CN108473572B - 用于治疗血源性癌症的免疫检查点抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗血源性癌症、特别是急性骨髓性白血病(AML)的方法的针对CD112(连接蛋白‑2、PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集素‑9、TIM‑3和/或TIGIT的抑制剂。此外，本发明提供了一种包含针对CD112(连接蛋白‑2、PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集素‑9、TIM‑3和/或TIGIT的抑制剂和CAR T细胞的药物组合物。本发明还提供了一种包含针对CD112(连接蛋白‑2、PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集素‑9、TIM‑3和/或TIGIT的抑制剂和能够接合T细胞的抗体构建体的药物组合物。

Description

用于治疗血源性癌症的免疫检查点抑制剂

发明领域

本发明提供用于治疗血源性癌症、特别是AML的免疫检查点抑 制剂。本发明还涉及包含所述免疫检查点抑制剂和能够分别接合T细 胞的CAR T细胞或抗体构建体的药物组合物。

发明技术

激活治疗性抗肿瘤免疫的最有希望的方法之一是封闭免疫检查 点。免疫检查点是指免疫系统固有的大量抑制途径，其对维持自身耐 受性和调节外周组织中生理学免疫应答的持续时间和幅度至关重要， 以使附带组织损伤最小化。

一般来讲，T细胞不会对这些配体-受体相互作用产生应答，除 非它们首先通过TCR识别其同源抗原。许多配体结合至多种受体， 其中一些递送共刺激信号，另一些递送抑制信号。一般来讲，结合相 同的一种或多种配体(诸如CD28和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4))的共刺激-抑制性受体对显示出与初始和静息T细胞上表 达的共刺激受体不同的表达动力学，但是抑制性受体通常在T细胞活 化后上调。结合共刺激受体和抑制性受体二者的一个重要的膜结合配 体家族是B7家族。所有的B7家族成员及其已知的配体都属于免疫 球蛋白超家族。最近确定的B7家族成员的许多受体尚未确定。与同 源TNF受体家族分子结合的TNF家族成员代表调控性配体-受体对的 第二个家族。这些受体主要在被其同源配体接合时递送共刺激信号。

调控T细胞活化的另一个主要信号种类来自微环境中的可溶性 细胞因子。T细胞和APC之间的通讯是双向的。在一些情况下，这 在配体自身将信号传导至APC时发生。在其它情况下，活化的T细 胞上调接合APC上的同源受体的配体，诸如CD40L。

然而，肿瘤指定某些免疫检查点途径作为免疫抗性的主要机制， 特别是针对肿瘤抗原特异性的T细胞。因为许多免疫检查点是由配体 -受体相互作用引发的，所以它们可以被抗体封闭或受到重组形式的 配体或受体的调节。CTLA4抗体是第一种此类获得FDA批准的免疫 治疗剂。使用另外的免疫检查点蛋白封闭剂(诸如PD-1)的初步临床发 现表明了存在广泛而多样的增强抗肿瘤免疫的机会，并且具有产生持 久临床应答的潜力。

因此，癌症免疫疗法也集中在开发可使赘生性细胞和癌细胞更易 于被免疫系统、特别是被T细胞杀死的药剂。例如，这可以通过使用 干扰免疫检查点蛋白，即配体或受体或它们二者来实现。虽然免疫检 查点分子的知识以及癌细胞所用的免疫检查点分子的知识不断增加， 但是仍不知道赘生性细胞以及随后的癌细胞使用哪些来逃避免疫系 统，从而获得不受控制的增长的能力。例如，同时已知血源性癌症， 特别是急性骨髓性白血病(AML)也逃避免疫系统。虽然推测可能涉及 免疫检查点蛋白，但还没有这方面的证据。因此，为了使血源性癌细 胞更容易接近免疫系统的杀死机构，需要提供克服免疫检查点蛋白的 影响的手段和方法，该需要未得到满足。

因此，本专利申请背后的技术问题是满足这种未满足的需要，即 提供使血源性癌细胞、特别是AML细胞更易于被身体免疫系统杀死 的手段和方法。一般来讲，解决方案是提供用于治疗血源性癌症、特 别是AML的免疫检查点配体CD112、CD155、其受体TIGIT、免疫检查点配体半乳糖凝集素-9(Galectin-9)和/或其受体TIM-3的抑制剂。 解决方案也反映在权利要求中，体现在说明书中，例示在所附实施例 中并且示于附图中。

发明概述

本发明涉及调节免疫系统以用于治疗血源性癌症(诸如淋巴瘤或 白血病，特别是AML)的化合物。此外，本发明涉及包含所述免疫调 节化合物和嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)的药物组合物。另外， 本发明提供了包含所述免疫调节化合物和能够接合T细胞的抗体构 建体的药物组合物。

就此而言，本发明注意到在血源性癌症治疗，特别是可受到各种 抑制剂影响的AML治疗中提供新免疫检查点，以治疗已产生免疫逃 避机制的癌细胞的需要。具体地讲，本发明人发现，CD112、CD155、 TIGIT、半乳糖凝集素-9和TIM-3作为新免疫检查点蛋白，可以特异 性靶向治疗血源性癌症，特别是AML。因此，针对CD112、CD155、 TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂导致AML细胞的细胞 裂解显著增加。另外，发明人发现，当与嵌合抗原受体T细胞(CAR T 细胞)或能够接合T细胞的抗体构建体(诸如双特异性T细胞接合(BiTE)抗体构建体AMG 330，其具有对CD3和CD33的双重特异性) 组合时，所述免疫检查点抑制剂的影响可以甚至更有效。因此，本发 明的化合物和组合物为血源性癌症，特别是AML患者提供了新治疗 选择，从而提供了使血源性癌细胞更易于被人体防御杀死的有希望的方法。因此，本发明表明了存在广泛而多样的增强抗肿瘤免疫的机会， 并且提供了似乎具有实现持久临床应答潜力的化合物和组合物。

在第一方面，本发明涉及用于治疗血源性癌症(特别是急性骨髓 性白血病(AML))的方法的针对CD112(连接蛋白-2、PVRL2)、CD155 (PVR)、半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑制剂。如本文所述， 第一组此类抑制剂抑制免疫检查点蛋白配体和受体之间的相互作用。 因此设想本发明的针对CD112的抑制剂抑制CD112和TIGIT之间的 相互作用。设想本发明的针对CD155的抑制剂抑制CD155和TIGIT 之间的相互作用。设想本发明的针对TIGIT的抑制剂抑制TIGIT和 CD112之间的相互作用。设想本发明的针对TIGIT的抑制剂抑制 TIGIT和CD155之间的相互作用。设想本发明的针对半乳糖凝集素-9 的抑制剂抑制半乳糖凝集素-9和TIM-3之间的相互作用。设想本发 明的针对TIM-3的抑制剂抑制TIM-3和半乳糖凝集素-9之间的相互 作用。本发明的抑制剂可以是抗体构建体。

还设想本发明的抑制剂还可以包含CAR T细胞。本发明的抑制 剂还可以包含能够接合T细胞的抗体构建体。能够接合T细胞的抗 体构建体优选地包含CD3结合域和靶向在AML细胞上表达的表面分 子的另外结合域。所述表面分子可以选自由CD33、CD19和Flt3组成的组。能够接合T细胞的抗体构建体优选地是能够结合CD3ε的结 合分子。本发明的抑制剂还可以包含免疫刺激剂。

如本文所述，另一组免疫检查点抑制剂减少免疫检查点蛋白的表 达。因此，设想本发明的针对CD112的抑制剂减少CD112的表达。 设想本发明的针对CD155的抑制剂减少CD155的表达。设想本发明 的针对TIGIT的抑制剂减少TIGIT的表达。设想本发明的针对半乳 糖凝集素-9的抑制剂增加半乳糖凝集素-9的表达。设想本发明的针对 TIM3的抑制剂增加TIM-3的表达。设想本发明的抑制剂是iRNA。 设想本发明的抑制剂敲除CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9 和/或TIM-3。敲除可以通过CRISPR/cas9技术来实现。

如本文所述，另一组免疫检查点抑制剂调节免疫检查点蛋白的细 胞内信号传导。因此，设想本发明的针对CD112的抑制剂调节CD112 的细胞内信号传导。设想本发明的针对CD155的抑制剂调节CD155 的细胞内信号传导。设想本发明的针对TIGIT的抑制剂调节TIGIT 的细胞内信号传导。设想本发明的针对半乳糖凝集素-9的抑制剂调节 半乳糖凝集素-9的细胞内信号传导。设想本发明的针对TIM-3的抑 制剂调节TIM-3的细胞内信号传导。

在另一个方面，本发明涉及包含针对CD112(连接蛋白-2、 PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑 制剂和CAR T细胞的药物组合物。所述针对CD112(连接蛋白-2、 PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑 制剂可以是抗体构建体。

在另一个方面，提供了包含针对CD112(连接蛋白-2、PVRL2)、 CD155(PVR)、半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑制剂和能够 接合T细胞的抗体构建体的药物组合物。所述能够接合T细胞的抗 体构建体可以包含CD3结合域和靶向在AML细胞上表达的表面分子 的另外结合域。

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必须注意的是，如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否则 单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物。因此，例如，提 及“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，并且提及“所述方法”包 括提及本领域的普通技术人员已知的可以为本文所述的方法而修改 或替代的等同步骤和方法。

除非另外指明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是 指该系列中的每个要素。本领域的技术人员将会认识到，或仅仅使用 常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同 物。此类等同物旨在被本发明所涵盖。

术语“和/或”无论在本文何处使用，均包括“和”、“或”以及“由所 述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的含义。

如本文所用，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％内， 优选地在10％内，更优选地在5％内。然而，它也包括具体的数字， 例如约20包括20。

术语“小于”或“大于”包括具体的数字。例如，小于20意指小于 或等于。类似地，多于或大于分别意指多于或等于或者大于或等于。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否 则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变化将被理解为意指包括所 述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或 者整体或步骤的组。当在本文中使用时，或者有时当在本文中与术语 “具有”一起使用时，术语“包含”可以被术语“含有”或“包括”代替。

当在本文中使用时，“由......组成”排除权利要求要素中未指定的 任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不 排除对权利要求的基本和新颖特征无实质上影响的材料或步骤。

在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由...... 组成”中的任何一者可以被另外两个术语中的任一者代替。

应该理解的是，本发明不限于本文描述的具体方法、方案、材料、 试剂和物质等，并且因此可以变化。本文所用的术语仅仅是出于描述 具体实施方案的目的，并且不旨在限制仅由权利要求限定的本发明的 范围。

本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利 申请、科学出版物、制造商的规格说明、说明书等)，无论是上文还 是下文，全文均据此以引用的方式并入。本文中的任何内容都不应被 理解为承认本发明由于在先发明而无权先于此类公开。就以引用的方 式并入的材料与本说明书相矛盾或不一致而言，说明书将代替任何此 类材料。

最后，应当理解，本文公开的本发明的实施方案是对本发明原理 的示例。可以采用的其它修改在本发明的范围内。因此，作为示例而 非限制，根据本文的教导可以利用本发明的替代配置。因此，本发明 不限于正如所示和所描述的那样。

附图说明

图1：在不同AML细胞系上表达的PVR、PVRL2和半乳糖凝 集素-9蛋白，相对于来自健康供体的PBMC。通过FACS确定蛋白 质表达。所有检查的AML细胞系均为PVR和PVRL2蛋白表达约100％阳性。相比之下，分别仅有52％和40％的来自健康供体的PBMC 表达PVR和PVRL2。PVR和PVRL2的蛋白质密度(由MFI假定)非 常高，相比之下PBMC的密度非常低。半乳糖凝集素-9蛋白的表达 和密度很低，相当于来自健康供体的PBMC。左柱显示PVR表达， 中柱显示PVRL2表达，右柱显示半乳糖凝集素-9表达。

图2：AML患者的原代母细胞的PVR和PVRL2蛋白表达。已 分离初发性(de novo)AML患者的MNC，并且分别对CD33和PVR 或PVRL2进行同时染色。此处描述了CD33群体内PVR或PVRL2 阳性细胞的百分比份额。左柱显示PVRL2表达，右柱显示PVR表达。

图3：使用针对PVR和PVRL2的封闭性抗体与AMG330组合 对PBMC来源的细胞毒性进行测量的体外测定。

图4：PVR封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系MV441)中增强 杀死作用。PVR封闭性抗体D171在24h后以剂量依赖性方式显著增 强细胞杀死作用。下图显示实验1，上图显示实验2。

图5：PVR的封闭导致MV4-11细胞的细胞裂解显著增加。 PVR-Ab具有相当于单独AMG330的效果。对于AMG330和PVR-Ab 的组合，可以观察到叠加效应。

图6：PVR封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系KG-1)中增强杀 死作用。PVR封闭性抗体D171在24h后以剂量依赖性方式显著增强 细胞杀死作用。下图显示实验1，上图显示实验2。

图7：PVR的封闭导致KG-1细胞的细胞裂解显著增加。PVR-Ab 具有相当于单独AMG330的效果。对于AMG330和PVR-Ab的组合， 可以观察到叠加效应。

图8：PVRL2封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系MV4-11)中增 强杀死作用。PVRL2抗体L-14在24h后显著增强细胞杀死。下图显 示实验2，上图显示实验1。

图9：PVRL2的封闭导致MV4-11细胞的细胞裂解显著增加。 对于AMG330和PVRL2-Ab的组合，可以观察到叠加效应。

图10：PVRL2封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系Kasumi-1) 中增强杀死作用。PVRL2抗体L-14在24h后显著增强细胞杀死。下 图显示实验1，中图显示实验3，上图显示实验2。

图11：PVRL2的封闭导致Kasumi-1细胞的细胞裂解显著增加。 与仅用AMG330处理相比，PVRL2-Ab对细胞裂解产生类似的效果。 对于AMG330和PVRL2-Ab的组合，可以观察到叠加效应。

图12：PVRL2封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系UKE-1)中增 强杀死作用。PVRL2抗体L-14在24h后显著增强细胞杀死。下图显 示实验2，上图显示实验1。

图13：AMG330和PVRL2封闭性抗体的组合导致UKE-1中细 胞毒性显著增加。

图14：半乳糖凝集素-9的封闭导致MV4-11细胞的细胞裂解显 著增加。对于AMG330和9M1-3-Ab的组合，可以观察到叠加效应。

图15：半乳糖凝集素-9的封闭导致KG-1细胞的细胞裂解显著 增加。对于AMG330和9M1-3-Ab的组合，可以观察到叠加效应。

图16：PVR和PVRL2在AML细胞系和原代CD33⁺AML母细 胞上高度表达。PVR和PVRL2蛋白表达如阳性CD33⁺细胞的百分比 所示，并且中值荧光强度比例作为AML细胞系(n＝8；A、B)和来自 未经治疗的患者的CD33⁺AML母细胞(n＝17；C、D)上表达强度的量 度。黑色连接线表示中值。

图17：PVR和PVRL2的封闭增加了AML细胞系的裂解。在24h后测定HD-PBMC介导的AML细胞系MV4-11(A)、TF-1(B)、 Molm-13(C)、Kasumi-1(D)的裂解。结果表示为归一化至无封闭性抗 体的对照的死亡靶细胞的倍数变化(FC)的平均值±SD。对于统计分 析，进行Mann-Whitney U检验(#p≤0.05；*p≤0.001；n≥3)。

图18：通过另外施用PVR和PVRL2封闭性抗体，

抗体 构建体AMG 330的T细胞介导的裂解显著增强。在存在或不存在 针对PVR或PVRL2的封闭性抗体的情况下，将MV4-11(A)、TF-1 (B)、Molm-13(C)、Kasumi-1(D)细胞与HD-PBMC和AMG 330一起 温育。结果表示为归一化至无封闭性抗体的对照的死亡靶细胞的倍数 变化(FC)的平均值±SD。对于统计分析，进行Mann-Whitney U检验 (#p≤0.05；*p≤0.001；n≥3)。

图19：通过封闭PVR和PVRL2来增加细胞裂解是特异性的， 而不是通过ADCC介导的。A、B为了排除ADCC的贡献，对来自 相同健康供体的PBMC进行CD3+ T细胞的抗白血病效应的比较分 析，其中我们不通过细胞系MV4-11(A)和TF-1(B)另外施用AMG 330。结果表示为死亡靶细胞的平均值±SD(n＝2)。C、D在存在或不 存在AMG 330(n＝2，+2μg/mL，++10μg/mL，+++50μg/mL)的情况下， 将Kasumi-1细胞与递增剂量的靶向CD117的抗体一起温育。结果表 示为归一化至对照的死亡靶细胞的倍数变化(FC)的平均值±SD。E、F HD-PBMC上的Fcγ受体使用多克隆人IgG饱和，并且与未饱和的 HD-PBMC进行比较，两者都用作针对MV4-11细胞的效应细胞。结 果表示为死亡靶细胞的平均值±SD(n＝3)。

图20：PVR和PVRL2双敲除细胞在体外重现抗体效应，在体 内延长使用人T细胞重建的NSG小鼠的存活期。A通过使用 CRISPR/Cas9，产生具有PVR和PVRL2双敲除的MV4-11的多克隆 群体。在不存在或存在AMG 330的情况下，将MV4-11野生型或双 敲除细胞与HD-PBMC一起温育24小时。对于统计分析，进行 Mann-Whitney U检验(#p≤0.05；*p≤0.001，n＝3)。B使用MV4-11野 生型(WT)或PVR和PVRL2双敲除(KO)细胞移植免疫缺陷NSG小鼠 并使用人类T细胞重建。治疗包括每天腹膜内施用安慰剂(对于WT， n＝13；对于KO，n＝12)或15μg/kg AMG 330(对于WT，n＝12；对于 KO，n＝15)。进行对数秩检验：WT安慰剂对KO安慰剂，p＜0.001； WT AMG 330对KO AMG 330，p＜0.001；WT安慰剂对WT AMG 330， p＝0.003；KO安慰剂对KO AMG 330，p＝0.027。C CRISPR/Cas9产 生的敲除细胞的增殖能力。将MV4-11 PVR和PVRL2双敲除细胞的 生长速率与MV4-11野生型细胞的增殖能力进行比较。使用 Vi-Cell^TMXR自动细胞计数仪(Beckman Coulter)在第2天和第4天测 定细胞计数；n＝3。

图21：CRISPR/Cas9介导的PVR和PVRL2双敲除细胞的基因 组分析。为了在基因组水平上验证MV4-11细胞中CRISPR/Cas9介导 的PVR和PVRL2敲除，通过亚克隆和测序分析多个单细胞的对应基 因片段。分别提供PVR(A)和PVRL2(B)的三种不同敲除克隆的基因 组改变，包括对蛋白质序列的影响。顶部显示具有蓝色靶标位点和绿 色PAM序列的野生型序列。对于PVRL2，由于PVRL2指导RNA识 别反向平行DNA链，靶向区域和PAM序列处于反向互补方向。亚 克隆内的缺失以红色破折号表示，插入以红色表示。WT＝野生型， KO＝双敲除，PAM＝原间隔序列邻近基序，AA＝氨基酸。

详述

以下具体实施方式包括可以对理解陈述有用的信息。并非承认本 文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明 确或暗示引用的任何出版物是现有技术。

本发明至少部分基于出乎意料的发现，即针对CD112(连接蛋白 -2、PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的 免疫检查点抑制剂可以有效地用于治疗血源性癌症，特别是具有免疫 逃避机制的急性骨髓性白血病(AML)，从而在癌症治疗中提供新的、 非常有效的免疫治疗方法。就此而言，发明人发现，在使用各种白血 病细胞系的体外研究中，免疫检查点配体CD112和CD155及其受体 TIGIT、免疫检查点配体半乳糖凝集素-9及其受体TIM-3是非常合适 的治疗血源性癌症，特别是AML的靶标。CD112是CD155免疫检查点蛋白配体，其受体是TIGIT。半乳糖凝集素-9也是配体，TIM-3 是其受体。

本发明人发现免疫检查点配体PVR和PVRL2及其受体TIGIT似 乎对AML患者的总体存活率具有负面预后影响(数据未显示)。此外， 本发明人揭示了PVL、PVRL2或TIGIT的封闭导致显著杀死AML 细胞(图3-13)。因此，本发明人关注PVR、PVRL2和TIGIT作为血 源性癌症治疗，特别是AML治疗中的新靶标，并且提供了有效地抑 制PVR、PVRL2和/或TIGIT的免疫抑制信号的物质，从而通过T细 胞免疫功能的恢复和活化机制抑制癌症增殖。此外，在描述免疫检查 点配体半乳糖凝集素-9及其受体TIM-3对T细胞活性和肿瘤发展的 正面和负面预后影响的领域中存在相互矛盾的数据。尽管表达研究似 乎强调了半乳糖凝集素-9和TIM-3对癌症患者具有相当积极的预后 影响(数据未显示)，但是本发明人揭示了半乳糖凝集素-9和TIM-3的 封闭导致显著杀死AML细胞(参见图14和15)。因此，本发明还提供 有效地抑制半乳糖凝集素-9/TIM-3相互作用的免疫抑制信号，从而通 过T细胞的恢复和活化来抑制癌细胞增殖的物质。

如本发明人所示，所有检查的AML细胞系均为PVR和PVRL2 蛋白表达约100％阳性。相比之下，分别仅有52％和40％的来自健康 供体的PBMC表达PVR和PVRL2(图1)。此外，PVR和PVRL2的 蛋白质密度非常高，相比之下PBMC的密度非常低。另外，半乳糖 凝集素-9蛋白的表达和密度很低，相当于来自健康供体的PBMC。 AML患者的原代母细胞也显示出PVR和PVRL2蛋白表达。据此， 已分离初发性AML患者的MNC，并且分别对CD33和PVR或PVRL2 进行同时染色。此处可以找到CD33群体内PVR或PVRL2阳性细胞 的百分比份额(图2)。

如本文所公开，PVR和PVRL2与其受体TIGIT的相互作用以及 半乳糖凝集素-9与其受体TIM-3的相互作用充当免疫阻抑或甚至免 疫抑制信号，因此在AML中作为免疫逃逸机制发挥功能。根据上述 内容，预期本发明的针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9 和/或TIM-3的免疫检查点抑制剂应当抑制CD112和TIGIT、CD155 和TIGIT和/或半乳糖凝集素-9和TIM-3之间的相互作用或使其难以 进行，从而促进癌症特异性免疫应答。同样，预期本发明的针对CD155 的免疫检查点抑制剂抑制CD155和TIGIT之间的相互作用或使 CD155和TIGIT之间的相互作用更难以进行。还预期本发明的针对 TIGIT的免疫检查点抑制剂抑制TIGIT和CD112和/或CD155之间的 相互作用或使TIGIT和CD112和/或CD155之间的相互作用更难以进 行。此外，预期本发明的针对半乳糖凝集素-9的免疫检查点抑制剂抑 制半乳糖凝集素-9和TIM-3之间的相互作用或使半乳糖凝集素-9和 TIM-3之间的相互作用更难以进行。同样，预期本发明的针对TIM-3 的免疫检查点抑制剂抑制TIM-3和半乳糖凝集素-9之间的相互作用 或使TIM-3和半乳糖凝集素-9之间的相互作用更难以进行。

如本文所用，术语“抑制(inhibit/inhibiting)”是指本发明的抑制剂 封闭、部分封闭、干扰、降低、抑制、减少靶蛋白或使其失活的能力， 所述靶蛋白即免疫检查点配体CD112和CD155和/或其受体TIGIT、 免疫检查点配体半乳糖凝集素-9和/或其受体TIM-3。因此，本领域 的技术人员理解术语“抑制”可以涵盖所述配体或受体的全部和/或部 分活性丧失。所述配体或受体的活性可以通过与配体/受体蛋白的活 性位点结合的化合物，或通过其它方式，诸如使激活受抑制的第一蛋 白的第二蛋白失活来阻抑或抑制。例如，CD112和TIGIT、CD155 和TIGIT以及半乳糖凝集素-9和TIM-3之间的相互作用的全部和/或 部分抑制可以通过细胞裂解的显著增加，即血源性癌症靶细胞，特别 是AML靶细胞的细胞死亡率显著增加来表示。

本文所用的术语“血源性癌症”包括特别是白血病和淋巴瘤，如霍 奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。它还包括骨髓增生异常综合征(MDS) 和多发性骨髓瘤(MM)。

本专利申请的免疫检查点抑制剂除了用于治疗血源性癌症之外， 还可以用于治疗实体瘤，诸如口腔癌或胰腺癌(Thijssen等人(2015)， Biochim Biophys 1855，235-247)。

“急性骨髓性白血病”也称为急性髓细胞白血病、急性髓细胞性白 血病、急性粒细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病或仅称为 “AML”，通常是指急性形式的白血病，其典型特征是癌性、未成熟的 成髓细胞、红细胞或血小板产生过剩和/或积聚于骨髓中。“急性”意指 如果不治疗，则这种白血病可以迅速进展，并且可能在几个月内致命。 “骨髓性”是指这种白血病起始的细胞类型。大多数AML病例从可转 变为白细胞的细胞(除淋巴细胞之外)发展而来，但有不同的AML亚 型。AML从骨髓起始，但在大多数情况下，迅速进入血液。如本文 所用，术语“AML”包括急性、难治性和复发的AML。本文所用的术 语“难治性AML”意指AML对常规或标准AML治疗(诸如化学治疗和 /或造血干细胞移植(HSCT))的耐受性，即常规或标准AML治疗不能 最终治愈所有AML患者。本文所用的术语“复发的AML”表示患者在 缓解后恢复了AML疾病的体征和症状。例如，在使用化学治疗和/ 或HSCT的常规AML治疗之后，AML患者可缓解为无AML的体征 或症状，保持缓解期几年，但是会复发并且必须再次治疗AML。本 文所用的术语“AML”还包括AML的患者中的微小残留疾病(MRD)， 即在治疗期间或治疗之后患者处于缓解期间，患者中存在少量癌性骨 髓细胞残留。

当在本文中使用时，术语“免疫检查点抑制剂”是指适于作用于免 疫检查点蛋白CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3 的任何结合剂或化合物，从而抑制或阻抑CD112和TIGIT、CD155 和TIGIT和/或半乳糖凝集素-9和TIM-3之间相互作用的免疫抑制信 号。当在本文中使用时，术语“免疫抑制信号”是指本发明的免疫检查 点配体和受体之间的相互作用，从而减少所涉及的T细胞对所涉及的 肿瘤细胞的免疫活性并且允许肿瘤细胞逃避有机体的免疫防御机制。 本发明的抑制剂涉及CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/ 或TIM-3，因此抑制本发明的免疫检查点配体和受体之间的该免疫抑 制信号，从而允许T细胞攻击和消除所涉及的肿瘤细胞。因此，本发 明的抑制剂能够降低或抑制本发明的免疫检查点配体与其受体之间 的免疫抑制信号。因此，本发明的抑制剂通过激活对癌细胞的T细胞 应答而表现出“免疫增强”活性。具体地讲，本发明的具有免疫增强活 性的抑制剂能够降低或抑制CD112和TIGIT之间的免疫抑制信号的 强度。还设想本发明的具有免疫增强活性的抑制剂能够降低或抑制 CD155和TIGIT之间的免疫抑制信号的强度。还设想本发明的具有 免疫增强活性的抑制剂能够降低或抑制半乳糖凝集素-9和TIM-3之 间的免疫抑制信号的强度。

根据本发明，本发明的免疫检查点抑制剂与各自的免疫检查点靶 蛋白的结合调节所述靶蛋白的细胞内信号传导。因此，设想针对 CD112的抑制剂调节CD112的细胞内信号传导。同样，设想针对 CD155的抑制剂调节CD155的细胞内信号传导。同样，设想针对 TIGIT的抑制剂调节TIGIT的细胞内信号传导。同样，设想针对半乳 糖凝集素-9的抑制剂调节半乳糖凝集素-9的细胞内信号传导。同样， 设想针对TIM-3的抑制剂调节TIM-3的细胞内信号传导。当在本文 中使用时，术语“调节”或“调整”包括增加、减少或者以另外方式改变 本发明的免疫检查点蛋白(即CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素 -9和/或TIM-3)的细胞内信号。就此而言，与该免疫检查点蛋白偶联 的细胞内信号途径可被增强、阻止或完全阻止，从而改变包括细胞活 化、增殖和恶性生长的下游信号传导元件的水平、量和/或活性。

如本文所公开，本发明的针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖 凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂可用于治疗血源性癌症，特别是急性 骨髓性白血病(AML)。血源性癌症是在骨髓中起始的血细胞癌症，通 常包括白血病和淋巴瘤。就血源性癌症而言，骨髓开始产生异常细胞， 从而排挤正常血细胞。同样，本文公开的抑制剂特别适用于治疗任何 种类的以肿瘤细胞上CD112、CD155和/或半乳糖凝集素-9的表达增 加为特征的血源性癌症。具体地讲，本文公开的抑制剂特别适用于治 疗任何种类的以为特征的血源性癌症。因此，设想本发明的抑制剂还 可以用于治疗以肿瘤细胞上CD112、CD155和/或半乳糖凝集素-9的 表达增加为特征的其它血源性癌症，诸如慢性骨髓性白血病(CML)、 急性淋巴性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MS或骨髓发育不良) 和骨髓增殖性肿瘤(MPN)。还设想本发明的抑制剂可用于治疗以 CD112、CD155和/或半乳糖凝集素-9表达增加为特征的实体瘤。就 此而言，本文公开的抑制剂可用于在肿瘤细胞上表达的免疫检查点配 体CD112、CD155和/或半乳糖凝集素-9与其在T细胞上表达的免疫 检查点受体TIGIT和TIM-3之间相互作用，如在本文别处所述。

如本发明通过各种白血病细胞系的FACS分析和体外细胞毒性测 定试验所示，针对PVR和PVRL2的抗体非常适合于封闭这些免疫检 查点配体，从而显著增加AML细胞的细胞裂解(图3-13)。因此，本 发明的抑制剂为抗体构建体是优选的。在本公开的意义上，术语“抗 体构建体”表示能够(特异性)结合本发明的免疫检查点分子、与其相互 作用或识别其的基于抗体的“结合分子”或“结合剂”。抗体构建体可以 与AML癌症靶细胞上的表面分子或T细胞上的受体复合物结合/与其 相互作用。优选的结合分子是抗体。

术语“抗体”是指其中结构和/或功能是基于抗体(例如全长或完整 免疫球蛋白分子)的结构和/或功能的分子。根据本发明，用于治疗血 源性癌症，特别是AML的抗体是特异性地抑制本发明的免疫检查点 配体和免疫检查点受体之间的相互作用的抑制性抗体。就此而言，设 想本文公开的抗体特异性地抑制CD112和TIGIT之间的相互作用。 还设想本文公开的抗体特异性地抑制CD155和TIGIT之间的相互作 用。还设想本文公开的抗体特异性地抑制半乳糖凝集素-9和TIM-3 之间的相互作用。具体地讲，当本发明的抗体抑制本发明的免疫检查 点配体和免疫检查点受体之间的相互作用时，其抑制CD112/TIGIT、 CD55/TIGI和/或半乳糖凝集素-9/TIM-3之间的免疫抑制相互作用， 从而抑制配体-受体相互作用的信号。因此，本文公开的抗体自身结 合本发明的免疫检查点配体或受体，使得获得所述配体和受体之间的 免疫抑制信号即使不是不可能，也是难以实现。根据上述内容，可用于本发明的方法和用途的示例性抗体包括抗CD112抗体、抗CD112 抗体、抗TIGIT抗体、抗半乳糖凝集素-9抗体和抗TIM-3抗体。技 术人员知道许多不同的抑制性抗体可以根据本发明使用，从而抑制免 疫检查点配体和受体之间的相互作用，如本文别处所公开。

术语“抗体”的定义包括诸如单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、 人源化抗体和人抗体，以及抗体片段尤其是例如Fab片段的实施方 案。抗体片段或衍生物还包括F(ab′)₂、Fv、scFv片段或单域抗体诸如 域抗体或纳米抗体、单可变域抗体或仅包含一个可变域的免疫球蛋白 单可变域，所述可变域可以是独立于其它V区或域而特异性结合抗 原或表位的VHH、VH或VL；参见例如Harlow和Lane(1988)和 (1999)，同上；Kontermann和Dübel，Antibody Engineering，Springer， 第2版，2010和Little，Recombinant Antibodies forImmunotherapy， Cambridge University Press 2009。此类免疫球蛋白单可变域不仅涵盖分离的抗体单可变域多肽，而且还涵盖包含抗体单可变域多肽序列的 一个或多个单体的较大多肽。符合上述定义的单价抗体片段描述了与 本发明有关的结合域的实施方案。此类单价抗体片段结合至特定的抗 原，也可以称为“抗原结合域”、“抗原结合片段”或“抗体结合区”。

根据本文提供的此定义，术语抗体可以归入术语“抗体构建体”之 下。所述术语还包括双抗体或双亲和重定向(DART)抗体。还设想了(双 特异性)单链双抗体、串联双抗体(Tandab′s)、“微抗体”，其结构示例 如下：(VH-VL-CH3)₂、(scFv-CH3)₂或(scFv-CH3-scFv)₂、“Fc DART” 抗体和“IgG DART”抗体以及多抗体诸如三抗体。免疫球蛋白单可变 域不仅涵盖分离的抗体单可变域多肽，而且还涵盖包含抗体单可变域 多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。

各种程序是本领域已知的，并且可用于产生此类抗体构建体(抗 体和/或片段)。因此，(抗体)衍生物可以通过肽模拟物产生。此外， 所述用于产生单链抗体的技术(参见尤其是美国专利4,946,778， Kontermann和Dübel(2010)，同上以及Little(2009)，同上)可适于产 生对选择的多肽具有特异性的单链抗体。另外，转基因动物可以用于 表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。为了制备 单克隆抗体，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技 术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(

和Milstein Nature 256 (1975)，495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤 技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.(1985)，77-96)。BIAcore系统中使用的表面等离子共振可用 于提高噬菌体抗体结合靶多肽表位(诸如CD3ε)的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol. Methods 183(1995)，7-13)。还设想在本发明的语境中，术语“抗体”包 括抗体构建体，其可以如下文所述在宿主中表达，例如可以通过尤其 是病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。

此外，本文所用的术语“抗体”还涉及显示出与所述抗体具有相同 特异性的本文所述的抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的实例包括非 人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见例如Hawkins等人， J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30， 10832-10837(1991))以及具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260，Kontermann和Dübel(2010)，同上以及Little (2009)同上)。

当在本文中使用时，术语“抗原结合域”、“抗原结合片段”和“抗 体结合区”是指包含负责抗体和抗原之间的特异性结合的氨基酸的抗 体分子的一部分。抗体特异性识别和结合的抗原的一部分称为如上文 所述的“表位”。如上文所述，抗原结合域通常可以包含抗体轻链可变 区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，抗原结合域不一定包含这两者。 例如，Fd片段具有两个VH域，并且通常保留了完整抗原结合域的 一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具 有VL、VH、CL和CH1域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，具有在铰 链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和 CH1域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH域的Fv片段，(5) 具有VH域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(6) 分离的互补决定区(CDR)，以及(7)单链Fv(scFv)。虽然Fv片段的两 个域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成 接头将它们连接起来，使得它们可以形成单个蛋白链，其中VL和 VH区域对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Huston等人 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。使用本领域的技术 人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方 式评估片段的功能。

在使用(合成)接头的情况下，该接头优选地具有足以确保第一和 第二域中的每者可以彼此独立地保持其差异结合特异性的长度和序 列。最优选地并且如所附实施例中所记载，本发明的抗体构建体是“双 特异性单链抗体构建体”，更优选地双特异性单链Fv(scFv)。双特异 性单链分子是本领域已知的，并且如WO 99/54440，Mack，J.Immu nol.(1997)，158，3965-3970，Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025， Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997)，45，193-197，

Blood，(2000)，95，6，2098-2103，Brühl，Immunol.，(2001)，166，242 0-2426，Kipriyanov，J.Mol.Biol.，(1999)，293，41-56所述。靶向与 本发明有关的化合物的CD33的一个实例(它是双特异性单链分子)是 AMG330，它也用于所附实施例中。AMG330的序列最初描述于WO 2008/119567中。本文所述的抗体构建体中包含的所述可变域可通过 另外的接头序列连接。术语“肽接头”根据本发明定义了其中本发明的 抗体构建体的第一域和第二域的氨基酸序列彼此连接的氨基酸序列。 此类肽接头的基本技术特征是所述肽接头不包含任何聚合活性。肽接 头的优选氨基酸残基包括Gly、Ser和Thr，其特征在于长度在5和2 5个氨基酸残基之间。合适的肽接头是美国专利4,751,180和4,935,2 33或WO 88/09344中所述的那些肽接头。肽接头的优选实施方案的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄Ser(SEQ ID No： 9)或其聚合物，即(Gly₄Ser)x，其中x是1或更大的整数(例如2或3)。 该接头序列的变体也是优选的，其包括诸如(Gly-Gly-Gly-Gly)_x(SEQ ID No：10)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Gln)_x(SEQ ID No：11)、(Pro-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser)_x(SEQ ID No：12)、(Pro-Gly-Gly-Asp-Gly-Ser)_x(S EQ IDNo：13)和(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_x(SEQ ID No：14)的实 例。所述肽接头的特征(其包括不存在促进二级结构)是本领域已知的， 并且如Dall’Acqua等人(Biochem.(1998)37，9266-9273)、Cheadle等 人(Mol Immunol(1992)29，21-30)和Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)中所述。优选的肽接头也不促进任何二级结构。所述 域彼此的连接可以通过例如基因工程提供，如实施例中所述。制备融 合和可操作地连接的双特异性单链构建体以及在哺乳动物细胞或细 菌中表达它们的方法是本领域熟知的(例如WO 99/54440或Sambroo k等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Har borLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。

对于连接本发明的抗体构建体中的至少两个结合域的肽接头，优 选的是仅包含几个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基或更少的肽接 头。因此，12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头是 优选的。设想的具有小于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨 基酸，其中富含Gly的接头是优选的。在所述“肽接头”的语境中，特 别优选的“单个”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可以由单个氨基酸 Gly构成。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得 的抗体，即构成该群的单个抗体是相同的，不同的是可以少量存在可 能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗 体是针对单个抗原位点高度特异性的。此外，与通常包含针对不同决 定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗 体针对抗原上的单个决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优点在 于它们通过杂交瘤培养物合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单 克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不被解释为 需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤 方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号 4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人，Nature，352： 624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描 述的技术从噬菌体抗体文库分离。

术语“人抗体”包括具有基本上对应于本领域已知的人生殖系免 疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，包括例如Kabat等人(参见 Kabat等人(1991)同上)所述的那些。本发明的人抗体可以包括不由人 生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点 诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR特别是CDR3 中。人抗体可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被 不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基置换的位置。需要强 调的是，如本文所使用的人抗体的定义还设想了完全人抗体，其仅包 括非人工和/或遗传改变的抗体的人序列，如可以通过使用系统(诸如Xenomice)的技术衍生的那些。

“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的” 抗体(参见例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和 Lowman等人，Biochemistry 30，10832-10837(1991))和具有改变的效 应子功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260，Kontermann和 Dübel(2010)，同上和Little(2009)，同上)。如本文所用，“体外产生 的抗体”是指其中全部或部分可变区(例如，至少一个CDR)在非免疫 细胞选择(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选 序列结合抗原的能力的任何其它方法)中产生的抗体。因此该术语优 选地排除在免疫细胞中通过基因组重排产生的序列。VH和VL配对 在一起形成单个抗原结合位点。最靠近VH的CH域称为CH1。每条 L链通过一个共价二硫键连接至H链，而两条H链根据H链同种型 通过一个或多个二硫键彼此连接。VH和VL域由称为框架区(FR1、 FR2、FR3和FR4)的相对保守序列的四个区构成，其形成高变区序列 (互补决定区，CDR)的三个区域的支架。CDR含有大部分负责抗体与 抗原的特异性相互作用的残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。 因此，重链上的CDR成分称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR成 分称为L1、L2和L3。

术语“可变”是指免疫球蛋白域在其序列中表现出可变性并且涉 及确定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即，“可变域”)。变异 性不是均匀分布在整个抗体的可变域中；它集中在每个重链和轻链可 变区的子域中。这些子域称为“高变”区或“互补决定区”(CDR)。可变 域的更保守的(即，非高变的)部分称为“框架”区(FRM)。天然存在的 重链和轻链的可变域各自包含四个FRM区，大部分采用β-折叠构型， 通过三个高变区连接，这三个高变区形成环连接，并且在一些情况下 形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FRM紧密保持在 一起，并且另一条链的高变区有助于形成抗原结合位点(参见Kabat 等人，同上)。恒定域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功 能，诸如例如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。

术语“CDR”及其复数是指其中三个构成轻链可变区(CDRL1、 CDRL2和CDRL3)的结合特征，三个构成重链可变区(CDRH1、 CDRH2和CDRH3)的结合特征的互补决定区(CDR)。CDR有助于抗 体分子的功能活性，并且被包含支架或框架区的氨基酸序列分开。准 确定义的CDR边界和长度受到不同分类和编号系统的限制。因此， CDR可与Kabat、Chothia、contact或任何其它边界定义(包括本文所 述的编号系统)相关。尽管有不同的边界，但是这些系统中的每个在 构成可变序列内所谓的“高变区”方面具有某种程度的重叠。因此，根 据这些系统的CDR定义可以在相对于邻近框架区的长度和边界区域 方面有所不同。参见例如Kabat、Chothia和/或MacCallum(Kabat等 人，同上；Chothia等人，J.Mol.Biol，1987，196：901；和MacCallum 等人，J.MoI.Biol，1996，262：732)。然而，根据所谓的Kabat系统 的编号是优选的。轻链的CDR3，特别是重链的CDR3可构成轻链和 重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体构建体中，重 链CDR3似乎构成抗原和抗体之间的主要接触区域。其中CDR3单独 改变的体外选择方案可用于改变抗体的结合性质或确定哪些残基有 助于抗原的结合。

在一些实施方案中，本文所述的结合分子是分离的蛋白质或基本 上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质不伴随有通常其天然状态下相关的至 少一些材料，例如构成给定样品中总蛋白的至少约5重量％或至少约 50重量％。可以理解的是，根据情况，分离的蛋白质可构成总蛋白含 量的5至99.9重量％。例如，蛋白质可以通过使用诱导型启动子或高 表达启动子以显著更高的浓度制备，使得蛋白质以增加的浓度水平制 备。该定义包括在本领域已知的许多生物体和/或宿主细胞中产生抗 原结合蛋白。

如本文所公开，本发明的实验结果特别示出了针对免疫检查点 CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和TIM-3的抗体的抑制效 果。然而，任何其它能够抑制CD112和TIGIT、CD155和TIGIT和/ 或半乳糖凝集素-9和TIM-3之间的免疫抑制信号的物质也具有类似 的效果。具有此类效果的物质包括例如可溶性CD112、可溶性CD155、 可溶性TIGIT、可溶性半乳糖凝集素-9、可溶性TIM-3、C112拮抗剂、 CD155拮抗剂、TIGIT拮抗剂、半乳糖凝集素-9拮抗剂、TIM-3拮抗 剂、抑制CD112和TIGIT、CD155和TIGIT和/或半乳糖凝集素-9和TIM-3之间的相互作用的物质、CD112产生抑制剂、CD155产生抑制 剂、TIGIT产生抑制剂、TIGIT产生抑制剂、TIM-3产生抑制剂和通 过TIGIT或TIM-3发挥作用的细胞内抑制信号抑制剂。

因此，本发明的CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/ 或TIM-3抑制剂包含蛋白质或非蛋白质化合物或药剂。就此而言，结 合至CD112、CD15、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的蛋白质 和多肽或衍生物包括D112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9或TIM-3 的每个部分蛋白质，其中CD112和TIGIT、CD155和TIGIT和/或半 乳糖凝集素-9和TIM-3之间的免疫抑制信号未诱导。对于诱导TIGIT 或TIM-3的免疫抑制信号，TIGIT或TIM-3存在于免疫检查点受体 附近是必不可少的，出于该目的它通过在肿瘤或癌细胞中与CD112、 CD155(TIGIT)或半乳糖凝集素-9(TIM-3)相互作用而受到抑制。因 此，可溶性CD112、CD155或半乳糖凝集素-9具有仅为胞外域并且 与TIGIT或TIM-3相互作用的部分，可以抑制CD112、CD155或半 乳糖凝集素-9的免疫抑制信号。在另一个方面，可溶性TIGIT或TIM-3 具有类似的结构并且可以与CD122、CD155或半乳糖凝集素-9相互 作用的部分，可以抑制免疫抑制信号。这些可溶性蛋白质只需要包括 必须和足以结合CD122、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9或TIM-3 的胞外区，并且可以通过熟知的表达和精制技术来制备。

如果CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9或TIM-3的相互 作用抑制剂是蛋白质或多肽，并且相互作用的必要区域仅由多肽组 成，并且相互作用的必要区域仅由连续多肽组成，则此类多肽片段可 以成为相互拮抗剂。另外，具有更强活性的拮抗剂可以从其中该多肽 片段是经化学修饰的分子组鉴定，或根据多肽片段的空间结构通过计 算机设计。另外，最好的拮抗剂可以从分子组更有效地选择，所述分 子组根据相互作用区域的蛋白质立体分析数据通过计算机设计。

还设想用于治疗血源性癌症特别是本文公开的AML的抑制剂是 小分子抑制剂。术语“小分子”意指具有低分子量，通常小于1000Da 的分子。本文所用的此类小分子是指具有低分子量的有益剂，其通常 通过有机化学合成，但也可以从天然来源诸如植物、真菌和微生物分 离。当用于治疗本发明范围内的血源性癌症时，此类小分子也称为小 分子药物。递送小分子药物的常见途径是口服、注射、肺部和经皮给 药。

还设想本发明的针对CD112的抑制剂减少CD112的表达。同样， 本发明的针对CD155的抑制剂减少CD155的表达。同样，本发明的 针对TIGIT的抑制剂减少TIGIT的表达。同样，本发明的针对半乳 糖凝集素-9的抑制剂减少半乳糖凝集素-9的表达。同样，本发明的针 对TIM-3的抑制剂减少TIM-3的表达。因此，本文还公开了使用核 酸序列(例如治疗性核酸分子，例如反义寡核苷酸，编码其的DNA或 产生其的载体)制备适合于减少靶基因(例如编码CD112、CD155、TI GIT、半乳糖凝集素-9和TIM-3的基因)表达的反义分子的用途。当在本文中使用时，术语“减少表达”是指本发明的抑制剂以特异性和转 录后方式减少或封闭靶基因(即编码CD112、CD155、TIGIT、半乳糖 凝集素-9和TIM-3的基因)的表达的能力。就此而言，本发明涉及能 够减少癌细胞中CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TI M-3表达的核苷酸。所述核苷酸可以通过靶向mRNA的序列，以及 通过与靶mRNA具有至少50％序列同一性，或至少70％序列同一性， 或至少80％序列同一性，或至少90％序列同一性来表征。对此目的特 别有用的是可以用于制备基于核苷酸的抑制剂的RNA序列。具有～2 个核苷酸的3′突出(的21-23个核苷酸的RNA双链称为小干扰RNA 或siRNA)已显示出在哺乳动物细胞中通过转录后基因沉默(PTGS)机 制(称为RNA干扰(RNAi))介导基因表达的序列特异性抑制。因此， 通过致病基因的体内沉默，RNAi被认为是最有希望的新治疗策略之 一。因此，在本发明的优选实施方案中，能够减少CD112、CD155、 TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3表达的核苷酸是RNAi(iRNA)。 本领域的技术人员知道几种合成RNAi以及将这些构建体体内递送至 肿瘤细胞的技术，从而使用例如如例如Santel等人，2006，Gene Therapy13，1360-1370中描述的脂质体制剂。就此而言，双链RNA首 先使用与所关注的基因互补的序列合成，并引入细胞或生物体，其在 该处被识别为外源性遗传物质并激活RNAi途径。由于RNAi不能完 全消除基因的表达，所以该技术有时称为“基因敲低”，以区别于其中基因的表达完全消除的“http：//en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout”程 序。

因此，还设想减少CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/ 或TIM-3表达的本发明的抑制剂敲除CD112、CD155、TIGIT、半乳 糖凝集素-9和/或TIM-3。当在本文中使用时，术语“敲除”是指与野生 型动物相比，完全减少内源性基因(编码单个细胞、选择的细胞或哺乳动物的全部细胞的CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/ 或TIM-3)编码的多肽的至少一部分的表达。哺乳动物可以是“杂合敲 除”，其中内源性基因的一个等位基因已破坏。或者，哺乳动物可以 是“纯合敲除”，其中内源性基因的两个等位基因已破坏。还设想编码CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的超过一个基 因，优选地两个基因被“敲除”。在这种情况下，哺乳动物是“双敲除” 哺乳动物。根据本发明，本发明人示出了当使用CRISPR/Cas9技术 时，PVR和PVRL2可以在AML细胞系中特异性地单敲除或双敲除。 因此，本发明还涉及敲除CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9 和/或TIM-3的针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或 TIM-3抑制剂的抑制剂，其中所述敲除通过CRISPR/cas9技术实现。 然而，本领域的技术人员知道适用于敲除血源性癌细胞特别是AML 细胞中的免疫检查点的各种不同技术。因此，本发明范围内的敲除技 术包括改变基因序列从而产生失活基因的任何技术，或其中在发育期 间的选择时间可以使表达失活从而导致基因的功能丧失的技术。

本发明的免疫检查点抑制剂还可以包含嵌合抗原受体(CAR)T 细胞。CAR T细胞表现出工程化受体(嵌合抗原受体)，它将单克隆抗 体的特异性移植到T细胞，并且转移逆转录病毒载体促进的编码序 列。这些CAR允许T细胞识别肿瘤细胞上的特定蛋白质(抗原)。根据本发明，CAR T细胞优选地表现出CAR，其允许T细胞识别血源 性癌细胞上的特定蛋白质。优选地，本发明的CAR T细胞能够识别 血源性癌细胞(特别是AML细胞)表面上的CD33。就此而言，加入涉 及在血源性癌细胞上表达的特异性表面分子(诸如CD33)的CAR T细 胞可以增强针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3 的抑制剂的细胞毒性效应。因此，设想本发明的针对CD112、CD155、 TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂包含CART细胞。所 述CAR T细胞优选地包含靶向在血源性癌细胞特别是AML细胞上表 达的表面分子的结合域。所述表面分子优选地是CD33、CD19或Flt3。 因此，本发明的抑制剂可以包含具有靶向CD33的结合域的CAR T 细胞。本发明的抑制剂还可以包含具有靶向CD19的结合域的CAR T 细胞。本发明的抑制剂也可以包含具有靶向Flt3的结合域的CAR T 细胞。本领域的技术人员知道产生所谓的第一代、第二代和第三代 CAR T细胞的多种技术涉及所述表面分子。

在一些实施方案中，如本文别处所述的免疫检查点抑制剂还可以 包含接合T细胞的抗体构建体。此类接合T细胞的抗体构建体优选 地是双特异性T细胞接合体(BiTE抗体构建体)，即结合至T细胞抗 原和肿瘤抗原的双特异性抗体。BiTE抗体构建体已显示出诱导靶肿 瘤细胞的定向裂解，因此也为癌症和其它病症的治疗提供了巨大潜 力。一种可能的方法是双特异性T细胞接合抗体构建体AMG330， 其对CD3和唾液酸结合凝集素CD33具有双重特异性，且经常在AML 母细胞和白血病干细胞的表面上表达。AMG330被开发用于治疗急性骨髓性白血病(AML)，并且不久将在I期研究中进行评估(Friedrich等 人，2014，AmericanAssociation for Cancer Research，1549-1557)。

根据本发明的双特异性T细胞接合体可以具有不同的抗体构建 体形式，此类形式包括例如di-scFv或bi(s)-scFv、(scFv)₂-Fc、scFv- 拉链、(scFab)₂、Fab₂、Fab₃、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tan dab′s)、串联di-scFv、串联tri-scFv、“微抗体”(其结构示例如下：(VH- VL-CH3)₂、(scFv-CH3)₂、((scFv)₂-CH3+CH3)、((scFv)₂-CH3)或(sc Fv-CH3-scFv)₂)、多抗体诸如三抗体或四抗体以及双特异性单域抗体 诸如纳米抗体或双特异性单可变域抗体(其在一个或两个结合域中仅 包含一个可变域，所述可变域可以是独立于其它V区或域而特异性 结合抗原或表位的VHH、VH或VL)。T细胞接合分子/双特异性抗体 内的结合域通常可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(V H)；但是，结合域不一定包含这两者。例如，Fd片段具有两个VH 域，并且通常保留了完整抗原结合域的一些抗原结合功能。抗体片段、 抗体变体或结合域的形式的另外实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、 CL和CH1域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，具有在铰链区通过二硫 桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1域的Fd 片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH域的Fv片段，(5)具有VH域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补 决定区(CDR)，以及(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，来源于 scFV文库)。根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例例如在WO 0 0/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/03 02037、W O2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272中有 所描述。

就此而言，本发明人在体外杀死测定中研究了另外在存在 AMG330的情况下PVR和PVRL2封闭的治疗效果(图3-13)。从而出 乎意料地发现AMG330可显著增强PVR和/或PVRL2封闭性抗体的 细胞毒性。因此，设想本发明的针对CD112、CD155、TIGIT、半乳 糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂还可包含能够接合T细胞的抗体构 建体。所述抗体构建体优选地包含CD3结合域和靶向在血源性癌细 胞特别是AML细胞上表达的表面分子的另外结合域。所述表面分子 选自由CD33、CD19和Flt3组成的组。根据上述内容，本发明提供 了用于治疗血源性癌症(特别是AML)的方法的针对CD112、CD155、 半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑制剂，所述抑制剂包括具有 CD3结合域和CD33结合域的抗体构建体。本发明还提供了用于治疗 血源性癌症(特别是AML)的方法的针对CD112、CD155、半乳糖凝集 素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑制剂，所述抑制剂包括具有CD3结合 域和CD19结合域的抗体构建体。本发明还提供了用于治疗血源性癌 症(特别是AML)的方法的针对CD112、CD155、半乳糖凝集素-9、TIM-3和/或TIGIT的抑制剂，所述抑制剂包括具有CD3结合域和Flt3 结合域的抗体构建体。所述抗体构建体优选地是能够结合CD3ε的结 合分子。

因此，设想本文所述的CD33、CD19或Flt3靶向抗体构建体， 除了其结合血源性癌症靶细胞上的细胞表面分子CD33、CD19或Flt3 和T细胞的细胞表面上的CD3的功能之外，还具有另外的功能。在 该形式中，化合物是多功能化合物，通过结合癌症靶细胞表面上的CD33、CD19或Flt3来靶向细胞，通过CD3结合来介导细胞毒性T 细胞活性并提供另外的功能，诸如完全功能的Fc恒定域通过募集效 应细胞如NK细胞来介导抗体依赖性细胞毒性，半衰期延长域诸如白 蛋白结合域或修饰的Fc恒定域缺乏抗体依赖性细胞毒性，但增加了 化合物的分子量，标记(荧光等)、治疗剂诸如例如毒素或放射性核素 的介导作用和/或增加血清半衰期的手段等。靶向血源性癌症靶细胞 表面上的CD33、CD19或Flt3和T细胞的细胞表面上的CD3的双特 异性抗体构建体的实例为例如SEQ ID No：15至37所示的分子。

术语“(能够)结合至”、“特异性地识别”、“针对”和“与...反应”意指 根据本发明结合域能够与表位的一个或多个，优选地至少两个，更优 选地至少三个以及最优选地至少四个氨基酸特异性地相互作用。如本 文所用，术语“特异性地相互作用”、“特异性地结合”或“特异性结合” 意指结合域对特定蛋白质或抗原表现出明显的亲和力，并且通常不表 现出对除CD33、CD19、Flt3或CD3之外的蛋白质或抗原的显著反 应性。“明显的亲和力”包括约10^-6M(KD)或更强的结合亲和力。优选 地，当结合亲和力为约10^-12至10^-8M、10^-12至10^-9M、10^-12至10^-10M、 10^-11至10^-8M，优选地约10^-11至10^-9M时，结合被认为是特异性的。 结合域是否特异性地与靶标反应或结合可以容易地通过尤其是将所 述结合域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合域与除CD33、CD19、Flt3 或CD3之外的蛋白质或抗原的反应比较来测试。优选地，本发明的 结合域不实质上结合或不能够结合除CD33、CD19、Flt3或CD3以 外的蛋白质或抗原(即第一结合域不能够结合除CD33、CD19或Flt3 之外的蛋白质，并且第二结合域不能够结合除CD3之外的蛋白质)。 术语“不实质上结合”或“不能结合”意指本发明的结合域不结合除 CD33、CD19、Flt3或CD3之外的另一种蛋白质或抗原，即显示出与 除CD33、CD19、Flt3或CD3之外的蛋白质或抗原的反应性不超过 30％，优选地不超过20％，更优选地不超过10％，特别优选地不超过 9％、8％、7％、6％或5％，由此分别与CD33、CD19、Flt3或CD3 的结合设定为100％。本文所述的CD33、CD19或FLT3靶向化合物 还可以包含另外的域，其例如有助于分离该分子或涉及该分子的改适 的药代动力学特征。

本文所述的结合CD33、CD19或FLT3和CD3的靶向化合物可 以在细菌中产生。在表达后，靶向化合物优选地抗体构建体从可溶性 级分中的大肠杆菌(E.coli)细胞浆分离，并且可通过例如亲和层析和/ 或分子大小排阻来纯化。最终纯化可以类似于例如在CHO细胞中表 达的抗体的纯化过程来进行。除原核生物之外，真核微生物诸如丝状 真菌或酵母是本文所述的CD33、CD19或FLT3靶向化合物的合适克 隆或表达宿主。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥 和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。用于在植物细胞培养物中 产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域的技术人员已知的。参见例如 Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78，Owen等人(1992)Bio/Technology 10：790-794，Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750和Fecker 等人(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。

可以直接筛选本文所述的抑制CD112和TIGIT、CD155和TIGIT 和/或半乳糖凝集素-9和TIM-3的相互作用的物质。此类物质可以例 如从蛋白质、多肽、肽、多核苷酸或多核苷、非肽化合物、有机合成 化合物或天然产物(例如发酵产物、细胞提取物、植物提取物和动物 组织提取物)的文库鉴定。因此，本文还公开了筛选针对CD112、 CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂的方法，该抑 制剂用于治疗血源性癌症特别是AML的方法。所述筛选方法可以通 过测定血源性癌细胞特别是AML细胞的细胞功能的方法来执行。就此而言，表面上表达CD112、CD155或半乳糖凝集素-9的细胞可用 于筛选方法。此类细胞包括白细胞、单核细胞、巨噬细胞或抗原呈递 细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、癌细胞或其细胞系。

本文还公开了本发明的抑制剂，其包含免疫刺激剂。如本文所用， 术语“免疫刺激剂”是指另外刺激本发明的抑制剂的免疫增强效应，从 而增强所涉及的T细胞针对所涉及的肿瘤细胞的细胞毒性活性的任 何佐剂。有相当多的证据表明，癌症患者具有能够攻击其肿瘤细胞的 T细胞，并且癌症的出现是免疫监视：一旦出现癌细胞，患者的自身 免疫系统即将其破坏的能力的失效。免疫刺激剂是调节人体免疫防御 的非特异性药剂。就此而言，已描述一些成功的实例：将类似于佐剂 的药剂直接注入肿瘤、左旋咪唑、白介素-2(IL-2)、T细胞的强效生 长因子、白介素-15(IL-15)或α-干扰素(IFN-α)的口服治疗等等。

如本文所述，针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/ 或TIM-3的抑制剂可以非常适用于治疗血源性癌症特别是AML的方 法。因此，本发明在本文中还公开了用于治疗患有血源性癌症特别是 AML的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂施用于有此需 要的受试者。

本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”意指减少、稳定或 抑制血源性癌症特别是AML的进展。那些需要治疗的人包括那些已 患有所述疾病的人。优选地，治疗减少或抑制血源性癌细胞的增殖活 性，从而导致所述癌细胞的裂解增强。“治疗”是指治疗性处理，其中 目标是减缓(减轻)或至少部分缓解或消除生物体的病理状况。那些需 要治疗的人包括那些已患有该疾病的人，以及那些怀疑患有该疾病的 人。术语“施用”涉及将化合物掺入生物体的细胞或组织的方法。

用于治疗患有本发明所述的血源性癌症，特别是AML的受试者 的化合物通常以治疗有效量施用于受试者。所述治疗有效量足以抑制 或缓解血源性癌症特别是AML的症状。“治疗效果”或“治疗有效”意 指所用的化合物将引起研究人员、兽医、医生或其它临床医生所寻求 的组织、系统、动物或人的生物或医学响应。术语“治疗有效”还指对 导致或促成疾病的因素的抑制。术语“治疗有效量”包括当施用时化合 物的量足以显著改善正在治疗的疾病的进展。治疗有效量将根据化合 物、疾病及其严重程度以及受试者的个体因素等等而变化。因此，本 发明的化合物将不会在所有情况下被证明是治疗有效的，因为本文公 开的方法不能提供100％安全的预测，无论受试者是否对所述化合物 产生响应，因为还涉及个体因素。预期年龄、体重、一般健康状况、 性别、饮食、药物相互作用等等可以对用于治疗患有血源性癌症特别 是AML的受试者的化合物是否为治疗有效的具有一般影响。优选地， 用于治疗患有血源性癌症特别是AML的受试者的化合物的治疗有效 量在约0.01mg/kg体重和约1g/kg体重之间，诸如约0.02、0.03、0.04、 0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、 500、600、700、800或约900mg/kg体重。甚至更优选地，用于治疗 患有血源性癌症特别是AML的受试者的化合物的治疗有效量在约 0.01mg/kg体重和约100mg/kg体重之间，诸如约0.1mg/kg体重和约10mg/kg体重之间。化合物的治疗有效量将根据待治疗患者的种类关 于其中含有的活性化合物的重量而变化。

本文所用的术语“受试者”也称为个体，是指哺乳动物。哺乳动物 可以是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴、马或人中的任一者。因 此，本发明的哺乳动物可以是人或非人哺乳动物。因此，本文档所述 的方法、用途和组合物通常适用于人和非人哺乳动物二者。当受试者 是可以接受本文所述的疾病治疗的人时，其也被称为“患者”。本文公 开的“患者”也比照适用于一组患者。

用于治疗患有根据本发明的血源性癌症特别是AML的受试者的 抑制剂的施用可以通过本领域已知的任何方法进行。在一些实施方案 中，施用通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、通过 鼻内滴注、通过移植、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶 内、经皮或通过施用至粘膜或它们的组合等等进行。

在本发明的范围内，例如设想使用本领域可用的技术，例如使用 白细胞(WBC或白血球)计数和分类，通过评估患者中血源性癌细胞 的数量来检测所用抑制剂的治疗效果。白细胞可以在血细胞计数器 (Neubauer chamber)中手动计数或使用自动计数器计数。为了确定差 别，可以将一滴血在载玻片上涂成薄层，空气干燥，并且用 Romanofsky染色剂染色(最常见的是Wright或 May-Grunewald-Giemsa技术)。然后如Blumenreich MSThe WhiteBlood Cell and Differential Count.载于：Walker HK、Hall WD、Hurst JW 编ClinicalMethods：The History，Physicals，and Laboratory Examinations.第3版Boston：Butterworths；1990.第153章所述使用形 态学检查和/或组织化学对细胞进行计数和分类。或者，从血样分离 白细胞，使用针对白细胞表面标记物的荧光标记抗体染色，随后通过流式细胞术分析以计算每个白细胞亚群的绝对细胞数。另外或替代 地，还可以评估各个患者的整体外观，这也将帮助熟练从业者评估该 治疗是否有效。本领域的技术人员知道许多其它方式，它们将允许从 业者观察在本发明的方法或用途的语境中用于治疗本文公开的血源 性癌症特别是AML的化合物的治疗效果。

尽管可以直接施用本发明的抑制剂而不需要任何配制，但是在本 发明的另一个方面，化合物优选地以药物或兽用制剂组合物的形式利 用，所述组合物包含药学上或兽医上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂 以及本发明的化合物，优选地本发明的免疫球蛋白。与本发明的化合 物组合使用的载剂是水基的并且形成水溶液。含有本发明的化合物的 油基载剂溶液是载剂水溶液的替代物。水基或油基溶液还含有增稠剂 以使组合物具有搽剂、乳膏、软膏、凝胶等等的粘度。合适的增稠剂 是本领域的技术人员熟知的。本发明的替代实施方案也可以使用含有 该化合物的固体载剂治疗本文别处公开的S100A12：TLR4/MD2/CD14介导的炎性病症。这使得替代实施方案能够通过棒状施涂器、贴剂或 栓剂应用。固体载剂还含有增稠剂以使组合物具有蜡或石蜡的稠度。

还想到将另外的AML治疗与本发明的抑制剂组合用于治疗患有 血源性癌症特别是AML的受试者。另外的AML治疗通常可以预先、 同时和/或随后应用于本发明的用途和方法。

造血干细胞移植(HSCT)是常见的AML治疗。该术语通常是指通 常来源于骨髓或血液的造血干细胞的移植，并且包括自体(即，干细 胞来源于患者)和同种异体(即，干细胞来源于供体)HSCT。对于AML 治疗，同种异体HSCT通常是优选的。还设想本发明的用途和方法可 以在HSCT之前或之后或它们两者或在两次HSCT治疗之间应用。

根据本发明的方法治疗的患者(或患者组)也可以接受化学治疗处 理。在本发明的语境中，“化学治疗处理”是指使用抗肿瘤剂或超过一 种这些药剂的组合进行标准化治疗方案的治疗。在本发明的语境中， 术语“化学治疗处理”包括任何抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂包括小有机分 子、肽、寡核苷酸等等。包括在化学治疗定义中的药剂为但不限于烷 化剂，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环 磷酰胺、白消安、N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛 莫司汀(CCNU)、司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀、链脲佐菌素、达 卡巴仁、米托唑胺、替莫唑胺、噻替哌、丝裂霉素、地吖醌(AZQ)、 顺铂、卡铂、奥沙利铂、甲基苄肼和六甲蜜胺；抗代谢物，例如甲氨 蝶呤、培美曲塞、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西 他滨、维达扎、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、克罗拉滨、喷司他丁、硫鸟嘌呤、巯嘌呤；微管抑制剂，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、 长春地辛、长春氟宁、紫杉醇、多西他赛、鬼臼毒素；拓扑异构酶抑 制剂，例如伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、阿霉素、米托蒽醌、替 尼泊苷、新生霉素、莫巴酮(merbarone)、阿柔比星；细胞毒素抗生素， 例如放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、阿霉素、柔红霉素、 表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌等等。然而， 本领域的普通技术人员将会理解，本发明不限于这些化学治疗剂，也 可以涉及使用其它DNA损伤剂。根据本发明的所述组合可以作为组 合制剂或彼此单独施用。

另外的AML治疗还包括放射治疗。还设想了CNS治疗或预防， 以防止恶性细胞在CNS中扩散，例如通过脑和脊髓的鞘内化学治疗 和/或放射治疗。

由于本发明人推测本文公开的抑制剂的治疗成功可以(部分)基于 所述抑制剂的免疫增强活性，其通过抑制本文所述的免疫检查点，从 而产生增强的T细胞抗癌活性，因此还设想了T细胞活化和/或增殖 的诱导剂和增强剂、CAR T细胞、供体T细胞、抗细胞毒性T淋巴 细胞相关抗原-4(CTLA-4)抗体等等。

根据另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文别处所 述的针对CD112(连接蛋白-2、PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝集 素-9、TIM-3和/或TIGIT的免疫检查点抑制剂和本文别处所述的CAR T细胞。在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文别处 所述的针对CD112(连接蛋白-2、PVRL2)、CD155(PVR)、半乳糖凝 集素-9、TIM-3和/或TIGIT的免疫检查点抑制剂和本文别处所述的能 够接合T细胞的抗体构建体。

所述药物组合物可以包含治疗有效量的本文所述的一种或多种 免疫检查点抑制剂、CAR T细胞和/或抗体构建体以及药学上有效的 稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。本文所述的药 物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。优选地，制剂材料 在所利用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。

如本文所用，术语“药物组合物”涉及施用于患者优选地人患者的 组合物。优选地，药物组合物包含合适的载剂、稳定剂和/或赋形剂 的制剂。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含肠胃外、经皮、 腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的组合物。 特别设想所述组合物通过输注或注射施用于患者。合适的组合物的施 用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、 局部或真皮内施用。具体地讲，本发明提供了合适组合物的不间断施 用。作为非限制性实例，不间断(即连续)施用可以通过患者佩戴的小 泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583 所述。

本发明的组合物还可以包含药学上可接受的载剂。合适的药物载 剂的实例在本领域中是熟知的，并且包括溶液，例如磷酸盐缓冲盐溶 液、水、乳液诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质 体等。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法配制。制剂可以包 含碳水化合物、缓冲溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可 以是非还原糖，优选地海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨糖醇或木糖醇。 通常，如本文所用，“药学上可接受的载剂”意指与药物施用相容的任 何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸 收延迟剂。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是熟知 的。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所利用的剂量和浓度下对接受 者是无毒的，并且包括：另外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂， 包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂诸如EDTA；金属复合物(例如Zn- 蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物，诸如聚酯；成盐抗衡离子， 诸如钠、多元糖醇；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯 丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨糖 醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、 半乳糖、乳糖醇、核糖醇、中肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、 环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛 酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；小分子量 蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白； 以及亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮。此类制剂可以用于连续施用， 其可以是使用和/或不使用泵系统的静脉内或皮下施用。氨基酸可以 是带电氨基酸，优选地赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或 组氨酸。表面活性剂可以是洗涤剂(优选地具有＞1.2KD的分子量)和/ 或聚醚(优选地具有＞3KD的分子量)。优选的洗涤剂的非限制性实例 是Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80或Tween 85。优选的 聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。 用于本发明的缓冲体系可以具有5-9的优选pH，并且可以包含柠檬 酸、琥珀酸、磷酸、组氨酸和乙酸。

本发明的药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者，所述剂量 可以例如通过剂量递增研究来确定，所述剂量递增研究将增加剂量的 本文所述的多肽施用于非黑猩猩灵长类，例如猕猴，所述多肽表现出 本文所述的跨物种特异性。如上所述，表现出本文所述的种间特异性 的本文所述的CD33靶向组合物可以有利地以相同的形式用于非黑猩 猩灵长类的临床前试验以及作为人类的药物。组合物或这些组合物也 可以与另外的其它蛋白质和非蛋白质药物组合施用。这些药物可以与 包含如本文定义的本文所述多肽的组合物同时施用，或者在以确定的 时间间隔和剂量施用所述多肽之前或之后单独施用。给药方案由主治 医生和临床因素确定。如医学领域所熟知，任何一个患者的剂量取决 于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合 物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其它药 物。

肠胃外给药制剂包括无菌水溶液或非水溶液剂、混悬剂和乳剂。 非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射 的有机酯诸如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮 液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右 旋糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物 包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那 些)等等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如例如抗微生物剂、 抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。此外，本发明的组合物可以包含 优选地人类来源的蛋白质载剂，例如血清白蛋白或免疫球蛋白。设想 本发明的组合物，除了如本文定义的本文所述多肽之外，还可以包含 其它生物活性剂，取决于组合物的预期用途。此类药剂可以是作用于 胃肠系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、 抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性响应的药物、作用 于循环系统的药物和/或药剂诸如本领域已知的细胞因子。还设想在 单独或分开的制剂中包含CD33靶向化合物和至少一种表观遗传因子 的本发明组合物以另外的联合疗法，即与另一种抗癌药物组合应用。

本文定义的药物组合物的生物学活性可以例如通过细胞毒性测 定来确定，如以下实施例、WO 99/54440或Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)所述。本文所用的“功效”或“体 内功效”是指使用例如标准化NCI响应标准的对本发明的药物组合物 治疗的响应。使用本发明的药物组合物的治疗的成功或体内功效是指 组合物出于其预期目的的效力，即组合物引起其所需效果(即消耗病 理性细胞，例如肿瘤细胞)的能力。体内功效可以通过各个疾病实体 的既定标准方法来监测，包括但不限于白细胞计数、分类、荧光活化 细胞分选、骨髓穿刺。此外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数 和其它既定标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影术、X射 线、核磁共振断层摄影术(例如，用于基于美国国家癌症研究所 (National Cancer Institute)标准的响应评估[Cheson BD、Horning SJ、 Coiffier B、Shipp MA、Fisher RI、Connors JM、Lister TA、Vose J、 Grillo-Lopez A、Hagenbeek A、Cabanillas F、Klippensten D、Hiddemann W、Castellino R、Harris NL、Armitage JO、Carter W、Hoppe R、Canellos GP.Report of aninternational workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin′slymphomas.NCI Sponsored International Working Group.J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层扫描、 白细胞计数、分类、荧光活化细胞分选、骨髓穿刺、淋巴结活检/组 织学和各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)和其它既定 标准方法。

药物诸如本发明的药物组合物的开发中的另一个主要挑战是药 代动力学性质的可预测调节。为此，可以建立候选药物的药代动力学 曲线，即影响特定药物治疗给定病症的能力的药代动力学参数曲线。 影响药物治疗某些疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但 不限于：半衰期、分布体积、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药 剂的功效可以受到上述每个参数的影响。“半衰期”意指通过生物过程 例如代谢、排泄等消除50％所施用的药物的时间。所谓“肝脏首过代 谢”意指在首次接触肝脏时，即在第一次通过肝脏期间，代谢药物的 倾向。“分布体积”意指药物在身体的各个隔室，例如细胞内和细胞外 空间、组织和器官等的滞留程度，以及药物在这些隔室内的分布。“血 清结合程度”意指药物与血清蛋白诸如白蛋白相互作用和结合，导致 药物的生物活性的减少或丧失的倾向。

药代动力学参数还包括给定量的施用药物的生物利用率、滞后时 间(Tlag)、Tmax、吸收率、更高的起效和/或Cmax。“生物利用率”意 指血液隔室中的药物量。“滞后时间”意指药物的施用及其在血液或血 浆中的检测和可测定性之间的时间延迟。“Tmax”是达到最大血药浓 度的时间，“Cmax”是使用给定药物最大获得的血液浓度。达到药物 的生物学效应所需的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。

本文所用的术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现 的药物的毒性效应。这些副作用可以指一般药物缺乏耐受性和/或施 用后缺乏局部耐受性。毒性还可包括药物引起的致畸或致癌效应。

本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义为在给 药后(局部耐受)和药物施用的较长时间期间，药物的施用不引起严重 不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可以例如在治疗和随 访期间定期评估。测定包括临床评估，例如器官表现，以及实验室异 常的筛查。可以进行临床评估，并且根据NCI-CTC和/或MedDRA 标准来记录/编码与正常结果的偏差。器官表现可以包括诸如过敏/免 疫学、血液/骨髓、心律不齐、凝血等等的标准，例如不良事件通用 术语标准3.0版(Common Terminology Criteria foradverse events v3.0 (CTCAE))所述。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血特征和尿液分析以及其它体液诸如血清、血浆、淋巴或脊髓液、 液体等等的检查。因此，可以例如通过身体检查、成像技术(即超声 波、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、使用技术装置(即心电图) 进行的其它测定、生命体征，通过测定实验室参数和记录不良事件来评估安全性。例如，根据本发明的用途和方法中的非黑猩猩灵长类的 不良事件可以通过组织病理学和/或组织化学方法来检查。

术语“有效剂量”或“有效用量”被定义为足以实现或至少部分实 现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分 阻止已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对该用途有效的量将 取决于疾病的严重性和受试者自身免疫系统的一般状态。术语“患者” 包括接受预防性或治疗性处理的人和其它哺乳动物受试者。本文所用的术语“有效和无毒剂量”是指药物组合物(即在单独或分开制剂中包 含针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制 剂和CAR T细胞或接合T细胞的抗体构建体的药物组合物)的耐受剂 量，其足够高以引起病理细胞消耗、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定， 而没有或基本上没有大量毒性效应。此类有效和无毒剂量可以例如通 过本领域中描述的剂量递增研究来确定，并且应低于诱导严重不良副 作用的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。

上述术语还例如在生物技术衍生药物S6的临床前安全性评估； ICH三方协调指南(ICH Harmonised Tripartite Guideline)；1997年7月 16日举行的ICH指导委员会(ICHSteering Committee)会议中提及。包 含本发明的抑制剂和本文别处所述的CAR T细胞或抗体构建体的药 物组合物的适当剂量或治疗有效量将取决于待治疗的病症、病症的严 重性、先前治疗以及患者的临床病史和对治疗剂的响应。适当的剂量 可以根据主治医生的判断调整，使得可以通过一次或一系列给药施用 于患者。药物组合物可以作为单独的治疗剂或与另外的治疗(诸如根 据需要的抗癌治疗)组合施用。

本发明的药物组合物特别适用于肠胃外施用，即皮下、肌肉内、 静脉内、关节内和/或滑膜内施用。肠胃外施用可以通过弹丸注射或 连续输注进行。如果药物组合物已冻干，则在施用之前首先在适当的 液体中复原冻干材料。可以在例如抑菌性注射用水(BWFI)、生理盐水、 磷酸盐缓冲盐水(PBS)或蛋白质在冻干之前所用的相同制剂中复原冻干材料。

结合本发明出乎意料地发现，与通过封闭单独针对CD112和 CD155的抗体来单独减少的细胞裂解相比，本发明的抑制剂和双特异 性抗体构建体AMG330的组合以剂量依赖性方式显著增加AML细胞 的细胞裂解(图3-13)。该发现支持了针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂与CD33、CD19或Flt3定向的 T细胞接合体的组合的协同治疗将比单独施用的任何一种治疗更有 效。因此，一种或多种针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素 -9和/或TIM-3的抑制剂与本文所述的CD33、CD19或Flt3定向T细 胞接合体组合的所述施用可允许较低剂量的双特异性T细胞接合体 在给定的时间点有效。通过多特异性、至少双特异性构建体募集T细 胞来进行的靶细胞的重定向裂解涉及细胞裂解突触形成和穿孔素和 粒酶的递送。接合的T细胞能够进行连续靶细胞裂解，并且不受干扰 肽抗原加工和呈递的免疫逃逸机制的影响，或克隆T细胞分化；参见 例如WO 2007/042261或WO2008/119567。

本文所述的制剂在如本文所述的有此需要的患者的病理医学状 况的治疗、改善和/或预防中可用作药物组合物。术语“治疗”是指治疗 处理和预防或防止措施二者。治疗包括将制剂应用或施用于具有疾病 /病症、疾病/病症的症状或疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组 织或细胞，目的是治愈、痊愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改 进或影响疾病、疾病的症状或疾病的倾向。那些“需要治疗”的人包括 那些已患有该疾病的人，以及其中要预防病症的那些人。术语“疾病” 是将受益于使用本文所述的蛋白质制剂治疗的任何病症。这包括慢性 和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论疾病的那些病理状 况。本文待治疗的疾病/病症的非限制性实例包括本文所述的血源性 癌症，特别是骨髓性白血病诸如AML。

药物组合物可以含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、 渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶 解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在此类实施方案中，合适的 制剂材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 精氨酸、脯氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、 亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、 柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；填充剂(诸如甘露糖醇或甘氨酸)； 螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；双糖；和其它 碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合 物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；小分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸，硫柳汞、苯乙醇、对羟基 苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶 剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)； 悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、 氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定增强剂(诸如蔗糖或 山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾、 甘露糖醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(A. R.Genrmo编)，1990年，MackPublishing Company。

本领域的技术人员将根据例如预期的给药途径、递送形式和所需 的剂量确定最佳药物组合物。参见例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，出处同上。在某些实施方案中，此 类组合物可影响本文所述的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内 释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要 媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒介物 或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液、可能补充有用 于肠胃外施用的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在具体实施方案中，药物组 合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液， 因此还可包含山梨糖醇或合适的替代物。在本发明的某些实施方案 中，本文所述的人抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体构建体， 可以通过将具有所需纯度的选择组合物与任选的制剂试剂 (REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，出处同上)以冻干 饼或水溶液的形式混合来制备组合物以用于储存。另外，在某些实施 方案中，可使用合适的赋形剂诸如蔗糖将针对CD112、CD155、TIGIT、 半乳糖凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂和CAR T细胞或接合T细胞的 抗体构建体配制为冻干物。

本文所述的药物组合物可以选择用于肠胃外递送。或者，可以选 择用于吸入或通过消化道递送如口服的组合物。此类药学上可接受的 组合物的制备在本领域的技术范围内。制剂组分优选地以施用部位可 接受的浓度存在。在某些实施方案中，使用缓冲剂将组合物维持在生 理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。

本领域的技术人员将清楚另外的药物组合物，包括作为持续或控 制递送制剂的涉及本文所述的针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖 凝集素-9和/或TIM-3的抑制剂和CAR T细胞或接合T细胞的抗体构 建体的制剂。用于配制各种其它持续或控制递送手段(诸如脂质体载 剂、可生物侵蚀的微粒或多孔珠粒和储库注射剂)的技术也是本领域 的技术人员已知的。参见例如国际专利申请No.PCT/US93/00829，其 以引用的方式并入，并且描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微 粒的控制释放。持续释放制剂可以包括成型制品形式的半渗透性聚合 物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚 交酯(如美国专利No.3,773,919和欧洲专利申请公开No.EP 058481 所公开，每个专利以引用的方式并入)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸 的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙 基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277 和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等 人，1981，出处同上)或聚-D(-)-3-羟丁酸(欧洲专利申请公开No. EP133,988)。持续释放组合物还可以包括可以通过本领域已知的几种 方法中的任何一种制备的脂质体。参见例如Eppstein等人，1985，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开No.EP 036,676、EP 088,046和EP 143,949，它们以引用的方式并入。

用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂提供。灭菌可以通过 无菌滤膜过滤实现。当冻干组合物时，可以在冻干和复原之前或之后 进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或 溶液储存。通常将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具 有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。盐可以根据 本发明的某些实施方案使用，以便例如根据本发明调整制剂的离子强 度和/或等渗性和/或改善组合物的蛋白质或其它成分的溶解度和/或 物理稳定性。众所周知，离子可以通过结合至蛋白质表面的带电残基， 通过屏蔽蛋白质中的带电和极性基团，以及降低其静电相互作用、吸 引力和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通 过结合至特别是蛋白质的变性肽键(--CONH)来稳定蛋白质的变性状 态。此外，与蛋白质中的带电和极性基团的离子相互作用还可以减少 分子间静电相互作用，从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。

已开发许多离子及其对蛋白质的作用的分类排序，该分类排序可 用于配制根据本发明的药物组合物。一个实例是Hofmeister系列，它 通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的影响对离子和极性非离子溶质 进行排序。稳定化的溶质称为“稳液剂(kosmotropic)”。去稳定化的溶 质称为“离液剂”。稳液剂通常以高浓度(例如，＞1摩尔硫酸铵)使用， 以便从溶液沉淀蛋白质(“盐析”)。离液剂通常用于使蛋白质变性和/ 或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性确定了它们在 Hofmeister系列中的位置。

根据本发明的各种实施方案，游离氨基酸可以在制剂中用作填充 剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸 和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保饼的 结构和性质正确。在液体和冻干制剂二者中，精氨酸可用于抑制蛋白 质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。多元醇包括糖，例如甘露糖醇、 蔗糖和山梨糖醇，以及多羟基醇，诸如例如甘油和丙二醇，以及出于 本文讨论的目的，聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是稳液剂。它 们在液体和冻干制剂二者中是有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理 和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调整制剂的张力。

该制剂还可以包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上，药物制 剂中蛋白质的有害氧化可以通过维持适当水平的环境氧气和温度以 及通过避免暴露于光线来防止。也可以使用抗氧化剂赋形剂来防止蛋 白质的氧化降解。就此而言，可用的抗氧化剂是还原剂、除氧剂/自 由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂的抗氧化 剂优选地是水溶性的并且在产品的整个保质期内保持其活性。就此而 言，EDTA是根据本发明的优选的抗氧化剂。

抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，特别是诸如谷胱甘肽， 可以破坏分子内二硫键。因此，除此之外选择用于本发明的抗氧化剂 来消除或充分降低其本身破坏制剂中的蛋白质的可能性等等。根据本 发明的制剂可以包括金属离子，所述金属离子是蛋白质辅因子并且是 形成蛋白质配位络合物必需的，诸如形成某些胰岛素悬浮液必需的 锌。金属离子也可以抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子还 催化降解蛋白质的物理和化学过程。

正如所预期，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战 性。冷冻干燥的产物可以在无防腐剂的情况下冻干，并且在使用时使 用含有防腐剂的稀释剂复原。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间， 使相关的稳定性风险显著降至最小。使用液体制剂时，应在整个产物 保质期(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。重要的是， 防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中显 示出来。

药物组合物一旦配制，即可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固 体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存于无菌小瓶中。此类制剂可以以 即用的形式或以施用前复原的形式(例如冻干)储存。本发明还提供用 于产生单剂量施用单元的试剂盒。在本发明的某些实施方案中，提供 了含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干剂注射器(lyosyringe))的试剂盒。包含针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝 集素-9和/或TIM-3的抑制剂和CAR T细胞或接合T细胞的抗体构建 体的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域 的技术人员将会理解，用于治疗的合适剂量水平将部分取决于所递送 的分子、正在使用的本文所述的组合物的适应症、给药途径以及患者 的体型(体重、身体表面或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)。 在某些实施方案中，临床医生可以滴定该剂量并且修改施用途径以获 得最佳治疗效果。根据上述因素，典型的剂量可以在约0.1μg/kg至最 高约30mg/kg或更高的范围内。在具体实施方案中，剂量可以在 1.0μg/kg最高至约20mg/kg，任选地10μg/kg最高至约10mg/kg或 100μg/kg最高至约5mg/kg的范围内。

治疗有效量的包含针对CD112、CD155、TIGIT、半乳糖凝集素 -9和/或TIM-3的抑制剂和本文别处所述的CART细胞或接合T细胞 的抗体构建体的本发明的药物组合物优选地使得疾病症状的严重性 减少、无疾病症状期的频率或持续时间增加或由于疾病折磨而受到的 损伤或残疾得以预防。对于治疗表达CD112、CD155和/或半乳糖凝 集素-9的肿瘤，相对于未治疗的患者，治疗有效量的本文公开的组合 物优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约 50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在 预测人肿瘤功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。

本发明的药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组 合物的医疗装置的实例在美国专利No.4,475,196、4,439,196、 4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、 4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163 中有所描述，这些专利均以引用的方式并入本文。

值得注意的是，本文所述的免疫检查点抑制剂以及本文所述的与 其有关的所有实施方案可以应用于治疗血源性癌症(诸如白血病或淋 巴瘤，特别是AML)的方法，所述方法包括将治疗有效量的所述抑制 剂施用于有此需要的受试者。

类似地，本文所述的免疫检查点抑制剂以及本文所述的与其有关 的所有实施方案可用于制备用于治疗血源性癌症(诸如白血病或淋巴 瘤，特别是AML)的药物组合物。

实施例

提供了以下实施例以说明本发明的具体实施方式或特征。这些实 施例不应解释为限制本发明的范围。包括实施例是出于说明目的，并 且本发明仅受到权利要求书的限制。

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通过RT-qPCR分析来自140名新诊断为AML(AMLSG 07-04， NCT00151242)的未接受治疗的患者的样品的免疫检查点分子PVR、 PVRL2和半乳糖凝集素-9(Gal-9)的表达。通过多变量cox回归将表达 与患者人口统计学(年龄、核型、FLT3突变状态)和临床存活数据相关 联。大多数患者显示出PVR(94％)、PVRL2(95％)和Gal-9(92％)的 mRNA表达。在总体存活的多变量逐步cox回归中，将不利的核型、 高PVR和高Gal-9表达鉴定为非依赖性预后标记物(对于核型， p＜0.001，HR：2.10，CI 1.39-3.15；对于PVR，p＝0.001，HR：1.64， CI1.21-2.21和对于Gal-9，p＜0.001，HR：0.67，CI 0.54-0.84)。由于 PVR和PVRL2之间的高度相关性(皮尔森氏rho(Pearson’s rho)＝0.827，p＜0.001)，PVRL2在逐步过程期间被移除。然而，如果 将PVR排除在多变量cox回归之外，则除了核型和Gal-9之外，PVRL2 在逐步程序中仍然是重要的术语(对于PVRL2，p＝0.003，HR：1.58，CI 1.17-2.13)。在第二个非依赖性患者群组中，包含291名AML患者 的基于微阵列的基因表达和临床数据(Verhaak等人，Haematologica 2009；94)，与CD80、CD86或PD-L1的表达相比，高PVR和PVRL2 表达与总体存活差相关(分别地，对数秩检验p＝0.003和p＝0.032)。在 体外杀死测定中，使用7-AAD染色通过FACS研究PVR和PVRL2 封闭的治疗效果。将AML细胞系MV4-11、Kasumi-1和Molm-13与针对PVR、PVRL2或它们二者的封闭性抗体一起预温育，并且在存 在或不存在AMG 330的情况下与健康供体的外周血单核细胞(PBMC) 共培养24h。

在不存在AMG 330的情况下，MV4-11的细胞杀死从 12.6±4.7％(对照)增加至33.0±8.8％(PVR)、至40.4±10.4％(PVRL2)以 及至56.0±12.0％(两者均为PVR+PVRL2)。在存在次优选浓度的AMG 330(0.1ng/ml MV4-11)的情况下，细胞裂解为29.4±9.0％(单独AMG 330)、49.7±12.6％(AMG 330+PVR)、57.9±11.3％(AMG 330+PVRL2) 和70.0±9.8％(AMG 330+PVR+PVRL2；对于所有比较，n＝4，p＜0.05)。 观察到Kasumi-1和Molm-13的可比较结果，其中两种检查点抑制剂 的封闭都是最有效的治疗，但是在所有情况下都无法证实针对PVR 和PVRL2的抗体的叠加效应(数据未显示)。为了确定该方法的特异 性并且排除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)导致的影响，通过 CRISPR/Cas-9产生细胞系MV4-11的PVR和PVRL2双敲除。与野 生型细胞相比，在PVR和PVRL2双敲除细胞中观察到杀死显著增加(40.5±8.1％对比25.9±9.1；n＝3，p＜0.001)。另外的实验使用不相关的 针对CD117的抗体或通过纯化的IgG抗体封闭Fcγ受体排除了 ADCC，从而确认了了PVR/PVRL2封闭的功能相关性。

免疫检查点配体PVR和PVRL2的表达赋予可能由于免疫逃避而 导致的AML患者的预后不良。我们还显示，通过PBMC杀死AML 细胞可以通过封闭这些新检验点抑制剂来增强。此外，将PVR和/或 PVRL2封闭性抗体添加至AMG 330可增强细胞毒性。因此，PVR和 PVRL2的封闭表示有前景的治疗AML的靶标。

PVR、PVRL2和半乳糖凝集素-9在AML中的预后影响

使用LightCycler 96(Roche，Basel，Switzerland)在定量RT-PCR中 分析140名患有初发性AML的患者的PVR、PVRL2和半乳糖凝集 素-9mRNA表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作参考基因。使 用以下引物：PVR正向5’-agcaggagcgtggatatctg-3’(SEQ IDNo：1)、PVR 反向5’-gactgtgccagacaggaacc-3’(SEQ ID No：2)、PVRL2正向 5’-gaggacgagggcaactacac-3’(SEQ ID No：3)、PVRL2反向 5’-agggatgagagccaggagat-3’(SEQID No：4)、半乳糖凝集素-9正向 5’-gtctccaggacggacttcag-3’(SEQ ID No：5)、半乳糖凝集素-9反向 5’-caggaagcagaggtcaaagg-3’(SEQ ID No：6)、GAPDH正向 5’-gtcagtggtggacctgacct-3’(SEQ ID No：7)、GAPDH反向 5’-tgctgtagccaaattcgttg-3’(SEQID No：8)。对于将AML患者群组分为 低表达者对比高表达者的每个基因定义了截止值。使用多变量cox回 归将基因表达与患者人口统计学(年龄、核型、FLT3突变状态)和临床 存活数据相关联。统计分析使用SPSS 17(SPSS Inc，Chicago，IL)完成。

PVR、PVRL2和半乳糖凝集素-9的蛋白质表达

使用以下抗体在流式细胞术(FACSCalibur和CellQuestPro软件， BDBiosciences)中分析AML细胞系和原代AML细胞中PVR和 PVRL2的蛋白质表达：小鼠抗PVR克隆D171(ThermoScientific^TM Lab Vision，Waltham，MA)和小鼠抗PVRL2克隆L14(Bottino等人，J Exp Med 2003；198：557-567)作为一抗，且抗小鼠APC抗体作为二抗。半 乳糖凝集素-9直接用APC标记的小鼠抗人抗体(克隆9M1-3；Biozol， Eching，Germany)染色。

T细胞诱导的AML细胞裂解

来自健康供体的血沉棕黄层作为T细胞来源。使用Ficoll-Paque 离心分离单核细胞(MNC)级分。AML细胞用CellTracker^TM Green CMFDA Dye(LifeTechnologies)预染色一小时，并用细胞培养基洗涤 两次。将预染色的AML靶细胞与含有MNC级分的T细胞以1∶6的 比例混合，并涂铺于96孔板(200.000个细胞/孔)中。

将细胞混合物与PVR封闭性抗体克隆D171(4-20μg/ml；Thermo Scientific^TM LabVision)、PVRL2封闭性抗体克隆L14(5-20μl细胞培养 物上清液；Bottino等人，J Exp Med2003；198：557-567)、半乳糖凝 集素-9封闭性抗体9M3-1(10-50μg/ml；Biozol，Eching，Germany)一起 或不加抗体温育2小时。在2小时后，将100-500pg/ml AMG330加 入培养物。

在24小时后，将细胞混合物使用7-AAD染色并使用FACSCalibur 和CellQuestPro软件(BD Biosciences)通过流式细胞术进行分析。根据 CellTracker^TM Green CMFDA染料染色对AML靶细胞进行门控。杀 死比例被确定为靶细胞门内7-AAD阳性细胞的比例。

Claims (6)

1.一种药物组合物在制备用于治疗急性骨髓性白血病(AML)的药物中的用途，所述药物组合物包含

-针对CD112(连接蛋白-2、PVRL2)、CD155(PVR)和/或TIGIT的抑制剂，其中所述抑制剂为特异性结合CD112、CD155和/或TIGIT的抗体，和

-双特异性单链Fv(scFv)抗体构建体，其接合T细胞并包含CD3ε结合结构域和靶向选自CD33、CD19和Flt3的表面分子的另一结合结构域。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述针对CD112的抑制剂抑制CD112和TIGIT之间的相互作用，或其中所述针对CD155的抑制剂抑制CD155和TIGIT之间的相互作用，或其中所述针对TIGIT的抑制剂抑制TIGIT和CD112之间的相互作用，或其中所述针对TIGIT的抑制剂抑制TIGIT和CD155之间的相互作用。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述针对CD112的抑制剂调节CD112的细胞内信号传导。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述针对CD155的抑制剂调节CD155的细胞内信号传导。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述针对TIGIT的抑制剂调节TIGIT的细胞内信号传导。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述接合T细胞并包含CD3ε结合结构域和靶向选自CD33、CD19和Flt3的表面分子的另一结合结构域的抗体构建体选自SEQ ID Nos.:15至37所示的分子。

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