CN113473964B - 蜂胶液体提取物及其制剂和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的标准化蜂胶液体提取物和由所述提取物制备成的药物制剂，及其制备方法和用途。该液体提取物是用PEG200‑600(96.5‑99.9％w/w)和卵磷脂(0.1‑3.5％w/w)的混合物作为提取溶剂提取粗蜂胶制备而成。该提取物的特征在于含有标准化含量的对香豆酸(1)，反式阿魏酸(2)，咖啡酸(3)，以及咖啡酸苯乙酯CAPE(4)。该组合物可作为活性成分用于制备药物，化妆品，兽药，农用化学品或功能性食品。本发明的药物制剂由5‑95％w/w的所述蜂胶提取物和制备各种剂型所需的使总量达100％的赋形剂组成。该产品可用于治疗人或动物的疾病，包括炎性疾病，细菌和真菌感染，病毒性疾病，自身免疫性疾病和癌症，还可用于治疗烧伤和促进伤口愈合。

Description

蜂胶液体提取物及其制剂和用途
技术领域
本发明涉及一种新的液体标准化蜂胶提取物，其制备方法，以及基于所述提取物的新的药物组合物和其用途。
背景技术
研究事实表明，蜂胶是蜂蜡和大量天然有机化合物的混合物，不同的提取方法产生活性物质不同，从而组成不同的提取物。通过采用不同选择性的化学溶剂(ES)提取，可以选择性提取某一类有机化合物，并结合合适的分析方法，理论上可以获得具有一致性和标准化的蜂胶提取物组合物。
本发明解决的技术问题包括：
(i)一种不含酒精的液体蜂胶提取物，其特征在于酚类蜂胶酸、对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和2-苯乙酯咖啡酸、3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)的含量高且标准化，其中已知对人和动物生物体的几种有益的药理学活性物质为；
Figure GDA0003216979160000011
(ii)其制备方法；
(iii)用于生产具有已知标准化含量的蜂胶活性物质1-4的药物、化妆品、兽药、农用化学品或食品；并且特别地，
(iv)一种基于上述蜂胶提取物的药物组合物，其可有效治疗炎性和感染性疾病，以及现有技术中的某些参考文献记载的特定蜂胶活性物质的抗氧化、抗炎和免疫调节活性及其发病病因学中起重要作用的疾病和病症。
这种蜂蜡含量可忽略不计的无醇提取物和其它稳定的蜂胶化合物，具有高和标准化含量的高生物活性蜂胶成分，是开发和生产高价值药物，兽药，农用化学品或功能性食品或食品增补剂的基础。相比之下，为了实现上述目的，使用乙醇、甘油或1,2-丙二醇制备的标准蜂胶提取物还存在一些问题，例如其中蜂胶活性物的含量未知或有价值的酚酸的含量低以及黄酮类蜂胶成分不足。
本发明的基础为：
(i)使用特定的提取溶剂(ES)制剂，用其化学选择性的提取粗蜂胶；
(ii)定量测定关键活性物质1-4的蜂胶活性成分方法；
(iii)通过用一定量的相同提取溶剂稀释，将所制备的液体蜂胶提取物标准化，直至达到本发明所述的活性物质1-4的水平；其中所述提取溶剂由两种或多种食品或药学上可接受的物质组成，并且在最终产品中还包括液体标准化的蜂胶提取物。所述相同的提取溶剂具有载体或稀释剂的作用；以及，
(iv)药物组合物，其基于本发明的所述标准化蜂胶提取物，被证明是治疗炎性和感染性疾病的有效药剂。由于其药理活性的广谱性，可用于治疗各种疾病和病症，例如：炎性疾病、细菌和真菌感染、病毒性疾病、自身免疫疾病，还可用于粘膜再生、治疗烧伤和伤口以及用于癌症相关的疾病。
现有技术
蜂胶是由蜜蜂收获的天然产品，对于蜜蜂来说，蜂胶用于封闭蜂箱上不需要的较小的开口。蜂胶含有蜂蜡作为主要成分和各种大量的有机化合物。上述化合物有许多表现出显著的有益药理学作用；参见例如参考文献1
1)S.Castaldo,F.Capasso:Propolis,and old remedy used in modernmedicine,Fitoterapia 73(2002)S1-6.
除了上述活性物质1-4之外，蜂胶还含有一系列其他天然化合物，例如，对于酸性成分，它还含有反式肉桂酸(5)，以及含量丰富的白杨素(6)、松柏素(7)、高良姜素(8)、芹菜素(9)和山奈酚(10)的类黄酮系列：
Figure GDA0003216979160000031
传统的方法为用乙醇或乙醇和水的混合物提取粗蜂胶，从而得到的蜂胶酊剂。这种液体蜂胶提取物的特征在于存在以下缺点：
(i)采用相对侵蚀性的溶剂(乙醇)；
(ii)含酒精的产品不适用于儿童、孕妇和哺乳期妇女以及某些患者；以及，
(iii)相对高含量的蜂蜡，其在药物和其他产品的制造过程中通过与水混合引起蜂蜡解聚，其中这种提取物用作活性成分。
除了乙醇之外，还使用甘油、水、甘油和水的混合物以及其他有机溶剂作为提取溶剂。
通过这种方式，Tsukada及其同事公开了使用甘油作为提取溶剂提取蜂胶，提取溶剂的比例为1:2w/w，90-160℃提取后过滤。这样的甘油提取物是水溶性的并且适合于作为活性药物成分(API)生产药物产品；参见参考文献2
2)JPH05957A；T.Tsukada,W W.Kameda,M.Ide:Production of water-solublepropolis pharmaceutical preparation；Ogawa Koryo KK,Santapuron KK(JP).
现有技术中也有蜂胶水溶液提取物的相关描述。用水作为溶剂的提取条件为在30-50℃的温度下提取6-8分钟，过滤后直接得到液体蜂胶提取物。后者最终可以采用喷雾干燥技术将其进一步微胶囊化处理加工到合适的载体如麦芽糖糊精和阿拉伯树胶上，制成固体提取物；参见参考文献3
3)CN103783349A；Z.Wang,S.Shao,H.Ma,S.Wang,L.Wang,C.Zhang,X.Ma:Processfor preparing honeycomb polyphenol extractive microcapsule by adopting spray；University Jiangsu(CN).
现有技术中还存在使用表面活性剂作为萃取溶剂(包括卵磷脂)的提取。例如，Paradkar及其同事描述了在40-90℃下使用聚山梨醇酯水溶液提取蜂胶2-24小时的方法，得到液体蜂胶提取物；参见参考文献4：
4)WO2011092511A1；A.Paradkar,R.Dhumal,A.Kelly,S.Gilda:Propolis andprocess for the treatment thereof and end products formed therefrom；NaturesLab Ltd(GB).
Sosnowski公开了用不同有机溶剂提取蜂胶的方法，所述有机溶剂包括1,2-丙二醇、聚乙二醇(PEG)以及这些溶剂与水的混合物；参见参考文献5
5)US4382886；Z.M.Sosnowski:Method for extracting propolis and watersoluble dry propolis powder.
Chun及其同事公开了一种药物组合物，其中，该药物组合物以1,3-丁二醇作为提取溶剂的液体蜂胶提取物为基础，通过使用氢化卵磷脂以及其他乳化剂，将其转化为药物剂型，该药物剂型包含具有该蜂胶提取物的纳米颗粒；参见参考文献6：
6)KR20130134800A；Y.J.Chun,S.B.Shim,X.Ke:Composition of nano-vesiclecontaining propolis and manufacturing method of it；University Chungwoon IACF(KR).
尽管该文献没有使用卵磷脂来促进用1,3-丁二醇提取蜂胶活性物质，但它显然提出了将其用作表面活性剂的可能性，其最终可以改善某些脂肪活性蜂胶成分在更极性的溶剂中的提取和乳化。
关于蜂胶的分析，现有技术中有大量的分析方法用于定量测定含有大量成分的复合蜂胶提取物中的蜂胶活性物质。例如，在中国作者Cui-Ping及其合作者的研究中给出了与本发明中采用的分析方法类似的分析方法。他们描述了一种通过高效液相色谱(HPLC)定量测定12种不同黄酮类化合物和8种酚型蜂胶酸的方法。该方法尤其能够测定对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)和咖啡酸(3)，它们被提及作为定性蜂胶标记物；参见参考文献7：
7)Z.Cui-ping,H.Shuai,W.Wen-ting,P.Shun,S.Xiao-ge,L.Ya-jing,H.Fu-liang:Development of high-performance liquid chromatographic for quality andauthenticity control of Chinese propolis,J.Food Sci.79(2014)C1315-C1322.
由于含有一定量的活性物质1-10，蜂胶和蜂胶提取物对人、动物和植物健康表现出一系列非常有价值和有益的药理学作用。现有技术中存在大量科学和专利文献，记载了其广泛的有益效果，最重要如下：抗炎；抗氧化剂；免疫调节；保肝剂；抗微生物剂，包括抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂；和抗癌；参见例如参考文献8-12：
8)E.L.Ghisalberti:Propolis:A Review,Bee World 60(1979)59-84.
9)A.Banskota,Y.Tezuka,S.Kadota:Recent Progress in PharmacologicalResearch of Propolis,Phytother.Res.15(2001)561-571.
10)G.A.Burdock:Review of the Biological Properties and Toxicity ofBee Propolis(Propolis),Food Chem.Toxicol.36(1998)347-363.
11)J.M.Sforcin:Propolis and the immune system:a review,J.Ethnopharmacol.113(2007)1-14.
12)J.W.Dobrowolski,S.B.Vohora,K.Sharma,S.A.Shah,S.A.H.Naqvi,P.C.Dandiya:Antibacterial,antifungal,antiamoebic,antiinflammatory andantipyretic studies on propolis bee products,J.Ethnopharmacol.35(1991)77-82.
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除了蜂胶提取物之外，现有技术中描述了某些分离的(纯的)蜂胶活性物质的有益药理学作用，例如：
(i)对香豆酸(1)；参见参考文献13和14；
(ii)反式阿魏酸(2)；参见参考文献15和16；
(iii)咖啡酸(3)；参见参考文献17和18；以及
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)；参见参考文献19和20；其表现出显著的免疫调节、抗炎和抗微生物活性：
13)T.F.Bachiega,C.L.Orsatti,A.C.Pagliarone,J.M.Sforcin:The Effects ofPropolis and its Isolated Compounds on Cytokine Production by MurineMacrophages,Phyto
14)K.Pei,J.Ou,J.Huang,S.Ou:p-Coumaric acid and its conjugates:dietarysources,pharmacokinetic properties and biological activities,J.Sci.FoodAgric.96(2016)2956-2962.
15)N.Kumar,V.Pruthi:Potential applications of ferulic acid fromnatural sources,Biotechnol.Rep.4(2014)86-93.
16)C.Shi,X.Zhang,Y.Sun,M.Yang,K.Song,Z.Zheng,Y.Chen,X.Liu,Z.Jia,R.Dong,L.Cui,X.Xia:Antimicrobial activity of ferulic acid against Cronobactersakazakii and possible mechanism of action,Foodborne Pathog.Dis.13(2016)196-204.
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18)V.N.Lima,C.D.Oliveira-Tintino,E.S.Santos,L.P.Morais,S.R.Tintino,T.S.Freitas,Y.S.Geraldo,R.L.Pereira,R.P.Cruz,I.R.Menezes,H.D.Coutinho:Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenoliccompounds:Gallic acid,caffeic acid and pyrogallol,Microb.Pathog.99(2016)56-61.
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此外，蜂胶活性物质可作为杀真菌剂、杀细菌剂、杀病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂，并可用于保护植物。由于强大的抗氧化活性，蜂胶强化植物并增强其对非生物胁迫的抗性，并帮助其抵抗感染；参见参考文献21-25：
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由最新研究可知，现有技术中没有描述使用含有低(0.1-3.5％m/m)卵磷脂含量的基于液体聚乙二醇的特定提取溶剂(ES)作为蜂胶提取的化学选择性增强剂。本发明采用的这种特定提取溶剂(ES)能够增强粗蜂胶提取物的化学选择性，从而获得相应的液体提取物，其中相应活性物质1-4的含量显著提高。
此外，本发明所提及的、特定的、标准化的液体蜂胶提取物作为药物组合物中的活性药物成分(API)的用途在其使用的一系列不同适应症方面产生了预料不到的改善效果；如本发明的具体实施方式中所述。
发明内容
本发明采用特定提取溶剂(ES)提取的粗蜂胶的具有意想不到的功效和化学选择性。后者由比例为96.5-99.9:0.1-3.5％w/w的液体聚乙二醇(PEG)(例如PEG400)和卵磷脂或水解卵磷脂的混合物组成。
该提取溶剂(ES)有效且化学选择性地提取蜂胶中的活性物质对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和3,4-二羟基反式肉桂酸2-苯乙酯(4；CAPE)。使用合适的高效液相色谱(HPLC)分析方法能够定量测定制备的初级提取物中的活性物质1-4。后者通过在提取步骤中使用相同的ES稀释进行进一步标准化，直至达到本发明所述的活性物质1-4的所需含量。通过这样的方式，获得本发明所述的含有已知和标准化浓度的关键活性物质1-4的液体蜂胶提取物。该提取物可进一步用作活性药物成分(API)、活性化妆品成分(ACI)，或用作制造功能性食品和食品补充剂的食品成分。
本发明的组合物是以所述液体蜂胶提取物为基础的，其含有关键活性物质对香豆酸(1；10-1,300μg/mL)、反式阿魏酸(2；10-800μg/mL)、咖啡酸(3；5-300μg/mL)和3,4-二羟基反式肉桂酸2-苯乙酯(4；5-400μg/mL)，是治疗炎性疾病、细菌感染、真菌感染、病毒性疾病、自身免疫疾病、功能性胃肠道疾病、粘膜再生、治疗烧伤和伤口以及治疗癌症疾病的有效试剂。
附图说明
图1表示蜂胶关键成分1-4和伴随成分5-10的典型HPLC色谱图。
图2.1-2.4表示用乙醇(96％)以及乙醇与不同种类和浓度卵磷脂的混合物提取得到的液体蜂胶提取物中的蜂胶活性物质1-4的定量组成结果。
图2.5-2.10表示用乙醇(96％)以及乙醇与不同种类和浓度的卵磷脂的混合物提取得到的液体蜂胶提取物中的伴随物质5-10的定量组成结果。
图3.1-3.4表示通过用聚乙二醇400以及聚乙二醇400与不同种类和浓度卵磷脂的混合物提取得到的液体蜂胶提取物中的蜂胶活性物质1-4的定量组成结果。
图3.5-3.10表示通过用聚乙二醇400以及聚乙二醇400与不同种类和浓度卵磷脂的混合物提取得到的液体蜂胶提取物中的伴随物质5-10的定量组成结果。
图4表示了根据本发明的标准化液体蜂胶提取物的生产方法的框图。
图5表示本发明药物制剂，实施例11的产品的定量分析的典型HPLC色谱图。
缩写
ES-萃取溶剂
SL-大豆卵磷脂(Glycine max.L.)
RL-油菜籽卵磷脂(Brassica napus L.)
HRL-水解大豆卵磷脂
SUL-去油向日葵卵磷脂
EtOH-96％乙醇
PEG-聚乙二醇
HPLC-高效液相色谱法
GC-气相色谱
TLC-薄层色谱法
MIC-最小抑制浓度
RPMI-洛斯维公园纪念所
TTC-氯化三苯基四氮唑，氧化还原指示剂
PBS-磷酸盐缓冲液
CFU-集落形成单元；能形成菌落的活微生物的数量
XTT-XTT钠盐；2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羧基苯胺内盐，氧化还原指示剂
MRSA-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
MSSA-耐甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌
CLSI-美国临床实验室标准化协会
EUCAST-欧洲抗生素敏感性试验委员会
API-活性药物成分/物质
DER-药物与提取物的重量比；用起始药物和最终提取物的重量比表示的提取物强度的测量
SCC-体细胞计数
I.mam.-乳房内的(应用)
ATCC-美国典型培养物保藏中心；收集，储存和分配标准参比微生物的非利润组织
CNS-凝结酶阴性葡萄球菌
具体实施方式
本发明涉及一种新的蜂胶液体提取物及其制备方法和用途，其中将所述蜂胶液体提取物的关键活性物质的含量标准化，所述关键活性物质选自：对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4)。
Figure GDA0003216979160000111
根据本发明，作为药物、化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物由以下成分组成：
(A)干燥蜂胶提取物；0.1-10.0％w/w；以及
(B)萃取溶剂；90.0-99.9％w/w；
其中所述萃取溶剂由以下组成：
(B.1)一种或多种液体聚乙二醇(PEG)200-600；96.5-99.9％w/w；以及
(B.2)卵磷脂或水解卵磷脂；0.1-3.5％w/w；
所述蜂胶液体提取物通过以下步骤标准化：
(I)作为药物的粗蜂胶与最终提取物(DER)的定量重量比为：
1:2-1:20w/w；以及
(II)蜂胶活性物质的定量含量，所述蜂胶活性物质选自对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4)，其中所述关键活性物质中至少四种中的两种的定量组成如下：
(i)对香豆酸(1)；100-1,300μg/mL；
(ii)反式阿魏酸(2)；75-800μg/mL；
(i)咖啡酸(3)；25-300μg/mL；以及
(ii)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)；40-400μg/mL。
在本发明的优选实施方案中，作为提取溶剂(ES)的组分的液体聚乙二醇(PEG)选自：聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600或这些物质的混合物。
具体地，作为提取溶剂(ES)的组分的液体聚乙二醇(PEG)选自：聚乙二醇200、聚乙二醇400或这些物质的混合物。
此外，卵磷脂或水解卵磷脂选自由以下组成的组：以2-12的亲水-亲脂平衡(HLB)因子为特征的产品，并且选自由以下组成的组：大豆卵磷脂(SL，来自Glycine max.L.)；向日葵卵磷脂(SUL；来自向日葵(Helianthus annuus L.))；油菜籽卵磷脂(RL；来自Brassicanapus L.)；卡诺拉卵磷脂(Brassica rapa L.)；来自鸡(Gallus gallus domesticus L.)卵的卵磷脂；所述卵磷脂的脱油产物；来自所述来源的氢化卵磷脂；来自所述来源的水解卵磷脂；所述卵磷脂的酶改性衍生物；或这些物质的混合物。
具体地，本发明中的卵磷脂可以使用天然卵磷脂，包括来自大豆(Glycinemax.L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)、油菜籽(Brassica napus L.)或卡诺拉(Brassica rapa L.)的脱油、氢化、水解或酶改性的卵磷脂；或这些物质的混合物。
术语“酶改性的卵磷脂”包括通过酶催化水解一个高级脂肪酸部分获得的水解卵磷脂，其中产生高级脂肪酸的甘油单酯，分子中具有剩余的磷酸酯和胆碱基团。这导致这种水解卵磷脂的HLB因子显著增加。
优选地，根据本发明，可以使用以下混合物作为用于制备液体蜂胶提取物的提取溶剂：
(i)聚乙二醇(PEG)200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或其混合物；97-99％w/w；以及
(ii)来自大豆(Glycine max.L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)、油菜籽(Brassica napus L.)或油菜(Brassica rapa L.)天然卵磷脂、脱脂卵磷脂或水解卵磷脂；或这些物质的混合物；1-3％w/w；
在本发明的优选实施例中，根据本发明的液体蜂胶提取物在以下方面标准化：
(I)作为药物的粗蜂胶与最终提取物(DER)的质量百分比为：
1:3-1:5w/w；以及
(II)蜂胶活性物质的定量组成，所述蜂胶活性物质选自对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和2-苯基乙基3,4-二羟基肉桂酸酯(4)，其中所述关键活性物质中至少四种中的两种对应于以下定量含量：
(i)对香豆酸(1)；500-1,300μg/mL；
(ii)反式阿魏酸(2)；300-800μg/mL；
(iii)咖啡酸(3)；100-300μg/mL；以及
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)；100-400μg/mL。
蜂胶液体提取物中活性物质的分析
为了开发本发明的新型标准化液体蜂胶提取物，本申请建立了用于定量测定以下物质的合适的分析方法：
(i)选自以下物质的关键活性蜂胶物质：对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4)；以及
(ii)伴随的活性物质，其选自：反式肉桂酸(5)、白杨素(6)、松柏素(7)、高良姜素(8)、芹菜素(9)和山奈酚(10)，这些是很重要的。
Figure GDA0003216979160000131
Figure GDA0003216979160000141
为了初步研究所述分析方法，需要制备液体蜂胶提取物模型。使用乙醇(96％)和聚乙二醇制备蜂胶提取物模型。通过标准提取方法，在室温下浸渍24小时来制备。然后，过滤分离未溶解的残余物，并将澄清滤液作为液体蜂胶提取物模型用于进一步研究。作为模型液体的聚乙二醇采用的是聚乙二醇400(PEG400)。实施例1(96％乙醇)和实施例2(PEG400)描述了在经典提取溶剂乙醇(96％)和聚乙二醇400中制备液体蜂胶提取物模型的方法。
本发明建立了基于高效液相色谱(HPLC)的合适的分析方法，通过该方法实现了所有10种所述化合物1-10的成功分离。该方法精确地描述于实施例3中。
通过本分析方法获得的典型HPLC色谱图显示在图1中。化合物1-10的保留时间(tR)在表1中给出。
表1根据本发明的HPLC方法测定蜂胶活性物质1-10的保留时a
No. 蜂胶活性物质 保留时间(tR)[min]
1 对香豆酸(1) 14.13
2 反式阿魏酸(2) 15.31
3 咖啡酸(3) 10.57
4 2-苯乙基3,4-二羟基-反式-肉桂酸酯(4) 48.62
5 反式肉桂酸(5) 29.76
6 白杨素(6) 44.68
7 匹诺菌素(7) 47.39
8 高良姜素(8) 49.94
9 芹菜素(9) 37.72
10 山奈酚(10) 36.87
a色谱柱：Ascentis express；C18；尺寸:15cm×3.0mm；柱中的颗粒直径:2.7μm；流动相:A＝0.1％甲酸水溶液，B＝甲醇；洗脱梯度：0分钟，80％A，20％B；3分钟，70％A，30％B；60分钟，20％A，80％B；90分钟，20％A，80％B；100分钟，70％A，30％B；105分钟，80％A，20％B；柱温:30℃；流速:0.25mL/min；分析时间：110min；UV-VIS检测器上的波长：用于检测:370nm，用于积分290nm；注射体积:10μL；压力：210-290bars。
卵磷脂对蜂胶活性物质1-4提取效果影响的研究
在本研究的后续研究过程中，研究了不同提取溶剂(ES)以及不同种类(SL、RL、HRL)的卵磷脂和卵磷脂的浓度(1-30％w/w)对蜂胶活性物质1-4提取功效的影响；参见表2。
表2从蜂胶中提取活性物质1-4的提取取溶剂(ES)测试
Figure GDA0003216979160000151
对由此制备的液体蜂胶提取物的关键活性物质1-4和伴随的活性物质5-10的含量进行定量分析。结果在表3-6中给出。
在使用基于96％乙醇(EtOH)以及EtOH与不同种类(SL、RL、HRL)和浓度(ES组合物中的1-30％w/w)的混合物的提取溶剂(ES)的情况下，初级液体蜂胶提取物含有作为主要活性成分的对香豆酸(1；约800-1250μg/mL)、反式阿魏酸(2；约485-770μg/mL)、咖啡酸(3；约185-290μg/mL)和3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE；约215-320μg/mL)；参见表3。
表3用乙醇作为提取溶剂(ES)获得的液体蜂胶提取物中活性物质1-4的定量组成。
Figure GDA0003216979160000161
其中辅助活性物质5-10的浓度为以下水平：反式-肉桂酸(5；约40-65μg/mL)、白杨素(6；约500-690μg/mL)、松柏素(7；约440-670μg/mL)、高良姜素(8；约210-300μg/mL)、芹菜素(9；约90-150μg/mL)和山奈酚(10；约45-90μg/mL)；参见表4。
在使用基于聚乙二醇(PEG 400)和PEG 400与各种种类(SL、RL、HRL)和浓度(ES组合物中的1-10％w/w)的卵磷脂的混合物的提取溶剂(ES)的情况下，初级液体提取物还含有对香豆酸(1；约750-1300μg/mL)、反式阿魏酸(2；约400-800μg/mL)、咖啡酸(3；约140-300μg/mL)和3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE；约190-370μg/mL)；参见表5。
表4用乙醇作为提取溶剂(ES)获得的液体蜂胶提取物中伴随的活性物质5-10的定量组成。
Figure GDA0003216979160000171
表5用聚乙二醇400为提取溶剂(ES)获得的液体蜂胶提取物中活性物质1-4的定量组成。
Figure GDA0003216979160000181
在这种情况下，辅助活性物质5-10的浓度为以下水平：反式肉桂酸(5；约30-70μg/mL)、白杨素(6；约400-830μg/mL)、匹诺松素(7；约390-800μg/mL)、高良姜素(8；约190-360μg/mL)、芹菜素(9；约80-170μg/mL)和山奈酚(10；约40-140μg/mL)；参见表6。
表6用聚乙二醇400作为的提取溶剂(ES)获得的液体蜂胶提取物中的活性物质5-10的定量组成。
Figure GDA0003216979160000182
从结果可以看出，当以1-3％w/w的较低浓度使用组合物提取溶剂(ES)时，所测的卵磷脂(SL、RL、HRL)与96％乙醇或聚乙二醇400(PEG 400)的组合相比于任何纯溶剂更有助于选择性的提取化学活性物质1-4。
PEG 400和卵磷脂(大豆卵磷脂、油菜籽卵磷脂、水解油菜籽卵磷脂)组合的意想不到的效果体现在以下事实中：虽然PEG 400作为纯溶剂，但提取活性物质1-4的能力显著弱于96％乙醇(表3，第1行，第2列)；当与浓度为1-3％w/w的卵磷脂(大豆卵磷脂、油菜籽卵磷脂、水解油菜籽卵磷脂)组合使用时，与96％乙醇和相同卵磷脂的类似组合相比，可以更显著有效的提取化合物1-4。例如，尽管在用100％PEG 400作为提取溶剂获得的提取物中可以使对香豆酸(1)浓度在750μg/mL的范围内(表5，第1行，第2列)，用96％EtOH作为提取溶剂获得的提取物中使对香豆酸(1)浓度在916μg/mL的范围内(表3，第1行，第2列)，但是在PEG400中使用3％w/w大豆卵磷脂可使其浓度达1112.08μg/mL的(表5，第2行，第2列)，相对于使用3％w/w大豆卵磷脂和96％乙醇为提取溶剂情况下，其浓度820μg/mL的水平(表3，第2行，第2列)。
从该典型实施例中，在浓度为1-3％w/w的聚乙二醇和卵磷脂的组合的提取溶剂中，取得的完全意想不到的效果是显而易见的。这本领域技术人员可以以此推断，在ES组合物中达到0.1-3.5％w/w的最佳卵磷脂重量百分比的可接受范围。
当在提取溶剂(ES)组合物中使用更高重量百分比的卵磷脂时，与基于乙醇的类似体系相比，卵磷脂对蜂胶提取化学选择性的有益作用损失。例如，通过在ES中使用浓度为4％RL，7.7％HRL或10％SL的卵磷脂，与使用类似的基于乙醇的ES系统相比，得到较低浓度的关键活性物质1-4。对于两种最丰富的活性物质，即对香豆酸(1)和反式阿魏酸(2)，典型的结果示于表7和8中。
表7用本发明的不同提取溶剂获得的液体蜂胶提取物中对香豆酸(1)的定量成分。
Figure GDA0003216979160000201
在表7中，在第8行，第3列中可以看到本发明典型的意外结果。其中当使用萃取溶剂PEG 400+RL(98.9:1.1，w/w)时，与类似的EtOH基Es(EtOH+RL＝98.9:1.1，w/w)相比，观察到对香豆酸(1)浓度增加了50％。
表8为用本发明的不同提取溶剂获得的液体蜂胶提取物中反式阿魏酸(2)的定量成分。
Figure GDA0003216979160000211
作为意外结果的另一个典型例子，在表8的第12行，第3栏中的数据记录了当使用提取溶剂(ES)PEG400+HRL(97.8:2.2，w/w)时，与类似的96％乙醇基ES相比，反式阿魏酸(2)浓度增加53.5％。
根据本发明的标准化液体蜂胶提取物的生产方法
根据本发明的液体蜂胶提取物的制备方法包括以下步骤：
(i)在-20℃下冷却粗蜂胶至少1小时；
(ii)将冷冻的蜂胶研磨，过筛1-8mm的孔；
(iii)在以下条件下用提取溶剂提取粗蜂胶：
(a)粗蜂胶与提取溶剂的重量比为1:2～1:20w/w；
(b)提取温度为10-150℃；以及
(c)提取时间为5分钟至72小时；
(iv)将如此获得的混合物通过一系列具有100pm-5pm孔的过滤器过滤，产生未溶解的残留物和液体蜂胶提取物；
(v)通过高效液相色谱(HPLC)对关键活性蜂胶物质1-4进行定量分析；以及
(vi)通过用步骤(iii)中使用的新鲜提取溶剂稀释，将由此获得的液体蜂胶提取物标准化，所述液体蜂胶提取物具有步骤(v)中确定的关键活性物质1-4的精确定量组成，直至达到活性物质1-4的期望含量。
在实现根据本发明的制备液体蜂胶提取物的方法的优选实施方案中，提取步骤(iii)在以下条件下进行：
(a)粗蜂胶与提取溶剂的重量比为1:3～1:5w/w；
(b)提取温度为15-70℃；以及
(c)提取时间为1-24小时。
此外，关键活性物质1-4的定量测定步骤和伴随的辅助活性物质5-10的监测，为此目的开发的分析高效液相色谱方法(HPLC)如下进行：
(i)色谱柱：Ascentis Express；C18；尺寸:15cm×3.0mm；柱中颗粒的直径:2.7pm；
(ii)流动相:A＝0.1％甲酸水溶液，B＝甲醇；洗脱梯度：0min，80％A，20％B；3min，70％A，30％B；60min，20％A，80％B；90min，20％A，80％B；100min，70％A，30％B；105min，80％A，20％B；
(iii)柱温:30℃；
(iv)流量:0.25ml/min；
(v)分析时间：110min；
(vi)在UV-VIS检测器上的波长：用于检测:370nm，用于积分:290nm；
(vii)注射体积:10pl；
(viii)压力：210-290bars。
实施例4-9公开了制备本发明的液体蜂胶提取物的实验方法。在实施例9中，描述了根据本发明的标准化液体强度提取物的制备方法的优化形式，其由参数药物-提取物比率(DER)重量百分比1：2表示。
实施例3描述了用于定量测定关键活性物质1-4和辅助活性物质5-10的分析方法。
本发明标准化液体提取物的抗微生物功效的测定。对模型病原微生物的最小抑制 浓度(MIC)的测定
蜂胶提取物的抗微生物功效在位于克罗地亚首都萨格勒布的Rudjer Boskovic大学分子医学院测量得到。根据本发明，标准化液体蜂胶提取物的最小抑制浓度(MIC)由CLSI(美国临床实验室标准化协会)和EUCAST(欧洲抗生素敏感性试验委员会)的说明确定。抗微生物敏感性测试)方法，如文献参考文献26-29中所述。使用实施例9的产品。
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在体外条件下，对下列模型病原微生物(M)的ATCC菌株测试抗微生物效力：
(i)金黄色葡萄球菌ATCC 29293(M1)；
(ii)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MRSA(MFBF收集；M2)；
(iii)对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌；MSSA(MFBF集合；M3)；
(iv)粪肠球菌ATCC 9212(M4)；
(v)粪肠球菌VRE(MFBF收集)(M5)；
(vi)大肠杆菌ATCC 10536(M6)；
(vii)鲍曼不动杆菌ATCC 43498(M7)；
(viii)铜绿假单胞菌ATCC 9027(M8)；以及
(ix)白色念珠菌ATCC 90028(M9)。
进行一系列的微稀释过程以确定提取物的最小抑制浓度(MIC)。MIC值被确定为蜂胶提取物浓度，在该浓度下细菌或真菌计数发生80％的减少(MIC80)；表9所示的最小抑制浓度(MIC80)以相应的液体提取物在给定溶剂中的稀释(％)的形式显示。以粗蜂胶与最终提取物(DER)1:2的比例获得起始液体蜂胶提取物，即实施例9的产品。如果液体提取物的稀释度较大，即活性物质1-10的MIC值较低，则所得到的测试提取物的抗菌效果较高。
实施例10中公开了MIC值测定的实验过程的详细描述，结果列于表9中。
表9用96％乙醇(实施例1)或聚乙二醇400(实施例2)作为提取溶剂获得的液体提取物相比，对实施例9的产物稀释蜂胶提取物进行最小抑制浓度(MIC；％)测定的结果。
Figure GDA0003216979160000251
在表10-15中，给出了三种测试的提取溶剂体系中每种体系中蜂胶提取物的有效稀释物中活性物质1-10的质量浓度；这些是通过使用以下方法获得的：
(i)96％乙醇；实施例1的产物，
(ii)聚乙二醇400(PEG400)；实施例2的产物；以及，
(iii)PEG 400(97％w/w)和大豆卵磷脂(3％w/w)的混合物；实施例9的产物；或者，每种特定液体提取物达到MIC值时相应活性物质1-10的质量浓度。从DER为1：2的初级液体提取物中测定，当达到MIC时，用稀释液分离。
表10在用96％乙醇获得的蜂胶液体提取物的有效稀释液中，蜂胶活性物质1-4的质量浓度(γ)，单位为[μg/ml]；实施例1的产品
Figure GDA0003216979160000261
表11在用96％乙醇获得的蜂胶液体提取物的有效稀释液中，蜂胶活性物质5-10的质量浓度(γ)，单位为[μg/ml]；实施例1的产品。
Figure GDA0003216979160000262
表12为在用聚乙二醇400(PEG400)获得的液体蜂胶提取物的有效稀释液中，蜂胶活性物质1-4的质量浓度(γ)，单位为[μg/ml]；实施例1的产品。
Figure GDA0003216979160000271
表13为在用聚乙二醇400(PEG400)获得的蜂胶液体提取物的有效稀释液中，蜂胶活性物质5-10的质量浓度(γ)，单位为[μg/ml]；实施例2的产品.
Figure GDA0003216979160000272
表14为在有效稀释用聚乙二醇400(PEG400；97％w/w)和大豆卵磷脂(3％w/w)的混合物获得的液体蜂胶提取物中，蜂胶活性物质1-4的质量浓度(γ)，单位为[μg/ml]；实施例9的产品。
Figure GDA0003216979160000281
表15为在有效稀释用聚乙二醇400(PEG400；97％w/w)和大豆卵磷脂(3％w/w)的混合物获得的液体蜂胶提取物中，蜂胶活性物质5-10的质量浓度(γ)，单位为[μg/ml]；实施例9的产品。
Figure GDA0003216979160000282
通过几种活性物质1-10的协同作用达到每种测试的液体蜂胶提取物的总抗微生物作用(MIC)。令人感兴趣且完全意想不到的是，低浓度的活性物质1-10的混合物比高浓度的某些(纯)活性物质1-10的混合物更有效。
本发明的制剂对革兰氏阳性微生物如葡萄球菌最有效。但是，如表9所示，在较高浓度下，它也对一些革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌和鲍曼弧菌，以及真菌白色念珠菌有效。
本发明标准化液体蜂胶提取物的用途
根据本发明的作为药物、化妆品、农用化学品或食品成分的蜂胶提取物含有标准化浓度的高生物活性物质：
(i)对香豆酸(1)；100-1300μg/ml；
(ii)反式阿魏酸(2)；75-800μg/ml；
(iii)咖啡酸(3)；25-300μg/ml；以及
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)；40-400μg/ml。
由于关键活性物质1-4的含量标准化，根据本发明的液体蜂胶提取物代表用于人和动物的活性药物成分(API)，活性化妆品成分(ACI)或用于食品或动物饲料的功能成分，其特征在于以下有益的药理学作用：
(i)抗炎；参见文献参考文献1，8，9，11，12，13，17；
(ii)抗氧化剂；参见文献参考文献8，9，14，15，20；
(iii)免疫调节剂；参见文献参考文献1，8，11，13，15，17，18，19，20；
(iv)保肝；参见文献参考文献9；
(v)抗菌剂；包括抗菌，抗病毒，抗真菌和抗原虫；参见文献参考文献9，10，12，15，16，18；
(vi)抗肿瘤；参见文献参考文献9，10，11，14，19；以及
(vii)抗癌；参见文献参考文献11，14。
本发明的液体蜂胶提取物的其它有价值的作用，还来源于在植物保护中的杀真菌，杀细菌，杀病毒，杀虫和杀线虫作用。由于较强的抗氧化活性，本发明的液体蜂胶提取物间接增强了植物和它们对非生物胁迫因子的抗性，并帮助它们抵抗感染。因此，它可用作植物增强剂；参见文献参考ILLS。根据本发明的液体蜂胶提取物，其还可用作：
(i)用于生产选自以下的药物产品的活性药物成分或赋形剂：药物，药物装置或治疗剂；
(ii)用于生产化妆品的活性化妆品成分或赋形剂；
(iii)用于生产功能性食品，食品增补剂或用于特殊营养目的的食品中的食品成分；
(iv)用于生产兽医产品的活性药物成分或赋形剂，所述兽医产品来源于：兽医药物产品；动物饲料；动物饲料添加剂；或兽医用药物；或
(v)用于生产农业化学产品的活性农用化学品或赋形剂，所述农业化学产品来源于：杀真菌剂，杀细菌剂，杀病毒剂，杀虫剂，杀线虫剂和植物增强剂；特别适用于生态农业。
根据本发明的基于所述标准化液体蜂胶提取物的药物组合物
此外，本发明公开了基于所述标准化液体蜂胶提取物作为活性药物成分(API)的药物组合物。根据本发明的药物组合物包括：
(i)根据本发明的液体蜂胶提取物；5-95％w/w；以及，
(ii)一种或多种最终剂型制剂所需的药用赋形剂，来源于：溶液，悬浮液，凝胶，乳膏，软膏，口服或鼻用喷雾剂；最多100％w/w的最终组合物；
其中所述组合物的特征在于四种关键活性蜂胶物质中至少两种的定量含量在以下值内：
(i)对香豆酸(1)；10-1300μg/g；
(ii)反式阿魏酸(2)；10-800μg/g；
(iii)咖啡酸(3)；5-300μg/g；以及，
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)；5-400μg/g。
因此，药用赋形剂(辅料)选自稀释剂，湿润剂，防腐剂，螯合剂，抗氧化剂，增稠剂，润肤剂，乳化剂，张力剂和pH控制剂。
稀释剂是药学上可接受的液体，来源于：纯化水；乙醇；1,2-丙二醇；液体聚乙二醇(PEG)，例如PEG200，PEG400或PEG600；或这些物质的混合物。
保湿剂来源于甘油，山梨醇，1,2-丙二醇或这些物质的混合物。
防腐剂来源于：对羟基苯甲酸甲酯，4-羟基苯甲酸乙酯，4-羟基苯甲酸丙酯，4-羟基苯甲酸丁酯；4-氯-甲酚；三氯生；苯甲醇；2-苯氧基乙醇；苯甲酸及其盐如苯甲酸钠；山梨酸或其盐如山梨酸钾；脱氢乙酸(3-乙酰基-2-羟基-6-甲基-4a-吡喃-4-酮)；洗必泰及其盐如洗必泰二葡萄糖酸盐；季铵盐如苯扎氯铵或十六烷基溴化铵；或这些物质的混合物。
螯合剂来源于：乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，次氮基三乙酸(NTA)的钠盐或钾盐；可溶性柠檬酸盐如柠檬酸三钠二水合物(Na3C6H5O7·2H2O)，典型的螯合剂是乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2EDTA·2H2O)。
抗氧化剂来源于：α-生育酚及其酯如α-生育酚琥珀酸酯；抗坏血酸及其盐如抗坏血酸钠；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)；叔丁基苯甲醚(BHA)；或这些物质的混合物。
增稠剂来源于：纤维素胶如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，羟乙基纤维素(HEC)，甲基纤维素(MC)，羧甲基纤维素钠(NaCMC)；合成聚合物如聚乙烯醇(PVA)，聚丙烯酸(PAA)及其共聚物聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；各种树胶如阿拉伯胶，黄原胶，黄蓍胶；藻酸及其盐如藻酸钠；高级脂肪酸的金属盐，如单硬脂酸铝，二硬脂酸铝，三硬脂酸铝；或这些物质的混合物。
润肤剂来源于：凡士林；矿物油；植物油如杏仁油，向日葵油或橄榄油；中链甘油三酯；高级脂肪酸和一元醇如肉豆蔻酸异丙酯或希蒙得木油的天然或合成酯；蜡如蜂蜡；硅油；高级脂肪酸如油酸或硬脂酸；高级脂肪醇如十六醇；或这些物质的混合物。
乳化剂来源于：羊毛脂；乙氧基化羊毛脂；羊毛脂醇；乙氧基化羊毛脂醇；卵磷脂；水解卵磷脂；甘油和高级脂肪酸如单硬脂酸甘油酯的单酯和二酯；高级脂肪酸如山梨糖醇单硬脂酸酯的山梨糖醇酯；乙氧基化高级脂肪醇如聚氧乙烯(23)月桂基醚或聚氧乙烯(2)油酸酯，其中数字23或2表示环氧乙烷单元的数目；乙氧基化脱水山梨糖醇酯如聚山梨酯60的酯；水溶性皂如硬脂酸钠；高级脂肪醇的水溶性硫酸盐如月桂基硫酸钠；脂肪醇的水溶性磷酸盐，如十六烷基磷酸钾；或这些物质的混合物。该张力剂主要用于施用在粘膜，例如鼻粘膜上的药物剂型，选自氯化钠(NaCl)，甘油，1,2-丙二醇或这些物质的混合物。
pH控制剂包括用于降低或增加pH值的药学上可接受的酸和碱以及缓冲体系，它来源于：盐酸(HCl)，硫酸(H2SO4)，磷酸(H3PO4)，柠檬酸，乙酸，氢氧化钠(NaOH)，氢氧化钾(KOH)，氢氧化铵(NH4OH)，磷酸二氢钠(NaH2PO4)，磷酸氢钠(Na2HPO4)，柠檬酸二氢钠(NaH2C6H5O7)，柠檬酸氢钠(Na2HC6H5O7)，柠檬酸钠(Na3C6H5O7)或这些物质的混合物。
根据本发明的药物组合物的制备本发明的药物组合物通过包括以下步骤的方法制备：
(i)将本发明的标准化液体蜂胶提取物加入到稀释剂中并使其均质化；
(ii)加入一种或多种其它赋形剂；和它们的均质化；
其中步骤(i)和(ii)在10-100℃的温度下，优选在20-60℃的温度下，在1-5分钟内进行；接着，在剂型制备的情况下：
(iii.a)溶液或喷雾用溶液；进行最终溶液的过滤，如果需要，包括无菌过滤；
(iii.b)凝胶或悬浮液；加入增稠剂，均质；
(iii.c)乳膏；通过将润肤剂和乳化剂混合并在50-80℃的温度下均质1-15分钟，然后加入加热到50-80℃的步骤(ii)的溶液，接着在50-80℃，优选55-65℃的温度下用高剪切或高压均质器乳化1-30分钟，随后在65-20℃的温度下均质10-120分钟；或
(Ⅲ.d)软膏；在5-30分钟内，在50-70℃的温度下，进行步骤(ii)的溶液与先前熔化的润肤剂和最终乳化剂的混合物的混合，随后在10-120分钟内，在70-20℃的温度下进行均质。
从本发明制备药物组合物的步骤还可以包括生产所述剂型的各种可供选择的常用技术步骤，这对于本领域的技术人员是熟知的。
实施例11-16描述了根据本发明的药物组合物生产的代表性实施例。
作为一个特殊的例子，这里描述了实施例11中公开的用于乳房内施用的溶液的最终剂型。在这种情况下，初级标准化液体蜂胶提取物，其制备在实施例9中描述；在这种情况下，使用聚乙二醇400(97％w/w)和大豆卵磷脂(3％w/w)的混合物，其在其中起到了稀释剂的功能。基于上述方式获得的乳房内施用溶液使关键活性物质1-4的定量含量的给定范围，参见表16。
表1通过本发明药物组合物的高效液相色谱(HPLC)定量分析活性物质1-10的结果
Figure GDA0003216979160000331
本发明组合物定量分析的典型HPLC色谱图如图5所示。
本发明药物组合物药理作用的研究
在临床研究中研究了来自本发明的组合物在来自溶液的剂量中的选定药理作用，来自实施例11的产物，可用于以下治疗：
(i)奶牛乳房炎，乳房炎症；
(ii)山羊乳腺炎；以及，
(iii)马匹的伤口愈合。
奶牛乳房炎治疗效果的研究
奶牛乳房炎治疗的研究是在5个具有荷斯登品种奶牛的养殖场进行的。总共86头奶牛(339个乳房部分)参与了研究，其中一个乳房部分用作一个统计单位。将动物自由地安置在厚铺窝中，并饲养不添加抗生素的奶牛标准预混料。该研究被兽医协会批准。包括体细胞计数(SCC)低于200,000/mL的没有乳腺炎临床症状的健康动物和乳房部分，以及SCC高于200,000/mL的被感染的乳房部分。通过乳房内(i.mam.)应用施用本发明的组合物进行安全性和功效的随机交叉临床研究。将实施例11中的本发明组合物在牛的全部四个乳房部分中施用三次：早挤奶期间，晚挤奶期间和早挤奶后的第二天。在实施例17中描述了详细的方法，而表17表示在第一次i.mam.应用之前的一定数量的乳房部分中鉴定的每种病原体的细菌学治愈。
表17为本发明实施例11的制剂应用于母牛i.mam.应用后的母牛乳房炎的细菌治疗/治愈的有效性测试
Figure GDA0003216979160000341
实施例11的组合物的三次(两天)给药方案仅在7天内就提供了100％的治愈率。
与之相比，头孢菌素类抗生素头孢噻呋的抗菌治愈率达到66％，但在经过8天的每日i.mam应用后，5天后仅有54％的病例治愈；参见文献参考文献30。对于由橡胶链球菌引起的亚临床乳腺炎，用吡利霉素治疗两天可使58.1％的病例痊愈，而治疗5和8天可使68.8％和80％的病例痊愈；参见文献参考30：
30)S.P.Oliver,B.E.Gillespie,S.J.Headrick,H.Moorehead,P.Lunn,H.H.Dowlen,D.J.Johnson,K.C.Lamar,S.T.Chester,W.M.Moseley:Efficacy of extendedCeftiofur intramammary therapy for treatment of subclinical mastitis inlactating dairy cows.J.Dairy Sci.87(2004)2393-2400.
或者，在奶牛乳房炎治疗中，如实施例12中所述，本发明的用于乳房内施用的悬浮液剂型的组合物也可以成功地使用。
山羊乳腺炎治疗的研究
山羊乳腺炎治疗的研究是在克罗地亚Sigetec Ludbreski的OPG Matijasec的高寒山羊养殖场对25只山羊进行的。所有山羊在左半乳和右半乳中诊断为隐性乳腺炎。羊奶经微生物检验呈阳性的山羊分为两组：一组施用实施例11的本发明组合物，另一组施用阿莫西林和克拉维酸(Klavuxil⑧)的乳内悬浮液(日内瓦，克罗地亚)；全部采用三次给药方案。在使用实施例11的组合物进行i.mam.应用后并行监测两组乳房的耐受性和细菌固化。三次(两天)施用本发明的制剂在75％的感染半乳中提供了细菌治疗，14天后提供了85％的细菌治疗。而在乳房内进行抗生素给药能够在73.3％的病例中进行细菌治疗。这证明前者比后者更加有效。研究结果表明，在不使用抗生素的情况下，用实施例11的组合物治疗山羊的乳腺炎是能够及时提供细菌治疗的。
在实施例18中描述了研究的详细过程，而在表18中给出了细菌治疗的结果。
表18为本发明实施例11的制剂与抗生素(阿莫西林和克拉维酸的固定组合)a的混合物应用于山羊i.mam.应用后的山羊乳腺炎的细菌治疗/治愈的有效性测试
Figure GDA0003216979160000351
Figure GDA0003216979160000361
比较作为广谱抗生素的阿莫西林在i.mam应用的活性，其适于治疗由奶样品和实施例11的组合物中发现的病原体引起的乳腺炎，证明后者具有更强的活性。在施用阿莫西林后7天，只有60％的半乳被治愈，而实施例11的组合物的结果是75％。在第一次施用后14天，使用抗生素的被治愈的半乳的总百分比为73.3％，而试验组合物的总百分比为85％。
从所述结果可以看出，本发明组合物在治疗乳腺炎方面的抗炎和抗微生物活性具有很高的功效。其疗效高于经典的阿莫西林和棒酸固定组合作为广谱抗生素的疗效。
或者，在山羊乳腺炎治疗中，也可以成功地使用如实施例12中所述的用于乳房内施用的悬浮液剂型的本发明组合物。
可以得出结论，本发明的组合物除了其它性质外，其特征还在于对一系列细菌和真菌的抗菌活性，其中抗菌功效与经典抗生素相比在体内比在体外条件下更高。它不仅是一种抗微生物剂，更是一种抗炎和免疫调节剂。
免疫调节蜂胶作用与其抗氧化作用密切相关，氧化应激是乳腺炎发病机理的组成部分；参见例如文献参考31：
31)O.Atakisi,H.Oral,E.Atakisi,O.Merhan,S.Metin Pancarci,A.Ozcan,S.Marasli,B.Polat,A.Colak,S.Kaya:Subclinical mastitis causes alterations innitric oxide,total oxidant and antioxidant capacity in cow milk,Res.Vet.Sci.89(2010)10-13.
马的伤口愈合情形的研究
所述情形为描述母马前腿的伤口愈合情况，其为在前腿的麦角区域中产生的深度创伤，当后腿在落地期间划伤前腿时产生该深度创伤。在开始施用实施例11的组合物之前，用不同的制剂保守地，不成功地治疗该创伤。
然后，用生理溶液洗涤创伤，干燥并在5天内用实施例11的组合物每天处理一次。48小时后可看到类似上皮新生的改善，96小时后伤口完全愈合。母马在几天内强烈地屈伸，而在这之后，没有观察到跛脚的情况出现，治疗完成。在实施例19中描述了这种情况的详细描述。
尽管为了更精确的结论，必须进行详细的临床研究，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本发明组合物有效地起到伤口愈合剂的作用。由于从文献中已知抗炎，抗氧化和上皮化活性对于创伤愈合过程是至关重要的，因此胶原合成的刺激，与本发明的组合物一样，连同已证明的抗微生物活性，是药理学作用谱的一部分；为了比较，参见文献参考32：
32)S.Marinotti,E.Ranzato:Propolis:a new frontier for wound healing,Burns Trauma(2015)3:9,doi 10.1186/s41038-015-0010-z.
本发明药物组合物的用途
本发明的药物组合物用于治疗人和动物的疾病和病症，包含：炎症；细菌感染；真菌感染；病毒性疾病；自身免疫疾病；功能性胃肠疾病；用于粘膜再生，烧伤治疗和伤口愈合；以及癌症疾病。
炎症及其病症包括：牙龈炎，牙周炎，喉炎，胃炎，结肠炎，痔疮，皮炎，外耳炎，鼻窦炎，鼻炎，阴道炎和乳腺炎。
本发明的药物组合物用于治疗由以下组中的细菌引起的细菌感染：
(i)革兰氏阳性菌：葡萄球菌属：金黄色葡萄球菌，MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)，MSSA(对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)，中间葡萄球菌，假中间葡萄球菌；凝结酶阴性葡萄球菌：表皮葡萄球菌，腐烂葡萄球菌，猪葡萄球菌；链球菌属：葡萄球菌属，牛链球菌，异常乳链球菌，无乳链球菌，犬链球菌，化脓链球菌，肺炎链球菌，口腔链球菌，嗜热链球菌；肽链球菌属；棒杆菌属：牛棒杆菌；化脓性隐秘菌；诺卡氏菌；枯草芽孢杆菌；蜡样芽孢杆菌；肠球菌：屎肠球菌，粪肠球菌；万古霉素抗性肠球菌(VRE)：木薯肠球菌；以及，
(ii)革兰氏阴性菌：大肠杆菌；鲍曼不动杆菌；铜绿假单胞菌；流感嗜血杆菌；霍乱沙门氏菌；小肠结肠炎耶尔森菌；肠杆菌属(阴沟肠杆菌)；克雷伯氏菌：肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌；福氏志贺氏菌；洋葱伯克霍尔德氏菌；奇异变形杆菌；变形杆菌；放线菌聚集体；以太放线菌；脆弱拟杆菌；幽门螺杆菌；大肠杆菌；空肠弯曲菌；古拉卟啉单胞菌；唾液卟啉单胞菌；齿状卟啉单胞菌；中间普氏菌；密螺旋体属；类芽孢杆菌。
此外，本发明的药物组合物用于治疗由真菌引起的真菌感染，例如：念珠菌属：白色念珠菌，杜氏念珠菌，光滑念珠菌，克鲁泽念珠菌，热带念珠菌，副伤寒念珠菌；曲霉属：黑曲霉，花色曲霉；嗜松青霉；变种拟青霉；绿色木霉；球毛壳菌；和厚皮马拉塞氏菌。
此外，本发明的组合物用于治疗由病毒引起的病毒性疾病，例如：单纯疱疹病毒(HSV)；人乳头瘤病毒(HPV)；EB病毒(EBV)；巨细胞病毒(CMV)；脊髓灰质炎病毒；甲型和乙型流感病毒；逆转录病毒；牛痘病毒；普通感冒病毒，鼻病毒，小核糖核酸病毒，人副流感病毒(HPIV)，人偏肺病毒(HMPV)，冠状病毒，腺病毒，人呼吸道合胞病毒(HRSV)，肠病毒。
或者，根据本发明的药物组合物用于治疗自身免疫性疾病，例如：银屑病，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，炎性肠病，腹腔疾病和多发性硬化。
另外，本发明的药物组合物用于治疗癌症疾病，例如：皮肤和粘膜癌，胃肠肿瘤，结肠直肠癌。
本发明的药物组合物用于治疗如下功能性胃肠疾病：食管、胃、十二指肠、小肠和结肠疾病，中枢介导的胃肠疼痛，ODDI疾病的胆囊和括约肌，肛肠疾病，儿童和青少年特异性胃肠疾病。具体地，本发明的组合物用于治疗动物的乳腺炎。
实施例
一般备注
使用Hedera公司的杨树型粗蜂胶作为初级蜂胶。乙醇(96％)和聚乙二醇200,400和600，以及粉末状大豆卵磷脂(SL)购自Fagron Cratia公司(HR)。油菜籽卵磷脂(RL)和水解油菜籽卵磷脂(HRL)购自Pfannenschmidt(DE)。脱油向日葵卵磷脂(SUL)购自Barentz(NL)。二硬脂酸铝购自Sigma-Aldrich(US)。其它起始原料均从本地供应商购买。
用于分析目的的化学纯化合物样品：对香豆酸(1；大于等于98％HPLC)，反式阿魏酸(2；99％)，咖啡酸(3；大于等于98％HPLC)，3,4-二羟基-反式肉桂酸2-苯乙酯(CAPE；4；大于等于97％的HPLC)，反式肉桂酸(5；大于等于96.5％,DC)，金黄素(6；大于等于98％HPLC，松果伞素(7；大于等于95％TLC)，高良姜素(8；大于等于95％HPLC)，芹菜素(9；大于等于99％HPLC)和山奈酚(10；大于等于90％HPLC)，其用作定量分析标准，用于测定它们在液体蜂胶提取物中的定量含量，其购自Sigma-Aldrich(US)公司。
术语“室温”是指20-25℃的温度区间。缩写“min“表示分钟。产率(理论产率的百分比)表示为相对于起始提取溶剂(乙醇，PEG，乙醇+卵磷脂，PEG+卵磷脂)的质量，分离的液体蜂胶提取物的重量(％w/w)。
液体蜂胶提取物中活性物质1-10的定量含量用质量浓度(γ)表示，单位为微克每毫升[μg/ml]，在本发明的药物组合物中，以微克/克最终产品(剂型)[μg/g]表示其定量组成：。
实施例1以96％乙醇为提取溶剂制备液体蜂胶提取物
提取前的蜂胶预处理：将粗蜂胶(杨树型；1kg)的样品在-20℃的冰箱中冷冻至少1小时。然后在研磨机中研磨样品。
用96％乙醇提取：向研磨的蜂胶(30.00g)中加入乙醇(96％；70.00g)。将获得的混合物在室温下放置72小时，同时周期性地搅拌。然后，混合物通过滤纸(黑带)过滤，得到60.00g(85.7％)液体蜂胶提取物，其为深棕色溶液，具有轻微浓郁的蜂胶气味。
为了测试实施例10中所述的醇蜂胶提取物的最小抑制浓度(MIC)，以药物与提取物(DER)比1：2重复相同的步骤。
实施例2使用聚乙二醇400作为提取溶剂制备液体蜂胶提取物
将其预处理如实施例1所述的研磨的蜂胶(30.00g)与聚乙二醇400(PEG400；70.00g)混合。将获得的混合物在室温下放置72小时，同时周期性地搅拌。然后，混合物通过滤纸(黑带)过滤，产生55.00g(78.6％)深棕色粘稠液体形式的液体蜂胶提取物，具有类似蜂胶的轻微浓郁气味。
为了测试实施例10中所述的聚乙二醇蜂胶提取物的最小抑制浓度(MIC)，以药物与提取物(DER)比1：2重复相同的步骤。
实施例3一种定量测定液体蜂胶提取物中活性物质1-10的HPLC分析方法通过高效液相色谱(HPLC)进行定量分析，该方法专门开发用于监测来自蜂胶的关键活性物质1-4和伴随的活性成分5-10。
通过用乙醇：水＝75：25的混合物稀释至100μg/ml来制备市售活性物质1-10标准品的样品以供分析。
在分析之前，将本发明的液体蜂胶提取物(100pL)的样品用乙醇：水＝75：25，V/V(900pL)以1:10w/w(十倍稀释比)的混合物进行稀释。
在装有自动取样器，泵，脱气器，柱式烘箱和UV-VIS检测器的岛津LC201CHT仪器上，在以下条件下进行分析：
(i)色谱柱：Ascentis Express；C18；尺寸:15cm×3.0mm；柱中颗粒的直径:2.7pm；
(ii)流动相:A＝0.1％甲酸水溶液，B＝甲醇；洗脱梯度:0min，80％A，20％B；3min，70％A，30％B；60min，20％A，80％B；90min，20％A，80％B；100min，70％A，30％B；105min，80％A，20％B；
(iii)柱温:30℃；
(iv)流量:0.25ml/min；
(v)分析时间：110min；
(vi)在UV-VIS检测器上的波长：用于检测:370nm，用于积分:290nm；
(vii)注射体积:10pl；
(viii)压力：210-290bars。
在上述条件下，关键活性物质1-4和伴随的成分5-10具有以下保留时间(tR)：
(i)TR[对香豆酸(1)]＝14.13min；TR[反式阿魏酸(2)]＝15.31min；
TR[咖啡酸(3)]＝10.57min；TR[3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯；
CAPE(4)]＝48.62min；
(ii)TR[反式肉桂酸(5)]＝29.76min；TR[白杨素(6)]＝44.68min；
TR[松柏素(7)]＝47.39min；TR[高良姜素(8)]＝49.94min；
TR[芹菜素(9)]＝37.72min；TR[山萘酚(10)]＝36.87min。
关键蜂胶活性物质1-4和伴随的活性成分5-10的保留时间列于表1。
实施例4使用基于乙醇和卵磷脂混合物的提取溶剂制备标准化液体蜂胶提取物
磨碎蜂胶，其预处理如实施例1所述，将30.00g该蜂胶与以下组合物的提取溶剂混合(实验EL-8)：
E1:96％乙醇(67.00g；95.7％)和大豆卵磷脂(SL；3.00g；4.3％)；
E2:96％乙醇(60.00g；85.7％)和大豆卵磷脂(SL；10.00g；14.3％)；
E3:96％乙醇(50.00g；74％)和大豆卵磷脂(SL；20.00g；28.6％)；
E4:96％乙醇(40.00g；57.1％)和大豆卵磷脂(SL；30.00g；42.9％)；
E5:96％乙醇(67.00g；98.9％)和油菜籽卵磷脂(RL；3.00g 25％-制剂；0.75g卵磷脂1.1％)；理论产量E5＝67g乙醇+0.75g卵磷脂＝67.75g；
E6:96％乙醇(60.00g；96.0％)和油菜籽卵磷脂(RL；10.00g 25％-制剂；2.50g卵磷脂；4.0％)；理论产量E6＝60g乙醇+2.50g卵磷脂＝62.50g；
E7:96％乙醇(67.00g；97.8％)和水解油菜籽卵磷脂(HRL；3.00g 50％-制剂；50g水解油菜籽卵磷脂；2.2％)；理论产量E7＝67g乙醇+1.50g卵磷脂＝68.50g；
E8:96％乙醇(60.00g；92.3％)和水解油菜籽卵磷脂(HRL；10.00g 50％-制剂；5.00g卵磷脂；7.7％)；理论产量E8＝60g乙醇+5.00g卵磷脂＝65.00g。
将获得的混合物在室温下搅拌1小时，并在室温下静置72小时，同时周期性地搅拌。然后，混合物通过滤纸(黑带)过滤，产生50-60g(71.0-85.7％)液体蜂胶提取物，其为深棕色粘稠液体，具有类似蜂胶的轻微浓郁气味。
根据实施例3中所述的分析方法，对如此制备的初级液体蜂胶提取物进行了关键活性物质1-4和伴随成分5-10的含量的定量分析。结果列于表3和4中。
在实验E1-E8中所述的提取溶剂(ES)中制备的初级液体蜂胶提取物，其中活性物质的量含量为1-4，用在提取步骤中使用的相同ES稀释标准化，直到根据本发明的活性物质1-4的定量组合物的所需水平。
实施例5使用基于聚乙二醇400和卵磷脂混合物的提取溶剂制备标准化液体蜂胶 提取物
磨碎蜂胶，其预处理如实施例1所述，将30.00g该蜂胶与以下组合物的提取溶剂混合(实验E1-E8)：
EL：聚乙二醇400(PEG400；67.00g；97％)和大豆卵磷脂(SL；3.00g；3％)；
E2：聚乙二醇400(PEG400；60.00g；90％)和大豆卵磷脂(SL；10.00g；10％)；
E3:聚乙二醇400(PEG400；67.00g；98.9％)和油菜籽卵磷脂(RL；3.00g 25％-制剂；0.75g卵磷脂；1.1％)；理论产量E3＝67g PEG 400+0.75g卵磷脂＝67.75g；
E4:聚乙二醇400(PEG400；60.00g；96.0％)和油菜籽卵磷脂(RL；10.00g 25％-制剂；2.50g卵磷脂；4.0％)；理论产量E4＝60g PEG 400+2.50g卵磷脂＝62.50g；
E5:聚乙二醇400(PEG400；67.00g；97.8％)和水解油菜籽卵磷脂(HRL；3.00g50％-制剂；50g水解卵磷脂；2.2％)；理论产量E5＝67g PEG 400+50g卵磷脂＝68.50g；
E6:聚乙二醇400(PEG400；60.00g；92.3％)和水解油菜籽卵磷脂(HRL；10.00g50％-制剂；5.00g卵磷脂；7.7％)；理论产量E6＝60g PEG 400+5.00g卵磷脂＝65.00g。
将获得的混合物在室温下搅拌1小时，并在室温下静置72小时，同时周期性地搅拌。然后，混合物通过滤纸(黑带)过滤。产生45-55g(69.0-78.6％)的液体蜂胶提取物，其形式为深棕色粘稠液体，具有类似蜂胶的轻微浓郁气味。
根据实施例3中所述的分析方法，对如此制备的初级液体蜂胶提取物进行了关键活性物质1-4和伴随成分5-10的含量的定量分析。结果列于表5和6中。
在实验E1-E6中所述的提取溶剂(ES)中制备的这种初级液体蜂胶提取物，用提取步骤中使用的相同ES稀释，使活性物质1-4的已知定量含量标准化，直到根据本发明的活性物质1-4的定量组合物的所需水平。
实施例6使用基于聚乙二醇200和大豆卵磷脂混合物的提取溶剂制备标准化液体 蜂胶提取物
磨碎蜂胶，其预处理如实施例1所述，将30.00g该蜂胶与萃取溶剂混合，其中萃取溶剂为聚乙二醇200(149.85g；99.9％)和大豆卵磷脂(SL；0.15g；0.1％)。将获得的混合物在室温下搅拌1小时，并在室温下静置48小时，同时周期性地搅拌。然后，混合物通过滤纸(黑带)过滤。可得到137.00g(93％)深褐色粘稠液体形式的液体蜂胶提取物，具有类似蜂胶的轻微浓郁气味。
然后，根据实施例3中所述的方法进行定量HPLC分析，以获得关键活性物质1-4的定量含量。滤液用相同的提取溶剂稀释，其中聚乙二醇200和大豆卵磷脂(SL)的混合物的混合比例为99.9:0.1w/w，根据本发明标准化液体提取物的规格，可以获得最高水平的活性物质1-4。
实施例7使用基于聚乙二醇600和脱油向日葵卵磷脂混合物的提取溶剂制备标准 化液体蜂胶提取物
磨碎蜂胶，其预处理如实施例1所述，将30.00g该蜂胶与萃取溶剂，聚乙二醇600(PEG600；297，00g；99％)和脱油向日葵卵磷脂(SUL；3.00g；0％)的混合物混合。将获得的混合物加热至70℃并强烈搅拌3小时。然后将混合物冷却至室温，并通过滤纸(黑带)过滤。得到2600g(87.0％)深棕色粘稠液体形式的液体蜂胶提取物，具有类似蜂胶的轻微浓郁气味。
然后，根据实施例3中所述的方法进行定量HPLC分析，由此测定关键活性物质1-4的定量含量。滤液用相同的提取溶剂稀释，即聚乙二醇600和去油向日葵卵磷脂(SUL)的混合物，其比例为99:1w/w，根据本发明标准化液体提取物的规格，可以获得最高水平的活性物质1-4。
实施例8使用基于聚乙二醇200，聚乙二醇600和水解油菜籽卵磷脂的混合物的提 取溶剂制备标准化液体蜂胶提取物
磨碎蜂胶，其预处理如实施例1所述，将30.00g该蜂胶与提取溶剂，聚乙二醇200(PEG200；150.00g；50％)，聚乙二醇600(139.50g；46.5％)和水解油菜籽卵磷脂(HRL；10.50g；3.5％)的混合物混合。将获得的混合物在强烈搅拌下于100℃加热3小时。然后将混合物冷却至室温，并通过滤纸(黑带)过滤。得到245.00g(81.7％)深棕色粘稠液体形式的液体蜂胶提取物，具有类似蜂胶的轻微浓郁气味。
然后，根据实施例3中所述的方法进行定量HPLC分析，由此测定关键活性物质1-4的定量含量。滤液用相同的提取溶剂稀释，聚乙二醇200，聚乙二醇600和水解油菜籽卵磷脂(HRL)的混合物，50:46.5:3.5，w/w/w，根据本发明标准化液体提取物的规格，可以获得最高水平的活性物质1-4。
实施例9使用聚乙二醇400和大豆卵磷脂混合物制备标准化液体蜂胶提取物
磨碎蜂胶，其预处理如实施例1所述，将30.00g该蜂胶与提取溶剂，聚乙二醇400(PEG400；87.30g；97％m/m)和大豆卵磷脂(SL；2.70g；3％w/w)的混合物混合。得到的混合物在周期性搅拌下静置浸渍72小时。然后，混合物通过滤纸(800孔隙/cm2)，得到50-55g深褐色粘稠液体，具有类似蜂胶的强烈气味。用相同的提取溶剂稀释得到的产物，直到质量达到60.00g。以这种方式，得到药物与提取物(DER)比为1：2的所得提取物，或者，从30g起始蜂胶中得到所述60g提取物。
对于本发明的药物组合物制剂而言，制备的液体蜂胶提取物是：
(i)根据实施例3中所述的方法进行定量HPLC分析，以确定活性物质1-4，并以此通过前述方式制备的提取物中活性物质1-4的实际质量浓度，
(ii)将纯(新鲜)溶剂混合物稀释标准化：聚乙二醇400(97％w/w)和大豆卵磷脂(3％w/w)；直到达到活性物质1-4的质量浓度：
(i)对香豆酸(1)；10-1300μg/ml；
(ii)反式阿魏酸(2)；10-800μg/ml；
(iii)咖啡酸(3)；5-300μg/ml；以及，
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4；CAPE)；5-400μg/ml；
除以因子X/100，其中X＝药物组合物制剂中，所述标准化液体蜂胶提取物的重量百分比％，w/w。
实施例10 本发明标准化液体提取物的抗微生物功效的测定，对模型病原微生物 的最小抑制浓度(MIC)的测定
测定本发明标准化液体蜂胶提取物的最小抑制浓度(MIC)，根据美国临床实验室标准化协会和欧洲抗生素敏感性试验委员会方法的说明，使用来自实施例9的产物，与用96％乙醇(来自实施例1的产物)或PEG400(来自实施例2的产物)获得的类似液体蜂胶提取物相比。参见文献参考文献26-29。
在体外条件下，对下列模型病原微生物(M)的ATCC菌株进行抗微生物效力测试：金黄色葡萄球菌ATCC 29293(M1)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MRSA(MFBF Collection；M2)；对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌；MSSA(MFBF Collection；M3)；粪肠球菌ATCC 9212(M4)；粪肠球菌(MFBF Collection)(M5)；大肠杆菌ATCC 10536(M6)；鲍曼不动杆菌ATCC43498(M7)；铜绿假单胞菌ATCC 9027(M8)；和白色念珠菌ATCC 90028(M9)。
进行连续的微量稀释过程以确定提取物的最小抑制浓度(MIC)。从亲本培养物在PBS缓冲液(pH7.4)中制备细胞悬浮液，并通过浊度法将其调节至0.5McFarland单位。测试在96孔微量滴定板中以100-0.7125μg/ml的范围连续稀释进行，加入100pl溶解在米勒辛顿肉汤中的蜂胶提取物溶液。培育后100pl的每种细菌培养物调节至105CFU/mL。然后将平板在37℃下培养24小时。MIC通过在每个单井中加入10pl 0.5mg/ml的2,3,5-三苯基-2H-四唑鎓氯化物(TTC；氧化还原指示剂)溶液来测定，并且在30℃温育4小时后，通过分光光度法在波长490nm处测定吸光度。
MIC值确定为发生80％细菌减少时的蜂胶提取物浓度(MIC80)；
对于真菌种类，通过与细菌相同的方案，在添加葡萄糖的RPMI培养基中测定MIC值。孵育后(48h，37℃，需氧条件，黑暗中)，加入XTT(氧化还原指示剂)与甲萘醌组合，在波长540nm通过分光光度法测定吸光度。
MIC值作为发生80％细菌或真菌减少的蜂胶提取物浓度测定(MIC80)；
阴性对照仅含有培养基和溶剂(未添加微生物和蜂胶)，而阳性对照暴露于抗生素或抗真菌剂的影响。
通过体外测定蜂胶溶液的抗微生物活性，测量最小抑制浓度(MIC80)，并以液体提取物在给定溶剂中的稀释(％)形式显示在表9中。以药物与提取物(DER)重量比1：2获得起始液体蜂胶提取物，即实施例9的产品。如果液体提取物的稀释度较大，即MIC活性物质1-10的浓度较低，则所得到的测试提取物的抗菌效果较高。
上述结果列于表9。
在表10-15中，给出了每种特定活性物质1-10的质量浓度( )(以[μg/ml]为单位表示)的计算值，其中每种特定提取物都达到了MIC。用以下提取溶剂获得提取物：96％乙醇(即实施例1的产物)，聚乙二醇400(PEG400；即实施例2的产物)，以及PEG400(97％w/w)和大豆卵磷脂(3％w/w)的混合物(即实施例9的产物)。这些是从DER为1：2的初级液体提取物中测定的；萃取以达到相应MIC的稀释度(因子)。
实施例11用至少150μg/g活性物质1-4以用于乳房内施用的溶液的形式制备本发 明的组合物
制剂(针对100g溶液)：
---------------------------------------------------------------------
(1)50.00g(50.00％w/w)根据本发明的液体蜂胶提取物，来自实施例9的产品，以最低300μg/mL活性物质1-4标准化
(2)50.00g(20.00％w/w)聚乙二醇400
---------------------------------------------------------------------
制备：在室温下搅拌5分钟将成分(1)和(2)混合并均质化。将溶液通过滤纸过滤并以4-8g的量填充到乳房内注射器中。
溶液组成：活性物质1-4具有最低150μg/g总浓度。HPLC的定量分析结果见表16中，而相应的典型HPLC色谱图见图5。
实施例12.制备含有至少100μg/g浓度的活性物质1-4的本发明组合物的乳房内施 用悬浮液
制剂(针对100g悬浮液)：
---------------------------------------------------------------------
(1)77.00g(77.00％w/w)本发明的液体蜂胶提取物，来自实施例9的产品，以最低150μg/mL活性物质1-4标准化
(2)20.00g(20.00％w/w)聚乙二醇4000
(3)3.00g(3.00％w/w)二硬脂酸铝
---------------------------------------------------------------------
制备：将聚乙二醇(2)在60℃下熔融，加入二硬脂酸铝(3)并在该温度下均化15分钟。然后，在搅拌下冷却混合物，并在40-45℃下加入蜂胶提取物(1)。在一边搅拌一边将混合物进一步冷却至室温，并另外在室温下均化15分钟。得浅黄色粘性悬浮液，每4-8g填充到乳房内注射器中。
悬浮液组成：最低总浓度为100μg/g的活性物质1-4
实施例13.制备含有最低250μg/g活性物质1-4的本发明组合物的凝胶剂制剂
制剂(针对100g凝胶)：
---------------------------------------------------------------------
(1)30.00g(30.00％w/w)本发明的液体蜂胶提取物，来自实施例9的产品，以最低850μg/mL活性物质1-4标准化
(2)2.00g(2.00％w/w)卡波姆940
(3)1.00g(1.00％w/w)聚山梨醇酯60
(4)0.20g(0.20％w/w)山梨酸钾
(5)0.30g(0.30％w/w)苯甲酸钠
(6)0.30g(0.30％w/w)无水柠檬酸
(7)适量氢氧化钠(20％溶液)
(8)加100％纯净水至100％
---------------------------------------------------------------------
制备：向30g本发明的液体蜂胶提取物中加入(2)并在室温下搅拌均化20分钟。然后，加入50g纯化水(8)，并通过在室温下搅拌均化5分钟。之后，加入成分(3-6)并搅拌10分钟溶解。然后，用(7)将pH值调节至5.5-6。向由此获得的凝胶中加入剩余量的纯净水，达到100g总质量，并通过在室温下搅拌15分钟均化，最终使产物脱气。
凝胶组合物：最低总浓度为250μg/g的活性物质1-4
实施例14制备具有最低100μg/g活性物质1-4的本发明组合物的乳膏剂
制剂(针对100g乳膏)：
---------------------------------------------------------------------
(1)20.00g(20.00％w/w)本发明的液体蜂胶提取物，来自实施例9的产品，以最低500μg/mL活性物质1-4标准化
(2)5.00g(5.00％w/w)聚山梨醇酯60
(3)5.00g(5.00％w/w)羊毛脂，无水
(4)2.00g(2.00％w/w)蜂蜡，白色
(5)8.00g(8.00％w/w)鲸蜡醇
(6)8.00g(8.00％w/w)凡士林，白色
(7)10.00g(10.00％w/w)矿物油，稠的
(8)0.20g(0.20％w/w)4-氯-间甲酚
(9)加100％纯净水至100％
---------------------------------------------------------------------
制备：将成分(2-7)的混合物在65-70℃下熔化15-20分钟直至形成几乎无色的油性液体，以此来制备油相。将(8)和(1)溶解在纯化水中，随后在搅拌下加热至65-70℃来制备水相。然后，将水相缓慢加入油相中，充分混合，优选使用能够在15-20分钟内以1,000-3,000转/分钟(r.p.m.)进行高剪切均化的均化器。在30分钟内将如此获得的乳液在65℃-20℃的温度下3进一步剧烈搅拌并逐渐冷却。
乳膏组合物：最低总浓度为100μg/g的活性物质1-4
实施例15制备具有最低500μg/g活性物质1-4的本发明组合物的软膏剂
制剂(针对100g软膏)：
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(1)50.00g(50.00％w/w)本发明的液体蜂胶提取物，来自实施例9的产品，以最低1,000μg/mL活性物质1-4标准化
(2)10.00g(10.00％w/w)聚乙二醇400
(3)40.00g(40.00％w/w)聚乙二醇4000
---------------------------------------------------------------------
制备：将成分(1-3)小心混合并加热至60℃，通过搅拌均化5分钟并在混合下逐渐冷却至室温。
软膏组合物：最低总浓度为500μg/g的活性物质1-4。
实施例16制备具有最低50μg/g活性物质1-4的本发明组合物的鼻喷雾剂
制剂(针对100g喷雾溶液)：
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(1)5.00g(5.00％w/w)根据本发明的液体蜂胶提取物，来自实施例9的产品，以最低1,000μg/mL活性物质1-4标准化
(2)0.60g(0.60％w/w)氯化钠
(3)0.10g(0.10％w/w)聚山梨醇酯60
(4)0.10g(0.10％w/w)山梨酸钾
(5)0.10g(0.10％w/w)苯甲酸钠
(6)0.20g(0.20％w/w)柠檬酸，无水
(7)0.01g(0.01％w/w)乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA·2H2O)
(8)加100％纯净水至100％
---------------------------------------------------------------------
制备：向90g纯化水(1)中加入成分(2-7)并在室温下搅拌溶解15分钟。然后，加入(1)并将混合物在室温下均化15分钟。之后，将溶液通过无菌0.2μm过滤器过滤，并填充到配备有封闭件和喷雾泵的合适的无菌瓶中用于鼻部施用。
溶液组成：最低总浓度为50μg/g的活性物质1-4。
实施例17实施例11的乳房内溶液形式的本发明组合物在乳牛乳腺炎治疗中的抗 炎活性的研究
在五个荷斯坦奶牛农场进行了奶牛乳房炎治疗的研究。共有86头奶牛或339个乳房部分参与了研究，其中以乳房部分作为统计单位。将动物自由地保持在厚铺窝中，并在不添加抗生素的情况下用标准的奶牛预混料喂养。该研究得到了兽医伦理委员会的批准。包括没有乳腺炎临床症状且体细胞计数(SCC)低于200,000/mL的健康动物和区域，以及SCC高于200,000/mL的感染区域。在地形条件下，通过乳房内(i.mam.)施用溶液形式的本发明的组合物进行安全性和功效的随机交叉临床研究。在早晨挤奶期间、晚上挤奶期间和早晨挤奶之后的第二天将来自实施例11的本发明的组合物在奶牛乳房部分的所有四分之一处施用三次。首先，测试组合物在乳房内施用中的耐受性。监测奶牛行为的变化，以及乳房的宏观外观(水肿和发红)、乳汁和乳房对触摸的敏感性。从第一次乳房内(i.mam.)施用之前的时期开始监测乳中体细胞计数(SCC)的变化。将组合物施用于第一次应用开始计算的第二天。根据SCC是否高或低于200,000/mL，以及样品对于细菌学调查是阳性还是阴性，对乳样品以及乳区进行分组；参见参考文献33：
33)European Medicines Agency(1992):Local Tolerance of IntramammaryPreparations in Cows.Directive 81/852/EEC.
然后，根据欧洲医药机构(EMA)的指导，用蜂胶组合物进行细菌治疗的功效测试，这是i.mam的唯一功效量度。治疗亚临床乳腺炎的制剂。它被定义为在i.mam后的某些时间段内收集的乳样品中不存在先前确认的病原体。施用给定制剂；参见参考文献34：
34)European Medicines Agency(2017):Guideline on the conduct ofefficacy studies for intramammary products for use in cattle.CVMP.EMA/CVMP/344/1999-Rev.2.
采用标准方法进行乳取样。按照标准进行微生物调查；参见参考文献35：
35)J.W.Hogan:Laboratory handbook on bovine mastitis.National MastitisCouncil(1999)Madison,Wisconsin,SAD.
奶牛乳腺炎的细菌愈合结果见表17。
实施例18实施例11的乳房内溶液形式的本发明组合物在山羊乳腺炎治疗中的抗 炎活性研究
对25只诊断为左半乳和右半乳的亚临床乳腺炎的山羊进行了山羊乳腺炎治疗的研究。将羊乳的微生物调查呈阳性的山羊分成两组：一组施用本发明实施例11的组合物，而另一组施用阿莫西林和克拉维酸(克罗地亚
Figure GDA0003216979160000511
属)的乳房内悬浮液；全部采用三次施用方案给药。
在应用实施例11的组合物i.mam后平行监测乳房半体的耐受性和细菌学治愈。用抗生素或来自实施例11的组合物通过三次(两天)方案一起给药。
在研究期间，将山羊保持在深垫料的畜栏中。有170只处于哺乳期的山羊，在持续约300天的一次哺乳期期间，每只山羊平均泌乳产量为500-600kg。根据需要给它们饲喂干草，每只山羊最少2kg，并且饲喂含有16％蛋白质的预混物，每只山羊约1kg；分为早晨和晚上挤奶两部分。将2％维生素-矿物质预混物
Figure GDA0003216979160000512
(Sano Company,Croatia)加入预混物中。将在细菌学检查中呈阳性的羊乳的山羊分成两组：一组(处理的半数，N＝20)，施用来自实施例11的组合物；而在另一组(N＝15)中，施用阿莫西林与克拉维酸(/>
Figure GDA0003216979160000513
全部采用三次施用方案。
在测试来自实施例11的组合物的耐受性期间，既没有观察到任何山羊的行为变化，也没有观察到乳房的宏观外观(水肿和发红)和乳汁变化，也没有观察到乳房对触摸的敏感性。在对前几次挤奶之后，在预先标记的无菌塑料管中对来自左半乳和右半乳的奶样品进行取样。在第一次施用自实施例11的制剂之前、在第一次施用后12小时、在第一次施用后24小时和第一次施用后7天取样。在将乳样品保持在4℃直至第二天，并在克罗地亚兽医研究所的实验室中分析乳腺炎和原乳质量。
根据欧洲药物管理局(European Medicinal Agency，EMA)的指导进行细菌治疗功效测试；参见参考文献34。通过标准方法进行取乳，按照标准程序进行微生物检查；参见参考文献35。
山羊乳腺炎的细菌学治疗结果见表18。
本例描述了雌性马前腿伤口愈合的情况。当母马向下跳时，其后腿踩住了前腿，在前腿的麦角区域产生了深度创伤。在开始施用来自实施例11的组合物之前，用不同的制剂保守治疗伤口未成功。
伤口是在母马舞动过程中形成的，当母马跳跃时，其后腿过伸踩到前腿。然后，蹄的头部和后腿的马蹄形损伤前脚的关节区域。这产生了尺寸为2×4cm的椭圆形伤口。马在受伤后立即表现出跛行的迹象，评分为4/5(美国马从业人员协会)。受伤后立即将伤口剃毛并用普通冷水冲洗，然后用碘(聚维酮碘，0.01％)处理并用硝酸银喷雾剂喷雾。闭合伤口以避免感染性污染。由于母马已经接种了破伤风疫苗，因此不应用TAT血清处理。使母马静置两周，每天通过机械清洁处理伤口并保持清洁和干燥。用碘和硝酸银喷雾处理伤口，每次48小时。5天后，伤口开始愈合并且变好。然后，开始用锌-维生素软膏治疗伤口。两周后，让母马继续工作。然而，一旦母马开始舞动，伤口就开始出血。伤口再次用碘消毒，并且施用用于乳房内施用的制剂中的头孢菌素的局部抗生素
Figure GDA0003216979160000521
在机械伤口清洁的同时，用抗生素再局部处理5天。然后，尝试让母马继续工作，伤口再次开始出血。
之后，用生理溶液洗涤伤口，干燥，并用实施例11的组合物处理，每天一次，持续5天。48小时后可以观察到上皮化可见的改善，而96小时后伤口完全愈合。母马仅在前几天内跛行，但之后没有观察到跛行的迹象。母马恢复完毕。
结论
实验结果表明，与纯溶剂(如96％乙醇、PEG 400或EtOH和相同卵磷脂的混合物)相比，液体聚乙二醇(PEG)(如PEG 400)与提取溶剂(ES)的0.1-3.5％质量的卵磷脂组合的特定混合物以出乎意料的方式有效地和化学选择性地提取到蜂胶中的活性物质对香豆酸(1)、反式阿魏酸(2)、咖啡酸(3)和2-苯乙基3,4-二羟基-反式肉桂酸酯(4)。
通过使用本发明建立的合适的HPLC分析方法，精确定量测定蜂胶初级液体提取物中关键活性物质1-4和伴随成分5-10。然后，用与提取步骤中相同的提取溶剂(ES)标准化这样的初级提取物。从而得到本发明的液体蜂胶提取物，其具有已知和标准化浓度的关键活性物质1-4。由此制备的标准化蜂胶提取物用作活性药物成分(API)、活性化妆品成分(ACI)、或用于制造功能性食品和食品补充剂的食品成分。
本发明的组合物基于所述液体蜂胶提取物得到，含有关键活性物质对香豆酸(1；10-1,300μg/g)、反式阿魏酸(2；10-800μg/g)、咖啡酸(3；5-300μg/g)和2-苯乙基3，4-二羟基-反式-肉桂酸酯(4；5-400μg/g)，是治疗炎性疾病、细菌感染、真菌感染、病毒性疾病、自身免疫疾病、功能性胃肠紊乱、粘膜再生、治疗烧伤和伤口愈合以及治疗癌症疾病的有效试剂。
工业适用性
由于液体蜂胶提取物和基于其的药物组合物的广泛实际应用，本发明的工业实用性是显而易见的。

Claims (22)

1.一种作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其组成为：
(A)干燥蜂胶提取物；0.1-10.0％w/w；以及
(B)提取溶剂；90.0-99.9％w/w；
以下混合物作为用于制备液体蜂胶提取物的提取溶剂：
(B.l)一种或多种液体聚乙二醇(PEG)200-600；
96.5-99.9％w/w；以及
(B.2)卵磷脂或水解卵磷脂；0.1-3.5％w/w；
其中所述液体蜂胶提取物依据如下标准化：
(i)作为药物的粗蜂胶与最终提取物的质量百分比为：1:2～1:20w/w；以及
(ii)蜂胶活性物质的质量含量，所述蜂胶活性物质包括对香豆酸(1)，反式阿魏酸(2)，咖啡酸(3)和3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4):
Figure FDA0004232982590000011
其中四种所述活性物质中至少两种的质量组成如下：
(i)对香豆酸(1)；100-1300ug/ml；
(ii)反式阿魏酸(2)；75-800ug/mL；
(iii)咖啡酸(3)；25-300ug/mL；以及
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4，CAPE)；40-400ug/mL。
2.如权利要求1所述的作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其中所述液体聚乙二醇(PEG)选自：聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400，聚乙二醇600，或这些物质的混合物。
3.如权利要求2所述的作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其中所述液体聚乙二醇(PEG)选自：聚乙二醇200，聚乙二醇400，或这些物质的混合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其中卵磷脂或水解卵磷脂的特征在于亲水性-亲油性平衡因子为2-12，并且选自以下成分：大豆卵磷脂(Glycine max L)；向日葵卵磷脂(Helianthus annus L)；油菜籽卵磷脂(Brassica napus L)；油菜卵磷脂(Brassica rapa L)；蛋鸡卵磷脂(Gallusgallusdomesticul L)；所述卵磷脂的脱油产物；所述来源的氢化卵磷脂；上述卵磷脂的水解卵磷脂；上述卵磷脂的酶修饰衍生物；或这些物质的混合物。
5.一种如权利要求4所述的作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其中卵磷脂选自：来源于大豆、向日葵、油菜籽或油菜的天然卵磷脂、脱油卵磷脂、氢化卵磷脂、水解卵磷脂或酶修饰的卵磷脂；或这些物质的混合物。
6.如权利要求5所述的作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其中所述提取溶剂包括：
(i)聚乙二醇(PEG)200，聚乙二醇300，聚乙二醇400或它们的混合物；97～99％w/w；以及
(ii)来源于大豆、向日葵、油菜籽或油菜的天然卵磷脂、脱油卵磷脂、氢化卵磷脂、水解卵磷脂或酶修饰的卵磷脂；或这些物质的混合物；1-3％w/w。
7.如权利要求1-3中任一项所述的作为药物，化妆品或农用化学品或食品成分的液体蜂胶提取物，其中所述液体蜂胶提取物标准化如下：
(i)作为药物的粗蜂胶与最终提取物的质量百分比为1:3～1:5w/w；以及
(ii)蜂胶活性物质的质量含量，所述蜂胶活性物质包括对香豆酸(1)，反式阿魏酸(2)，咖啡酸(3)和3,4-二羟基反式肉桂酸-2苯乙酯(4)；
其中四种所述关键活性物质中至少两种的质量组成如下：
(v)对香豆酸(1)；100-1300ug/ml；
(v i)反式阿魏酸(2)；75-800ug/mL；
(vii)咖啡酸(3)；25-300ug/mL；以及
(viii)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4，CAPE)；40-400ug/mL。
8.如权利要求1-7中任一项的液体蜂胶提取物的制备方法，包括以下步骤：
(i)在-20℃下冷却粗蜂胶至少1小时；
(ii)将冷冻的蜂胶研磨，过筛1-8mm的孔；
(iii)在以下条件下采用提取溶剂提取粗蜂胶：
(a)粗蜂胶与提取溶剂的重量比为1:2～1:20w/w；
(b)提取温度为10-150℃；以及
(c)提取时间为5分钟至72小时；
(iv)将上述条件获得的混合物通过具有100pm-5pm孔的过滤器过滤，产生未溶解的残留物和液体蜂胶提取物；
(v)采用高效液相色谱对关键活性蜂胶物质1-4进行定量分析；以及
(vi)用步骤(v)中确定的关键活性物质1-4的精确定量组成标准化所得的液体蜂胶提取物，用步骤(iii)中使用的新鲜提取溶剂稀释，使活性物质1-4达到所需的含量。
9.一种权利要求1-7任一项的液体蜂胶提取物的制备方法，其中提取步骤(iii)在以下条件下进行：
(a)粗蜂胶与提取溶剂的重量比为1:3～1:5w/w；(b)提取温度为15-70℃；以及
(c)提取时间为1-24小时。
10.如权利要求8和9所述的液体蜂胶提取物的制备方法，其中高效液相色谱方法用于定量测定关键活性物质1-4，色谱条件如下：
(i)层析柱：Ascentis Express；C18；尺寸：15cm×3.0mm；柱中颗粒的直径:2.7μm；
(ii)流动相:A为0.1％甲酸水溶液，B为甲醇；洗脱梯度:0分钟，80％A，20％B；3分钟，70％A，30％B；60分钟，20％A，80％B；90分钟，20％A，80％B；100min，70％A，30％B；105min，80％A，20％B；
(iii)柱温:30℃；
(iv)流速:0.25ml/min；
(v)分析时间：110分钟；
(vi)在UV-VIS检测器上的波长：用于检测的波长:370nm，用于的积分波长:290nm；
(vii)进样体积:10pl；
(viii)压力：210-290bars。
11.如权利要求1-7中任一项的标准化液体蜂胶提取物的用途，其中所述提取物作为活性成分或赋形剂，且用于生产抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027的药物或治疗剂的药物产品。
12.权利要求1-7中任一项的标准化液体蜂胶提取物的用途，其中所述提取物作为活性成分或赋形剂，且用于生产抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027的化妆品。
13.权利要求1-7中任一项的标准化液体蜂胶提取物的用途，其中用作活性药物成分或赋形剂，用于生产抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027的兽药产品，动物饲料或动物饲料添加剂。
14.权利要求1-7中任一项的标准化液体蜂胶提取物的用途，其作为农用化学品活性成分或赋形剂，用于生产抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC9027的农业化学产品，其中所述农业化学产品选自：杀真菌剂，杀菌剂，杀病毒剂，杀虫剂，杀线虫剂和植物增强剂。
15.一种药物组合物，包括：
(i)权利要求1-7中任一项的液体蜂胶提取物；5-95％w/w；以及，
(ii)一种或多种制备如下剂型所需的药用赋形剂，该剂型选自：溶液，悬浮液，凝胶，乳膏，软膏，口服或鼻用喷雾剂；直到100％w/w的最终组合物；其中
所述组合物的特征在于至少四种关键活性蜂胶物质中的两种的定量含量在以下值内：
(i)对香豆酸(1)；100-1300ug/ml；
(ii)反式阿魏酸(2)；75-800ug/mL；
(iii)咖啡酸(3)；25-300ug/mL；以及
(iv)3,4-二羟基-反式-肉桂酸苯乙酯(4，CAPE)；40-400ug/mL。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述药物赋形剂选自：稀释剂，湿润剂，防腐剂，螯合剂，抗氧化剂，增稠剂，润肤剂，乳化剂，表面张力剂和pH调节剂。
17.根据权利要求15和16的药物组合物的制备方法，其中它包括以下步骤：
(i)向稀释剂中加入权利要求1-7中任一项的标准化液体蜂胶提取物，并使其均质化；
(ii)加入一种或多种其它赋形剂；并将它们均质化；
其中步骤(i)和(ii)在10-100℃的温度下，优选在20-60℃的温度下，在1-5分钟内进行；进一步的，制备剂型的条件为:
(iii.a)溶液或喷雾用溶液；将最终得到的溶液过滤，如有必要采用无菌过滤；
(iii.b)凝胶或悬浮液；加入增稠剂，均质；
(iii.b)乳膏；油相的制备方法为：将润肤剂和乳化剂混合并在50-80℃下均质，在1-15分钟内，加入步骤(ii)的溶液，加热至50-80℃，然后在50-80℃，优选55-65℃下，1-30分钟内用高剪切或高压均质机乳化，随后在65-20℃，10-120分钟内均质；或
(iii.b)软膏；在5-30分钟内，50-70℃，将步骤(ii)的溶液与先前均质的润肤剂和乳化剂的混合物的混合，随后在10-120分钟内，在70-20℃下进行均质。
18.如权利要求15和16的药物组合物的用于制备用于治疗人和动物疾病，具体选自：由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027引起的炎性疾病和细菌感染功能性胃肠疾病；用于粘膜再生，烧伤治疗和伤口愈合相关疾病的用途。
19.权利要求18的药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027引起的炎性疾病，所述炎性疾病选自：牙龈炎，牙周炎，喉炎，胃炎，结肠炎，痔疮病，皮炎，外耳炎，鼻窦炎，鼻炎，阴道炎和乳腺炎。
20.权利要求18的药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于治疗由以下组中的细菌引起的细菌感染：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；粪肠球菌VRE；铜绿假单胞菌ATCC 9027。
21.权利要求18的药物组合物的用途，其特征在于用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027引起的动物的乳腺炎。
22.权利要求18的药物组合物的用途，其特征在于用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌VRE或铜绿假单胞菌ATCC 9027引起的功能性胃肠病症，所述功能性胃肠病症选自：食管，胃，十二指肠，小肠和结肠病症，中枢介导的胃肠疼痛，胆囊和括约肌ODDI病症，肛肠病症，儿童和青少年特异性胃肠病症。
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