BR112021016024A2 - Extrato de própolis líquido, sua formulação e uso do mesmo - Google Patents

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Abstract

extrato de própolis líquido, sua formulação e uso do mesmo. a presente invenção se refere a um inédito extrato de própolis líquido padronizado e formulação farmacêutica com base no dito extrato, seus métodos de manufatura e usos. o extrato líquido é produzido pela extração do própolis bruto com um solvente de extração com base em uma mistura de peg 200-600 (96,5-99,9% p/p) e lecitinas (0,1-3,5% p/p). o extrato é distinguido com conteúdo padronizado de ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3), e cape (4). o mesmo é usado como um ingrediente ativo na manufatura de produtos farmacêuticos, cosméticos, veterinários, agroquímicos ou alimentícios funcionais. a formulação farmacêutica de acordo com a invenção consiste em 5 a 95% p/p do dito extrato de própolis e até 100% dos excipientes exigidos para a preparação de várias formas de dosagem. a mesma é usada para tratamento de doenças e condições em humanos e animais, tais como: doenças inflamatórias, infecções bacterianas e fúngicas, doenças virais, autoimunes e cancerosas, e para o tratamento de queimaduras e cicatrização de feridas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO, SUA FORMULAÇÃO E USO DO MESMO”
CAMPO DA TÉCNICA
[001] Esta invenção se refere a um inédito extrato de própolis líquido padronizado, ao processo para sua preparação em uma inédita composição farmacêutica com base no extrato mencionado e ao seu uso.
PROBLEMA DA TÉCNICA
[002] Em relação ao fato de que própolis é uma mistura de cera de abelhas e um grande número de compostos orgânicos naturais, diferentes processos de extração rendem extrato de uma composição muito diferente de substâncias ativas. Com o uso de solventes de extração (ES) quimiosseletivos, que têm uma capacidade de extração seletiva de predominantemente certos grupos de compostos orgânicos, juntamente com o uso de métodos analíticos adequados, é teoricamente possível alcançar uma composição de extrato de própolis consistente e padronizada.
[003] O problema técnico que é resolvido pela presente invenção inclui: (i) um extrato de própolis líquido não alcoólico, que será distinguido por conteúdo alto e padronizado de ácidos fenólicos de própolis, ácido para-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) e 2-feniletil éster de ácido cafeico, 2- fenetil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE), para os quais diversas atividades farmacológicas benéficas são conhecidas, em organismos tanto humano quanto animal; COOH H3CO COOH HO COOH
HO HO HO 1 2 3
O HO O
HO 4 (ii) o processo para sua produção; (iii) o uso para a produção de produtos farmacêuticos, cosméticos,
veterinários, agroquímicos ou alimentícios com conteúdo padronizado conhecido de substâncias ativas do própolis 1 a 4; e, especialmente, (iv) uma composição farmacêutica com base no extrato de própolis mencionado, que será efetiva no tratamento de doenças inflamatórias e infecciosas, bem como doenças e condições em que a atividade antioxidante, anti-inflamatória e imunomodulatória de substâncias ativas do própolis em particular, desempenham um papel importante na etiologia de sua incidência, da forma sugerida por certas referências no estado da técnica.
[004] Tal extrato sem álcool com conteúdo de cera de abelhas desprezível e outros compostos de própolis de lastro, com conteúdos altos e padronizados de ingredientes de própolis altamente bioativos, representa uma base o desenvolvimento e a produção de produtos farmacêuticos, veterinários, agroquímicos ou alimentícios funcionais ou suplementos alimentares altamente valiosos. Ao contrário, o uso de extrato de própolis padrão com base em etanol, glicerol ou 1,2-propilenoglicol para este propósito é acoplado com várias dificuldades, tais como conteúdos desconhecidos das supramencionadas substâncias ativas do própolis ou uma baixa composição quantitativa de valiosos ácidos fenólicos e CAPE contra ingredientes flavonoides do própolis.
[005] A presente invenção é com base em: (i) o uso de uma formulação de solvente de extração (ES) específica que serve para o processo de extração quimiosseletiva do própolis bruto; (ii) um método para determinação quantitativa de ingredientes ativos de própolis, incluindo as substâncias ativas chaves 1 a 4; (iii) padronização de extrato de própolis líquido assim preparado pela diluição com uma certa quantidade do mesmo solvente de extração, até o nível desejado de substâncias ativas 1 a 4 de acordo com esta invenção; em que o dito solvente de extração consiste em duas ou mais substâncias alimentícias e farmaceuticamente aceitáveis, e, também, no final produto, um extrato de própolis líquido padronizado. Este mesmo solvente de extração tem o papel de carreador ou diluente; e, (iv) a composição farmacêutica, que é com base no dito extrato de própolis padronizado de acordo com esta invenção, que provou ser um agente efetivo para o tratamento de doenças inflamatórias e infecciosas. Devido aos amplos espectros de sua atividade farmacológica, a mesma pode ser usada para tratamento de várias doenças e condições, tais como: doenças inflamatórias, infecções bacterianas e fúngicas, doenças virais, doenças autoimunes, para regeneração da mucosa, tratamento de queimaduras e feridas e para doenças cancerosas.
ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR
[006] O própolis é um produto natural, colhido por abelhas que, para as mesmas, serve como uma cola para fechar as menores aberturas indesejadas nas colmeias. O própolis contém cera de abelhas como um principal ingrediente e um grande número de vários compostos orgânicos. Muitos dos mesmos exibem significativos efeitos farmacológicos benéficos; veja, por exemplo, a referência de literatura 1: 1) S. Castaldo, F. Capasso: Propolis, and old remedy used in modern medicine, Fitoterapia 73 (2002) S1-6.
[007] Além das substâncias ativas 1 a 4 mencionadas, o própolis contém toda uma série de outros compostos naturais, por exemplo, entre ácidos, o mesmo também contém ácido trans-cinâmico (5), e série de flavonoide com uma quantidade relativamente abundante de crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9) e kaempferol (10):
HO O HO O COOH
OH O OH O 5 6 7
OH HO O HO O HO O OH OH
OH O OH O OH O 8 9 10
[008] Tradicionalmente, o própolis bruto é extraído com etanol ou misturas de etanol e água, rendendo assim denominadas tinturas de própolis. Tais extratos de própolis líquidos são distinguidos por diversas desvantagens: (i) a presença de um solvente relativamente agressivo (etanol); (ii) produtos com base em álcool não são adequados para crianças, mulheres gestantes e lactantes e certos pacientes; e, (iii) conteúdo relativamente alto de cera de abelhas, que causa sua desagregação através da fase de mistura com água, durante a manufatura de produtos farmacêuticos e ainda outros produtos, em que um extrato como este é empregado como um ingrediente ativo.
[009] Separados de etanol, como um solvente de extração, glicerol, água, misturas de glicerol e água, e outros solventes orgânicos foram usados.
[010] Desta maneira, Tsukada e colaboradores revelaram o uso de glicerol como um solvente de extração, na razão de própolis:solvente de extração, 1:2 p/p, em 90 a 160°C, com subsequente filtração. Tais extratos de glicerol são solúveis em água e adequados para a produção de produtos farmacêuticos como um ingrediente farmacêutico ativo (API); veja a referência de literatura 2: 2) JPH05957A; T. Tsukada, W W. Kameda, M. Ide: Production of water- soluble propolis pharmaceutical preparation; Ogawa Koryo KK, Santapuron KK (JP).
[011] Extratos de própolis aquosos também são descritos na tecnologia anterior. A extração com água como ES pode ser realizada nas temperaturas de 30 a 50°C durante 6 a 8 minutos, o que, depois da filtração, proporciona diretamente um extrato de própolis líquido. O último pode ser, eventualmente, adicionalmente processado por meio de microencapsulação através da tecnologia da secagem por aspersão sobre carreadores adequados, tais como maltodextrina e goma arábica, nos extratos sólidos; veja a referência de literatura 3: 3) CN103783349A; Z. Wang, S. Shao, H. Ma, S. Wang, L. Wang, C. Zhang, X. Ma: Proccess for preparing honeycomb polyphenol extractive microcapsule by adopting spray; University Jiangsu (CN).
[012] O uso de agentes ativos na superfície como componentes do solvente de extração (ES), que incluem lecitinas, é, no geral, conhecido na tecnologia anterior. Por exemplo, Paradkar e colaboradores descreveram o processo para extração de própolis com o uso de uma solução de polissorbato aquoso em 40 a 90°C durante 2 a 24h, rendendo um extrato de própolis líquido; veja a referência de literatura 4: 4) WO2011092511A1; A. Paradkar, R. Dhumal, A. Kelly, S. Gilda: Propolis and process for the treatment thereof and end products formed therefrom; Natures Lab Ltd (GB).
[013] Sosnowski revelou o método para extração de própolis com diferentes solventes orgânicos, incluindo 1,2-propileno glicol, polietileno glicol (PEG) e misturas destes solventes com água; veja a referência de literatura 5: 5) US4382886; Z. M. Sosnowski: Method for extracting propolis and water soluble dry propolis powder.
[014] Chun e colaboradores revelaram a composição farmacêutica que, entre outros, é com base em um extrato de própolis líquido em 1,3-butilenoglicol como um solvente de extração, que é, pelo uso de lecitina hidrogenada, juntamente com outros emulsificantes, convertido em uma forma de dosagem farmacêutica, que contém nanopartículas com este extrato de própolis; veja a referência de literatura 6: 6) KR20130134800A; Y. J. Chun, S. B. Shim, X. Ke: Composition of nano- vesicle containing propolis and manufacturing method of it; University Chungwoon IACF (KR).
[015] Apesar do fato de que este documento não usa lecitina para facilitar a extração de substâncias ativas do própolis com 1,3-butilenoglicol, certamente, o mesmo sugere uma possibilidade para seu uso como um agente tensoativo, que pode melhorar eventualmente a extração e a emulsificação de certos ingredientes ativos gordurosos de própolis em solventes mais polares.
[016] Em relação à analítica do própolis, há um grande número de métodos analíticos na tecnologia anterior para determinação quantitativa de substâncias ativas do própolis em extratos de própolis complexos, que contêm um grande número de ingredientes. Como um exemplo, um método analítico similar àquele empregado na presente invenção é dado no trabalho dos autores chineses Cui-Ping e colaboradores. Os mesmos descreveram um método quantitativo para a determinação de 12 diferentes flavonoides e 8 ácidos fenólicos de própolis por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Este método, entre outros, habilita a determinação de ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2) e ácido cafeico (3), que são mencionados como marcadores qualitativos de própolis; veja a referência de literatura 7: 7) Z. Cui-ping, H. Shuai, W. Wen-ting, P. Shun, S. Xiao-ge, L. Ya-jing, H. Fu-liang: Development of high-performance liquid chromatographic for quality and authenticity control of Chinese propolis, J. Food Sci. 79 (2014) C1315-C1322.
[017] Devido ao conteúdo das substâncias ativas 1 a 10 e ainda outras, o própolis e o extrato de própolis exibem uma série de efeitos farmacológicos muito valiosos e benéficos na saúde de humanos, animais e vegetais. Existe um grande número de documentos científicos e de patente na tecnologia anterior que suporta a ampla faixa de efeitos benéficos, dentre os quais os mais significativos são como segue: anti-inflamatório; antioxidante; imunomodulatório; hepatoprotetor; antimicrobiano, incluindo antibacteriano, antiviral, antifúngico e antiprotozoário; e anticâncer; veja, por exemplo, as referências de literatura 8 a 12: 8) E. L. Ghisalberti: Propolis: A Review, Bee World 60 (1979) 59-84.
[018] 9) A. Banskota, Y. Tezuka, S. Kadota: Recent Progress in Pharmacological Research of Propolis, Phytother. Res. 15 (2001) 561-571.
[019] 10) G. A. Burdock: Review of Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis (Propolis), Food Chem. Toxicol. 36 (1998) 347-363.
[020] 11) J. M. Sforcin: Propolis and the immune system: a review, J. Ethnopharmacol. 113 (2007) 1-14.
[021] 12) J. W. Dobrowolski, S. B. Vohora, K. Sharma, S. A. Shah, S. A. H. Naqvi, P. C. Dandiya: Antibacterial, antifungal, antiamoebic, antiinflammatory and antipyretic studies on propolis bee products, J. Ethnopharmacol. 35 (1991) 77-82.
[022] Além do extrato de própolis, uma ampla faixa de efeitos farmacológicos benéficos é descrita na tecnologia anterior para certas substâncias ativas isoladas (puras) do própolis, por exemplo: (i) ácido p-coumárico (1); veja as referências de literatura 13 e 14; (ii) ácido trans-ferúlico (2); veja as referências de literatura 15 e 16; (iii) ácido cafeico (3); veja as referências de literatura 17 e 18; bem como (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE); veja as referências de literatura 19 e 20; que, entre outras, exibem atividades imunomodulatória, anti- inflamatória e antimicrobiana: 13) T. F. Bachiega, C. L. Orsatti, A. C. Pagliarone, J. M. Sforcin: The Effects of Propolis and its Isolated Compounds on Cytokine Production by Murine Macrophages, Phytother. Res. 26 (2012) 1308-1313.
[023] 14) K. Pei, J. Ou, J. Huang, S. Ou: p-Coumaric acid and its conjugates: dietary sources, pharmacokinetic properties and biological activities, J. Sci. Food Agric. 96 (2016) 2956-2962.
[024] 15) N. Kumar, V. Pruthi: Potential applications of ferulic acid from natural sources, Biotechnol. Rep. 4 (2014) 86-93.
[025] 16) C. Shi, X. Zhang, Y. Sun, M. Yang, K. Song, Z. Zheng, Y. Chen, X. Liu, Z. Jia, R. Dong, L. Cui, X. Xia: Antimicrobial activity of ferulic acid against Cronobacter sakazakii and possible mechanism of action, Foodborne Pathog. Dis. 13 (2016) 196-204.
[026] 17) H. G. Choi, P. T. Tran, J. H. Lee, B. S. Min, J. A. Kim: Anti- inflammatory activity of caffeic acid derivatives isolated from the roots of Salvia miltiorrhiza Bunge, Arch. Pharm. Res. (2018) 64-70.
[027] 18) V. N. Lima, C. D. Oliveira-Tintino, E. S. Santos, L. P. Morais, S. R. Tintino, T. S. Freitas, Y. S. Geraldo, R. L. Pereira, R. P. Cruz, I. R. Menezes, H. D. Coutinho: Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol, Microb. Pathog. 99 (2016) 56-61.
[028] 19) K. Frenkel, H. Wei, R. Bhimani, J. Ye, J. A. Zadunaisky, M.-T. Huang, T. Ferraro, A. H. Conney, D. Grunberger: Inhibition of Tumor Promoter-mediated Processes in mouse Skin and Bovine Lens by Caffeic Acid Phenethyl Ester, Cancer Res. 53 (1993) 1255-1261.
[029] 20) A. Russo, R. Longo, A. Vanella: Antioxidant activity of propolis: role of caffeic acid phenethyl ester and galangin, Fitother. 73 (2002) S21-S29.
[030] Além do mais, as substâncias ativas do própolis são fungicidas, bactericidas, virucidas, inseticidas, nematicidas e são usadas na proteção de plantas. Devido a uma forte atividade antioxidante, o própolis fortalece plantas e intensifica sua resistência contra tensão abiótica e ajuda as mesmas a combater infecções; veja as referências de literatura 21 a 25: 21) C. A. Guginski-Piva, I. dos Santos, A. W. Júnior, D. W. Heck, M. F. Flores, K. Pazolini: Propolis for the control of powdery mildew and the induction of phytoalexins in cucumber, IDESIA (Chile) 33 (2015) 39-47; 22) Z. Ararso, G. Legesse: Inseticida action of honeybees propolis extract against larvae of lesser wax moth, Agric. Biol. J. North Am. (2015) doi:10.5251/abjna.2016.7.6.302.306; 23) L. Kumar, M. K. Mahatma, K. A. Kalariya, S. K. Bishi, A. Mann: Plant Phenolics: Important Bio-Weapon against Pathogens and Insect Herbivores, Popular Kheti 2 (2014) 149-152; 24) E. M. Noweer, M. G. Dawood: Efficiency of propolis extract on faba bean plants and its role against nematode infection, Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. 74 (2009) 593-603; 25) K. Kulbat: The role of phenolic compounds in plant resistance, Biotechnol. Food Sci. 80 (2016) 97-108.
[031] De acordo com nosso melhor conhecimento, o uso de um solvente de extração (ES) específica com base em polietileno glicol líquido, contendo um baixo (0,1-3,5% m/m) conteúdo de lecitina, como um intensificador da quimiosseletividade da extração de própolis, não fio descrito na tecnologia anterior. A aplicação de tal ES específico desta invenção habilita a intensificação da quimiosseletividade em extração de própolis bruto, rendendo o correspondente extrato líquido com um conteúdo significativamente intensificado das respectivas substâncias ativas 1 a 4.
[032] Também, o uso do extrato de própolis líquido padronizado específico mencionado como um ingrediente farmacêutico ativo (API) na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção provê inesperada melhoria em uma série de diferentes indicações para seu uso; como é descrito na descrição detalhada desta invenção.
SUMÁRIO
[033] A presente invenção é com base em inesperadas eficácia e quimiosseletividade da extração de própolis bruto com um solvente de extração (ES) específica. O último consiste na mistura de polietileno glicol líquido (PEG), por exemplo PEG 400, e lecitina ou lecitina hidrolisada na razão: 96,5-99,9 : 0,1-3,5 % p/p.
[034] O solvente de extração (ES) extrai efetivamente e quimiosseletivamente as substâncias ativas do própolis ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) e 2-fenetil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE). O uso de um método analítico adequado, com base em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), habilita uma determinação quantitativa das substâncias ativas 1 a 4 de uma maneira como esta do extrato primário preparado. O último é sujeito à padronização adicional pela diluição com o mesmo ES que foi empregado na etapa de extração, até o conteúdo desejado das substâncias ativas 1 a 4 de acordo com a presente invenção. Desta maneira, um extrato de própolis líquido com concentrações conhecidas e padronizadas das substâncias ativas chaves 1 a 4, de acordo com esta invenção, é obtido. O mesmo é adicionalmente usado como um ingrediente farmacêutico ativo (API), um ingrediente cosmético ativo (ACI), ou como um ingrediente alimentício para manufatura de alimento e suplementos alimentares funcionais.
[035] A composição desta invenção com base no dito extrato de própolis líquido, que contém as substâncias ativas chaves ácido p-coumárico (1; 10-1.300 µg/mL), ácido trans-ferúlico (2; 10-800 µg/mL), ácido cafeico (3; 5-300 µg/mL), e 2- fenetil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; 5-400 µg/mL) é um agente efetivo na terapia das doenças inflamatórias, das infecções bacterianas, das infecções fúngicas, das doenças virais, das doenças autoimunes, das disfunções gastrointestinais funcionais, para regeneração da mucosa, tratamento de queimaduras e feridas, bem como no tratamento de doenças cancerosas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[036] A figura 1 mostra um típico cromatograma HPLC dos ingredientes chaves de própolis 1 a 4 e ingredientes associados 5 a 10.
[037] As figuras 2.1 a 2.4 mostram os resultados da composição quantitativa de substâncias ativas do própolis 1 a 4 no extrato de própolis líquido obtido pela extração com etanol (96%) e misturas de etanol com diferentes tipos e concentrações de lecitinas.
[038] As figuras 2.5 a 2.10 mostram os resultados da composição quantitativa de substâncias associadas 5 a 10 no extrato de própolis líquido obtido pela extração com etanol (96%) e misturas de etanol com diferentes tipos e concentrações de lecitinas.
[039] As figuras 3.1 a 3.4 mostram os resultados da composição quantitativa de substâncias ativas do própolis 1 a 4 no extrato de própolis líquido obtido pela extração com polietileno glicol 400 e misturas de polietileno glicol 400 com diferentes tipos e concentrações de lecitinas.
[040] As figuras 3.5 a 3.10 mostram os resultados da composição quantitativa das substâncias associadas 5 a 10 no extrato de própolis líquido obtido pela extração com polietileno glicol 400 e misturas de polietileno glicol 400 com diferentes tipos e concentrações de lecitinas.
[041] A figura 4 mostra um esquema de blocos do processo para a produção de um extrato de própolis líquido padronizado de acordo com a presente invenção.
[042] A figura 5 mostra um típico cromatograma HPLC de uma análise quantitativa da formulação farmacêutica desta invenção, produto proveniente do Exemplo 11.
ABREVIAÇÕES ES - solvente de extração SL - lecitina de soja (Glycine max. L.) RL - lecitina da colza (Brassica napus L.) HRL - lecitina de soja hidrolisada SUL - lecitina de girassol desoleada EtOH - etanol 96% PEG - polietileno glicol HPLC - cromatografia líquida de alto desempenho GC - cromatografia gasosa TLC - cromatografia de camada fina MIC - mínima concentração inibitória RPMI - meio Roswell Park Memorial Institute TTC - cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio, indicador de redox PBS - tampão de fosfato em solução salina CFU - unidades de formação de colônia; número de micro-organismos vivos capazes de formar colônias XTT - sal de sódio XTT; sal interno do 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5- sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida, indicador de redox MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina MSSA - Staphylococcus aureus sensível a meticilina CLSI - Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais EUCAST - Comitê Europeu para Teste de Susceptibilidade
Antimicrobiana API - ingrediente / substância farmacêuticos ativos DER – fármaco por extrato, razão em peso; medida da força do extrato expressada pela razão em peso de um fármaco inicial e um extrato final SCC - contagem de célula somática i.mam. - intramamária (aplicação) ATCC - Coleta de Cultura Tipo Americana; organização sem fins lucrativos que coleta, armazena, e distribui micro-organismos de referência padrões CNS - staphylococci coagulase negativo
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[043] A presente invenção se refere ao inédito extrato de própolis líquido, padronizado no conteúdo das substâncias ativas chaves, selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) e ácido cafeico 2-feniletil éster, 2-fenetil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4), ao processo para sua preparação e seu uso. COOH H3CO COOH HO COOH
HO HO HO 1 2 3
O HO O
HO 4
[044] O extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício, de acordo com a presente invenção consiste em: (A) um extrato de própolis seco; 0,1-10,0% p/p; e (B) um solvente de extração; 90,0-99,9% p/p; em que o solvente de extração consiste em: (B.1) um ou mais polietileno glicóis líquidos (PEG) 200-600; 96,5-99,9% p/p; e (B.2) lecitina ou lecitina hidrolisada; 0,1-3,5% p/p;
em que o dito extrato de própolis líquido é padronizado por: (I) a razão em peso quantitativa de própolis bruto como um fármaco e extrato final (DER) na razão de: 1 : 2 - 1 : 20 p/p; e (II) o conteúdo quantitativo de substâncias ativas do própolis, selecionado a partir do grupo que consiste em ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) e 2-feniletil 3,4-di-hidroxicinamato (4), em que a composição quantitativa de minimamente duas de quatro das ditas substâncias ativas chaves é como segue: (i) ácido p-coumárico (1); 100-1.300 µg/mL; (ii) ácido trans-ferúlico (2); 75-800 µg/mL; (iii) ácido cafeico (3); 25-300 µg/mL; e (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE); 40-400 µg/mL.
[045] Na modalidade preferida desta invenção, polietileno glicol líquido (PEG) como o componente do solvente de extração (ES) é selecionado a partir do grupo que consiste em: polietileno glicol 200, polietileno glicol 300, polietileno glicol 400, polietileno glicol 600, ou misturas destas substâncias.
[046] Especificamente, o polietileno glicol líquido (PEG) como o componente do solvente de extração (ES) é selecionado a partir do grupo que consiste em: polietileno glicol 200, polietileno glicol 400, ou misturas destas substâncias.
[047] Além do mais, a lecitina ou a lecitina hidrolisada é selecionada a partir do grupo que consiste nos produtos distinguidos pelo fator de equilíbrio hidrofílico- lipofílico (HLB) de 2 a 12, e selecionada a partir do grupo que consiste em: lecitina de soja (SL; proveniente de Glycine max. L.); lecitina de girassol (SUL; proveniente de Helianthus annuus L.); lecitina da colza (RL; proveniente de Brassica napus L.); lecitina de canola (Brassica rapa L.); lecitina proveniente dos ovos de galinha (Gallus gallus domesticus L.); produtos desoleados das ditas lecitinas; lecitinas hidrogenadas provenientes das ditas origens; lecitinas hidrolisadas provenientes das ditas origens; derivados modificados por enzima das ditas lecitinas; ou misturas destas substâncias.
[048] Especificamente, como a lecitina na presente invenção, lecitina nativa, desoleada, hidrogenada, hidrolisada ou lecitina modificada por enzima proveniente da soja (Glycine max. L.), do girassol (Helianthus annuus L.), da colza (Brassica napus L.) ou da canola (Brassica rapa L.); ou misturas destas substâncias podem ser empregadas.
[049] O termo “lecitina modificada por enzima” inclui lecitina hidrolisada, obtida por hidrólise catalisada por enzima de uma fração de ácido graxo superior com uma geração de monoéster de glicerol dos ácidos graxos superiores com um grupo fosfato e colina restante na molécula. Isto resulta em fator HLB significativamente aumentado de tal lecitina hidrolisada.
[050] Preferivelmente, como o solvente de extração (ES) para a preparação do extrato de própolis líquido, de acordo com a presente invenção, a mistura de: (i) polietileno glicol (PEG) 200, polietileno glicol 300, polietileno glicol 400 ou suas misturas; de 97 a 99% p/p; e (ii) lecitina nativa, lecitina desoleada ou lecitina hidrolisada proveniente da soja (Glycine max. L.), do girassol (Helianthus annuus L.), da colza (Brassica napus L.) ou da canola (Brassica rapa L.); ou misturas destas substâncias; de 1 a 3% p/p; pode ser usada.
[051] Na modalidade preferida desta invenção, o extrato de própolis líquido de acordo com a invenção é padronizado em: (I) uma razão em peso quantitativa de própolis bruto como o fármaco contra o extrato final (DER) em uma razão de: 1 : 3 - 1 : 5 p/p; e (II) a composição quantitativa das substâncias ativas do própolis selecionadas a partir do grupo que consiste em ácido p-coumárico (1), ácido trans- ferúlico (2), ácido cafeico (3), e 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-cinamato (4), em que minimamente duas de quatro das ditas substâncias ativas chaves correspondem ao seguinte conteúdo quantitativo:
(i) ácido p-coumárico (1); 500-1.300 µg/mL; (ii) ácido trans-ferúlico (2); 300-800 µg/mL; (iii) ácido cafeico (3); 100-300 µg/mL; e (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-cinamato (4; CAPE); 100-400 µg/mL.
ANALÍTICA DAS SUBSTÂNCIAS ATIVAS DO PRÓPOLIS EM EXTRATOS LÍQUIDOS
[052] Para o desenvolvimento de um extrato de própolis líquido padronizado inédito de acordo com esta invenção, o desenvolvimento de um método analítico adequado para a determinação quantitativa de: (i) substâncias ativas chaves do própolis selecionadas a partir do grupo que consiste nos supramencionados: ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3), e 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-cinamato (4); e (ii) substâncias ativas associadas selecionadas a partir do grupo que consiste em: ácido trans-cinâmico (5), crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9) e kaempferol (10) foi essencial.
HO O HO O COOH
OH O OH O 5 6 7
OH HO O HO O HO O OH OH
OH O OH O OH O 8 9 10
[053] Com o propósito do estudo inicial do dito método analítico, extratos de própolis líquidos modelos precisaram ser preparados. Os extratos de própolis modelos em etanol (96%) e polietileno glicol foram usados. Os mesmos foram preparados pelo método de extração padrão, por meio de maceração em temperatura ambiente durante 24h. Então, o resíduo não dissolvido foi separado pela filtração e o filtrado claro foi empregado como um extrato de própolis líquido modelo para estudo adicional. Como o polietileno glicol líquido modelo, polietileno glicol 400 (PEG 400) foi usado. Os procedimentos para a preparação dos extratos de própolis líquidos modelos em clássicos solventes de extração, etanol (96%) e polietileno glicol 400, são descritos no Exemplo 1 (etanol 96%) e no Exemplo 2 (PEG 400).
[054] Um método analítico adequado, com base na cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), foi desenvolvido, pelo qual, uma separação bem-sucedida de todos os 10 ditos compostos 1 a 10 foi alcançada. O método é precisamente descrito no Exemplo 3.
[055] Um típico cromatograma HPLC, obtido pelo presente método analítico, é mostrado na figura 1. Os tempos de retenção (tR) dos compostos 1 a 10 são dados na Tabela 1. Tabela 1. Tempos de retenção das substâncias ativas do própolis 1 a 10 de acordo com o método HPLC da presente invenção.a Tempo de retenção (tR) Nº Substância ativa do própolis [min] 1 ácido p-coumárico (1) 14,13 2 ácido trans-ferúlico (2) 15,31 3 ácido cafeico (3) 10,57 4 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4) 48,62 5 ácido trans-cinâmico (5) 29,76 6 crisina (6) 44,68 7 pinocembrina (7) 47,39 8 galangina (8) 49,94 9 apigenina (9) 37,72 10 kaempferol (10) 36,87
[056] a Coluna cromatográfica: Ascentis express; C18; dimensões: 15 cm x 3,0 mm; diâmetro das partículas na coluna: 2,7 µm; fase móvel: A = solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, B = metanol; gradiente: 0 min, 80% A, 20% B; 3 min, 70% A, 30% B; 60 min, 20% A, 80% B; 90 min, 20% A, 80% B; 100 min, 70% A, 30% B; 105 min, 80% A, 20% B; temperatura da coluna: 30°C; fluxo: 0,25 mL/min; tempo de análise: 110 min; comprimento de onda no detector UV-VIS: para detecção: 370 nm, para integração 290 nm; volume de injeção: 10 µL; pressão: 21.000 a 29.000 kPa (210 a 290 bars).
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA LECITINA NA EFICÁCIA DA EXTRAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS ATIVAS DO PRÓPOLIS 1 A 4
[057] Na continuação desta pesquisa, o efeito de diferentes solventes de extração (ES), com conteúdo de vários tipos (SL, RL, HRL) e concentrações (1 a 30% p/p) de lecitinas, na eficácia da extração da substância ativa do própolis 1 a 4 foi estudado; veja Tabela 2. Tabela 2. Sistemas do solvente de extração (ES) testados para extração de substâncias ativas 1 a 4 do própolis. Razão em peso Nº Solvente Lecitina solvente:lecitina Experimento (p/p) 1 EtOH - - Exemplo 1 2 EtOH SL 97 : 3 Exemplo 4, E1 3 EtOH SL 90 : 10 Exemplo 4, E2 4 EtOH SL 80 : 20 Exemplo 4, E3 5 EtOH SL 70 : 30 Exemplo 4, E4 6 EtOH RL 98,9 : 1,1 Exemplo 4, E5 7 EtOH RL 96 : 4 Exemplo 4, E6 8 EtOH HRL 97,8 : 2,2 Exemplo 4, E7 9 EtOH HRL 92,3 : 7,7 Exemplo 4, E8 10 PEG 400 - - Exemplo 2 11 PEG 400 SR 97 : 3 Exemplo 5, E1
12 PEG 400 SR 90 : 10 Exemplo 5, E2 13 PEG 400 RL 98,9 : 1,1 Exemplo 5, E3 14 PEG 400 RL 96 : 4 Exemplo 5, E4 15 PEG 400 HRL 97,8 : 2,2 Exemplo 5, E5 16 PEG 400 HRL 92,3 : 7,7 Exemplo 5, E6 EtOH = etanol 96%; PEG 400 = polietileno glicol 400; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
[058] Extratos de própolis líquidos assim preparados foram sujeitos a análise quantitativa contra o conteúdo das substâncias ativas chaves 1 a 4 e das substâncias ativas associadas 5 a 10. Os resultados são dados nas Tabelas 3 a 6.
[059] No caso do uso do solvente de extração (ES) com base em etanol 96% (EtOH) e das misturas de EtOH e diferentes tipos (SL, RL, HRL) e concentração (1 a 30% p/p na composição de ES), extratos de própolis líquidos primários contêm ácido p-coumárico (1; aproximadamente 800-1.250 µg/mL), ácido trans-ferúlico (2; aproximadamente 485-770 µg/mL), ácido cafeico (3; aproximadamente 185-290 µg/mL) e 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE; aproximadamente 215- 320 µg/mL) como ingredientes ativos dominantes; veja Tabela 3. Tabela 3. Composição quantitativa das substâncias ativas 1 a 4 nos extratos de própolis líquidos obtidos com solventes de extração (ES) com base em etanol. ácido p- ácido trans- ácido cafeico 2-fenetil 3,4- coumárico ferúlico (2) (3) di-hidróxi (1) cinamato (4) γ [µg/mL]
ES (figura 2.4) γ [µg/mL] γ [µg/mL] γ[µg/mL] (figura 2.2) (figura 2.3) (figura 2.1) 1 916,32 559,26 209,49 236,68 2 820,35 501,87 186,22 216,63
3 872,51 533,16 204,30 232,98 4 1.116,27 679,58 251,24 289,45 5 1.248,16 770,88 288,66 320,75 6 808,30 485,32 185,58 231,19 7 981,25 596,21 225,33 266,46 8 861,11 516,41 196,96 248,14 9 945,73 582,69 228,69 263,48 Solvente de extração (ES) 1 - EtOH 6 - EtOH + 1.1% RL 2 - EtOH + 3% SL 7 - EtOH + 4% RL 3 - EtOH + 10% SL 8 - EtOH + 2.2% HRL 4 - EtOH + 20% SL 9 - EtOH + 7.7% HRL 5 - EtOH + 30% SL ES = solvente de extração; EtOH = etanol 96%; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
[060] Aqui, a concentração das substâncias ativas auxiliares 5 a 10 foram no seguinte nível: ácido trans-cinâmico (5; aproximadamente 40-65 µg/mL), crisina (6; aproximadamente 500-690 µg/mL), pinocembrina (7; aproximadamente 440-670 µg/mL), galangina (8; aproximadamente 210-300 µg/mL), apigenina (9; aproximadamente 90-150 µg/mL) e kaempferol (10; aproximadamente 45-90 µg/mL); veja Tabela 4.
[061] No caso do uso do solvente de extração (ES) com base em polietileno glicol (PEG 400) e misturas de PEG 400 e vários tipos (SL, RL, HRL) e concentrações (1 a 10% p/p em composição de ES) de lecitinas, extratos líquidos primários também contêm ácido p-coumárico (1; aproximadamente 750-1.300 µg/mL), ácido trans-ferúlico (2; aproximadamente 400-800 µg/mL), ácido cafeico (3; aproximadamente 140-300 µg/mL) e 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE; aproximadamente 190-370 µg/mL); veja Tabela 5. Tabela 4. Composição quantitativa das substâncias ativas associadas 5 a 10 nos extratos de própolis líquidos obtidos com solventes de extração (ES) com base em etanol. ácido crisina pinocembrina (7) galangina apigenina kaempferol trans- (6) (8) (9) (10) ES cinâmico (5) γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] 1 48,88 521,03 496,38 232,36 103,38 54,00 2 43,06 463,66 444,22 208,74 93,41 47,72 3 46,60 499,97 479,67 224,56 100,84 74,08 4 58,37 623,32 594,05 267,18 127,17 62,16 5 65,92 685,81 665,44 297,85 146,91 71,11 6 40,53 500,50 477,17 226,86 96,11 79,10 7 51,21 576,39 552,12 263,99 115,45 87,40 8 43,15 534,08 510,26 245,27 102,79 85,78 9 51,21 557,42 535,33 256,51 111,98 88,93 Solvente de extração (ES) 1 - EtOH 6 - EtOH + 1,1% RL 2 - EtOH + 3% SL 7 - EtOH + 4% RL 3 - EtOH + 10% SL 8 - EtOH + 2,2% HRL 4 - EtOH + 20% SL 9 - EtOH + 7,7% HRL 5 - EtOH + 30% SL ES = solvente de extração; EtOH = etanol 96%; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
Tabela 5. Composição quantitativa das substâncias ativas 1 a 4 nos extratos de própolis líquidos obtidos com solventes de extração (ES) com base em polietileno glicol 400.
ácido p- ácido trans- ácido cafeico 2-fenetil 3,4- coumárico (1) ferúlico (2) (3) di-hidróxi cinamato (4)
EO γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] (figura 3.4) (figura 3.1) (figura 3.2) (figura 3.3) 1 750,57 458,93 167,79 226,14 2 1.112,08 685,14 249,67 329,41 3 781,98 485,75 171,88 223,99 4 1.215,61 745,35 274,49 366,41 5 659,80 405,60 146,30 194,79 6 1.294,35 792,50 292,18 392,23 7 806,44 495,64 182,80 236,48 Solvente de extração (ES) 1 - PEG 400 5 - PEG 400 + 4% RL 2 - PEG 400 + 3% SL 6 - PEG 400 + 2,2% HRL 3 - PEG 400 + 10% SL 7 - PEG 400 + 7,7% HRL 4 - PEG 400 + 1,1% RL ES = solvente de extração; PEG 400 = polietilenoglicol 400; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
[062] Neste caso, a concentração das substâncias ativas auxiliares 5 a 10 foi no nível: ácido trans-cinâmico (5; aproximadamente 30-70 µg/mL), crisina (6; aproximadamente 400-830 µg/mL), pinocembrina (7; aproximadamente 390-800 µg/mL), galangina (8; aproximadamente 190-360 µg/mL), apigenina (9; aproximadamente 80-170 µg/mL) e kaempferol (10; aproximadamente 40-140 µg/mL); veja Tabela 6. Tabela 6. Composição quantitativa das substâncias ativas associadas 5 a 10 nos extratos de própolis líquidos obtidos com solventes de extração (ES) com base em polietileno glicol 400. ácido crisina pinocembrina galangina apigenina kaempferol trans- (6) (7) (8) (9) (10) cinâmico
ES (5) γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] γ[µg/mL] 1 38,40 476,77 457,71 208,31 97,03 80,18 2 57,81 681,36 649,38 293,11 145,59 68,23 3 39,28 456,61 437,36 196,76 103,89 43,00 4 62,14 772,55 736,93 329,80 157,13 130,60 5 32,92 412,97 391,23 172,80 84,25 44,46 6 66,58 824,77 794,67 354,62 171,29 138,94 7 40,75 499,97 473,43 210,09 103,22 54,16 Solvente de extração (ES) 1 - PEG 400 5 - PEG 400 + 4% RL 2 - PEG 400 + 3% SL 6 - PEG 400 + 2,2% HRL 3 - PEG 400 + 10% SL 7 - PEG 400 + 7,7% HRL 4 - PEG 400 + 1,1% RL ES = solvente de extração; PEG 400 = polietileno glicol 400; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
[063] Como pode ser visto a partir dos resultados, todas as lecitinas testadas (SL, RL, HRL) em combinação com qualquer solvente puro, etanol 96% ou polietileno glicol 400 (PEG 400), quando usadas em concentrações mais baixas, de 1 a 3% p/p, na composição do solvente de extração (ES), contribui significativamente para o aumento da quimiosseletividade da extração das substâncias ativas 1 a 4 em comparação com solventes puros.
[064] Um efeito inesperado da combinação de PEG 400 e lecitina (SL, RL, HRL) é revelado no fato de que, enquanto PEG 400 como um solvente puro, extrai substâncias ativas 1 a 4 significativamente mais fracas do que o etanol 96% faz (Tabela 3; linha 1, coluna 2); quando empregada em combinação com lecitinas (SL, RL, HRL) em concentração de 1 a 3% p/p, a mesma extrai compostos 1 a 4 de uma maneira significativamente mais efetiva em comparação com combinações análogas de etanol 96% com as mesmas lecitinas. Por exemplo, embora a concentração do ácido p-coumárico (1) alcançado no extrato obtido com 100% de PEG 400 como o solvente de extração tenha ficado na faixa de 750 µg/mL (Tabela 5; linha 1, coluna 2) e com 96% de EtOH como ES na faixa de 916 µg/mL (Tabela 3; linha 1, coluna 2), o uso de 3% p/p de SL em PEG 400 resultou em uma concentração de 1.112 µg/mL (Tabela 5; linha 2, coluna 2), contra o nível de 820 µg/mL (Tabela 3; linha 2, coluna 2) no caso de uso de ES com base em etanol 96% com 3% p/p de SL.
[065] A partir deste típico exemplo, um efeito completamente inesperado da combinação de polietileno glicol e lecitina em concentração de 1 a 3% p/p no solvente de extração (ES) é claramente visível. Isto pode ser extrapolado pelos versados na técnica, até uma faixa aceitável de percentual em peso de lecitina ideal de 0,1-3,5% p/p na composição de ES.
[066] No uso de percentuais em peso mais altos da lecitina na composição do solvente de extração (ES), o efeito benéfico da lecitina na quimiosseletividade da extração de própolis é perdido, em comparação com sistemas análogos com base em etanol. Por exemplo, pelo emprego de lecitinas em concentrações de 4% de RL, 7,7% de HRL ou 10% de SL em ES, concentrações mais baixas das substâncias ativas chaves 1 a 4 foram registradas, em comparação com o uso de sistemas ES com base em etanol análogos. Típicos resultados são mostrados nas Tabelas 7 e 8 para as duas substâncias ativas mais abundantes, ácido p-coumárico (1) e ácido trans-ferúlico (2). Tabela 7. Composição quantitativa de ácido p-coumárico (1) em extratos de própolis líquidos obtidos com diferentes solventes de extração de acordo com a presente invenção.
ácido p-coumárico Mudança percentual Mudança percentual no (1) no sistema PEG 400 sistema ES EtOH ES ES ES em comparação em comparação com γ[µg/mL] com ES com base em ES com base em PEG EtOH (%)a 400 (%)b 1 916,32 - +22,1 2 750,57 -18,1 - 3 820,35 - -26,2 4 1.112,08 +35,6 - 5 872,51 - +11,6 6 781,98 -10,4 - 7 808,30 - -33,5 8 1.215,61 +50,4 - 9 981,25 - +48,7 10 659,80 -32,8 - 11 861,11 - -33,5 12 1.294,35 +50,3 - 13 945,73 - +17,3 14 806,44 -14,7 - Solvente de extração (ES) 1 - EtOH 8 - PEG 400 + 1,1% RL 2 - PEG 400 9 - EtOH + 4% RL 3 - EtOH + 3% SL 10 - PEG 400 + 4% RL 4 - PEG 400 + 3% SL 11 - EtOH + 2,2% HRL 5 - EtOH + 10% SL 12 - PEG 400 + 2,2% HRL 6 - PEG 400 + 10% SL 13 - EtOH + 7,7% HRL 7 - EtOH + 1,1% RL 14 - PEG 400 + 7,7% HRL
ES = solvente de extração; EtOH = etanol 96%; PEG 400 = polietileno glicol 400; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
a Aumento ou diminuição percentual (%) da concentração do ácido p-coumárico (1) no extrato obtido com ES com base em PEG 400 em comparação com ES com base em etanol análogo. b Aumento ou diminuição percentual (%) da concentração do ácido p-coumárico (1) no extrato obtido com ES com base em etanol em comparação com ES com base em PEG 400 análogo.
[067] Na Tabela 7, pode-se ver o típico resultado inesperado da presente invenção na linha 8, coluna 3, em que um aumento de 50% da concentração do ácido p-coumárico (1) foi observado, quando o solvente de extração (ES), PEG 400 + RL (98,9 : 1,1, p/p) foi usado, em comparação com ES com base em EtOH análogo (EtOH + RL = 98,9 : 1,1, p/p). Tabela 8. Composição quantitativa do ácido trans-ferúlico (2) nos extratos de própolis líquidos obtidos com diferentes solventes de extração de acordo com a presente invenção. ácido trans-ferúlico Mudança percentual Mudança percentual no (2) no sistema ES PEG sistema ES EtOH em ES 400 em comparação comparação com ES γ[µg/mL] com ES com base em com base em PEG 400 EtOH (%)a (%)b 1 559,26 - +21,9 2 458,93 -17,9 - 3 501,87 - -26,7 4 685,14 +36,5 - 5 533,16 - +9,8 6 485,75 -10,4 - 7 485,32 - -33,5
8 745,35 +50,4 - 9 596,21 - -19,3 10 405,60 +23,9 - 11 516,41 - -34,8 12 792,50 +53,5 - 13 582,69 - +17,6 14 495,64 -14,9 - Solvente de extração (ES) 1 - EtOH 8 - PEG 400 + 1,1% RL 2 - PEG 400 9 - EtOH + 4% RL 3 - EtOH + 3% SL 10 - PEG 400 + 4% RL 4 - PEG 400 + 3% SL 11 - EtOH + 2,2% HRL 5 - EtOH + 10% SL 12 - PEG 400 + 2,2% HRL 6 - PEG 400 + 10% SL 13 - EtOH + 7,7% HRL 7 - EtOH + 1,1% RL 14 - PEG 400 + 7,7% HRL ES = solvente de extração; EtOH = etanol 96%; PEG 400 = polietileno glicol 400; SL = lecitina de soja; RL = lecitina da colza; HRL = lecitina da colza hidrolisada.
a Aumento ou diminuição percentual (%) da concentração do ácido trans-ferúlico (2) no extrato obtido com ES com base em PEG 400 em comparação com ES com base em etanol análogo. b Aumento ou diminuição percentual (%) da concentração do ácido trans-ferúlico (2) no extrato obtido com ES com base em etanol em comparação com ES com base em PEG 400 análogo.
[068] Como típico exemplo adicional do resultado inesperado, aqui, há os dados na Tabela 8, linha 12, coluna 3, em que um aumento de 53,5% na concentração do ácido trans-ferúlico (2) foi registrada, quando o solvente de extração (ES) PEG 400 + HRL (97,8 : 2,2, p/p) foi empregado, em comparação com ES com base em etanol 96% análogo.
O PROCESSO DE PRODUÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO PADRONIZADO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[069] O processo para a produção do extrato de própolis líquido de acordo com a invenção inclui as seguintes etapas: (i) resfriamento do própolis bruto em -20°C por minimamente 1h; (ii) moagem do própolis arrefecido com peneiramento através de poros de 1 a 8 mm; (iii) extração do própolis bruto com o solvente de extração sob as seguintes condições: (a) razão em peso de própolis bruto e solvente de extração = 1:2 a 1:20 p/p; (b) temperatura de extração de 10 a 150°C; e (c) tempo de extração de 5 minutos a 72h; (iv) filtração da mistura assim obtida através de uma série de filtros com poros de 100 µm a 5 µm, com geração do resíduo não dissolvido e do extrato de própolis líquido; (v) análise quantitativa das substâncias ativas chaves do própolis 1 a 4 por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC); e (vi) padronização do extrato de própolis líquido assim obtido com composição quantitativa exata determinada das substâncias ativas chaves 1 a 4 na etapa (v), através da diluição com um solvente de extração fresco que foi usado na etapa (iii), até o conteúdo desejado das substâncias ativas 1 a 4.
[070] Na modalidade preferida da realização do processo para a preparação do extrato de própolis líquido de acordo com a invenção, a etapa de extração (iii) é realizada sob as seguintes condições: (a) razão em peso de própolis bruto e solvente de extração = 1:3 a 1:5 p/p; (b) temperatura de extração de 15 a 70°C; e (c) tempo de extração de 1 a 24h.
[071] Também, a etapa da determinação quantitativa das substâncias ativas chaves 1 a 4, e para monitoramento acompanhado das substâncias ativas auxiliares 5 a 10, o método cromatográfico líquido de alto desempenho analítico (HPLC), desenvolvido para este propósito, é realizado como segue: (i) coluna cromatográfica: Ascentis express; C18; dimensões: 15 cm x 3,0 mm; diâmetro de partículas na coluna: 2,7 µm; (ii) fase móvel: A = solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, B = metanol; gradiente: 0 min, 80% A, 20% B; 3 min, 70% A, 30% B; 60 min, 20% A, 80% B; 90 min, 20% A, 80% B; 100 min, 70% A, 30% B; 105 min, 80% A, 20% B; (iii) temperatura da coluna: 30°C; (iv) fluxo: 0,25 mL/min; (v) tempo de análise: 110 min; (vi) comprimento de onda no detector UV-VIS: para detecção: 370 nm, para integração: 290 nm; (vii) volume de injeção: 10 µL; (viii) pressão: 21.000 a 29.000 kPa (210 a 290 bars).
[072] Os procedimentos experimentais para a preparação do extrato de própolis líquido de acordo com a presente invenção são revelados nos Exemplos 4 a 9. No Exemplo 9, uma versão otimizada do processo de preparação para o extrato líquido padronizado de força, expressada pelo parâmetro percentual em peso na razão de fármaco por extrato (DER) 1:2, de acordo com a invenção, é descrita.
[073] O método analítico para determinação quantitativa das substâncias ativas chaves 1 a 4 e das substâncias ativas auxiliares 5 a 10 é descrito no Exemplo 3.
DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA ANTIMICROBIANA DO EXTRATO LÍQUIDO PADRONIZADO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO. DETERMINAÇÃO DA MÍNIMA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA (MIC) NOS MICRO- ORGANISMOS PATOGÊNICOS MODELOS
[074] A eficácia antimicrobiana dos extratos de própolis foi medida no Departamento para Medicina Molecular do Rudjer Boskovic Institute, Zagreb,
Croácia. As mínimas concentrações inibitórias (MIC) do extrato de própolis líquido padronizado, de acordo com a presente invenção, foram determinadas pelas direções dos métodos de CLSI (Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais) e EUCAST (Comitê Europeu para Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana), da forma descrita nas referências de literatura 26 a 29. O produto proveniente do Exemplo 9 foi usado.
[075] 26) M. Balouiri, M. Sadiki, S. K. Ibnsouda: Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review, J. Pharm. Anal. 6 (2016) 71-79.
[076] 27) CLSI, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, Approved Standard, 9th ed., CLSI document M07-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087, USA, 2012.
[077] 28) CLSI, Reference Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Approved Standard, 2nd ed., NCCLS document M27-A2. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087- 1898, USA, 2002.
[078] 29) CLSI, Methods for Determining Bactericida Activity of Antimicrobial Agents. Approved Guideline, CLSI document M26-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087, USA, 1998.
[079] A eficácia antimicrobiana foi testada sob condições in vitro em cepas ATCC dos seguintes micro-organismos patogênicos modelos (M): (i) Staphylococcus aureus ATCC 29293 (M1); (ii) Staphylococcus aureus resistente a meticilina; MRSA (coletânea MFBF; M2); (iii) Staphylococcus aureus sensível a meticilina; MSSA (coletânea MFBF; M3); (iv) Enterococcus faecalis ATCC 9212 (M4); (v) Enterococcus faecalis VRE (coletânea MFBF) (M5);
(vi) Escherichia coli ATCC 10536 (M6); (vii) Acinetobacter baumanii ATCC 43498 (M7); (viii) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (M8); e (ix) Candida albicans ATCC 90028 (M9).
[080] Um procedimento de microdiluição serial foi conduzido a fim de determinar mínimas concentrações inibitórias (MIC) dos extratos. Os valores de MIC foram determinados como a concentração do extrato de própolis na qual 80% de redução na contagem de bactéria ou fungos ocorreu (MIC80). Mínimas concentrações inibitórias (MIC80) mostradas na Tabela 9 são mostradas na forma de diluição (%) do correspondente extrato líquido em um dado solvente. O extrato de própolis líquido inicial foi obtido na razão do própolis bruto e do extrato final (DER) 1:2; produto proveniente do Exemplo 9. Se a diluição do extrato líquido for maior, significando que a concentração das substâncias ativas 1 a 10 é mais baixa para MIC, o efeito antimicrobiano resultado do extrato testado é superior.
[081] A descrição detalhada do procedimento experimental para determinação de MIC é revelada no Exemplo 10, e os resultados são dados na Tabela 9. Tabela 9. Resultados da determinação da mínima concentração inibitória (MIC; %) dos extratos de própolis diluídos, produto proveniente do Exemplo 9, em comparação com os extratos líquidos obtidos com etanol 96% (Exemplo 1) ou polietileno glicol 400 (Exemplo 2) como solventes de extração. Micro-organismo modelo MIC80 (%)a Nº Extrato Extrato Extrato líquido com líquido com líquido com base em base em base em ES1b ES2c ES3d 1 Staphylococcus aureus 40 10 40 ATCC 29293 (M1)
2 MRSA (M2) 20 10 40 3 MSSA (M3) 52,5 10 51,5 4 Enterococcus faecalis 10 5 10 ATCC 9212 (M4) 5 Enterococcus faecalis VRE 0 0 2,5 (M5) 6 Escherichia coli ATCC 10 10,85 12,8 10536 (M6) 7 Acinetobacter baumanii 20 10 20 ATCC 43498 (M7) 8 Pseudomonas aeruginosa 0 0 1,85 ATCC 9027 (M8) 9 Candida albicans ATCC 0 0 12,85 90028 (M9) ES = solvente de extração; ES1 = etanol 96%; ES2 = polietileno glicol 400 (PEG 400); ES3 = mistura de PEG 400 + 3% lecitina de soja a MIC80 é a mínima concentração inibitória da substância testada na qual a concentração de micro-organismos modelos vivos é diminuída em 80%. Quando MIC80 = 0, o extrato exibe nenhum efeito. b Produto proveniente do Exemplo 1. c Produto proveniente do Exemplo 2. d Produto proveniente do Exemplo 9.
[082] Nas Tabelas 10 a 15, concentrações em massa das substâncias ativas 1 a 10 em diluições efetivas dos extratos de própolis em cada um dos três sistemas de solvente de extração testados são dadas; as mesmas são obtidas pelo uso de: (i) etanol 96%; produto proveniente do Exemplo 1, (ii) polietileno glicol 400 (PEG 400); produto proveniente do Exemplo 2; e, (iii) mistura de PEG 400 (97% p/p) e lecitina de soja (3% p/p); produto proveniente do Exemplo 9; ou, as concentrações em massa das correspondentes substâncias ativas 1 a 10 nas quais cada extrato líquido em particular alcançou MIC.
Isto foi determinado a partir do extrato líquido primário em que DER é 1:2, dividido com diluição na qual a MIC é alcançada.
Tabela 10. Concentração em massa (γ) em [µg/mL] para substâncias ativas do própolis 1 a 4 em diluições efetivas do extrato de própolis líquido obtido com etanol 96%; produto proveniente do Exemplo 1. Micro-organismo Substância ativa 1 a 4 modelo 1 2 3 4 M1 22,91 13,98 5,24 5,92 M2 45,82 27,96 10,47 11,83 M3 17,41 10,63 3,98 4,50 M4 90,91 55,48 20,78 23,48 M5 916,32 559,26 209,49 236,68 M6 91,63 55,93 20,95 23,67 M7 45,82 27,96 10,47 11,83 M8 916,32 559,26 209,49 236,68 M9 916,32 559,26 209,49 236,68 Substância ativa: ácido para-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3), 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4)
Micro-organismo modelo: S. aureus ATCC 29293 (M1), MRSA (M2), MSSA (M3), E. faecalis ATCC 9212 (M4), E. faecalis VRE (M5), E. coli ATCC 10536 (M6), A. baumanii ATCC 43498 (M7), P. aeruginosa ATCC 9027 (M8), C. albicans ATCC 90028 (M9) Tabela 11. Concentração em massa (γ) em [µg/mL] para substâncias ativas do própolis 5 a 10 em diluições efetivas do extrato de própolis líquido obtido com etanol 96%; produto proveniente do Exemplo 1.
Micro- Substância ativa 5 a 10 organismo 5 6 7 8 9 10 modelo M1 1,22 13,03 12,41 5,81 2,59 1,35 M2 2,44 26,05 24,82 11,62 5,17 2,70 M3 0,93 9,90 9,43 4,42 1,96 1,03 M4 4,85 51,69 49,24 23,05 10,26 5,36 M5 48,88 521,03 496,38 232,36 103,38 54,00 M6 4,89 52,10 49,64 23,24 10,34 5,40 M7 2,44 26,05 24,82 11,62 5,17 2,70 M8 48,88 521,03 496,38 232,36 103,38 54,00 M9 48,88 521,03 496,38 232,36 103,38 54,00 Substância ativa: ácido cinâmico (5), crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9), kaempferol (10)
Micro-organismo modelo: S. aureus ATCC 29293 (M1), MRSA (M2), MSSA (M3), E. faecalis ATCC 9212 (M4), E. faecalis VRE (M5), E. coli ATCC 10536 (M6), A. baumanii ATCC 43498 (M7), P. aeruginosa ATCC 9027 (M8), C. albicans ATCC 90028 (M9) Tabela 12. Concentração em massa (γ) em [µg/mL] para substâncias ativas do própolis 1 a 4 em diluições efetivas do extrato de própolis líquido obtido com polietileno glicol 400 (PEG 400); produto proveniente do Exemplo 2. Micro-organismo Substância ativa 1 a 4 modelo 1 2 3 4 M1 75,06 45,89 16,78 22,61 M2 75,06 45,89 16,78 22,61 M3 75,06 45,89 16,78 22,61 M4 433,08 264,80 96,81 130,63 M5 750,57 458,93 167,79 226,14
M6 69,05 42,22 15,44 20,81 M7 75,06 45,89 16,78 22,61 M8 >750,57 >458,93 >167,79 >226,14 M9 >750,57 >458,93 >167,79 >226,14 Substância ativa: ácido para-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3), 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4)
Micro-organismo modelo: S. aureus ATCC 29293 (M1), MRSA (M2), MSSA (M3), E. faecalis ATCC 9212 (M4), E. faecalis VRE (M5), E. coli ATCC 10536 (M6), A. baumanii ATCC 43498 (M7), P. aeruginosa ATCC 9027 (M8), C. albicans ATCC 90028 (M9) Tabela 13. Concentração em massa (γ) em [µg/mL] para substâncias ativas do própolis 5 a 10 em diluições efetivas do extrato de própolis líquido obtido com polietileno glicol 400 (PEG 400); produto proveniente do Exemplo 2. Micro- Substância ativa 5 a 10 organismo 5 6 7 8 9 10 modelo M1 3,84 47,68 45,77 20,83 9,70 8,02 M2 3,84 47,68 45,77 20,83 9,70 8,02 M3 3,84 47,68 45,77 20,83 9,70 8,02 M4 22,16 275,10 264,10 120,20 56,05 46,26 M5 38,40 476,77 457,71 208,31 97,03 80,18 M6 3,53 43,86 42,11 19,17 8,93 7,38 M7 3,84 47,68 45,77 20,83 9,70 8,02 M8 >38,40 >476,77 >457,71 >208,31 >97,03 >80,18 M9 >38,40 >476,77 >457,71 >208,31 >97,03 >80,18 Substância ativa: ácido cinâmico (5), crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9), kaempferol (10)
Micro-organismo modelo: S. aureus ATCC 29293 (M1), MRSA (M2), MSSA (M3), E. faecalis ATCC 9212 (M4), E. faecalis VRE (M5), E. coli ATCC 10536 (M6), A. baumanii ATCC 43498 (M7), P. aeruginosa ATCC 9027 (M8), C. albicans ATCC 90028 (M9) Tabela 14. Concentração em massa (γ) em [µg/mL] para substâncias ativas do própolis 1 a 4 em diluições efetivas do extrato de própolis líquido obtido com a mistura de polietileno glicol 400 (PEG 400; 97% p/p) e lecitina de soja (3% p/p); produto proveniente do Exemplo 9. Micro-organismo Substância ativa 1 a 4 modelo 1 2 3 4 M1 27,80 17,13 6,24 8,24 M2 27,80 17,13 6,24 8,24 M3 27,80 17,13 6,24 8,24 M4 111,21 68,51 25,00 32,94 M5 547,05 337,03 122,82 162,05 M6 86,50 53,29 19,42 25,62 M7 55,60 34,26 12,48 16,47 M8 603,22 371,64 135,42 178,68 M9 864,95 532,89 194,19 256,21 Substância ativa: ácido para-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3), 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4)
Micro-organismo modelo: S. aureus ATCC 29293 (M1), MRSA (M2), MSSA (M3), E. faecalis ATCC 9212 (M4), E. faecalis VRE (M5), E. coli ATCC 10536 (M6), A. baumanii ATCC 43498 (M7), P. aeruginosa ATCC 9027 (M8), C. albicans ATCC 90028 (M9) Tabela 15. Concentração em massa (γ) em [µg/mL] para substâncias ativas do própolis 5 a 10 em diluições efetivas do extrato de própolis líquido obtido com a mistura de polietileno glicol 400 (PEG 400; 97% p/p) e lecitina de soja (3% p/p);
produto proveniente do Exemplo 9. Micro- Substância ativa 5 a 10 organismo 5 6 7 8 9 10 modelo M1 1,45 17,03 16,24 7,33 3,64 1,71 M2 1,45 17,03 16,24 7,33 3,64 1,71 M3 1,45 17,03 16,24 7,33 3,64 1,71 M4 5,78 68,14 64,94 29,31 14,60 6,82 M5 28,44 335,17 319,44 144,19 71,62 33,56 M6 4,50 53,00 50,51 22,80 11,32 5,31 M7 2,89 34,07 32,47 14,66 7,28 3,41 M8 31,36 369,59 352,24 158,99 78,97 37,01 M9 44,96 529,95 505,08 227,98 113,23 53,07 Substância ativa: ácido cinâmico (5), crisina (6), pinocembrina (7), galangina (8), apigenina (9), kaempferol (10) Micro-organismo modelo: S. aureus ATCC 29293 (M1), MRSA (M2), MSSA (M3), E. faecalis ATCC 9212 (M4), E. faecalis VRE (M5), E. coli ATCC 10536 (M6), A. baumanii ATCC 43498 (M7), P. aeruginosa ATCC 9027 (M8), C. albicans ATCC 90028 (M9)
[083] O efeito antimicrobiano geral (MIC) de cada um dos extratos de própolis líquidos testados é alcançado por um efeito sinérgico de diversas substâncias ativas 1 a 10. Uma coisa interessante e completamente inesperada é que a mistura das substâncias ativas 1 a 10 em pequenas concentrações é mais efetiva do que aquela de concentrações muito mais altas de certas substâncias ativas (puras) 1 a 10.
[084] A formulação da presente invenção é a mais efetiva contra micro- organismos Gram positivos, tais como espécies de Staphylococcus, mas, como pode-se ver a partir da Tabela 9, em uma concentração mais alta, a mesma também é efetiva contra algumas bactérias Gram-negativas: E. coli e A. baumanii, bem como o fungo C. albicans.
O USO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO PADRONIZADO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[085] O extrato de própolis como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com a presente invenção contém concentrações padronizadas de substâncias altamente bioativas: (i) ácido p-coumárico (1); 100-1.300 µg/mL; (ii) ácido trans-ferúlico (2); 75-800 µg/mL; (iii) ácido cafeico (3); 25-300 µg/mL; e (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE); 40-400 µg/mL.
[086] Devido ao conteúdo padronizado das substâncias ativas chaves 1 a 4, o extrato de própolis líquido de acordo com a invenção representa um ingrediente farmacêutico ativo (API) para uso em humanos e animais, ingrediente cosmético ativo (ACI), ou ingrediente funcional para alimento ou alimento para animal, que é distinguido pelos seguintes efeitos farmacológicos benéficos: (i) anti-inflamatório; veja as referências de literatura 1, 8, 9, 11, 12, 13, 17; (ii) antioxidante; veja as referências de literatura 8, 9, 14, 15, 20; (iii) imunomodulatório; veja as referências de literatura 1, 8, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20; (iv) hepatoprotetor; veja a referência de literatura 9; (v) antimicrobiano; incluindo, também, antibacteriano, antiviral, antifúngico e antiprotozoário; veja as referências de literatura 9, 10, 12, 15, 16, 18; (vi) antitumor; veja as referências de literatura 9, 10, 11, 14, 19; e (vii) anticâncer; veja as referências de literatura 11, 14.
[087] Outros efeitos valiosos do extrato de própolis líquido de acordo com a invenção, são efeitos fungicida, bactericida, virucida, inseticida e nematicida na proteção de plantas. Devido à forte atividade antioxidante, o extrato de própolis líquido de acordo com a invenção fortalece indiretamente as plantas e suas resistências contra fatores de tensão abiótica e ajuda as mesmas contra infecções.
Em virtude disto, o mesmo é usado como um agente de fortalecimento de plantas; veja as referências de literatura 21 a 25.
[088] O extrato de própolis líquido de acordo com a presente invenção é usado como: (i) um ingrediente farmacêutico ativo ou excipiente para a produção de produtos farmacêuticos selecionados a partir do grupo que consiste em: fármacos, dispositivos medicinais ou remédios; (ii) um ingrediente cosmético ativo ou excipiente para a produção de produtos cosméticos; (iii) um ingrediente alimentício para a produção de produtos alimentícios funcionais, suplementos alimentares, ou alimento para propósitos nutricionais especiais; (iv) um ingrediente farmacêutico ativo ou excipiente para a produção de produtos veterinários selecionados a partir do grupo que consiste em: produtos medicinais veterinários; alimento para animal; suplementos alimentares para animal; ou remédios para uso veterinário; ou (v) um ingrediente agroquímico ativo ou excipiente para a produção de produtos agroquímicos selecionados a partir do grupo que consiste em: fungicidas, bactericidas, virucidas, inseticidas, nematicidas e fortalecedores de plantas; o que é especialmente adequado para agricultura ecológica.
A COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COM BASE NO DITO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO PADRONIZADO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[089] Além do mais, a presente invenção revela a composição farmacêutica que é com base no dito extrato de própolis líquido padronizado como um ingrediente farmacêutico ativo (API). A composição farmacêutica de acordo com esta invenção consiste em: (I) o extrato de própolis líquido de acordo com a presente invenção; de 5 a 95% p/p; e,
(II) um ou mais excipientes farmacêuticos exigidos para a preparação da forma de dosagem final selecionados a partir do grupo que consiste em: uma solução, uma suspensão, um gel, um creme, uma pomada, uma pulverização para aplicação oral ou nasal; até 100% p/p da composição final; em que a dita composição é distinguida por conteúdos quantitativos de minimamente duas das quatro substâncias ativas chaves do própolis, nos seguintes valores: (i) ácido p-coumárico (1); de 10 a 1.300 µg/g; (ii) ácido trans-ferúlico (2); de 10 a 800 µg/g; (iii) ácido cafeico (3); de 5 a 300 µg/g; e, (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato (4; CAPE); de 5 a 400 µg/g.
[090] Desse modo, os excipientes farmacêuticos (substâncias auxiliares) são selecionados a partir do grupo que consiste em: diluentes, umectantes, conservantes, agentes quelantes, antioxidantes, espessantes, emolientes, emulsificantes, agentes de tonicidade e agentes de controle de pH.
[091] O diluente é um líquido farmaceuticamente aceitável, selecionado a partir do grupo que consiste em: água purificada; etanol; 1,2-propilenoglicol; polietileno glicóis líquidos (PEG), tais como PEG 200, PEG 400 ou PEG 600; ou misturas destas substâncias.
[092] O umectante é selecionado a partir do grupo que consiste em: glicerol, sorbitol, 1,2-propileno glicol, ou misturas destas substâncias.
[093] O conservante é selecionado a partir do grupo que consiste em: parabeno, como 4-hidroxibenzoato de metila, 4-hidroxibenzoato de etila, 4- hidroxibenzoato de propila, 4-hidroxibenzoato de butila; 4-cloro-m-cresol; triclosano; álcool benzílico; 2-fenoxietanol; ácido benzoico e seus sais, como benzoato de sódio; ácido sórbico ou seus sais, tal como sorbato de potássio; ácido deidroacético (3-acetil-2-hidroxi-6-metil-4H-pirano-4-ona); clorexidina e seus sais, como digliconato de clorexidina; sais de amônio quaternário, tais como cloreto de benzalcônio ou brometo de cetrimônio; ou misturas destas substâncias.
[094] O agente quelante é selecionado a partir do grupo que consiste em: sais de sódio ou de potássio de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriamino penta-acético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA); sais de citrato solúveis, como citrato trissódico di-hidratado (Na3C6H5O7•2H2O); ou misturas destas substâncias. Um típico agente quelante é edetato dissódico di-hidratado (Na2EDTA•2H2O).
[095] O antioxidante é selecionado a partir do grupo que consiste em: α- tocoferol e seus ésteres, tal como succinato de α-tocoferila; ácido ascórbico e seus sais, como ascorbato de sódio; 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (BHT); terc-butil-anisol (BHA); ou misturas destas substâncias.
[096] O espessante é selecionado a partir do grupo que consiste em: goma celulósica, como hidroxipropil metilcelulose (HPMC), hidroxipropil celulose (HPC), hidroxietil celulose (HEC), metil celulose (MC), carboximetil celulose de sódio (NaCMC); polímeros sintéticos, tais como álcool polivinílico (PVA), ácido poliacrílico (PAA) e seus copolímeros, polivinil pirrolidona (PVP); vários gomas, como goma arábica, goma xantana, goma adragante; ácido algínico e seus sais, como alginato de sódio; sais de metal dos ácidos graxos superiores, tais como monoestearato de alumínio, diestearato de alumínio, triestearato de alumínio; ou misturas destas substâncias.
[097] O emoliente é selecionado a partir do grupo que consiste em: vaselina; óleo mineral; óleos vegetais, como óleo de amêndoa, girassol ou azeite de oliva; triglicerídeos de cadeia média; ésteres naturais ou sintéticos de ácidos graxos superiores e álcoois monovalentes, tais como miristato isopropílico ou óleo de jojoba; ceras, como cera de abelhas; óleo de silicone; ácidos graxos superiores, como ácido oleico ou esteárico; álcoois graxos superiores, tais como álcool cetílico; ou misturas destas substâncias.
[098] O emulsificante é selecionado a partir do grupo que consiste em: lanolina; lanolina etoxilada; álcoois lanolínicos; álcoois lanolínicos etoxilados; lecitina; lecitina hidrolisada; mono e diésteres de glicerol e ácidos graxos superiores, tal como monoestearato de glicerol; ésteres de sorbitano de ácidos graxos superiores, como monoestearato de sorbitano; álcoois graxos superiores etoxilados, tais como polioxietileno(23) lauriléter ou oleato de polioxietileno(2), em que o número 23 ou 2 representa o número de unidades de etilenóxido; ésteres de ésteres de sorbitano etoxilados, como polissorbato 60; sabões solúveis em água, tal como estearato de sódio; sulfatos solúveis em água dos álcoois graxos superiores, como lauril sulfato de sódio; fosfatos solúveis em água de álcoois graxos, tais como cetil fosfato de potássio; ou misturas destas substâncias.
[099] O agente de tonicidade é empregado principalmente em formas de dosagem farmacêuticas que são aplicadas na mucosa, por exemplo, na mucosa nasal, e são selecionadas a partir do grupo que consiste em: cloreto de sódio (NaCl), glicerol, 1,2-propilenoglicol, ou misturas destas substâncias.
[0100] O agente de controle de pH inclui ácidos e bases farmaceuticamente aceitáveis para diminuir ou aumentar o valor do pH e sistemas de tampão. O mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido hidroclórico (HCl), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido fosfórico (H3PO4), ácido cítrico, ácido acético, hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de amônio (NH4OH), di- hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4), hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4), di- hidrogenocitrato de sódio (NaH2C6H5O7), hidrogenocitrato de sódio (Na2HC6H5O7), citrato de sódio (Na3C6H5O7), ou misturas destas substâncias.
PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[0101] A composição farmacêutica da presente invenção é preparada pelo processo que inclui as seguintes etapas: (i) adição de extrato de própolis líquido padronizado de acordo com esta invenção no diluente e sua homogeneização; (ii) adição de um ou mais outros excipientes; e sua homogeneização; em que as etapas (i) e (ii) são realizadas na temperatura de 10 a 100°C, preferivelmente na temperatura de 20 a 60°C, durante 1 a 5 minutos; seguidas por,
no caso da preparação da forma de dosagem de: (iii.a) solução ou solução para pulverização; filtração da solução final é realizada, incluindo filtração estéril se necessário; (iii.b) gel ou suspensão; adição de espessante e sua homogeneização são realizadas; (iii.c) creme; preparação de fase gordurosa é conduzida pela mistura do emoliente e do emulsificante e sua homogeneização na temperatura de 50 a 80°C, durante 1 a 15 minutos, e, então, adição da solução da etapa (ii) aquecida até 50 a 80°C é realizada, seguida pela emulsificação com o uso do homogeneizador de alto cisalhamento ou alta pressão, na temperatura de 50 a 80°C, preferivelmente de 55 a 65°C, durante 1 a 30 minutos, com subsequente homogeneização na temperatura de 65 a 20°C, durante 10 a 120 minutos; ou em (iii.d) pomada; a mistura da solução da etapa (ii) com mistura previamente derretida do emoliente e, eventualmente, emulsificante na temperatura de 50 a 70°C, durante 5 a 30 minutos, é realizada, seguida pela homogeneização na temperatura de 70 a 20°C, durante 10 a 120 minutos.
[0102] Os procedimentos para a preparação da composição farmacêutica da presente invenção também podem incluir vários procedimentos tecnológicos comuns alternativos para a produção das ditas formas de dosagem, como é conhecido pelos versados na técnica da tecnologia farmacêutica.
[0103] Os exemplos representativos da produção da composição farmacêutica de acordo com a invenção são descritos nos Exemplos 11 a 16.
[0104] Como um exemplo especial, aqui é exposta a forma de dosagem final esboçada de uma solução para aplicação intramamária, que é revelada no Exemplo
11. Neste caso, o extrato de própolis líquido primário padronizado, cuja preparação é descrita no Exemplo 9, é somente diluído com o solvente de extração de acordo com a invenção; neste caso, com a mistura de polietileno glicol 400 (97% p/p) e lecitina de soja (3% p/p), que está aqui na função do diluente. A solução assim obtida para a aplicação intramamária proporciona o conteúdo quantitativo das substâncias ativas chaves 1 a 4 nos supramencionados limites; veja a Tabela 16. Tabela 16. Resultados da análise quantitativa das substâncias ativas 1 a 10 por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) da composição farmacêutica da presente invenção; a forma de dosagem da solução para aplicação intramamária; produto proveniente do Exemplo 11, distinguido pela razão em peso de fármaco por extrato (DER) 1:2, diluído 10x com o propósito de análise HPLC.a Nº Substância ativa do própolis Concentração 1 a 10 [µg/g] 1 ácido para-coumárico (1) 40,97 2 ácido trans-ferúlico (2) 52,18 3 ácido cafeico (3) 17,73 4 CAPE (4) 52,25 5 ácido cinâmico (5) 6,99 6 crisina (6) 84,70 7 pinocembrina (7) 77,36 8 galangina (8) 43,37 9 apigenina (9) 15,24 10 kaempferol (10) 4,76 a Método analítico HPLC é descrito no Exemplo 3.
[0105] Típico cromatograma HPLC proveniente da análise quantitativa da presente composição é mostrado na figura 5.
ESTUDOS DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DA PRESENTE INVENÇÃO
[0106] Efeitos farmacológicos selecionados da composição da presente invenção, na dosagem da solução, produto proveniente do Exemplo 11, foram estudados em estudos clínicos na terapia de: (i) mastite, inflamação do úbere em vacas; (ii) mastite em cabras; e,
(iii) cicatrização de feridas em cavalos.
O ESTUDO DA TERAPIA DE MASTITE EM VACAS
[0107] O estudo do tratamento de mastite em vacas foi realizado em cinco fazendas com gado leiteiro da raça Holstein. O total de 86 vacas foi envolvido no estudo ou 339 quartos, em que o quarto do úbere foi usado como uma unidade estatística. Os animais foram mantidos livremente em leito espesso e alimentados com pré-mistura padrão para gado leiteiro sem adição de antibiótico. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para medicina veterinária. Animais e quartos saudáveis, sem sintomas clínicos de mastite com contagem de célula somática (SCC) abaixo de 200.000/mL foram incluídos, bem como quartos infectados com SCC mais alta do que 200.000/mL. Um estudo clínico cruzado randomizado de segurança e eficácia foi realizado com aplicação intramamária (i.mam.) da composição desta invenção, na forma de uma solução, sob condições de terreno. A composição da presente invenção proveniente do Exemplo 11 foi aplicada três vezes em todos os quatro quartos do úbere de vaca: durante ordenha matinal, ordenha vespertina e, no próximo dia, depois do ordenha matinal. O procedimento detalhado é descrito no Exemplo 17, ao mesmo tempo em que a Tabela 17 representa a cura bacteriológica para cada patógeno identificado em um certo número de quartos antes da primeira aplicação i.mam. Tabela 17. Efetividade do tratamento/cura bacteriológico de mastite em vacas depois da aplicação i.mam. da formulação da presente invenção proveniente do Exemplo
11.a Formulação proveniente do Exemplo 11 Nº Patógeno Número de Número de % quartos quartos curado tratados (N) bacterianamente curados 1 Streptococcus uberis 9 9 100 2 Espécies de 2 2 100
Streptococcus 3 CNS 1 1 100 4 Espécies de 2 2 100 Enterococcus 5 E. coli 3 3 100 6 Espécies de 4 4 100 Corynebacterium 7 Espécies de Pasteurella. 2 2 100 8 Espécies de Citrobacter. 1 1 100 9 Serratia 1 1 100 10 Bacillus 1 1 100 Total: 26 26 100 a O procedimento para realizar o estudo é descrito no Exemplo 17.
[0108] O regime de administração de três vezes (dois dias) da composição proveniente do Exemplo 11 proveu uma cura bacteriológica em 100% dos casos em apenas 7 dias.
[0109] Em comparação, o antibiótico tipo cefalosporina ceftiofur, alcança 66% de cura bacteriológica, mas apenas depois da aplicação i.mam. diária durante 8 dias, ao mesmo tempo em que, depois de 5 dias, o mesmo produz a cura em apenas 54% dos casos; veja a referência de literatura 30. Em mastite subclínica causada por S. uberis, uma terapia de dois dias com pirlimicina levou à cura em 58,1% dos casos, ao mesmo tempo em que as terapias para 5 e 8 dias proveu a cura em 68,8% e 80% dos casos; veja a referência de literatura 30: 30) S. P. Oliver, B. E. Gillespie, S. J. Headrick, H. Moorehead, P. Lunn, H. H. Dowlen, D. J. Johnson, K. C. Lamar, S. T. Chester, W. M. Moseley: Efficacy of extended Ceftiofur intramammary therapy for treatment of subclinical mastitis in lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 87 (2004) 2393-2400.
[0110] Alternativamente, em terapia de mastite em vacas, a composição da presente invenção na forma de dosagem de suspensão para aplicação intramamária, da forma descrita no Exemplo 12, também pode ser usada com sucesso.
O ESTUDO NA TERAPIA DE MASTITE EM CABRAS
[0111] O estudo de tratamento de mastite em cabras foi conduzido na fazenda de cabras Alpinas em OPG Matijasec, Sigetec Ludbreski, Croácia, em 25 cabras. Todas as cabras foram diagnosticadas com mastite subclínica em metades esquerda e direita do úbere. As cabras cujo leite testou positivo para um levantamento microbiológico, foram divididas em dois grupos: em um grupo, a composição da presente invenção proveniente do Exemplo 11 foi aplicada, ao mesmo tempo em que, no outro grupo, a suspensão intramamária de amoxicilina e ácido clavulânico (Klavuxil®; Genera, Croácia) foi aplicada; todas por regime de aplicação de três vezes. A tolerabilidade e a cura bacteriológica das metades foram monitoradas em paralelo depois da aplicação i.mam. da composição proveniente do Exemplo 11. Aplicação em três vezes (dois dias) da formulação da presente invenção proveu uma cura bacteriológica em 75% das metades infectadas, e 85% depois de 14 dias. Isto se provou mais efetivo do que administração antibiótica intramamária que habilitou a cura bacteriológica em 73,3% dos casos. Os resultados do estudo mostraram que o tratamento de mastite com a composição proveniente do Exemplo 11 em cabras pode prover uma cura bacteriológica em tempo, sem o uso de antibióticos.
[0112] O procedimento detalhado do estudo é descrito no Exemplo 18, ao mesmo tempo em que os resultados da cura bacteriológica são apresentados na Tabela 18. Tabela 18. Efetividade do tratamento/cura bacteriológico de mastite em cabras depois da aplicação i.mam. da formulação da presente invenção proveniente do Exemplo 11 em comparação com o antibiótico (uma combinação fixa de amoxicilina e ácido clavulânico).a Número de Número de Número de Nº Patógeno metades de metades de metades de %
úbere úbere úbere curado tratadas (N) curadas de curadas de bact. depois bact. depois de 7 dias de 14 dias Antibiótico (amoxicilina + ácido clavulânico) 1 Espécies de 8 2 4 50 Staphylococcus 2 S. aureus 1 1 1 100 3 Espécies de 3 3 3 100 Streptococcus 4 S. uberis 2 2 2 100 5 Arcanobacterium 2 2 2 100 pyogenes Total: 15 9 11 73,3 Formulação proveniente do Exemplo 11 1 Espécies de 8 6 7 87,5 Staphylococcus 2 S. aureus 7 4 6 85,7 3 Espécies de 2 2 2 100 Streptococcus 4 S. uberis 2 2 2 100 5 Arcanobacterium 1 1 1 100 pyogenes Total: 20 15 17 85 a O procedimento para realizar o estudo é descrito no Exemplo 18.
[0113] Comparando a atividade da aplicação i.mam. de amoxicilina, como um antibiótico de amplo espectro, que é adequado para o tratamento de mastite causada por patógenos verificados nas amostras de leite e da composição proveniente do Exemplo 11, uma atividade mais forte da última foi provada. Sete dias depois da aplicação da amoxicilina, apenas 60% das metades foram curadas, ao mesmo tempo em que o resultado para a composição proveniente do Exemplo 11 foi 75%. 14 dias depois da primeira aplicação, o percentual total de metades bacteriologicamente curadas na aplicação de antibiótico foi 73,3%, ao mesmo tempo em que para a composição testada foi 85%.
[0114] A partir dos ditos resultados, pode-se ver uma alta eficácia em atividade anti-inflamatória e antimicrobiana da composição proveniente desta invenção no tratamento da mastite. A eficácia é mais alta do que aquela da terapia clássica, como aquela com uma combinação fixa de amoxicilina e ácido clavulânico como um antibiótico de amplo espectro.
[0115] Alternativamente, na terapia de mastite em cabras, a composição da presente invenção na forma de dosagem de suspensão para aplicação intramamária, da forma descrita no Exemplo 12, também pode ser usada com sucesso.
[0116] Pode ser concluído que a composição proveniente desta invenção, além de suas outras propriedades, é distinguida por atividade antimicrobiana contra uma série de bactéria e fungos, em que a eficácia antimicrobiana é, em comparação com antibióticos clássicos, mais alta in vivo do que sob condições in vitro. A mesma não é apenas um agente antimicrobiano, mas também, um agente anti-inflamatório e imunomodulatório.
[0117] Os efeitos do própolis imunomodulatório são intimamente conectados com seus efeitos antioxidantes e tensão oxidativa é uma parte integral da patogênese da mastite; veja, por exemplo, referência de literatura 31: 31) O. Atakisi, H. Oral, E. Atakisi, O. Merhan, S. Metin Pancarci, A. Ozcan, S. Marasli, B. Polat, A. Colak, S. Kaya: Subclinical mastitis causes alterations in nitric oxide, total oxidant and antioxidant capacity in cow milk, Res. Vet. Sci. 89 (2010) 10-
13.
UMA REVISÃO DO CASO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM CAVALOS
[0118] O caso de cicatrização de feridas na perna frontal de uma égua é descrito. A mesma foi uma ferida profunda na área de ergotina da perna frontal, que surgiu quando a perna posterior agarrou na perna frontal durante repouso. Antes de iniciar a administração da composição proveniente do Exemplo 11, a ferida foi tratada conservadoramente, sem sucesso, com diferentes preparações.
[0119] Então, a ferida foi lavada com uma solução fisiológica, seca e tratada com a composição proveniente do proveniente do Exemplo 11 uma vez por dia durante 5 dias. A melhoria como epitelização pode ser vista depois de 48h e a cicatrização completa da ferida ocorreu depois de 96h. A égua coxeou intensivamente durante diversos dias, ao mesmo tempo em que, depois disto, nenhum sinal de manqueira foi observado. A recuperação foi completa. A descrição detalhada deste caso é descrita no Exemplo 19.
[0120] Apesar do fato de que, para conclusões mais precisas, um estudo clínico detalhado precisa ser realizado, fica claro para versados na técnica que a presente composição age efetivamente como um agente de cicatrização de feridas. Já que é conhecido a partir da literatura que atividades anti-inflamatórias, antioxidantes e epitelizantes são importantes para o processo de cicatrização de feridas, o estímulo da síntese de colágeno, como com a composição da presente invenção, juntamente com atividade antimicrobiana comprovada, é parte do espectro dos efeitos farmacológicos; por comparação, veja a referência de literatura 32: 32) S. Marinotti, E. Ranzato: Propolis: a new frontier for wound healing, Burns Trauma (2015) 3:9, doi 10.1186/s41038-015-0010-z.
O USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[0121] A composição farmacêutica proveniente desta invenção é usada para o tratamento de doenças e condições em humanos e animais, dos grupos de: doenças inflamatórias; infecções bacterianas; infecções fúngicas; doenças virais; doenças autoimunes; disfunções gastrointestinais funcionais; para regeneração da mucosa,
tratamento de queimadura e cicatrização de feridas; bem como doenças cancerosas.
[0122] Doenças e condições inflamatórias incluídas são: gengivite, periodontite, laringite, gastrite, colite, doença hemorroidal, dermatite, inflamação do ouvido externo, sinusite, rinite, vaginite e mastite.
[0123] A composição farmacêutica proveniente desta invenção é usada para o tratamento de infecções bacterianas causadas por bactérias dos grupos de: (i) bactéria Gram-positiva: espécies de Staphylococcus: Staphylococcus aureus, MRSA (Staphylococcus aureus resistente a meticilina), MSSA (Staphylococcus aureus sensível a meticilina), Staphylococcus intermedius, Staphylococcus pseudintermedius; staphylococci coagulase negativo: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus; espécies de Streptococcus: Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Streptococcus thermophilus; espécies de Peptostreptococcus; espécies de Corynebacterium: Corynebacterium bovis; Trueperella pyogenes; espécies de Nocardia; Bacillus subtilis; Bacillus cereus; enterococci: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis; enterococci resistente a vancomicina (VRE): Enterococcus casseliflavus; e, (ii) bactéria Gram-negativa: Escherichia coli; Acinetobacter baumanii; Pseudomonas aeruginosa; Haemophilus influenzae; Salmonella choleraesuis; Yersinia enterocolitica; espécies de Enterobacter (Enterobacter cloacae); espécies de Klebsiella: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca; Shigella flexneri; Burkholderia cepacia; Proteus mirabilis; Proteus vulgaris; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinomyces israelii; Bacteroides fragilis; Helicobacter pylori; Campylobacter coli; Campylobacter jejuni; Porphyromonas gulae; Porphyromonas salivosa; Porphyromonas denticanis; Prevotella intermedia; espécies de Treponema; Bacteroides splanchnicus.
[0124] Além do mais, a presente composição farmacêutica é usada para o tratamento de infecções fúngicas causadas por fungos, tais como: espécies de Candida: Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida kruzei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis; espécies de Aspergillus: Aspergillus niger, Aspergillus versicolor; Penicillium pinophilum; Paecilomyces variotii; Trichoderma virens; Chaetomium globosum; e Malassezia pachydermatis.
[0125] Também, a composição da invenção é usada para o tratamento de doenças virais causadas por vírus, tais como: Vírus do Herpes Simples (HSV); Papilomavírus Humano (HPV); Vírus Epstein-Barr (EBV); Citomegalovírus (CMV); poliovírus; vírus da influenza A e B; retrovírus; vírus vaccinia; vírus do resfriado comum: rinovírus, picornavírus, vírus da parainfluenza humana (HPIV), metapneumovírus humano (HMPV), coronavírus, adenovírus, vírus sincicial respiratório humano (HRSV), enterovírus.
[0126] Alternativamente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é usada para o tratamento de doenças autoimunes, tais como: psoríase, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal, doença celíaca e esclerose múltipla.
[0127] Adicionalmente, a composição farmacêutica proveniente desta invenção é usada para o tratamento de doenças cancerosas, tais como: câncer de pele e mucosa, tumores gastrointestinais, carcinoma colorretal.
[0128] A composição farmacêutica da presente invenção é usada para tratamento de disfunções gastrointestinais funcionais como segue: disfunções do esôfago, do estômago, do duodeno, do intestino delgado e do cólon, desconforto gastrointestinal centralmente mediado, disfunções da vesícula biliar e do esfíncter de Oddi, disfunções anorretais, disfunções gastrointestinais específicas de crianças e adolescentes.
[0129] Especificamente, a composição da presente invenção é usada para o tratamento de mastite em animais.
EXEMPLOS OBSERVAÇÕES GERAIS
[0130] Como o própolis primário, o própolis bruto do tipo choupo, proveniente de Hedera Ltd, foi usado. Etanol (96%) e polietileno glicol 200, 400 e 600, e lecitina de soja (SL) em pó foram adquiridos a partir de Fagron Croatia Ltd (HR). Lecitina da colza (RL) e lecitina da colza hidrolisada (HRL) foram adquiridas a partir de Pfannenschmidt (DE). Lecitina de girassol desoleada (SUL) foi adquirida a partir de Barentz (NL). Diestearato de alumínio foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (US). Todas as outras matérias-primas iniciais foram adquiridas a partir de fornecedores locais.
[0131] As amostras de compostos quimicamente puros para o propósito analítico: ácido p-coumárico (1; ≥ 98% HPLC), ácido trans-ferúlico (2; 99%), ácido cafeico (3; ≥ 98% HPLC), 2-fenetil 3,4-di-hidroxi-trans-cinamato (CAPE; 4; ≥ 97% HPLC), ácido trans-cinâmico (5; ≥ 96,5% GC), crisina (6; ≥ 98% HPLC), pinocembrina (7; ≥ 95% TLC), galangina (8; ≥ 95% HPLC), apigenina (9; ≥ 99% HPLC) e kaempferol (10; ≥ 90% HPLC), que serviram como padrões analíticos quantitativos para a determinação de seu conteúdo quantitativo no extrato de própolis líquido, foram adquiridas a partir da companhia Sigma-Aldrich (US).
[0132] O termo temperatura ambiente se refere ao intervalo de temperatura de 20 - 25°C. A abreviação “min” significa minuto. O rendimento (% a partir do rendimento teórico) é expressado como percentual em peso (% p/p) de extrato de própolis líquido isolado contra a massa de solvente de extração (etanol, PEG, etanol + lecitina, PEG + lecitina) inicial.
[0133] O conteúdo quantitativo das substâncias ativas 1 a 10 no extrato de própolis líquido é expressado como concentração em massa (γγ) em microgramas por mililitro [µg/mL], ao mesmo tempo em que sua composição quantitativa na composição farmacêutica proveniente desta invenção é expressada em microgramas por grama do produto final (forma de dosagem) [µg/g]. EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO PELO USO DE ETANOL 96% COMO O SOLVENTE DE EXTRAÇÃO
[0134] Pré-tratamento de própolis antes da extração: A amostra do própolis bruto
(tipo choupo; 1 kg) foi arrefecida em um refrigerador em -20°C por minimamente 1h. Então, a amostra foi moída no moinho.
[0135] Extração com etanol 96%: Etanol (96%; 70,00 g) foi adicionado no própolis moído (30,00 g). Permitiu-se que a mistura assim obtida ficasse em temperatura ambiente durante 72h com agitação periódica. Então, a mistura foi filtrada através do papel de filtro (fita preta), rendendo 60,00 g (85,7%) de extrato de própolis líquido na forma de solução de cor marrom escuro com odor de própolis ligeiramente intenso.
[0136] Com o propósito de testar a mínima concentração inibitória (MIC) do extrato de própolis alcoólico descrito no Exemplo 10, o mesmo procedimento foi repetido na razão de fármaco por extrato (DER) 1:2. EXEMPLO 2. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO PELO USO DE POLIETILENO GLICOL 400 COMO O SOLVENTE DE EXTRAÇÃO
[0137] O própolis moído cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1 (30,00 g) foi misturado com polietileno glicol 400 (PEG 400; 70,00 g). Permitiu-se que a mistura assim obtida ficasse em temperatura ambiente durante 72h com agitação periódica. Então, a mistura foi filtrada através do papel de filtro (fita preta). Isto rendeu em 55,00 g (78,6%) um extrato de própolis líquido na forma de um líquido viscoso marrom escuro, de odor ligeiramente intenso que se assemelha a própolis.
[0138] Com o propósito de testar a mínima concentração inibitória (MIC) do extrato de própolis de polietileno glicol descrito no Exemplo 10, o mesmo procedimento foi repetido na razão de fármaco por extrato (DER) 1:2. EXEMPLO 3. MÉTODO ANALÍTICO HPLC PARA DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DAS SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 10 NOS EXTRATOS DE
PRÓPOLIS LÍQUIDOS
[0139] As análises quantitativas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foram realizadas com o método desenvolvido especialmente com o propósito de monitorar as substâncias ativas chaves 1 a 4 e os ingredientes ativos associados 5 a 10 provenientes do própolis.
[0140] As amostras dos padrões comercialmente disponíveis das substâncias ativas 1 a 10 são preparadas para análise pela diluição com mistura de etanol : água, 75:25, V/V, até a concentração de 100 µg/mL.
[0141] As amostras dos extratos de própolis líquido (100 µL) de acordo com a presente invenção foram, antes da análise, diluídas com mistura de etanol : água, 75:25, V/V (900 µL), na razão 1:10 p/p (diluição de 10x).
[0142] As análises foram realizadas no instrumento Shimadzu LC201CHT, equipado com um autoamostrador, bomba, desgaseificador, forno de coluna, e detector UV-VIS, sob as seguintes condições: (i) coluna cromatográfica: Ascentis express; C18; dimensões: 15 cm x 3,0 mm; diâmetro de partículas na coluna: 2,7 µm; (ii) fase móvel: A = solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, B = metanol; gradiente: 0 min, 80% A, 20% B; 3 min, 70% A, 30% B; 60 min, 20% A, 80% B; 90 min, 20% A, 80% B; 100 min, 70% A, 30% B; 105 min, 80% A, 20% B; (iii) temperatura da coluna: 30°C; (iv) fluxo: 0,25 mL/min; (v) tempo de análise: 110 min; (vi) comprimento de onda no detector UV-VIS: para detecção: 370 nm, para integração: 290 nm; (vii) volume de injeção: 10 µL; (viii) pressão: 21.000 a 29.000 kPa (210 a 290 bars).
[0143] Sob as ditas condições, as substâncias ativas chaves 1 a 4 e os ingredientes associados 5 a 10 têm os seguintes tempos de retenção (tR): (i) tR [ácido p-coumárico (1)] = 14,13 min; tR [ácido trans-ferúlico (2)] = 15,31 min; tR [ácido cafeico (3)] = 10,57 min; tR [2-fenetil 3,4-di-hidroxi-trans- cinamato; CAPE (4)] = 48,62 min; (ii) tR [ácido trans-cinâmico (5)] = 29,76 min; tR [crisina (6)] = 44,68 min; tR [pinocembrina (7)] = 47,39 min; tR [galangina (8)] = 49,94 min; tR [apigenina (9)] = 37,72 min; tR [kaempferol (10)] = 36,87 min.
[0144] Os tempos de retenção das substâncias ativas chaves do própolis 1 a 4 e dos ingredientes ativos associados 5 a 10 são dados na Tabela 1. EXEMPLO 4. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS
LÍQUIDOS PADRONIZADOS PELO USO DO SOLVENTE DE EXTRAÇÃO COM BASE NA MISTURA DE ETANOL E LECITINA
[0145] O própolis moído, cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1, (30,00 g) foi misturado com o solvente de extração da seguinte composição (experimentos E1 a 8): E1: etanol 96% (67,00 g; 95,7%) e lecitina de soja (SL; 3,00 g; 4,3%); E2: etanol 96% (60,00 g; 85,7%) e lecitina de soja (SL; 10,00 g; 14,3%); E3: etanol 96% (50,00 g; 71,4%) e lecitina de soja (SL; 20,00 g; 28,6%); E4: etanol 96% (40,00 g; 57,1%) e lecitina de soja (SL; 30,00 g; 42,9%); E5: etanol 96% (67,00 g; 98,9%) e lecitina da colza (RL; 3,00 g 25% - preparação; 0,75 g de lecitina; 1,1%); rendimento teórico em E5 = 67 g de etanol + 0,75 g de lecitina = 67,75 g; E6: etanol 96% (60,00 g; 96,0%) e lecitina da colza (RL; 10,00 g 25% - preparação; 2,50 g de lecitina; 4,0%); rendimento teórico em E6 = 60 g de etanol + 2,50 g de lecitina = 62,50 g; E7: etanol 96% (67,00 g; 97,8%) e lecitina da colza hidrolisada (HRL; 3,00 g 50% - preparação; 1,50 g de lecitina de colza hidrolisada; 2,2%); rendimento teórico em E7 = 67 g de etanol + 1,50 g de lecitina = 68,50 g; E8: etanol 96% (60,00 g; 92,3%) e lecitina da colza hidrolisada (HRL; 10,00 g 50% - preparação; 5,00 g de lecitina; 7,7%); rendimento teórico em E8 = 60 g de etanol + 5,00 g de lecitina = 65,00 g.
[0146] A mistura assim obtida foi agitada em temperatura ambiente por 1h e permitiu-se que ficasse em temperatura ambiente por 72h com agitação periódica. Então, a mistura foi filtrada através do papel de filtro (fita preta). Isto rendeu em 50 a 60 g (71,0 a 85,7%) um extrato de própolis líquido na forma de um líquido viscoso marrom escuro, de odor ligeiramente intenso que se assemelha a própolis.
[0147] Extrato de própolis líquido primário assim preparado passou por análises quantitativas do conteúdo das substâncias ativas chaves 1 a 4 e, também, dos ingredientes associados 5 a 10, de acordo com o método analítico descrito no Exemplo 3. Os resultados são apresentados nas Tabelas 3 e 4.
[0148] Tais extratos de própolis líquidos primários preparados em solventes de extração (ES) descritos nos experimentos E1 a E8 com conhecidos conteúdos quantitativos das substâncias ativas 1 a 4 foram padronizados pela diluição com o mesmo ES que foi empregado na etapa de extração, até o nível desejado da composição quantitativa das substâncias ativas 1 a 4 de acordo com a presente invenção. EXEMPLO 5. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO
PADRONIZADO PELO USO DO SOLVENTE DE EXTRAÇÃO COM BASE NA MISTURA DE POLIETILENO GLICOL 400 E LECITINA
[0149] O própolis moído, cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1, (30,00 g) foi misturado com o solvente de extração da seguinte composição (experimentos E1 a E8): E1: polietilenoglicol 400 (PEG 400; 67,00 g; 97%) e lecitina de soja (SL; 3,00 g; 3%); E2: polietileno glicol 400 (PEG 400; 60,00 g; 90%) e lecitina de soja (SL; 10,00 g; 10%); E3: polietileno glicol 400 (PEG 400; 67,00 g; 98,9%) e lecitina da colza (RL; 3,00 g 25% - preparação; 0,75 g de lecitina; 1,1%); rendimento teórico em E3 = 67 g de PEG 400 + 0,75 g de lecitina = 67,75 g; E4: polietileno glicol 400 (PEG 400; 60,00 g; 96,0%) e lecitina da colza (RL; 10,00 g 25% - preparação; 2,50 g de lecitina; 4,0%); rendimento teórico em E4 = 60 g de PEG 400 + 2,50 g de lecitina = 62,50 g; E5: polietileno glicol 400 (PEG 400; 67,00 g; 97,8%) e lecitina da colza hidrolisada (HRL; 3,00 g 50% - preparação; 1,50 g de lecitina hidrolisada; 2,2%); rendimento teórico em E5 = 67 g de PEG 400 + 1,50 g de lecitina = 68,50 g;
E6: polietileno glicol 400 (PEG 400; 60,00 g; 92,3%) e lecitina da colza hidrolisada (HRL; 10,00 g 50% - preparação; 5,00 g de lecitina; 7,7%); rendimento teórico em E6 = 60 g de PEG 400 + 5,00 g de lecitina = 65,00 g.
[0150] A mistura assim obtida foi agitada em temperatura ambiente por 1h e permitiu-se que ficasse em temperatura ambiente por 72h com agitação periódica. Então, a mistura foi filtrada através do papel de filtro (fita preta). Isto rendeu em 45 a 55 g (69,0 a 78,6%) um extrato de própolis líquido na forma de um líquido viscoso marrom escuro de odor ligeiramente intenso que se assemelha a própolis.
[0151] O extrato de própolis líquido primário assim preparado passou por análises quantitativas do conteúdo das substâncias ativas chaves 1 a 4 e, também, dos ingredientes associados 5 a 10, de acordo com o método analítico descrito no Exemplo 3. Os resultados são apresentados nas Tabelas 5 e 6.
[0152] Tais extratos de própolis líquidos primários preparados nos solventes de extração (ES) descritos nos experimentos E1 a E6, com conhecidos conteúdos quantitativos das substâncias ativas 1 a 4, foram padronizados pela diluição com o mesmo ES que foi empregado na etapa de extração, até o nível desejado da composição quantitativa das substâncias ativas 1 a 4 de acordo com a presente invenção. EXEMPLO 6. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS
LÍQUIDOS PADRONIZADOS PELO USO DO SOLVENTE DE EXTRAÇÃO COM BASE NA MISTURA DE POLIETILENO GLICOL 200 E LECITINA DE SOJA
[0153] O própolis moído, cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1, (30,00 g) foi misturado com o solvente de extração, a mistura de polietileno glicol 200 (149,85 g; 99,9%) e lecitina de soja (SL; 0,15 g; 0,1%). A mistura assim obtida foi agitada em temperatura ambiente por 1h e permitiu-se que ficasse em temperatura ambiente por 48h com agitação periódica. Então, a mistura foi filtrada através do papel de filtro (fita preta). Isto rendeu em 137,00 g (91,3%) um extrato de própolis líquido na forma de um líquido viscoso marrom escuro, de odor ligeiramente intenso que se assemelha a própolis.
[0154] Então, uma análise HPLC quantitativa de acordo com o método descrito no Exemplo 3 foi realizada para obter o conteúdo quantitativo das substâncias ativas chaves 1 a 4. O filtrado foi diluído com o mesmo solvente de extração, mistura de polietileno glicol 200 e lecitina de soja (SL), 99,9 : 0,1 p/p, até o nível total do conteúdo das substâncias ativas 1 a 4, de acordo com a especificação do extrato líquido padronizado da presente invenção. EXEMPLO 7. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS LÍQUIDO
PADRONIZADO PELO USO DO SOLVENTE DE EXTRAÇÃO COM BASE NA MISTURA DE POLIETILENO GLICOL 600 E LECITINA DE GIRASSOL
DESOLEADA
[0155] O própolis moído, cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1, (30,00 g) foi misturado com o solvente de extração, a mistura de polietileno glicol 600 (PEG 600; 297,00 g; 99%) e lecitina de girassol desoleada (SUL; 3,00 g; 1,0%). A mistura assim obtida foi aquecida até 70°C e intensamente agitada por 3h. Então, a mistura foi resfriada até a temperatura ambiente e filtrada através do papel de filtro (fita preta). Isto rendeu em 261,00 g (87,0%) um extrato de própolis líquido na forma de um líquido viscoso marrom escuro, de odor ligeiramente intenso que se assemelha a própolis.
[0156] Então, uma análise HPLC quantitativa de acordo com o método descrito no Exemplo 3 foi realizada, a partir da qual o conteúdo quantitativo das substâncias ativas chaves 1 a 4 foi determinado. O filtrado foi diluído com o mesmo solvente de extração, mistura de polietileno glicol 600 e lecitina de girassol desoleada (SUL), 99 : 1 p/p, até o nível total do conteúdo das substâncias ativas 1 a 4, de acordo com a especificação do extrato líquido padronizado proveniente desta invenção. EXEMPLO 8. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS
LÍQUIDOS PADRONIZADOS PELO USO DO SOLVENTE DE EXTRAÇÃO COM BASE NA MISTURA DE POLIETILENO GLICOL 200, POLIETILENO GLICOL 600
E LECITINA DA COLZA HIDROLISADA
[0157] O própolis moído, cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1, (30,00 g)
foi misturado com o solvente de extração, a mistura de polietileno glicol 200 (PEG 200; 150,00 g; 50%), polietileno glicol 600 (139,50 g; 46,5%), e lecitina da colza hidrolisada (HRL; 10,50 g; 3,5%). A mistura assim obtida foi aquecida em 100°C com agitação intensa por 3h. Então, a mistura foi resfriada até a temperatura ambiente e filtrada através do papel de filtro (fita preta). Isto rendeu em 245,00 g (81,7%) um extrato de própolis líquido na forma de um líquido viscoso marrom escuro, de odor ligeiramente intenso que se assemelha a própolis.
[0158] Então, a análise HPLC quantitativa de acordo com o método descrito no Exemplo 3 foi realizada, a partir da qual o conteúdo quantitativo das substâncias ativas chaves 1 a 4 foi determinado. O filtrado foi diluído com o mesmo solvente de extração, mistura de polietileno glicol 200, polietileno glicol 600, e lecitina da colza hidrolisada (HRL), 50 : 46,5 : 3,5, p/p/p, até o nível total do conteúdo das substâncias ativas 1 a 4, de acordo com a especificação do extrato líquido padronizado proveniente desta invenção. EXEMPLO 9. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS
LÍQUIDOS PADRONIZADOS PELO USO DA MISTURA DE POLIETILENO GLICOL 400 E LECITINA DE SOJA
[0159] O própolis moído, cujo pré-tratamento é descrito no Exemplo 1, (30,00 g) foi misturado com o solvente de extração, a mistura de polietileno glicol 400 (PEG 400; 87,30 g; 97% m/m) e lecitina de soja (SL; 2,70 g; 3% p/p). Permitiu-se que a mistura assim obtida suportasse maceração com agitação periódica por 72h. Então, a mistura foi filtrada através do papel de filtro (800 poros/cm2). Isto proporcionou 50 a 55 g de um líquido viscoso marrom escuro, de odor intenso que se assemelha a própolis. O produto assim obtido foi diluído com o mesmo solvente de extração até a massa de 60,00 g. Desta maneira, o extrato resultante de razão de fármaco por extrato (DER) 1:2 foi obtido, ou, ditos 60 g de extrato a partir de 30 g de própolis inicial.
[0160] Tal extrato de própolis líquido preparado foi, com o propósito da preparação de composição farmacêutica, a partir desta invenção:
(I) sujeito a análise HPLC quantitativa de acordo com o método descrito no Exemplo 3 para determinação de substâncias ativas 1 a 4, e, subsequentemente, em relação à real concentração em massa de substâncias ativas 1 a 4 em um extrato preparado como este, (II) padronizado pela diluição com mistura de solvente pura (fresca): polietileno glicol 400 (97% p/p) e lecitina de soja (3% p/p); até a concentração em massa das substâncias ativas 1 a 4: (i) ácido p-coumárico (1); 10-1.300 µg/mL; (ii) ácido trans-ferúlico (2); 10-800 µg/mL; (iii) ácido cafeico (3); 5-300 µg/mL; e, (iv) 2-fenetil 3,4-di-hidroxi-trans-cinamato (4; CAPE); 5-400 µg/mL; dividido com o fator X/100, em que X = percentual em peso %, p/p, do dito extrato de própolis líquido padronizado na formulação da composição farmacêutica. EXEMPLO 10. DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA ANTIMICROBIANA
DOS EXTRATOS LÍQUIDOS PADRONIZADOS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO. DETERMINAÇÃO DA MÍNIMA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA (MIC) NOS MICRO-ORGANISMOS PATOGÊNICOS MODELOS
[0161] As mínimas concentrações inibitórias (MIC) dos extratos de própolis líquidos padronizados de acordo com esta invenção foram determinadas, com o uso do produto proveniente do Exemplo 9, em comparação com extratos de própolis líquidos análogos obtidos com etanol 96% (produto proveniente do Exemplo 1) ou PEG 400 (produto proveniente do Exemplo 2), de acordo com as direções dos métodos CLSI e EUCAST; veja as referências de literatura 26 a 29.
[0162] A eficácia antimicrobiana foi testada sob condições in vitro em cepas ATCC dos seguintes micro-organismos patogênicos modelos (M): Staphylococcus aureus ATCC 29293 (M1); Staphylococcus aureus resistente a meticilina; MRSA (coletânea MFBF; M2); Staphylococcus aureus sensível a meticilina; MSSA (coletânea MFBF; M3); Enterococcus faecalis ATCC 9212 (M4); Enterococcus faecalis VRE (coletânea MFBF) (M5); Escherichia coli ATCC 10536 (M6);
Acinetobacter baumanii ATCC 43498 (M7); Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (M8); e Candida albicans ATCC 90028 (M9).
[0163] O procedimento de microdiluição serial foi conduzido a fim de determinar as mínimas concentrações inibitórias (MIC) dos extratos. As suspensões de célula foram preparadas a partir da cultura parental em tampão PBS (pH 7,4), e as mesmas foram ajustadas em 0,5 unidades de McFarland por nefelometria. O teste foi realizado em diluição serial em placas de microtitulação de 96 poços na faixa de 100 a 0,7125 µg/mL, pela adição de 100 µL da solução de extrato de própolis dissolvida em caldo Mueller Hinton. Depois da inoculação de 100 µL de cada cultura bacteriana ajustada em 105 cfu/mL, placas foram incubadas por 24h em 37°C. MIC foi determinada pela adição de 10 µL da solução em 0,5 mg/mL de cloreto de 2,3,5- trifenil-2H-tetrazólio (TTC; indicador de redox) por poço individual, e, depois da incubação por 4h em 30°C, a absorbância foi determinada por espectrofotometria no comprimento de onda 490 nm.
[0164] Os valores de MIC foram determinados como a concentração do extrato de própolis na qual 80% de redução na bactéria ocorreu (MIC80).
[0165] Para espécies fúngicas, os valores de MIC foram determinados em meio RPMI com glicose adicional, pelo mesmo esquema tal como com bactéria. Depois da incubação (48h, 37°C, condições aeróbicas, em escuro), XTT (indicador de redox) foi adicionado em combinação com menadiona, e a absorbância foi determinada por espectrofotometria no comprimento de onda 540 nm.
[0166] Os valores de MIC foram determinados como a concentração do extrato de própolis na qual 80% redução na bactéria ou nos fungos ocorreu (MIC80).
[0167] O controle negativo continha apenas o meio e o solvente (sem micro- organismos e própolis adicionados), ao mesmo tempo em que o controle positivo foi exposto à influência de agentes antibióticos ou antifúngicos.
[0168] Pela determinação in vitro da atividade antimicrobiana da solução de própolis, as mínimas concentrações inibitórias (MIC80) foram medidas, e mostradas na Tabela 9 na forma de diluição (%) do extrato líquido em um dado solvente. O extrato de própolis líquido inicial foi obtido na razão em peso de fármaco por extrato (DER) 1:2; produto proveniente do Exemplo 9. Se a diluição do extrato líquido for maior, significando que a concentração das substâncias ativas 1 a 10 é inferior para MIC, o efeito antimicrobiano resultado do extrato testado é superior.
[0169] Os resultados são apresentados na Tabela 9.
[0170] Nas Tabelas 10 a 15, os valores calculados para concentração em massa (γ) em [µg/mL] para cada substância ativa 1 a 10 em particular são dados (provenientes de cada um de três extratos de própolis líquidos examinados) em que cada extrato em particular alcançou a MIC. Extratos foram obtidos com os seguintes solventes de extração (ES): etanol 96% (produto proveniente do Exemplo 1), polietileno glicol 400 (PEG 400; produto proveniente do Exemplo 2), e mistura de PEG 400 (97% p/p) e lecitina de soja (3% p/p) (produto proveniente do Exemplo 9). Os mesmos foram determinados a partir do extrato líquido primário em que a DER é 1:2; dividida pela diluição (fator) na qual a MIC correspondente foi alcançada. EXEMPLO 11. PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DA PRESENTE
INVENÇÃO NA FORMA DE DOSAGEM DA SOLUÇÃO PARA APLICAÇÃO INTRAMAMÁRIA COM MINIMAMENTE 150 ΜG/G DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 4 Formulação (para 100 g de solução): -------------------------------------------------------------------- (1) 50,00 g (50,00% p/p) de extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, produto proveniente do Exemplo 9, padronizado em minimamente 300 µg/mL de substâncias ativas 1 a 4 (2) 50,00 g (20,00% p/p) de polietileno glicol 400 --------------------------------------------------------------------
[0171] Preparação: Ingredientes (1) e (2) foram misturados e homogeneizados pela agitação em temperatura ambiente por 5 minutos. A solução foi filtrada através do papel de filtro e enchida no interior de injetores intramamários por 4 a 8 g.
[0172] Composição da solução: minimamente 150 µg/g de concentração total das substâncias ativas 1 a 4. Os resultados da análise HPLC quantitativa são apresentados na Tabela 16, ao mesmo tempo em que o correspondente típico cromatograma HPLC é dado na figura 5. EXEMPLO 12. PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA
PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE DOSAGEM DA SUSPENSÃO PARA APLICAÇÃO INTRAMAMÁRIA COM MINIMAMENTE 100 ΜG/G DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 4 Formulação (para 100 g de suspensão): -------------------------------------------------------------------- (1) 77,00 g (77,00% p/p) de extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, produto proveniente do Exemplo 9, padronizado em minimamente 150 µg/mL de substâncias ativas 1 a 4 (2) 20,00 g (20,00% p/p) de polietileno glicol 4.000 (3) 3,00 g (3,00% p/p) de diestearato de alumínio --------------------------------------------------------------------
[0173] Preparação: Polietileno glicol foi derretido (2) em 60°C, e diestearato de alumínio (3) foi adicionado e homogeneizado nesta temperatura por 15 minutos. Então, a mistura foi resfriada com agitação e o extrato de própolis (1) foi adicionado em 40 a 45°C. A mistura foi adicionalmente resfriada até a temperatura ambiente com agitação e adicionalmente homogeneizada em temperatura ambiente por 15 minutos. Uma suspensão viscosa amarela pálida foi obtida, que foi adicionalmente enchida no interior de injetores intramamários por 4 a 8 g.
[0174] Composição da suspensão: minimamente 100 µg/g de concentração total das substâncias ativas 1 a 4. EXEMPLO 13. PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA
PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE DOSAGEM DE GEL COM MINIMAMENTE 250 ΜG/G DAS SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 4 Formulação (para 100 g de gel): --------------------------------------------------------------------
(1) 30,00 g (30,00% p/p) de extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, produto proveniente do Exemplo 9, padronizado em minimamente 850 µg/mL das substâncias ativas 1 a 4 (2) 2,00 g (2,00% p/p) de Carbopol 940 (3) 1,00 g (1,00% p/p) de polissorbato 60 (4) 0,20 g (0,20% p/p) de sorbato de potássio (5) 0,30 g (0,30% p/p) de benzoato de sódio (6) 0,30 g (0,30% p/p) de ácido cítrico, anidro (7) hidróxido de sódio q.s. (solução 20%) (8) adicionar água purificada até 100% --------------------------------------------------------------------
[0175] Preparação: Em 30 g do extrato de própolis líquido de acordo com a presente invenção (2) foram adicionados e homogeneizados pela agitação em temperatura ambiente durante 20 minutos. Então, 50 g de água purificada (8) foram adicionados e homogeneizados pela agitação em temperatura ambiente por 5 minutos. Depois disto, os ingredientes (3 a 6) foram adicionados e dissolvidos pela agitação por 10 minutos. Então, o valor do pH foi ajustado em 5,5 a 6 com (7). No assim obtido gel, a quantidade restante de água purificada foi adicionada, até 100 g de massa total, e homogeneizada pela agitação em temperatura ambiente por 15 minutos, com desaeração final do produto.
[0176] Composição do gel: minimamente 250 µg/g de concentração total das substâncias ativas 1 a 4. EXEMPLO 14. PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA
PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE DOSAGEM DE CREME COM MINIMAMENTE 100 ΜG/G DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 4 Formulação (para100 g de creme): -------------------------------------------------------------------- (1) 20,00 g (20,00% p/p) do extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, produto proveniente do Exemplo 9, padronizado em minimamente 500 µg/mL de substâncias ativas 1 a 4 (2) 5,00 g (5,00% p/p) de polissorbato 60 (3) 5,00 g (5,00% p/p) de lanolina, anidra (4) 2,00 g (2,00% p/p) de cera de abelhas, branca (5) 8,00 g (8,00% p/p) de álcool cetílico (6) 8,00 g (8,00% p/p) de vaselina, branca (7) 10,00 g (10,00% p/p) de óleo mineral, espesso (8) 0,20 g (0,20% p/p) de 4-cloro-m-cresol (9) adicionar água purificada até 100% --------------------------------------------------------------------
[0177] Preparação: A fase oleosa foi preparada pelo derretimento da mistura de ingredientes (2 a 7) em 65 a 70°C durante 15 a 20 minutos até a formação de líquido oleoso quase incolor. A fase aquosa foi preparada pela dissolução de (8) e (1) em água purificada, com subsequente aquecimento até 65 a 70°C com agitação. Então, a fase aquosa foi lentamente adicionada na fase oleosa com mistura intensa, preferivelmente, com homogeneizador que habilita homogeneização em alto cisalhamento, de 1.000 a 3.000 revoluções por minuto (r.p.m.), durante 15 a 20 minutos. A emulsão assim obtida foi adicionalmente intensamente agitada com resfriamento gradual nas temperaturas de 65 a 20°C durante 30 minutos.
[0178] Composição do creme: minimamente 100 µg/g de concentração total das substâncias ativas 1 a 4. EXEMPLO 15. PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA
PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE DOSAGEM DA POMADA COM MINIMAMENTE 500 ΜG/G DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 4 Formulação (para 100 g de pomada): -------------------------------------------------------------------- (1) 50,00 g (50,00% p/p) de extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, produto proveniente do Exemplo 9, padronizado em minimamente 1.000 µg/mL de substâncias ativas 1 a 4
(2) 10,00 g (10,00% p/p) de polietileno glicol 400 (3) 40,00 g (40,00% p/p) de polietileno glicol 4.000 --------------------------------------------------------------------
[0179] Preparação: Ingredientes (1 a 3) foram cuidadosamente misturados e aquecidos até 60°C, homogeneizados pela agitação por 5 minutos e gradualmente resfriados até temperatura ambiente com mistura.
[0180] Composição da pomada: minimamente 500 µg/g de concentração total das substâncias ativas 1 a 4. EXEMPLO 16. PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA
PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE DOSAGEM DE PULVERIZAÇÃO NASAL COM MINIMAMENTE 50 ΜG/G DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS 1 A 4 Formulação (para 100 g da solução para pulverização): -------------------------------------------------------------------- (1) 5,00 g (5,00% p/p) de extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, produto proveniente do Exemplo 9, padronizado em minimamente 1.000 µg/mL de substâncias ativas 1 a 4 (2) 0,60 g (0,60% p/p) de sódio cloreto (3) 0,10 g (0,10% p/p) de polissorbato 60 (4) 0,10 g (0,10% p/p) de sorbato de potássio (5) 0,10 g (0,10% p/p) de benzoato de sódio (6) 0,20 g (0,20% p/p) de ácido cítrico, anidro (7) 0,01 g (0,01% p/p) de edetato de sódio (Na2EDTA•2H2O) (8) adicionar água purificada até 100% --------------------------------------------------------------------
[0181] Preparação: Em 90 g de água purificada (1), os ingredientes (2 a 7) foram adicionados e dissolvidos pela agitação em temperatura ambiente durante 15 minutos. Então, (1) foi adicionado e a mistura foi homogeneizada em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disto, a solução foi filtrada através de um filtro estéril de 0,2 µm e enchida no interior de garrafas estéreis adequadas equipadas com tampa e bombas de pulverização para aplicação nasal.
[0182] Composição da solução: minimamente 50 µg/g de concentração total das substâncias ativas 1 a 4. EXEMPLO 17. O ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DA
COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE SOLUÇÃO INTRAMAMÁRIA PROVENIENTE DO EXEMPLO 11 EM
TRATAMENTO DE MASTITE DE VACAS LEITEIRAS
[0183] O estudo do tratamento de mastite em vacas foi realizado em cinco fazendas de gado leiteiro da raça Holstein. O total de 86 vacas foram envolvidas no estudo ou 339 quartos, em que o quarto do úbere foi usado como uma unidade estatística. Os animais foram mantidos livremente em leito espesso e alimentados com uma pré-mistura padrão para gado leiteiro sem adição de antibiótico. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para medicina veterinária. Animais e quartos saudáveis, sem sintomas clínicos de mastite com contagem de célula somática (SCC) abaixo de 200.000/mL foram incluídos, bem como quartos infectados com SCC mais alta do que 200.000/mL. O estudo clínico cruzado randomizado de segurança e eficácia foi realizado com aplicação intramamária (i.mam.) da composição proveniente desta invenção na forma de uma solução, sob condições de terreno. A composição da presente invenção proveniente do Exemplo 11 foi aplicada três vezes em todos os quatro quartos do úbere de vaca: durante ordenha matinal, ordenha vespertina e, no dia seguinte, depois do ordenha matinal. Primeiro, a tolerabilidade da composição na aplicação intramamária foi testada. As mudanças no comportamento das vacas foram monitoradas, bem como a aparência macroscópica do úbere (edema e vermelhidão), leite e sensibilidade do úbere ao toque. A mudança da contagem de célula somática (SCC) no leite foi monitorada a partir do período antes da primeira aplicação i.mam. da composição, até o dia 7 a partir da primeira aplicação. As amostras de leite, e, também, dos quartos, foram agrupadas dependendo de se a SCC foi elevada ou abaixo de 200.000/mL, e se as amostras foram positivas ou negativas contra um levantamento bacteriológico; veja a referência de literatura 33: 33) European Medicines Agency (1992): Local Tolerance of Intramammary Preparations in Cows. Directive 81/852/EEC.
[0184] Então, os testes de eficácia da cura bacteriológica foram realizados com a composição de própolis de acordo com as direções de Agência de Medicina Europeia (EMA), que é a única medida de eficácia para formulações i.mam. no tratamento de mastite subclínica. A mesma é definida como uma ausência de patógeno previamente confirmado em uma amostra de leite coletada em certos períodos de tempo depois da aplicação i.mam. de uma dada formulação; veja a referência de literatura 34: 34) European Medicines Agency (2017): Guideline on the conduct of efficacy studies for intramammary products for use in cattle. CVMP. EMA/CVMP/344/1999-Rev.2.
[0185] A amostragem de leite foi realizada por metodologia padrão. O levantamento microbiológico foi realizado de acordo com as direções padrões; veja a referência de literatura 35: 35) J. W. Hogan: Laboratory handbook on bovine mastitis. National Mastitis Council (1999) Madison, Wisconsin, SAD.
[0186] Os resultados da cura bacteriológica da mastite em vacas são apresentados na Tabela 17. EXEMPLO 18. O ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DA
COMPOSIÇÃO PROVENIENTE DA PRESENTE INVENÇÃO NA FORMA DE SOLUÇÃO INTRAMAMÁRIA PROVENIENTE DO EXEMPLO 11 NO
TRATAMENTO DE MASTITE DE CABRAS
[0187] O estudo do tratamento de mastite em cabras foi conduzido em 25 cabras com mastite subclínica diagnosticada nas metades esquerda e direita do úbere. As cabras cujo leite foi positivo para um levantamento microbiológico foram divididas em dois grupos: em um grupo, a composição da presente invenção proveniente do Exemplo 11 foi aplicada, ao mesmo tempo em que, no outro grupo, a suspensão intramamária de amoxicilina e ácido clavulânico (Klavuxil®; Genera, Croácia) foi aplicada; todas pelo regime de aplicação de três vezes.
[0188] A tolerabilidade e a cura bacteriológica das metades foram monitoradas em paralelo depois da aplicação i.mam. da composição proveniente do Exemplo 11. As preparações foram aplicadas pelo regime de três vezes (dois dias) com o dito antibiótico ou a composição proveniente do Exemplo 11.
[0189] Durante o estudo, as cabras foram mantidas em um estábulo em leito espesso. Havia 170 cabras em lactação com produção média de 500 a 600 kg de leite por cabra durante uma lactação que dura cerca de 300 dias. As mesmas foram alimentadas com feno, como desejado, minimamente com 2 kg por cabra, e com a pré-mistura contendo 16% de proteínas, cerca de 1 kg por cabra; divididos em duas partes durante ordenha matinal e vespertina. 2% de pré-mistura vitamina-mineral Ovisan® (Sano Company, Croácia) foi adicionado na pré-mistura. As cabras cujo leite foi positivo no exame bacteriológico foram divididas em dois grupos: em um grupo (número de metades tratadas, N = 20), a composição proveniente do Exemplo 11 foi aplicada; ao mesmo tempo em que, no outro grupo (N = 15), a suspensão intramamária de amoxicilina com ácido clavulânico (Klavuxil®; Genera Company, Croácia) foi aplicada; todas pelo regime de aplicação de três vezes.
[0190] Durante o teste de tolerabilidade da composição proveniente do Exemplo 11, nem mudanças comportamentais em nenhuma cabra, nem na aparência macroscópica do úbere (edema e vermelhidão) e do leite, nem na sensibilidade do úbere ao toque foram observadas. As amostras de leite provenientes das metades esquerda e direita do úbere foram amostradas em tubos plásticos estéreis previamente marcados depois da ordenha dos primeiros poucos jatos. As amostras foram tomadas antes da primeira aplicação da formulação proveniente do Exemplo 11, 12h depois da primeira aplicação, 24h depois da primeira aplicação, e no dia 7 depois da primeira aplicação da composição. As amostras de leite foram mantidas em 4°C até o próximo dia e analisadas no laboratório por mastite e qualidade do leite bruto no Instituto Croata de Veterinária.
[0191] O teste da eficácia da cura bacteriológica foi realizado de acordo com as direções provenientes da Agência de Medicina Europeia (EMA); veja a referência de literatura 34. A amostragem de leite foi conduzida pela metodologia padrão, ao mesmo tempo em que o exame microbiológico foi realizado de acordo com procedimentos padrões; veja a referência de literatura 35.
[0192] Os resultados de cura bacteriológica da mastite em cabras são apresentados na Tabela 18. EXEMPLO 19. UMA REVISÃO DA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS BEM-
SUCEDIDA NA PERNA DA ÉGUA COM A ADMINISTRAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO PROVENIENTE DO EXEMPLO 11 NA FORMA DA
SOLUÇÃO
[0193] O caso de cicatrização de feridas na perna frontal da égua é descrito. A mesma foi uma ferida profunda na área de ergotina da perna frontal que surgiu quando a perna posterior da égua agarrou na perna frontal durante fundo do poço. Antes do início da administração da composição proveniente do Exemplo 11, a ferida foi tratada conservadoramente com diferentes preparações sem sucesso.
[0194] A ferida foi formada durante o galope da égua, quando a mesma “passou dos seus limites“ com as pernas posteriores. Então, a parte craniana do casco e da ferradura da perna posterior lesionaram a área da articulação do pé frontal. Isto causou uma ferida de forma elíptica com dimensões de 2x4 cm. A égua exibiu sinais de manqueira imediatamente depois da lesão, classificada como 4/5 (Associação Americana de Praticantes Equestres). Imediatamente depois da lesão, a ferida foi raspada e lavada com água fria comum e, depois disto, tratada com iodo (iodopovidona, 0,01%) e pulverizada com pulverização de nitrato de prata. A ferida foi fechada para evitar contaminação infecciosa. Uma vez que a égua já estava vacinada contra tétano, o soro TAT não foi aplicado. Foi permitido que a égua descansasse por duas semanas e a ferida foi tratada em uma base diária por limpeza mecânica e mantida limpa e seca. A ferida foi tratada com iodo e pulverização de nitrato de prata a cada 48h. Depois de 5 dias, a ferida começou a cicatrizar e foi ficando melhor. Então, a ferida começou a ser tratada com pomada de vitamina de zinco. Depois de duas semanas, a égua foi reintroduzida ao trabalho. Entretanto, a ferida começou a sangrar assim que a égua começou o galope. A ferida foi novamente desinfetada com iodo e um antibiótico tópico com base em cefalosporina na formulação para aplicação intramamária foi aplicado (Cobactan®). Juntamente com a limpeza mecânica da ferida, a ferida foi localmente tratada com um antibiótico por 5 dias adicionais. Então, trabalho adicional com a égua foi tentado, mas a ferida começou a sangrar novamente.
[0195] Depois disto, a ferida foi lavada com solução fisiológica, seca, e tratada com a composição proveniente do Exemplo 11, uma vez por dia, durante 5 dias. A melhoria visível através da epitelização pode ser observada depois de 48h, ao mesmo tempo em que a cura completa ocorreu depois de 96h. A égua ficou coxeando apenas durante os primeiros poucos dias, mas, posteriormente, nenhum sinal de manqueira foi observado. A recuperação foi completa.
CONCLUSÃO
[0196] Os resultados experimentais mostraram que a mistura específica de polietileno glicóis líquidos (PEG) como PEG 400 em combinação com lecitinas em quantidade de 0,1 a 3,5% em massa do solvente de extração (ES), de uma maneira inesperada, extrai efetivamente e quimiosseletivamente as substâncias ativas do própolis ácido p-coumárico (1), ácido trans-ferúlico (2), ácido cafeico (3) e 2-fenetil 3,4-di-hidroxi-trans-cinamato (4), em comparação com solventes puros, como etanol 96%, PEG 400 ou misturas de EtOH e as mesmas lecitinas.
[0197] A exata composição quantitativa das substâncias ativas chaves 1 a 4 e ingredientes associados 5 a 10 no extrato de própolis líquido primário é determinada pelo uso de um método HPLC analítico adequado desenvolvido nesta invenção. Então, um extrato primário como este é padronizado com o mesmo solvente de extração (ES) que foi empregado na etapa de extração. Isto resulta em um extrato de própolis líquido de acordo com esta invenção, com concentrações conhecidas e padronizadas das substâncias ativas chaves 1 a 4. O extrato de própolis padronizado assim preparado é usado como um ingrediente farmacêutico ativo (API), ingrediente cosmético ativo (ACI), ou ingrediente alimentício para manufatura de produtos alimentícios funcionais e suplementos alimentares.
[0198] A composição proveniente da presente invenção com base no dito extrato de própolis líquido, que contém as substâncias ativas chaves ácido p-coumárico (1; 10-1.300 µg/g), ácido trans-ferúlico (2; 10-800 µg/g), ácido cafeico (3; 5-300 µg/g), e 2-fenetil 3,4-di-hidroxi-trans-cinamato (4; 5-400 µg/g), é um agente efetivo na terapia de doenças inflamatórias, infecções bacterianas, infecções fúngicas, doenças virais, doenças autoimunes, disfunções gastrointestinais funcionais, para regeneração da mucosa, tratamento de queimaduras e cicatrização de feridas, e para o tratamento de doenças cancerosas.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[0199] Devido ao amplo uso prático do extrato de própolis líquido e da composição farmacêutica em sua base, a aplicabilidade industrial da presente invenção é óbvia.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES
1. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício, caracterizado por consistir em: (A) extrato de própolis seco; 0,1-10,0% p/p; e (B) solvente de extração; 90,0-99,9% p/p; em que o solvente de extração consiste em: (B.1) um ou mais polietileno glicóis líquidos <PEG> 200-600; 96,5-99,9% p/p; e (B.2) lecitina ou lecitina hidrolisada; 0,1-3,5% p/p; em que o dito extrato de própolis líquido é padronizado por: (I) uma razão em peso quantitativa de própolis bruto como um fármaco e extrato final <DER> na razão: 1 : 2 - 1 : 20 p/p; e (II) conteúdo quantitativo de substâncias ativas do própolis selecionadas a partir do grupo que consiste em ácido p-coumárico <1>, ácido trans-ferúlico <2>, ácido cafeico <3> e 2-feniletil 3,4-di-hidroxicinamato <4>: COOH H3CO COOH HO COOH
HO HO HO 1 2 3
O
HO
O
HO 4 em que a composição quantitativa de minimamente duas de quatro das ditas substâncias ativas chaves é como segue: (i) ácido p-coumárico <1>; 100-1.300 µg/mL; (ii) ácido trans-ferúlico <2>; 75-800 µg/mL; (iii) ácido cafeico <3>; 25-300 µg/mL; e
(iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato <4; CAPE>; 40-400 µg/mL.
2. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polietileno glicol líquido <PEG> ser selecionado a partir do grupo que consiste em: polietileno glicol 200, polietileno glicol 300, polietileno glicol 400, polietileno glicol 600, ou misturas destas substâncias.
3. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polietileno glicol líquido <PEG> ser selecionado a partir do grupo que consiste em: polietileno glicol 200, polietileno glicol 400, ou misturas destas substâncias.
4. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por lecitina ou lecitina hidrolisada ser distinguida pelo fator de equilíbrio hidrofílico-lipofílico <HLB> a partir de 2 a 12, e selecionada a partir do grupo que consiste em: lecitina de soja <Glycine max L>; lecitina de girassol <Helianthus annuus L>; lecitina da colza <Brassica napus L>; lecitina de canola <Brassica rapa L>; lecitina proveniente dos ovos de galinha <Gallus gallus domesticus L>; produtos desoleados das ditas lecitinas; lecitinas hidrogenadas provenientes das ditas origens; lecitinas hidrolisadas provenientes das ditas origens; derivados modificados por enzima das ditas lecitinas; ou misturas destas substâncias.
5. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a lecitina ser selecionada a partir do grupo que consiste em: lecitina nativa, desoleada, hidrogenada, hidrolisada ou lecitina modificada por enzima provenientes da soja <Glycine max L>, do girassol <Helianthus annuus L>, da colza <Brassica napus L> ou da canola <Brassica rapa L>; ou misturas destas substâncias.
6. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o solvente de extração consistir em: (i) polietileno glicol <PEG> 200, polietileno glicol 300, polietileno glicol 400 ou suas misturas; 97-99% p/p; e (ii) lecitina nativa, lecitina desoleada ou lecitina hidrolisada provenientes da soja <Glycine max L>, do girassol <Helianthus annuus L>, da colza <Brassica napus L> ou da canola <Brassica rapa L>; ou misturas destas substâncias; 1-3% p/p.
7. Extrato de própolis líquido como um ingrediente farmacêutico, cosmético ou agroquímico ou ingrediente alimentício de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o dito extrato de própolis líquido ser padronizado em: (I) uma razão em peso quantitativa de própolis bruto como o fármaco contra o extrato final <DER> em razão: 1 : 3 - 1 : 5 p/p; e (II) composição quantitativa de substâncias ativas do própolis selecionadas a partir do grupo que consiste em ácido p-coumárico <1>, ácido trans- ferúlico <2>, ácido cafeico <3> e 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-cinamato <4>, em que minimamente duas de quatro das ditas substâncias ativas chaves correspondem ao seguinte conteúdo quantitativo: (i) ácido p-coumárico <1>; 500-1.300 µg/mL; (ii) ácido trans-ferúlico <2>; 300-800 µg/mL; (iii) ácido cafeico <3>; 100-300 µg/mL; e (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-cinamato <4; CAPE>; 100-400 µg/mL.
8. Processo para a produção do extrato de própolis líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o mesmo incluir as seguintes etapas: (i) resfriamento do própolis bruto em -20°C por minimamente 1h;
(ii) moagem do própolis arrefecido com peneiramento através de poros de 1 a 8 mm; (iii) extração do própolis bruto com o solvente de extração sob as seguintes condições: (a) razão em peso de própolis bruto e solvente de extração = 1:2 a 1:20 p/p; (b) temperatura de extração de 10 a 150°C; e (c) tempo de extração de 5 minutos a 72h; (iv) filtração da mistura assim obtida através de uma série de filtros com poros de 100 µm a 5 µm, com geração do resíduo não dissolvido e do extrato de própolis líquido; (v) análise quantitativa de substâncias ativas chaves do própolis 1 a 4 por meio de cromatografia líquida de alto desempenho <HPLC>; e (vi) padronização do extrato de própolis líquido assim obtido com composição quantitativa exata determinada das substâncias ativas chaves 1 a 4 na etapa (v), através da diluição com um solvente de extração fresco que foi usado na etapa (iii), até o conteúdo desejado das substâncias ativas 1 a 4.
9. Processo para a produção do extrato de própolis líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a etapa de extração (iii) ser realizada sob as seguintes condições: (a) razão em peso de própolis bruto e solvente de extração = 1:3-1:5 p/p; (b) temperatura de extração de 15 a 70°C; e (c) tempo de extração de 1 a 24h.
10. Processo para a produção do extrato de própolis líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 e 9, caracterizado por o método cromatográfico líquido de alto desempenho <HPLC> ser usado para determinação quantitativa das substâncias ativas chaves 1 a 4 como segue: (i) coluna cromatográfica: Ascentis express; C18; dimensões: 15 cm x 3,0 mm; diâmetro de partículas na coluna: 2,7 µm;
(ii) fase móvel: A = solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, B = metanol; gradiente: 0 min, 80% A, 20% B; 3 min, 70% A, 30% B; 60 min, 20% A, 80% B; 90 min, 20% A, 80% B; 100 min, 70% A, 30% B; 105 min, 80% A, 20% B; (iii) temperatura da coluna: 30°C; (iv) fluxo: 0,25 mL/min; (v) tempo de análise: 110 min; (vi) comprimento de onda no detector UV-VIS: para detecção: 370 nm, para integração: 290 nm; (vii) volume de injeção: 10 µL; (viii) pressão: 21.000 a 29.000 kPa (210 a 290 bars).
11. Uso do extrato de própolis líquido padronizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o mesmo ser empregado como o ingrediente farmacêutico ativo ou o excipiente para a produção de produtos farmacêuticos selecionados a partir do grupo que consiste em: fármacos, dispositivos medicinais ou remédios.
12. Uso do extrato de própolis líquido padronizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o mesmo ser empregado como o ingrediente cosmético ativo ou o excipiente para a produção de produtos cosméticos.
13. Uso do extrato de própolis líquido padronizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o mesmo ser empregado como o ingrediente alimentício para a produção de produtos alimentícios funcionais, suplementos alimentares, e alimento para propósitos nutricionais especiais.
14. Uso do extrato de própolis líquido padronizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o mesmo ser empregado como o ingrediente farmacêutico ativo ou o excipiente para a produção de produtos veterinários selecionados a partir do grupo que consiste em: produtos medicinais veterinários; alimento para animal; suplementos alimentares para animal; ou remédios para uso veterinário.
15. Uso do extrato de própolis líquido padronizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o mesmo ser empregado como o ingrediente agroquímico ativo ou o excipiente para a produção de produtos agroquímicos selecionados a partir do grupo que consiste em: fungicidas, bactericidas, virucidas, inseticidas, nematicidas e fortalecedores de plantas.
16. Composição farmacêutica, caracterizada por a mesma consistir em: (I) extrato de própolis líquido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; de 5 a 95% p/p; e, (II) um ou mais excipientes farmacêuticos exigidos para preparação da forma de dosagem final selecionados a partir do grupo que consiste em: solução, suspensão, gel, creme, pomada, pulverização para aplicação oral ou nasal; até 100% p/p da composição final; em que a dita composição é distinguida por um conteúdo quantitativo de minimamente duas de quatro das substâncias ativas chaves do própolis nos seguintes valores: (i) ácido p-coumárico <1>; 10-1.300 µg/g; (ii) ácido trans-ferúlico <2>; 10-800 µg/g; (iii) ácido cafeico <3>; 5-300 µg/g; e, (iv) 2-feniletil 3,4-di-hidróxi-trans-cinamato <4; CAPE>; 5-400 µg/g.
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o excipiente farmacêutico ser selecionado a partir do grupo que compreende: diluentes, umectantes, conservantes, agentes quelantes, antioxidantes, espessantes, emolientes, emulsificantes, agentes de tonicidade, e agentes de controle de pH.
18. Processo para a produção de composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 e 17, caracterizado por o mesmo incluir as seguintes etapas: (i) adição de extrato de própolis líquido padronizado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 no diluente e sua homogeneização;
(ii) adição de um ou mais outros excipientes; e sua homogeneização; em que as etapas (i) e (ii) são realizadas na temperatura de 10 a 100°C, preferivelmente na temperatura de 20 a 60°C, durante 1 a 5 minutos; seguidas por, no caso da preparação da forma de dosagem de: (iii.a) solução ou solução para pulverização; filtração da solução final é realizada, incluindo filtração estéril se necessário; (iii.b) gel ou suspensão; adição de espessante e sua homogeneização são realizadas; (iii.c) creme; preparação de fase gordurosa é conduzida pela mistura do emoliente e do emulsificante e sua homogeneização na temperatura de 50 a 80°C, durante 1 a 15 minutos e, então, adição da solução proveniente da etapa (ii), aquecido até 50 a 80°C, é realizada, seguida pela emulsificação com o uso de homogeneizador de alto cisalhamento ou alta pressão, na temperatura de 50 a 80°C, preferivelmente de 55 a 65°C, durante 1 a 30 minutos, com subsequente homogeneização na temperatura de 65 a 20°C, durante 10 a 120 minutos; ou em (iii.d) pomada; a mistura da solução da etapa (ii) com mistura previamente derretida de emoliente e, eventualmente, emulsificante na temperatura de 50-70°C, durante 5 a 30 minutos, é realizada, seguida pela homogeneização na temperatura de 70 a 20°C, durante 10 a 120 minutos.
19. Uso da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 e 17, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de doenças e condições humanas e animais dos grupos de: doenças inflamatórias; infecções bacterianas; infecções fúngicas; doenças virais; doenças autoimunes; disfunções gastrointestinais funcionais; para regeneração da mucosa, tratamento de queimadura, e cicatrização de feridas; e doenças cancerosas.
20. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de doenças inflamatórias dos grupos de: gengivite, periodontite, laringite, gastrite, colite, doença hemorroidal, dermatite, inflamação do ouvido externo, sinusite, rinite, vaginite e mastite.
21. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de infecções bacterianas causadas por bactérias dos grupos de: (i) bactérias Gram-positivas: espécies de Staphylococcus: Staphylococcus aureus, MRSA <Staphylococcus aureus resistente a meticilina>, MSSA <Staphylococcus aureus sensível a meticilina>, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus pseudintermedius; staphylococci coagulase negativo: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus; espécies de Streptococcus: Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Streptococcus thermophilus; espécies de Peptostreptococcus; espécies de Corynebacterium: Corynebacterium bovis; Trueperella pyogenes; espécies de Nocardia; Bacillus subtilis; Bacillus cereus; enterococci: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis; enterococci resistente a vancomicina <VRE>: Enterococcus casseliflavus; e, (ii) bactérias Gram-negativas: Escherichia coli; Acinetobacter baumanii; Pseudomonas aeruginosa; Haemophilus influenzae; Salmonella choleraesuis; Yersinia enterocolitica; espécies de Enterobacter <Enterobacter cloacae>; espécies de Klebsiella: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca; Shigella flexneri; Burkholderia cepacia; Proteus mirabilis; Proteus vulgaris; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinomyces israelii; Bacteroides fragilis; Helicobacter pylori; Campylobacter coli; Campylobacter jejuni; Porphyromonas gulae; Porphyromonas salivosa; Porphyromonas denticanis; Prevotella intermedia; espécies de Treponema; Bacteroides splanchnicus.
22. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de infecções fúngicas causadas por fungos dos grupos de: espécies de Candida: Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida kruzei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis; espécies de Aspergillus: Aspergillus niger, Aspergillus versicolor; Penicillium pinophilum; Paecilomyces variotii; Trichoderma virens; Chaetomium globosum; Malassezia pachydermatis.
23. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de doenças virais causadas por vírus dos grupos de: Vírus do Herpes Simples <HSV>; Papilomavírus Humano <HPV>; Vírus Epstein-Barr <EBV>; Citomegalovírus <CMV>; poliovírus; vírus da influenza A e B; retrovírus; vírus vaccinia; vírus do resfriado comum: rinovírus, picornavírus, vírus da parainfluenza humana <HPIV>, metapneumovírus humano <HMPV>, coronavírus, adenovírus, vírus sincicial respiratório humano <HRSV>, enterovírus.
24. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de doenças autoimunes dos grupos de: psoríase, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal, doença celíaca e esclerose múltipla.
25. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de doenças cancerosas dos grupos de: câncer de pele e mucosa, tumores gastrointestinais, carcinoma colorretal.
26. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de mastite em animais.
27. Uso da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mesma ser empregada para o tratamento de disfunções gastrointestinais funcionais selecionadas a partir dos grupos de: disfunções do esôfago, estômago, duodeno, intestino delgado e cólon, desconforto gastrointestinal centralmente mediado, disfunções da vesícula biliar e do esfíncter de Oddi, disfunções anorretais, disfunções gastrointestinais específicas de crianças e adolescentes.
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