ES2861436T3

ES2861436T3 - Inhibidores de puntos de control inmunitario para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos

Info

Publication number: ES2861436T3
Application number: ES16757165T
Authority: ES
Inventors: Walter Fiedler; Jasmin Wellbrock; Hauke Stamm; Felix Klingler
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2015-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2036-08-05
Also published as: EA201890428A1; AU2016301961B2; TW201718002A; ZA201708598B; LT3331915T; HUE053763T2; MX2018001351A; CN108473572B; JP2018531215A; JO3620B1; US20190077869A1; SI3331915T1; US20170037133A1; SG10202000914VA; HK1249524A1; IL256874B; IL256874A; TWI719041B; EA039307B1; EP3331915A1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR) y/o TIGIT para el uso en el tratamiento de leucemia mieloide (AML), en donde el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a CD112, CD155 y/o TIGIT, y en donde la composición farmacéutica comprende además una construcción de anticuerpo de Fv monocatenario (scFv) biespecífica que se acopla a células T y comprende un dominio de unión a CD3épsilon y un dominio de unión adicional que elige como diana una molécula superficial seleccionada del grupo que consiste en CD33, CD19 y Flt3.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de puntos de control inmunitario para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona inhibidores de puntos de control inmunitario para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos, en particular AML. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos inhibidores de puntos de control inmunitario y construcciones de anticuerpo capaces de acoplarse a células T.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Entre los enfoques más prometedores para activar la inmunidad antitumoral terapéutica está el bloqueo de puntos de control inmunitario. Los puntos de control inmunitario se refieren a un gran número de rutas inhibidoras programadas en el sistema inmunitario que son cruciales para mantener la autotolerancia y modular la duración y la amplitud de respuestas inmunitarias fisiológicas en tejidos periféricos a fin de minimizar el daño tisular colateral.

En general, las células T no responden a estas interacciones ligando-receptor a menos que reconozcan en primer lugar su antígeno cognado a través del TCR. Muchos de los ligandos se unen a múltiples receptores, algunos de los cuales aportan señales coestimulantes y otros aportan señales inhibidoras. En general, los pares de receptores coestimulantes-inhibidores que se unen al mismo ligando o ligandos - tales como CD28 y antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA4) - presentan distintas cinéticas de expresión con el receptor coestimulante expresado sobre células T vírgenes y en reposo, pero el receptor inhibidor comúnmente es regulado al alza después de la activación de células T. Una familia importante de ligandos unidos a la membrana que se unen a receptores tanto coestimulantes como inhibidores es la familia B7. Todos los miembros de la familia B7 y sus ligandos conocidos pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Muchos de los receptores para miembros de la familia B7 más recientemente identificados no se han identificado todavía. Los miembros de la familia de TNF que se unen a moléculas de la familia de receptores de TNF cognados representan una segunda familia de pares de ligando regulador-receptor. Estos receptores aportan predominantemente señales coestimulantes cuando se acoplan mediante sus ligandos cognados.

Otra categoría principal de señales que regulan la activación de células T proviene de citocinas solubles en el microambiente. La comunicación entre células T y APCs es bidireccional. En algunos casos, esto se produce cuando los propios ligandos señalan a la APC. En otros casos, las células T activadas regulan al alza ligandos, tales como CD40L, que se acoplan a receptores cognados sobre APCs.

Sin embargo, los tumores cooperan con ciertas rutas de puntos de control inmunitario como un mecanismo principal de resistencia inmunitaria, particularmente contra células T que son específicas para antígenos tumorales. Debido a que muchos de los puntos de control inmunitario son iniciados por interacciones ligando-receptor, se pueden bloquear mediante anticuerpos o modular mediante formas recombinantes de ligandos o receptores. Los anticuerpos para CTLA4 fueron los primeros de esta clase de inmunoterapia en alcanzar la aprobación por la FDA. Hallazgos clínicos preliminares con bloqueadores de proteínas de puntos de control inmunitario adicionales, tales como PD-1, indican amplias y diversas oportunidades para mejorar la inmunidad antitumoral con el potencial de producir respuestas clínicas duraderas. Por ejemplo, Krupka y cols. ("Blockade of the PD-1/PD-L1 axis augments lysis of AML cells by the CD33/CD3 BiTE® antibody construction AMG 330: reversing a T-cell-induced immune escape mechanism.", LEUKEMIA FEB 2016, vol. 30, n° 2, páginas 484-491) divulga el uso de un anticuerpo anti-PD-1 en combinación con la construcción del anticuerpo anti-CD33/CD3 BiTE® para destruir células de AML in vitro.

Así, la inmunoterapia del cáncer también se enfoca al desarrollo de agentes que puedan hacer a las células neoplásicas y cancerosas más propensas a la destrucción por el sistema inmunitario, particularmente por células T. Por ejemplo, esto se puede alcanzar al interferir con proteínas de los puntos de control inmunitario, bien con ligandos, bien con receptores o bien con ambos. Aunque el conocimiento de moléculas de los puntos de control inmunitario, así como el conocimiento de qué moléculas de los puntos de control inmunitario son usadas por qué células cancerosas se incrementa, no se sabe cuál de ellas puede ser usada por qué células neoplásticas y a continuación cancerosas para evadir el sistema inmunitario, ganando de ese modo la capacidad de crecimiento descontrolado. Se sabe mientras tanto que, por ejemplo, los cánceres hemáticos, en particular la leucemia mieloide (AML), evaden el sistema inmunitario. Aunque se especula que las proteínas de los puntos de control inmunitario pueden estar implicadas, todavía no existe ninguna prueba de esto. Sánchez-Correa Beatriz y cols. ("Natural killer cell immunosenescence in acute myeloid leukaemia patients: new targets for immunotherapeutic strategies?", CANCER IMMUNOLOGY , IMMUNOTHERAPY : CII a Br 2016, vol. 65, n° 4, páginas 453-463) revisa el mecanismo de anergia de células NK en AML, analiza la regulación de células NK a través de los ligandos TIGIT y DNAM-1 (es decir, CD112, CD155) y analiza la expresión de CD112 sobre células de AML. Hou Shengke y cols. ("Recombinant soluble CD226 protein directly inhibits cancer cell proliferation in vitro.", INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY MAR 2014, vol. 19, n° 1, marzo 2014, páginas 119-126) divulga el uso de sCD266 (CD226 soluble, es decir DNAM-1) para inhibir el crecimiento de células leucémicas (Punto 3.3). CD226 es un receptor tanto para CD112 como para CD155. Así, sCD226 es al menos un inhibidor de CD112/CD226 y la interacción CD155/CD226. Así, existe una necesidad no cumplida de proporcionar medios y métodos para anular la influencia de proteínas de los puntos de control inmunitario a fin de hacer a las células de cáncer hemático más propensas al acceso de la maquinaria de destrucción del sistema inmunitario.

Según esto, el problema técnico subyacente a la presente solicitud es satisfacer esta necesidad no cumplida, es decir proporcionar medios y métodos para hacer a las células de cánceres hemáticos, particularmente células de AML, más propensas a la destrucción por el sistema inmunitario del cuerpo. La solución es, en general, el suministro de inhibidores de los ligandos de puntos de control inmunitario CD112, CD155, su receptor TIGIT para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos, en particular AML. Dicha solución también se refleja en las reivindicaciones, encarnadas en la descripción, se ejemplifica en los Ejemplos adjuntos y se ilustra en las Figuras.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La materia de la invención se identifica en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a compuestos que modulan el sistema inmunitario para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos, tales como linfoma o leucemia, particularmente AML. Por otra parte, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dichos compuestos inmunomoduladores y, como un aspecto de la divulgación, células T receptoras de antígenos quiméricos (células T CAR). Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dichos compuestos inmunomoduladores y una construcción de anticuerpo capaz de acoplarse a células T.

A este respecto, la presente invención presta atención a la necesidad de proporcionar nuevos puntos de control inmunitario en la terapia de cánceres hemáticos, particularmente la terapia de AML, que pueden estar influenciados por diversos inhibidores a fin de tratar células cancerosas que han desarrollado mecanismos de escape inmunitario. En particular, los presentes inventores descubrieron CD112, CD155 y TIGIT - y, como aspectos de la divulgación galectina 9 y TIM-3 - como nuevas proteínas de puntos de control inmunitario que se pueden elegir como diana específicamente para la terapia de cánceres hemáticos, particularmente AML. De ese modo, los inhibidores contra CD112, CD155 y/o TIGIT - y como aspectos de la divulgación galectina 9 y/o TIM-3 - conducen a un incremento significativo de la lisis celular de células de AML. Adicionalmente, los inventores descubrieron que el impacto de dichos inhibidores de puntos de control inmunitario puede ser incluso más eficaz cuando se combinen - como un aspecto de la divulgación células T receptoras de antígenos quiméricos (células T CAR) - o construcciones de anticuerpo capaces de acoplarse a células T, tales como la construcción de anticuerpo biespecífica que se acopla a células T (BiTE®) AMG 330 que tiene doble especificidad para CD3 y CD33. Así, los compuestos y la composición de la presente invención permiten una nueva opción terapéutica para pacientes con cáncer hemático, en particular AML, proporcionando así un modo prometedor para hacer a las células de cáncer hemático más propensas a la destrucción por las defensas del cuerpo. Según esto, la presente invención indica amplias y diversas oportunidades para mejorar la actividad antitumoral y proporciona compuestos y una composición que parecen tener el potencial de alcanzar respuestas clínicas duraderas.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un inhibidor contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR) y/o TIGIT para el uso en un método de tratamiento de cánceres hemáticos, en particular leucemia mieloide (AML). Un primer grupo de este inhibidor inhibe la interacción entre ligandos y receptores de proteínas de puntos de control inmunitario según se describe en la presente. Así, se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra CD112 inhiba la interacción entre CD112 y TIGIT. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra CD155 inhiba la interacción entre CD155 y TIGIT. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra TIGIT inhiba la interacción entre TIGIT y CD112. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra TIGIT inhiba la interacción entre TIGIT y CD155. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor contra galectina 9 inhiba la interacción entre galectina 9 y TIM-3. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor contra TIM-3 inhiba la interacción entre TIM-3 y galectina 9. El inhibidor usado en la presente invención es una construcción de anticuerpo.

Como un aspecto de la divulgación, también se prevé que el inhibidor pueda comprender además una célula T CAR. El inhibidor también puede comprender una construcción de anticuerpo que sea capaz de acoplarse a células T. La construcción de anticuerpo capaz de acoplarse a células T comprende preferiblemente un dominio de unión a CD3 y un dominio de unión adicional que elige como diana una molécula superficial expresada sobre células de AML. Dicha molécula superficial se puede seleccionar del grupo que consiste en CD33, CD19 y Flt3. La construcción de anticuerpo capaz de acoplarse a células T es preferiblemente una molécula de unión capaz de unirse a CD3épsilon. El inhibidor puede comprender además un inmunoestimulante.

Un grupo adicional de inhibidores de puntos de control inmunitario reduce la expresión de proteínas de puntos de control inmunitario según se describe en la presente. Según esto, se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra CD112 reduzca la expresión de CD112. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra CD155 reduzca la expresión de CD155. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra TIGIT reduzca la expresión de TIGIT. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor contra galectina 9 incremente la expresión de galectina 9. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor contra TIM3 incremente la expresión de TIM-3. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor sea un ARNi. Se prevé que el inhibidor desactive CD112, CD155 y/o TIGIT. La desactivación se puede alcanza mediante la técnica CRISPR/cas9.

Otro grupo de inhibidores de puntos de control inmunitario modula la señalización intracelular de las proteínas de los puntos de control inmunitario según se describe en la presente. Así, se prevé que en inhibidor usado en la presente invención contra CD112 module la señalización intracelular de CD112. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra CD155 module la señalización intracelular de CD155. Se prevé que el inhibidor usado en la presente invención contra TIGIT module la señalización intracelular de TIGIT. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor contra galectina 9 module la señalización intracelular de galectina 9. Como un aspecto de la divulgación, se prevé que el inhibidor contra TIM-3 module la señalización intracelular de TIM-3.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR), galectina 9, TIM-3 y/o TIGIT y una célula T c A r . Dicho inhibidor contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR) y/o TIGIT puede ser una construcción de anticuerpo.

En un aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR) y/o TIGIT y una construcción de anticuerpo que es capaz de acoplarse a células T. Dicha construcción de anticuerpo capaz de acoplarse a células T puede comprender un dominio de unión a CD3 y un dominio de unión adicional que elige como diana una molécula superficial expresada sobre células de AML.

Se debe apuntar que, según se usan en la presente, las formas singulares "un", "uno(a)" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de estos reactivos diferentes y la referencia a "el método" incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos normales en la especialidad que se podrían modificar o sustituir por los métodos descritos en la presente.

A menos que se indique otra cosa, se ha de entender que el término "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a cualquier elemento de la serie.

El término "y/o", siempre que se use en la presente, incluye el significado de "y", "o" y "la totalidad o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".

El término "alrededor de" o "aproximadamente", según se usa en la presente, significa dentro de 20%, preferiblemente dentro de 10% y más preferiblemente dentro de 5% de un valor o intervalo dado. Incluye, sin embargo, también el número concreto, p. ej., alrededor de 20 incluye 20.

El término "menor de" o "mayor de" incluye el número concreto. Por ejemplo, menor de 20 significa menor de o igual a. De forma similar, más de o mayor de significa más de o igual a, o mayor de o igual a, respectivamente.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implicarán la inclusión de un número entero o una etapa o un grupo de números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de número entero o etapa. Cuando se usa en la presente, el término "que comprende" se puede sustituir por el término "que contiene" o "que incluye" o a veces cuando se usa en la presente por el término "que tiene".

Cuando se usa en la presente, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en la presente, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y nuevas de la reivindicación.

En cada caso en la presente, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" se puede reemplazar por cualquiera de los otros dos términos.

Se debe entender que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos, el material, los reactivos y las sustancias, etc., particulares descritos en la presente y como tales pueden variar. La terminología usada en la presente con este propósito para describir solamente realizaciones particulares, y no está destinada a limitar el alcance de la presente invención, que se define solamente por las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Expresión de proteínas de PVR, PVRL2 y galectina 9 sobre diferentes líneas celulares de AML en comparación con PBMCs procedentes de donantes sanos. La expresión de proteínas se determinó mediante FACS. Todas las líneas celulares de AML examinadas son alrededor de 100% positivas con respecto a la expresión de proteínas de PVR y PVRL2. En contraste, solo 52% y 40% de PBMCs procedentes de donantes sanos expresan PVR y PVRL2, respectivamente. La densidad de proteínas (supuesta mediante MFI) para PVR y PVRL2 es muy alta en comparación con la densidad muy baja sobre PBMCs. La expresión y la densidad de proteína de galectina 9 es baja y comparable a PBMCs procedentes de donantes sanos. La columna de la izquierda muestra la expresión de PVR, la columna del medio muestra la expresión de PVRL2, la columna de la derecha muestra la expresión de galectina 9.

Figura 2: Expresión de proteínas de PVR y PVRL2 por blastos primarios de pacientes con AML. MNCs de pacientes con AML de novo se han aislado y teñido simultáneamente con respecto a CD33 y PVR o PVRL2, respectivamente. Se representa aquí el porcentaje de compartición de células positivas a PVR o PVRL2 dentro de la población de CD33. La columna de la izquierda muestra la expresión de PVRL2, la columna de la derecha muestra la expresión de PVR.

Figura 3: Ensayo in vitro que mide citotoxicidad derivada de PBMC usando anticuerpos de bloqueo contra PVR y PVRL2 en combinación con AMG330.

Figura 4: Los anticuerpos de bloqueo de PVR intensifican la destrucción en ensayos de citotoxicidad (línea celular MV441). El anticuerpo de bloqueo de PVR D171 intensifica significativamente la destrucción de células de un modo dependiente de la dosis después de 24 h. La gráfica inferior muestra el experimento 1, la gráfica superior muestra el experimento 2.

Figura 5: El bloqueo de PVR conduce a un incremento significativo en la lisis celular de células MV4-11. PVR-Ab tiene un efecto comparable a AMG330 solo. Se podían observar efectos aditivos para la combinación de AMG330 y PVR-Ab.

Figura 6: Los anticuerpos de bloqueo de PVR intensifican la destrucción en ensayos de citotoxicidad (línea celular KG-1). El anticuerpo de bloqueo de PVR D171 intensifica significativamente la destrucción de células de un modo dependiente de la dosis después de 24 h. La gráfica inferior muestra el experimento 1, la gráfica superior muestra el experimento 2.

Figura 7: El bloqueo de PVR conduce a un incremento significativo en la lisis celular de células KG-1. PVR-Ab tiene un efecto comparable a AMG330 solo. Se podrían observar efectos aditivos para la combinación de AMG330 y PVR-Ab.

Figura 8: Los anticuerpos de bloqueo de PVRL2 intensifican la destrucción en ensayos de citotoxicidad (línea celular MV4-11). El anticuerpo para PVRL2 L-14 intensifica significativamente la destrucción de células después de 24 h. La gráfica inferior muestra el experimento 2, la gráfica superior muestra el experimento 1.

Figura 9: El bloqueo de PVRL2 conduce a un incremento significativo en la lisis celular de células MV4-11. Se podrían observar efectos aditivos para la combinación de AMG330 y PVRL2-Ab.

Figura 10: Los anticuerpos de bloqueo de PVRL2 intensifican la destrucción en ensayos de citotoxicidad (línea celular Kasumi-1). El anticuerpo para PVRL2 L-14 intensifica significativamente la destrucción de células después de 24 h. La gráfica inferior muestra el experimento 1, la gráfica del medio muestra el experimento 3, la gráfica superior muestra el experimento 2.

Figura 11: El bloqueo de PVRL2 conduce a un incremento significativo en la lisis celular en células Kasumi-1. PVRL2-Ab provoca efectos similares sobre la lisis celular en comparación con el tratamiento con AMG330 solamente. Se podrían observar efectos aditivos para la combinación de AMG330 y PVRL2-Ab.

Figura 12: Los anticuerpos de bloqueo de PVRL2 intensifican la destrucción en ensayos de citotoxicidad (línea celular UKE-1). El anticuerpo para PVRL2 L-14 intensifica significativamente la destrucción de las células después de 24 h. La gráfica inferior muestra el experimento 2, la gráfica superior muestra el experimento 1.

Figura 13: Una combinación tanto de AMG330 como del anticuerpo de bloqueo de PVRL2 da como resultado un incremento significativo de la citotoxicidad en UKE-1.

Figura 14: El bloqueo de galectina 9 conduce a un incremento significativo en la lisis celular de células MV4-11. Se podrían observar efectos aditivos para la combinación de AMG330 y 9M1 -3-Ab.

Figura 15: El bloqueo de galectina 9 conduce a un incremento significativo en la lisis celular de células KG-1. Se podrían observar efectos aditivos para la combinación de AMG330 y 9M1-3-Ab.

Figura 16: PVR y PVRL2 se expresan altamente sobre líneas celulares de AML y blastos de AML CD33+ primarios. Expresión de las proteínas PVR y PVRL2 según se representa por el porcentaje de células CD33+ positivas así como la relación de intensidades de fluorescencia mediana como medida de la intensidad de expresión sobre líneas celulares de AML (n=8; A,B) y blastos de AML CD33+ procedentes de pacientes no tratados (n=17; C,D). Las rayas negras representan la mediana.

Figura 17: El bloqueo de PVR y PVRL2 incrementa la lisis de líneas celulares de AML. La lisis mediada por HD-PBMC de las líneas celulares de AML MV4-11 (A), TF-1 (B), Molm-13 (C), Kasumi-1 (D) se midió después de 24 h. Los resultados se representan como la media ± SD de cambios en número de veces (CNV) de células diana muertas normalizada para el control sin anticuerpos de bloqueo. Para el análisis estadístico, se realizaron pruebas de la U de Mann-Whitney (# p<0,05; * p<0,001; n>3).

Figura 18: La lisis mediada por células T de la construcción de anticuerpo AMG 330 BiTE® se intensifica significativamente mediante la administración adicional de anticuerpos de bloqueo de PVR y PVRL2. Células MV4-11 (A), TF-1 (B), Molm-13 (C), Kasumi-1 (D) se incubaron con HD-PBMCs y AMG 330 en presencia o ausencia de anticuerpos de bloqueo contra PVR o PVRL2. Los resultados se representan como la media ± SD de cambios en número de veces (CNV) de células diana muertas normalizada para el control sin anticuerpos de bloqueo. Para el análisis estadístico, se realizaron pruebas de la U de Mann-Whitney (# p<0,05; * p<0,001; n>3).

Figura 19: El incremento de la lisis celular al bloquear PVR y PVRL2 es específico y no está mediado a través de ADCC. A, B Para descartar una contribución de ADCC, los efectos antileucémicos de células T CD3+ se han analizado comparativamente para las PBMCs procedentes del mismo donante sano con o sin la administración adicional de AMG 330 usando las líneas celulares MV4-11 (A) y TF-1 (B). Los resultados se representan como la media ± SD de células diana muertas (n=2). C, D Células Kasumi-1 se incubaron con dosis crecientes de un anticuerpo que elige como diana CD117 en presencia o ausencia de AMG 330 (n=2, 2 pg/ml, + 10 pg/ml, ++ 50 pg/ml). Los resultados se representan como la media ± SD de cambios en número de veces (CNV) de células diana muertas normalizada para el control. E, F Receptores de Fcy sobre HD-PBMCs se saturaron con IgGs humanas policlonales y se compararon con HD-PBMCs no saturadas, ambas usadas como células efectoras contra células MV4-11. Los resultados se representan como la media ± SD de células diana muertas (n=3).

Figura 20: Las células con inactivación doble de PVR y PVRL2 recapitulan efectos de anticuerpos in vitro y prolongan la supervivencia de ratones NSG reconstituidos con células T humanas in vivo. A Al usar CRISPR/Cas9, se generó una población policlonal de MV4-11 que alberga una inactivación doble de PVR y PVRL2. Células bien MV4-11 silvestres o bien con doble inactivación se incubaron con HD-PBMCs durante 24 h sin o con AMG 330. Para el análisis estadístico, se realizaron pruebas de la U de Mann-Whitney (# p<0,05; * p<0,001, n=3). B Ratones NSG inmunodeficientes fueron trasplantados con células bien MV4-11 silvestres (WT) o bien con doble inactivación (KO) para PVR y PVRL2 y se reconstituyeron con células T humanas. El tratamiento consistía en la aplicación intraperitoneal diaria bien de placebo (n=13 para WT y n=12 para KO) o bien de 15 pg/kg de AMG 330 (n=12 para WT y n=15 para KO). Se realizaron pruebas de rango logarítmico: placebo de WT frente a placebo KO p <0,001; WT AMG 330 frente a KO AMG 330 p <0,001; placebo de WT frente a WT AMG 330 p=0,003; placebo de k O frente a KO AMG 330 p=0,027. C Capacidad de proliferación de células inactivadas generadas por CRISPR/Cas9. La velocidad de crecimiento de células MV4-11 con doble inactivación para PVR y PVRL2 se comparó con la capacidad de proliferación de células silvestres MV4-11. Los recuentos de células se midieron el día 2 y 4 usando el contador de células automático Vi-Cell™XR (Beckman Coulter); n=3.

Figura 21: Análisis genómico de células con doble inactivación para PVR y PVRL2 mediada por CRISPR/Cas9. Para validar la inactivación mediada por CRISPR/Cas9 de PVR y PVRL2 en células MV4-11 a nivel genómico, las correspondientes secciones génicas de varias células individuales se analizaron mediante subclonación y secuenciación. Las alteraciones genómicas para tres clones inactivados diferentes incluyendo el impacto sobre la secuencia proteínica se presentan para PVR (A) y PVRL2 (B), respectivamente. La secuencia silvestre con los sitios diana en azul y la secuencia de PAM en verde se muestra en la parte superior. Para PVRL2, la región elegida como diana y la región PAM están en la orientación complementaria inversa ya que el ARN de guía de PVRL2 reconocía la hebra de ADN antiparalela. Las eliminaciones dentro de los subclones se muestran como rayas rojas y las inserciones se muestran en rojo. WT = silvestre, KO = doble inactivación, PAM = motivo adyacente al protoespaciador, AA = aminoácido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presentación. No se reconoce que ninguna de la información proporcionada en la presente sea especialidad anterior o relevante para las invenciones actualmente reivindicadas, o que ninguna publicación mencionadas específicamente o implícitamente sea especialidad anterior.

La presente invención se basa al menos parcialmente en el hallazgo sorprendente de que los inhibidores de puntos de control inmunitario contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR) y/o TIGIT se pueden usar eficazmente para el tratamiento de cánceres hemáticos, en particular leucemia mieloide (AML), que tienen mecanismos de escape inmunitario, proporcionando de ese modo un enfoque inmunoterapéutico nuevo y muy eficaz en la terapia del cáncer. A este respecto, los inventores descubrieron en estudios in vitro con diversas líneas celulares leucémicas que los ligandos de puntos de control inmunitario CD112 y CD155 y su receptor TIGIT, el ligando de puntos de control inmunitario galectina 9 y su receptor TIM-3 son dianas muy adecuadas para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos, en particular AML. CD112 son ligandos proteínicos de puntos de control inmunitario de CD155, mientras que su receptor es TIGIT. Como un aspecto de la divulgación, la galectina 9 también es un ligando y TIM-3 su receptor.

Se encontró por los presentes inventores que los ligandos de puntos de control inmunitario PVR y PVRL2 y su receptor TIGIT parecen tener un impacto de pronóstico negativo sobre la supervivencia global en pacientes con AML (datos no mostrados). Por otra parte, los presentes inventores revelaron que el bloqueo de PVL, PVRL2 o TIGIT conduce a una destrucción significativa de células de AML (Figuras 3-13). Según esto, los presentes inventores prestaron atención a PVR, PVRL2 y TIGIT como nuevas dianas para el uso en el tratamiento de cánceres hemáticos, particularmente el tratamiento de AML, y proporcionan sustancias que inhiben eficazmente la señal inmunoinhibidora de PVR, PVRL2 y/o TIGIT, inhibiendo de ese modo la proliferación del cáncer a través del mecanismo de la recuperación y la activación de la función inmunitaria de células T. Además, existen datos contradictorios en la especialidad que describen un impacto de pronóstico tanto positivo como negativo del ligando de puntos de control inmunitario galectina 9 y su receptor TIM-3 sobre la actividad de células T y el desarrollo de tumores. Aunque estudios de expresión parecen subrayar que galectina 9 y TIM-3 tienen un impacto de pronóstico bastante positivo en pacientes con cáncer (datos no mostrados), como un aspecto de la divulgación se revela que el bloqueo de galectina 9 y TIM-3 conduce a una destrucción significativa de células de AML (véanse las Figuras 14 y 15).

Según se muestra por los presentes inventores, todas las líneas celulares de AML examinadas son alrededor de 100% positivas para la expresión de proteínas PVR y PVRL2. En contraste, solo 52% y 40% de las PBMCs procedentes de donantes sanos expresan PVR y PVRL2, respectivamente (Figura 1). Por otra parte, la densidad proteínica para PVR y PVRL2 es muy alta en comparación con la densidad muy baja sobre PBMCs. Además, la expresión y la densidad de la proteína galectina 9 es baja y comparable a PBMCs procedentes de donantes sanos. También blastos primarios de pacientes con AML muestran expresión proteínica de PVR y PVRL2. De ese modo, MNCs de pacientes con AML de novo se han aislado y teñido simultáneamente para CD33 y PVR o PVRL2, respectivamente. Aquí, se podría encontrar un porcentaje de compartición de células positivas a PVR o PVRL2 dentro de la población CD33 (Figura 2).

Según se divulga en la presente, la interacción de PVR y PVRL2 con su receptor TIGIT, así como - como un aspecto de la divulgación - la interacción de galectina 9 con su receptor TIM-3 actúan como una señal inmunosupresora o incluso inmunoinhibidora y así funciona como un mecanismo de escape inmunitario en AML. Según lo precedente, se pretende que los inhibidores de puntos de control inmunitario contra CD112, CD155 y/o TIGIT inhiban o hagan difícil la interacción entre CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT, y de ese modo fomenten la respuesta inmunitaria específica para el cáncer. Asimismo, se pretende que los inhibidores de puntos de control inmunitario contra CD155 inhiban la interacción entre CD155 y TIGIT o hagan más difícil la interacción entre CD155 y TIGIT. También se pretende que los inhibidores de puntos de control inmunitario contra TIGIT inhiban la interacción entre TIGIT y CD112 y/o CD155 o hagan más difícil la interacción entre TIGIT y CD112 y/o CD155. Por otra parte, como un aspecto de la divulgación, se pretende que los inhibidores de puntos de control inmunitario contra galectina 9 inhiban la interacción entre galectina 9 y TIM-3 o hagan más difícil la interacción entre galectina 9 y TIM-3. Asimismo, se pretende como un aspecto de la divulgación que los inhibidores de puntos de control inmunitario contra TIM-3 inhiban la interacción entre TIM-3 y galectina 9 o hagan más difícil la interacción entre TIM-3 y galectina 9.

Según se usa en la presente, el término "inhibir" o "inhibición" se refiere a la capacidad de los inhibidores de bloquear, bloquear parcialmente, interferir, disminuir, suprimir, reducir o desactivar una proteína diana, es decir los ligandos de puntos de control inmunitario CD112 y CD155 y/o su receptor TIGIT, el ligando de puntos de control inmunitario galectina 9 y/o su receptor TIM-3. Así, un experto en la especialidad entiende que el término "inhibir" puede abarcar una pérdida completa y/o parcial de actividad de dicho ligando o receptor. La actividad de dicho ligando o receptor se puede suprimir o inhibir mediante un compuesto que se une al sitio activo de la proteína del ligando/receptor, o por otros medios, tales como inhabilitar una segunda proteína que active la primera proteína inhibida. Por ejemplo, una inhibición completa y/o parcial de la interacción entre CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT, así como galectina 9 y TIM-3 puede estar indicada por una lisis celular significativamente incrementada, es decir un incremento significativo de la tasa de células muertas de células diana de cáncer hemático, en particular células diana de AML.

El término "cáncer hemático", según se usa en la presente, incluye particularmente leucemia y linfoma, p. ej. linfoma hodgkiniano o linfoma no hodgkiniano. También incluye síndrome mielodisplásico (MDS) y mieloma múltiple (MM).

Los inhibidores de puntos de control inmunitario de la presente solicitud, aparte de usarse en el tratamiento del cáncer hemático, también se pueden usar en el tratamiento de tumores sólidos, tales como cáncer oral o cáncer pancreático (Thijssen y cols. (2015), Biochim Biophys 1855, 235-247).

"Leucemia mieloide", también llamada leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia granulocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda o solo "AML" se refiere generalmente a una forma aguda de leucemia que se caracteriza típicamente por la sobreproducción y/o la acumulación de células cancerosas, mieloblastos inmaduros, glóbulos rojos o plaquetas en la médula ósea. "Aguda" significa que esta leucemia puede progresar rápidamente si no se trata, y probablemente sería letal en pocos meses. "Mieloide" se refiere al tipo de célula a partir del cual comienza esta leucemia. La mayoría de los casos de AML se desarrollan a partir de células que se convertirían en glóbulos blancos (distintos de linfocitos), sin embargo, existen diferentes subtipos de AML. La AML comienza en la médula ósea, pero en la mayoría de los casos se mueve rápidamente a la sangre. Según se usa en la presente, el término "AML" incluye AML aguda, refractaria y recidivante. El término "AML refractaria", según se usa en la presente, significa resistencia de la AML a terapia para AML convencional o estándar, tal como quimioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), es decir la terapia para AML convencional o estándar no es capaz de curar definitivamente a todos los pacientes con AML. El término "AML recidivante", según se usa en la presente, indica el retorno de signos y síntomas de la enfermedad AML después de que un paciente haya disfrutado de una remisión. Por ejemplo, después del tratamiento de AML convencional usando quimioterapia y/o HSCT, un paciente con AML puede tener una remisión sin signos o síntomas de la AML, sigue en remisión durante un par de años, pero sufre una recidiva y tiene que ser tratado una vez más de AML. El término "AML", según se usa en la presente, también incluye una enfermedad residual mínima (MRD) en un paciente con AML, es decir la presencia de pequeños números de células mieloides cancerosas que permanecen en el paciente durante el tratamiento, o después del tratamiento cuando el paciente está en remisión.

El término "inhibidor de puntos de control inmunitario", cuando se usa en la presente, se refiere a cualquier agente o compuesto de unión adecuado para actuar contra las proteínas de los puntos de control inmunitario CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3, inhibiendo o suprimiendo de ese modo la señal inmunoinhibidora entre CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT y/o la interacción de galectina 9 y TIM-3. El término "señal inmunoinhibidora", cuando se usa en la presente, se refiere a la interacción entre los ligandos de puntos de control inmunitario y los receptores, reduciendo de ese modo la inmunoactividad de la célula T implicada contra la célula tumoral implicada y permitiendo que la célula tumoral escape de los mecanismos de defensa inmunitaria del organismo. Los inhibidores usados en la presente invención dirigidos contra CD112, CD155 y/o TIGIT inhiben por lo tanto esta señal inmunoinhibidora entre los ligandos de puntos de control inmunitario y los receptores, permitiendo de ese modo que las células T ataquen y eliminen la célula tumoral implicada. Según esto, los inhibidores usados en la presente invención son capaces de disminuir o inhibir la señal inmunoinhibidora entre el ligando de puntos de control inmunitario y su receptor. Según esto, los inhibidores usados en la presente invención exhiben actividad "inmunopotenciadora" al activar la respuesta de células T hacia células cancerosas. En particular, el inhibidor que tiene actividad inmunopotenciadora es capaz de disminuir o inhibir la intensidad de la señal inmunoinhibidora entre CD112 y TIGIT. Se prevé además que el inhibidor que tiene actividad inmunopotenciadora sea capaz de disminuir o inhibir la intensidad de la señal inmunoinhibidora entre CD155 y TIGIT. Se prevé además como un aspecto de la divulgación que el inhibidor que tiene actividad inmunopotenciadora sea capaz de disminuir o inhibir la intensidad de la señal inmunoinhibidora entre galectina 9 y TIM-3.

Según la presente invención, la unión del inhibidor de puntos de control inmunitario contra la respectiva proteína diana del punto de control inmunitario modula la señalización intracelular de dicha proteína diana. Así, se prevé que el inhibidor contra CD112 module la señalización intracelular de CD112. Asimismo, se prevé que el inhibidor contra CD155 module la señalización intracelular de CD155. Asimismo, se prevé que el inhibidor contra TIGIT module la señalización intracelular de TIGIT. Asimismo, un aspecto de la divulgación es que el inhibidor contra galectina 9 module la señalización intracelular de galectina 9. Asimismo, un aspecto de la divulgación es que el inhibidor contra TIM-3 module la señalización intracelular de TIM-3. El término "modular" o "modulación", cuando se usa en la presente, incluye incrementar, disminuir o cambiar de otro modo la señal intracelular de las proteínas de los puntos de control inmunitario, es decir CD112, CD155 y/o TIGIT. A este respecto, la ruta de señalización intracelular acoplada a estas proteínas de los puntos de control inmunitario se puede intensificar, impedir o evitar completamente, cambiando de ese modo el nivel, la cantidad y/o la actividad de elementos de señalización aguas abajo, que comprenden activación celular, proliferación y crecimiento de enfermedades malignas.

Según se divulga en la presente, los inhibidores contra CD112, CD155 y/o TIGIT se pueden usar para tratar un cáncer hemático, en particular leucemia mieloide (AML). Los cánceres hemáticos son cánceres de las células sanguíneas que comienzan en la médula ósea, que comprenden típicamente leucemia y linfoma. En el caso de un cáncer hemático, la médula ósea empieza a formar células anormales que desplazan a las células sanguíneas normales. Asimismo, los inhibidores que se divulgan en la presente son particularmente útiles para tratar cualquier tipo de cáncer hemático caracterizado por un incremento en la expresión de CD112, y/o CD155 en las células tumorales. En particular, los inhibidores divulgados en la presente son especialmente útiles para tratar cualquier tipo de cáncer hemático caracterizado por Según esto, se prevé que los inhibidores también se puedan usar en el tratamiento de otros cánceres hemáticos caracterizados por un incremento en la expresión de CD112 y/o CD155 en las células tumorales, tales como leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), síndrome mielodisplásico (MS o mielodisplasia) y neoplasmas mieloproliferativos (MPN). Se prevé además que los inhibidores se puedan usar para tratar tumores sólidos caracterizados por un incremento en la expresión de CD112, CD155 y/o galectina 9. A este respecto, los inhibidores divulgados en la presente también se pueden usar para interactuar entre los ligandos de puntos de control inmunitario CD112 y/o CD155 expresados sobre la célula tumoral y su receptor de puntos de control inmunitario TIGIT expresado sobre la célula T según se describe en cualquier parte de la presente.

Según se demuestra en la presente invención mediante análisis de FACS y una prueba de ensayo de citotoxicidad in vitro para diversas líneas celulares leucémicas, anticuerpos contra PVR y PVRL2 son muy adecuados para bloquear estos ligandos de puntos de control inmunitario, incrementando de ese modo significativamente la lisis celular de células de AML (Figuras 3-13). Según esto, el inhibidor usado en la presente invención es una construcción de anticuerpo. El término "construcción de anticuerpo" en el sentido de la presente divulgación indica una "molécula de unión" o un "agente de unión" basado en anticuerpo que sea capaz de unirse (específicamente a), interactuar con o reconocer las moléculas de los puntos de control inmunitario de la presente invención. La construcción de anticuerpo puede unirse/interactuar con la molécula superficial sobre una célula diana cancerosa de AML o un complejo receptor sobre una célula T. Una molécula de unión preferida es un anticuerpo.

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula en la que la estructura y/o función se basa o se basan en la estructura y/o la función de un anticuerpo, p. ej. de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera. Según la presente invención, el anticuerpo para el uso en el tratamiento de un cáncer hemático, en particular AML, es un anticuerpo inhibidor que inhibe específicamente la interacción entre el ligando de puntos de control inmunitario y el receptor de puntos de control inmunitario según se define en las reivindicaciones. A este respecto, se prevé que el anticuerpo divulgado en la presente inhiba específicamente la interacción entre CD112 y TIGIT. También se prevé que el anticuerpo divulgado en la presente inhiba específicamente la interacción entre CD155 y TIGIT. En particular, cuando se inhibe la interacción entre el ligando de puntos de control inmunitario y el receptor de puntos de control inmunitario, el anticuerpo inhibe la interacción inmunoinhibidora entre CD112/TIGIT y/o CD55/TIGI, inhibiendo de ese modo la señal de la interacción ligando-receptor. Así, el anticuerpo divulgado en la presente se une a los ligandos o los receptores de puntos de control inmunitario y hace difícil, si no imposible, obtener una señal inmunoinhibidora entre dichos ligandos y receptores. Según lo precedente, anticuerpos ejemplares útiles en los usos de la presente invención incluían anticuerpos anti-CD112, anticuerpos anti-CD112 y anticuerpos anti-TIGIT. El experto está al tanto de un gran número de diversos anticuerpos inhibidores que se pueden usar según la presente invención, inhibiendo de ese modo la interacción entre los ligandos y los receptores de puntos de control inmunitario según se divulga en cualquier parte en la presente.

La definición del término "anticuerpo" incluye realizaciones tales como anticuerpos monoclonales, quiméricos, monocatenarios, humanizados y humanos, así como fragmentos de anticuerpo como, entre otros, fragmentos Fab. Fragmentos o derivados de anticuerpos comprenden además fragmentos F(ab')², Fv, scFv o anticuerpos de un solo dominio tales como anticuerpos o nanocuerpos de dominio, anticuerpos de un solo dominio variable o un solo dominio variable de inmunoglobulina que comprende meramente un dominio variable, que podría ser VHH, VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V; véanse, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit.; Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009. Este único dominio variable de inmunoglobulina abarca no solo un polipéptido de un solo dominio variable de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos mayores que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de un solo dominio variable de anticuerpo. Fragmentos de anticuerpo monovalentes en línea con la definición anterior describen una realización de un dominio de unión en relación con esta invención. Estos fragmentos de anticuerpo monovalente se unen a un antígeno específico y también se pueden denominar "dominio de unión antigénica", "fragmento de unión antigénica" o "región de unión del anticuerpo".

En línea con esta definición proporcionada en la presente, el término anticuerpo se puede incluir bajo el término "construcción de anticuerpo". Dicho término también incluye diacuerpos o anticuerpos de redireccionamiento de doble afinidad (DART). Se prevén además diacuerpos monocatenarios (biespecíficos), diacuerpos en tándem (Tandab's), "minicuerpos" ejemplificados por una estructura que es como sigue: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 o (scFv-CH3-scFv)2, anticuerpos "Fc DART" y anticuerpos "IgG DART", y multicuerpos tales como triacuerpos. Dominios variables simples de inmunoglobulina abarcan no solo un polipéptido de un solo dominio variable de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos mayores que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de un solo dominio variable de anticuerpo.

Se conocen en la especialidad diversos procedimientos y se pueden usar para la producción de estas construcciones de anticuerpo (anticuerpos y/o fragmentos). Así, se pueden producir derivados (de anticuerpo) mediante peptidomiméticos. Además, técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véanse, entre otros, la Patente de EE. UU. 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little(2009), loc. cit.) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios específicos para el polipéptido o los polipéptidos elegidos. Además, se pueden usar animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de esta invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Ejemplos de estas técnicas incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales (Cole y cois., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). La resonancia plasmónica superficial que se emplea en el sistema BIAcore se puede usar para incrementar la eficacia de anticuerpos fágicos que se unen a un epítopo de un polipéptido diana, tal como CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (i 996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). También se prevé en el contexto de esta invención que el término "anticuerpo" comprenda construcciones de anticuerpo, que se pueden expresar en un hospedador según se describe en la presente posteriormente, p. ej. construcciones de anticuerpo que se pueden transfectar y/o transducir a través de, entre otros, virus o vectores plasmídicos.

Por otra parte, el término "anticuerpo" según se emplea en la presente también se refiere a derivados o variantes de los anticuerpos descritos en la presente que exhiben la misma especificidad que los anticuerpos descritos. Ejemplos de "variantes de anticuerpo" incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véanse, p. ej., Hawkins y cols. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman y cols., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) y mutantes de anticuerpo con función o funciones efectoras alteradas (véanse, p. ej., la Patente de EE. UU. 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little(2009), loc. cit.).

Los términos "dominio de unión antigénica", "fragmento de unión antigénica" y "región de unión del anticuerpo" cuando se usan en la presente se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables de la unión específica entre el anticuerpo y el antígeno. La parte del antígeno que es específicamente reconocida por y se une al anticuerpo se denomina el "epítopo" según se describe en la presente anteriormente. Según se menciona anteriormente, un dominio de unión antigénica puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH); sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo retienen alguna función de unión antigénica del dominio de unión antigénica intacto. Ejemplos de fragmentos de unión antigénica de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de una sola rama de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward y cols., (1989) Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv monocatenario (scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se puede enlazar usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que los permita elaborarse como una sola cadena proteínica en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, p. ej., Huston y cols. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la especialidad, y los fragmentos se evalúan con respecto a la función del mismo modo que los anticuerpos intactos.

En caso de que se use un ligador (sintético), este ligador es preferiblemente de una longitud y una secuencia suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo pueda, independientemente del otro, retener sus especificidades de unión diferenciales. Lo más preferiblemente y según se documenta en los ejemplos adjuntos, la construcción de anticuerpo de la invención es una "construcción de anticuerpo monocatenario biespecífica", más preferiblemente un Fv monocatenario (scFv) biespecífico. Moléculas monocatenarias biespecíficas se conocen en la especialidad y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965 3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Un ejemplo de un compuesto de elección como diana de CD33 en relación con la presente invención, que es una molécula monocatenaria biespecífica, es AMG330, que también se ha usado en los ejemplos adjuntos. La secuencia de AMG330 se describió inicialmente en el documento WO 2008/119567. Dichos dominios variables comprendidos en las construcciones de anticuerpo descritas en la presente pueden estar conectados por secuencias ligadoras adicionales. El término "ligador peptídico" define según la presente invención una secuencia de aminoácidos por la que las secuencias de aminoácidos del primer dominio y el segundo dominio de la construcción de anticuerpo de la invención están ligadas entre sí. Una característica técnica esencial de este ligador peptídico es que dicho ligador peptídico no comprenda actividad de polimerización. Residuos de aminoácido preferidos para un ligador peptídico incluyen Gly, Ser y Thr se caracterizan por una longitud entre 5 y 25 residuos de aminoácido. Entre los ligadores peptídicos adecuados están los descritos en las Patentes de EE. UU. 4.751.180 y 4.935.233 o el documento WO 88/09344. Una realización preferida de un ligador peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir Gly4Ser (SEQ ID No: 9), o sus polímeros, es decir (Gly4Ser)x, donde x es un número entero 1 o mayor (p. ej. 2 o 3). También se prefieren variaciones de esta secuencia ligadora que incluye ejemplos tales como (Gly-Gly-Gly-Gly)x (SEQ ID No: 10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Gln)x (SEQ ID No: 11), (Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x (SEQ ID No: 12), (Pro-Gly-Gly-Asp-Gly-Ser)x ( S ^eQ ⁱD No: 13) y (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x (SEQ ID No: 14) Las características de dicho ligador peptídico, que comprenden la ausencia de la promoción de estructuras secundarias, se conocen en la especialidad y se describen, p. ej., en Dall'Acqua y cols. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle y cols. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow ( ^{f a}S ^eB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren ligadores peptídicos que tampoco promuevan estructuras secundarias. La ligadura de dichos dominios entre sí se puede proporcionar, p. ej., mediante manipulación genética, según se describe en los ejemplos. Métodos para preparar construcciones monocatenarias biespecíficas fusionadas y ligadas operativamente y que las expresan en células de mamífero o bacterias son muy conocidos en la especialidad (p. ej. el documento WO 99/54440 o Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).

Para los ligadores peptídicos, que conectan los al menos dos dominios de unión en la construcción de anticuerpo de la invención, se prefieren ligadores peptídicos que comprende solo un pequeño número de residuos de aminoácido, p. ej. 12 residuos de aminoácido o menos. Así, se prefiere un ligador peptídico de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos de aminoácido. Un ligador peptídico previsto con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido o aminoácidos, en donde se prefieren ligadores ricos en Gly. Un aminoácido "individual" particularmente preferido en el contexto de dicho "ligador peptídico" es Gly. Según esto, dicho ligador peptídico puede consistir en el aminoácido individual Gly.

El término "anticuerpo monoclonal" según se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones presentes en la naturaleza y/o modificaciones postraduccionales (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un solo sitio antigénico. Por otra parte, en contraste con preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se sintetizan mediante el cultivo de hibridomas, sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se considera que se requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar según la presente invención se pueden elaborar mediante el método del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y cols., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden elaborar mediante métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos fágicos usando las técnicas descritas en Clackson y cols., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks y cols., J. Mol. Biol., 222: 581 -597 (1991), por ejemplo.

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes sustancialmente la secuencias inmunoglobulínicas de la línea germinal humana conocidas en la especialidad, incluyendo, por ejemplo, las descritas por Kabat y cols. (Véase Kabat y cols. (1991) loc. cit.). Los anticuerpos humanos usados en la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias inmunoglobulínicas de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDRs, y en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un residuo de aminoácido que no es codificado por la secuencia inmunoglobulínica de la línea germinal humana. Se destaca que la definición de anticuerpos humanos que se usa en la presente también contempla anticuerpos totalmente humanos, que incluyen solo secuencias humanas no artificialmente y/o genéticamente alteradas de anticuerpos como las que se pueden derivar al usar tecnologías que usan sistemas tales como Xenomice.

Ejemplos de "variantes de anticuerpo" incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véanse, p. ej., Hawkins y cols. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman y cols., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) y mutantes de anticuerpo con función o funciones efectoras alteradas (véanse, p. ej., la Patente de EE. UU. 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little(2009), loc. cit.). Según se usa en la presente, "anticuerpo generado in vitro" se refiere a un anticuerpo en el que la totalidad o parte de la región variable (p. ej., al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunitarias (p. ej., una presentación en fagos in vitro, un chip proteínico o cualquier otro método en el que se puedan probar posibles secuencias con respecto a su capacidad para unirse a un antígeno). Así, preferiblemente, este término excluye secuencias generadas mediante reordenación genómica en una célula inmunitaria. El apareamiento de una VH y una VL conjuntamente forma un solo sitio de unión antigénica. El dominio CH más próximo a VH se denomina CH1. Cada cadena L esta ligada a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están ligadas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Los dominios VH y VL consisten en cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas llamadas regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), que forman un armazón para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones determinantes de la complementariedad, CDRs). Las CDRs contienen la mayoría de los residuos responsables de interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDRs se denominan CDR1, CDR2 y CDR3. Según esto, los constituyentes de las CDRs en la cadena pesada se denominan H1, H2 y H3, mientras que los constituyentes de las CDRs en la cadena ligera se denominan L1, L2 y L3.

El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios inmunoglobulínicos que exhiben variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y la afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, "dominio o dominios variables"). La variabilidad no está uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras. Estos subdominios se llaman regiones "hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDRs). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se llaman las regiones "marco" (FRM). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras presentes en la naturaleza comprenden cada una cuatro regiones FRM, que adoptan principalmente una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad mediante la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión antigénica (véase Kabat y cols., loc. cit.). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión antigénica, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como, por ejemplo, citotoxicidad mediada celularmente y activación del complemente dependientes de anticuerpos.

Los términos "CDR", y su plural "CDRs", se refieren a una región determinante de la complementariedad (CDR) de la que tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Las CDRs contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo y están separadas por secuencias de aminoácidos que comprenden regiones de armazón o marco. Los límites y las longitudes definitorios exactos de las CDRs están sometidos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, las CDRs se pueden denominar mediante Kabat, Chothia, contacto o cualesquiera otras definiciones de límites, incluyendo el sistema de numeración descrito en la presente. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de solapamiento en lo que constituye las llamadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Por lo tanto, las definiciones de las CDRs según estos sistemas pueden diferir en longitud y zonas límite con respecto a la región marco adyacente. Véanse, por ejemplo Kabat, Chothia y/o MacCallum (Kabat y cols., loc. cit.; Chothia y cols., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901; y MacCallum y cols., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Sin embargo, se prefiere la numeración según el llamado sistema de Kabat. La CDR3 de la cadena ligera y, particularmente, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión antigénica dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. En algunas construcciones de anticuerpo, la CDR3 de la cadena pesada parece constituir la mayor superficie de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Se pueden usar esquemas de selección in vitro en los que se varía la CDR3 sola para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antígeno.

En algunas realizaciones, las moléculas de unión descritas en la presente son proteínas aisladas o proteínas sustancialmente puras. Una proteína "aislada" no está acompañada por al menos algo del material con el que normalmente está asociada en su estado natural, constituyendo por ejemplo al menos alrededor de 5%, o al menos alrededor de 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir de 5 a 99,9% en peso del contenido de proteína total dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la proteína se puede formar en una concentración significativamente superior a través del uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que la proteína se forme a niveles de concentración incrementados. La definición incluye la producción de una proteína de unión antigénica en una amplia variedad de organismos y/o células hospedadoras que son conocidos en la especialidad.

Según se divulga en la presente, los resultados experimentales de la presente invención demuestran particularmente el efecto inhibidor de anticuerpos dirigidos contra los puntos de control inmunitario CD112, CD155 y TIGIT, y como aspectos de la divulgación galectina 9 y TIM-3. Sin embargo, cualquier otra sustancia que pueda inhibir la señal inmunoinhibidora entre CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT y/o galectina 9 y TIM-3 tendrá efectos similares. La sustancia con estos efectos incluye, por ejemplo, CD112 soluble, CD155 soluble, TIGIT soluble, galectina 9 soluble, TIM-3 soluble, antagonistas de C112, antagonistas de CD155, antagonistas de TIGIT, antagonistas de galectina 9, antagonistas de TIM-3, sustancias que inhiben la interacción entre CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT y/o galectina 9 y TIM-3, inhibidores de la producción de CD112, inhibidores de la producción de CD155, inhibidores de la producción de TIGIT, inhibidores de la producción de TIGIT, inhibidores de la producción de TIM-3 e inhibidores de señales inhibidoras intracelulares por TIGIT o TIM-3.

Según esto, los inhibidores de CD112, CD155 y/o TIGIT usados en la presente invención comprenden compuestos o agentes proteínicos o no proteínicos. A este respecto, proteínas y polipéptidos o derivados que se unen a CD112, CD155 y/o TIGIT incluyen cada una de las proteínas parciales de CD112, CD155 y/o TIGIT, de las que no se induce la señal inmunoinhibidora entre CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT y/o galectina 9 y TIM-3. La presencia de TIGIT o TIM-3 en la proximidad de los receptores de puntos de control inmunitario es indispensable para la inducción de la señal inmunoinhibidora de TIGIT o TIM-3, con ese propósito está refrenada por la interacción con CD112, CD155 (TIGIT) o galectina 9 (TIM-3) en tumores o células de carcinoma. Por lo tanto, CD112, CD155 o galectina 9 solubles con una parte que solamente es dominios extracelulares e interactúa con TIGIT o TIM-3 pueden inhibir la señal inmunoinhibidora de CD112, CD155 o galectina 9. Por otra parte, TIGIT o TIM-3 solubles con una parte que tiene una estructura similar y puede interactuar con CD122, CD155 o galectina 9 pueden inhibir la señal inmunoinhibidora. Estas proteínas solubles solo tienen que incluir la región extracelular que es necesaria y suficiente para unirse a CD122, CD155, TIGIT, galectina 9 o TIM-3 y se pueden preparar mediante técnicas de expresión y refinado muy conocidas.

Si un inhibidor de la interacción de CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 o TIM-3 es una proteína o un polipéptido y una zona esencial para la interacción está compuesta solamente por un polipéptido y una zona esencial para la interacción está compuesta solamente por un polipéptido consecutivo, este fragmento polipeptídico se puede convertir en un antagonista mutuo. Además, un antagonista con una actividad de refuerzo se puede identificar a partir de grupos moleculares de los que este fragmento polipeptídico está químicamente modificado, o diseñarse mediante un ordenador basándose en la estructura espacial del fragmento polipeptídico. Además, el mejor antagonista se puede seleccionar más eficazmente de grupos moleculares diseñados por ordenador basándose en datos de estereoanálisis proteínico de la zona de interacción.

Se prevé además que el inhibidor para el uso en el tratamiento de un cáncer hemático, particularmente AML, según se divulga en la presente sea un inhibidor de molécula pequeña. El término "molécula pequeña" significa una molécula con un bajo peso molecular, típicamente menor de 1000 Da. Esta molécula pequeña según se usa en la presente se refiere a agentes beneficiosos que tienen bajo peso molecular que habitualmente se sintetizan mediante química orgánica, pero también se pueden aislar de fuentes naturales tales como plantas, hongos y microbios. Cuando se usan en el tratamiento de cánceres hemáticos, estas moléculas pequeñas también se denominan fármacos de molécula pequeña. Las vías comunes para aportar fármacos de molécula pequeña son oral, inyección, pulmonar y transdérmica.

Se prevé además que el inhibidor contra CD112 reduzca la expresión de CD112. Asimismo, el inhibidor contra CD155 reduce la expresión de CD155. Asimismo, el inhibidor contra TIGIT reduce la expresión de TIGIT. Asimismo, el inhibidor contra galectina 9 reduce la expresión de galectina 9. Asimismo, el inhibidor contra TIM-3 reduce la expresión de TIM-3. Según esto, se divulga además en la presente el uso de una secuencia de ácido nucleico (p. ej. una molécula de ácido nucleico terapéutica, p. ej., un oligonucleótido antisentido, un ADN que codifica el mismo o un vector que produce el mismo) para preparar una molécula antisentido adecuada para reducir la expresión de un gen diana, p. ej. los genes que codifican CD112, CD155, TIGIT galectina 9 y TIM-3. El término "reducir la expresión" cuando se usa en la presente se refiere a la capacidad del inhibidor para disminuir o bloquear la expresión del gen diana, es decir los genes que codifican CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y TIM-3 de un modo específico y postranscripcional. A este respecto, la presente divulgación se refiere a nucleótidos capaces de reducir la expresión de CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 en células cancerosas. Dichos nucleótidos se pueden caracterizar por una secuencia que elige como diana el ARNm al tener al menos 50% de identidad de secuencia, o al menos 70% de identidad de secuencia, o al menos 80% de identidad de secuencia, o al menos 90% de identidad de secuencia con el ARNm diana. Particularmente útiles para este propósito son secuencias de ARN que se pueden usar para preparar un inhibidor basado en nucleótidos. Se ha mostrado que dúplex de ARN de 21 - 23 nucleótidos ~2, con solapamientos de nucleótidos 3' (llamados ARNs interferentes pequeños o ARNsip), median en la inhibición específica de la secuencia de la expresión génica en células de mamífero a través de un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) denominado interferencia de ARN (iARN). Según esto, iARN se considera como una de las nuevas estrategias más prometedoras a través del silenciamiento de genes que provocan enfermedad in vivo. Así, en un aspecto de la divulgación, el nucleótido capaz de reducir la expresión de CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 es un ARNi (iARN). El experto en la especialidad está al tanto de varias técnicas para sintetizar ARNi y para aportar estas construcciones a células tumorales in vivo, usando de ese modo, p. ej., formulaciones liposómicas según se describe, p. ej., en Santel y cols. 2006, Gene Therapy 13, 1360-1370. A este respecto, se sintetiza en primer lugar ARN bicatenario con una secuencia complementaria a un gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético exógeno y activa la ruta de iARN. Puesto que la iARN no puede evitar totalmente la expresión del gen, esta técnica se denomina a veces una "atenuación génica" (“knockdown") para distinguirla de procedimientos de "http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout" en los que la expresión de un gen se elimina totalmente.

Según esto, se prevé además que el inhibidor que reduce la expresión de CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 inactive CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3. El término “inactivación” ("knock out") cuando se usa en la presente se refiere a una reducción completa de la expresión de al menos una porción de un polipéptido codificado por un gen endógeno que codifica CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 de una sola célula, células seleccionadas o todas las células de un mamífero, en comparación con un animal silvestre. El mamífero puede ser uno "inactivado heterocigóticamente", en donde se ha alterado un alelo del gen endógeno. Alternativamente, el mamífero puede ser uno "inactivado homocigóticamente", en donde se han alterado ambos alelos del gen endógeno. También se prevé que más de un gen que codifica CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3, preferiblemente dos genes, esté "inactivado". En este caso, el mamífero es un mamífero "doblemente inactivado". Según la presente invención, los presentes inventores demostraron que PVR y PVRL2 pueden estar específicamente simplemente o doblemente inactivados en líneas celulares de AML cuando se use la técnica CRISPR/Cas9. Según esto, la presente divulgación también se refiere a un inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3, inhibidor que inactiva CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3, en donde dicha inactivación se alcanza mediante la técnica CRISPR/cas9. Sin embargo, el experto está al tanto de diversas técnicas diferentes aplicables a la inactivación de puntos de control inmunitario en una célula de cáncer hemático, en particular células de AML. Por lo tanto, las técnicas de inactivación comprenden cualquiera de las técnicas para alterar una secuencia génica que dé como resultado un gen inactivado, o una en la que la expresión se pueda inactivar en un momento dado durante el desarrollo dando como resultado la pérdida de función de un gen.

El inhibidor de puntos de control inmunitario puede comprender además una célula T receptora de antígeno quimérico (CAR). Las células T CAR exhiben receptores manipulados (receptores de antígenos quiméricos) que injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal sobre una célula T con transferencia de su secuencia codificante facilitada por vectores retrovirales. Estos CARs permite que la célula T reconozca una proteína específica (antígeno) sobre células tumorales. La célula T CAR exhibe preferiblemente CARs que permiten que la célula T reconozca proteínas específicas sobre células de cáncer hemático. Preferiblemente, la célula T CAR es capaz de reconocer CD33 sobre la superficie de células de cáncer hemático, en particular sobre células de AML. A este respecto, la adición de células T CAR dirigidas a una molécula superficial específica expresada sobre células de cáncer hemático tales como CD33 puede intensificar el efecto citotóxico de inhibidores contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3. Según esto, se prevé que los inhibidores contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 comprendan una célula T CAR. Dicha célula T CAR comprende preferiblemente un dominio de unión que elige como diana una molécula superficial expresada sobre células de cáncer hemático, en particular células de AML. Dicha molécula superficial es preferiblemente CD33, CD19 o Flt3. Según esto, el inhibidor puede comprender una célula T CAR que tiene un dominio de unión que elige como diana CD33. El inhibidor puede comprender además una célula T CAR que tiene un dominio de unión que elige como diana CD19. El inhibidor también puede comprender una célula T CAR que tiene un dominio de unión que elige como diana Flt3. El experto está al tanto de una variedad de técnicas para producir células T CAR de las llamadas primera, segunda y tercera generaciones dirigidas a dichas moléculas superficiales.

En algunos aspectos, el inhibidor de puntos de control inmunitario que se describe en cualquier parte en la presente puede comprender además una construcción de anticuerpo que se acopla a células T. Estas construcciones de anticuerpo que se acoplan a células T son preferiblemente acopladores para células T biespecíficos (construcciones de anticuerpo BiTE), es decir anticuerpos biespecíficos que se unen a un antígeno de célula T y un antígeno tumoral. Se ha mostrado que las construcciones de anticuerpo BiTE inducen la lisis dirigida de células tumorales diana y así también proporcionan terapias de gran potencial para cánceres y otros trastornos. Un posible enfoque es la construcción de anticuerpo que se acopla a células T biespecífico AMG330 con especificidad doble para CD3 y la lectina CD33 que se une a ácido siálico, que se expresa frecuentemente sobre la superficie de blastos de AML y células madre leucémicas. AMG330 se desarrolló para la terapia de leucemia mieloide (AML) y se evaluará en estudios en fase I próximamente (Friedrich y cols. 2014, American Association for Cáncer Research, 1549-1557).

Los acopladores para células T biespecíficos pueden estar en el formato de diferentes construcciones de anticuerpo, comprendiendo estos formatos, p. ej., di-scFv o bi(s)-scFv, (scFv)²-Fc, scFv-cremallera, (scFab)², Fab², Fab3, diacuerpos, diacuerpos monocatenarios, diacuerpos en tándem (Tandab's), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, "minicuerpos" ejemplificado por una estructura que es como sigue: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 , ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) o (scFv-CH3-scFv)2, multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de un solo dominio biespecíficos tales como nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable biespecíficos que comprenden meramente un dominio variable en uno o ambos de los dominios de unión, que podría ser VHH, VH o Vl , que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V. Un dominio de unión dentro de la molécula/el anticuerpo biespecífico que se acopla a células T puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH); sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo retienen alguna función de unión a antígeno del dominio de unión antigénica intacto. Ejemplos adicionales para el formato de fragmentos de anticuerpo, variantes de anticuerpo o dominios de unión incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de una sola rama de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward y cols., (1989) Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada y (7) un Fv monocatenario (scFv), prefiriéndose el último (por ejemplo, derivado de una biblioteca de scFV). Ejemplos para construcciones de anticuerpo se describen, p. ej., en los documentos WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO2014/144722, WO 2014/151910 y WO 2015/048272.

A este respecto, los presentes inventores estudiaron en ensayos de destrucción in vitro el efecto terapéutico del bloqueo de PVR y PVRL2 también en presencia de AMG330 (Figura 3-13). De ese modo, se encontró sorprendentemente que AMG330 podía intensificar significativamente la citotoxicidad de anticuerpos que bloquean PVR y/o PVRL2. Según esto, se prevé que los inhibidores contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 puedan comprender además una construcción de anticuerpo capaz de acoplarse a células T. Dicha construcción de anticuerpo comprende preferiblemente un dominio de unión a CD3 y un dominio de unión adicional que elige como diana una molécula superficial expresada sobre una célula de cáncer hemático, en particular células de AML. Dicha molécula superficial se selecciona del grupo que consiste en CD33, CD19 y Flt3. Según lo precedente, la presente divulgación proporciona un inhibidor contra CD112, CD155, galectina 9, TIM-3 y/o TIGIT para el uso en un método de tratamiento de un cáncer hemático, particularmente AML, que comprende una construcción de anticuerpo que tiene un dominio de unión a CD3 y un dominio de unión a CD33. La presente divulgación proporciona además un inhibidor contra CD112, CD155, galectina 9, TIM-3 y/o TIGIT para el uso en un método de tratamiento de un cáncer hemático, particularmente AML, que comprende una construcción de anticuerpo que tiene un dominio de unión a CD3 y un dominio de unión a CD19. La presente divulgación también proporciona un inhibidor contra CD112, CD155, galectina 9, TIM-3 y/o TIGIT para el uso en un método de tratamiento de un cáncer hemático, particularmente AML, que comprende una construcción de anticuerpo que tiene un dominio de unión a CD3 y un dominio de unión a Flt3. Dicha construcción de anticuerpo es preferiblemente una molécula de unión capaz de unirse a CD3épsilon.

Así, se prevé que la construcción de anticuerpo que elige como diana CD33, CD19 o Flt3 descrita en la presente tenga, aparte de su función para unirse a las moléculas de la superficie celular CD33, CD19 o Flt3 sobre una célula diana de cáncer hemático y CD3 sobre la superficie celular de una célula T, una función adicional. En este formato, el compuesto es un compuesto multifuncional al elegir como diana células a través de la unión a CD33, CD19 o Flt3 sobre la superficie celular de una célula diana cancerosa, mediar en la actividad de células T citotóxicas a través de unión a CD3 y proporcionar una función adicional tal como un dominio constante de Fc totalmente funcional que media en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo a través de la incorporación de células efectoras como células NK, un dominio de extensión de la semivida tal como un dominio de unión a albúmina o un dominio constante de Fc modificado que carece de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo pero que amplia el peso molecular del compuesto, la mediación de un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como, p. ej. una toxina o un radionúclido y/o medios para intensificar la semivida, etc. Ejemplos de construcciones de anticuerpo biespecíficas que eligen como diana CD33, CD19 o Flt3 sobre la superficie de células diana de cáncer hemático y CD3 sobre la superficie celular de una célula T son, p. ej., las moléculas representadas en SEQ ID NOs: 15 a 37.

Los términos "(capaz de) unión a", "reconocer específicamente", "contra" y "reaccionar con" significan según esta invención que un dominio de unión es capaz de interactuar específicamente con uno o más, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres y lo más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un epítopo. Según se usan en la presente, los términos "interactuar específicamente", "unirse específicamente" o "se une o unen específicamente" significan que un dominio de unión exhibe una afinidad apreciable para una proteína o un antígeno particular y, generalmente, no exhibe reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos de CD33, CD19, Flt3 o CD3. "Afinidad apreciable" incluye la unión con una afinidad de alrededor de 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de alrededor de 10-12 a 10-8 M, de 10-12 a 10-9 M, de 10-12 a 10-10 M, de 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de alrededor de 10-11 a 10-9 M. Si un dominio de unión reacciona específicamente con o se une a una diana se puede probar fácilmente mediante, entre otras cosas, la comparación de la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o un antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de CD33, CD19, Flt3 o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencialmente o no es capaz de unirse a proteínas o antígenos distintos de CD33, CD19, Flt3 o CD3 (es decir el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD33, CD19 o Flt3 y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3). El término "no se une esencialmente" o "no es capaz de unirse" significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a otra proteína o antígeno distintos de CD33, CD19, Flt3 o CD3, es decir, no muestra una reactividad de más de 30%, preferiblemente no más de 20%, más preferiblemente no más de 10%, particularmente preferiblemente no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos distintos de CD33, c D19, Flt3 o CD3, con lo que la unión a CD33, CD19, Flt3 o CD3, respectivamente, se fija para que sea 100%. Un compuesto que elige como diana CD33, CD19 o FLT3 descrito en la presente también puede comprender dominios adicionales, que, p. ej., son útiles en el aislamiento de la molécula o se refieren a un perfil farmacocinético adaptado de la molécula.

El compuesto de elección de diana que se une a CD33, CD19 o FLT3 y CD3 según se describe en la presente se puede producir en bacterias. Después de la expresión, el compuesto de elección de diana, preferiblemente la construcción de anticuerpo, se aísla de la pasta celular de E. co lien una fracción soluble y se puede purificar a través de, p. ej., cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar anticuerpo expresado, p. ej., en células CHO. Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores de clonación o expresión adecuados para el compuesto que elige como diana CD33, CD19 o FLT3 descrito en la presente. También se pueden utilizar como hospedadores cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco. Vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en un cultivo de células vegetales son conocidos por los expertos en la especialidad. Véanse, p. ej., Hiatt y cols., Nature (1989) 342: 76-78, Owen y cols. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko y cols. (1995) The Plant J 8: 745-750, y Fecker y cols. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Una sustancia que inhiba la interacción de CD112 y TIGIT, CD155 y TIGIT y/o galectina 9 y TIM-3 como la descrita en la presente se puede cribar directamente. Esta sustancia se puede identificar, p. ej., de bibliotecas de proteína, polipéptido péptido, polinucleótido o polinucleósido, un compuesto de síntesis orgánica de compuestos no peptídicos o productos naturales (p. ej. productos de fermentación, extractos celulares, extractos vegetales y extractos de tejidos animales). Según esto, se divulga además en la presente un método para cribar un inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 para el uso en un método de tratamiento de un cáncer hemático, en particular AML. El método de cribado descrito se puede ejecutar mediante un método de medida de la función celular de una célula de cáncer hemático, particularmente una célula de AML. A este respecto, células que expresan CD112, CD155 o galectina 9 sobre su superficie se pueden usar para el método de cribado. Estas células incluyen leucocitos, monocitos, macrófagos o células que presentan antígeno, células epiteliales, células tumorales, células de carcinoma, o esas líneas celulares.

Se divulga adicionalmente en la presente el inhibidor, que comprende un inmunoestimulante. Según se usa en la presente, el término "inmunoestimulante" se refiere a cualquier adyuvante que estimule adicionalmente el efecto inmunopotenciador de los inhibidores, intensificando de ese modo la actividad citotóxica de la célula T implicada contra la célula tumoral implicada. Existe una evidencia considerable de que los pacientes con cáncer tienen células T que son capaces de atacar sus células tumorales y la aparición del cáncer es un fallo de la vigilancia inmunitaria: la capacidad del propio sistema inmunitario para destruir células cancerosas tan pronto como aparezcan. Los inmunoestimulantes son agentes inespecíficos que afinan las defensas inmunitarias del cuerpo. A este respecto, se han descrito algunos éxitos con la inyección de agentes similares a adyuvantes directamente en el tumor, terapia oral con levamisol, interleucina-2 (IL-2), un potente factor de crecimiento para células T, interleucina-15 (IL-15) o interferón alfa (IFN-a), por nombrar solo algunos.

Según se describe en la presente, los inhibidores contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 pueden ser muy adecuados para el uso en un método de tratamiento de un cáncer hemático, en particular AML.

El termino "tratar", "tratando" o "tratamiento" según se usa en la presente significa reducir, estabilizar o inhibir la progresión de un cáncer hemático, en particular AML. Los que necesitan un tratamiento comprenden los que ya sufren dicha enfermedad. Preferiblemente, un tratamiento reduce o inhibe la actividad de proliferación de células de cáncer hemático, conduciendo de ese modo a una lisis intensificada de dichas células cancerosas. "Tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico, en donde el objeto es frenar (disminuir) o al menos aliviar o suprimir parcialmente el estado patológico del organismo. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen la enfermedad así como lo que se supone que tienen la enfermedad. El término "administrar" se refiere a un método para incorporar un compuesto en células o tejidos de un organismo.

Los compuestos para el uso en el tratamiento de un sujeto de un cáncer hemático, en particular AML, según se describe en la presente invención se administran generalmente al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Dicha cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para inhibir o aliviar los síntomas de un cáncer hemático, en particular AML. Por "efecto terapéutico" o "terapéuticamente eficaz" se entiende que el compuesto para el uso provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que esté siendo buscada por el investigador, veterinario, médico u otro profesional clínico. El término "terapéuticamente eficaz" se refiere además a la inhibición de factores que provocan o contribuyen a la enfermedad. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye que la cantidad del compuesto cuando se administra sea suficiente para mejorar significativamente la progresión de la enfermedad que se trate. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad y del factor individual de este sujeto. Por lo tanto, el compuesto usado en la presente invención resultará ser en todos los casos terapéuticamente eficaz, debido a que el método divulgado en la presente no puede proporcionar un 100% de predicción de seguridad ya pueda ser un sujeto sensible a dicho compuesto o no, puesto que también están implicados factores individuales. Se ha de esperar que la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, la interacción con fármacos y similares puedan tener una influencia general en cuanto a si el compuesto para el uso en el tratamiento de un sujeto que sufre un cáncer hemático, en particular AML, sea terapéuticamente eficaz o no. Preferiblemente, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto usado para tratar a un sujeto que sufre un cáncer hemático, en particular AML, está entre alrededor de 0,01 mg por kg de peso corporal y alrededor de 1 g por kg de peso corporal, tal como de alrededor de 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o alrededor de 900 mg por kg de peso corporal. Aún más preferiblemente, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto usado para tratar a un sujeto que sufre un cáncer hemático, en particular AML, está entre alrededor de 0,01 mg por kg de peso corporal y alrededor de 100 mg por kg de peso corporal, tal como entre alrededor de 0,1 mg por kg de peso corporal y alrededor de 10 mg por kg de peso corporal. La cantidad eficaz terapéutica del compuesto variará con respecto al peso de compuesto activo contenido en la misma, dependiendo de la especie de sujeto que se vaya a tratar.

El término "sujeto", según se usa en la presente, también indicado como un individuo, se refiere a un mamífero. El mamífero puede ser uno cualquiera de ratón, rata, cobaya, conejo, gato, perro, mono, caballo o ser humano. Según esto, el mamífero según la presente invención puede ser un ser humano o un mamífero no humano. Así, los métodos, los usos y las composiciones descritos en este documento son generalmente aplicables a mamíferos tanto humanos como y no humanos. Cuando el sujeto es un ser humano que puede recibir el compuesto para el uso en el tratamiento de una enfermedad según se describe en la presente, también se indica como un "paciente". Lo que se divulga para un "paciente" en la presente también se aplica a un grupo de pacientes, y viceversa.

La administración de los inhibidores para el uso en el tratamiento de un sujeto que sufre cáncer hemático, en particular AML, según la presente invención se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en la especialidad. En algunas realizaciones, la administración se lleva a cabo oralmente, parenteralmente, subcutáneamente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, mediante instilación intranasal, mediante implantación, mediante instilación intracavitaria o intravesical, intraocularmente, intraarterialmente, intralesionalmente, transdérmicamente, o mediante la aplicación a membranas mucosas, o sus combinaciones, por nombrar solo algunas.

En el alcance de la presente invención, por ejemplo, se prevé que el efecto terapéutico de los inhibidores usados se detecte al evaluar el número de células de cáncer hemático en un paciente, usando técnicas disponibles en la especialidad, p. ej. usando el recuento de glóbulos rojos (WBC, o leucocitos) y la fórmula leucocítica. Los glóbulos blancos se pueden contar manualmente en hemocitómetros (cámara de Neubauer) o con contadores automáticos. Para determinar la fórmula leucocítica, una gota se sangre se puede extender finamente sobre un portaobjetos de vidrio, secar al aire y teñir con colorante de Romanofsky, lo más comúnmente la técnica de Wright o May-Grunewald-Giemsa. A continuación, las células se cuentan y se clasifican usando un examen morfológico y/o histoquímica según se describe en Blumenreich MS. The White Blood Cell and Differential Count. En: Walker HK, Hall WD, Hurst JW, editores. Clinical Methods: The History, Physicals, and Laboratory Examinations. 3a edición. Boston: Butterworths; 1990. Capítulo 153. Alternativamente, los leucocitos se aíslan de una muestra de sangre y se tiñen con anticuerpos marcados fluorescentemente contra marcadores de la superficie celular de leucocitos y posteriormente se analizan mediante citometría de flujo a fin de calcular el número absoluto de células para cada subpoblación de leucocitos. Adicionalmente o alternativamente, también es posible evaluar la apariencia general del paciente respectivo, lo que también ayudará al médico experto a evaluar si la terapia es eficaz. Los expertos en la especialidad están al tanto de otros muchos modos que permitirán a un médico observar un efecto terapéutico del compuesto para el uso en el tratamiento de cáncer hemático, en particular AML, según se divulga en la presente en el contexto de un método o uso de la presente invención.

Aunque es posible administrar los inhibidores según la presente invención directamente sin formulación, en otro aspecto de la presente invención los compuestos se emplean preferiblemente en la forma de una composición de formulación farmacéutica o veterinaria, que comprende un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y un compuesto según se define en las reivindicaciones, es decir la inmunoglobulina según se define en las reivindicaciones. El portador usado en combinación con el compuesto se basa en agua y forma una solución acuosa. Una solución portadora oleosa que contiene el compuesto es una alternativa a la solución portadora acuosa. Las soluciones bien acuosas o bien oleosas contienen además agentes espesantes para proporcionar a la composición la viscosidad de un linimento, una crema, una pomada, un gel, o similares. Agentes espesantes adecuados son muy conocidos por los expertos en la especialidad. Realizaciones alternativas de la presente invención también pueden usar un portador sólido que contiene el compuesto para el uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio mediado por S100A12:TLR4/MD2/CD14 según se describe en cualquier parte en la presente. Esto permite que se aplique una realización alternativa a través de un aplicador en barra, un parche o un supositorio. El portador sólido contiene además agentes espesantes para proporcionar a la composición la consistencia de cera o parafina.

También es concebible usar un tratamiento para AML adicional en combinación con los inhibidores para el uso en el tratamiento de un sujeto que sufra un cáncer hemático, en particular AML. El tratamiento para AML adicional se puede aplicar en general anticipadamente, simultáneamente y/o posteriormente a los usos de la invención.

El trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) es un tratamiento común para AML. El término se refiere generalmente al trasplante de células madre hematopoyéticas, habitualmente derivadas de la médula ósea o la sangre, y comprende HSCT autólogo (es decir, las células madre se derivan del paciente) y alogénico (es decir, las células madre se derivan de un donante). Para el tratamiento de la AML, generalmente se prefiere e1HSCT alogénico. También se prevé que los usos de la presente invención se puedan aplicar antes o después de1HSCT, o ambos, o entre dos tratamientos de HSCT.

Los pacientes (o grupos de pacientes) tratados según la invención también pueden recibir un tratamiento quimioterapéutico. En el contexto de la presente invención, un "tratamiento quimioterapéutico" se refiere a un tratamiento con un agente antineoplástico o la combinación de más de uno de estos agentes en un régimen de tratamiento estandarizado. En el contexto de la presente invención, el término "tratamiento quimioterapéutico" comprende cualquier agente antineoplástico incluyendo moléculas orgánicas de pequeño tamaño, péptidos, oligonucleótidos y similares. Agentes incluidos en la definición de quimioterapia son, sin limitación, agentes alquilantes, p. ej. mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, clorambucilo, ifosfamida, busulfano, N-nitroso-N-metilurea (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (MeCCNU), fotemustina, estreptozotocina, dacarbazina, mitozolomida, temozolomida, tiotepa, mitomicina, diazicuona (AZQ), cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, procarbazina y hexametilmelamina; antimetabolitos, p. ej. metotrexato, pemetrexed, fluorouracilo, capecitabina, citarabina, gemcitabina, decitabina, Vidaza, fludarabina, nelarabina, cladribina, clofarabina, pentostatina, tioguanina, mercaptopurina; agentes antimicrotubulares, p. ej. vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, vinflunina, paclitaxel, docetaxel, podofilotoxina; inhibidores de topoisomerasa, p. ej. irinotecano, topotecano, etopósido, doxorrubicina, mitoxantrona, tenipósido, novobiocina, merbarona, aclarrubicina; antibióticos citotóxicos, p. ej. actinomicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, pirarrubicina, aclarrubicina y mitoxantrona, solo por nombrar algunos. Sin embargo, un experto normal en la especialidad apreciará que la invención no se limita a estos agentes quimioterapéuticos y puede implicar asimismo el uso de otros agentes que dañan el ADN. Dicha combinación según la presente invención se puede administrar como una formulación combinada o separadamente.

Un tratamiento para AML adicional también incluye radioterapia. También se prevé el tratamiento o la profilaxis del SNC a fin de evitar que las células malignas se extiendan en el SNC, p. ej. mediante quimioterapia intratecal y/o radioterapia del cerebro y la médula espinal.

Puesto que los presentes inventores especulan que el éxito terapéutico de los inhibidores divulgados en la presente se podría basar (en parte) en una actividad inmunopotenciadora de dichos inhibidores al inhibir los puntos de control inmunitario descritos en la presente, dando como resultado de ese modo una intensificación de la actividad anticancerosa de las células T, también se prevén inductores e intensificadores de la activación y la proliferación de células T, células T CAR, células T donantes, anticuerpos anti-antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y otros.

Según otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de puntos de control inmunitario contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR), galectina 9, TIM-3 y/o TIGIT según se describe en cualquier parte en la presente y una célula T CAR según se describe en cualquier parte en la presente. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de puntos de control inmunitario contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR), galectina 9, T ⁱM - 3 y/o TIGIT según se describe en cualquier parte en la presente y una construcción de anticuerpo capaz de acoplarse a células T según se describe en cualquier parte en la presente.

Dicha composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o una pluralidad de los inhibidores de puntos de control inmunitario, las células T CAR y/o la construcción de anticuerpo descritos en la presente junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Composiciones farmacéuticas descritas en la presente incluyen, pero no se limitan a, composiciones líquidas, congeladas y liofilizadas. Preferiblemente, los materiales de la formulación son atóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Según se usa en la presente, el término "composición farmacéutica" se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de portadores, estabilizantes y/o excipientes. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o mediante la inyección directa a un tejido. En particular, se prevé que dicha composición se administre a un paciente a través de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar de diferentes modos, p. ej., mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como un ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida, es decir continua, se puede realizar mediante un pequeño sistema de bombeo portado por el paciente para dosificar la entrada de agente terapéutico en el cuerpo del paciente según se describe en el documento WO2015/036583.

Las composiciones pueden comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son muy conocidos en la especialidad e incluyen soluciones, p. ej. soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Las composiciones que comprenden estos portadores se pueden formular mediante métodos convencionales conocidos. Las formulaciones pueden comprender carbohidratos, soluciones tamponadoras, aminoácidos y/o tensioactivos. Los carbohidratos pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. En general, según se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" significa todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la especialidad. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son atóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen: agentes tamponadores adicionales; conservantes; codisolventes; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables, tales como poliésteres; iones conjugados formadores de sales, tales como sodio, alcoholes sacarinos polihidroxilados; aminoácidos, tales como alanina, glicina, asparagina, 2-fenilalanina y treonina; azúcares o alcoholes sacarinos, tales como trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitoles (p. ej., inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como glutationa, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol y tiosulfato sódico; proteínas de bajo peso molecular, tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; y polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona. Estas formulaciones se pueden usar para administraciones continuas que pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistemas de bombeo. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina. Los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de >1,2 KD y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular de >3 KD. Ejemplos no limitativos para detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Ejemplos no limitativos para poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistemas tamponadores usados en la presente invención pueden tener un pH preferido de 5-9 y pueden comprender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada que se puede determinar, p. ej., mediante estudios de aumento a escala de la dosis mediante la administración de dosis crecientes del polipéptido descrito en la presente que exhibe especificidad para especies cruzadas descrita en la presente a primates distintos a chimpancés, a modo de ejemplo macacos. Según se indica anteriormente, la composición que elige como diana CD33 descrita en la presente que exhibe la especificidad para especies cruzadas descrita en la presente se puede usar ventajosamente en forma idéntica en una prueba preclínica en primates distintos de chimpancés y como fármaco en seres humanos. La composición o estas composiciones también se pueden administrar en combinación con otros fármacos proteínicos o no proteínicos adicionales. Estos fármacos se pueden administrar simultáneamente con la composición que comprende el polipéptido descrito en la presente según se define en la presente o separadamente antes o después de la administración de dicho polipéptido en intervalos y dosis definidos temporalmente. El régimen de dosificación será determinado por el médico responsable y los factores clínicos. Como se sabe bien en las especialidades médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla, la superficie corporal, la edad del paciente, el compuesto particular que se vaya a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente.

Preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución láctica de Ringer o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición podría comprender portadores proteínicos, como, p. ej., albúmina sérica o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano. Se prevé que la composición pueda comprender, además del polipéptido descrito en la presente definido en la presente, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Estos agentes podrían ser fármacos que actúen sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúen como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben inmunorreacciones (p. ej. corticosteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidos en la especialidad. También se prevé que la composición que comprende el compuesto que elige como diana CD33 y al menos un factor epigenético en una sola formulación o formulaciones separadas se aplique en una coterapia adicional, es decir, en combinación con otro medicamento anticanceroso.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en la presente se puede determinar a modo de ejemplo mediante ensayos de citotoxicidad, según se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth y cols. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Eficacia" o "eficacia in vivo" según se usa en la presente se refiere a la respuesta a la terapia mediante la composición farmacéutica de la invención, usando, p. ej., criterios de respuesta a NCl estandarizados. El éxito o la eficacia in vivo de la terapia usando una composición farmacéutica según la invención se refiere a la efectividad de la composición para su propósito pretendido, es decir la capacidad de la composición para provocar su efecto deseado, es decir agotamiento de células patológicas, p. ej. células tumorales. La eficacia in vivo se puede controlar mediante métodos estándar establecidos para las entidades patológicas respectivas incluyendo, pero no limitadas a, recuentos de glóbulos blancos, fórmulas leucocíticas, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de la médula ósea. Además, se pueden usar diversos parámetros de la química clínica específicos de una enfermedad y otros métodos estándar establecidos. Por otra parte, se pueden usar tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía de resonancia magnética nuclear (p. ej. para la valoración de la respuesta basada en los criterios del National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. Abril 1999;17(4):1244]), barrido por tomografía de emisión positrónica, recuentos de glóbulos blancos, fórmulas leucocíticas, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de la médula ósea, biopsias/histologías de nódulos linfáticos, y diversos parámetros de la química clínica específicos para linfomas (p. ej. lactato deshidrogenasa) y otros métodos estándar establecidos.

Otro reto importante en el desarrollo de fármacos es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. A este fin, se puede establecer un perfil farmacocinético del candidato a fármaco, es decir un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular para tratar una afección dada. Parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco para tratar cierta entidad patológica incluyen, pero no se limitan a: semivida, volumen de distribución, metabolismo hepático de primer paso y el grado de unión a suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede estar influenciada por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente. "Semivida" significa el tiempo en el que el 50% de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, p. ej. metabolismo, excreción, etc. Por "metabolismo hepático de primer paso" se entiende la propensión de un fármaco a ser metabolizado tras el primer contacto con el hígado, es decir durante su primer paso a través del hígado. "Volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco a través de los diversos compartimentos del cuerpo, como, p. ej., espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos. "Grado de unión a suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco para interactuar con y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, conduciendo a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retraso (Tretraso), Tmáx, velocidades de absorción, más ataque y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado. "Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimento hemático. "Tiempo de retraso" significa el retardo temporal entre la administración del fármaco y su detección y mensurabilidad en sangre o plasma. "Tmáx" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración máxima en sangre del fármaco, y "Cmáx" es la concentración en sangre máximamente obtenida con un fármaco dado. El tiempo para alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco que se requiere para su efecto biológico está influenciado por todos los parámetros.

El término "toxicidad" según se usa en la presente se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en episodios adversos o episodios adversos graves. Estos episodios secundarios se podrían referir a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.

El término "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" según se usa en la presente define la administración de un fármaco sin inducir episodios adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período más prolongado de aplicación del fármaco. La "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" se puede evaluar, p. ej., a intervalos regulares durante el período de tratamiento y seguimiento. Las medidas incluyen evaluación clínica, p. ej. manifestaciones orgánicas, y cribado de anormalidades de laboratorio. La evaluación clínica se puede llevar a cabo y las desviaciones de los hallazgos normales se pueden registrar/codificar según estándares de NCI-CTC y/o MedDRA. Manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, según se indica, p. ej., en los criterios de terminología comunes para episodios adversos v3.0 (CTCAE). Parámetros de laboratorio que se pueden probar incluyen a modo de ejemplo hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y el examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, fluido linfático o espinal, un líquido y similares. Así, la seguridad se puede valorar, p. ej., mediante examen físico, técnicas de obtención de imágenes (es decir ultrasonidos, rayos X, barridos CT, obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir electrocardiograma), los signos vitales, al medir parámetros de laboratorio y registrar episodios adversos. Por ejemplo, los episodios adversos en primates distintos a chimpancés en los usos y los métodos según la invención se pueden examinar mediante métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

El término "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para alcanzar o al menos alcanzar parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya sufra la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y el estado general del propio sistema inmunitario del sujeto. El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciban tratamiento profiláctico o terapéutico. El término "dosis eficaz y atóxica", según se usa en la presente, se refiere a una dosis tolerable de una composición farmacéutica (es decir una composición farmacéutica que comprende el inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 y una célula T CAR o una construcción de anticuerpo que se acopla a células T en una sola formulación o en formulaciones separadas) que es suficientemente alta para provocar el agotamiento de células patológicas, la eliminación de un tumor, la disminución de un tumor o la estabilización de una enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Estas dosis eficaces y atóxicas se pueden determinar, p. ej., mediante estudios de aumento a escala de la dosis descritos en la técnica y deben estar por debajo de la dosis que induzca episodios adversos graves (toxicidad limitativa de la dosis, DLT).

Los términos anteriores también se mencionan, p. ej., en la evaluación de seguridad preclínica de productos farmacéuticos derivados de biotecnología S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; reunión del ICH Steering Committee el 16 de julio de 1997. La dosificación apropiada, o cantidad terapéuticamente eficaz, de una composición farmacéutica que comprende el inhibidor según la presente invención y una célula T CAR o una construcción de anticuerpo según se describe en cualquier parte en la presente dependerá de la afección que se vaya a tratar, la gravedad de la afección, una terapia anterior y la anamnesis y la respuesta al agente terapéutico del paciente. La dosis apropiada se puede ajustar según el juicio del médico responsable de modo que se pueda administrar al paciente una vez o a lo largo de una serie de administraciones. La composición farmacéutica se puede administrar como un solo agente terapéutico o en combinación con terapias adicionales tales como terapias anticancerosas según sea necesario.

Las composiciones farmacéuticas según esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, intraarticular y/o intrasinovial. La administración parenteral puede ser mediante inyección en embolada o infusión continua. Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye en primer lugar en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado se puede reconstituir, p. ej., en agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o la misma formulación en la que ha estado la proteína antes de la liofilización.

Se ha encontrado sorprendentemente en relación con la presente invención que una combinación del inhibidor según se define en las reivindicaciones y la construcción de anticuerpo biespecífica AMG330 incrementa significativamente la lisis celular de células de AML de un modo dependiente de la dosis en comparación con la lisis celular solamente reducida por anticuerpos de bloqueo contra CD112 y CD155 solos (Figura 3-13). Este hallazgo apoya que la combinación de un inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 y un acoplador para células T dirigido por CD33, CD19 o Flt3 sería sinérgicamente más eficaz que cualquier terapia administrada separadamente. Según esto, la administración descrita de uno o más inhibidores contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 en combinación con un acoplador para células T dirigido por CD33, CD19 o Flt3 descrito en la presente puede permitir que dosis inferiores de un acoplador para células T biespecífico sea eficaz en un momento dado. La lisis redirigida de células diana a través de la incorporación de células T mediante una construcción multiespecífica, al menos biespecífica, implica la formación de sinapsis citolíticas y el aporte de perforina y granzimas. Las células T acopladas son capaces de una lisis de células diana en serie, y no se ven afectadas por mecanismos de escape inmunitario que interfieren con el procesamiento y la presentación de antígenos peptídicos, o la diferenciación de células T clonales; véanse, por ejemplo, los documentos WO 2007/042261 o WO 2008/119567.

Las formulaciones descritas en la presente son útiles como composiciones farmacéuticas para el uso en el tratamiento, la mejora y/o la prevención de la afección médica patológica según que se describe en la presente en un paciente que lo necesite. El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado o una célula procedente de un paciente que tiene una enfermedad/un trastorno, un síntoma de una enfermedad/un trastorno o una predisposición a una enfermedad/un trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o afectar a la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. Los "que necesitan tratamiento" incluyen los que ya tienen el trastorno, así como aquellos en los que se ha de prevenir el trastorno. El término "enfermedad" es cualquier afección que se beneficie del tratamiento con la formulación proteínica descrita en la presente. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión. Ejemplos no limitativos de enfermedades/trastornos que se van a tratar en la presente incluyen los cánceres hemáticos descritos en la presente, particularmente leucemia mielógena tal como AML.

La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. En estas realizaciones, materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, prolina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito sódico o hidrogenosulfito sódico); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes voluminizadores (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; iones conjugados formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes sacarinos (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes intensificadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes intensificadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro sódico o potásico, manitol sorbitol); vehículos de aporte; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase REMINGTON'S PHARMa Ce UTICAL SCIENCES, 18" Edición, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

La composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la especialidad dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración pretendida, el formato de aporte y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, anteriormente. En ciertas realizaciones, estas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de depuración in vivo de las proteínas de unión antigénica descritas en la presente. En ciertas realizaciones, el vehículo o portador principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza bien acuosa o bien no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón de Tris de alrededor de pH 7,0-8,5, o tampón de acetato de alrededor de pH 4,0-5,5, y pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En ciertas realizaciones de la invención, el anticuerpo humano o su fragmento de unión antigénica descritos en la presente o la construcción de anticuerpo descrita en las composiciones de la presente se pueden preparar para el almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, anteriormente) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas realizaciones, el inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 y una célula T CAR o una construcción de anticuerpo que se acopla a células T se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se pueden seleccionar para el aporte parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para la inhalación o para el aporte a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la especialidad. Los componentes de la formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que sean aceptables para la zona de administración. En ciertas realizaciones, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH de alrededor de 5 a alrededor de 8.

Composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la especialidad, incluyendo formulaciones que implican al inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 y una célula T CAR o una construcción de anticuerpo que se acopla a células T según se describe en la presente en formulaciones de aporte sostenido o controlado. Técnicas para formular una variedad de otros medios de aporte sostenido o controlado, tales como portadores liposómicos, micropartículas bioerosionables o cuentas porosas e inyección de depósito, también son conocidas por los expertos en la especialidad. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional N° WO 9315722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el aporte de composiciones farmacéuticas. Preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (como los divulgados en la Pat. EE. UU. N° 3.773.919 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea N° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo gamma (Sidman y cols., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer y cols., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer y cols., 1981, anteriormente) o poli-ácido D(-)-3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea N° EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que se pueden preparar mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la especialidad. Véase, p. ej., Eppstein y cols., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; las Publicaciones de Solicitud de Patente Europea N° EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

Las composiciones farmacéuticas usadas para la administración in vivo se proporcionan típicamente como preparaciones estériles. La esterilización se puede efectuar mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método se puede efectuar bien antes o bien después de la liofilización y la reconstitución. Las composiciones para la administración parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en una solución. Generalmente, las composiciones parenterales se introducen en un recipiente que tiene una abertura de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o un vial para soluciones intravenosas que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Se pueden usar sales según ciertas realizaciones de la invención para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o la estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición según la invención. Como se sabe bien, los iones pueden estabilizar el estado natural de proteínas al unirse a residuos cargados sobre la superficie de las proteínas y al proteger grupos cargados y polares en la proteína y reducir la fuerza de sus interacciones electrostáticas, interacciones atractivas y repulsivas. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína al unirse a, en particular, los enlaces peptídicos (--CONH) desnaturalizados de la proteína. Por otra parte, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteína también puede reducir interacciones electrostáticas intermoleculares y, de ese modo, prevenir o reducir la agregación y la insolubilidad de la proteína.

Se ha desarrollado un número de clasificaciones categóricas de iones y sus efectos sobre proteínas, que se pueden usar para formular composiciones farmacéuticas según la invención. Un ejemplo es la serie de Hofmeister, que clasifica los solutos iónicos e iniónicos polares por su efecto sobre la estabilidad de conformación de proteínas en solución. Los solutos estabilizantes se denominan "cosmotrópicos". Los solutos desestabilizantes se denominan "caotrópicos". Los cosmótropos se usan comúnmente a altas concentraciones (p. ej., sulfato amónico >1 molar) para precipitar proteínas en solución ("desalación"). Los caótropos se usa comúnmente para denture y/o para solubilizar proteínas ("salación"). La eficacia de los iones para la "salación" y la "desalación" define su posición en la serie de Hofmeister.

Se pueden usar aminoácidos libres en las formulaciones según diversas realizaciones de la invención como agentes voluminizadores, estabilizantes y antioxidantes, así como otros usos estándar. Se pueden unir lisina, prolina, serina y alanina para estabilizar proteínas en una formulación. La glicina es útil en la liofilización para asegurar la estructura y las propiedades correctas de la torta. La arginina se puede usar para inhibir la agregación de proteínas, en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas. La metionina es útil como un antioxidante. Los polioles incluyen azúcares, p. ej., manitol, sacarosa y sorbitol y alcoholes polihidroxilados tales como, a modo de ejemplo, glicerol y propilenglicol, y, con propósitos de análisis en la presente, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmotrópicos. Son agentes estabilizantes útiles en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas para proteger a las proteínas de procesos de degradación física y química. Los polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones.

Las formulaciones pueden comprender además uno o más antioxidantes. La oxidación perjudicial de proteína se puede prevenir hasta cierto punto en formulaciones farmacéuticas al mantener niveles apropiados de oxígeno ambiental y temperatura y al evitar la exposición a la luz. Asimismo, se pueden usar excipientes antioxidantes para prevenir la degradación oxidativa de proteínas. Entre los antioxidantes útiles a este respecto están agentes reductores, eliminadores de oxígeno/radicales libres y agentes quelantes. Los antioxidantes para el uso en formulaciones proteínicas terapéuticas según la invención son preferiblemente hidrosolubles y mantienen su actividad a lo largo de la vida útil de un producto. A este respecto, el EDTA es un antioxidante preferido según la invención.

Los antioxidantes pueden dañar las proteínas. A modo de ejemplo, los agentes reductores, tales como glutationa en particular, pueden romper enlaces disulfuro intramoleculares. Así, los antioxidantes para el uso en la invención se seleccionan, entre otras cosas, para eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que ellos mismos dañen las proteínas en la formulación. Las formulaciones según la invención pueden incluir iones metálicos que son cofactores proteínicos y que son necesarios para formar complejos de coordinación proteínicos, tales como cinc necesario para formar ciertas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan procesos físicos y químicos que degradan proteínas.

Como se podría esperar, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más problemático que las formulaciones liofilizadas. Los productos criosecados se pueden liofilizar sin el conservante y reconstituirse con un diluyente que contiene conservante en el momento del uso. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante está en contacto con la proteína, minimizando significativamente los riesgos para la estabilidad asociados. Con formulaciones líquidas, la eficacia y la estabilidad del conservante se deben mantener a lo largo de toda la vida útil del producto (alrededor de 18 a 24 meses). Un punto importante a señalar es que la eficacia del conservante se debe mostrar en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes excipientes.

Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, una suspensión, un gel, una emulsión, un sólido, un cristal, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar bien en una forma lista para usar o bien en una forma (p. ej., liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. La divulgación también proporciona estuches para producir una unidad de dosis única. En ciertos aspectos, se proporcionan estuches que contienen jeringas precargadas de una sola cámara y múltiples cámaras (p. ej., jeringas para líquido y liojeringas). La cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende un inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 y una célula T CAR o una construcción de anticuerpo que se acopla a células T dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Un experto en la especialidad apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula aportada, la indicación para la que se esté usando la composición descrita en la presente, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o la condición (la edad y la salud general) del paciente. En ciertas realizaciones, el médico puede valorar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede variar de alrededor de 0,1 pg/kg hasta alrededor de 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones específicas, la dosificación puede variar de 1,0 pg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg, opcionalmente desde 10 pg/kg hasta alrededor de 10 mg/kg o desde 100 pg/kg hasta alrededor de 5 mg/kg.

Una cantidad eficaz terapéutica de la composición farmacéutica que comprende el inhibidor contra CD112, CD155, TIGIT, galectina 9 y/o TIM-3 y una célula T CAR o una construcción de anticuerpo que se acopla a células T según se describe en cualquier parte en la presente preferiblemente da como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia o duración de los períodos libres de síntomas de enfermedad o una prevención del deterioro o la discapacidad debidos al padecimiento de la enfermedad. Para tratar tumores que expresan CD112, CD155 y o galectina 9, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición divulgada en la presente inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80% o al menos alrededor de 90% con relación a pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar en un modelo en animales predictivo de la eficacia en tumores humanos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando un dispositivo médico. Ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas se describen en las Patentes de EE. UU. N° 4.475.196, 4.439.196, 4.447.224, 4.447.233, 4.486.194, 4.487.603, 4.596.556, 4.790.824, 4.941.880, 5.064.413, 5.312.335, 5.312.335, 5.383.851 y 5.399.163.

A destacar que los inhibidores de puntos de control inmunitario descritos en la presente así como todas las realizaciones relativas a los mismos que se describen en la presente pueden ser para el uso en métodos de tratamiento de un cáncer hemático, tal como leucemia o linfoma, particularmente AML, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho inhibidor a un sujeto que lo necesite.

De forma similar, los inhibidores de puntos de control inmunitario descritos en la presente se pueden usar para la preparación de una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de un cáncer hemático, tal como leucemia o linfoma, particularmente AML.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar realizaciones o características específicas de la presente invención. No se debe considerar que estos limiten el alcance de esta invención. Los ejemplos se incluyen con propósitos ilustrativos, y la presente invención solamente está limitada por las reivindicaciones.

Muestras procedentes de 140 pacientes sin tratamiento con AML (AMLSG 07-04, NCT00151242) recientemente diagnosticada se analizaron mediante RT-qPCR con respecto a la expresión de las moléculas de puntos de control inmunitario PVR, PVRL2 y galectina 9 (Gal-9). La expresión se correlacionó con la demografía del paciente (edad, cariotipo, estado de la mutación FLT3) y los datos de supervivencia clínica mediante regresión de Cox multivariable. La mayoría de los pacientes mostraba expresión de ARNm de PVR (94%), PVRL2 (95%) y Gal-9 (92%). En una regresión de Cox por etapas multivariable para la supervivencia global, se identificaron un cariotipo desfavorable, alto PVR y alta expresión de Gal-9 como marcadores independientes (p <0,001, HR: 2,10, CI 1,39-3,15 para el cariotipo; p=0,001, HR: 1,64, CI 1,21 -2,21 para PVR y p<0,001, HR: 0,67, CI 0,54-0,84 para Gal-9). Debido a una alta correlación entre PVR y PVRL2 (rho de Pearson =0,827, p<0,001), PVRL2 se retiró durante el procedimiento por etapas. No obstante, si se excluía PVR de la regresión de Cox multivariable, PVRL2 permanecía como un término significativo en el procedimiento por etapas además del cariotipo y Gal-9 (p=0,003, HR: 1,58, CI 1,17-2,13 para PVRL2). En una segunda cohorte de pacientes independiente que contiene la expresión génica basada en micromatrices y datos clínicos de 291 pacientes con AML (Verhaak y cols., Haematologica 2009;94) una alta expresión de PVR y PVRL2 en contraste con la expresión de CD80, CD86 o PD-L1 se asociaba con una escasa supervivencia global (prueba de rango logarítmico p=0,003 y p=0,032, respectivamente). En ensayos de destrucción in vitro, se estudió el efecto terapéutico del bloqueo de PVR y PVRL2 mediante FACS usando tinción con 7-AAD. Las líneas celulares de AML MV4-11, Kasumi-1 y Molm-13 se preincubaron con anticuerpos de bloqueo contra PVR, PVRL2 o ambos y se cocultivaron durante 24 h con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos en presencia o ausencia de AMG 330.

En ausencia de AMG 330, la destrucción celular de MV4-11 se incrementaba de 12,6 ± 4,7% (control) a 33,0 ± 8,8% (PVR), a 40,4 ± 10,4% (PVRL2) y a 56,0 ± 12,0% (ambos PVR PVRL2). En presencia de una concentración insuficiente de AMG 330 (la lisis celular de 0,1 ng/ml de MV4-11 era 29,4 ± 9,0% (AMG 330 solo), 49,7 ± 12,6% (AMG 330 PVR), 57,9 ± 11,3% (AMG 330 PVRL2) y 70,0 ± 9,8% (AMG 330 PVR PVRL2; n=4, p<0,05 para todas las comparaciones). Se encontraron resultados comparables para Kasumi-1 y Molm-13, siendo el tratamiento más eficaz el bloqueo de ambos inhibidores de puntos de control, aunque no se podían verificar en todos los casos efectos aditivos de los anticuerpos contra PVR y PVRL2 (datos no mostrados). Para confirmar la especificidad del enfoque y excluir efectos provocados por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), se generaron inactivaciones dobles de PVR y PVRL2 de la línea celular MV4-11 mediante CRISPR/Cas-9. Se observó una destrucción significativa en células con doble inactivación de PVR y PVRL2 en comparación con células silvestres (40,5 ± 8,1% frente a 25,9 ± 9,1; n=3, p<0,001). Experimentos adicionales que usan un anticuerpo irrelevante contra el bloqueo del receptor de CD117 o Fcy mediante anticuerpos de IgG purificados excluían la ADCC, confirmando la importancia funcional del bloqueo de PVR/PVRL2.

La expresión de los ligandos de puntos de control inmunitario PVR y PVRL2 confiere un pronóstico negativo a pacientes con AML posiblemente debido a una evasión inmunitaria. Se podría mostrar adicionalmente que la destrucción de células de AML por PBMCs se podría aumentar mediante el bloqueo de estos nuevos inhibidores de puntos de control. Por otra parte, la adición de anticuerpos que bloquean PVR y/o PVRL2 a AMG 330 podría intensificar la citotoxicidad. Por lo tanto, el bloqueo de PVR y PVRL2 representa un objetivo prometedor para el tratamiento de AML.

Impacto de pronóstico de PVR, PVRL2 y galectina 9 en AML

La expresión de ARNm de PVR, PVRL2 y galectina 9 de 140 pacientes con AML de novo se analizó en RT-PCR cuantitativa usando el LightCycler 96 (Roche, Basilea, Suiza). La gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) servía como un gen de referencia. Se usaron los siguientes cebadores: PVR directo 5'-agcaggagcgtggatatctg-3' (SEQ ID No: 1), PVR inverso 5'-gactgtgccagacaggaacc-3'(SEQ ID No: 2), PVRL2 directo 5'-gaggacgagggcaactacac-3' (SEQ ID No: 3), PVRL2 inverso 5'-agggatgagagccaggagat-3' (SEQ ID No: 4), galectina 9 directo 5'-gtctccaggacggacttcag-3' (SEQ ID No: 5), galectina 9 inverso 5'-caggaagcagaggtcaaagg-3' (SEQ ID No: 6), GAPDH directo 5'-gtcagtggtggacctgacct-3' (SEQ ID No: 7), GAPDH inverso 5'- tgctgtagccaaattcgttg-3' (SEQ ID No: 8). Se definió un corte para cada gen dividiendo la cohorte de pacientes con AML en expresores bajos frente a altos. La expresión génica se correlacionó con la demografía del paciente (edad, cariotipo, estado de la mutación FLT3) y los datos de supervivencia clínica usando regresión de Cox multivariable. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 17 (SPSS Inc, Chicago, IL).

Expresión proteínica de PVR, PVRL2 y galectina 9

Se analizó la expresión proteínica de PVR y PVRL2 en líneas celulares de AML y células de AML primarias en citometría de flujo (programas FACSCalibur y CellQuestPro, BD Biosciences) usando los siguientes anticuerpos: clon anti-PVR de ratón D171 (Thermo Scientific™ Lab Vision, Waltham, MA) y clon anti-PVRL2 de ratón L14 (Bottino y cols, J Exp Med 2003;198:557-567) como anticuerpos primarios y anticuerpo anti-APC de ratón como anticuerpo secundario. La galectina 9 se tiñó con el anticuerpo de ratón contra inmunoglobulinas humanas marcado con APC directamente (clon 9M1-3; Biozol, Eching, Alemania).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor contra CD112 (nectina 2, PVRL2), CD155 (PVR) y/o TIGIT para el uso en el tratamiento de leucemia mieloide (AML), en donde el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a CD112, CD155 y/o TIGIT, y en donde la composición farmacéutica comprende además una construcción de anticuerpo de Fv monocatenario (scFv) biespecífica que se acopla a células T y comprende un dominio de unión a CD3épsilon y un dominio de unión adicional que elige como diana una molécula superficial seleccionada del grupo que consiste en CD33, CD19 y Flt3.

2. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor contra CD112 inhibe la interacción entre CD112 y TIGIT o en donde dicho inhibidor contra CD155 inhibe la interacción entre CD155 y TIGIT, o en donde dicho inhibidor contra TIGIT inhibe la interacción entre TIGIT y CD112, o en donde dicho inhibidor contra TIGIT inhibe la interacción entre TIGIT y CD155.

3. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor contra CD112 modula la señalización intracelular de CD112.

4. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor contra CD155 modula la señalización intracelular de CD155.

5. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor contra TIGIT modula la señalización intracelular de TIGIT.

6. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en donde la construcción de anticuerpo que se acopla a células T y comprende un dominio de unión a CD3épsilon y un dominio de unión adicional que elige como diana una molécula superficial seleccionada del grupo que consiste en CD33, CD19 y Flt3 se selecciona de las moléculas representadas en SEQ ID Nos.: 15 a 37.