ES2843204T3 - Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso - Google Patents
Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso Download PDFInfo
- Publication number
- ES2843204T3 ES2843204T3 ES19152573T ES19152573T ES2843204T3 ES 2843204 T3 ES2843204 T3 ES 2843204T3 ES 19152573 T ES19152573 T ES 19152573T ES 19152573 T ES19152573 T ES 19152573T ES 2843204 T3 ES2843204 T3 ES 2843204T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- zearalenone
- zen
- amino acid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N zearalenone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N 0.000 title claims abstract description 179
- MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N trans-Zearalenon Natural products O=C1OC(C)CCCC(=O)CCCC=CC2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 124
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 109
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 19
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 16
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 claims description 14
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 claims description 14
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 6
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 claims description 4
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 claims description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 102220493139 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating_F32Y_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220470959 Amiloride-sensitive sodium channel subunit delta_D22A_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220579739 Cohesin subunit SA-1_S51D_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220518654 Enhancer of filamentation 1_R31A_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220615310 RIB43A-like with coiled-coils protein 2_V43T_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220559475 Transmembrane protein 207_L57V_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220415904 c.104G>A Human genes 0.000 claims description 2
- 102220362271 c.137T>A Human genes 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 2
- 102200115278 rs121918085 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200060761 rs121918667 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220039969 rs138542210 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220245300 rs1404795980 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220276898 rs1553350175 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220273027 rs1555734913 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220011641 rs201315884 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220164107 rs201867379 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200026976 rs35086888 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220023191 rs387907511 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200058101 rs63750592 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220057257 rs730881170 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220321659 rs775267971 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220085632 rs777158919 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220149728 rs886061035 Human genes 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 102200067010 rs587621539 Human genes 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 21
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 10
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- -1 For example Substances 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010067572 Oestrogenic effect Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- APJDQUGPCJRQRJ-LBPRGKRZSA-N Zearalanone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 APJDQUGPCJRQRJ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 2
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 239000003008 fumonisin Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 229960002300 zeranol Drugs 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241001346367 Apiotrichum mycotoxinivorans Species 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101000894568 Catharanthus roseus Catharanthine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 229920001268 Cholestyramine Polymers 0.000 description 1
- 241001149472 Clonostachys rosea Species 0.000 description 1
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 102000005486 Epoxide hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 108020002908 Epoxide hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000896533 Gliocladium Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 1
- 102220491472 Matrix metalloproteinase-23_F84Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000187653 Nocardia globerula Species 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 1
- 241001464989 Rhodococcus globerulus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000693619 Starmerella bombicola Lactone esterase Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187439 Streptomyces exfoliatus Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- APJDQUGPCJRQRJ-UHFFFAOYSA-N Zearalanone Natural products O=C1OC(C)CCCC(=O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 APJDQUGPCJRQRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- FPQFYIAXQDXNOR-QDKLYSGJSA-N alpha-Zearalenol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@H](O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 FPQFYIAXQDXNOR-QDKLYSGJSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000012216 bentonite Nutrition 0.000 description 1
- DWTTZBARDOXEAM-JSGCOSHPSA-N beta-Zearalanol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@@H](O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 DWTTZBARDOXEAM-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- FPQFYIAXQDXNOR-PMRAARRBSA-N beta-Zearalenol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@@H](O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 FPQFYIAXQDXNOR-PMRAARRBSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N deoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N 0.000 description 1
- 229930002954 deoxynivalenol Natural products 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229930183344 ochratoxin Natural products 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N vomitoxin hydrate Natural products OCC12C(O)C(=O)C(C)=CC1OC1C(O)CC2(C)C11CO1 LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
- A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
- A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
- Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Physiology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona por medio de un polipéptido que disocia hidrolíticamente, caracterizado porque se hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona mediante el polipéptido, que es una hidrolasa con una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID nº 13 o una variante funcional de la misma, en donde hay una identidad de secuencia de al menos el 70% entre la variante funcional y la secuencia de aminoácidos.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso
La presente invención se refiere a un procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de al menos un derivado de zearalenona con un polipéptido, así como un aditivo que contiene un polipéptido de ese tipo y también a un uso de un polipéptido de ese tipo.
Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos. Un representante importante de las mismas es la zearalenona (ZEN), difundida por todo el mundo, anteriormente conocida como toxina F-2, que es producida por una pluralidad de hongos del género Fusarium. Estos hongos infectan, entre otros, plantas de cultivo tales como distintos tipos de cereales, manifestándose la micosis del hongo por norma general antes de la cosecha, en donde el crecimiento del hongo o bien la producción de micotoxinas puede tener lugar antes y/o, en el caso de un almacenamiento no apropiado, también después de la cosecha. La FAO estima que el 25% de los productos agrícolas en todo el mundo están contaminados con micotoxinas, lo que provoca pérdidas económicas considerables. En un estudio global realizado recientemente, se analizaron un total de 23.781 muestras entre enero de 2009 y diciembre de 2011, con un 81% de pruebas positivas para al menos una micotoxina y un 45% positivas para ZEN. ZEN se puede encontrar en todas las regiones del mundo, así como en todas las clases de cereales y alimentos para animales analizados, como maíz, harina de soja, trigo, salvado de trigo, DDGS (granos secos de destilería con solubles) y en mezclas de alimentos para animales ya preparados con una frecuencia de hasta el 100%.
ZEN es una lactona macrocíclica, estrogénica, no esteroidea, sintetizada a través de la vía metabólica de los policétidos, con la fórmula estructural:
y el nombre de la nomenclatura IUPAC (2E,11S)-15,17-dihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-I (18),2,14,16-tetraeno-7,13-diona.
Sin embargo, también se encuentran en la naturaleza una gran cantidad de derivados de ZEN, que están formados por modificaciones enzimáticas o químicas de ZEN. Ejemplos de los mismos son conjugados de ZEN glucosídicos o que contienen sulfato, que se forman en hongos, plantas o el metabolismo de mamíferos, así como metabolitos de ZEN, que se forman en el organismo humano o animal, entre otros. A continuación, por derivados de ZEN se entienden conjugados de ZEN o metabolitos de ZEN que se presentan en la naturaleza o están preparados mediante síntesis química o bioquímica, pero en especial a-zearalenol (a-ZEL; (2E,7R,11 S)-7,15,17-trihidroxi-11 -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),2,14,16-tetraen-13-ona), p-zearalenol (p-ZEL; (2E,7S,11 S)-7,15,17-trihidroxi-11 -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),2,14,16-tetraen-13-ona), a-zearalanol (a-ZAL; (7R,11 S)-7,15,17-trihidroxi-I I -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),14,16-trien-13-ona), p-zearalanol (p-ZAL; (7S,11 S)-7,15,17-trihidroxi-11 -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (14),15,17-trien-13-ona), zearalenon-14-sulfato (Z14S; [(2e , 11 S)-15-hidroxi-11 -metil-7,13-dioxo-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),2,14,16-tetraen-17-il]hidrogenosulfato), zearalenon-14-glucósido (Z14G; (2E,11 S)-15-hidroxi-11 -metil-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxi-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18)2,14,16-tetraeno-7,13-diona), así como zearalanona (ZAN; (11 S)-15,17-dihidroxi-11 -metil-12-oxa-biciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),14,16-trieno-7,13-diona).
ZEN, así como los derivados de ZEN, especialmente a-ZEL, p-ZEL, Z14S, a-ZAL, p-ZAL, Z14G y ZAN, pueden detectarse también, en virtud de su elevada estabilidad química y física, en alimentos o alimentos para animales procesados, tales como, p. ej., pan o cerveza.
ZEN se une al receptor de estrógenos y puede causar alteraciones hormonales, por lo que es absorbida inmediatamente después de la ingestión y se transforma en los mamíferos en los dos metabolitos estereoisoméricos a-ZEL y p-ZEL. En este caso, p. ej., a-ZEL, pero también a-ZAL o ZAN, tienen un efecto estrogénico mucho más fuerte que ZEN. Los derivados de ZEN conjugados a veces tienen una estrogenicidad menor que ZEN, pero a partir de estos derivados de ZEN se puede liberar de nuevo ZEN en el tracto digestivo.
Aunque ZEN tiene una toxicidad aguda relativamente baja y un valor de DL50 oral de hasta 20.000 mg/kg de peso corporal, en caso de una ingesta prolongada pueden aparecer efectos tóxicos subagudos y/o subcrónicos, como por ejemplo, efectos teratogénicos, carcinógenos, estrogénicos e inmunosupresores en animales o seres humanos. Los alimentos para animales contaminados con ZEN provocan trastornos del desarrollo en mamíferos, siendo los cerdos y, especialmente los animales jóvenes, extremadamente sensibles a ZEN. Concentraciones de ZEN en alimento para animales superiores a 0,5 ppm conducen a trastornos del desarrollo, p. ej., concentraciones superiores a 1,5 ppm pueden provocar hiperestrogenicidad en los cerdos y concentraciones de 12 ppm de ZEN se han hecho responsables
de abortos en el ganado vacuno. Dado que la zearalenona se absorbe rápidamente a través de las membranas mucosas, en particular a través de la mucosa gástrica pero también la oral, es necesaria una desactivación inmediata y, sobre todo, cuantitativa. Tan solo 30 minutos después de la administración oral de ZEN, ésta ya se puede detectar en la sangre. En este caso, el uso de enzimas aisladas tiene ventajas sobre los microorganismos, como una mayor actividad específica o un efecto más rápido. Debido a los efectos nocivos de ZEN, en la Unión Europea existen límites superiores de ZEN, que son vinculantes para los alimentos, así como recomendaciones para límites superiores de ZEN en los alimentos para animales (EC NO: 1881/2006).
La estrategia principal para reducir la contaminación de los alimentos o piensos con ZEN, es restringir el crecimiento de los hongos, por ejemplo, cumpliendo las "buenas prácticas agrícolas". Esto incluye, entre otras cosas, que las semillas estén exentas de agentes patógenos e infecciones con hongos, o que los productos de desecho agrícolas se eliminen a tiempo de los campos. Además, a través del uso de fungicidas se puede reducir el crecimiento de los hongos en el campo. Después de la cosecha, el material cosechado se debe almacenar con una humedad residual inferior al 15% y una temperatura baja para evitar el crecimiento de los hongos. Cualquier material contaminado por hongos también se debe eliminar antes de continuar con el tratamiento posterior. A pesar de esta lista de medidas, I. Rodriges y K. Naehrer (2012) informaron que incluso en regiones con los más altos estándares agrícolas, como Estados Unidos y Europa Central, en los años 2009 a 2011 el 29% o el 39%, respectivamente, de las muestras de maíz analizadas estaban contaminadas con ZEN.
Otras opciones para eliminar ZEN de los piensos o los alimentos son la adsorción o la transformación de la micotoxina. Para ello, es necesario que la unión de la micotoxina al adsorbente sea fuerte y específica en un intervalo amplio de pH y se conserve estable en la zona gastrointestinal durante todo el proceso digestivo. Aunque algunos agentes de adsorción no biológicos, p. ej., el carbón activado, los silicatos o los polímeros sintéticos, como la colestiramina, se pueden utilizar eficazmente para las aflatoxinas; su uso para otras micotoxinas está limitado. La principal desventaja de los agentes de adsorción es la unión inespecífica de otras moléculas, algunas de las cuales son esenciales para la alimentación. Los agentes de adsorción biológicos, p. ej., extractos de levadura o levadura también se describen en las publicaciones, pero tienen una limitación similar a la de los agentes de adsorción no biológicos.
La eliminación de la toxicidad de ZEN mediante tratamientos físicos y químicos también está limitada. Mediante un tratamiento térmico, ZEN no puede ser desactivada de manera efectiva, no obstante, el contenido en ZEN se puede reducir en un 83,9% mediante extrusión y tratamiento con agentes oxidantes, p. ej., durante 16 h a 80°C con una solución de peróxido de hidrógeno al 10%. El empleo de procedimientos de extrusión y agentes oxidantes, tales como ozono o peróxido de hidrógeno, en la preparación de piensos y alimentos está limitado en virtud de los elevados costes, la pérdida de calidad, la eficiencia parcialmente baja y la escasa especificidad.
También la biotransformación de ZEN mediante microorganismos tales como, p. ej., cepas de Trichosporon mycotoxinivorans, Gliocladium roseumo Bacillus subtilis o enzimas aisladas a partir de las mismas, tales como hidrolasas o peroxidasas, se ha descrito, p. ej., en E. Vekiru et al., en Appl. and Environ, Microb. 2010, 76, 7, 2353-2359.
A partir del documento EP 0938575 B1 se han dado a conocer propiedades para la degradación de ZEN que poseen bacterias del género Rhodococcus y Nocardia, especialmente R. globerulus, R. erythropolis y N. globerula.
A partir del documento WO 02/076205 se puede deducir el efecto de degradación de ZEN a partir de enzimas aisladas a partir de Gliocladium roseum, entre otras la hidrolasa a/p, la zearalenona hidrolasa 1 (ZHD1), que catalizan la degradación de ZEN mediante una tríada catalítica.
A partir del documento WO 2012/113827 se extraen zonasas recombinantes, es decir, enzimas degradantes de ZEN, que permanecen estables en el tracto gastrointestinal, en particular se describen microorganismos tales como Thermobifidia fusca, Streptomyces exfoliatus, Acidovorans delafieldii y Streptomyces sp.
A partir de la base de datos UniProt del 16 de noviembre de 2011, "SubName: Full=Alpha/beta hydrolase fold containing protein {ECO:0000313|EMBL:AEM80235.1}", que se encuentra con el número de orden de EBI. UNIPROT :G2P9U4, se puede deducir una secuencia proteica de una hidrolasa a/p, pero sobre la que no se da ninguna información sobre sus posibles usos o propiedades.
Los polipéptidos o enzimas que son capaces de hidrolizar ZEN y/o al menos un derivado de ZEN, también se pueden denominar zonasas.
Los términos y expresiones utilizados a continuación se han tomado de la terminología técnica y se utilizan con los significados convencionales, a menos que se indique lo contrario. Por tanto, el término "polinucleótido" se refiere a cualquier tipo de material genético de cualquier longitud y secuencia, como p. ej., moléculas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario, incluyendo elementos reguladores, elementos estructurales, grupos de genes, plásmidos, genomas completos y fragmentos de los mismos. El término "polipéptido" incluye proteínas, como por ejemplo, enzimas, anticuerpos así como polipéptidos con hasta 500 aminoácidos, como por ejemplo, inhibidores de péptidos, dominios de proteínas, pero también polipéptidos cortos con longitudes de secuencia cortas, por ejemplo, menos de 10 aminoácidos, tales como receptores, ligandos, hormonas peptídicas, marcadores y similares El término "posición" en un polinucleótido o un polipéptido se refiere a una base o un aminoácido único y específico en la secuencia del polinucleótido o del polipéptido.
La presente invención tiene como objeto proporcionar un procedimiento con el que sea posible una disociación hidrolítica rápida y fiable de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN.
Para resolver esta tarea, la presente invención se caracteriza esencialmente porque la zearalenona y/o al menos un derivado de la zearalenona se hidroliza a través del polipéptido que es una hidrolasa con una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID n° 13, o una variante funcional de la misma, en donde una identidad de secuencia entre la variante funcional y la secuencia de aminoácidos, es de al menos el 70%.
La expresión "identidad de secuencia" de acuerdo con la presente invención, se refiere a un porcentaje de identidad de secuencia. Para las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos, la identidad de secuencia se puede determinar visualmente, pero preferiblemente se calcula con un programa informático. La comparación de secuencias también se lleva a cabo dentro de segmentos de una secuencia, entendiéndose que un segmento es una secuencia continua de la secuencia de referencia y que preferiblemente comprende una región conservada de la secuencia.
En el presente caso, la identidad de secuencia se determinó con la ayuda del programa NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), en particular con BLASTP para polipéptidos y BLASTN para polinucleótidos, que está disponible en la página principal del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este permite comparar dos o más secuencias entre sí según el algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Para los fines de esta invención, se utilizaron los programas con la versión del 15 de mayo de 2013. Como ajustes del programa se utilizó la configuración básica, pero en particular para la comparación de secuencias de aminoácidos: "secuencia diana máxima" = 100; "umbral esperado" = 10; "tamaño de palabra" = 3; "matriz" = BLOSOM62; "costes por hueco" = "Existencia: 11; Extensión: 1"; "ajuste informático" = "Ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional"; así como para la comparación de secuencias de nucleótidos, tamaño de palabra: 11; valor esperado: 10; costes por hueco: Existencia = 5, Extensión = 2; Filtro = baja complejidad activada; puntuaciones de coincidencia/no coincidencia: 2, -3; cadena de filtro: L; m.
Las expresiones "variante funcional del polipéptido" o "variante funcional" se refieren, por un lado, a "variantes alélicas" del polipéptido y a "fragmentos funcionales" del polipéptido, y por otro lado a una "modificación" del polipéptido, en donde la función enzimática permanece esencialmente sin alterar. La expresión "variante alélica" se refiere a un polipéptido que ha surgido por una o varias mutaciones de la secuencia de nucleótidos que ocurren de forma aleatoria en la naturaleza y que provocan un cambio en la secuencia de aminoácidos, sin que ello influya en la función enzimática. Las "modificaciones" pueden ser, por ejemplo, fusiones del extremo C-terminal o N-terminal con polipéptidos o polipéptidos mutados, en donde se pueden obtener mutaciones mediante sustitución, inserción o deleción de al menos un aminoácido, en particular mediante mutagénesis específica del sitio o mutagénesis aleatoria, recombinación y/o cualquier otro método de modificación genética de proteínas. Los términos sustitución, inserción y deleción se utilizan en el sentido habitual en la tecnología genética y con los que está familiarizado el experto en la materia. La expresión "fragmento funcional" se refiere a una parte o una secuencia parcial de un polipéptido o una parte o una secuencia parcial de una variante funcional del mismo, en donde se conserva esencialmente la función enzimática. Una función enzimática se conserva esencialmente cuando el mecanismo de reacción enzimática permanece sin cambios, es decir, la micotoxina se hidroliza en el mismo lugar y la actividad residual específica "variante funcional" asciende al menos al 5%, preferiblemente al menos al 10%, en particular al menos al 50%, con respecto al polipéptido original.
Mediante la elección de una secuencia de aminoácidos de ese tipo, o una variante funcional de la misma, se constató una hidrólisis sorprendentemente rápida y completa de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN.
Como corresponde a un desarrollo adicional preferido de la invención, la disociación hidrolítica se lleva a cabo con un polipéptido que contiene al menos un segmento de la secuencia de aminoácidos conservada o una variante funcional de la misma, en donde la variante funcional del segmento de secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos un 70%, preferiblemente al menos un 84%, más preferiblemente al menos un 92% y lo más preferiblemente al menos un 98% y al menos un segmento de secuencia de aminoácidos conservada se selecciona a partir del grupo de secuencias de aminoácidos 89 a 145, 223 a 228, 257 a 261, 263 a 270, de la secuencia con la secuencia ID n° 1. A través de la presencia de al menos uno de tales segmentos de secuencia de aminoácidos conservada, es posible proporcionar un polipéptido que, además de la hidrólisis rápida y completa de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN, también tiene un valor de actividad particularmente elevado, en comparación con los polipéptidos degradadores de ZEN conocidos hasta la fecha.
Se podrían lograr resultados igualmente buenos si la variante funcional mostrase al menos una modificación de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en una sustitución, deleción e inserción de uno o varios aminoácidos.
Dado que el polipéptido muestra una actividad específica de al menos 0,01 U/mg, preferiblemente al menos 0,1 U/mg, en particular al menos 1 U/mg; y/o un valor Km de disociación hidrolítica de ZEN de como máximo 50 pM, preferiblemente como máximo 3,5 pM, en particular como máximo 0,5 pM; y/o posee un valor kcat de disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,05 s-1, preferiblemente al menos 0,6 s-1, en particular al menos 5 s-1 y/o posee un valor vmáx de disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,00001 pM-1 s-1, preferiblemente al menos 0,0001 pM-1 s-1, en particular al menos 0,001 pM-1 s-1, ZEN y/o los derivados de ZEN se pueden hidrolizar, en particular eliminar la
toxicidad, de una manera particularmente rápida y completa.
El polipéptido se puede seleccionar de modo que sea una hidrolasa a/p adecuada para una disociación hidrolítica sin necesidad de oxígeno y exenta de cofactores, de la agrupación éster de zearalenona y/o de los derivados de ZEN, que presenta una tríada de aminoácidos que cataliza la disociación hidrolítica que consiste en serina, un aminoácido ácido seleccionado a partir de ácido glutámico y ácido aspártico, en particular ácido aspártico, así como histidina, y que es la tríada catalítica, por ejemplo, S128, D264 y H303, en donde el posicionamiento es con relación a la secuencia ID n° 1.
La hidrólisis de ZEN y de los derivados de ZEN se realiza con éxito con cada uno de los polipéptidos de secuencias ID n° 1 a 15, en el grupo éster de la zearalenona o de sus derivados, de acuerdo con el siguiente mecanismo de reacción:
La hidrólisis de ZEN para proporcionar zearalenona hidrolizada no tóxica (HZEN) o a derivados de ZEN hidrolizados, se lleva a cabo a través de los polipéptidos de acuerdo con la invención, en particular las hidrolasas a/p. La descarboxilación adicional de HZEN a ZEN descarboxilada, hidrolizada (DHZEN) o a derivados de ZEN hidrolizados, descarboxilados generalmente tiene lugar de forma espontánea.
En particular, es posible hidrolizar completamente ZEN y los derivados de ZEN por medio de la tríada catalítica mencionada anteriormente, en donde la reacción de degradación tiene una buena estabilidad frente al pH, en particular a valores de pH en el intervalo ácido.
Además, se ha encontrado que con un polipéptido que contiene en uno de los 3 aminoácidos antes de la serina y 3 aminoácidos después de la serina del segmento de secuencia que consiste en la tríada catalítica mencionada anteriormente, al menos un aminoácido polar seleccionado a partir de Y, Q, N, T, K , R, E, D y al menos un aminoácido no polar seleccionado a partir de F, M, L, I, V, A, G, P, se consiguen buenos resultados constantes y como mínimo también mejorar un parámetro de la cinética enzimática.
En un desarrollo adicional preferido de la invención, el procedimiento se lleva a cabo con un polipéptido que tiene al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia ID n° 1, en al menos una de las siguientes posiciones 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311,314, 317, 319, 321,323, 325 y 326.
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invención, el procedimiento se lleva a cabo con un polipéptido que tiene al menos una mutación seleccionada a partir del grupo: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29p, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P en la secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia ID n° 1. Con un polipéptido de ese tipo, ZEN se puede hidrolizar completamente, en particular perder la toxicidad, en poco tiempo, en donde la actividad específica del polipéptido es de al menos 6,00 U/mg, preferiblemente de al menos 7,00 U/mg, en particular de al menos 8,00 U/mg. La unidad "U" o también "unidad" es una medida de la actividad catalítica absoluta y se define por la hidrólisis de 1 pMol de ZEN por minuto a 32°C en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,2), en donde: por "actividad catalítica" se entiende la conversión enzimática de un sustrato en condiciones de reacción definidas y por "actividad específica" se entiende la relación entre la actividad catalítica y la concentración en masa de polipéptido (masa por unidad de volumen).
Finalmente, el polipéptido puede contener al menos una sustitución de aminoácidos conservadora en al menos una posición, en donde la sustitución de aminoácidos conservadora se selecciona a partir de sustituciones de G a A; o de A a G, S; o de V a I, L, A, T, S; o de I a V, L, M; o de L a I, M, V; o de M a L, I, V; o de P a A, S, N; o de F a Y, W, H; o de Y a F, W, H; o de W a Y, F, H; o de R a K, E, D; o de K a R, E, D; o de H a Q, N, S; o de D a N, E, K, R, Q; o de E a Q, D, K, R, N; o de S a T, A; o de T a S, V, A; o de C a S, T, A; o de N a D, Q, H, S; o de Q a E, N, H, K, R. En donde la denominación sustitución conservadora de aminoácidos se refiere a la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que un experto en la técnica considera conservadora, es decir, que tiene propiedades específicas
similares. Tales propiedades específicas son, por ejemplo, el tamaño, la polaridad, la hidrofobicidad, la carga o el valor pKa del aminoácido. Por mutación conservadora se entiende, por ejemplo, una sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido polar por otro aminoácido polar.
Con tales sustituciones conservadoras de aminoácidos, es posible preparar variantes polipeptídicas funcionales, cuya actividad específica es aproximadamente igual de fuerte que la del polipéptido original, pero preferiblemente aumenta en al menos 0,1 U/mg.
Al llevar a cabo el procedimiento de tal manera que el polipéptido se emplea en un aditivo que contiene un adyuvante para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona, para alimentos para animales para cerdos, aves de corral y acuicultura, en alimentos o granos secos de destilería con solubles, tiene lugar la conversión bioquímica de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN a ZEN hidrolizada y/o a un derivado de ZEN hidrolizado. El procedimiento también se puede usar, por ejemplo, para la hidrólisis estereoselectiva de ZEN y/o de derivados de ZEN en procesos industriales.
En un desarrollo adicional preferido de la invención, el procedimiento se desarrolla de tal manera que los aditivos se seleccionan al menos a partir de un vehículo inerte así como, dado el caso, de otros componentes como vitaminas y/o minerales y/o enzimas y/u otros componentes para eliminar la toxicidad de las micotoxinas. De esta forma se puede garantizar, por ejemplo, en piensos o alimentos, que las cantidades posiblemente contenidas de ZEN y/o derivados de ZEN se hidrolizan con seguridad, en particular dejan de ser tóxicas, hasta tal punto que no existe ningún efecto nocivo sobre el organismo del sujeto que ingiere ese pienso o alimento.
Para ello, también puede estar presente un polipéptido en una preparación enzimática que, además de contener al menos un polipéptido, también contiene al menos una enzima que está implicada, por ejemplo, en la degradación de proteínas, como por ejemplo, proteasas, o que está implicada en el metabolismo del almidón o de fibra o grasa o glucógeno, como por ejemplo, una amilasa, celulasa o glucanasa, así como, por ejemplo, hidrolasas, enzimas lipolíticas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, fitasas, xilanasas y/o combinaciones de las mismas.
Otras áreas de aplicación son preparaciones enzimáticas que, además de al menos un polipéptido, también contienen al menos un componente para eliminar la toxicidad de las micotoxinas, tal como una enzima que degrada micotoxinas, como por ejemplo, alfatoxina oxidasa, ergotamina hidrolasas, ergotamina amidasas, zearalenona esterasas, zearalenona lactonasas, ocratoxina amidasas, fumonisina carboxilesterasas, fumonisina aminotransferasas, aminopoliol aminoxidasas, desoxinivalenol epóxido hidrolasas; y/o al menos un microorganismo que degrada micotoxinas, como Bacillus subtilis; y/o que contienen al menos un componente que se une a las micotoxinas, por ejemplo, paredes celulares de microbios o materiales inorgánicos como bentonitas.
De acuerdo con un desarrollo adicional particularmente preferido de la invención, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que se emplea al menos un polipéptido en el aditivo en una concentración de como máximo 10.000 U/g, preferiblemente como máximo 1.000 U/g, más preferiblemente como máximo 100 U/g y lo más preferiblemente como máximo 10 U/g, con lo que es posible convertir rápidamente ZEN y/o derivados de z En en metabolitos no tóxicos o menos tóxicos, en particular HZEN y DHZEN, antes de su resorción en el organismo de un sujeto consumidor de pienso o alimentos contaminados, en particular un mamífero.
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invención, el aditivo está en forma encapsulada o recubierta, pudiéndose recurrir para la encapsulación o el recubrimiento a métodos convencionales, como se describen por ejemplo, en el documento WO 92/12645. Mediante la encapsulación o el recubrimiento se puede transportar el polipéptido a su lugar de uso sin cambios, en particular sin una degradación ni deterioro, de modo que el polipéptido solo comienza a actuar después de que la cubierta protectora se ha disuelto, por ejemplo, en el tracto digestivo de los animales, con lo cual se puede conseguir una degradación todavía más dirigida, rápida y completa de ZEN y/o de los derivados de ZEN, también en un medio ácido, rico en proteasas y anaerobio. Además, mediante la encapsulación o el recubrimiento se consigue aumentar la estabilidad térmica de los polipéptidos en el aditivo.
De acuerdo con un desarrollo adicional preferido, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que el polipéptido o el aditivo se mezcla con un alimento o pienso contaminado con zearalenona y/o con al menos un derivado de zearalenona, de manera que el alimento o el pienso contaminado entra en contacto con humedad, y el polipéptido o el aditivo hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona contenidos en el pienso o el alimento contaminado. En el caso de piensos o alimentos húmedos, tales como caldos fermentados o papillas, la hidrólisis de la zearalenona y/o del al menos un derivado de zearalenona tiene lugar antes de la ingestión oral del pienso o el alimento húmedo. Con este procedimiento se asegura que se eliminan en gran medida los efectos nocivos de la zearalenona y de los derivados de la zearalenona sobre los seres humanos y los animales. En este contexto, se entiende que humedad significa la presencia de agua o de líquidos con contenido en agua, estando incluidos entre ellos también, p. ej., la saliva u otros líquidos presentes en el tracto digestivo. Como tracto digestivo se define la cavidad bucal, la faringe (garganta), el esófago y el tracto gastrointestinal o equivalentes de los mismos, pudiéndose presentar diferentes denominaciones en el caso de animales o bien pudiendo no estar presentes componentes individuales en el tracto digestivo de animales.
El procedimiento inventivo también se puede llevar a cabo de tal manera que el pienso o el alimento se granula antes de la ingestión oral.
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invención, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que se hidroliza al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, en particular al menos el 90% de la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona. De este modo se pueden evitar efectos tóxicos subagudos y/o subcrónicos, tales como efectos teratogénicos, carcinógenos, estrogénicos e inmunosupresores en animales o seres humanos.
La presente invención tiene como objeto además el uso de un aditivo que contiene al menos un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID n° 13 o una variante funcional de las mismas, en donde una identidad de secuencia entre la variante funcional y la secuencia de aminoácidos es de al menos el 70%, para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona en piensos, en particular para cerdos, aves y acuicultura, en alimentos o en granos secos de destilería con solubles. Mediante el uso del aditivo de acuerdo con la invención, se consigue hidrolizar o eliminar la toxicidad de ZEN y/o de los derivados de ZEN contenidos en el alimento o pienso o en granos secos de destilería con solubles, en donde se produce una pérdida de toxicidad de este tipo ya con concentraciones de polipéptido de aproximadamente 1 U/g de pienso o alimento contaminado.
La invención se explica a continuación con mayor detalle con ayuda de ejemplos de realización, así como dibujos. En estos, se muestra:
Fig. 1, que no forma parte de la invención, la degradación a lo largo del tiempo de ZEN y el aumento de los metabolitos HZEN y DHZEN a través del polipéptido con la secuencia ID n° 1, en donde en la Fig. 1A el polipéptido no está marcado, en la Fig. 1B el polipéptido tiene un marcador 6xHis C-terminal y en la Fig. 1C un marcador 6xHis N-terminal,
Fig. 2, que no forma parte de la invención, la cinética de Michaelis-Menten del polipéptido con la secuencia ID n° 1.
Ejemplo 1: Modificación, clonación y expresión de polinucleótidos que codifican polipéptidos que pueden disociar hidrolíticamente ZEN y/o al menos un derivado de ZEN.
Las sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos se llevaron a cabo mediante una mutación de las secuencias de nucleótidos con una PCR, utilizando el "kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick-change" (Stratagene) siguiendo las instrucciones. Alternativamente, se obtuvieron también secuencias de nucleótidos completas (GeneArt). Las secuencias de nucleótidos generadas mediante mutagénesis con PCR u obtenidas en GeneArt contenían además opcionalmente un marcador 6xHis C-terminal o N-terminal a nivel de aminoácidos y se integraron mediante métodos convencionales en vectores de expresión para una expresión en E. coli o P. pastoris, se transformaron en E. coli o P. pastoris y se expresaron en E. coli o P. pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, segunda edición, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al.. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4a edición, Cold Spring Harbor), en donde para este estudio también se podía recurrir a cualquier otra célula hospedadora adecuada.
La expresión "vector de expresión" se refiere a una estructura artificial de ADN que es capaz de expresar un gen in vivo o in vitro. En particular, bajo esa denominación se entienden estructuras artificiales de ADN que son adecuadas para transferir la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido a la célula hospedadora, con el fin de integrarla allí en el genoma o dejarla libre en el espacio extracromosómico y expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de forma intracelular y, si es necesario, expulsar el polipéptido desde la célula.
La expresión "célula hospedadora" se refiere a todas las células que contienen o bien una secuencia de nucleótidos que se va a expresar o bien un vector de expresión y son capaces de producir un polipéptido de acuerdo con la invención. En particular, se entienden células procariotas y/o eucariotas, preferentemente P. pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, células vegetales y/o esporas de Bacillus, Trichoderma o Aspergillus.
El lisado celular soluble en el caso de E. coli o el material sobrenadante del cultivo en el caso de P. pastoris, se utilizaron para determinar las propiedades catalíticas de los polipéptidos. Para determinar el valor Km, vmáx, kcat y la actividad específica, los polipéptidos se enriquecieron selectivamente usando métodos convencionales de forma cromatográfica sobre columnas de níquel-sefarosa. La concentración de proteína se determinó usando métodos convencionales, ya fuera con el método BCA (Pierce BCA Protein Assay KitProd n° 23225), pero preferiblemente fotométricamente con los coeficientes de extinción específicos para las respectivas proteínas, que se calcularon con el programa "ProtParam" disponible en línea en http://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (compilador): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607).
Ejemplo 2: Determinación de la identidad de secuencia así como los segmentos de secuencias de aminoácidos conservados
La determinación del porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de toda longitud de los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos con las secuencias ID n° 1 a 15 relativamente entre sí (Tabla 1), se llevó a cabo con ayuda del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), en particular con BLASTP que está disponible en la página principal del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Con ello es posible
comparar dos o más secuencias entre sí según el algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402). Como ajustes del programa se recurrió a la configuración básica, pero en particular a “secuencia diana máx” = 100; “umbral esperado” = 10; “tamaño de la palabra” = 3; “matriz” = BLOSOM62; “costes por hueco” = “Existencia: 11; Extensión: 1”; “ajuste computacional” = “ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional”.
Para determinar los segmentos de secuencias de aminoácidos conservados, se determinaron los polipéptidos con las secuencias ID n° 1 a 6, que tenían una identidad de secuencia de al menos un 70% entre sí, utilizando el programa informático COBALT (J.S. Papadopoulos y R. Agarwala, 2007, COBALT: constraint-based alignment tool for multiple protein sequences, Bioinformatics 23:1073-79), utilizando los parámetros convencionales, en particular los parámetros (“Penalizaciones por hueco”: -11, -1; “Penalizaciones por hueco terminal”: -5, -1; “Uso de RPS BLAST” : activado; “valor Blast E” : 0,003; “Encontrar columnas conservadas y volver a calcular”: activado, “utilizar búsqueda de agrupaciones”: activado; “tamaño de la palabra” : 4; “distancia de posible agrupación”: 0,8; “Alfabeto”: regular; “Ajuste de la conversación de homologías”: 3 bits). El resultado de este análisis representa los aminoácidos conservados. Como segmentos de secuencias de aminoácidos conservados se definieron las siguientes regiones con al menos 5 aminoácidos conservados consecutivos, a saber, en relación con la secuencia ID n° 1, los segmentos A desde la posición 24 a la posición 50, B desde la posición 52 a la posición 77, C desde la posición 79 a la posición 87, D desde la posición 89 a la posición 145, E desde la posición 150 a la posición 171, F desde la posición 177 a la posición 193, G desde la posición 223 a la posición 228, H desde la posición 230 a la posición 237, I desde la posición 239 a la posición 247, J desde la posición 249 a la posición 255, K desde la posición 257 a la posición 261, L desde la posición 263 a la posición 270, M desde la posición 272 a la posición 279, N desde la posición 297 a la posición 301 y O desde la posición 303 a la posición 313.
Las determinaciones del porcentaje de identidad de secuencia de los polipéptidos entre sí y de los segmentos de secuencias de aminoácidos conservados de los polipéptidos individuales con respecto a los segmentos de secuencia de aminoácidos conservados de la secuencia ID n° 1, se llevaron a cabo a modo de ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2.
Tabla 1: Porcentaje de identidad de secuencia de los polipéptidos entre sí
Tabla 2: Porcentaje de identidad de secuencia de los segmentos de secuencia de aminoácidos conservados A a O.
Ejemplo 3: Hidrólisis de ZEN mediante polipéptidos en lisados celulares
Para determinar su capacidad para degradar ZEN en los metabolitos no tóxicos o menos tóxicos HZEN y DHZEN, se preparó el polipéptido con la secuencia ID n° 1, codificada por la secuencia de nucleótidos con el n° de secuencia ID 17, como tal y con un marcador 6xHis en el extremo C-terminal o N-terminal en E. coli, como se ha descrito en el Ejemplo 1. El polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la secuencia ID n° 13, que se codificaba con la secuencia de nucleótidos con la secuencia ID n° 29, se marcó con 6xHis solo en los extremos C-terminales. Se recogieron 100 ml de cada cultivo de E. coli con una densidad óptica (DO600 nm) de 2,0-2,5 mediante centrifugación a 4°C y se resuspendieron en 20 ml de medio mineral Brunner (medio para microorganismos de DSMZ número 462, 2012). Las suspensiones celulares se lisaron mediante un tratamiento con una prensa francesa, 3 veces a 20.000 psi. Los lisados celulares obtenidos de ese modo se utilizaron en una dilución 1:10, 1:100 o 1:1.000, que se había preparado en medio mineral Brunner que incluía 0,1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino). Para los experimentos de degradación de ZEN se utilizaron 9,9 ml de medio mineral Brunner que incluía 0,1 mg/ml de BSA, 0,1 ml de lisado celular diluido y 31 pl de solución madre de sustrato ZEN. En total, los lisados celulares se diluyeron de este modo 1:1.000, 1:10.000 o 1:100.000. Una solución de ZEN 2,08 mM (40% en volumen de ACN 60% en volumen de H2O) servía como solución madre de sustrato ZEN. Para preparar esta solución, se pesó y se disolvió adecuadamente ZEN en forma cristalina
(Biopure Standard de Romer Labs, Art. n° 001109, al menos 98% de pureza). Cada lote de degradación se llevó a cabo en viales de vidrio de 25 ml y se incubó a 25°C con agitación a 100 rpm durante un total de 120 h. En los puntos temporales 0; 0,5; 1; 2; 5; 24; 47; 72 y 120 h se tomó en cada caso una muestra de 1 ml, los polipéptidos se inactivaron con calor durante 10 min a 99°C y se almacenaron a -20°C. Después de la descongelación, se separaron de las muestras los componentes insolubles mediante centrifugación. Se analizaron ZEN, HZEN y DHZEN mediante LC/MS/MS. Para ello, los metabolitos se separaron cromatográficamente utilizando una columna Phenomenex Luna C18(2) con unas dimensiones de 250 mm x 3 mm y un tamaño de partícula de 5 gm. Una mezcla de acetonitrilo-agua con una concentración de ácido fórmico de 1 ml/l servía como fase móvil. Se registró la señal UV a 270 nm. La ionización mediante electropulverización (ESI) sirvió como fuente de ionización. Se cuantificaron ZEN, HZEN y DHZEN usando QTrap/LC/MS/MS (triple cuadrupolo, Applied Biosystems) en "modo mejorado". Después de 24 horas como máximo, ya no se podían detectar cantidades significativas de ZEN en ninguno de los lotes. La mayoría, más del 80%, de ZEN se había convertido en HZEN o DHZEN.
En la Fig. 1, que no forma parte de la invención, se observa a modo de ejemplo la degradación temporal de ZEN y el aumento de HZEN y DHZEN para una solución de lisado celular diluido 1:10.000, tanto para un polipéptido con SEQ ID n° 1 sin marcar (Fig. 1A), como uno marcado con 6xHis en el extremo C-terminal (Fig. 1B) y uno marcado con 6xHis en el extremo N-terminal (Fig. 1C). De esto se desprende claramente, 1° que la conversión de ZEN tiene lugar de forma inmediata y completa, ya que casi no se pudo detectar ZEN en la primera muestra (0 h), que se tomó inmediatamente después del inicio de la prueba, y 2° a través de la adición de un marcador, C-terminal o N-terminal, no había pérdidas significativas de la actividad.
Ejemplo 4: Hidrólisis de derivados de ZEN mediante polipéptidos en lisados celulares
Para determinar la capacidad de los polipéptidos para transformar tanto ZEN como derivados de ZEN en metabolitos no tóxicos o menos tóxicos, se prepararon los polipéptidos con las secuencias ID n° 1 y 13, tal y como se describe en el Ejemplo 3, con un marcador His C-terminal y como lisados celulares en la degradación se emplearon las respectivas secuencias de nucleótidos sintéticos con las secuencias ID n° 17 y 29.
Los experimentos de degradación se llevaron a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 3, sometiendo a ensayo cada polipéptido con cada derivado de ZEN seleccionado a partir del grupo a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL, Z14G, Z14S y ZAN. Los lisados celulares se utilizaron en una dilución total de 1:10.000. Como solución madre de sustrato, en lugar de una solución de ZEN 2,08 mM (40% en volumen de ACN 60% en volumen de H2O), se utilizaron soluciones equimolares, es decir, soluciones 2,08 mM de los derivados de ZEN. a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL y ZAN se adquirieron en Sigma y se utilizaron como patrones para el análisis. Z14G y Z14S se obtuvieron con una pureza de al menos el 90% de acuerdo con los procedimientos tal y como se describen en P. Krenn et al., 2007 (Micotoxin Research, 23, 4, 180-184 y M. Sulyok et al., 2007 (Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523) y se emplearon como patrones para el análisis. Otra diferencia con el Ejemplo 3 es que únicamente se tomó una muestra después de 24 h. La reducción de la concentración de los derivados de ZEN durante el ensayo de degradación se cuantificó mediante LC/MS/MS. a-ZEL, p-ZEL, Z14G y Z14S se midieron según el método de M. Sulyok et al. (2010, Food Chemistry, 119, 408-416); a-ZAL, p-ZAL y ZAN se midieron según el método de P. Songsermaskul et al. (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). Sorprendentemente, se ha comprobado que después de 24 h de incubación solo estaba presente desde 0 a como máximo un 13% de las cantidades de partida de derivados de ZEN.
Ejemplo 5: Actividad específica así como parámetros de cinética enzimática de los polipéptidos y de sus variantes
La determinación de la actividad específica de los polipéptidos así como de variantes de los mismos tuvo lugar fotométricamente, presentando todos los polipéptidos empleados un marcador 6xHis C-terminal. La preparación, el enriquecimiento y la purificación de los polipéptidos o bien de variantes de los mismos, se realizaron tal y como se describe en el Ejemplo 1. La degradación de ZEN en HZEN se midió a través de la disminución de la adsorción con una longitud de onda de 315 nm. Los coeficientes de extinción molar [s] de ZEN y HZEN se determinaron experimentalmente y ascendían a 0,0078895 L gmol-1 cm-1 y a 0,0030857 L gmol-1 cm-1. Los coeficientes de extinción son fuertemente dependientes del pH y, por lo tanto, la medición de la actividad debe llevarse a cabo siempre exactamente con el mismo valor del pH y, preferiblemente, también en la misma matriz. Las mediciones se llevaron a cabo en una solución tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2, en cubetas de cuarzo, en un intervalo de longitudes de onda de 200 a 2500 nm, en un fotómetro UV-VIS (Hitachi U-2001) a 32°C.
Como solución madre de sustrato ZEN servía una solución de ZEN 2,08 mM (40% en vol. de ACN 60% en vol. de H2O). Para la preparación de esta solución, ZEN se pesó y se disolvió de manera correspondiente en forma cristalina (Biopure Standard de Romer Labs, Art. n° 001109, al menos 98% de pureza). Las diluciones del sustrato ZEN (0,79 gM, 1,57 gM, 2,36 gM, 3,14 gM, 4,71 gM, 6,28 gM, 7,85 gM, 9,42 gM, 10,99 gM, 12,56 gM, 14,13 gM, 15,71 gM, 17,28 gM, 18,85 gM) se prepararon con Tris-HCl 50 mM pH = 8,2. Las soluciones polipeptídicas se diluyeron con tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2, hasta tener una concentración final de aprox. 70 ng/ml. Las diluciones de sustrato ZEN se calentaron previamente en un baño de agua a 32°C.
Se mezclaron 100 gl de la dilución de sustrato ZEN respectiva con 0,2 gl de la solución polipeptídica, y la absorción se midió durante 5 min, midiéndose cada una de las combinaciones a base de solución polipeptídica - dilución de sustrato ZEN al menos dos veces.
Teniendo en cuenta los coeficientes de extinción de ZEN y HZEN, a través del aumento de la absorción a lo largo del tiempo, se calculó la velocidad de la reacción para cada una de las concentraciones de sustrato.
Las expresiones “valor Km” o “constante de Michaelis-Menten” se refieren a un parámetro para describir la afinidad enzimática que poseen las unidades [pM] o [mM] y se calcula con ayuda del diagrama lineal de Hanes según H. Bisswang (2002, Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, página 19), utilizándose para ello preferiblemente la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. Las expresiones “constante catalítica de la reacción enzimática” o el “valor kcat” se refieren a un parámetro para describir la tasa de conversión de un polipéptido o bien una enzima, que se indica en [s]-1 y preferiblemente se calcula con ayuda de la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. La “velocidad enzimática máxima” o el “valor vmáx” se indica en las unidades [pM/s] o [mM/s] y se determina de forma análoga al valor Km con ayuda del diagrama lineal de Hanes, utilizando para ello preferiblemente la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. Por medio de vmáx y la concentración de enzima utilizada, se calculó la actividad específica según la fórmula vmáx [pM /s] x 60 [s/m in]
Actividad específica [U/mg] =
Concentración de enzima [m g/l]
en donde una unidad se define como la hidrólisis de ZEN 1 pmol por minuto a 32°C en solución tampón Tris-HCl 50 mM, pH = 8,2.
A continuación, se indican los datos sin procesar para la determinación de los parámetros enzimáticos Km, vmáx, kcat, así como la actividad específica, a modo de ejemplo para el polipéptido con la secuencia ID n° 1. La Tabla 3 muestra las velocidades de reacción con las concentraciones de sustrato ZEN respectivas, la Fig. 2 muestra las gráficas de Michaelis-Menten respectivas y en la Tabla 4 se indican los parámetros de cinética enzimática correspondientes. La solución enzimática empleada tenía una concentración de 68 ng/l.
Tabla 3: Velocidades de reacción del polipéptido con la SEQ ID n°: 1 con diferentes concentraciones de ZEN.
Tabla 4: Parámetros de la cinética enzimática del polipéptido con la secuencia ID n° 1.
Las actividades específicas de los polipéptidos examinados son para la secuencia ID n° 1, 8,25 U/mg, para la secuencia ID n° 13, 6,43 U/mg.
Ejemplo 6: Degradación de ZEN y derivados de ZEN en maíz contaminado
Para la determinación de la capacidad de los polipéptidos para degradar ZEN y derivados de ZEN que se presentan de forma natural en una matriz compleja y a un valor de pH bajo, se mezcló maíz contaminado a modo de ejemplo con diferentes concentraciones de, en cada caso, uno de los polipéptidos con las secuencias ID n° 1 a 6 y se controló la degradación de ZEN y derivados de ZEN.
El maíz contaminado se molió y se empleó en el ensayo de degradación, consistiendo cada lote en 1 g de maíz molido y contaminado, 8,9 ml de tampón acetato 100 mM, pH = 4,0 y 0,1 ml de solución polipeptídica. Se prepararon soluciones polipeptídicas enriquecidas y purificadas, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 5, diluyéndose éstas hasta una concentración de 10 mU/ml, 100 mU/ml o bien 1.000 mU/ml. En el lote se empleó, por consiguiente, de forma absoluta 1 mU (= 1 mU/g de maíz), 10 mU (= 10 mU/g de maíz) o bien 100 mU (= 100 mU/g de maíz). Cada lote de degradación se llevó a cabo en 25 ml y se incubó a 37°C con agitación a 100 rpm. Antes de la adición de la enzima o bien después de incubar durante 1 hora, se tomó en cada caso una muestra de 1 ml, el polipéptido se inactivó térmicamente durante 10 min a 99°C y la muestra se almacenó a -20 °C. Después de la descongelación de la muestra, los componentes no solubles se separaron mediante centrifugación. Se midieron las concentraciones de ZEN, así como de los derivados de ZEN mediante LC/MS/MS tal y como se describe en M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). El contenido en ZEN y derivados de ZEN en ese maíz ascendía para ZEN a 238 ppb, para a-ZEL a 15 ppb, para p-ZEL a 23 ppb, para Z14G a 32 ppb y para Z14S a 81 ppb. En la Tabla 5 se presenta el porcentaje de disminución del contenido en ZEN y derivados de ZEN en el ensayo de degradación.
Tabla 5: Porcentaje de reducción de ZEN y de los derivados de ZEN referido al contenido inicial del ensayo de degradación de diferentes polipéptidos y cantidades de polipéptidos.
Ejemplo 7: Aditivos que contienen polipéptido para la disociación hidrolítica de ZEN y/o de derivados de ZEN
Para la preparación de los aditivos para la disociación hidrolítica de ZEN, se purificaron a modo de ejemplo materiales sobrenadantes de la fermentación de polipéptidos expresados mediante P. pastoris con las secuencias ID n° 1,2, 6 y 13, mediante microfiltración y ultrafiltración (límite de exclusión: 10 kDa) en condiciones convencionales y se concentraron hasta tener una concentración de sustancia seca de aproximadamente 9% en peso. A continuación, esas soluciones con contenido en polipéptidos se continuaron elaborando con un secador de pulverización (Mini B290 de Büchi), asimismo en condiciones convencionales, para formar polvos secos. Esos cuatro polvos se denominaron
Claims (11)
1. Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona por medio de un polipéptido que disocia hidrolíticamente, caracterizado porque se hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona mediante el polipéptido, que es una hidrolasa con una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID n° 13 o una variante funcional de la misma, en donde hay una identidad de secuencia de al menos el 70% entre la variante funcional y la secuencia de aminoácidos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido contiene al menos un segmento de secuencia de aminoácidos conservado o una variante funcional del mismo, en donde la variante funcional del segmento de secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos un 70%, preferiblemente al menos un 84%, más preferiblemente al menos un 92% y lo más preferiblemente al menos un 98%, y el al menos un segmento de secuencia de aminoácidos conservado se selecciona a partir del grupo de secuencias de aminoácidos 89 a 145, 223 a 228, 257 a 261, 263 a 270 de la secuencia con la secuencia ID n° 1.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia ID n° 1 en al menos una de las siguientes posiciones seleccionadas a partir del grupo: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31,32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311,314, 317, 319, 321,323, 325 y 326.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia ID n° 1 seleccionada a partir del grupo D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, 1118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311 P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polipéptido se utiliza en un aditivo que contiene un adyuvante que disocia la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona para piensos para cerdos, aves de corral y acuicultura, en alimentos o en granos secos de destilería con solubles.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque los adyuvantes contenidos en el aditivo se seleccionan a partir de al menos un vehículo inerte, así como ingredientes adicionales opcionales, tales como vitaminas y/o minerales y/o enzimas y/u otros componentes para eliminar la toxicidad de las micotoxinas.
7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque el polipéptido está contenido en el aditivo en una concentración de como máximo 10.000 U/g, preferiblemente como máximo 1000 U/g, más preferiblemente como máximo 100 U/g y lo más preferiblemente como máximo 10 U/g.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, 6 o 7, caracterizado porque el aditivo se emplea en forma encapsulada o recubierta.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el polipéptido o el aditivo se mezcla con un producto alimenticio o pienso contaminado con zearalenona y/o con al menos un derivado de zearalenona, porque el producto alimenticio o el pienso contaminado se pone en contacto con humedad y porque el polipéptido o el aditivo hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona presente en el producto alimenticio o el pienso contaminado.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se hidroliza al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, en particular al menos el 90% de la zearalenona y/o de al menos un derivado de zearalenona.
11. Uso de un aditivo que contiene al menos un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID n° 13 o una variante funcional de la misma, en donde una identidad de secuencia entre la variante funcional y la secuencia de aminoácidos es de al menos el 70%, para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona en piensos, en particular para cerdos, aves y acuicultura, en alimentos o en granos secos de destilería con solubles.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ATA667/2013A AT514775B1 (de) | 2013-08-28 | 2013-08-28 | Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2843204T3 true ES2843204T3 (es) | 2021-07-16 |
Family
ID=51662974
Family Applications (7)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14783532.6T Active ES2675026T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona, polinucleótido aislado del mismo, así como un aditivo que contiene un polipéptido, uso del mismo, así como procedimiento |
| ES19152484T Active ES2843788T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso |
| ES19152160T Active ES2837422T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso |
| ES19152381T Active ES2840306T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso |
| ES19152332T Active ES2840305T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso |
| ES19152573T Active ES2843204T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso |
| ES19152082T Active ES2840303T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como su uso |
Family Applications Before (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14783532.6T Active ES2675026T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona, polinucleótido aislado del mismo, así como un aditivo que contiene un polipéptido, uso del mismo, así como procedimiento |
| ES19152484T Active ES2843788T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso |
| ES19152160T Active ES2837422T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso |
| ES19152381T Active ES2840306T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso |
| ES19152332T Active ES2840305T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19152082T Active ES2840303T3 (es) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como su uso |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US10149489B2 (es) |
| EP (8) | EP3498830B1 (es) |
| JP (3) | JP6526671B2 (es) |
| KR (2) | KR102215533B1 (es) |
| CN (6) | CN110499304A (es) |
| AT (1) | AT514775B1 (es) |
| AU (2) | AU2014311244B2 (es) |
| BR (2) | BR112016004340B1 (es) |
| CA (1) | CA2922178C (es) |
| CL (2) | CL2016000464A1 (es) |
| CR (2) | CR20200234A (es) |
| DK (7) | DK3495474T3 (es) |
| DO (1) | DOP2016000051A (es) |
| EA (2) | EA037776B1 (es) |
| EC (1) | ECSP16012693A (es) |
| ES (7) | ES2675026T3 (es) |
| HK (1) | HK1226101A1 (es) |
| HU (2) | HUE038188T2 (es) |
| IL (1) | IL244144B (es) |
| MX (1) | MX371487B (es) |
| MY (1) | MY171604A (es) |
| NI (1) | NI201600028A (es) |
| PE (2) | PE20220389A1 (es) |
| PH (1) | PH12016500377A1 (es) |
| PL (2) | PL3495473T3 (es) |
| PT (2) | PT3039135T (es) |
| SG (2) | SG11201601355XA (es) |
| UA (1) | UA118681C2 (es) |
| WO (2) | WO2015027259A2 (es) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT514775B1 (de) * | 2013-08-28 | 2017-11-15 | Erber Ag | Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid |
| AT516457B1 (de) * | 2014-11-07 | 2017-03-15 | Erber Ag | Polypeptid zur enzymatischen Detoxifizierung von Zearalenon, sowie isoliertes Polynukleotid, sowie Zusatzstoff, Verwendung und Verfahren desselben |
| CN104788543B (zh) * | 2015-04-13 | 2018-03-02 | 南昌大学 | 一种基于多肽的玉米赤霉烯酮抗体模拟物及其应用 |
| CN104804070B (zh) * | 2015-04-13 | 2018-03-02 | 南昌大学 | 可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其应用 |
| PE20181026A1 (es) | 2015-08-03 | 2018-06-27 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para tolerancia a los herbicidas en plantas |
| US10378023B2 (en) | 2015-09-01 | 2019-08-13 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
| EP3490366A4 (en) | 2016-07-29 | 2020-04-22 | Monsanto Technology LLC | METHOD AND COMPOSITIONS FOR GENE EXPRESSION IN PLANTS |
| CN108251399B (zh) * | 2016-12-29 | 2020-08-21 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 伏马毒素降解酶、编码基因、重组载体、细胞、添加剂及其应用 |
| BR112020002029A2 (pt) | 2017-07-31 | 2020-10-06 | Poet Research, Inc. | remediação de toxinas em correntes de processo de biorrefinaria |
| CN109825484B (zh) * | 2017-11-23 | 2022-06-28 | 吉林中粮生化有限公司 | 玉米赤霉烯酮水解酶zhd101突变体及利用该突变体水解玉米赤霉烯酮的方法 |
| LU100899B1 (en) * | 2018-07-31 | 2020-02-03 | Erber Ag | Means and methods for cleavage of zearalenone |
| CN110777128A (zh) * | 2018-07-31 | 2020-02-11 | 奥地利商艾尔柏有限公司 | 用于裂解玉米赤霉烯酮的手段和方法 |
| MX2021001168A (es) * | 2018-07-31 | 2021-04-19 | Erber Ag | Medios y metodos para el clivaje de la zearalenona. |
| CN110029095B (zh) * | 2019-04-15 | 2022-06-07 | 南京工业大学 | 一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用 |
| CN110592046B (zh) * | 2019-09-30 | 2022-03-15 | 湖北大学 | 玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用 |
| CN110819608B (zh) * | 2019-10-29 | 2022-03-15 | 湖北大学 | 一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法 |
| US20210403841A1 (en) * | 2020-03-12 | 2021-12-30 | Poet Research, Inc. | Enzymatic degradation of mycotoxins during grain processing |
| MX2023003959A (es) * | 2020-10-08 | 2023-05-25 | DSM Austria GmbH | Variantes de hidrolasa alfa/beta tetramerica con estabilidad a la temperatura incrementada y metodos de uso y produccion de las mismas. |
| CN112760300B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-08-30 | 潍坊康地恩生物科技有限公司 | 一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其生产菌株 |
| CN114774386B (zh) * | 2022-03-11 | 2024-02-02 | 暨南大学 | 一种对胃蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶 |
| CN114774385B (zh) * | 2022-03-11 | 2024-02-02 | 暨南大学 | 一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK13491D0 (da) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | Novo Nordisk As | Anvendelse af et enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling af et forderstof i tabletform |
| US5846812A (en) * | 1996-11-22 | 1998-12-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Zearalenone detoxification compositions and methods |
| JP2002536005A (ja) * | 1999-02-10 | 2002-10-29 | デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 飼料酵素含有粒状物 |
| AR028977A1 (es) * | 2000-07-13 | 2003-05-28 | Syngenta Participations Ag | Genes de lipoxigenasa, promotores, peptidos de transito y proteinas de los mismos |
| US6812380B2 (en) * | 2001-03-27 | 2004-11-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of zearalenone detoxification |
| WO2002099142A2 (de) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | Wilhelm Holzapfel | Actinomyceten zum abbau von aflatoxin b1, ochratoxin a und/oder zearalenon |
| AT413540B (de) * | 2001-12-20 | 2006-03-15 | Erber Ag | Mikroorganismus, welcher ochratoxine sowie ochratoxine und zearalenone entgiftet, sowie verfahren und verwendung hiefür |
| JP2004000130A (ja) * | 2002-03-25 | 2004-01-08 | Inst Of Physical & Chemical Res | ゼアラレノン解毒酵素遺伝子及び該遺伝子を導入した形質転換体 |
| US20060008888A1 (en) * | 2004-07-07 | 2006-01-12 | Kragh Karsten M | Polypeptide |
| KR101280811B1 (ko) | 2010-11-15 | 2013-07-02 | (주)진바이오텍 | 제아라레논 분해 활성을 갖는 미생물, 이를 이용한 제아라레논 분해 방법 및 사료첨가제 |
| EP2677881B1 (en) * | 2011-02-24 | 2020-04-01 | Erber Aktiengesellschaft | Feed processing enzymes |
| CN102199581B (zh) * | 2011-03-31 | 2013-02-06 | 国家粮食局科学研究院 | 一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用 |
| AT514775B1 (de) * | 2013-08-28 | 2017-11-15 | Erber Ag | Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid |
-
2013
- 2013-08-28 AT ATA667/2013A patent/AT514775B1/de active
-
2014
- 2014-08-27 PE PE2020001602A patent/PE20220389A1/es unknown
- 2014-08-27 EA EA201891967A patent/EA037776B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-08-27 EP EP19152381.0A patent/EP3498830B1/de active Active
- 2014-08-27 KR KR1020207003360A patent/KR102215533B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-27 EP EP14783532.6A patent/EP3039135B1/de active Active
- 2014-08-27 ES ES14783532.6T patent/ES2675026T3/es active Active
- 2014-08-27 CR CR20200234A patent/CR20200234A/es unknown
- 2014-08-27 DK DK19152160.8T patent/DK3495474T3/da active
- 2014-08-27 CN CN201910861359.0A patent/CN110499304A/zh active Pending
- 2014-08-27 EP EP19152573.2A patent/EP3495477B1/de active Active
- 2014-08-27 DK DK14783532.6T patent/DK3039135T3/en active
- 2014-08-27 DK DK19152082.4T patent/DK3495473T3/da active
- 2014-08-27 CR CR20160128A patent/CR20160128A/es unknown
- 2014-08-27 MY MYPI2016700612A patent/MY171604A/en unknown
- 2014-08-27 BR BR112016004340-5A patent/BR112016004340B1/pt active IP Right Grant
- 2014-08-27 ES ES19152484T patent/ES2843788T3/es active Active
- 2014-08-27 PT PT147835326T patent/PT3039135T/pt unknown
- 2014-08-27 ES ES19152160T patent/ES2837422T3/es active Active
- 2014-08-27 CN CN201910861330.2A patent/CN110527674A/zh active Pending
- 2014-08-27 WO PCT/AT2014/000165 patent/WO2015027259A2/de active Application Filing
- 2014-08-27 JP JP2016537048A patent/JP6526671B2/ja active Active
- 2014-08-27 EP EP19152484.2A patent/EP3495476B1/de active Active
- 2014-08-27 DK DK19152381.0T patent/DK3498830T3/da active
- 2014-08-27 BR BR122020001707-4A patent/BR122020001707B1/pt active IP Right Grant
- 2014-08-27 AU AU2014311244A patent/AU2014311244B2/en active Active
- 2014-08-27 KR KR1020167008042A patent/KR102075752B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-27 PL PL19152082T patent/PL3495473T3/pl unknown
- 2014-08-27 EP EP19152082.4A patent/EP3495473B1/de active Active
- 2014-08-27 HU HUE14783532A patent/HUE038188T2/hu unknown
- 2014-08-27 UA UAA201603121A patent/UA118681C2/uk unknown
- 2014-08-27 DK DK19152332.3T patent/DK3495475T3/da active
- 2014-08-27 DK DK19152573.2T patent/DK3495477T3/da active
- 2014-08-27 PL PL14783532T patent/PL3039135T3/pl unknown
- 2014-08-27 CN CN201910861349.7A patent/CN110527675A/zh active Pending
- 2014-08-27 SG SG11201601355XA patent/SG11201601355XA/en unknown
- 2014-08-27 CN CN201480055221.7A patent/CN105705637A/zh active Pending
- 2014-08-27 US US14/914,671 patent/US10149489B2/en active Active
- 2014-08-27 ES ES19152381T patent/ES2840306T3/es active Active
- 2014-08-27 EP EP19152160.8A patent/EP3495474B1/de active Active
- 2014-08-27 ES ES19152332T patent/ES2840305T3/es active Active
- 2014-08-27 DK DK19152484.2T patent/DK3495476T3/da active
- 2014-08-27 SG SG10201900355RA patent/SG10201900355RA/en unknown
- 2014-08-27 EP EP14781432.1A patent/EP3039134B1/de not_active Not-in-force
- 2014-08-27 PT PT191520824T patent/PT3495473T/pt unknown
- 2014-08-27 CN CN201910861350.XA patent/CN110527676A/zh active Pending
- 2014-08-27 ES ES19152573T patent/ES2843204T3/es active Active
- 2014-08-27 WO PCT/AT2014/000164 patent/WO2015027258A2/de active Application Filing
- 2014-08-27 EP EP19152332.3A patent/EP3495475B1/de active Active
- 2014-08-27 MX MX2016002636A patent/MX371487B/es active IP Right Grant
- 2014-08-27 ES ES19152082T patent/ES2840303T3/es active Active
- 2014-08-27 CA CA2922178A patent/CA2922178C/en active Active
- 2014-08-27 CN CN201910861336.XA patent/CN110499303A/zh active Pending
- 2014-08-27 EA EA201690471A patent/EA032685B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-08-27 HU HUE19152082A patent/HUE052623T2/hu unknown
- 2014-08-28 PE PE2016000319A patent/PE20160243A1/es unknown
-
2016
- 2016-02-16 IL IL244144A patent/IL244144B/en active IP Right Grant
- 2016-02-18 DO DO2016000051A patent/DOP2016000051A/es unknown
- 2016-02-19 NI NI201600028A patent/NI201600028A/es unknown
- 2016-02-26 US US15/054,232 patent/US10076125B2/en active Active
- 2016-02-26 PH PH12016500377A patent/PH12016500377A1/en unknown
- 2016-02-29 CL CL2016000464A patent/CL2016000464A1/es unknown
- 2016-03-28 EC ECIEPI201612693A patent/ECSP16012693A/es unknown
- 2016-12-22 HK HK16114603A patent/HK1226101A1/zh unknown
-
2018
- 2018-10-16 US US16/161,266 patent/US10779556B2/en active Active
- 2018-12-27 JP JP2018244394A patent/JP2019088287A/ja active Pending
-
2019
- 2019-05-20 CL CL2019001365A patent/CL2019001365A1/es unknown
-
2020
- 2020-04-13 JP JP2020071453A patent/JP7138674B2/ja active Active
- 2020-06-12 AU AU2020203904A patent/AU2020203904B2/en active Active
- 2020-07-21 US US16/934,179 patent/US11324235B2/en active Active
-
2021
- 2021-12-20 US US17/555,731 patent/US11910807B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-01 US US17/829,416 patent/US11998027B2/en active Active
- 2022-06-01 US US17/829,431 patent/US11998028B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2843204T3 (es) | Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polipéptido, así como el uso | |
| ES2664178T3 (es) | Aditivo alimentario que comprende una amidasa para degradar la ocratoxina | |
| CN106085983B (zh) | 多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及方法 | |
| NZ717021B2 (en) | Polypeptide for hydrolytic cleavage of zearalenone and/or zearalenone derivatives, isolated polynucleotide thereof as well as a polypeptide containing an additive, use of same as well as a process |