JP2022520665A - 液体プロポリス抽出物、その製剤およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規な標準化された液体プロポリス抽出物及び抽出物に基づく医薬製剤、それらの製造方法及び使用を開示する。液体抽出物は、ＰＥＧ２００～６００（９６．５～９９．９％ｗ／ｗ）及びレシチン（０．１～３．５％ｗ／ｗ）の混合物をベースとした抽出溶媒での粗プロポリスの抽出によって生成される。抽出物は、ｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）、及びＣＡＰＥ（４）の標準化された含有量で特徴付けられる。これは、医薬品、化粧品、獣医学、農薬、又は機能性食品の製造における有効成分として使用される。本発明による医薬製剤は、５～９５％ｗ／ｗのプロポリス抽出物、及び様々な剤形の調製に必要な最大１００％の賦形剤からなる。これは、炎症性疾患、細菌及び真菌感染症、ウイルス、自己免疫、及びがん疾患等のヒト及び動物の疾患及び状態の処置、並びに熱傷及び創傷治癒の処置に使用される。

Description

本発明は、新規な液体標準化プロポリス抽出物、該抽出物をベースとした新規な医薬組成物への調製方法、およびその使用に関する。
技術的課題
プロポリスが蜜蝋と多数の天然有機化合物との混合物であるという事実に関して、異なる抽出プロセスが非常に異なる組成の活性物質の抽出物をもたらす。適切な分析方法の使用と共に、主にある特定の群の有機化合物を選択的に抽出する能力を有する化学選択的抽出溶媒（ＥＳ）を使用すると、一貫した標準化されたプロポリス抽出物組成物を達成することが理論的に可能である。
本発明によって解決される技術的課題は、以下を含む：
（ｉ）人間および動物の両方の生物に対するいくつかの有益な薬理学的活性が知られている、フェノール性プロポリス酸、パラ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）、およびコーヒー酸の２－フェニルエチルエステル、２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）の高い標準化された含有量を特徴とする、非アルコール性液体プロポリス抽出物；
Figure 2022520665000001
（ｉｉ）その生成プロセス；
（ｉｉｉ）既知の標準化された含有量のプロポリス活性物質１～４を有する医薬品、化粧品、獣医学製品、農薬、または食品の製造のための使用；ならびに特に、
（ｉｖ）炎症性および感染性疾患や、最先端のある特定の参考文献によって示唆されているように、特定のプロポリス活性物質の抗酸化、抗炎症および免疫調節活性がそれらの発生の病因における重要な役割を果たす疾患および状態の処置に効果的である、前述のプロポリス抽出物をベースとした医薬組成物。
高い標準化された含有量の非常に生物活性の高いプロポリス成分を有する、ごくわずかな蜜蝋含有量のアルコール不含抽出物および他のバラストプロポリス化合物は、非常に価値の高い医薬品、獣医学製品、農薬または機能性食品もしくは食品サプリメントの開発および製造の基礎となる。対照的に、この目的のためのエタノール、グリセロールまたは１，２－プロピレングリコールをベースとした標準的プロポリス抽出物の使用は、上述のプロポリス活性物質の未知の含有量、またはフラボノイドプロポリス成分に対する貴重なフェノール酸およびＣＡＰＥの低い定量的組成等の様々な困難を伴う。
本発明は、
（ｉ）粗プロポリスの化学選択的抽出プロセスに役立つ特定の抽出溶媒（ＥＳ）製剤の使用；
（ｉｉ）主要な活性物質１～４を含む活性プロポリス成分の定量方法；
（ｉｉｉ）このようにして調製された液体プロポリス抽出物の、本発明に従い所望のレベルの活性物質１～４まである特定の量の同じ抽出溶媒で希釈することによる標準化に基づいており、抽出溶媒は、２種以上の食品および薬学的に許容される物質からなり、また、最終生成物において、液体の標準化されたプロポリス抽出物からなる。この同じ抽出溶媒は、担体または希釈剤の役割を有し、また本発明は、
（ｉｖ）炎症性および感染性疾患の処置に効果的な薬剤であることが証明された、本発明による標準化プロポリス抽出物をベースとした医薬組成物に基づいている。その広範囲の薬理活性のために、それは、炎症性疾患、細菌および真菌感染、ウイルス性疾患、自己免疫疾患、粘膜再生、火傷および創傷の処置、ならびにがん疾患等の様々な疾患および状態の処置に使用することができる。
先行技術
プロポリスは、ハチによって収穫された天然産物であり、ハチにとっては、蜂の巣の小さな望ましくない開口部を閉じるための接着剤として働く。プロポリスは、主成分としての蜜蝋と、多数の各種有機化合物とを含む。それらの多くは、有意な有益な薬理学的効果を示し、例えば参考文献１を参照されたい：
１）非特許文献１
上述の活性物質１～４の他に、プロポリスは一連の他の天然化合物全体を含有し、例えば、酸の中にはトランス－桂皮酸（５）、および比較的豊富な量のクリシン（６）、ピノセンブリン（７）、ガランギン（８）、アピゲニン（９）およびケンペロール（１０）を含む一連のフラボノイドも含有する。
Figure 2022520665000002
伝統的に、粗プロポリスは、エタノールまたはエタノールおよび水の混合物で抽出され、いわゆるプロポリスのチンキ剤が得られる。そのような液体プロポリス抽出物は、以下のいくつかの欠点を特徴とする：
（ｉ）比較的攻撃的な溶媒（エタノール）の存在；
（ｉｉ）アルコールベースの製品は、子供、妊娠中や授乳中の女性および特定の患者には適していない；ならびに、
（ｉｉｉ）そのような抽出物が有効成分として使用される医薬品および他の製品の製造中に、水との混合相を介してその分解を引き起こす比較的高い含有量の蜜蝋。
エタノールの他に、抽出溶媒としては、グリセロール、水、グリセロールおよび水の混合物、ならびに他の有機溶媒が使用されている。
このようにして、Ｔｓｕｋａｄａらは、１：２ｗ／ｗのプロポリス：抽出溶媒の比および９０～１６０℃での抽出溶媒としてのグリセロールの使用およびその後の濾過を開示した。そのようなグリセロール抽出物は水溶性であり、活性医薬成分（ＡＰＩ）としての医薬品の製造に適している。参考文献２を参照されたい：
２）特許文献１
水性プロポリス抽出物も先行技術において説明されている。ＥＳとしての水による抽出は、３０～５０℃の温度で６～８分間実施することができ、これは濾過後に液体プロポリス抽出物を直接与える。後者は、最終的に、マルトデキストリンおよびアラビアガム等の適切な担体上への噴霧乾燥技術によるマイクロカプセル化を介して固体抽出物にさらに処理することができる。参考文献３を参照されたい：
３）特許文献２
レシチンを含む抽出溶媒（ＥＳ）の成分としての表面活性剤の使用は、従来技術において一般に知られている。例えば、Ｐａｒａｄｋａｒらは、４０～９０℃で２～２４時間、水性ポリソルベート溶液を使用してプロポリス抽出を行い、液体プロポリス抽出物を得る方法を説明した。参考文献４を参照されたい：
４）特許文献３
Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉは、１，２－プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびこれらの溶媒と水との混合物を含む様々な有機溶媒を用いたプロポリス抽出のための方法を開示した。参考文献５を参照されたい：
５）特許文献４
Ｃｈｕｎらは、とりわけ、抽出溶媒としての１，３－ブチレングリコール中の液体プロポリス抽出物をベースとした医薬組成物であって、水素化レシチンを他の乳化剤と共に使用することによって、このプロポリス抽出物を含むナノ粒子を含有する医薬剤形に変換される医薬組成物を開示した。参考文献６を参照されたい：
６）特許文献５
この文献は、１，３－ブチレングリコールによるプロポリス活性物質の抽出を促進するためにレシチンを使用していないという事実にもかかわらず、確かに界面活性剤としてのその使用の可能性を示唆しており、これは最終的にある特定の脂肪活性プロポリス成分のより極性の溶媒における抽出および乳化を改善することができる。
プロポリス分析に関して、多数の成分を含む複雑なプロポリス抽出物中のプロポリス活性物質の定量のための分析方法が、先行技術において数多くある。一例として、本発明で使用されるものと同様の分析方法が、中国の著者Ｃｕｉ－Ｐｉｎｇらの研究において示されている。彼らは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介した１２種類の異なるフラボノイドおよび８種類のフェノール性プロポリス酸の定量方法を説明した。この方法は、とりわけ、定性的プロポリスマーカーとして言及されるｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）およびコーヒー酸（３）の決定を可能にする。参考文献７を参照されたい：
７）非特許文献２
活性物質１～１０等の含有量のために、プロポリスおよびプロポリス抽出物は、ヒト、動物および植物の健康に対して一連の非常に価値のある有益な薬理学的効果を示す。先行技術には、広範囲の有益な効果を裏付ける多数の科学文献および特許文献が存在し、その中で最も重要なものは、抗炎症性；抗酸化性；免疫調節性；肝臓保護性；抗細菌性、抗ウイルス性、抗真菌性および抗原虫性を含む抗菌性；ならびに抗がん性である。例えば参考文献８～１２を参照されたい：
８）非特許文献３
９）非特許文献４
１０）非特許文献５
１１）非特許文献６
１２）非特許文献７
プロポリス抽出物に加えて、有益な薬理学的効果の全範囲が、例えば以下のようなある特定の単離された（純粋な）プロポリス活性物質について先行技術で説明されている：
（ｉ）ｐ－クマル酸（１）（参考文献１３および１４を参照されたい）；
（ｉｉ）トランス－フェルラ酸（２）（参考文献１５および１６を参照されたい）；
（ｉｉｉ）コーヒー酸（３）（参考文献１７および１８を参照されたい）；ならびに
（ｉｖ）２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）（参考文献１９および２０を参照されたい）。これはとりわけ、免疫調節、抗炎症および抗菌活性を示す。
１３）非特許文献８
１４）非特許文献９
１５）非特許文献１０
１６）非特許文献１１
１７）非特許文献１２
１８）非特許文献１３
１９）非特許文献１４
２０）非特許文献１５
さらに、プロポリス活性物質は殺真菌剤、殺菌剤、殺ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤であり、植物保護に使用される。
強力な抗酸化活性のために、プロポリスは植物を強化し、非生物的ストレスに対する耐性を高め、感染症に対抗するのを助ける。参考文献２１～２５を参照されたい：
２１）非特許文献１６；
２２）非特許文献１７
２３）非特許文献１８；
２４）非特許文献１９；
２５）非特許文献２０
特開平５－９５７号公報 中国特許出願公開ＣＮ１０３７８３３４９Ａ号公報 国際公開ＷＯ２０１１／０９２５１１Ａ１号公報 米国特許第４，３８２，８８６号公報 韓国特許出願公開ＫＲ２０１３０１３４８００Ａ号公報
Ｓ．Ｃａｓｔａｌｄｏ，Ｆ．Ｃａｐａｓｓｏ：Ｐｒｏｐｏｌｉｓ，ａｎｄ ｏｌｄ ｒｅｍｅｄｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ７３（２００２）Ｓ１－６ Ｚ．Ｃｕｉ－ｐｉｎｇ，Ｈ．Ｓｈｕａｉ，Ｗ．Ｗｅｎ－ｔｉｎｇ，Ｐ．Ｓｈｕｎ，Ｓ．Ｘｉａｏ－ｇｅ，Ｌ．Ｙａ－ｊｉｎｇ，Ｈ．Ｆｕ－ｌｉａｎｇ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐｒｏｐｏｌｉｓ，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．７９（２０１４）Ｃ１３１５－Ｃ１３２２ Ｅ．Ｌ．Ｇｈｉｓａｌｂｅｒｔｉ：Ｐｒｏｐｏｌｉｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｂｅｅ Ｗｏｒｌｄ６０（１９７９）５９－８４ Ａ．Ｂａｎｓｋｏｔａ，Ｙ．Ｔｅｚｕｋａ，Ｓ．Ｋａｄｏｔａ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｐｒｏｐｏｌｉｓ，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．１５（２００１）５６１－５７１ Ｇ．Ａ．Ｂｕｒｄｏｃｋ：Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂｅｅ Ｐｒｏｐｏｌｉｓ（Ｐｒｏｐｏｌｉｓ），Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６（１９９８）３４７－３６３ Ｊ．Ｍ．Ｓｆｏｒｃｉｎ：Ｐｒｏｐｏｌｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｒｅｖｉｅｗ，Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１３（２００７）１－１４ Ｊ．Ｗ．Ｄｏｂｒｏｗｏｌｓｋｉ，Ｓ．Ｂ．Ｖｏｈｏｒａ，Ｋ．Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ａ．Ｓｈａｈ，Ｓ．Ａ．Ｈ．Ｎａｑｖｉ，Ｐ．Ｃ．Ｄａｎｄｉｙａ：Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ，ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ，ａｎｔｉａｍｏｅｂｉｃ，ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｂｅｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５（１９９１）７７－８２ Ｔ．Ｆ．Ｂａｃｈｉｅｇａ，Ｃ．Ｌ．Ｏｒｓａｔｔｉ，Ａ．Ｃ．Ｐａｇｌｉａｒｏｎｅ，Ｊ．Ｍ．Ｓｆｏｒｃｉｎ：Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｏｌｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２６（２０１２）１３０８－１３１３ Ｋ．Ｐｅｉ，Ｊ．Ｏｕ，Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｏｕ：ｐ－Ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｕｒｃｅｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．９６（２０１６）２９５６－２９６２ Ｎ．Ｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｐｒｕｔｈｉ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｕｒｃｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｐ．４（２０１４）８６－９３ Ｃ．Ｓｈｉ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｓｕｎ，Ｍ．Ｙａｎｇ，Ｋ．Ｓｏｎｇ，Ｚ．Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｊｉａ，Ｒ．Ｄｏｎｇ，Ｌ．Ｃｕｉ，Ｘ．Ｘｉａ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｐａｔｈｏｇ．Ｄｉｓ．１３（２０１６）１９６－２０４ Ｈ．Ｇ．Ｃｈｏｉ，Ｐ．Ｔ．Ｔｒａｎ，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｓ．Ｍｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｋｉｍ：Ａｎｔｉ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ，Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（２０１８）６４－７０ Ｖ．Ｎ．Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｄ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ－Ｔｉｎｔｉｎｏ，Ｅ．Ｓ．Ｓａｎｔｏｓ，Ｌ．Ｐ．Ｍｏｒａｉｓ，Ｓ．Ｒ．Ｔｉｎｔｉｎｏ，Ｔ．Ｓ．Ｆｒｅｉｔａｓ，Ｙ．Ｓ．Ｇｅｒａｌｄｏ，Ｒ．Ｌ．Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．Ｐ．Ｃｒｕｚ，Ｉ．Ｒ．Ｍｅｎｅｚｅｓ，Ｈ．Ｄ．Ｃｏｕｔｉｎｈｏ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ，ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．９９（２０１６）５６－６１ Ｋ．Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｈ．Ｗｅｉ，Ｒ．Ｂｈｉｍａｎｉ，Ｊ．Ｙｅ，Ｊ．Ａ．Ｚａｄｕｎａｉｓｋｙ，Ｍ．－Ｔ．Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｆｅｒｒａｒｏ，Ａ．Ｈ．Ｃｏｎｎｅｙ，Ｄ．Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ Ｓｋｉｎ ａｎｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｌｅｎｓ ｂｙ Ｃａｆｆｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ Ｅｓｔｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３（１９９３）１２５５－１２６１ Ａ．Ｒｕｓｓｏ，Ｒ．Ｌｏｎｇｏ，Ａ．Ｖａｎｅｌｌａ：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ａｎｄ ｇａｌａｎｇｉｎ，Ｆｉｔｏｔｈｅｒ．７３（２００２）Ｓ２１－Ｓ２９ Ｃ．Ａ．Ｇｕｇｉｎｓｋｉ－Ｐｉｖａ，Ｉ．ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ，Ａ．Ｗ．Ｊｕｎｉｏｒ，Ｄ．Ｗ．Ｈｅｃｋ，Ｍ．Ｆ．Ｆｌｏｒｅｓ，Ｋ．Ｐａｚｏｌｉｎｉ：Ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ，ＩＤＥＳＩＡ（Ｃｈｉｌｅ）３３（２０１５）３９－４７ Ｚ．Ａｒａｒｓｏ，Ｇ．Ｌｅｇｅｓｓｅ：Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｎｅｙｂｅｅｓ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｒｖａｅ ｏｆ ｌｅｓｓｅｒ ｗａｘ ｍｏｔｈ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．（２０１５）ｄｏｉ：１０．５２５１／ａｂｊｎａ．２０１６．７．６．３０２．３０６ Ｌ．Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｋ．Ｍａｈａｔｍａ，Ｋ．Ａ．Ｋａｌａｒｉｙａ，Ｓ．Ｋ．Ｂｉｓｈｉ，Ａ．Ｍａｎｎ：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ：Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｂｉｏ－Ｗｅａｐｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ，Ｐｏｐｕｌａｒ Ｋｈｅｔｉ２（２０１４）１４９－１５２ Ｅ．Ｍ．Ｎｏｗｅｅｒ，Ｍ．Ｇ．Ｄａｗｏｏｄ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｆａｂａ ｂｅａｎ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｃｏｍｍｕｎ．Ａｇｒｉｃ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．７４（２００９）５９３－６０３ Ｋ．Ｋｕｌｂａｔ：Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．８０（２０１６）９７－１０８
我々の知る限り、低い（０．１～３．５％ｍ／ｍ）レシチン含有量を含有する、液体ポリエチレングリコールをベースとした特定の抽出溶媒（ＥＳ）の、プロポリス抽出化学選択性の増強剤としての使用は、先行技術において説明されていない。本発明からのそのような特定のＥＳの適用は、粗プロポリス抽出における化学選択性の向上を可能にし、それぞれの活性物質１～４の含有量が著しく向上した対応する液体抽出物をもたらす。
また、本発明による医薬組成物中の活性医薬成分（ＡＰＩ）としての前述の特定の標準化された液体プロポリス抽出物の使用は、本発明の詳細な説明に記載されているように、その使用のための一連の異なる適応症において予想外の改善を提供する。
本発明は、特定の抽出溶媒（ＥＳ）による粗プロポリス抽出の予想外の有効性および化学選択性に基づく。後者は、液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ４００、およびレシチンまたは加水分解レシチンの９６．５～９９．９：０．１～３．５％ｗ／ｗの比の混合物からなる。
抽出溶媒（ＥＳ）は、プロポリス活性物質であるｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）および２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）を効果的かつ化学選択的に抽出する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に基づく適切な分析方法の使用は、そのように調製された一次抽出物中の活性物質１～４の定量を可能にする。後者は、本発明による活性物質１～４の所望の含有量まで、抽出ステップで使用したのと同じＥＳで希釈することによってさらに標準化される。このようにして、本発明による、既知の標準化された濃度の主要な活性物質１～４を有する液体プロポリス抽出物が得られる。これは、活性医薬成分（ＡＰＩ）、活性化粧品成分（ＡＣＩ）、または機能性食品および食品サプリメントを製造するための食品成分としてさらに使用される。
主要な活性物質であるｐ－クマル酸（１；１０～１，３００μｇ／ｍＬ）、トランス－フェルラ酸（２；１０～８００μｇ／ｍＬ）、コーヒー酸（３；５～３００μｇ／ｍＬ）、および２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；５～４００μｇ／ｍＬ）を含有する液体プロポリス抽出物をベースとした本発明の組成物は、炎症性疾患、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス性疾患、自己免疫疾患、機能性胃腸障害の治療、粘膜再生、熱傷および創傷の処置、ならびにがん疾患の処置に有効な薬剤である。
主要なプロポリス成分１～４および付随する成分５～１０の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 図２．１は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質１の定量的組成の結果を示す図である。図２．２は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質２の定量的組成の結果を示す図である。図２．３は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質３の定量的組成の結果を示す図である。図２．４は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質４の定量的組成の結果を示す図である。 図２．５は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質５の定量的組成の結果を示す図である。図２．６は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質６の定量的組成の結果を示す図である。図２．７は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質７の定量的組成の結果を示す図である。図２．８は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質８の定量的組成の結果を示す図である。図２．９は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質９の定量的組成の結果を示す図である。図２．１０は、エタノール（９６％）、ならびにエタノールと異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質１０の定量的組成の結果を示す図である。 図３．１は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質１の定量的組成の結果を示す図である。図３．２は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質２の定量的組成の結果を示す図である。図３．３は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質３の定量的組成の結果を示す図である。図３．４は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中のプロポリス活性物質４の定量的組成の結果を示す図である。 図３．５は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質５の定量的組成の結果を示す図である。図３．６は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質６の定量的組成の結果を示す図である。図３．７は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質７の定量的組成の結果を示す図である。図３．８は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質８の定量的組成の結果を示す図である。図３．９は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質９の定量的組成の結果を示す図である。図３．１０は、ポリエチレングリコール４００、ならびにポリエチレングリコール４００と異なる種類および濃度のレシチンとの混合物での抽出によって得られた液体プロポリス抽出物中の付随する物質１０の定量的組成の結果を示す図である。 本発明による標準化された液体プロポリス抽出物を生成するための方法のブロックスキームを示す図である。 本発明の医薬製剤、実施例１１の生成物の定量分析の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
略語
ＥＳ－抽出溶媒
ＳＬ－大豆レシチン（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ．Ｌ．）
ＲＬ－菜種レシチン（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）
ＨＲＬ－加水分解大豆レシチン
ＳＵＬ－脱油ヒマワリレシチン
ＥｔＯＨ－９６％エタノール
ＰＥＧ－ポリエチレングリコール
ＨＰＬＣ－高速液体クロマトグラフィー
ＧＣ－ガスクロマトグラフィー
ＴＬＣ－薄層クロマトグラフィー
ＭＩＣ－最小阻止濃度
ＲＰＭＩ－ロズウェルパーク記念研究所培地
ＴＴＣ－２，３，５トリフェニル－２ｆｉ－テトラゾリウムクロリド、酸化還元指示薬ＰＢＳ－リン酸緩衝生理食塩水
ＣＦＵ－コロニー形成単位；コロニーを形成することができる生存微生物の数
ＸＴＴ－ＸＴＴナトリウム塩；２，３－ビス（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２ｆｉ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド内部塩、酸化還元指示薬
ＭＲＳＡ－メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
ＭＳＳＡ－メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
ＣＬＳＩ－臨床および検査標準協会
ＥＵＣＡＳＴ－抗菌剤感受性試験に関する欧州委員会
ＡＰＩ－活性医薬成分／物質
ＤＥＲ－薬物対抽出物重量比；出発薬物および最終抽出物の重量比によって表される抽出物強度の尺度
ＳＣＣ－体細胞数
ｉ．ｍａｍ．－乳房内（適用）
ＡＴＣＣ－アメリカ培養細胞系統保存機関；標準参照微生物を収集、保存および配布する非営利組織
ＣＮＳ－コアグラーゼ陰性ブドウ球菌
発明の詳細な説明
本発明は、ｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）およびコーヒー酸２－フェニルエチルエステル、２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４）からなる群から選択される主要な活性物質の含有量で標準化された新規な液体プロポリス抽出物、その調製方法ならびにその使用に関する。
Figure 2022520665000003
本発明による医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としての液体プロポリス抽出物は、
（Ａ）０．１～１０．０％ｗ／ｗの乾燥プロポリス抽出物；および
（Ｂ）９０．０～９９．９％ｗ／ｗの抽出溶媒
からなり、抽出溶媒は、
（Ｂ．１）９６．５～９９．９％ｗ／ｗの１種または複数種の液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００～６００；および
（Ｂ．２）０．１～３．５％ｗ／ｗのレシチンまたは加水分解レシチン
からなり、液体プロポリス抽出物は、
（Ｉ）１：２～１：２０ｗ／ｗの薬物としての粗プロポリスおよび最終抽出物の定量的重量比（ＤＥＲ）；ならびに
（ＩＩ）ｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシシンナメート（４）からなる群から選択されるプロポリス活性物質の定量的含有量
により標準化され、前述の主要な活性物質の４つのうちの最低２つの定量的組成は、
（ｉ）１００～１，３００μｇ／ｍＬのｐ－クマル酸（１）；
（ｉｉ）７５～８００μｇ／ｍＬのトランス－フェルラ酸（２）；
（ｉｉｉ）２５～３００μｇ／ｍＬのコーヒー酸（３）；および
（ｉｖ）４０～４００μｇ／ｍＬの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）
である。
本発明の好ましい実施形態において、抽出溶媒（ＥＳ）の成分としての液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
具体的には、抽出溶媒（ＥＳ）の成分としての液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
さらに、レシチンまたは加水分解レシチンは、２～１２の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）因子を特徴とする生成物からなる群から選択され、大豆レシチン（ＳＬ；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ．Ｌ．由来）、ヒマワリレシチン（ＳＵＬ；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．由来）；菜種レシチン（ＲＬ；Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．由来）；キャノーラレシチン（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）；ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ Ｌ．）の卵からのレシチン；レシチンの脱油生成物；供給源からの水素化レシチン；供給源からの加水分解レシチン；レシチンの酵素修飾誘導体；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
具体的には、本発明におけるレシチンとしては、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ．Ｌ．）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）もしくはキャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）由来の天然レシチン、脱油レシチン、水素化レシチン、加水分解レシチンもしくは酵素修飾レシチン、またはこれらの物質の混合物を使用することができる。
「酵素修飾レシチン」という用語は、分子中に残りのリン酸基およびコリン基を有する高級脂肪酸のグリセロール－モノエステルの生成を伴う１つの高級脂肪酸部分の酵素触媒加水分解によって得られる加水分解レシチンを含む。これにより、そのような加水分解レシチンのＨＬＢ因子が有意に増加する。
好ましくは、本発明による液体プロポリス抽出物の調製のための抽出溶媒（ＥＳ）として、
（ｉ）９７～９９％ｗ／ｗのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００またはそれらの混合物；および
（ｉｉ）１～３％ｗ／ｗの大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ．Ｌ．）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）もしくはキャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）由来の天然レシチン、脱油レシチンもしくは加水分解レシチン；またはこれらの物質の混合物
の混合物が使用され得る。
本発明の好ましい実施形態において、本発明による液体プロポリス抽出物は、
（Ｉ）１：３～１：５ｗ／ｗの比率での最終抽出物に対する薬物としての粗プロポリスの定量的重量比（ＤＥＲ）；および
（ＩＩ）ｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－シンナメート（４）からなる群から選択されるプロポリス活性物質の定量的組成
で標準化され、前述の主要な活性物質の４つのうちの最低２つは、以下の定量的含有量：
（ｉ）５００～１，３００μｇ／ｍＬのｐ－クマル酸（１）；
（ｉｉ）３００～８００μｇ／ｍＬのトランス－フェルラ酸（２）；
（ｉｉｉ）１００～３００μｇ／ｍＬのコーヒー酸（３）；および
（ｉｖ）１００～４００μｇ／ｍＬの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）
に対応する。
液体抽出物中のプロポリス活性物質の分析
本発明による新規な標準化された液体プロポリス抽出物の開発のために、
（ｉ）上記のｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）、および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－シンナメート（４）からなる群から選択される主要な活性プロポリス物質；ならびに
（ｉｉ）トランス－桂皮酸（５）、クリシン（６）、ピノセンブリン（７）、ガランギン（８）、アピゲニン（９）およびケンペロール（１０）からなる群から選択される付随する活性物質
の定量のための適切な分析方法の開発が必須であった。
Figure 2022520665000004
前述の分析方法の最初の研究のために、モデル液体プロポリス抽出物を調製する必要があった。エタノール（９６％）およびポリエチレングリコール中のモデルプロポリス抽出物を使用した。これらを、室温で２４時間の浸軟による標準的な抽出法によって調製した。次いで、未溶解残渣を濾過によって分離し、透明な濾液をさらなる研究のためのモデル液体プロポリス抽出物として使用した。モデル液体ポリエチレングリコールとして、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を使用した。古典的な抽出溶媒であるエタノール（９６％）およびポリエチレングリコール４００中でモデル液体プロポリス抽出物を調製するための手順は、実施例１（９６％エタノール）および実施例２（ＰＥＧ４００）に記載されている。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に基づく適切な分析方法が開発され、それによって１０種の前述の化合物１～１０のすべての分離の成功が達成された。この方法は、実施例３に正確に記載されている。
本分析方法によって得られた典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。化合物１～１０の保持時間（ｔＲ）を表１に示す。
Figure 2022520665000005
プロポリス活性物質１～４の抽出の有効性に対するレシチンの影響の研究
この研究を続けるに当たり、様々な種類（ＳＬ、ＲＬ、ＨＲＬ）の含量および濃度（１～３０％ｗ／ｗ）のレシチンを含む異なる抽出溶媒（ＥＳ）の、プロポリス活性物質１～４抽出の有効性に対する効果を研究した。表２を参照されたい。
Figure 2022520665000006
このようにして調製された液体プロポリス抽出物を、主要な活性物質１～４および付随する活性物質５～１０の含有量に対して定量分析に供した。結果を表３～６に示す。
９６％エタノール（ＥｔＯＨ）、ならびにＥｔＯＨと異なる種類（ＳＬ、ＲＬ、ＨＲＬ）および濃度（ＥＳ組成物中１～３０％ｗ／ｗ）のものとの混合物をベースとした抽出溶媒（ＥＳ）を使用する場合、一次液体プロポリス抽出物は、ｐ－クマル酸（１；約８００～１２５０μｇ／ｍＬ）、トランス－フェルラ酸（２；約４８５～７７０μｇ／ｍＬ）、コーヒー酸（３；約１８５～２９０μｇ／ｍＬ）および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ；約２１５～３２０μｇ／ｍＬ）を主要有効成分として含む。表３を参照されたい。
Figure 2022520665000007
ここで、補助活性物質５～１０の濃度は以下のレベルであった：トランス－桂皮酸（５；約４０～６５μｇ／ｍＬ）、クリシン（６；約５００～６９０μｇ／ｍＬ）、ピノセンブリン（７；約４４０～６７０μｇ／ｍＬ）、ガランギン（８；約２１０～３００μｇ／ｍＬ）、アピゲニン（９；約９０～１５０μｇ／ｍＬ）およびケンペロール（１０；約４５～９０μｇ／ｍＬ）。表４を参照されたい。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）、ならびにＰＥＧ４００と様々な種類（ＳＬ、ＲＬ、ＨＲＬ）および濃度（ＥＳ組成物中１～１０％ｗ／ｗ）のレシチンとの混合物をベースとした抽出溶媒（ＥＳ）を使用する場合、一次液体抽出物はまた、ｐ－クマル酸（１；約７５０～１３００μｇ／ｍＬ）、トランス－フェルラ酸（２；約４００～８００μｇ／ｍＬ）、コーヒー酸（３；約１４０～３００μｇ／ｍＬ）および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ；約１９０～３７０μｇ／ｍＬ）を含有する。表５を参照されたい。
Figure 2022520665000008
Figure 2022520665000009
この場合、補助活性物質５～１０の濃度は以下のレベルであった：トランス－桂皮酸（５；約３０～７０μｇ／ｍＬ）、クリシン（６；約４００～８３０μｇ／ｍＬ）、ピノセンブリン（７；約３９０～８００μｇ／ｍＬ）、ガランギン（８；約１９０～３６０μｇ／ｍＬ）、アピゲニン（９；約８０～１７０μｇ／ｍＬ）およびケンペロール（１０；約４０～１４０μｇ／ｍＬ）。表６を参照されたい。
Figure 2022520665000010
結果から分かるように、抽出溶媒（ＥＳ）組成物中１～３％ｗ／ｗのより低い濃度で使用される場合、任意の純粋な溶媒、９６％エタノールまたはポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）と組み合わせた全ての試験レシチン（ＳＬ、ＲＬ、ＨＲＬ）は、純粋な溶媒と比較して、活性物質１～４の抽出化学選択性の増加に有意に寄与する。
ＰＥＧ４００およびレシチン（ＳＬ、ＲＬ、ＨＲＬ）の組み合わせの予想外の効果は、ＰＥＧ４００が、純粋な溶媒としてであっても、９６％エタノールよりも著しく弱い活性物質１～４を抽出するという事実で明らかになる（表３；１行２列）。１～３％ｗ／ｗの濃度のレシチン（ＳＬ、ＲＬ、ＨＲＬ）と組み合わせて使用すると、同じレシチンを用いた９６％エタノールの類似の組み合わせと比較して、化合物１～４を有意により効果的に抽出する。例えば、抽出溶媒として１００％のＰＥＧ４００を用いて得られた抽出物中の達成されたｐ－クマル酸（１）濃度は、７５０μｇ／ｍＬ（表５；１行２列）の範囲であり、ＥＳとして９６％のＥｔＯＨを用いると９１６μｇ／ｍＬ（表３；１行２列）の範囲であったが、ＰＥＧ４００中３％ｗ／ｗのＳＬの使用は、３％ｗ／ｗのＳＬを含む９６％エタノールに基づくＥＳの使用の場合の８２０μｇ／ｍＬ（表５；２行２列）のレベルに対して、１．１１２μｇ／ｍＬ（表３；２行２列）の濃度をもたらした。
この典型的な例から、抽出溶媒（ＥＳ）中１～３％ｗ／ｗの濃度のポリエチレングリコールおよびレシチンの組み合わせの全く予想外の効果が明らかに見て取れる。これは、ＥＳ組成物中の０．１～３．５％ｗ／ｗの最適レシチン重量パーセンテージの許容範囲まで、当業者によって推定することができる。
抽出溶媒（ＥＳ）組成物中でより高い重量パーセントのレシチンを使用すると、エタノールに基づく類似の系と比較して、プロポリス抽出の化学選択性に対するレシチンの有益な効果が失われる。例えば、ＥＳ中４％のＲＬ、７．７％のＨＲＬまたは１０％のＳＬの濃度でレシチンを使用することにより、類似のエタノールベースＥＳ系の使用と比較して、より低い濃度の主要な活性物質１～４が記録された。２つの最も豊富に存在する活性物質、ｐ－クマル酸（１）およびトランス－フェルラ酸（２）についての典型的な結果を表７および８に示す。
Figure 2022520665000011
表７において、８行３列の本発明の典型的な予想外の結果を見ることができ、類似のＥｔＯＨベースＥＳ（ＥｔＯＨ＋ＲＬ＝９８．９：１．１、ｗ／ｗ）と比較して、抽出溶媒（ＥＳ）、ＰＥＧ４００＋ＲＬ（９８．９：１．１、ｗ／ｗ）を使用した場合、ｐ－クマル酸（１）濃度の５０％の増加が観察された。
Figure 2022520665000012
予想外の結果のさらなる典型的な例として、類似の９６％エタノールベースＥＳと比較して、抽出溶媒（ＥＳ）ＰＥＧ４００＋ＨＲＬ（９７．８：２．２、ｗ／ｗ）を使用した場合トランス－フェルラ酸（２）濃度の５３．５％の増加が記録された表８の１２行３列のデータを本明細書に示す。
本発明による標準化された液体プロポリス抽出物を生成するための方法
本発明による液体プロポリス抽出物を生成するための方法は、
（ｉ）粗プロポリスを－２０℃で最低１時間冷却するステップと；
（ｉｉ）冷却したプロポリスを１～８ｍｍの細孔でふるいにかけて粉砕するステップと；
（ｉｉｉ）以下の条件下：
（ａ）粗プロポリスおよび抽出溶媒の重量比＝１：２～１：２０ｗ／ｗ；
（ｂ）１０～１５０℃の抽出温度；ならびに
（ｃ）５分～７２時間の抽出時間
で抽出溶媒により粗プロポリスを抽出するステップと；
（ｉｖ）このようにして得られた混合物を、１００ｐｍ～５ｐｍの細孔を有する一連のフィルタを通して濾過し、未溶解残留物および液体プロポリス抽出物を生成するステップと；
（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により主要な活性プロポリス物質１～４の定量分析するステップと；
（ｖｉ）活性物質１～４の望ましい含有量までステップ（ｉｉｉ）で使用された新鮮な抽出溶媒で希釈することにより、ステップ（ｖ）で主要な活性物質１～４の正確な定量的組成が決定された、このようにして得られた液体プロポリス抽出物を標準化するステップと
を含む。
本発明による液体プロポリス抽出物を調製するための方法の実現の好ましい実施形態において、抽出ステップ（ｉｉｉ）は、以下の条件下：
（ａ）粗プロポリスおよび抽出溶媒の重量比＝１：３～１：５ｗ／ｗ；
（ｂ）１５～７０℃の抽出温度；ならびに
（ｃ）１～２４時間の抽出時間
で行われる。
また、主要な活性物質１～４の定量ステップ、および補助活性物質５～１０の付随するモニタリングのための、この目的で開発された分析高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）は、以下の条件：
（ｉ）クロマトグラフィーカラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃ１８；寸法：１５ｃｍ×３．０ｍｍ；カラム内の粒子径：２．７μｍ；
（ｉｉ）移動相：Ａ＝０．１％ギ酸水溶液、Ｂ＝メタノール；勾配：０分、８０％Ａ、２０％Ｂ；３分、７０％Ａ、３０％Ｂ；６０分、２０％Ａ、８０％Ｂ；９０分、２０％Ａ、８０％Ｂ；１００分、７０％Ａ、３０％Ｂ；１０５分、８０％Ａ、２０％Ｂ；
（ｉｉｉ）カラム温度：３０℃；
（ｉｖ）流量：０．２５ｍＬ／分；
（ｖ）分析時間：１１０分；
（ｖｉ）ＵＶ－ＶＩＳ検出器の波長：検出用：３７０ｎｍ、積分用：２９０ｎｍ；
（ｖｉｉ）注入量：１０μＬ；
（ｖｉｉｉ）圧力：２１０～２９０バール
で使用される。
本発明による液体プロポリス抽出物を調製するための実験手順は、実施例４～９に開示されている。実施例９では、本発明によるパラメータ薬物対抽出物比（ＤＥＲ）重量パーセンテージ１：２によって表される、強度の標準化された液体抽出物の調製プロセスの最適化されたバージョンが記載されている。
主要な活性物質１～４および補助活性物質５～１０の定量のための分析方法は、実施例３に記載されている。
本発明による標準化された液体抽出物の抗菌効果の決定。モデル病原微生物に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
プロポリス抽出物の抗菌効果を、クロアチアのザグレブにあるＲｕｄｊｅｒ Ｂｏｓｋｏｖｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの分子医学部門で測定した。本発明による標準化された液体プロポリス抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、参考文献２６～２９に記載されているように、ＣＬＳＩ（臨床および検査標準協会）およびＥＵＣＡＳＴ（抗菌剤感受性試験に関する欧州委員会）法の指示によって決定した。実施例９の生成物を使用した。
２６）Ｍ．Ｂａｌｏｕｉｒｉ，Ｍ．Ｓａｄｉｋｉ，Ｓ．Ｋ．Ｉｂｎｓｏｕｄａ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ａｎａｌ．６（２０１６）７１－７９
２７）ＣＬＳＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ Ｇｒｏｗ Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ，９ｔｈ ｅｄ．，ＣＬＳＩ ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ０７－Ａ９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９５０ Ｗｅｓｔ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ ２５００，Ｗａｙｎｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９０８７，ＵＳＡ，２０１２
２８）ＣＬＳＩ，Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｒｏｔｈ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｙｅａｓｔｓ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ，２ｎｄ ｅｄ．，ＮＣＣＬＳ ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ２７－Ａ２．ＣＬＳＩ，９４０Ｗｅｓｔ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ１４００，Ｗａｙｎｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１９０８７－１８９８，ＵＳＡ，２００２
２９）ＣＬＳＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ．Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，ＣＬＳＩ ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ２６－Ａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９５０ Ｗｅｓｔ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ ２５００，Ｗａｙｎｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９０８７，ＵＳＡ，１９９８
以下のモデル病原性微生物（Ｍ）のＡＴＣＣ株に対してインビトロ条件下で抗菌効果を試験した：
（ｉ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２９２９３（Ｍ１）；
（ｉｉ）メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ＭＲＳＡ（ＭＦＢＦコレクション；Ｍ２）；
（ｉｉｉ）メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ＭＳＳＡ（ＭＦＢＦコレクション；Ｍ３）；
（ｉｖ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ９２１２（Ｍ４）；
（ｖ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＶＲＥ（ＭＦＢＦコレクション）（Ｍ５）；
（ｖｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１０５３６（Ｍ６）；
（ｖｉｉ）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ４３４９８（Ｍ７）；
（ｖｉｉｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ９０２７（Ｍ８）；および
（ｉｘ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ９００２８（Ｍ９）。
抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために、連続微量希釈手順を行った。ＭＩＣ値は、細菌または真菌数の８０％の減少が生じたプロポリス抽出物濃度（ＭＩＣ８０）として決定された。表９に示される最小阻止濃度（ＭＩＣ８０）は、所与の溶媒中の対応する液体抽出物の希釈（％）の形式で示される。出発液体プロポリス抽出物は、粗プロポリスと最終抽出物との比（ＤＥＲ）が１：２で得られた。これは実施例９の生成物である。液体抽出物の希釈がより大きい場合、すなわち活性物質１～１０の濃度がＭＩＣに対してより低い場合、試験された抽出物の得られる抗菌効果はより高い。
ＭＩＣ決定のための実験手順の詳細な説明は実施例１０に開示されており、結果は表９に示される。
Figure 2022520665000013
表１０～１５に、３つの試験した抽出溶媒系のそれぞれにおけるプロポリス抽出物の有効希釈物中の活性物質１～１０の質量濃度（これらは、
（ｉ）９６％エタノール；実施例１の生成物、
（ｉｉ）ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）；実施例２の生成物；および
（ｉｉｉ）ＰＥＧ４００（９７％ｗ／ｗ）および大豆レシチン（３％ｗ／ｗ）の混合物；実施例９の生成物
を使用して得られる）；
または、各特定の液体抽出物がＭＩＣに達した対応する活性物質１～１０の質量濃度が示されている。これは、ＤＥＲが１：２である一次液体抽出物から、ＭＩＣが達成される希釈で除して決定された。
Figure 2022520665000014
Figure 2022520665000015
Figure 2022520665000016
Figure 2022520665000017
Figure 2022520665000018
Figure 2022520665000019
試験された液体プロポリス抽出物のそれぞれの全体的な抗菌効果（ＭＩＣ）は、いくつかの活性物質１～１０の相乗効果によって達成される。興味深い全く予想外のことは、低濃度の活性物質１～１０の混合物が、はるかに高濃度のある特定の（純粋な）活性物質１～１０の混合物よりも効果的であることである。
本発明の製剤は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．等のグラム陽性微生物に対して最も効果的であるが、表９から分かるように、より高い濃度では、一部のグラム陰性細菌：Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡ．ｂａｕｍａｎｉｉ、ならびに真菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対しても効果的である。
本発明による標準化された液体プロポリス抽出物の使用
本発明による医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としてのプロポリス抽出物は、標準化された濃度の高生物活性物質：
（ｉ）１００～１，３００μｇ／ｍＬのｐ－クマル酸（１）；
（ｉｉ）７５～８００μｇ／ｍＬのトランス－フェルラ酸（２）；
（ｉｉｉ）２５～３００μｇ／ｍＬのコーヒー酸（３）；および
（ｉｖ）４０～４００μｇ／ｍＬの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）
を含む。
主要な活性物質１～４の標準化された含有量により、本発明による液体プロポリス抽出物は、ヒトおよび動物で使用するための活性医薬成分（ＡＰＩ）、活性化粧品成分（ＡＣＩ）、または食品もしくは動物用飼料の機能性成分となり、これは以下の有益な薬理効果を特徴とする：
（ｉ）抗炎症性（参考文献１、８、９、１１、１２、１３、１７を参照されたい）；
（ｉｉ）抗酸化性（参考文献８、９、１４、１５、２０を参照されたい）；
（ｉｉｉ）免疫調節性（参考文献１、８、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０を参照されたい）；
（ｉｖ）肝臓保護性（参考文献９を参照されたい）：
（ｖ）抗細菌性、抗ウイルス性、抗真菌性および抗原虫性も含む抗菌性（参考文献９、１０、１２、１５、１６、１８を参照されたい）；
（ｖｉ）抗腫瘍性（参考文献９、１０、１１、１４、１９を参照されたい）；ならびに
（ｖｉｉ）抗がん性（参考文献１１、１４を参照されたい）。
本発明による液体プロポリス抽出物の他の有益な効果は、植物保護における殺真菌、殺細菌、殺ウイルス、殺虫および殺線虫効果である。強力な抗酸化活性のために、本発明による液体プロポリス抽出物は、植物および非生物的ストレス因子に対するそれらの耐性を間接的に強化し、感染症に対抗するのを助ける。このため、これは植物強化剤として使用される。参考文献２１～２５を参照されたい。
本発明による液体プロポリス抽出物は、
（ｉ）薬物、医療デバイスもしくは治療薬からなる群から選択される医薬品を製造するための活性医薬成分もしくは賦形剤；
（ｉｉ）化粧品を製造するための活性化粧品成分もしくは賦形剤；
（ｉｉｉ）機能性食品、食品サプリメントもしくは特別な栄養目的のための食品を製造するための食品成分；
（ｉｖ）獣医用医薬製品、動物飼料、動物飼料サプリメント、もしくは獣医学的用途のための治療薬からなる群から選択される獣医学製品を製造するための活性医薬品成分もしくは賦形剤；または
（ｖ）殺真菌剤、殺細菌剤、殺ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤および植物強化剤からなる群から選択される農薬製品を製造するための活性農薬成分もしくは賦形剤、特に生態系農業に特に適しているもの
として使用される。
本発明による標準化された液体プロポリス抽出物に基づく医薬組成物
さらに、本発明は、活性医薬成分（ＡＰＩ）としての標準化された液体プロポリス抽出物に基づく医薬組成物を開示する。本発明による医薬組成物は、
（Ｉ）５～９５％ｗ／ｗの本発明による液体プロポリス抽出物；および
（ＩＩ）最終組成物の最大１００％ｗ／ｗの、溶液、懸濁液、ゲル、クリーム、軟膏、経口または経鼻適用のためのスプレーからなる群から選択される最終剤形調製に必要な１種または複数種の医薬賦形剤
からなり、
前述の組成物は、以下の値の範囲内の４つの主要な活性プロポリス物質：
（ｉ）１０～１，３００μｇ／ｇのｐ－クマル酸（１）；
（ｉｉ）１０～８００μｇ／ｇのトランス－フェルラ酸（２）；
（ｉｉｉ）５～３００μｇ／ｇのコーヒー酸（３）；および
（ｉｖ）５～４００μｇ／ｇの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）
のうちの最低２つの定量的含有量を特徴とする。
それにより、医薬賦形剤（補助物質）は、希釈剤、保湿剤、保存剤、キレート剤、抗酸化剤、増粘剤、皮膚軟化剤、乳化剤、等張化剤、およびｐＨ制御剤からなる群から選択される。
希釈剤は、精製水、エタノール、１，２－プロピレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００もしくはＰＥＧ６００等の液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される薬学的に許容される液体である。
保湿剤は、グリセロール、ソルビトール、１，２－プロピレングリコール、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
保存剤は、４－ヒドロキシ安息香酸メチル、４－ヒドロキシ安息香酸エチル、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、４－ヒドロキシ安息香酸ブチル等のパラベン；４－クロロ－ｍ－クレゾール；トリクロサン；ベンジルアルコール；２－フェノキシエタノール；安息香酸およびその塩、例えば安息香酸ナトリウム；ソルビン酸またはその塩、例えばソルビン酸カリウム；デヒドロ酢酸（３－アセチル－２－ヒドロキシ－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－オン）；クロルヘキシジンおよびその塩、例えばクロルヘキシジンジグルコン酸塩；塩化ベンザルコニウムもしくは臭化セトリモニウム等の四級アンモニウム塩；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
キレート剤は、エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のナトリウム塩またはカリウム塩；クエン酸三ナトリウム二水和物（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・２Ｈ２Ｏ）等の可溶性クエン酸塩；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。典型的なキレート剤は、エデト酸二ナトリウム二水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ）である。
抗酸化剤は、α－トコフェロールおよびそのエステル、例えばα－トコフェリルスクシネート；アスコルビン酸およびその塩、例えばアスコルビン酸ナトリウム；２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール（ＢＨＴ）；ｔｅｒｔ－ブチル－アニソール（ＢＨＡ）；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
増粘剤は、セルロースガム、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）；合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）およびそのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；各種ガム、例えばアラビアガム、キサンタンガム、トラガカント；アルギン酸およびその塩、例えばアルギン酸ナトリウム；高級脂肪酸の金属塩、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ジステアリン酸アルミニウム、トリステアリン酸アルミニウム；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
皮膚軟化剤は、ワセリン；鉱物油；植物油、例えばアーモンド、ヒマワリもしくはオリーブ油；中鎖トリグリセリド；高級脂肪酸および一価アルコールの天然もしくは合成エステル、例えばミリスチン酸イソプロピルもしくはホホバ油；ワックス、例えば蜜蝋；シリコン油；高級脂肪酸、例えばオレイン酸もしくはステアリン酸；高級脂肪アルコール、例えばセチルアルコール；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
乳化剤は、ラノリン；エトキシル化ラノリン；ラノリンアルコール；エトキシル化ラノリンアルコール；レシチン；加水分解レシチン；グリセロールおよび高級脂肪酸のモノおよびジエステル、例えばグリセロールモノステアレート；高級脂肪酸のソルビタンエステル、例えばソルビタンモノステアレート；エトキシル化高級脂肪アルコール、例えばポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルもしくはポリオキシエチレン（２）オレエート（数字２３もしくは２はエチレンオキシド単位の数を表す）；エトキシル化ソルビタンエステルのエステル、例えばポリソルベート６０；水溶性石鹸、例えばステアリン酸ナトリウム；高級脂肪アルコールの水溶性硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム；脂肪アルコールの水溶性リン酸塩、例えばセチルリン酸カリウム；またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
等張化剤は、主に、粘膜、例えば鼻粘膜に適用される医薬剤形で使用され、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、グリセロール、１，２－プロピレングリコールまたはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
ｐＨ制御剤は、ｐＨ値を低下または上昇させるための薬学的に許容される酸および塩基ならびに緩衝系を含む。これは、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、クエン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、クエン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＣ６Ｈ５Ｏ７）、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される。
本発明による医薬組成物の調製
本発明による医薬組成物は、
（ｉ）本発明による標準化された液体プロポリス抽出物を希釈剤に添加し、それらを均質化するステップと；
（ｉｉ）１種または複数の他の賦形剤を添加し、それらを均質化するステップと
を含み；
ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、１０～１００℃の温度で、好ましくは２０～６０℃の温度で１～５分間行われ；
続いて、
（ｉｉｉ．ａ）溶液もしくはスプレー用溶液の剤形調製の場合、必要に応じて滅菌濾過を含む最終溶液の濾過を実行するステップ；
（ｉｉｉ．ｂ）ゲルもしくは懸濁液の剤形調製の場合、増粘剤の添加およびその均質化を行うステップ；
（ｉｉｉ．ｃ）クリームの剤形調製の場合、皮膚軟化剤および乳化剤を混合し、５０～８０℃の温度で１～１５分間均質化することにより脂肪相の調製を行い、次いでステップ（ｉｉ）の溶液を添加し、５０～８０℃に加熱し、続いて高剪断もしくは高圧ホモジナイザーを使用して、５０～８０℃、好ましくは５５～６５℃の温度で１～３０分間乳化し、その後６５～２０°の温度で１０～１２０分間均質化するステップ；または
（ｉｉｉ．ｄ）軟膏の剤形調製の場合、ステップ（ｉｉ）の溶液を、事前に溶融した皮膚軟化剤、および最終的には乳化剤の混合物と、５０～７０℃の温度で５～３０分間混合し、続いて７０～２０℃の温度で１０～１２０分間均質化するステップと
を含む方法により調製される。
本発明の医薬組成物を調製するための手順はまた、医薬技術の当業者に知られているように、前述の剤形を製造するための様々な代替の一般的な技術的手順を含み得る。
本発明による医薬組成物の製造の代表的な例は、実施例１１～１６に記載されている。
特別な例として、ここでは、実施例１１に開示されている、乳房内適用のための溶液の最終剤形が概説される。この場合、調製が実施例９に記載されている一次標準化液体プロポリス抽出物は、本発明による抽出溶媒、この場合ポリエチレングリコール４００（９７％ｗ／ｗ）および大豆レシチン（３％ｗ／ｗ）との混合物で希釈されるだけであり、これはここでは希釈剤の機能である。このようにして得られた乳房内適用のための溶液は、上述の限度内の主要な活性物質１～４の定量的含有量を与える。表１６を参照されたい。
Figure 2022520665000020
本組成物の定量分析からの典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを図５に示す。
本発明の医薬組成物の薬理効果の研究
実施例１１の生成物である溶液からの投与量における本発明の組成物の選択された薬理学的効果を、
（ｉ）ウシの乳腺炎、乳房炎；
（ｉｉ）ヤギの乳腺炎；および
（ｉｉｉ）ウマの創傷治癒
の治療における臨床試験で研究した。
ウシの乳腺炎治療の研究
ウシの乳腺炎処置の研究を、ホルスタイン種の乳牛を有する５つの飼育場で行った。合計８６頭のウシまたは３３９の分房が研究に含まれ、乳房の分房が統計単位として使用された。動物を深い寝床で自由に飼育し、抗生物質を添加せずに乳牛用の標準的なプレミックスを与えた。この試験は獣医学倫理委員会によって承認された。２００，０００／ｍＬ未満の体細胞数（ＳＣＣ）を有する乳腺炎の臨床症状のない健康な動物および分房、ならびに２００，０００／ｍＬを超えるＳＣＣを有する感染した分房を含めた。安全性および有効性の無作為化クロスオーバー臨床試験を、地形条件下で溶液の形態の本発明の組成物の乳房内（ｉ．ｍａｍ．）適用で行った。朝の搾乳中、夕方の搾乳中および翌日の朝の搾乳後に、実施例１１の本発明の組成物を、牛の乳房の４つ全ての分房に３回適用した。詳細な手順は実施例１７に記載されるが、表１７は、最初のｉ．ｍａｍ．適用前の一定数の分房で特定された各病原体の細菌学的治癒を表す。
Figure 2022520665000021
実施例１１からの組成物の３回（２日）投与レジメンは、わずか７日以内に１００％の症例で細菌学的治癒をもたらした。
比較すると、セファロスポリン型抗生物質セフチオフルは、６６％の細菌学的治癒を達成するが、８日間の毎日のｉ．ｍａｍ．適用後にのみ達成され、一方５日後では、治癒は５４％の症例にのみ生じる。参考文献３０を参照されたい。Ｓ．ｕｂｅｒｉｓによって引き起こされた不顕性乳腺炎では、ピルリマイシンを用いた２日間の処置は５８．１％の症例で治癒をもたらしたが、５日間および８日間の治療は６８．８％および８０％の症例で治癒をもたらした。参考文献３０を参照されたい。
３０）Ｓ．Ｐ．Ｏｌｉｖｅｒ，Ｂ．Ｅ．Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｓ．Ｊ．Ｈｅａｄｒｉｃｋ，Ｈ．Ｍｏｏｒｅｈｅａｄ，Ｐ．Ｌｕｎｎ，Ｈ．Ｈ．Ｄｏｗｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．Ｌａｍａｒ，Ｓ．Ｔ．Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｗ．Ｍ．Ｍｏｓｅｌｅｙ：Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｃｅｆｔｉｏｆｕｒ ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｓｔｉｔｉｓ ｉｎ ｌａｃｔａｔｉｎｇ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８７（２００４）２３９３－２４００
代替として、ウシの乳腺炎治療では、実施例１２に記載されているように、乳房内適用のための懸濁液の剤形の本発明の組成物も、成功裏に使用することができる。
ヤギの乳腺炎治療の研究
クロアチア、Ｓｉｇｅｔｅｃ ＬｕｄｂｒｅｓｋｉのＯＰＧ Ｍａｔｉｊａｓｅｃにおけるアルペンヤギ飼育場で、２５頭のヤギに対しヤギの乳腺炎処置の研究を行った。全てのヤギは、左右の乳房半体において不顕性乳腺炎と診断された。乳が微生物学的調査に対して陽性の試験結果であったヤギを２つの群に分けた。一方の群には、実施例１１からの本発明の組成物を適用し、他方の群には、アモキシシリンおよびクラブラン酸の乳房内懸濁液（クラブキシル（登録商標）；Ｇｅｎｅｒａ、クロアチア）を適用した。すべて３回の適用レジメンによる。半体の忍容性および細菌学的治癒を、実施例１１からの組成物のｉ．ｍａｍ．適用後に並行してモニタリングした。本発明の製剤の３回（２日間）の適用は、７５％の感染した半体、および１４日後に８５％の細菌学的治癒をもたらした。これは、７３．３％の症例において細菌学的治癒を可能にした乳房内抗生物質投与よりも有効であることが判明した。研究の結果は、ヤギにおける実施例１１の組成物による乳腺炎処置が、抗生物質を使用せずに、時間通りに細菌学的治癒をもたらし得ることを示した。
研究の詳細な手順は実施例１８に記載されており、細菌学的治癒の結果は表１８に示される。
Figure 2022520665000022
乳試料に見られる病原体によって引き起こされる乳腺炎の処置に適した広域抗生物質としてのアモキシシリン、および実施例１１からの組成物のｉ．ｍａｍ．塗布の活性を比較すると、後者のより強い活性が証明された。アモキシシリンの適用から７日後、６０％の半体のみが治癒したが、実施例１１の組成物の結果は７５％であった。最初の適用から１４日後、抗生物質適用で細菌学的に治癒した半体の全パーセンテージは７３．３％であったが、試験組成物については８５％であった。
前述の結果から、乳腺炎の処置において、本発明の組成物の抗炎症および抗菌活性において高い有効性を認めることができる。有効性は、広域抗生物質としてアモキシシリンおよびクラブラン酸の固定された組み合わせを有するもの等の古典的な治療の有効性よりも高い。
代替として、ヤギの乳腺炎治療では、実施例１２に記載されているように、乳房内適用のための懸濁液の剤形の本発明の組成物も、成功裏に使用することができる。
本発明の組成物は、その他の特性に加えて、一連の細菌および真菌に対する抗菌活性を特徴とし、抗菌効果は、古典的な抗生物質と比較して、インビトロ条件下よりもインビボで高いと結論付けることができる。それは抗菌剤だけでなく、抗炎症剤および免疫調節剤でもある。
免疫調節プロポリス効果はその抗酸化効果と密接に関連しており、酸化ストレスは乳腺炎の病因の不可欠な部分である。例えば、参考文献３１を参照されたい：
３１）Ｏ．Ａｔａｋｉｓｉ，Ｈ．Ｏｒａｌ，Ｅ．Ａｔａｋｉｓｉ，Ｏ．Ｍｅｒｈａｎ，Ｓ．Ｍｅｔｉｎ Ｐａｎｃａｒｃｉ，Ａ．Ｏｚｃａｎ，Ｓ．Ｍａｒａｓｌｉ，Ｂ．Ｐｏｌａｔ，Ａ．Ｃｏｌａｋ，Ｓ．Ｋａｙａ：Ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｓｔｉｔｉｓ ｃａｕｓｅｓ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ｔｏｔａｌ ｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｎ ｃｏｗ ｍｉｌｋ，Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．８９（２０１０）１０－１３
ウマの創傷治癒症例の総説
雌ウマの前脚の創傷治癒の場合を説明する。これは前脚のエルゴット領域の深い創傷であり、着地中に後脚が前脚をグリップしたときに生じた。実施例１１からの組成物の投与を開始する前に、創傷は、異なる調製物で保存的に処置されたが成功しなかった。
次いで、創傷を生理溶液で洗浄し、乾燥させ、実施例１１からの組成物で１日１回５日間処置した。４８時間後に上皮化のような改善が見られ、９６時間後に創傷の完全な治癒が生じた。雌ウマは数日間にわたって激しく肢を引きずっていたが、その後は跛行の徴候は観察されなかった。回復は完了した。この症例の詳細な説明は、実施例１９に記載されている。
より正確な結論のためには詳細な臨床研究を行う必要があるものの、本組成物が創傷治癒剤として効果的に作用することは当業者には明らかである。抗炎症活性、抗酸化活性および上皮化活性が創傷治癒プロセスに重要であることが文献から知られているため、コラーゲン合成の刺激が、本発明の組成物のように、証明された抗菌活性と共に、薬理学的効果の範囲の一部である。比較のために、参考文献３２を参照されたい：
３２）Ｓ．Ｍａｒｉｎｏｔｔｉ，Ｅ．Ｒａｎｚａｔｏ：Ｐｒｏｐｏｌｉｓ：ａ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｆｏｒ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，Ｂｕｒｎｓ Ｔｒａｕｍａ（２０１５）３：９，ｄｏｉ １０．１１８６／ｓ４１０３８－０１５－００１０－ｚ。
本発明による医薬組成物の使用
本明細書の医薬組成物は、炎症性疾患、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス性疾患、自己免疫疾患、機能性胃腸障害、粘膜再生、熱傷処置および創傷治癒、ならびに癌疾患の群からのヒトおよび動物の疾患および状態の処置に使用される。
含まれる炎症性疾患および状態は、歯肉炎、歯周炎、喉頭炎、胃炎、大腸炎、痔核疾患、皮膚炎、外耳炎症、副鼻腔炎、鼻炎、膣炎および乳腺炎である。
本発明の医薬組成物は、
（ｉ）グラム陽性菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ＭＳＳＡ（メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ；コアグラーゼ陰性ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ；Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ；腸球菌：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ；および
（ｉｉ）グラム陰性菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ；Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ
の群からの細菌によって引き起こされる細菌感染症の処置に使用される。
さらに、本医薬組成物は、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｚｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍ；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ；Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ；およびＭａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ等の真菌によって引き起こされる真菌感染症の処置に使用される。
また、本発明の組成物は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）；エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ポリオウイルス；インフルエンザＡおよびＢウイルス；レトロウイルス；ワクシニアウイルス；一般的な風邪ウイルス：ライノウイルス、ピコルナウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、コロナウイルス、アデノウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）、エンテロウイルス等のウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の処置に使用される。
代替として、本発明による医薬組成物は、乾癬、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病および多発性硬化症等の自己免疫疾患の処置に使用される。
さらに、本発明の医薬組成物は、皮膚および粘膜のがん、胃腸腫瘍、結腸直腸癌等のがん疾患の処置に使用される。
本発明の医薬組成物は、食道、胃、十二指腸、小腸および結腸の障害、中枢性胃腸痛、胆嚢およびオッディ括約筋障害、肛門直腸障害、小児および青年特異的胃腸障害のような機能性胃腸障害の処置に使用される。
具体的には、本発明の組成物は、動物の乳腺炎の処置に使用される。
概論
一次プロポリスとして、Ｈｅｄｅｒａ Ｌｔｄ製のポプラ型の粗プロポリスを使用した。エタノール（９６％）およびポリエチレングリコール２００、４００および６００、ならびに粉末大豆レシチン（ＳＬ）は、Ｆａｇｒｏｎ Ｃｒｏａｔｉａ Ｌｔｄ（ＨＲ）から購入した。菜種レシチン（ＲＬ）および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ）は、Ｐｆａｎｎｅｎｓｃｈｍｉｄｔ（ＤＥ）から購入した。脱油ヒマワリレシチン（ＳＵＬ）は、Ｂａｒｅｎｔｚ（ＮＬ）から購入した。ジステアリン酸アルミニウムは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳ）から購入した。他の全ての出発原料は、現地の供給業者から購入した。
分析目的の化学的に純粋な化合物の試料：ｐ－クマル酸（１；≧９８％ＨＰＬＣ）、トランス－フェルラ酸（２；９９％）、コーヒー酸（３；≧９８％ＨＰＬＣ）、２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（ＣＡＰＥ；４；≧９７％ＨＰＬＣ）、トランス－桂皮酸（５；＞９６．５％ＧＣ）、クリシン（６；≧９８％ＨＰＬＣ）、ピノセンブリン（７；≧９５％ＴＬＣ）、ガランギン（８；≧９５％ＨＰＬＣ）、アピゲニン（９；≧９９％ＨＰＬＣ）およびケンペロール（１０；≧９０％ＨＰＬＣ）は、液体プロポリス抽出物中のそれらの定量的含有量を決定するための定量的分析標準として機能し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（ＵＳ）から購入した。
室温という用語は、２０～２５℃の温度間隔を指す。略称「ｍｉｎ」は、分を表す。収率（理論収率からの％）は、出発抽出溶媒（エタノール、ＰＥＧ、エタノール＋レシチン、ＰＥＧ＋レシチン）の質量に対する単離された液体プロポリス抽出物の重量（％ｗ／ｗ）パーセントとして表される。
液体プロポリス抽出物中の活性物質１～１０の定量的含有量は、１ミリリットル当たりのマイクログラム［μｇ／ｍＬ］の質量濃度（γ）として表されるが、本発明の医薬組成物中のその定量的組成は、最終生成物（剤形）１グラム当たりのマイクログラム［μｇ／ｇ］で表される。
実施例１：抽出溶媒として９６％エタノールを使用することによる液体プロポリス抽出物の調製
抽出前のプロポリスの前処理：粗プロポリスの試料（ポプラ型；１ｋｇ）を－２０℃の冷蔵庫で最低１時間冷却した。次いで、試料をミルで粉砕した。
９６％エタノールによる抽出：エタノール（９６％；７０．００ｇ）を粉砕プロポリス（３０．００ｇ）に添加した。このようにして得られた混合物を、周期的に撹拌しながら室温で７２時間放置した。次いで、濾紙（黒色リボン）を通して混合物を濾過し、わずかに強いプロポリス臭を有する深褐色溶液の形態の６０．００ｇ（８５．７％）の液体プロポリス抽出物を得た。
実施例１０に記載されているアルコールプロポリス抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を試験する目的で、薬物対抽出物（ＤＥＲ）比１：２で同じ手順を繰り返した。
実施例２：抽出溶媒としてポリエチレングリコール４００を使用することによる液体プロポリス抽出物の調製
実施例１に前処理が記載されている粉砕プロポリス（３０．００ｇ）を、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；７０．００ｇ）と混合した。このようにして得られた混合物を、周期的に撹拌しながら室温で７２時間放置した。次いで、濾紙（黒色リボン）を通して混合物を濾過した。これにより、プロポリスに似たわずかに強い臭気のある深褐色の粘性液体の形態の液体プロポリス抽出物５５．００ｇ（７８．６％）が得られた。
実施例１０に記載のポリエチレングリコールプロポリス抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を試験する目的で、薬物対抽出物（ＤＥＲ）比１：２で同じ手順を繰り返した。
実施例３：液体プロポリス抽出物中の活性物質１～１０を定量するためのＨＰＬＣ分析方法
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量分析は、特にプロポリスからの主要な活性物質１～４および付随する活性成分５～１０をモニタリングする目的で開発された方法と共に行った。
活性物質１～１０の市販の標準の試料を、１００μｇ／ｍＬの濃度までエタノール：水混合物、７５：２５、Ｖ／Ｖで希釈することにより、分析用に調製する。
本発明による液体プロポリス抽出物の試料（１００μＬ）を、分析前にエタノール：水混合物、７５：２５、Ｖ／Ｖ（９００μＬ）で１：１０ｗ／ｗの比（１０倍希釈）で希釈した。
オートサンプラー、ポンプ、脱気装置、カラムオーブンおよびＵＶ－ＶＩＳ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ２０１ＣＨＴ機器で、以下の条件下で分析を行った：
（ｉ）クロマトグラフィーカラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃ１８；寸法：１５ｃｍ×３．０ｍｍ；カラム内の粒子径：２．７μｍ；
（ｉｉ）移動相：Ａ＝０．１％ギ酸水溶液、Ｂ＝メタノール；勾配：０ｍｉｎ、８０％Ａ、２０％Ｂ；３ｍｉｎ、７０％Ａ、３０％Ｂ；６０ｍｉｎ、２０％Ａ、８０％Ｂ；９０ｍｉｎ、２０％Ａ、８０％Ｂ；１００ｍｉｎ、７０％Ａ、３０％Ｂ；１０５ｍｉｎ、８０％Ａ、２０％Ｂ；
（ｉｉｉ）カラム温度：３０℃；
（ｉｖ）流量：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ；
（ｖ）分析時間：１１０ｍｉｎ；
（ｖｉ）ＵＶ－ＶＩＳ検出器の波長：検出用：３７０ｎｍ、積分用：２９０ｎｍ；
（ｖｉｉ）注入量：１０μＬ；
（ｖｉｉｉ）圧力：２１０～２９０バール。
前述の条件下で、主要な活性物質１～４および付随する成分５～１０は、以下の保持時間（ｔＲ）を有する：
（ｉ）ｔＲ［ｐ－クマル酸（１）］＝１４．１３ｍｉｎ；ｔＲ［トランス－フェルラ酸（２）］＝１５．３１ｍｉｎ；ｔＲ［コーヒー酸（３）］＝１０．５７ｍｉｎ；ｔＲ［２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート；ＣＡＰＥ（４）］＝４８．６２ｍｉｎ；（ｉｉ）ｔＲ［トランス－桂皮酸（５）］＝２９．７６ｍｉｎ；ｔＲ［クリシン（６）］＝４４．６８ｍｉｎ；ｔＲ［ピノセンブリン（７）］＝４７．３９ｍｉｎ；ｔＲ［ガランギン（８）］＝４９．９４ｍｉｎ；ｔＲ［アピゲニン（９）］＝３７．７２ｍｉｎ；ｔＲ［ケンペロール（１０）］＝３６．８７ｍｉｎ。
主要なプロポリス活性物質１～４および付随する活性成分５～１０の保持時間を表１に示す。
実施例４：エタノールおよびレシチンの混合物をベースとした抽出溶媒の使用による標準化された液体プロポリス抽出物の調製
前処理が実施例１に記載されている粉砕されたプロポリス（３０．００ｇ）を、以下の組成の抽出溶媒と混合した（実験Ｅ１～８）：
Ｅ１：９６％エタノール（６７．００ｇ；９５．７％）および大豆レシチン（ＳＬ；３．００ｇ；４．３％）；
Ｅ２：９６％エタノール（６０．００ｇ；８５．７％）および大豆レシチン（ＳＬ；１０．００ｇ；１４．３％）；
Ｅ３：９６％エタノール（５０．００ｇ；７１．４％）および大豆レシチン（ＳＬ；２０．００ｇ；２８．６％）；
Ｅ４：９６％エタノール（４０．００ｇ；５７．１％）および大豆レシチン（ＳＬ；３０．００ｇ；４２．９％）；
Ｅ５：９６％エタノール（６７．００ｇ；９８．９％）および菜種レシチン（ＲＬ；３．００ｇ ２５％－調製；０．７５ｇレシチン；１．１％）；Ｅ５での理論収量＝６７ｇエタノール＋０．７５ｇレシチン＝６７．７５ｇ；
Ｅ６：９６％エタノール（６０．００ｇ；９６．０％）および菜種レシチン（ＲＬ；１０．００ｇ ２５％－調製；２．５０ｇレシチン；４．０％）；Ｅ６での理論収量＝６０ｇエタノール＋２．５０ｇレシチン＝６２．５０ｇ；
Ｅ７：９６％エタノール（６７．００ｇ；９７．８％）および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ；３．００ｇ ５０％－調製；１．５０ｇ加水分解菜種レシチン；２．２％）；Ｅ７での理論収量＝６７ｇエタノール＋１．５０ｇレシチン＝６８．５０ｇ；
Ｅ８：９６％エタノール（６０．００ｇ；９２．３％）および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ；１０．００ｇ ５０％－調製物；５．００ｇレシチン；７．７％）；Ｅ８での理論収量＝６０ｇエタノール＋５．００ｇレシチン＝６５．００ｇ。
このようにして得られた混合物を室温で１時間撹拌し、周期的に撹拌しながら室温で７２時間放置した。次いで、濾紙（黒色リボン）を通して混合物を濾過した。これにより、プロポリスに似たわずかに強い臭気のある深褐色の粘性液体の形態の液体プロポリス抽出物５０～６０ｇ（７１．０～８５．７％）が得られた。
このようにして調製された一次液体プロポリス抽出物を、実施例３に記載の分析方法に従って、主要な活性物質１～４および付随する成分５～１０の含有量の定量分析に供した。結果を表３および表４に示す。
既知の定量的含有量の活性物質１～４を有する実験Ｅ１～Ｅ８に記載された抽出溶媒（ＥＳ）中のそのように調製された一次液体プロポリス抽出物を、本発明による活性物質１～４の定量的組成物の所望のレベルまで、抽出ステップで使用されたのと同じＥＳで希釈することによって標準化した。
実施例５：ポリエチレングリコール４００およびレシチンの混合物をベースとした抽出溶媒の使用による標準化された液体プロポリス抽出物の調製
前処理が実施例１に記載されている粉砕されたプロポリス（３０．００ｇ）を、以下の組成の抽出溶媒と混合した（実験Ｅ１～Ｅ８）。
Ｅ１：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；６７．００ｇ；９７％）および大豆レシチン（ＳＬ；３．００ｇ；３％）；
Ｅ２：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；６０．００ｇ；９０％）および大豆レシチン（ＳＬ；１０．００ｇ；１０％）；
Ｅ３：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；６７．００ｇ；９８，９％）および菜種レシチン（ＲＬ；３．００ｇ ２５％－調製；０．７５ｇレシチン；１．１％）；Ｅ３の理論収量＝６７ｇ ＰＥＧ４００＋０．７５ｇレシチン＝６７．７５ｇ；
Ｅ４：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；６０．００ｇ；９６．０％）および菜種レシチン（ＲＬ；１０．００ｇ ２５％－調製；２．５０ｇレシチン；４．０％）；Ｅ４での理論収量＝６０ｇ ＰＥＧ４００＋２．５０ｇレシチン＝６２．５０ｇ；
Ｅ５：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；６７．００ｇ；９７，８％）および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ；３．００ｇ ５０％－調製；１．５０ｇ加水分解レシチン；２．２％）；Ｅ５での理論収量＝６７ｇ ＰＥＧ４００＋１．５０ｇレシチン＝６８．５０ｇ；
Ｅ６：ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；６０．００ｇ；９２．３％）および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ；１０．００ｇ ５０％－調製物；５．００ｇレシチン；７．７％）；Ｅ６での理論収量＝６０ｇ ＰＥＧ４００＋５．００ｇレシチン＝６５．００ｇ。
このようにして得られた混合物を室温で１時間撹拌し、周期的に撹拌しながら室温で７２時間放置した。次いで、濾紙（黒色リボン）を通して混合物を濾過した。これにより、プロポリスに似たわずかに強い臭気のある深褐色の粘性液体の形態の液体プロポリス抽出物４５～５５ｇ（６９．０～７８．６％）が得られた。
このようにして調製された一次液体プロポリス抽出物を、実施例３に記載の分析方法に従って、主要な活性物質１～４および付随する成分５～１０の含有量の定量分析に供した。結果を表５および表６に示す。
既知の定量的含有量の活性物質１～４を有する実験Ｅ１～Ｅ６に記載された抽出溶媒（ＥＳ）中のそのように調製された一次液体プロポリス抽出物を、本発明による活性物質１～４の定量的組成物の所望のレベルまで、抽出ステップで使用されたのと同じＥＳで希釈することによって標準化した。
実施例６：ポリエチレングリコール２００および大豆レシチンの混合物をベースとした抽出溶媒の使用による標準化された液体プロポリス抽出物の調製
前処理が実施例１に記載されている粉砕されたプロポリス（３０．００ｇ）を、抽出溶媒、ポリエチレングリコール２００（１４９．８５ｇ；９９．９％）および大豆レシチン（ＳＬ；０．１５ｇ；０．１％）の混合物と混合した。このようにして得られた混合物を室温で１時間撹拌し、周期的に撹拌しながら室温で４８時間放置した。次いで、濾紙（黒色リボン）を通して混合物を濾過した。これにより、プロポリスに似たわずかに強い臭気のある深褐色の粘性液体の形態の液体プロポリス抽出物１３７．００ｇ（９１．３％）が得られた。
次いで、実施例３に記載の方法による定量的ＨＰＬＣ分析を行って、主要な活性物質１～４の定量的含有量を得た。濾液を同じ抽出溶媒、ポリエチレングリコール２００および大豆レシチン（ＳＬ）の混合物、９９．９：０．１ｗ／ｗで、標準化された本発明の液体抽出物の仕様に従って、活性物質１～４含有量の合計レベルまで希釈した。
実施例７：ポリエチレングリコール６００および脱油ヒマワリレシチンの混合物をベースとした抽出溶媒の使用による標準化された液体プロポリス抽出物の調製
前処理が実施例１に記載されている粉砕されたプロポリス（３０．００ｇ）を、抽出溶媒、ポリエチレングリコール６００（ＰＥＧ６００；２９７．００ｇ；９９％）および脱油ヒマワリレシチン（ＳＵＬ；３．００ｇ；１．０％）の混合物と混合した。このようにして得られた混合物を７０℃に加熱し、３時間激しく撹拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、濾紙（黒色リボン）を通して濾過した。これにより、プロポリスに似たわずかに強い臭気のある深褐色の粘性液体の形態の液体プロポリス抽出物２６１．００ｇ（８７．０％）が得られた。
次いで、実施例３に記載の方法による定量的ＨＰＬＣ分析を行って、そこから主要な活性物質１～４の定量的含有量を決定した。濾液を、本発明の標準化された液体抽出物の仕様に従って、同じ抽出溶媒、ポリエチレングリコール６００および脱油ヒマワリレシチン（ＳＵＬ）の混合物、９９：１ｗ／ｗで、活性物質１～４の含有量の合計レベルまで希釈した。
実施例８：ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール６００および加水分解菜種レシチンの混合物をベースとした抽出溶媒の使用による標準化された液体プロポリス抽出物の調製
前処理が実施例１に記載されている粉砕されたプロポリス（３０．００ｇ）を、抽出溶媒、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００；１５０．００ｇ；５０％）、ポリエチレングリコール６００（１３９．５０ｇ；４６．５％）および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ；１０．５０ｇ；３．５％）の混合物と混合した。このようにして得られた混合物を、３時間激しく撹拌しながら１００℃で加熱した。次いで、混合物を室温に冷却し、濾紙（黒色リボン）を通して濾過した。これにより、プロポリスに似たわずかに強い臭気のある深褐色の粘性液体の形態の液体プロポリス抽出物２４５．００ｇ（８１．７％）が得られた。
次いで、実施例３に記載の方法による定量的ＨＰＬＣ分析を行って、そこから主要な活性物質１～４の定量的含有量を決定した。濾液を、本発明の標準化された液体抽出物の仕様に従って、同じ抽出溶媒、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール６００および加水分解菜種レシチン（ＨＲＬ）の混合物、５０：４６．５：３．５（ｗ／ｗ／ｗ）で、活性物質１～４の含有量の合計レベルまで希釈した。
実施例９：ポリエチレングリコール４００および大豆レシチン混合物の使用による標準化された液体プロポリス抽出物の調製
前処理が実施例１に記載されている粉砕されたプロポリス（３０．００ｇ）を、抽出溶媒、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；８７．３０ｇ；９７％ｍ／ｍ）および大豆レシチン（ＳＬ；２．７０ｇ；３％ｗ／ｗ）の混合物と混合した。このようにして得られた混合物を、７２時間定期的に撹拌しながら静置して浸軟させた。次いで、濾紙（８００個の細孔／ｃｍ２）を通して混合物を濾過した。これにより、プロポリスに似た強い臭気の５０～５５ｇの深褐色の粘性液体が得られた。このようにして得られた生成物を、同じ抽出溶媒で６０．００ｇの質量まで希釈した。このようにして、薬物対抽出物（ＤＥＲ）比１：２の最終的な抽出物、または３０ｇの出発プロポリスから前述の６０ｇの抽出物が得られた。
そのように調製された液体プロポリス抽出物を、本発明の医薬組成物調製の目的で、
（Ｉ）活性物質１～４を決定するために実施例３に記載の方法に従い定量的ＨＰＬＣ分析に供し、その後、そのような調製された抽出物中の活性物質１～４の実際の質量濃度に関して、
（ＩＩ）純粋な（新鮮な）溶媒混合物：ポリエチレングリコール４００（９７％ｗ／ｗ）および大豆レシチン（３％ｗ／ｗ）で、活性物質１～４：
（ｉ）１０～１，３００μｇ／ｍＬのｐ－クマル酸（１）；
（ｉｉ）１０～８００μｇ／ｍＬのトランス－フェルラ酸（２）；
（ｉｉｉ）５～３００μｇ／ｍＬのコーヒー酸（３）；および
（ｉｖ）５～４００μｇ／ｍＬの２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；ＣＡＰＥ）；
の質量濃度を係数Ｘ／１００（Ｘ＝医薬組成物の製剤中の前述の標準化された液体プロポリス抽出物の重量パーセント％、ｗ／ｗ）で除した値まで希釈することによって標準化した。
実施例１０：本発明による標準化された液体抽出物の抗菌効果の決定。モデル病原微生物に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
本発明による標準化された液体プロポリス抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、実施例９の生成物を使用して、ＣＬＳＩおよびＥＵＣＡＳＴ法の指示に従って、９６％エタノール（実施例１からの生成物）またはＰＥＧ４００（実施例２からの生成物）を用いて得られた類似の液体プロポリス抽出物と比較して決定した。参考文献２６～２９を参照されたい。
以下のモデル病原性微生物（Ｍ）のＡＴＣＣ株に対してインビトロ条件下で抗菌効果を試験した：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２９２９３（Ｍ１）；メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ＭＲＳＡ（ＭＦＢＦコレクション；Ｍ２）；メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ＭＳＳＡ（ＭＦＢＦコレクション；Ｍ３）；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ９２１２（Ｍ４）；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＶＲＥ（ＭＦＢＦコレクション）（Ｍ５）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１０５３６（Ｍ６）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ４３４９８（Ｍ７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ９０２７（Ｍ８）；およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ９００２８（Ｍ９）。
抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために、連続微量希釈手順を行った。細胞懸濁液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の親培養物から調製し、これらを比濁法によって０．５マクファーランド単位に調整した。ミューラーヒントンブロスに溶解したプロポリス抽出物の溶液１００μＬを添加することによって、１００から０．７１２５μｇ／ｍＬの範囲の９６ウェルマイクロタイタープレートで段階希釈して試験を実施した。１０５ｃｆｕ／ｍＬに調整した各細菌培養物１００μＬを播種した後、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。単一ウェル当たり１０μＬの２，３，５－トリフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ；酸化還元指示薬）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を添加することによってＭＩＣを決定し、３０℃で４時間のインキュベーション後、波長４９０ｎｍで分光光度法によって吸光度を決定した。
ＭＩＣ値は、細菌の８０％の減少が生じたプロポリス抽出物濃度（ＭＩＣ８０）として決定された。
真菌種については、細菌と同じスキームによって、追加のグルコースを含むＲＰＭＩ培地でＭＩＣ値を決定した。インキュベーション（４８時間、３７℃、好気条件、暗所）後、ＸＴＴ（酸化還元指示薬）をメナジオンと組み合わせて添加し、波長５４０ｎｍで分光光度法によって吸光度を決定した。
ＭＩＣ値は、細菌または真菌の８０％の減少が生じたプロポリス抽出物濃度（ＭＩＣ８０）として決定された。
陰性対照は培地および溶媒のみを含有し（微生物およびプロポリスは添加されない）、陽性対照は抗生物質または抗真菌剤に曝露された。
プロポリス溶液の抗菌活性をインビトロで決定することにより最小阻止濃度（ＭＩＣ８０）を測定し、液体抽出物を所与の溶媒に希釈した形態（％）として表９にした。出発液体プロポリス抽出物は、薬物対抽出物（ＤＥＲ）重量比１：２で得られた。これは実施例９からの生成物である。液体抽出物の希釈がより大きい場合、すなわち活性物質１～１０の濃度がＭＩＣに対してより低い場合、試験された抽出物の得られる抗菌効果はより高い。
結果を表９に示す。
表１０～１５には、各特定の活性物質１～１０の［μｇ／ｍＬ］での質量濃度（γ）の計算値が示されており（３つの試験した液体プロポリス抽出物のそれぞれから）、各特定の抽出物がＭＩＣを達成した。以下の抽出溶媒（ＥＳ）を用いて抽出物を得た：９６％エタノール（実施例１からの生成物）、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００；実施例２からの生成物）、ならびにＰＥＧ４００（９７％ｗ／ｗ）および大豆レシチン（３％ｗ／ｗ）の混合物（実施例９からの生成物）。これらは、ＤＥＲが１：２である一次液体抽出物から決定され、対応するＭＩＣが達成された希釈（係数）で除した値である。
実施例１１：最低１５０μｇ／ｇの活性物質１～４を含む乳房内適用のための溶液の剤形の本発明の組成物の調製
製剤（１００ｇ溶液用）：
（１）最低３００μｇ／ｍＬの活性物質１～４で標準化された、実施例９の生成物である本発明による５０．００ｇ（５０．００％ｗ／ｗ）の液体プロポリス抽出物
（２）５０．００ｇ（２０．００％ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール４００
調製：成分（１）および（２）を混合し、室温で５分間撹拌することによって均質化した。溶液を濾紙で濾過し、４～８ｇごとに乳房内注入器に充填した。
溶液組成：最低１５０μｇ／ｇの活性物質１～４の総濃度。定量的ＨＰＬＣ分析の結果を表１６に示し、対応する典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを図５に示す。
実施例１２：最低１００μｇ／ｇの活性物質１～４を含む乳房内適用のための懸濁液の剤形の本発明の組成物の調製
製剤（１００ｇ懸濁液用）：
（１）最低１５０μｇ／ｍＬの活性物質１～４で標準化された、実施例９の生成物である本発明による７７．００ｇ（７７．００％ｗ／ｗ）の液体プロポリス抽出物
（２）２０．００ｇ（２０．００％ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール４０００
（３）３．００ｇ（３．００％ｗ／ｗ）のジステアリン酸アルミニウム
調製：ポリエチレングリコール（２）を６０℃で溶融し、ジステアリン酸アルミニウム（３）を添加し、この温度で１５分間均質化した。次いで、混合物を撹拌しながら冷却し、プロポリス抽出物（１）を４０～４５℃で添加した。混合物を撹拌しながら室温にさらに冷却し、加えて室温で１５分間均質化した。淡黄色の粘性懸濁液が得られ、これを４～８ｇごとに乳房内注入器にさらに充填した。
懸濁液組成：最低１００μｇ／ｇの活性物質１～４の総濃度
実施例１３：最低２５０μｇ／ｇの活性物質１～４を含むゲルの剤形の本発明の組成物の調製
製剤（１００ｇゲル用）：
（１）最低８５０μｇ／ｍＬの活性物質１～４で標準化された、実施例９の生成物である本発明による３０．００ｇ（３０．００％ｗ／ｗ）の液体プロポリス抽出物
（２）２．００ｇ（２．００％ｗ／ｗ）のＣａｒｂｏｐｏｌ９４０
（３）１．００ｇ（１．００％ｗ／ｗ）のポリソルベート６０
（４）０．２０ｇ（０．２０％ｗ／ｗ）のソルビン酸カリウム
（５）０．３０ｇ（０．３０％ｗ／ｗ）の安息香酸ナトリウム
（６）０．３０ｇ（０．３０％ｗ／ｗ）のクエン酸、無水
（７）適量の水酸化ナトリウム（２０％溶液）
（８）１００％までの精製水
調製：本発明による液体プロポリス抽出物３０ｇに（２）を添加し、室温で２０分間撹拌することによって均質化した。次いで、５０ｇの精製水（８）を添加し、室温で５分間撹拌することによって均質化した。その後、成分（３～６）を添加し、１０分間撹拌して溶解した。次いで、（７）でｐＨ値を５．５～６に調整した。このようにして得られたゲルに、残りの量の精製水を合計質量１００ｇまで添加し、室温で１５分間撹拌することによって均質化し、最終的に生成物を脱気した。
ゲル組成：最低２５０μｇ／ｇの活性物質１～４の総濃度。
実施例１４：最低１００μｇ／ｇの活性物質１～４を含むクリームの剤形の本発明の組成物の調製
製剤（１００ｇクリーム用）：
（１）最低５００μｇ／ｍＬの活性物質１～４で標準化された、実施例９の生成物である本発明による２０．００ｇ（２０．００％ｗ／ｗ）の液体プロポリス抽出物
（２）５．００ｇ（５．００％ｗ／ｗ）のポリソルベート６０
（３）５．００ｇ（５．００％ｗ／ｗ）のラノリン、無水
（４）２．００ｇ（２．００％ｗ／ｗ）の蜜蝋、白色
（５）８．００ｇ（８．００％ｗ／ｗ）のセチルアルコール
（６）８．００ｇ（８．００％ｗ／ｗ）ワセリン、白色
（７）１０．００ｇ（１０．００％ｗ／ｗ）の鉱油、濃厚
（８）０．２０ｇ（０．２０％ｗ／ｗ）の４－クロロ－ｍ－クレゾール
（９）１００％までの精製水
調製：成分（２～７）の混合物を６５～７０℃で１５～２０分間、ほぼ無色の油性液体が形成されるまで溶融することによって油相を調製した。（８）および（１）を精製水に溶解し、その後撹拌しながら６５～７０℃に加熱することによって水相を調製した。次いで、水相を、好ましくは１，０００～３，０００回転／分（ｒ．ｐ．ｍ．）の高剪断均質化を可能にするホモジナイザーを用いて、激しく混合しながら１５～２０分間油性相にゆっくりと添加した。このようにして得られたエマルジョンをさらに激しく撹拌し、６５～２０℃の温度で３０分間徐々に冷却した。
クリーム組成：最低１００μｇ／ｇの活性物質１～４の総濃度
実施例１５：最低５００μｇ／ｇの活性物質１～４を含む軟膏の剤形の本発明の組成物の調製
製剤（１００ｇ軟膏用）：
（１）最低１，０００μｇ／ｍＬの活性物質１～４で標準化された、実施例９の生成物である本発明による５０．００ｇ（５０．００％ｗ／ｗ）の液体プロポリス抽出物
（２）１０．００ｇ（１０．００％ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール４００
（３）４０．００ｇ（４０．００％ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール４０００
調製：成分（１～３）を慎重に混合し、６０℃に加熱し、５分間撹拌することによって均質化し、混合しながら室温に徐々に冷却した。
軟膏組成：最低５００μｇ／ｇの活性物質１～４の総濃度
実施例１６：最低５０μｇ／ｇの活性物質１～４を含む経鼻スプレーの剤形の本発明の組成物の調製
製剤（スプレー用の１００ｇ溶液用）：
（１）最低１，０００μｇ／ｍＬの活性物質１～４で標準化された、実施例９の生成物である本発明による５．００ｇ（５．００％ｗ／ｗ）の液体プロポリス抽出物
（２）０．６０ｇ（０．６０％ｗ／ｗ）の塩化ナトリウム
（３）０．１０ｇ（０．１０％ｗ／ｗ）のポリソルベート６０
（４）０．１０ｇ（０．１０％ｗ／ｗ）のソルビン酸カリウム
（５）０．１０ｇ（０．１０％ｗ／ｗ）の安息香酸ナトリウム
（６）０．２０ｇ（０．２０％ｗ／ｗ）のクエン酸、無水
（７）０．０１ｇ（０．０１％ｗ／ｗ）のエデト酸ナトリウム（Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ）
（８）１００％までの精製水
調製：９０ｇの精製水（１）に、成分（２～７）を添加し、室温で１５分間撹拌することによって溶解した。次いで、（１）を添加し、混合物を室温で１５分間均質化した。その後、溶液を滅菌０．２ｐｍフィルタで濾過し、鼻への適用のためのクロージャおよびスプレーポンプを備えた適切な滅菌ボトルに充填した。
溶液組成：最低５０μｇ／ｇの活性物質１～４の総濃度
実施例１７：乳牛の乳腺炎処置における実施例１１の乳房内溶液の形態の本発明の組成物の抗炎症活性の研究
ウシにおける乳腺炎処置の研究を、ホルスタイン種の乳牛の５つの飼育場で行った。合計８６頭のウシまたは３３９の分房が研究に含まれ、乳房の分房が統計単位として使用された。動物を深い寝床で自由に飼育し、抗生物質を添加せずに乳牛用の標準的なプレミックスを与えた。この試験は獣医学倫理委員会によって承認された。２００，０００／ｍＬ未満の体細胞数（ＳＣＣ）を有する乳腺炎の臨床症状のない健康な動物および分房、ならびに２００，０００／ｍＬを超えるＳＣＣを有する感染した分房を含めた。安全性および有効性の無作為化クロスオーバー臨床試験を、地形条件下で溶液の形態の本発明の組成物の乳房内（ｉ．ｍａｍ．）適用で行った。朝の搾乳中、夕方の搾乳中および翌日の朝の搾乳後に、実施例１１の本発明の組成物を、牛の乳房の４つ全ての分房に３回適用した。最初に、乳房内適用における組成物の耐容性を試験した。ウシの行動の変化、ならびに乳房の肉眼的外観（浮腫および発赤）、乳および触覚に対する乳房の感度をモニタリングした。乳中の体細胞数（ＳＣＣ）の変化を、組成物の最初のｉ．ｍａｍ．適用前の期間から最初の適用から７日後までモニタリングした。乳試料およびさらに分房を、ＳＣＣが上昇または２００，０００／ｍＬ未満であるかどうか、および試料が細菌学的調査に対して陽性または陰性であるかどうかに応じて群分けした。参考文献３３を参照されたい：
３３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（１９９２）：Ｌｏｃａｌ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｏｗｓ．Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ８１／８５２／ＥＥＣ
次いで、細菌学的治癒の有効性試験を、不顕性乳腺炎の処置におけるｉ．ｍａｍ．製剤の唯一の有効性尺度である欧州医薬品庁（ＥＭＡ）の指示に従って、プロポリス組成物を用いて行った。これは、所与の製剤のｉ．ｍａｍ．適用後のある特定の期間内に収集された乳の試料中に、以前に確認された病原体が存在しないこととして定義される。参考文献３４を参照されたい：
３４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（２０１７）：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔ ｏｆ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．ＣＶＭＰ．ＥＭＡ／ＣＶＭＰ／３４４／１９９９－Ｒｅｖ．２
乳試料採取は、標準的な方法で行った。微生物学的調査は、標準的な指示に従って行った。参考文献３５を参照されたい：
３５）Ｊ．Ｗ．Ｈｏｇａｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｂｏｖｉｎｅ ｍａｓｔｉｔｉｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｓｔｉｔｉｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ（１９９９）Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＳＡＤ
ウシの乳腺炎からの細菌学的治癒の結果を、表１７に示す。
実施例１８：ヤギの乳腺炎処置における実施例１１の乳房内溶液の形態の本発明の組成物の抗炎症活性の研究
ヤギにおける乳腺炎処置の研究を、左右の乳房半体に不顕性乳腺炎と診断された２５匹のヤギで行った。乳が微生物学的調査に対して陽性であったヤギを２つの群に分けた。一方の群には、実施例１１からの本発明の組成物を適用し、他方の群には、アモキシシリンおよびクラブラン酸の乳房内懸濁液（クラブキシル（登録商標）；Ｇｅｎｅｒａ、クロアチア）を適用した。すべて３回の適用レジメンによる。
半体の忍容性および細菌学的治癒を、実施例１１からの組成物のｉ．ｍａｍ．適用後に並行してモニタリングした。調製物を、前述の抗生物質または実施例１１からの組成物を用いて３回（２日）レジメンによって適用した。
研究中、ヤギを小屋の深い寝床の中に保った。授乳期間中のヤギは１７０匹であり、約３００日間継続する１回の授乳期間中のヤギ当たりの乳の平均生産量は５００～６００ｋｇであった。それらには、必要に応じて、ヤギ１匹当たり最低２ｋｇの干し草を与え、ヤギ１匹当たり約１ｋｇの約１６％タンパク質を含有するプレミックスを与えた。朝と夕方の搾乳中に２つの部分に分けた。２％ビタミン－ミネラルプレミックスＯｖｉｓａｎ（登録商標）（Ｓａｎｏ Ｃｏｍｐａｎｙ、クロアチア）を、プレミックスに添加した。細菌検査で乳が陽性であったヤギを２つの群に分けた。一方の群（処置された半体の数、Ｎ＝２０）には、実施例１１からの組成物を適用し、他方の群（Ｎ＝１５）では、アモキシシリンとクラブラン酸との乳房内懸濁液（クラブキシル（登録商標）；Ｇｅｎｅｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ、クロアチア）を適用した。すべて３回の適用レジメンによる。
実施例１１からの組成物の忍容性の試験中、ヤギの行動変化も、乳房（浮腫および発赤）ならびに乳の肉眼的外観も、触覚に対する乳房感受性も観察されなかった。最初の数回のジェットの搾乳後に、左右の乳房の半体からの乳試料を、予め印を付けた滅菌プラスチックチューブに採取した。試料は、実施例１１からの製剤の最初の適用前、最初の適用から１２時間後、最初の適用から２４時間後、および組成物の最初の適用後７日目に採取した。乳試料を翌日まで４℃に保ち、Ｃｒｏａｔｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで乳腺炎および生乳の品質について実験室で分析した。
細菌学的治癒の有効性の試験は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）の指示に従って行った。参考文献３４を参照されたい。乳試料採取は標準的な方法で行い、微生物学的検査は標準的な手順に従って行った。参考文献３５を参照されたい。
ヤギの乳腺炎からの細菌学的治癒の結果を、表１８に示す。
実施例１９：溶液の形態での実施例１１からの本発明の組成物の投与による雌ウマの脚の創傷治癒の成功の総説
雌ウマの前肢の創傷治癒の場合について説明する。それは、雌ウマの後脚がダウンホール中に前脚をグリップしたときに生じた前脚のエルゴット領域の深い創傷であった。実施例１１からの組成物の投与を開始する前に、創傷は、異なる調製物で保存的に処置されたが成功しなかった。
雌ウマがギャロップする間、雌ウマが後肢を伸ばしすぎたときに創傷が形成された。次いで、後肢の蹄および馬蹄の頭部が前足の指関節領域を損傷した。これにより、２×４ｃｍの寸法を有する楕円形状の創傷が生じた。雌ウマは、損傷直後に跛行の徴候を示し、４／５としてスコア化された（米国ウマ科医師会）。損傷直後に創傷部を剃毛し、通常の冷水で洗い流し、その後、ヨウ素（ポビドンヨード、０．０１％）で処置し、硝酸銀スプレーを噴霧した。感染性汚染を回避するために創傷部を閉じた。雌ウマは破傷風に対して既にワクチン接種されていたため、ＴＡＴ血清は適用しなかった。雌ウマを２週間安静にし、創傷を機械的洗浄によって毎日処置し、清潔かつ乾燥状態に保った。創傷をヨウ素および硝酸銀スプレーで４８時間毎に処置した。５日後、創傷は治癒し始め、回復しつつあった。次いで、亜鉛－ビタミン軟膏での創傷の処置を開始した。２週間後、雌ウマを再び作業に導入した。しかしながら、雌ウマがギャロップを開始するとすぐに、創傷は出血し始めた。創傷を再びヨウ素で消毒し、乳房内適用のための製剤中のセファロスポリンベースの局所抗生物質を適用した（Ｃｏｂａｃｔａｎ（登録商標））。機械的創傷洗浄と共に、創傷を抗生物質でさらに５日間局所的に処置した。次いで、雌ウマでさらに作業を試みたが、創傷は再び出血し始めた。
その後、創傷部を生理溶液で洗浄し、乾燥させ、実施例１１の組成物で１日１回、５日間処置した。上皮化により視認され得る改善は４８時間後に観察することができたが、完全な治癒は９６時間後に生じた。雌ウマは最初の数日間だけ跛行していたが、その後、跛行の徴候は観察されなかった。回復は完了した。
結論
実験結果は、抽出溶媒（ＥＳ）の０．１～３．５質量％の量のレシチンと組み合わせたＰＥＧ４００等の液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の特定の混合物が、予想外にも、９６％エタノール、ＰＥＧ４００等の純粋な溶媒、またはＥｔＯＨおよび同じレシチンの混合物と比較して、活性プロポリス物質であるｐ－クマル酸（１）、トランス－フェルラ酸（２）、コーヒー酸（３）および２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４）を効果的および化学選択的に抽出することを示した。
一次液体プロポリス抽出物中の主要な活性物質１～４および付随する成分５～１０の正確な定量的組成は、本発明において開発された適切な分析ＨＰＬＣ法の使用によって決定される。次いで、そのような一次抽出物は、抽出ステップで使用したのと同じ抽出溶媒（ＥＳ）で標準化される。これにより、既知の標準化された濃度の主要な活性物質１～４を含む、本発明による液体プロポリス抽出物が得られる。このようにして調製された標準化プロポリス抽出物は、活性医薬成分（ＡＰＩ）、活性化粧品成分（ＡＣＩ）、または機能性食品および食品サプリメントを製造するための食品成分として使用される。
主要な活性物質であるｐ－クマル酸（１；１０～１，３００μｇ／ｇ）、トランス－フェルラ酸（２；１０～８００μｇ／ｇ）、コーヒー酸（３；５～３００μｇ／ｇ）、および２－フェネチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート（４；５～４００μｇ／ｇ）を含有する前述の液体プロポリス抽出物をベースとした本発明の組成物は、炎症性疾患、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス性疾患、自己免疫疾患、機能性胃腸障害の治療、粘膜再生、熱傷の処置および創傷治癒、ならびにがん疾患の処置に有効な薬剤である。
液体プロポリス抽出物およびそれをベースとした医薬組成物の広範な実用的用途により、本発明の産業上の利用可能性は明らかである。

Claims (27)

  1. （Ａ）０．１～１０．０％ｗ／ｗの乾燥プロポリス抽出物；および
    （Ｂ）９０．０～９９．９％ｗ／ｗの抽出溶媒
    からなる、医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としての液体プロポリス抽出物であって；
    前記抽出溶媒は、
    （Ｂ．１）９６．５～９９．９％ｗ／ｗの１種または複数種の液体ポリエチレングリコール＜ＰＥＧ＞２００～６００；および
    （Ｂ．２）０．１～３．５％ｗ／ｗのレシチンまたは加水分解レシチン
    からなり、前記液体プロポリス抽出物は、
    （Ｉ）１：２～１：２０ｗ／ｗの薬物としての粗プロポリスおよび最終抽出物の定量的重量比＜ＤＥＲ＞；ならびに
    （ＩＩ）ｐ－クマル酸＜１＞、トランス－フェルラ酸＜２＞、コーヒー酸＜３＞および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシシンナメート＜４＞：
    Figure 2022520665000023
    からなる群から選択されるプロポリス活性物質の定量的含有量
    により標準化され、前記の主要な活性物質の４つのうちの最低２つの定量的組成は、
    （ｉ）１００～１，３００μｇ／ｍＬのｐ－クマル酸＜１＞；
    （ｉｉ）７５～８００μｇ／ｍＬのトランスフェルラ酸＜２＞；
    （ｉｉｉ）２５～３００μｇ／ｍＬのコーヒー酸＜３＞；および
    （ｉｖ）４０～４００μｇ／ｍＬの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート＜４；ＣＡＰＥ＞
    である、液体プロポリス抽出物。
  2. 前記液体ポリエチレングリコール＜ＰＥＧ＞が、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬品、化粧品もしくは農薬成分、または食品成分としての液体プロポリス抽出物。
  3. 前記液体ポリエチレングリコール＜ＰＥＧ＞が、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬品、化粧品もしくは農薬成分、または食品成分としての液体プロポリス抽出物。
  4. レシチンまたは加水分解レシチンが、２～１２の親水性－親油性バランス＜ＨＬＢ＞因子を特徴とし、大豆レシチン＜Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ＞、ヒマワリレシチン＜Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ＞、菜種レシチン＜Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ＞；キャノーラレシチン＜Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ＞、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ Ｌ）の卵からのレシチン、前記レシチンの脱油生成物、前記供給源からの水素化レシチン、前記供給源からの加水分解レシチン、前記レシチンの酵素修飾誘導体、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される、請求項１から３に記載の医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としての液体プロポリス抽出物。
  5. レシチンが、大豆＜Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ＞、ヒマワリ＜Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ＞、菜種＜Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ＞もしくはキャノーラ＜Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ＞由来の天然レシチン、脱油、水素化、加水分解もしくは酵素修飾されたレシチン、またはこれらの物質の混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としての液体プロポリス抽出物。
  6. 前記抽出溶媒が、
    （ｉ）９７～９９％ｗ／ｗのポリエチレングリコール＜ＰＥＧ＞２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００またはそれらの混合物；および
    （ｉｉ）１～３％ｗ／ｗの大豆＜Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ＞、ヒマワリ＜Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ＞、菜種＜Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ＞もしくはキャノーラ＜Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ＞由来の天然レシチン、脱オレイン化レシチンもしくは加水分解レシチン；またはこれらの物質の混合物
    からなる、請求項１から５に記載の医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としての液体プロポリス抽出物。
  7. （Ｉ）１：３～１：５ｗ／ｗの比率での最終抽出物に対する薬物としての粗プロポリスの定量的重量比＜ＤＥＲ＞
    ；および
    （ＩＩ）ｐ－クマル酸＜１＞、トランス－フェルラ酸＜２＞、コーヒー酸＜３＞および２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－シンナメート＜４＞からなる群から選択されるプロポリス活性物質の定量的組成
    で標準化され、前記の主要な活性物質の４つのうちの最低２つは、以下の定量的含有量：
    （ｉ）５００～１，３００μｇ／ｍＬのｐ－クマル酸＜１＞；
    （ｉｉ）３００～８００μｇ／ｍＬのトランス－フェルラ酸＜２＞；
    （ｉｉｉ）１００～３００μｇ／ｍＬのコーヒー酸＜３＞；および
    （ｉｖ）１００～４００μｇ／ｍＬの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－シンナメート＜４；ＣＡＰＥ＞
    に対応する、請求項１から３に記載の医薬品、化粧品もしくは農薬成分または食品成分としての液体プロポリス抽出物。
  8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の液体プロポリス抽出物を生成するための方法であって、
    （ｉ）粗プロポリスを－２０℃で最低１時間冷却するステップと；
    （ｉｉ）冷却したプロポリスを１～８ｍｍの細孔でふるいにかけて粉砕するステップと；
    （ｉｉｉ）以下の条件下：
    （ａ）粗プロポリスおよび抽出溶媒の重量比＝１：２～１：２０ｗ／ｗ；
    （ｂ）１０～１５０℃の抽出温度；ならびに
    （ｃ）５分～７２時間の抽出時間
    で抽出溶媒により粗プロポリスを抽出するステップと；
    （ｉｖ）このようにして得られた混合物を、１００ｐｍ～５ｐｍの細孔を有する一連のフィルタを通して濾過し、未溶解残留物および液体プロポリス抽出物を生成するステップと；
    （ｖ）高速液体クロマトグラフィー＜ＨＰＬＣ＞により主要な活性プロポリス物質１～４を定量分析するステップと；
    （ｖｉ）活性物質１～４の望ましい含有量までステップ（ｉｉｉ）で使用された新鮮な抽出溶媒で希釈することにより、ステップ（ｖ）で主要な活性物質１～４の正確な定量的組成が決定された、このようにして得られた液体プロポリス抽出物を標準化するステップと
    を含む方法。
  9. 前記抽出ステップ（ｉｉｉ）が、以下の条件下：
    （ａ）粗プロポリスおよび抽出溶媒の重量比＝１：３～１：５ｗ／ｗ；
    （ｂ）１５～７０℃の抽出温度；ならびに
    （ｃ）１～２４時間の抽出時間
    で行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の液体プロポリス抽出物を生成するための方法。
  10. 高速液体クロマトグラフィー＜ＨＰＬＣ＞法が、以下の条件：
    （ｉ）クロマトグラフィーカラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃ１８；寸法：１５ｃｍ×３．０ｍｍ；カラム内の粒子径：２．７μｍ；
    （ｉｉ）移動相：Ａ＝０．１％ギ酸水溶液、Ｂ＝メタノール；勾配：０ｍｉｎ、８０％Ａ、２０％Ｂ；３ｍｉｎ、７０％Ａ、３０％Ｂ；６０ｍｉｎ、２０％Ａ、８０％Ｂ；９０ｍｉｎ、２０％Ａ、８０％Ｂ；１００ｍｉｎ、７０％Ａ、３０％Ｂ；１０５ｍｉｎ、８０％Ａ、２０％Ｂ；
    （ｉｉｉ）カラム温度：３０℃；
    （ｉｖ）流量：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ；
    （ｖ）分析時間：１１０ｍｉｎ；
    （ｖｉ）ＵＶ－ＶＩＳ検出器の波長：検出用：３７０ｎｍ、積分用：２９０ｎｍ；
    （ｖｉｉ）注入量：１０μＬ；
    （ｖｉｉｉ）圧力：２１０～２９０バール
    で主要な活性物質１～４の定量に使用される、請求項８および９に記載の液体プロポリス抽出物を生成するための方法。
  11. 請求項１から７に記載の標準化された液体プロポリス抽出物の使用であって、該液体プロポリス抽出物が薬物、医療デバイスまたは治療薬からなる群から選択される医薬製品を製造するための活性医薬品成分または賦形剤として用いられる使用。
  12. 請求項１から７に記載の標準化された液体プロポリス抽出物の使用であって、該液体プロポリス抽出物が化粧製品を製造するための活性化粧品成分または賦形剤として用いられる使用。
  13. 請求項１から７に記載の標準化された液体プロポリス抽出物の使用であって、該液体プロポリス抽出物が機能性食品、食品サプリメント、および特別な栄養目的のための食品を製造するための食品成分として用いられる使用。
  14. 請求項１から７に記載の標準化された液体プロポリス抽出物の使用であって、該液体プロポリス抽出物が獣医用医薬製品、動物飼料、動物飼料サプリメント、または獣医学的用途のための治療薬からなる群から選択される獣医学製品を製造するための活性医薬品成分または賦形剤として用いられる使用。
  15. 請求項１から７に記載の標準化された液体プロポリス抽出物の使用であって、該液体プロポリス抽出物が殺真菌剤、殺細菌剤、殺ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤および植物強化剤からなる群から選択される農薬製品を製造するための活性農薬成分または賦形剤として用いられる使用。
  16. （Ｉ）５～９５％ｗ／ｗの請求項１から７のいずれか一項に記載の液体プロポリス抽出物；および
    （ＩＩ）最終組成物の最大１００％ｗ／ｗの、溶液、懸濁液、ゲル、クリーム、軟膏、経口または経鼻適用のためのスプレーからなる群から選択される最終剤形調製に必要な１種または複数種の医薬賦形剤
    からなる医薬組成物であって、
    前記組成物は、以下の値の範囲内の主要な活性プロポリス物質の４つ：
    （ｉ）１０～１，３００μｇ／ｇのｐ－クマル酸＜１＞；
    （ｉｉ）１０～８００μｇ／ｇのトランス－フェルラ酸＜２＞；
    （ｉｉｉ）５～３００μｇ／ｇのコーヒー酸＜３＞；および
    （ｉｖ）５～４００μｇ／ｇの２－フェニルエチル３，４－ジヒドロキシ－トランス－シンナメート＜４；ＣＡＰＥ＞
    のうちの最低２つの定量的含有量を特徴とする、医薬組成物。
  17. 前記医薬賦形剤が、希釈剤、保湿剤、保存剤、キレート剤、抗酸化剤、増粘剤、皮膚軟化剤、乳化剤、等張化剤、およびｐＨ制御剤を含む群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１６および１７に記載の医薬組成物を生成するための方法であって、
    （ｉ）請求項１から７に記載の標準化された液体プロポリス抽出物を希釈剤に添加し、それらを均質化するステップと；
    （ｉｉ）１種または複数の他の賦形剤を添加し、それらを均質化するステップと
    を含み；
    ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、１０～１００℃の温度で、好ましくは２０～６０℃の温度で１～５分間行われ；
    続いて、
    （ｉｉｉ．ａ）溶液もしくはスプレー用溶液の剤形調製の場合、必要に応じて滅菌濾過を含む最終溶液の濾過を実行するステップ；
    （ｉｉｉ．ｂ）ゲルもしくは懸濁液の剤形調製の場合、増粘剤の添加およびその均質化を行うステップ；
    （ｉｉｉ．ｃ）クリームの剤形調製の場合、皮膚軟化剤および乳化剤を混合し、５０～８０℃の温度で１～１５分間均質化することにより脂肪相の調製を行い、次いでステップ（ｉｉ）の溶液を添加し、５０～８０℃に加熱し、続いて高剪断もしくは高圧ホモジナイザーを使用して、５０～８０℃、好ましくは５５～６５℃の温度で１～３０分間乳化し、その後６５～２０°の温度で１０～１２０分間均質化するステップ；または
    （ｉｉｉ．ｄ）軟膏の剤形調製の場合、ステップ（ｉｉ）の溶液を、事前に溶融した皮膚軟化剤、および最終的には乳化剤の混合物と、５０～７０℃の温度で５～３０分間混合し、続いて７０～２０℃の温度で１０～１２０分間均質化するステップと
    を含む方法。
  19. 請求項１６および１７に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が炎症性疾患、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス性疾患、自己免疫疾患、機能性胃腸障害、粘膜再生、熱傷処置および創傷治癒、ならびに癌疾患の群からのヒトおよび動物の疾患および状態の処置に用いられる使用。
  20. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が歯肉炎、歯周炎、喉頭炎、胃炎、大腸炎、痔核疾患、皮膚炎、外耳炎症、副鼻腔炎、鼻炎、膣炎および乳腺炎の群からの炎症性疾患の処置に用いられる使用。
  21. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が以下の群の細菌：
    （ｉ）グラム陽性菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ＜メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ＞、ＭＳＳＡ＜メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ＞、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ；コアグラーゼ陰性ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ；Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ；腸球菌：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；バンコマイシン耐性腸球菌＜ＶＲＥ＞：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ；および
    （ｉｉ）グラム陰性菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ＜Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ＞；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ；Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓによって引き起こされる細菌感染症の処置に用いられる使用。
  22. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物がＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｚｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍ；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ；Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓの群からの真菌によって引き起こされる真菌感染症の処置に用いられる使用。
  23. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が単純ヘルペスウイルス＜ＨＳＶ＞；ヒトパピローマウイルス＜ＨＰＶ＞；エプスタイン－バーウイルス＜ＥＢＶ＞；サイトメガロウイルス＜ＣＭＶ＞；ポリオウイルス；インフルエンザＡおよびＢウイルス；レトロウイルス；ワクシニアウイルス；一般的な風邪ウイルス：ライノウイルス、ピコルナウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス＜ＨＰＩＶ＞、ヒトメタニューモウイルス＜ＨＭＰＶ＞、コロナウイルス、アデノウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス＜ＨＲＳＶ＞、エンテロウイルスの群からのウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の処置に用いられる使用。
  24. 乾癬、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病および多発性硬化症の群からの自己免疫疾患の処置に使用される、請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
  25. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が皮膚および粘膜のがん、胃腸腫瘍、結腸直腸癌の群からのがん疾患の処置に用いられる使用。
  26. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が動物の乳腺炎の処置に用いられる使用。
  27. 請求項１９に記載の医薬組成物の使用であって、食道、胃、十二指腸、小腸および結腸の障害、中枢性胃腸痛、胆嚢およびオッディ括約筋障害、肛門直腸障害、小児および青年特異的胃腸障害の群から選択される機能性胃腸障害の処置に用いられる使用。
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