en peso de propóleo bruto, como fármaco, con respecto al extracto final <DER> en la proporción de:
1:3-1:5 p/p; y
(II) una composición cuantitativa de sustancias activas del propóleo seleccionadas del grupo que consiste en ácido p-cumárico <1>, ácido trans-ferúlico <2>, ácido cafeico <3> y 3,4-dihidroxi-cinamato de 2-feniletilo <4>, en la que, como mínimo, dos de cuatro de dichas sustancias activas clave corresponden al siguiente contenido cuantitativo:
(i) ácido p-cumárico <1>; 500-1.300 pg/mL;
(ii) ácido trans-ferúlico <2>; 300-800 pg/mL;
(iii) ácido cafeico <3>; 100-300 pg/mL; y
(iv) 3,4-dihidroxi-cinamato de 2-feniletilo <4; CAPE>; 100-400 pg/mL.
6. Procedimiento para la producción de extracto líquido de propóleo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que este incluye las siguientes etapas:
(i) enfriamiento del propóleo bruto a -20 °C durante, como mínimo, 1 hora;
(ii) molienda del propóleo enfriado, con tamizado a través de poros de 1 -8 mm;
(iii) extracción del propóleo bruto con el disolvente de extracción en las siguientes condiciones:
(a) proporción en peso de propóleo bruto y disolvente de extracción = 1:2-1:20 p/p;
(b) temperatura de extracción de 10-150 °C; y
(c) tiempo de extracción de 5 minutos a 72 horas;
(iv) filtración de la mezcla obtenida de ese modo a través de una serie de filtros con poros de 100 pm a 5 pm, con generación de residuo no disuelto y el extracto líquido de propóleo;
(v) análisis cuantitativo de las sustancias activas clave 1-4 mediante cromatografía líquida de alta resolución <HPLC>; y
(vi) estandarización del extracto líquido de propóleo obtenido de ese modo con una determinada composición cuantitativa exacta de las sustancias activas clave 1-4 de la etapa (v), mediante dilución con un disolvente de extracción recién preparado que se ha utilizado en la etapa (iii), hasta el contenido deseado de las sustancias activas 1-4.
7. Extracto líquido de propóleo estandarizado, según las reivindicaciones 1-5, para utilización como fármaco.
8. Extracto líquido de propóleo estandarizado, según las reivindicaciones 1-5, para utilización según la reivindicación 7, en el que el fármaco es un medicamento veterinario.
9. Utilización no terapéutica del extracto líquido de propóleo estandarizado, según las reivindicaciones 1-5, como ingrediente cosmético activo, o como excipiente, para la producción de productos cosméticos.
10. Utilización no terapéutica del extracto líquido de propóleo estandarizado, según las reivindicaciones 1-5, como ingrediente alimentario para la producción de productos alimentarios funcionales, suplementos alimentarios, piensos para animales, suplementos para piensos para animales, y alimentos con fines nutricionales especiales.
11. Utilización del extracto líquido de propóleo estandarizado, según las reivindicaciones 1-5, como ingrediente agroquímico activo, o como excipiente, para la producción de productos agroquímicos seleccionados del grupo que consiste en: fungicidas, bactericidas, viricidas, insecticidas, nematicidas y fortificantes para plantas.
12. Composición farmacéutica, en la que esta consiste en:
(I) extracto líquido de propóleo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5; del 5-95 % p/p; y
(II) uno o más excipientes farmacéuticos, necesarios para la preparación de la forma farmacéutica final, seleccionados del grupo que consiste en: una solución, una suspensión, un gel, una crema, una pomada, un aerosol para aplicación oral o nasal; hasta el 100 % p/p de la composición final;
en la que dicha composición está caracterizada por un contenido cuantitativo de, como mínimo, dos de las cuatro sustancias activas clave del propóleo comprendido en los siguientes valores:
(i) ácido p-cumárico <1>; 10-1.300 pg/g;
(ii) ácido trans-ferúlico <2>; 10-800 pg/g;
(iii) ácido cafeico <3>; 5-300 pg/g; y
(iv) 3,4-dihidroxi-trans-cinamato de 2-feniletilo <4; CAPE>; 5-400 pg/g.
13. Procedimiento para la producción de la composición farmacéutica, según la reivindicación 12, en el que este incluye las siguientes etapas:
(i) adición de un extracto líquido de propóleo estandarizado, según las reivindicaciones 1-5, en el diluyente, y su homogeneización;
(ii) adición de uno o más excipientes diferentes, y su homogeneización;
en el que la etapas (i) e (ii) se llevan a cabo a una temperatura de 10-100 °C, preferentemente a una temperatura de 20-60 °C, durante 1 -5 minutos; seguidas de, en el caso de la preparación de la forma farmacéutica de:
(iii.a) una solución o una solución para aerosol; se realiza la filtración de la solución final, lo que incluye filtración estéril si es necesaria;
(iii.b) un gel o una suspensión; se lleva a cabo la adición de espesante y su homogeneización;
(iii.c) una crema; se lleva a cabo la preparación de la fase grasa mediante la mezcla del emoliente y el emulsionante, y su homogeneización, a una temperatura de 50-80 °C, durante 1-15 minutos, y a continuación se lleva a cabo la adición de la solución de la etapa (ii) calentada hasta 50-80 °C, seguida de emulsificación, con la utilización de un homogeneizador de alta cizalladura o alta presión, a una temperatura de 50-80 °C, preferentemente de 55-65 °C, durante 1-30 minutos, con homogeneización posterior a una temperatura de 65-20 °C, durante 10-120 minutos; o
(iii.d) una pomada; se realiza la mezcla de la solución de la etapa (ii) con la mezcla previamente fundida de emoliente y, en última instancia, emulsionante a una temperatura de 50-70 °C, durante 5-30 minutos, seguida de homogeneización a una temperatura de 70-20 °C, durante 10-120 minutos.
14. Composición farmacéutica, según la reivindicación 12, para utilización en el tratamiento de enfermedades y afecciones de los seres humanos y los animales, de los grupos de: enfermedades inflamatorias; infecciones bacterianas; infecciones fúngicas; enfermedades víricas; enfermedades autoinmunitarias, trastornos gastrointestinales funcionales; para la regeneración de la mucosa, el tratamiento de quemaduras y la cicatrización de heridas; y neoplasias malignas.
15. Composición farmacéutica, según la reivindicación 12, para utilización, según la reivindicación 14, para:
- el tratamiento de enfermedades inflamatorias de los grupos de: gingivitis, periodontitis, laringitis, gastritis, colitis, hemorroides, dermatitis, inflamación del oído externo, sinusitis, rinitis, vaginitis y mastitis;
- el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por bacterias de los grupos de:
(i) bacterias grampositivas: Staphylococcus spp: Staphylococcus aureus, MRSA <Staphylococcus aureus resistente a la meticilina>, MSSA <Staphylococcus aureus sensible a la meticilina>, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus pseudintermedius; estafilococos coagulasa-negativos: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus; Streptococcus spp.: Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Streptococcus thermophilus; Peptostreptococcus spp.; Corynebacterium spp.: Corynebacterium bovis; Trueperella pyogenes; Nocardia spp.; Bacillus subtilis; Bacillus cereus; enterococos: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis; enterococos resistentes a la vancomicina <VRE>: Enterococcus casseliflavus; y
(ii) bacterias gramnegativas: Escherichia coli; Acinetobacter baumani; Pseudomonas aeruginosa; Haemophilus influenzae; Salmonella choleraesuis; Yersinia enterocolitica; Enterobacterspp. <Enterobacter cloacae>; Klebsiella spp.: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca; Shigella flexneri; Burkholderia cepacia; Proteus mirabilis; Proteus vulgaris; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinomyces israelii; Bacteroides fragilis; Helicobacter pylor; Campylobacter coli; Campylobacter jejuni; Porphyromonas gulae; Porphyromonas salivosa; Porphyromonas denticanis; Prevotella intermedia; Treponema spp.; Bacteroides splanchnicus:
- el tratamiento de infecciones fúngicas causadas por hongos de los grupos de: Candida spp.: Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida kruzei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis; Aspergillus spp.: Aspergillus niger, Aspergillus versicolor; Penicillium pinophilum; Paecilomyces variotii; Trichoderma virens; Chaetomium globosum; Malassezia pachydermatis;
- el tratamiento de enfermedades víricas causadas por virus de los grupos de: virus del herpes simple <HSV>; virus del papiloma humano <HPV>; virus de Epstein-Barr <EBV>; citomegalovirus <CMV>; poliovirus; virus de la gripe A y B; retrovirus; virus de la variolovacuna; virus del resfriado común: rinovirus, picornavirus, virus paragripal humano <HPIV>, metaneumovirus humano <HMPV>, coronavirus, adenovirus, virus respiratorio sincicial humano <HRSV>, enterovirus;
- el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias de los grupos de: psoriasis, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, celiaquía y esclerosis múltiple;
- el tratamiento de neoplasias malignas de los grupos de: neoplasias malignas de la piel y las mucosas, tumores gastrointestinales, carcinoma colorrectal;
- el tratamiento de la mastitis en animales; y/o
- el tratamiento de trastornos gastrointestinales funcionales seleccionados de los grupos de: trastornos del esófago, estómago, duodeno, intestino delgado y colon, dolor gastrointestinal de origen central, trastornos de la vesícula biliar y el esfínter de Oddi, trastornos anorrectales, trastornos gastrointestinales específicos de los niños y los adolescentes.
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