ES2855299T3 - Lípidos oxidados y tratamiento o prevención de la fibrosis - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene una estructura según la Fórmula 4c: **(Ver fórmula)** o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: A2 está ausente o es CH2; X1 es un alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono; E está ausente o es una cadena de alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; F es hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y Y es fosforilcolina o fosforiletanolamina; para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis.
Description
DESCRIPCIÓN
Lípidos oxidados y tratamiento o prevención de la fibrosis
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos lipídicos oxidados para su uso en el tratamiento o la prevención de la fibrosis, como se define adicionalmente en las reivindicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La fibrosis es la formación de un exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido. La fibrosis engloba el estado patológico del exceso de depósito de tejido fibroso, así como el proceso de depósito de tejido conectivo en la curación. La fibrosis es similar al proceso de cicatrización en que ambos implican células estimuladas (por ejemplo, fibroblastos) que depositan tejido conectivo, incluyendo colágeno y glucosaminoglicanos.
La fibrosis se puede considerar como un proceso de cicatrización en respuesta a enfermedades crónicas donde la deposición excesiva de matriz extracelular (ECM) conduce a daño tisular irreversible y fallo o alteración de la función adecuada del órgano. La fisiopatología de la fibrosis se ha estudiado generalmente en el contexto del órgano o tejido particular afectado, incluidos pulmón, riñón, hígado, corazón y piel. La pérdida de la homeostasis metabólica y la inflamación crónica de bajo grado pueden influir en la patogénesis de la fibrosis. La fibrogénesis es un proceso dinámico y se produce en cuatro fases: i) inicio, debido a la lesión del órgano/tejido; ii) inflamación y activación de células efectoras; iii) síntesis mejorada de la ECM; y iv) depósito de la ECM con progresión a insuficiencia orgánica terminal.
La fibrosis puede producirse en muchos tejidos dentro del cuerpo. Los ejemplos incluyen fibrosis pulmonar (pulmones), fibrosis pulmonar idiopática (pulmones), fibrosis quística (pulmones), fibrosis masiva progresiva (pulmones), fibrosis hepática, cirrosis (hígado), esteatohepatitis (enfermedad del hígado graso), enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis endomiocárdica (corazón), infarto de miocardio (corazón), fibrosis auricular (corazón), fibrosis mediastínica (tejido blando del mediastino), mielofibrosis (médula ósea), fibrosis retroperitoneal (tejido blando del retroperitoneo), fibrosis sistémica nefrogénica (piel), queloide (piel), enfermedad de Crohn (intestino), esclerodermia/esclerosis sistémica (piel, pulmones), artrofibrosis (rodilla, hombro, otras articulaciones), enfermedad de Peyronie (pene), contractura de Dupuytren (manos, dedos), capsulitis adhesiva (hombro), fibrosis renal y glomeruloesclerosis focal y segmentaria (riñón).
Una de las principales complicaciones de la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico es la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que puede progresar desde el hígado graso hasta inflamación del hígado (EHNA) y fibrosis hepática. Se cree que debido a la fuga de la barrera intestinal, acompañada de un crecimiento excesivo y cambios en la composición de la flora intestinal, los componentes bacterianos viajan a través de la vena porta hacia el hígado, donde encuentran receptores tipo Toll (TLR).
Los TLR son una familia de receptores imprescindibles para la respuesta inmunitaria innata contra la invasión microbiana. Los TLR se pueden dividir en dos subgrupos principales según su localización celular. Los TLR expresados en la membrana plasmática incluyen TLR1, t LR2, TLR4, TLR5 y TLR6, mientras que los TLR intracelulares incluyen TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9. La interacción entre los TLR con sus agonistas afines instiga una cascada de señales que incluyen el reclutamiento de las moléculas adaptadoras MyD88/TRIF y la fosforilación cadena abajo de las MAPK cinasas y NF-kB. Estos eventos culminan en la secreción de citocinas proinflamatorias, incluidas IL-12/23, IL-6 y TNF-a. TLR2 forma un heterodímero con TLR1 que reconoce lipopéptidos triacilados bacterianos y un heterodímero con TLR6 que reconoce lipopéptidos diacilados bacterianos. El TlR4 acoplado a MD2 en complejo con la proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP) y el correceptor CD14 se unen a lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gramnegativas.
Las células de kupffer residentes en el hígado y las células estrelladas hepáticas (HSC) expresan TLR2 que reconoce lipopéptidos triacilados de bacterias gramnegativas y micoplasma y lipopéptidos diacilados de bacterias gramnegativas y micoplasma y TLR4 y su correceptor CD14 que reconoce lipopolisacárido (LPS) de bacterias gramnegativas. Tanto TLR2 como TLR4 también pueden unirse a patrones moleculares asociados al peligro liberados por los tejidos lesionados. Estos complejos de TLR2 y TLR4 median la producción de citocinas proinflamatorias y la respuesta fibrogénica de las células de kupffer y estrelladas. Los estudios preclínicos mostraron que la esteatohepatitis no alcohólica y la fibrosis hepática se inhiben en ratones con deficiencia de TLR2 y TLR4, lo que indica su papel en la patogénesis de la enfermedad. En los seres humanos, los niveles plasmáticos de LPS están elevados en pacientes con EHGNA y las alteraciones en los genes TLR4 y CD14 se asocian con riesgos de desarrollar esteatohepatitis no alcohólica y fibrogénesis.
Los monocitos son actores clave en el sistema inmunitario, con papeles críticos en la inmunidad innata y adaptativa, la inmunovigilancia y la inactivación de partículas. Mientras que un subconjunto de monocitos es "residente" y se recluta en los tejidos independientemente de los estímulos inflamatorios para ayudar en la vigilancia en estado estable,
la curación de heridas y la resolución de la inflamación, la mayoría absoluta (80-90 %) de los monocitos circulantes humanos se clasifica como "inflamatorios". Estos monocitos pueden detectar estímulos inflamatorios y migrar rápidamente a través del endotelio vascular o linfático hacia la periferia, donde pueden diferenciarse en macrófagos y células dendríticas (CD) que cooperan con subconjuntos de células adicionales (tales como las células Th1) para promover la inflamación. Si bien desempeñaban una función necesaria en la defensa del huésped, los monocitos se identificaron como mediadores críticos de varias enfermedades inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis, la artritis reumatoide (AR) y la esclerosis múltiple (EM). La supresión de la acumulación de monocitos/macrófagos no deseados en un tejido inflamado crónicamente tiene potencial terapéutico y, en por consiguiente, los inhibidores de la migración han demostrado resultados antiinflamatorios prometedores en modelos animales y ensayos clínicos.
La fibrosis renal (fibrosis del riñón) es una respuesta de curación/cicatrización de heridas después de una lesión renal que se produce en muchas formas de enfermedad renal crónica (ERC). Después de una lesión renal, los fibroblastos residentes se activan mediante diversos estímulos proinflamatorios y profibróticos. Los fibroblastos activados, también llamados miofibroblastos, producen un exceso de proteínas de la eCM que se acumulan en el intersticio y, por lo tanto, se consideran un mediador de la fibrosis renal. Independientemente del daño primario que conduce a la fibrosis renal, la inflamación crónica parece ser un proceso que anuncia la fibrogénesis renal. Los niveles elevados de marcadores inflamatorios se asociaron con un mayor riesgo de desarrollar ERC. La inducción de diversas citocinas proinflamatorias interleucina (IL)-6, IL-8, IL-10, ligando 2 de quimiocina (motivo C-C) (CCL2), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y moléculas de adhesión (molécula de adhesión intercelular 1 y molécula de adhesión de células vasculares 1 ) atrajeron la transmigración de macrófagos y linfocitos T de la circulación al intersticio, mejorando así aún más el estado inflamatorio. La evidencia sugiere que los TLR y los macrófagos están asociados con la patogénesis de la fibrosis renal.
La fibrosis puede provocar una morbilidad grave y efectos perjudiciales en la función diaria, la actividad de la vida diaria (AVD) y la calidad de vida de los pacientes, y puede conducir a un mal pronóstico. Por ejemplo, la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad crónica intratable asociada con empeoramiento y dificultad respiratoria debilitante. Los pacientes con FPI se vuelven dependientes del oxígeno y tienen un tiempo medio de supervivencia de tres años y una tasa de supervivencia de cinco años del 20 % al 40 % después del diagnóstico. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de nuevas terapias para la fibrosis.
El documento WO 2013/088245 se refiere a ciertos compuestos para el tratamiento de enfermedades o trastornos inflamatorios.
Shi H y col., Toxicology, 2013, 303:107-14 informan que el ácido clorogénico reduce la inflamación y la fibrosis hepática a través de la inhibición de la vía de señalización del receptor 4 de tipo toll.
Huebener P y col., Biochim Biophys Acta, 2013, 1832(7):1005-17 se refiere a la regulación de la cicatrización de heridas y la fibrosis orgánica mediante receptores de tipo toll.
El documento US 7.625.882 describe ciertos lípidos oxidados y su uso terapéutico.
Ali MH y col., Int J Pharm, 2013, 453(1):225-32 describen la función de la geometría de los lípidos en el diseño de liposomas para la solubilización de fármacos poco solubles en agua.
Mendel I y col., Clin Exp Immunol, 2014, 175(1):126-37 informan que VB-201, una molécula pequeña de fosfolípidos oxidados, inhibe la activación celular innata dependiente del receptor 2 de tipo Toll y CD14 y restringe la aterosclerosis. El documento WO 2013/121300 describe el tratamiento de la inflamación vascular en sujetos que padecen una enfermedad autoinmune crónica o inflamatoria crónica mediante la administración de VB-201.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un compuesto que tiene una estructura según la Fórmula 4c:
o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
A2 está ausente o es CH2;
X1 es un alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono;
E está ausente o es una cadena de alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
F es hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y
Y es fosforilcolina o fosforiletanolamina;
para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis.
En algunas realizaciones, el compuesto es 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina (VB-201). En algunas realizaciones, el compuesto es (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-sn-glicero-3-fosfocolina. En otras realizaciones, el compuesto tiene la siguiente estructura:
En otras realizaciones, el compuesto tiene la siguiente estructura:
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Algunas realizaciones de la invención se describen en esta invención, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que las particularidades mostradas son a modo de ejemplo y con el propósito de un análisis ilustrativo de las realizaciones de la invención.
Las figuras 1A-1D muestran que VB-201 inhibe la señalización inducida por lipopolisacáridos (LPS) (TLR4) en monocitos humanos (CD14+ primarios).
Las figuras 2A-2B muestran que VB-201 inhibe la señalización inducida por PGN (TLR2) en monocitos humanos (línea celular THP-1).
La figura 3 muestra que VB-201 inhibe la señalización inducida por MCP-1 en monocitos humanos (línea celular THP-1).
La figura 4 muestra que VB-201 inhibe la migración inducida por quimiocinas de monocitos humanos (CD14+ primarios).
La figura 5 muestra que VB-201 inhibe la migración celular inducida por SDF1 de monocitos humanos (línea celular THP-1).
La figura 6 muestra que VB-201 inhibe la señalización inducida por RANTES en monocitos humanos (CD14+ primarios).
Las figuras 7A-7B muestran que VB-201 inhibe los niveles de IL-12p40 en monocitos humanos (CD14+ primarios) que son estimulados por LPS (TLR4) (figura 7A) y estimulados por Pam3CSK4 (TLR2) (figura 7B).
La figura 8 muestra el efecto de VB-201 sobre la unión a LPS por monocitos primarios humanos. Las muestras se incubaron con VB-201 a las concentraciones indicadas durante 20 minutos antes de añadir biotina-LPS (100 ng/ml) durante 15 minutos más. Los resultados son la intensidad media de fluorescencia (IMF) de los triplicados.
La figura 9 muestra que VB-201 inhibe la secreción de IL-6 en células dendríticas derivadas de monocitos humanos estimuladas con LpS (TLR4) (CD derivadas de Mo).
La figura 10 muestra que VB-201 inhibe la secreción de IL-12p40 en CD derivadas de Mo humanas estimuladas con LPS (TLR4).
Las figuras 11A-11B muestran el efecto de VB-201 sobre la inflamación hepática (figura 11A). Se indujo EHNA mediante la inyección de ratones con 200 |jg de estreptozotocina (STZ) dos días después del nacimiento y mediante la alimentación con una dieta rica en grasas (HFD) a partir de las cuatro semanas de edad. A continuación, los ratones se trataron con vehículo (control negativo), VB-201 (4 mg/kg) o telmisartán (10 mg/kg; control positivo) a las seis semanas de edad durante tres semanas, o no se trataron (Normal). Los ratones se sacrificaron a las nueve semanas de edad. La figura 11A muestra la puntuación media de inflamación hepática después del tratamiento (Media ± E.E.; Normal - n = 5, Vehículo - n = 8, VB-201 - n = 8, Telmisartán - n = 6). La figura 11B muestra las muestras de hígado teñidas con H&E después del tratamiento (aumento de 200X).
Las figuras 12A-12B muestran el efecto de VB-201 sobre la fibrosis hepática. Se indujo EHNA como se explica en las figuras 11A-11B. Se utilizó la tinción de muestras histológicas hepáticas con rojo Sirio para determinar la extensión de la fibrosis. La figura 12A muestra el área de fibrosis media después del tratamiento (% de la sección de hígado analizada; Media ± E.E.; Normal - n = 5, Vehículo - n = 8, VB-201 - n = 8, Telmisartán - n = 6). La figura 12B muestra la tinción con rojo Sirio de muestras de hígado después del tratamiento (aumento de 200X).
La figura 13 presenta gráficos de barras que muestran el efecto de VB-201 en la reducción del número de glomérulos dañados (%) en un modelo de fibrosis renal. Se evaluaron a las 8 semanas los glomérulos dañados (%) en ratas sanas (n = 3) (barra de color blanco), ratas operadas simuladamente (n = 3) (barra de color blanco con rayas), ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) (barra de color negro) (n = 7), ratas nefrectomizadas tratadas con VB-201 a 4 mg/kg (n = 7) (barra de color gris claro) o ratas nefrectomizadas tratadas con telmisartán a 10 mg/kg (n = 8) (barra de color gris oscuro). Los datos estadísticos frente a ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) se presentan de la siguiente manera: * representa p = 0,01; ** representa p <0,005; y *** representa p <0,001. Las abreviaturas son: Nx, nefrectomizadas; Et., etanol.
La figura 14 presenta gráficos de barras que muestran el efecto de VB-201 en la reducción de la esclerosis glomerular (%). Se evaluó a las 8 semanas la esclerosis glomerular (%) en ratas sanas (n = 3) (barra de color blanco), ratas operadas simuladamente (n = 3) (barra de color blanco con rayas), ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) (barra de color negro) (n = 7), ratas nefrectomizadas tratadas con VB-201 a 4 mg/kg (n = 8) (barra de color gris claro) o ratas nefrectomizadas tratadas con telmisartán a 10 mg/kg (n = 8) (barra de color gris oscuro). Los datos estadísticos frente a ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) se presentan de la siguiente manera: * representa p <0,05; ** representa p <0,005; y *** representa p <0,001. Las abreviaturas son: Nx, nefrectomizadas; Et., etanol.
La figura 15 presenta imágenes de tinción PAS (x400) que muestran el efecto de VB-201 en la reducción de la esclerosis glomerular. La morfología renal se evaluó mediante microscopio óptico en secciones teñidas con PAS de ratas sanas (Sanas x400), ratas operadas simuladamente (simuladas x400), ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) (Nx PBS 0,5 % de Et. x400), ratas nefrectomizadas tratadas con VB-201 a 4 mg/kg (Nx VB-201 4 mg/kg x 400) o ratas nefrectomizadas tratadas con telmisartán a 10 mg/kg (Nx Telmisartán 10 mg/kg x400) 8 semanas después de la primera cirugía. Las abreviaturas son: Nx, nefrectomizadas; Et., etanol, PAS, ácido periódico de Schiff.
Las figuras 16A-16C muestran el efecto de VB-201 sobre la infiltración celular de monocitos/macrófagos en los glomérulos (figura 16A) o en el intersticio (figura 16B). Se evaluaron a las 8 semanas las células positivas para CD68 en los glomérulos (células/glomérulos) y en el intersticio (células/mm2) en ratas sanas (n = 3) (barra de color blanco), ratas operadas simuladamente (n = 3) (barra de color blanco con rayas), ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) (barra de color negro) (n = 7), ratas nefrectomizadas tratadas con VB-201 a 4 mg/kg (n = 8) (barra de color gris claro) o ratas nefrectomizadas tratadas con telmisartán a 10 mg/kg (n = 8) (barra de color gris oscuro). Los datos estadísticos frente a ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente
de control (etanol al 0,5 %/PBS) se presentan de la siguientes manera: en la figura 16A, * representa p = 0,008; y ** representa p <0,001; y en la figura 16B, * representa p <0,005. La figura 16C presenta imágenes representativas de la tinción de CD68 (x400) que muestran el efecto de VB-201 en la reducción del número de células CD68. Las abreviaturas son: Nx, nefrectomizadas; Et., etanol.
Las figuras 17A-17B presentan gráficos de barras que muestran el efecto de VB-201 sobre marcadores profibróticos. Se evaluó a las 8 semanas la expresión relativa de colágeno IV (figura 17A) y TGF-p (figura 17B) en el riñón en ratas sanas (barra de color blanco), ratas operadas simuladamente (barra de color blanco con rayas), ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) (barra de color negro), ratas nefrectomizadas tratadas con VB-201 a 4 mg/kg (barra de color gris claro) o ratas nefrectomizadas tratadas con telmisartán a 10 mg/kg (barra de color gris oscuro). Los datos estadísticos frente a ratas nefrectomizadas tratadas con disolvente de control (etanol al 0,5 %/PBS) se presentan de la siguiente manera: en la figura 17A, * representa p <0,05; y en la figura 17B, * representa p <0,001. Las abreviaturas son: Nx, nefrectomizadas; Et., etanol.
La figura 18 presenta gráficos de barras que muestran que VB-201 inhibe la expresión de IL-12/23p40 en hígados de ratones inducidos por EHNA. Se indujo EHNA en ratones y se administró por vía oral VB-201 a una dosis de 4 mg/kg una vez al día desde la Semana 6 a la Semana 9. Se administró telmisartán a una dosis de 10 mg/kg una vez al día. Se realizó un análisis por Q-PCR en ARN extraído de hígados de ratones inducidos por EHNA tratados con vehículo (disolvente, n = 8), VB-201 (n = 7), telmisartán (n = 5) como se ha descrito anteriormente, o de hígados de ratones normales. Se utilizó Q-PCR para detectar IL-12/23p40. Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de ARN. El análisis de IL-12/23p40 en los hígados de ratones inducidos por EHNA muestra que VB-201 atenuó significativamente la expresión de IL-12/23p40, con p <0,05.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Antes de explicar las realizaciones de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados por los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ser ponerse en práctica o realizarse de diversas formas. Además, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en esta invención tienen el propósito de describir y no deben considerarse limitantes.
Definiciones generales
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "incluyendo, pero sin limitación".
La palabra "opcionalmente" se usa en esta invención para referirse a "se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones". Cualquier realización particular de la invención puede incluir una pluralidad de características "opcionales" a menos que dichas características entren en conflicto.
Como se usa en esta invención, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
Como se usa en esta invención, el término "aproximadamente" que modifica una cantidad relacionada con la invención se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, por pruebas y manipulación de rutina; por error inadvertido en dichas pruebas y manipulación; por diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los ingredientes empleados en la invención; y similares. Ya estén modificadas o no por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes de las cantidades mencionadas. En una realización, el término "aproximadamente" significa dentro del 10 % del valor numérico informado.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en esta invención, se refiere a la cantidad de un agente terapéutico dado suficiente para producir la mejora de uno o más síntomas de un trastorno o afección, o prevenir la aparición o el avance de un trastorno o afección, o causar la regresión o curación del trastorno o afección. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de VB-201 es de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 160 mg de VB-201 al día.
Como se usa en esta invención en todo el documento, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado que incluye grupos de cadena lineal y de cadena ramificada. En algunas realizaciones, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono. Siempre que sea un intervalo numérico; por ejemplo, "1-20", como se indica en esta invención, implica que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e inclusive 20 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el alquilo es un alquilo de tamaño medio que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el alquilo es un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido (por ejemplo, con 1 a 5 grupos sustituyentes) o sin sustituir. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, el alquilo puede estar sin sustituir. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, el alquilo también puede estar sustituido con uno a cinco grupos sustituyentes, donde el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro,
azida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocargamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos términos en esta invención.
Un grupo "cicloalquilo" se refiere a un grupo de anillos condensados o monocíclicos totalmente de carbono (es decir, anillos que comparten un par adyacente de átomos de carbono) donde uno o más de los anillos no tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido (por ejemplo, con 1 a 5 grupos sustituyentes) o sin sustituir. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, el cicloalquilo puede estar sin sustituir. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, el cicloalquilo también puede estar sustituido con uno a cinco grupos sustituyentes, donde el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocargamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos términos en esta invención.
Un grupo "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que contiene al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono, que puede ser lineal o ramificado. Un grupo alquenilo puede estar sustituido o sin sustituir.
Un grupo "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que contiene al menos dos átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. Un grupo alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir.
Un grupo "arilo" se refiere a grupos policíclicos de anillos monocíclicos o condensados totalmente de carbono (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, los grupos arilo pueden tener de 6 a 14 carbonos, por ejemplo, de 6 a 10 carbonos. Los ejemplos, sin limitación, de grupos arilo son fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar sustituido (por ejemplo, con 1 a 5 grupos sustituyentes) o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocargamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos términos en esta invención. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, el grupo arilo puede ser un grupo fenilo, opcionalmente sustituido, por ejemplo, con uno a cinco sustituyentes tales como halógenos (por ejemplo, flúor o cloro), grupos alquilo (por ejemplo, un alquilo C1-4), o alquilos sustituidos con halógeno (por ejemplo, trifluorometilo).
Un grupo "heteroarilo" se refiere a un grupo de anillos monocíclicos o condensados (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el anillo o anillos uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, tener un sistema de electrones pi completamente conjugado. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, los grupos heteroarilo pueden tener de 5 a 14 átomos en el anillo, por ejemplo, de 5 a 10 átomos en el anillo (por ejemplo, 5 o 6 átomos en el anillo). Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede estar sustituido (por ejemplo, con 1 a 5 grupos sustituyentes) o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocargamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos términos en esta invención.
Un grupo "heteroalicíclico" se refiere a un grupo de anillos monocíclicos o condensados que tiene en el anillo o anillos uno o más heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, los grupos heteroalicíclicos pueden tener de 3 a 10 átomos en el anillo, por ejemplo, de 5 a 10 átomos en el anillo (por ejemplo, 5 o 6 átomos en el anillo). El heteroalicíclico puede estar sustituido (por ejemplo, con 1 a 5 grupos sustituyentes) o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituido puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocargamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos términos en esta invención. Son ejemplos representativos piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolina y similares.
Un grupo "alcoxi" se refiere tanto a un grupo -O-alquilo como a un grupo -O-cicloalquilo, donde el alquilo o el cicloalquilo pueden ser cualquiera de los definidos en esta invención.
Un grupo "ariloxi" se refiere tanto a un grupo -O-arilo como a un grupo -O-heteroarilo, donde el arilo o el heteroarilo pueden ser cualquiera de los definidos en esta invención.
Un grupo "tiohidroxi" se refiere a un grupo -SH.
Un grupo "tioalcoxi" se refiere tanto a un grupo -S-alquilo como a un grupo -S-cicloalquilo, donde el alquilo o el cicloalquilo pueden ser cualquiera de los definidos en esta invención.
Un grupo "tioariloxi" se refiere tanto a un grupo -S-arilo como a un grupo -S-heteroarilo, donde el arilo o el heteroarilo pueden ser cualquiera de los definidos en esta invención.
Un grupo "carbonilo" se refiere a un grupo -C(=O)-R, donde R es hidrógeno, alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un carbono en el anillo) o heteroalicíclico (unido a través de un carbono en el anillo) como se define en esta invención.
Un grupo "aldehído" se refiere a un grupo carbonilo, donde R es hidrógeno.
Un grupo "tiocarbonilo" se refiere a un grupo -C(=S)-R, donde R es como se define en esta invención.
Un grupo "C-carboxi" se refiere a un grupo -C(=O)-O-R, donde R es como se define en esta invención.
Un grupo "O-carboxi" se refiere a un grupo RC(=O)-O-, donde R es como se define en esta invención.
Un grupo "oxo" se refiere a un grupo =O.
Un grupo "ácido carboxílico" se refiere a un grupo C-carboxilo en el que R es hidrógeno.
Un grupo "halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
Un grupo "trihalometilo" se refiere a un grupo -CX3 donde X es un grupo halo como se define en esta invención, por ejemplo, un grupo CF3.
Un grupo "sulfinilo" se refiere a un grupo -S(=O)-R, donde R es como se define en esta invención.
Un grupo "sulfonilo" se refiere a un grupo -S(=O)2-R, donde R es como se define en esta invención.
Un grupo "S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(=O)2-NR2, con cada uno de R como se define en esta invención. Un grupo "N-sulfonamido" se refiere a un grupo RS(=O)2-NR, donde cada uno de R es como se define en esta invención.
Un grupo "O-carbamilo" se refiere a un grupo -OC(=O)-NR2, donde cada uno de R es como se define en esta invención. Un grupo "N-carbamilo" se refiere a un grupo ROC(=O)-NR-, donde cada uno de R es como se define en esta invención.
Un grupo "O-tiocarbamilo" se refiere a un grupo -OC(=S)-NR2, donde cada uno de R es como se define en esta invención.
Un grupo "N-tiocarbamilo" se refiere a un grupo ROC(=S)NR-, donde cada uno de R es como se define en esta invención.
Un grupo "amino" se refiere a un grupo -NR2 donde cada uno de R es como se define en esta invención.
Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo -C(=O)-NR2, donde cada uno de R es como se define en esta invención. Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo RC(=O)-NR-, donde cada uno de R es como se define en esta invención. Un grupo "urea" se refiere a un grupo -NRC(=O)-NR2, donde cada uno de R es como se define en esta invención. Un grupo "guanidino" se refiere a un grupo -RNC(=N)-NR2, donde cada uno de R es como se define en esta invención. Un grupo "guanilo" se refiere a un grupo R2NC(=N)-, donde cada uno de R es como se define en esta invención. El término "fosfonilo" o "fosfonato" describe un grupo -P(=O)(OR)2, con R como se define en esta invención.
El término "fosfato" describe un grupo -O-P(=O)(OR)2, con cada uno de R como se define en esta invención.
Un "ácido fosfórico" es un grupo fosfato donde cada uno de R es hidrógeno.
El término "fosfinilo" describe un grupo -PR2, con cada uno de R como se define en esta invención.
El término "tiourea" describe un grupo -NR-C(=S)-NR-, con cada uno de R como se define en esta invención.
El término "sacárido" se refiere a una o más unidades de azúcar, ya sea una unidad de azúcar de cadena abierta o una unidad de azúcar cíclica (por ejemplo, unidades a base de piranosa o furanosa), y abarca cualquier monosacárido, disacárido y oligosacárido, a menos que se indique de otro modo.
El término "estereoisómero" incluye isómeros geométricos, tales como isómeros E o Z, enantiómeros, diastereómeros y similares.
El término "mezcla estereoisomérica" incluye cualquier mezcla en cualquier relación de estereoisómeros definida en esta invención. En algunas realizaciones, una mezcla estereoisomérica incluye una mezcla racémica. En algunas realizaciones, una mezcla estereoisomérica incluye una mezcla enriquecida enantioméricamente. En algunas realizaciones, una mezcla estereoisomérica incluye una mezcla de diastereómeros en cualquier relación.
El término "exceso enantiomérico" o "e.e." se refiere a una medida de la cantidad de un enantiómero que está presente en comparación con el otro. Para una mezcla de enantiómeros R y S, el porcentaje de exceso enantiomérico se define como |R - S| * 100, donde R y S son las respectivas fracciones molares o en peso de enantiómeros en una mezcla de tal forma que R S = 1. Con el conocimiento de la rotación óptica de una sustancia quiral, el porcentaje de exceso enantiomérico se define como ([a]obs./[a]máx)*100, donde [a]obs. es la rotación óptica de la mezcla de enantiómeros y [a]máx es la rotación óptica del enantiómero puro.
El término "sal" incluye tanto la sal interna como la sal externa. En algunas realizaciones, la sal es una sal interna, es decir, una estructura de zwitteriones. En algunas realizaciones, la sal es una sal externa. En algunas realizaciones, la sal externa es una sal farmacéuticamente aceptable que tiene un contraión adecuado. Los contraiones adecuados para uso farmacéutico se conocen en la técnica.
A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar diversas realizaciones de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad. Por consiguiente, la descripción de un intervalo se debe considerar que describe específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6 tiene subintervalos descritos específicamente, tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como a los números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuadas en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de estas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.
Lípidos oxidados
La presente invención está dirigida a compuestos lipídicos oxidados para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis. Un lípido oxidado a utilizar según la invención es un compuesto que tiene una estructura según la Fórmula 4c:
o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
A2 está ausente o es CH2;
X1 es un alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono;
E está ausente o es una cadena de alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
F es hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y
Y es fosforilcolina o fosforiletanolamina.
En una realización de la Fórmula 4c, Y es fosforilcolina.
Cada átomo de carbono en la Fórmula 4c es un átomo de carbono quiral o no quiral, donde cada átomo de carbono quiral puede tener configuración S o configuración R.
En una realización, el lípido oxidado es 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina o 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina. Como se usa en esta invención, 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina y 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina son iguales y ambos se refieren al mismo compuesto, VB-201.
VB-201, según las realizaciones de esta solicitud puede ser un enantiómero quiral de 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina, es decir, el enantiómero (R) ((R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-sn-glicero-3-fosfocolina) o el enantiómero (S) ((S)-1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-sn-glicero-3-fosfocolina), o una mezcla de los mismos (por ejemplo, un racemato). En una realización, el fosfolípido oxidado es (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina. En algunas realizaciones, la (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una pureza enantiomérica de aproximadamente el 80 % de e.e. o más, por ejemplo, aproximadamente el 85 % de e.e., aproximadamente el 90 % de e.e., aproximadamente el 91 % de e.e., aproximadamente el 92 % de e.e., aproximadamente el 93 % de e.e., aproximadamente el 94 % de e.e., aproximadamente el 95 % de e.e., aproximadamente el 96 % de e.e., aproximadamente el 97 % de e.e., aproximadamente el 98 % de e.e., aproximadamente el 99 % de e.e., aproximadamente el 99,5 % de e.e. o más. En otras realizaciones, la (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una pureza enantiomérica de aproximadamente el 80 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 85 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 90 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 95 % de e.e. a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 80 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 85 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 90 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 95 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 %, o cualquier intervalo de los mismos.
En otras realizaciones, el lípido oxidado tiene la siguiente estructura:
En algunas realizaciones, un compuesto lipídico oxidado de la invención trata o previene la fibrosis hepática, la fibrosis renal o cualquier otra fibrosis descrita en esta invención tan bien como, o mejor que, telmisartán. En otras realizaciones, un compuesto lipídico oxidado de la invención reduce la fibrosis hepática, tan bien como, o mejor que, telmisartán. En otras realizaciones, un compuesto lipídico oxidado de la invención trata o previene la fibrosis renal tan bien como, o mejor que, telmisartán.
Se han descrito procedimientos para sintetizar lípidos oxidados de la invención, por ejemplo, en las publicaciones internacionales N.° WO 04/106486, WO 02/41827, y WO 2011/083469.
Composiciones farmacéuticas
El lípido oxidado de Fórmula 4c a usar según la invención se puede proporcionar en forma de una composición farmacéutica que comprende el lípido oxidado de la invención. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un lípido oxidado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del lípido oxidado. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del lípido oxidado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en esta invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de un lípido oxidado es una cantidad eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno de la presente invención. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía oral. La composición farmacéutica comprende un compuesto que tiene una estructura según la Fórmula 4c:
o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
A2 está ausente o es CH2;
X1 es un alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono;
E está ausente o es una cadena de alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
F es hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y
Y es fosforilcolina o fosforiletanolamina;
para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis.
En una realización de la Fórmula 4c, Y es fosforilcolina.
Cada átomo de carbono en la Fórmula 4c es un átomo de carbono quiral o no quiral, donde cada átomo de carbono
quiral puede tener configuración S o configuración R.
En otra realización, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butilglicero-3-fosfocolina o 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina (VB-201). En otra realización, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina. En algunas realizaciones, la (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una pureza enantiomérica de aproximadamente el 80 % de e.e. o más, por ejemplo, aproximadamente el 85 % de e.e., aproximadamente el 90 % de e.e., aproximadamente el 91 % de e.e., aproximadamente el 92 % de e.e., aproximadamente el 93 % de e.e., aproximadamente el 94 % de e.e., aproximadamente el 95 % de e.e., aproximadamente el 96 % de e.e., aproximadamente el 97 % de e.e., aproximadamente el 98 % de e.e., aproximadamente el 99 % de e.e., aproximadamente el 99,5 % de e.e. o más. En otras realizaciones, la (R)-1- hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una pureza enantiomérica de aproximadamente el 80 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 85 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 90 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 95 % de e.e. a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 80 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 85 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 90 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 95 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 %, o cualquier intervalo de los mismos.
En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un compuesto de la siguiente estructura:
En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un compuesto de la siguiente estructura:
En otras realizaciones, la composición farmacéutica trata o previene la fibrosis hepática, la fibrosis renal o cualquier otra fibrosis descrita en esta invención tan bien como, o mejor que, telmisartán. En otras realizaciones, la composición farmacéutica reduce la fibrosis hepática tan bien como, o mejor que, telmisartán. En otras realizaciones, la composición farmacéutica trata o previene la fibrosis renal tan bien como, o mejor que, telmisartán.
Tratamiento o prevención de la fibrosis
La invención se refiere a un compuesto de Fórmula 4c, o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis.
En algunas realizaciones de la invención, la fibrosis es fibrosis hepática o fibrosis renal. En otras realizaciones, la fibrosis es esteatohepatitis (enfermedad del hígado graso), particularmente enfermedad del hígado graso no alcohólico
(EHGNA) o esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En algunas realizaciones, la fibrosis es fibrosis hepática. En algunas realizaciones, la fibrosis es fibrosis renal. En algunas realizaciones, el sujeto que necesita tratamiento o prevención de la fibrosis renal tiene una enfermedad renal crónica.
En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis pulmonar idiopática. En otras realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis quística. En otras realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis masiva progresiva. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye cirrosis. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye esteatohepatitis (enfermedad del hígado graso). En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA). En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis endomiocárdica. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye infarto de miocardio. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis auricular. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis mediastínica. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye mielofibrosis. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis retroperitoneal. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye fibrosis sistémica nefrogénica. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye queloides. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye la enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye esclerodermia/esclerosis sistémica. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye artrofibrosis. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye la enfermedad de Peyronie. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye la contractura de Dupuytren. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye capsulitis adhesiva. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye glomeruloesclerosis focal y segmentaria. En algunas realizaciones, la fibrosis es una fibrosis que no incluye lesiones fibrosas o placas en las arterias.
En algunas realizaciones, el lípido oxidado trata o previene la fibrosis hepática, pero no altera la inflamación hepática.
En algunas realizaciones de la invención, la actividad de TLR2, TLR4 y/o CD14 se inhibe en una célula tratada. En algunas realizaciones, se inhibe la actividad de TLR2 y TLR4; se inhibe la actividad de TLR4 y CD14; se inhibe la actividad de TLR2 y CD14; o se inhibe la actividad de TLR2, TLR4 y CD14.
En algunas realizaciones de la invención, la esteatosis en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención no se reduce, en comparación con la de los sujetos no tratados o tratados con placebo. En otras realizaciones, la formación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuye, en comparación con la de los sujetos no tratados o tratados con placebo. En otras realizaciones, la formulación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención no disminuye, en comparación con la de los sujetos no tratados o tratados con placebo. En otras realizaciones, la esteatosis en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención no se reduce y la formación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuye, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo, respectivamente. En otras realizaciones, la esteatosis en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención no se reduce y la formación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención no disminuye, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo, respectivamente. En otras realizaciones, los macrófagos de tipo células espumosas disminuyen en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo. En algunas realizaciones, la formación lobulillar hepática y los macrófagos de tipo células espumosas en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuyen, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo, respectivamente. En algunas realizaciones, la inflamación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuye, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo. En algunas realizaciones, la inflamación lobulillar hepática y los macrófagos de tipo células espumosas en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuyen, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo, respectivamente. En algunas realizaciones, la formación lobulillar hepática, la inflamación lobulillar hepática y los macrófagos de tipo células espumosas en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuyen, en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo, respectivamente. En algunas realizaciones, la formación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuye en aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 % (por ejemplo, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, o cualquier intervalo entre los valores especificados) en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo. En algunas realizaciones, la formación de macrófagos de tipo células espumosas en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuye en aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 % (por ejemplo, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, o cualquier intervalo entre los valores especificados) en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo. En algunas realizaciones, la inflamación lobulillar hepática en un sujeto tratado con un lípido oxidado de la invención disminuye en aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 % (por ejemplo, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, o cualquier intervalo entre los valores especificados) en comparación con los sujetos no tratados o tratados con placebo.
El lípido oxidado a utilizar según la invención es un compuesto que tiene una estructura según la Fórmula 4c:
o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
A2 está ausente o es CH2;
X1 es un alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono;
E está ausente o es una cadena de alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
F es hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y
Y es fosforilcolina o fosforiletanolamina;
para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis.
En una realización de la Fórmula 4c, Y es fosforilcolina.
Cada átomo de carbono en la Fórmula 4c es un átomo de carbono quiral o no quiral, donde cada átomo de carbono quiral puede tener configuración S o configuración R.
En otra realización, el lípido oxidado es 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina o 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina (VB-201). En otra realización, el lípido oxidado es (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butilsn-glicero-3-fosfocolina. En algunas realizaciones, la (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una pureza enantiomérica de aproximadamente el 80 % de e.e. o más, por ejemplo, aproximadamente el 85 % de e.e., aproximadamente el 90 % de e.e., aproximadamente el 91 % de e.e., aproximadamente el 92 % de e.e., aproximadamente el 93 % de e.e., aproximadamente el 94 % de e.e., aproximadamente el 95 % de e.e., aproximadamente el 96 % de e.e., aproximadamente el 97 % de e.e., aproximadamente el 98 % de e.e., aproximadamente el 99 % de e.e., aproximadamente el 99,5 % de e.e. o más. En otras realizaciones, la (R)-1- hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una pureza enantiomérica de aproximadamente el 80 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 85 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 90 % de e.e. a aproximadamente el 100 % de e.e., de aproximadamente el 95 % de e.e. a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 80 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 85 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 90 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 % de e.e., de aproximadamente el 95 % de e.e. a aproximadamente el 99,5 %, o cualquier intervalo de los mismos.
En otras realizaciones, el lípido oxidado tiene la siguiente estructura:
En otras realizaciones, el lípido oxidado tiene la siguiente estructura:
En otras realizaciones, el compuesto lipídico oxidado trata o previene la fibrosis hepática, la fibrosis renal o cualquier otra fibrosis descrita en esta invención, tan bien como, o mejor que, telmisartán. En otras realizaciones, el compuesto lipídico oxidado reduce la fibrosis hepática tan bien como, o mejor que, telmisartán. En otras realizaciones, el compuesto lipídico oxidado trata o previene la fibrosis renal tan bien como, o mejor que, telmisartán.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero o un ser humano. En otras realizaciones, el ser humano es una mujer. En otras realizaciones, el ser humano es un hombre.
EJEMPLOS
Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención.
Ejemplo 1
VB-201 inhibe la señalización inducida por LPS (TLR4) en monocitos humanos (CD14+ primarios) Procedimientos y materiales
Aislamiento de monocitos
Se obtuvieron muestras de sangre venosa de donantes masculinos sanos según la Institutional Review Board en el Sheba Medical Center, Ramat Gan, Israel. Las PBMC se aislaron en Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) utilizando tubos Leucosep de 50 ml (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania). Las células se lavaron en PBS (Kibbutz Beit Haemek, Israel) y se incubaron a 4 °C durante 15 minutos en un tampón que contenía PBS y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5 % con microperlas de CD14 humano (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania).
Activación de células y transferencia de Western
Se pretrataron las células (106/ml) durante 20 min con VB-201 a las dosis indicadas en la figura 1, o con disolvente (Dis.) seguido de 15 min de activación con 100 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) o no se trataron (Sin tr.). Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía 1:100 de ditiotreitol (DTT), inhibidores de fosfatasa y proteasa (Thermo Scientific). Las muestras se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche al 5 % o BSA en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 h, seguido de incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Las membranas se desarrollaron utilizando un kit ECL (Thermo Scientific). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la inmunotransferencia:
Anticuerpos primarios: p-p38 (Cat. N.° 4511; 1:1000) y p-IKK (Cat. N.° 2697; 1:1000) eran de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). p-ERK1/2 (Cat. N.° M8159; 1:10000) se adquirió en Sigma (Israel). La aTubulina (Tub) o la proteína de choque térmico 90 (HSp90) sirvió como control de carga.
Anticuerpos secundarios: HRP anti-conejo de burro (1:5000) y HRP anti-ratón de cabra (1:3000) eran de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EE.UU.). HRP anti-cabra de burro (1:5000) era de Santa Cruz Biotechnology.
Resultados
Para determinar el efecto de VB-201 sobre las vías de señalización mediadas por TLR4, se preincubaron monocitos primarios humanos aislados (CD14+) con VB-201 y a continuación se activaron con LPS. Las figuras 1A-1D muestran que VB-201 inhibe la formación de p-IKK, p-ERK y p-p38 y p-AKT inducida por LPS en monocitos humanos de una manera dependiente de la dosis. Por consiguiente, VB-201 inhibe la señalización inducida por LPS (TLR4).
Ejemplo 2
VB-201 inhibe la señalización inducida por PGN (TLR2) en monocitos humanos (línea celular THP-1) Procedimientos y materiales
Activación de células y transferencia de Western
La línea celular monocítica THP-1 se adquirió de la Colección Americana de Cultivos de Tejidos Tipo (Cat. de la ATCC N.° TIB-202). Se pretrataron las células (106/ml) durante 20 min con VB-201 a las dosis indicadas en la figura 2, o con disolvente, seguido de activación con 20 pg/ml de peptidoglucano (PGN) (InvivoGen, San Diego, CA) durante 15 minutos, o no se trataron ("Sin tr."). Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía 1:100 de ditiotreitol (DTT), inhibidores de fosfatasa y proteasa (Thermo Scientific). Las muestras se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche al 5 % o BSA en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 h, seguido de incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Las membranas se desarrollaron utilizando un kit ECL (Thermo Scientific). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la inmunotransferencia:
Anticuerpos primarios: p-p38 (Cat. N.° 4511; 1:1000) y p-IKK (Cat. N.° 2697; 1:1000) eran de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). p-ERK1/2 (Cat. N.° M8159; 1:10000) se adquirió en Sigma (Israel). La aTubulina sirvió como control de carga.
Anticuerpos secundarios: HRP anti-conejo de burro (1:5000) y HRP anti-ratón de cabra (1:3000) eran de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EE.UU.). HRP anti-cabra de burro (1:5000) era de Santa Cruz Biotechnology.
Resultados
Las células THP-1 se trataron y se analizaron mediante transferencia de Western. Las figuras 2A-2B muestran que VB-201 inhibe la formación de p-IKK, p-ERK y p-p38 inducida por PGN en células THP-1. Por consiguiente, VB-201 inhibe la señalización inducida por PGN (TLR2).
Ejemplo 3
VB-201 inhibe la señalización inducida por MCP-1 en monocitos humanos (línea celular THP-1) Procedimientos y materiales
Activación de células y transferencia de Western
Se pretrataron células THP-1 (106/ml) durante 20 min con VB-201 a las dosis indicadas en la figura 4, o con disolvente, seguido de activación con 50 ng/ml de MCP1, o no se trataron ("Sin tr."). Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía 1:100 de ditiotreitol (DTT), inhibidores de fosfatasa y proteasa (Thermo Scientific). Las muestras se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado (Bio-Rad, Heme1Hempstead, Reino Unido) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche al 5 % o BSA en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 h, seguido de incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Las membranas se desarrollaron utilizando un kit ECL (Thermo Scientific). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la inmunotransferencia:
Anticuerpos primarios: p-ERK1/2 (Cat. N.° M8159; 1:10000) se adquirió en Sigma (Israel). p-AKT (Cat. N.° 4060; 1:1000) se adquirió en Cell Signaling Technology (Danvers, MA). La aTubulina sirvió como control de carga y se adquirió en Sigma (Israel).
Anticuerpos secundarios: HRP anti-conejo de burro (1:5000) y HRP anti-ratón de cabra (1:3000) eran de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EE.UU.). HRP anti-cabra de burro (1:5000) era de Santa Cruz Biotechnology.
Resultados
La figura 3 muestra que VB-201 inhibe la formación de p-AKT y p-ERK inducida por MCP-1 en células THP-1. Por consiguiente, VB-201 inhibe la señalización inducida por MCP-1.
Ejemplo 4
VB-201 inhibe la migración inducida por quimiocinas de monocitos humanos (CD14+ primarios)
Procedimientos y materiales
Aislamiento de monocitos
Se obtuvieron muestras de sangre venosa de donantes masculinos sanos según la Institutional Review Board en el Sheba Medical Center, Ramat Gan, Israel. Las PBMC se aislaron en Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) utilizando tubos Leucosep de 50 ml (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania). Las células se lavaron en PBS (Kibbutz Beit Haemek, Israel) y se incubaron a 4 °C durante 15 minutos en un tampón que contenía PBS y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5 % con microperlas de CD14 humano (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania).
Activación de células y ensayo de transpocillos de migración celular
Se pretrataron las células (106/ml) durante 20 min con VB-201 a las dosis indicadas en la figura 5, o con disolvente (Dis.).
Para probar la migración celular inducida por quimiocinas, se disolvieron RANTES (100 ng/ml; Cat. N.° 300-06, PeproTech, Israel) y MCP-1 (50 ng/ml; Cat. N.° 300-04, PeproTech, Israel) en medio RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino (FBS) al 0,5 % y se colocaron en la cámara inferior de placas de ensayo de migración QCM de 24 pocillos y poros de 5 mm (Corning-Costar, Corning, NY). Se sembraron células (3 x 105) en la cámara superior y se incubaron durante 2-4 horas. Posteriormente, se determinó el número de células que migraron al compartimento inferior mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Resultados
Los monocitos humanos se trataron y se analizaron para determinar la migración celular mediante un ensayo de transpocillos. La figura 4 muestra que VB-201 inhibe la migración inducida por quimiocinas de monocitos humanos (CD14+ primarios).
Ejemplo 5
VB-201 inhibe la migración inducida por SDF1 en monocitos humanos (línea celular THP-1)
Procedimientos y materiales
Se pretrataron células THP-1 (106/ml) durante 20 min con VB-201 o con disolvente (Dis.). Para probar la migración celular inducida por quimiocinas, se disolvieron RANTES (100 ng/ml, Cat. N.° 300-06) (PeproTech, Israel) y MCP-1 (50 ng/ml, Cat. N.° 300-04) (PeproTech, Israel) en medio RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino (FBS) al 0,5 % y se colocaron en la cámara inferior de placas de ensayo de migración QCM de 24 pocillos y poros de 5 mm (Corning-Costar, Corning, NY). Se sembraron células (3 x 105) en la cámara superior y se incubaron durante 2-4 horas. Posteriormente, se determinó el número de células que migraron al compartimento inferior mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Resultados
La figura 5 muestra que VB-201 inhibe la migración inducida por SDF1 de monocitos humanos (línea celular THP-1). Ejemplo 6
VB-201 inhibe la señalización inducida por RANTES en monocitos humanos (CD14+ primarios)
Se obtuvieron, se trataron y se analizaron monocitos humanos mediante transferencia de Western como se ha descrito en el Ejemplo 1 y la figura 6, excepto que las células se indujeron con RANTES (100 ng/ml; Cat. N.° 300-06, PeproTech, Israel) durante 15 minutos. La figura 6 muestra que VB-201 inhibe la formación de p-ERK inducida por RANTES en monocitos humanos. Por consiguiente, VB-201 inhibe la señalización inducida por RANTES.
Ejemplo 7
VB-201 inhibe los niveles de IL-12p40 en monocitos humanos (CD14+ primarios), estimulados por LPS (a través de TLR4) o Pam3CSK4 (a través de TLR2)
Procedimientos y materiales
Se sembraron monocitos humanos (106/ml) y se pretrataron durante 1 hora con VB-201 seguido de activación de 24 horas con 100 ng/ml de LPS de la cepa 055:B5 de Escherichia coli (Sigma, Israel) (figura 7A) o 300 ng/ml de Pam3CSK4 (InvivoGen, San Diego, CA, EE.UU.) (figura 7B) para inducir la producción de citocinas. A continuación,
se midió la concentración de IL-12/23p40 en el sobrenadante mediante ELISA (R&D systems, Cat. N.° DY1240). Las células activadas con disolvente (etanol al 0,5 % en PBS) se utilizaron como control.
Resultados
Las figuras 7A-7B muestran que VB-201 inhibe la secreción de IL-12p40 por monocitos humanos estimulados con LPS (TLR4) y estimulados con Pam3CSK4 (TLR2) (CD14+ primarios).
Ejemplo 8
VB-201 inhibe la unión de LPS por monocitos humanos (CD14+ primarios)
Procedimientos y materiales
Aislamiento de monocitos
Se obtuvieron muestras de sangre venosa de donantes masculinos sanos según la Institutional Review Board en el Sheba Medical Center, Ramat Gan, Israel. Las PBMC se aislaron en Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) utilizando tubos Leucosep de 50 ml (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania). Las células se lavaron en PBS (Kibbutz Beit Haemek, Israel) y se incubaron a 4 °C durante 15 minutos en un tampón que contenía PBS y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5 % con microperlas de CD14 humano (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania).
Ensayo de inhibición de la unión a LPS
Para evaluar la interferencia con la unión a lipopolisacárido (LPS), se incubaron VB-201 durante 20 minutos con células (106/ml), después de lo cual se añadieron 100 ng/ml de biotina-LPS (InvivoGen) durante 15 minutos adicionales, en su totalidad a 4 °C. Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron en un dispositivo FACS-Calibur.
La figura 8 muestra que VB-201 inhibió la unión a monocitos humanos (CD14+ primarios) de LPS con una CI50 de ~7 |jg/ml.
Ejemplo 9
VB-201 inhibe la secreción de IL-6 en células dendríticas derivadas de monocitos estimuladas con LPS (TLR4) (CD derivadas de Mo)
Procedimientos y materiales
Para generar CD derivadas de monocitos (CD derivadas de Mo), los monocitos CD14+ se contaron, se lavaron y se sembraron (106/ml) en medio que contenía RPMI-1640, L-glutamina, p-mercaptoetanol, suero fetal de ternero al 10 % (FCS), piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, HEPES 0,01 M, antibióticos (penicilina, estreptomicina), 50 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humanos (GMCSF) y 20 ng/ml de IL-4 humana (ambos de PeproTech Asia, Israel). El medio se reemplazó cada 2-3 días. Las Mo-CD se recogieron 5-6 días después del cultivo, se contaron y se sembraron (106/ ml). Las células se pretrataron durante 1 hora con VB-201, seguido de 24 horas de activación con 100 ng/ml de LPS de la cepa 055:B5 de Escherichia coli (Sigma, Israel) para inducir la producción de citocinas. La concentración de IL-6 (figura 9) en el sobrenadante se midió mediante ELISA (R&D systems, Cat. N.° DY206). Las células activadas con disolvente (etanol al 0,5 % en PBS) se utilizaron como control.
Resultados
La figura 9 muestra que VB-201 inhibe la secreción de IL-6 en CD derivadas de Mo estimuladas con LPS (TLR4). Ejemplo 10
VB-201 inhibe la secreción de IL-12p40 en CD derivadas de Mo estimuladas por LPS (TLR4)
Se obtuvieron, se trataron y analizaron CD derivadas de Mo mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 9 y la figura 10, excepto que la concentración de IL-12p40 en el sobrenadante se midió mediante ELISA (R&D systems, Cat. N.° DY1240). La figura 10 muestra que VB-201 inhibe la secreción de IL-12p40 en DC derivadas de Mo estimuladas con LPS (TLR4).
Ejemplo 11
Efecto de VB-201 sobre la inflamación y la fibrosis hepática
Procedimientos y materiales
Inducción de EHGNA y fibrosis hepática
Los ratones macho recién nacidos expuestos a dosis bajas de estreptozotocina (STZ) desarrollan esteatosis hepática con diabetes. La dieta continua rica en grasas (HFD) aumenta la inflamación lobulillar con macrófagos de tipo células espumosas, mostrando la patología de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). Se indujo EHNA en 40 ratones macho mediante una única inyección subcutánea de 200 |jg por ratón de STZ dos días después del nacimiento y con una alimentación HFD [57 % de kcal de grasa]) a partir de las cuatro semanas de edad. Se administraron una vez al día durante tres semanas vehículo, VB-201 (4 mg/kg) o telmisartán (10 mg/kg) como control positivo a partir de las seis semanas de edad. Los ratones se sacrificaron a las nueve semanas de edad.
Evaluación de la esteatohepatitis y la fibrosis
Se usó la patología hepática para determinar el efecto de VB-201 sobre la inflamación y la fibrosis hepática. Los portaobjetos de histología se tiñeron con hematoxilina/eosina (H&E) para evaluar la inflamación. La puntuación de inflamación se determinó de la siguiente manera:
0 - sin focos inflamatorios
1 - <2 focos inflamatorios
2 - 2-4 focos inflamatorios
3 - >4 focos inflamatorios
Se tiñeron los portaobjetos de histología con rojo Sirio para determinar el contenido de colágeno como marcador de la extensión de la fibrosis.
Resultados
Se probaron los efectos de VB-201 sobre la inflamación y la fibrosis del hígado en un modelo de ratón con EHNA. Las figuras 11A-11B muestran que la inducción de la enfermedad dio como resultado una inflamación notable en el hígado de los ratones tratados con vehículo. El tratamiento con VB-201 redujo significativamente la inflamación en un 65 %. La administración con el control positivo telmisartán redujo significativamente la inflamación hepática en un 77 %. Las figuras 12A-12B muestran que la inducción de enfermedad en el Ejemplo 11 también dio como resultado aumentos notables en el área de fibrosis en el hígado de los ratones tratados con vehículo. Los resultados de las figuras 12A-12B demuestran que VB-201 disminuyó significativamente la extensión de la fibrosis (en aproximadamente un 34 %) en comparación con los ratones tratados con vehículo.
Ejemplo 12
Efecto de VB-201 sobre la glomeruloesclerosis focal y segmentaria
Procedimientos y materiales
Animales y protocolo experimental
Se alojaron 2-3 ratas macho Sprague Dawley (SD) (Harlan Laboratories, Israel) con un peso inicial de 200 g por jaula en jaulas IVC en una instalación para animales de HVAC (calefacción, ventilación, aire acondicionado) dedicada. La instalación no tuvo exposición a la luz exterior y se mantuvo en ciclos alternos automáticos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Se proporcionó a los animales una dieta comercial para roedores (Dieta para ratas/ratones Harlan Teklad TRM) ad libitum y se les permitió el libre acceso al agua esterilizada en autoclave, suministrada a cada jaula a través de botellas de polisulfona con tubos para sorber de acero inoxidable. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Animal Care and Use Committee of Israel (IL-13-03-027).
Inducción de enfermedad renal crónica por nefrectomía 5/6
Las ratas se dividieron en tres grupos: (1) Ratas sanas (n = 3) en el grupo A, (2) grupo simulado - sometido a un proceso quirúrgico pero sin reducción de la masa renal (n = 3) en el grupo B, y (3) el resto fueron inducidos por insuficiencia renal crónica (n = 24). La insuficiencia renal crónica fue inducida por una nefrectomía en dos etapas (5/6) (Nx), con sustracción en primer lugar de aproximadamente 2/3 del riñón izquierdo mediante una incisión en el costado izquierdo y, una semana después, la extirpación completa del riñón derecho. La anestesia general consistió en una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilazina (0,85 ml de ketamina 0,15 ml de xilazina por cada ml de preparación; se inyectó I.P. 1 jl/g de PC).
Grupos experimentales
Una semana después de la segunda cirugía, las ratas se asignaron al azar a los siguientes grupos experimentales: Sanos, con administración por vía oral de vehículo - PBS 0,5 % de etanol (n = 3);
Operadas simuladamente, con administración por vía oral de vehículo - PBS 0,5 % de etanol (n = 3);
Nefrectomizadas, con administración por vía oral de vehículo - PBS 0,5 % de etanol (n = 8);
Nefrectomizadas, con administración por vía oral de VB-201 a 4 mg/kg (n = 8); y
Nefrectomizadas, con administración por vía oral de telmisartán a 10 mg/kg como control positivo (n = 8).
Se controló el peso corporal (PC) durante todo el estudio y las ratas se trataron mediante sonda oral según su peso corporal durante 7 semanas. Las ratas se sacrificaron mediante inhalación de CO28 semanas a partir de la extirpación del riñón derecho (2a cirugía).
Extracción de riñones
Tras el sacrificio, a las 8 semanas, se extrajeron los riñones, se pesaron y se fijaron en formaldehído al 4 %.
Morfología renal y análisis morfométrico
Para la microscopía óptica, se tiñeron portaobjetos de tejido de 4 pm incluidos en parafina con reactivo de ácido periódico de Schiff (PAS).
Índice de esclerosis glomerular. La glomeruloesclerosis se evaluó mediante secciones teñidas con PAS utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo. La extensión de la glomeruloesclerosis se evaluó examinando la mayor parte de 100 glomérulos seleccionados al azar con un aumento de x400 y aplicando un sistema de puntuación según el porcentaje de área glomerular esclerosada. La puntuación se calificó de 0 a 4: (0 = 0 % del área; 1 = 1-25 %; 2 = 26 50 %, 3 = 51-75 %, 4 = 76 % y superior). Se presentó la media de todos los glomérulos puntuados. Además, la extensión de la glomeruloesclerosis global y segmentaria se evaluó en los mismos glomérulos, donde <80 % de la esclerosis se denominó segmentaria y >80 % se denominó global.
Área glomerular. El área glomerular de la mayor parte de los 100 glomérulos seleccionados al azar a un aumento de x100 se cuantificó contando los cuadrados cubiertos por el área de los glomérulos utilizando una cuadrícula y se calculó el área media de los glomérulos.
Inmunohistoquímica. Los tejidos renales se fijaron en formaldehído al 4 % y se incluyeron en parafina. A continuación, se cortaron los tejidos incluidos en parafina para formar portaobjetos de tejido de 4 pm. Se analizó la inmunohistoquímica de los portaobjetos de tejido incluidos en parafina usando anticuerpos en la siguiente concentración: ratón monoclonal anti CD-68 de rata (ED-1, Serotec MCA341) 1:25. Para la cuantificación de la tinción de CD68+ intersticial, se contó el número de células positivas en 20 campos no superpuestos seleccionados al azar por animal, y se presentó el valor medio.
PCR en tiempo real. El ARN de riñón se extrajo con un kit RNeasy Fibrous Tissue Mini (Qiagen) y después del tratamiento con ADNasa I, se sintetizó ADNc monocatenario a partir de 2 pg de ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc qScript (Quanta Biosciences) y se diluyó para el análisis por PCR en tiempo real. La expresión de colágeno 4a, fibronectina y TGFp se cuantificó utilizando el sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems). El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante utilizando los cebadores (ID de ensayo) representados en la siguiente tabla proporcionada por Applied Biosystems. Los datos se normalizaron con respecto a la proteína de unión a la caja TATA (TBP) del gen de referencia y se presentaron como niveles de ARNm relativos en comparación con el tratamiento con Simulación PBS 0,5 % de Et. (Tabla 1).
Tabla 1: Referencias de ex resión enética
Estadísticas
Los datos se expresan como medias ± SEM. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional o prueba t de Student cuando fue apropiado. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Sigma Stat.
Resultados
Efecto del tratamiento VB-201 sobre el daño glomerular
Se evaluó la extensión de la fibrosis de los glomérulos mediante la puntuación y el cálculo del porcentaje de glomérulos con esclerosis segmentaria, esclerosis global y la suma de glomérulos escleróticos globales y segmentarios. Además, se calculó el área de los glomérulos y se calculó el porcentaje de glomérulos hipertrofiados. Los glomérulos dañados incluyeron glomérulos hipertrofiados (al menos x1,5 del área normal) o glomérulos escleróticos.
El tratamiento con VB-201 y telmisartán redujo significativamente los glomérulos dañados en un 29 % (p = 0,01) y un 31 % (p<0,005), respectivamente (figura 13). Se contribuyó parcialmente a este efecto por la reducción de la hipertrofia de los glomérulos. La principal contribución a la reducción del daño de los glomérulos se debió a la reducción de los glomérulos escleróticos. El tratamiento con VB-201 y telmisartán dio como resultado una reducción del 34 % (p <0,05) y del 57 % (p<0,005) de los glomérulos escleróticos, respectivamente (figura 14, Tabla 2).
Tabla 2: Efecto de VB-201 sobre la esclerosis lomerular media±E.E. *
La figura 15 muestra cambios escleróticos típicos en los glomérulos (tinción con PAS) de animales nefrectomizados tratados con vehículo en contraste con animales sanos o operados simuladamente o con animales tratados con VB-201 o animales tratados con telmisartán.
Efecto del tratamiento con VB-201 sobre la infiltración de monocitos/macrófagos glomerulares e intersticiales Se evaluó el número de monocitos/macrófagos que se infiltraron en los glomérulos 8 semanas después de la cirugía. (ED-1/CD68+) fueron significativamente (p<0,001) mayores en 11 o 4 veces, respectivamente, en ratas nefrectomizadas tratadas con vehículo (3,669±0,324), en contraste con animales sanos (0,320±0,040) u operados simuladamente (0,880±0,139). El tratamiento con VB-201 redujo significativamente (p = 0,008) el número de monocitos/macrófagos glomerulares en un 42 % (2,113±0,374) en comparación con los observados para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et. Los animales tratados con telmisartán tuvieron una reducción no significativa del 13 % (3,185±0,427) en comparación con los observados para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et. (figura 16A, 16C y Tabla 3).
Tabla
El número de monocitos/macrófagos intersticiales examinados 8 semanas después de la cirugía (ED-1/CD68+) fue significativamente (p = 0,005) mayor en 7 o 6 veces, respectivamente, en ratas nefrectomizadas tratadas con vehículo (527,9±72,93), en contraste con animales sanos (79,0±7,77) u operados simuladamente (86,67±16,18). El tratamiento con VB-201 redujo significativamente (p <0,005) el número de monocitos/macrófagos intersticiales en un 49 % (269,25±25,41) en comparación con los observados para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et. El tratamiento con telmisartán redujo el número de monocitos/macrófagos intersticiales en un 20 % (421,0±61,77) en comparación con los observados para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et. (figura 16B y Tabla 3).
Efecto del tratamiento con VB-201 sobre los marcadores profibróticos
La expresión de ARNm de colágeno IV aumentó significativamente en 7 u 8 veces, respectivamente, en ratas nefrectomizadas tratadas con vehículo (7,5±1,51), en contraste con animales sanos (1,1±0,12) u operados simuladamente (1,0±0,32). El tratamiento con VB-201 redujo significativamente (p <0,05) la expresión de colágeno IV en un 42 % (4,3±0,33) en comparación con lo observado para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et. Se observó una reducción del 41 % en la expresión de colágeno IV en las ratas nefrectomizadas tratadas con telmisartán (4,4±0,23) en comparación con lo observado para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et., con significación marginal (p = 0,064) (figura 17A).
La expresión de ARNm de TGF-p aumentó significativamente en 10 u 8 veces, respectivamente, en ratas nefrectomizadas tratadas con vehículo (8,4±0,49), en contraste con animales sanos (0,9±0,24) u operados simuladamente (1,0±0,23) (p<0,001). El tratamiento con VB-201 y telmisartán redujo significativamente (p<0,001) la expresión de TGF-p en un 37 % (5,3±0,33) y un 44 % (4,7±0,52), respectivamente, en comparación con lo observado para el tratamiento con Nx PBS 0,5 % de Et. (figura 17B).
Ejemplo 13
VB-201 inhibe la expresión de IL-12/23p40 en hígados de ratones inducidos por EHNA
A ratones inducidos por EHNA se les administró por vía oral VB-201 a una dosis de 4 mg/kg o telmisartán a una dosis de 10 mg/kg una vez al día desde la Semana 6 a la Semana 9. Se preparó ARN a partir de hígados de ratones normales y ratones inducidos por EHNA tratados con vehículo, VB-201 o telmisartán, usando el kit RNeasy mini (Qiagen). Para la preparación de ADNc, se combinaron 2 |jg de ARN con la mezcla de reacción qScript y la transcriptasa inversa qScript (Quanta BioSciences) durante 5 min a 22 °C y a continuación durante 30 min a 42 °C. La reacción se terminó mediante incubación durante 5 minutos más a 85 °C. Todas las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems). Se realizó un análisis por Q-PCR con conjuntos de sonda con cebador para IL-12/23p40 de ratón (Applied Biosystems). Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de ARN.
La figura 18 muestra que VB-201 inhibe la expresión de IL-12/23p40 en hígados de ratones inducidos por EHNA. El análisis de IL-12/23p40 en los hígados de ratones inducidos por EHNA muestra que VB-201 atenuó significativamente la expresión de IL-12/23p40.
Claims (15)
1. Un compuesto que tiene una estructura según la Fórmula 4c:
o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
A2 está ausente o es CH2;
X1 es un alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono;
E está ausente o es una cadena de alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
F es hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y
Y es fosforilcolina o fosforiletanolamina;
para su uso en el tratamiento o prevención de la fibrosis, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática, fibrosis renal o esteatohepatitis.
2. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, donde Y es fosforilcolina.
3. El compuesto para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde dicho compuesto es 1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-glicero-3-fosfocolina.
4. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicho compuesto es (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxibutil)-sn-glicero-3-fosfocolina.
5. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho compuesto inhibe la actividad de TLR2, TLR4 o CD14.
6. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho compuesto inhibe la actividad de TLR2 y TLR4.
7. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho compuesto inhibe la actividad de TLR4 y CD14.
8. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho compuesto inhibe la actividad de TLR2 y CD14.
9. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho compuesto inhibe la actividad de TLR2, TLR4 y CD14.
10. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho compuesto inhibe la migración de monocitos.
11. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde dicha fibrosis es fibrosis hepática.
12. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde dicha fibrosis es fibrosis renal.
13. El compuesto para su uso según la reivindicación 12, donde dicha fibrosis renal es glomeruloesclerosis focal y segmentaria.
14. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde dicho compuesto se administra a un mamífero.
15. El compuesto para su uso según la reivindicación 14, donde dicho compuesto se administra a un ser humano.
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