ES2675026T3

ES2675026T3 - Polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona, polinucleótido aislado del mismo, así como un aditivo que contiene un polipéptido, uso del mismo, así como procedimiento

Info

Publication number: ES2675026T3
Application number: ES14783532.6T
Authority: ES
Inventors: Sebastian FRUHAUF; Michaela THAMHESL; Martin Pfeffer; Dieter Moll; Gerd Schatzmayr; Eva Maria Binder
Original assignee: Erber AG
Current assignee: DSM Austria GmbH
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2018-07-05
Anticipated expiration: 2034-08-27
Also published as: MX371487B; JP7138674B2; DK3498830T3; DOP2016000051A; NI201600028A; DK3495474T3; US11910807B2; US20190124948A1; EA037776B1; EA201690471A1; EP3039135B1; DK3495473T3; KR20160044040A; CN106085983A; US10149489B2; IL244144B; DK3495476T3; KR20200015842A; EP3039134B1; EP3498830B1

Abstract

Polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona, caracterizado por que el polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos con una secuencia ID NO 1 de al menos 70%, preferiblemente al menos 84%, en particular preferiblemente al menos 92% y lo más preferiblemente al menos 98%, o contiene un fragmento funcional del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona, polinucleótido aislado del mismo, así como un aditivo que contiene un polipéptido, uso del mismo, así como procedimiento

La presente invención se refiere a un polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de 5 zearalenona, a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de este tipo, así como a un aditivo que contiene un polipéptido de este tipo y a un uso del mismo, así como a un procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona.

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos. Un representante importante de las mismas es la zearalenona (ZEN), difundida por todo el mundo, anteriormente conocida como toxina F-2, que es 10 producida por una pluralidad de hongos Fusanum. Estos hongos infestan, entre otros, plantas de cultivo tales como distintas especies de cereales, manifestándose por norma general la infestación por parte del hongo antes de la cosecha, en donde el crecimiento del hongo o bien la producción de micotoxinas puede tener lugar antes y/o, en el caso de un almacenamiento no apropiado, también después de la cosecha. La Organización para la Alimentación y la Agricultura (FAO) estima que en todo el mundo el 25% de los productos agrarios están contaminados con 15 micotoxinas, lo cual conduce a considerables pérdidas económicas. En un estudio actual llevado a cabo en todo el mundo de I. Rodrigues y K. Naehrer, Toxins, 2012, 4, 663-675, en el espacio de tiempo de enero de 2009 a diciembre de 2011 se analizaron en total 23.781 muestras, comprobándose un 81% positivas a al menos una micotoxina y un 45% positivas a ZEN. ZEN podía encontrarse en todas las regiones del mundo, así como en todas las clases de cereales y piensos sometidas a ensayo tales como, por ejemplo, maíz, harina de soja, trigo, salvado de 20 trigo, DDGS (granos secos de destilería con solubles) así como en mezclas de pienso completo con una frecuencia de hasta 100%.

ZEN es una lactona no esteroide, policétidos de la fórmula estructural:

25 y los nombres de nomenclatura

1(18),2,14,16-tetraeno-7,13-diona.

Sin embargo, en la naturaleza se presentan también una pluralidad de derivados de ZEN que se forman mediante modificaciones enzimáticas o químicas de ZEN. Ejemplos de ello son conjugados de ZEN glicosídicos o con contenido en sulfato que se forman mediante hongos, plantas o el metabolismo de los mamíferos, así como 30 metabolitos de ZEN que se forman, entre otros, en el organismo humano o animal. En lo que sigue, por derivados de ZEN se entienden conjugados de ZEN o metabolitos de ZEN que se presentan en la naturaleza o preparados mediante síntesis química o bioquímica, pero en especial a-zearalenol (a-ZEL; (2E,7R,11S)-7,15,17-trihidroxi-11- metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),2,14,16-tetraen-13-ona), p-zearalenol (p-ZEL; (2E,7S,11S)-7,15,17- trihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),2,14,16-tetraen-13-ona), a-Zearalanol (a-ZAL; (7R,11S)- 35 7,15,17-trihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca1(18),14,16-trien-13-ona), p-zearalanol (p-ZAL; (7S,11s)-

7,15,17-trihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(14),15,17-trien-13-ona), sulfato de zearalenona-14 (Z14S; [(2E,11S)-15-hidroxi-11-metil-7,13-dioxo-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),2,14,16-tetraen-17-il]hidrogenosulfato), zearalenona-14-glicósido (Z14G; (2E,11S)-15-hidroxi-11-metil-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-

(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxi-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18)2,14,16-tetraeno-7,13-diona), así como 40 zearalanona (ZAN; (11S)-15,17-dihidroxi-11-metil-12-oxa-biciclo[12.4.0]octadeca-1(18),14,16-trieno-7,13-diona).

ZEN, al igual que derivados de ZEN, ante todo a-ZEL, p-ZEL, Z14S, a-ZAL, p-ZAL, Z14G y ZAN pueden detectarse también, en virtud de su elevada estabilidad química y física, en alimentos o alimentos para animales elaborados tales como, p. ej., pan o cerveza.

ZEN se une al receptor de estrógenos y puede provocar trastornos hormonales, en donde inmediatamente después 45 de la ingesta oral es absorbido y es transformado por los mamíferos en los dos metabolitos estereoisómeros a-ZEL o bien p-ZEL. En este caso, p. ej., a-ZEL pero también a-ZAL o bien ZAN presentan un efecto estrógeno mucho más intenso que ZEN. Derivados de ZEN conjugados presentan, en ocasiones, una estrogenicidad menor que ZEN, pero eventualmente a partir de estos derivados de ZEN se puede liberar en el tracto digestivo de nuevo ZEN.

A pesar de que ZEN presenta una toxicidad aguda relativamente baja y posee un valor DL50 oral de hasta 20.000 50 mg/kg de peso corporal, en el caso de una ingesta prolongada pueden manifestarse efectos tóxicos sub-agudos y/o

2

estrógena, macrocíclica, sintetizada a través de la vía metabólica de los

imagen1

del IUPAC (2E,11S)-15,17-dihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

sub-crónicos tales como, por ejemplo, efectos teratógenos, carcinógenos, estrógenos e inmunosupresores en animales o en el hombre. Alimento para animales contaminado con ZEN conduce a trastornos en el desarrollo en mamíferos, en donde cerdos y, en especial animales jóvenes, son extremadamente sensibles frente a ZEN. Concentraciones de ZEN en el alimento para animales superiores a 0,5 ppm conducen a trastornos en el desarrollo, pudiendo conducir, p. ej., concentraciones superiores a 1,5 ppm, a una hiperestrogenicidad en el caso de cerdos, y concentraciones de 12 ppm de ZEN fueron responsabilizadas de abortos en ganado vacuno. Dado que zearalenona es absorbida rápidamente a través de las mucosas, en particular a través de la mucosa del estómago, pero también a través de la mucosa oral, es necesaria una desactivación inmediata y, ante todo, cuantitativa. Ya 30 minutos después de la administración oral de ZEN puede detectarse ésta en la sangre. En este caso, el empleo de enzimas aisladas frente a microorganismos presenta ventajas tales como una mayor actividad específica o un efecto más rápido. En virtud del efecto nocivo de ZEN indicado, en la Unión Europea existen límites superiores de ZEN vinculantes en alimentos, así como consejos para límites superiores de ZEN en alimentos para animales (EC NO: 1881/2006).

La estrategia primaria para reducir la contaminación de ZEN de alimentos o alimentos para animales es la limitación del crecimiento de hongos, por ejemplo, mediante el cumplimiento de la “buena práctica agrícola”. A ella pertenece, entre otros, el que el material de siembra esté exento de parásitos y de una infestación por hongos o el que productos de desecho de la agricultura sean eliminados a tiempo del campo. Además, mediante el empleo de fungicidas se puede reducir el desarrollo de hongos en el campo. Después de la cosecha, el material de cosecha debería almacenarse a una humedad residual inferior a 15% y a baja temperatura, con el fin de impedir el crecimiento de hongos. Asimismo, antes del tratamiento ulterior debería eliminarse el material contaminado mediante la infestación por hongos. A pesar de esta lista de medidas, I. Rodrigues y K. Naehrer (2012) informaron que incluso en regiones con las normas agrícolas más elevadas, tales como EE.UU. y Europa Central, en los años 2009 a 2011 el 29% o bien el 39% de las muestras de maíz sometidas a ensayo estaban contaminadas con ZEN.

Otras posibilidades para la separación de ZEN a partir de alimentos para animales o alimentos son la adsorción o bien la transformación de la micotixina. Para ello, es necesario que la unión de la micotoxina al adsorbente sea fuerte y específica a lo largo de un amplio intervalo de pH y permanezca siendo estable durante todo el proceso de digestión en el tracto gastrointestinal. A pesar de que algunos agentes de adsorción no biológicos tales como, p. ej., carbón activo, silicatos o polímeros sintéticos tales como colestiramina, se pueden emplear de manera eficaz para aflatoxinas, su empleo para otras micotoxinas está limitado. El inconveniente esencial de los agentes de adsorción es la unión no específica de otras moléculas que, en parte, son esenciales para la alimentación. Agentes de adsorción biológicos tales como, p. ej., levaduras o extractos de levadura, se describen asimismo en la bibliografía, pero tienen una limitación similar a la de agentes de adsorción no biológicos.

También está limitada la destoxificación de ZEN mediante tratamientos físicos y químicos. Mediante tratamiento térmico, ZEN no puede ser desactivado de manera efectiva, no obstante, el contenido en ZEN puede reducirse en un 83,9% mediante extrusión y tratamiento con agentes oxidantes, p. ej., durante 16 h a 80°C con solución de peróxido de hidrógeno al 10%. El empleo de procedimientos de extrusión y agentes oxidantes tales como ozono o peróxido de hidrógeno en la preparación de alimentos para animales y alimentos está limitado en virtud de los elevados costes, la pérdida de calidad, la eficiencia parcialmente baja y la escasa especificidad.

También la biotransformación de ZEN mediante microorganismos tales como, p. ej., cepas de Trichosporon mycotoxinivorans, Gliocladium roseum o Bacillus subtilis o bien enzimas aisladas a partir de las mismas tales como hidrolasas o peroxidasas se ha descrito, p. ej., en E. Vekiru et al., en Appl. and Environ, Microb. 2010, 76, 7, 23532359.

A partir del documento EP 0 938 575 B1 se han dado a conocer propiedades degradables de bacterias del género Rhodococcus y Nocardia, en particular R. globerulus, R. erythropolis y N. globerula.

Del documento WO 02/076205 se puede deducir el efecto degradante de ZEN de enzimas aisladas de Gliocladium roseum, entre otros, de la a/p-hidrolasa, zearalenona hidrolasa 1 (ZHD1), que catalizan la degradación de ZEN mediante una triada catalítica.

A partir del documento WO 2012/113827 se pueden deducir zonasas recombinantes, a saber, enzimas degradantes de ZEN que permanecen siendo estables en el tracto gastrointestinal, en particular en el mismo se describen microorganismos tales como Thermobifida fusca, Streptomyces exfoliatus, Acidovorans delafieldii y Streptomyces sp.

Polipéptidos o enzimas que están en condiciones de hidrolizar ZEN y/o al menos un derivado de ZEN pueden denominarse también como zonasas.

Las expresiones utilizadas en lo que sigue se pueden deducir del lenguaje científico y se utilizan en cada caso, a no ser que se indique de otro modo, en los significados habituales. Así, el término “polinucleótido” se refiere a todos los tipos de material genético de todas las longitudes y secuencias tales como, p. ej., moléculas de ADN y ARN de cadena sencilla y de doble cadena, inclusive elementos reguladores, elementos estructurales, grupos de genes, plásmidos, genomas completos y fragmentos de los mismos. El término “polipéptido” comprende proteínas tales

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

como, por ejemplo, enzimas, anticuerpos, así como polipéptidos con hasta 500 aminoácidos tales como, por ejemplo, inhibidores peptídicos, dominios de proteínas pero también polipéptidos cortos con pequeñas longitudes de secuencia, p. ej., menos de 10 aminoácidos tales como receptores, ligandos, hormonas peptídicas, etiquetas y similares. La denominación “posición” en un polinucleótido o polipéptido se refiere a una base o aminoácido específico individual en la secuencia del polinucleótido o del polipéptido.

La presente invención tiene entonces por objetivo proporcionar un polipéptido con el que se consiga transformar ZEN y/o derivados de ZEN rápidamente y de manera fiable en zEn hidrolizado y/o en derivados de ZEN hidrolizados.

Para la solución de este problema, la presente invención se caracteriza esencialmente porque el polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos con una secuencia ID NO 1 de al menos 70 %, preferiblemente al menos 84 %, en particular preferiblemente de al menos 92 % y lo más preferiblemente al menos 98 %, o contiene un fragmento funcional de la misma.

La expresión “identidad de la secuencia” correspondiente a la presente invención se refiere a una identidad de la secuencia porcentual. Para secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos, la identidad de la secuencia se puede determinar visualmente, pero preferiblemente se calcula con un programa de ordenador. Como secuencia de referencia se define la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO 1. La comparación de la secuencia se lleva a cabo también dentro de segmentos de la secuencia, entendiéndose como segmento una secuencia general de la secuencia de referencia y preferiblemente comprende una región conservada de la secuencia.

En el presente caso, la identidad de la secuencia se llevó a cabo con ayuda del programa NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - herramienta de búsqueda de alineamiento local básico), en particular con BLASTP para polipéptidos y BLASTN para polinucleótidos que son proporcionados en la página web del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Con ello, es posible comparar entre sí dos o más secuencias según el algoritmo de Altschul et al.,1997 (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En este caso, los programas se utilizaron en la versión del 15 de mayo de 2013. Como ajustes del programa se recurrió a los ajustes base, pero en particular para la comparación de la secuencia de aminoácidos: “secuencia diana máx” = 100; “umbral esperado” = 10; “tamaño de la palabra” = 3; “matriz” = BLOSOM62; “costes de huecos” = “Existencia: 11; Extensión: 1”; “ajuste computacional” = “ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional”; así como para la comparación de las secuencias de nucleótidos Tamaño de la Palabra: 11; Valor esperado: 10; Costos de huecos: Existencia = 5, Extensión = 2; Filtro = activado de baja complejidad; Puntuaciones de coincidencia/no coincidencia: 2, -3; cadena de filtro: L; m.

La expresión “variante poliipeptídica” o el término “variante” se refiere, por una parte, a “variantes alélicas” del polipéptido y, por otra, a “modificación” del polipéptido parental, en donde la función enzimática está esencialmente no modificada. La expresión “variante alélica” se refiere a un polipéptido que resulta por mutación o mutaciones de la secuencia de nucleótidos que se presentan ocasionalmente en la naturaleza y que determinan una modificación de la secuencia de aminoácidos, no estando influenciada por ello la función enzimática. “Modificaciones” pueden ser, por ejemplo, fusiones C- o N-terminales con polipéptidos o polipéptidos mutados, pudiendo obtenerse las mutaciones por sustitución, inserción o deleción de al menos un aminoácido, en particular mediante mutagénesis específica para el sitio o bien mutagénesis casual, recombinación y/o cualquier otro método de modificación de proteínas por ingeniería genética. Los términos sustitución, inserción y deleción se utilizan en el significado habitual en la técnica genética y familiar para el experto en la materia.

La expresión “fragmento funcional” aquí utilizada se refiere a una parte o bien a una secuencia parcial de un polipéptido o a una parte o bien a una secuencia parcial de una variante del mismo, manteniéndose esencialmente la función enzimática.

Mediante la elección de una secuencia de aminoácidos de este tipo, de un fragmento funcional de la misma, se comprobó una hidrólisis sorprendentemente rápida y completa de ZEN y/o de derivados de ZEN, pudiendo comprobarse valores de actividad particularmente elevados en comparación con los polipéptidos degradantes de ZEN hasta ahora conocidos.

Se pudieron alcanzar resultados constantemente buenos cuando, como esto corresponde a un perfeccionamiento de la invención, la variante polipeptídica presenta al menos una modificación de aminoácidos elegida del grupo sustitución, deleción e inserción de uno o varios aminoácidos.

Al estar perfeccionada la invención de modo que el polipéptido presenta una actividad específica de al menos 0,01 U/mg, preferiblemente al menos 0,1 U/mg, en particular al menos 1 U/mg; y/o presenta un valor Km de la disociación hidrolítica de ZEN de a lo sumo 50 pM, preferiblemente a lo sumo 3,5 pM, en particular a lo sumo 0,5 uM; y/o posee un valor kcat de la disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,05 s-1, preferiblemente al menos 0,6 s, en particular al menos 5 s-1; y/o posee un valor vmáx de la disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,00001 pM'1s'1, preferiblemente al menos 0,0001 pM'1s'1, en particular al menos 0,001 pM'1s'1, ZEN y/o derivados de ZEN pueden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

ser hidrolizados de manera particularmente rápida y completa, en particular destoxificados.

Además de ello, el polipéptido puede elegirse de modo que es una a/p-hidrolasa adecuada para la disociación hidrolítica, independiente del oxígeno y exenta de cofactor, de la agrupación éster de la zearalenona y/o de los derivados de ZEN, de modo que presenta una triada de aminoácidos catalizadores de la disociación hidrolítica, consistente en serina, un aminoácido de carácter ácido, elegido de ácido glutámico y ácido aspártico, en particular ácido aspártico, así como histidina, y de modo que la triada catalítica es S128, D264 y H303, estando representado el posicionamiento con respecto a la secuencia con la SEQ ID NO: 1.

La hidrólisis de ZEN y/o de derivados de ZEN se consigue con cada uno de los polipéptidos de la secuencia ID NO 1 a 14 en el grupo éster de la zearalenona o de sus derivaos según el siguiente mecanismo de reacción:

imagen2

La hidrólisis de ZEN para dar zearalenona hidrolizada (HZEN) no venenosa o bien derivados de ZEN hidrolizados tiene lugar mediante los polipéptidos de acuerdo con la invención, en particular las a/p-hidrolasas. La descarboxilación ulterior de HZEn para dar ZEN hidrolizado (DHZEN) descarboxilado o bien derivados de ZEN hidrolizados descarboxilados tiene lugar, por norma general, de forma espontánea.

En particular, mediante la triada catalítica arriba mencionada se consigue hidrolizar por completo ZEN y/o derivados de ZEN, presentando la reacción de degradación una buena estabilidad al pH, en particular valores de pH en el intervalo ácido.

Sorprendentemente, se ha comprobado que se consigue lograr resultados constantemente buenos con un polipéptido que en un segmento de secuencia consistente en 3 aminoácidos delante y en 3 aminoácidos detrás de la serina de la triada catalítica arriba mencionada, contiene al menos un aminoácido polar elegido de Y, Q, N, T, K, R, E, D y al menos un aminoácido no polar, elegido de F, M, L, I, V, A, G, P y, además de ello, mejorar un parámetro de cinética enzimática.

En un perfeccionamiento preferido de la invención, el polipéptido presenta al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO 1 en al menos una de las siguientes posiciones: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141,

146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205,

206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249,

251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307,

308, 309, 311, 314, 317, 319, 321, 323, 325 y 326. Estas posiciones resultan de las diferencias de secuencia del polipéptido con la secuencia ID NO 1 y de los polipéptidos con las secuencias ID NO 2 a 6 que presentan un elevado grado de identidad con respecto a esta secuencia y particularmente activos. Al ser modificado el polipéptido con la secuencia ID NO 1 en al menos una de estas posiciones de modo que en esta posición son tomadas las variantes de aminoácidos de las secuencias ID NO 2 a 6, se consigue demostrar que estas posiciones poseen una influencia importante sobre los parámetros de cinética enzimática del polipéptido y que, además, combinaciones de la secuencia con la secuencia ID NO 1 con las secuencias ID NO 2 a 6 que presentan un elevado grado de identidad de la secuencia conducen a actividades elevadas.

De acuerdo con un perfeccionamiento de la invención, el polipéptido presenta al menos una mutación elegida del grupo: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C,

V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S,

AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y,

F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V,

Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q,

F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P en la secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia ID NO 1. Con un polipéptido de este tipo se consigue hidrolizar, en particular, destoxificar por completo ZEN en un breve tiempo, ascendiendo la actividad específica del polipéptido al menos a 6,00 U/mg, preferiblemente al menos a 7,00 U/mg, en particular a al menos 8,00 U/mg. La unidad “U” o también “unidad” es una medida para la actividad catalítica absoluta y se define por la hidrólisis de 1 |jmol de ZEN por minuto a 32 °C, en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,2), entendiéndose - como “actividad catalítica” la reacción enzimática de un sustrato bajo condiciones de reacción definidas, y entendiéndose por “actividad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

específica”, la relación de la actividad catalítica y de la concentración en masa del polipéptido (masa por unidad de volumen).

Al estar configurado el polipéptido de manera que al menos está contenido uno de los siguientes motivos de aminoácidos con las secuencias ID NO 30 a 48, se consigue proporcionar polipéptidos que presenten una actividad específica de al menos 7,00 U/mg, preferiblemente al menos 8,00 U/mg. Sorprendentemente, se ha demostrado que cuando está contenido al menos uno de los siguientes motivos de aminoácidos con las secuencias ID NO 49 a 56, la actividad enzimática del polipéptido se continua aumentando, por ejemplo, frente a un motivo que contiene 7 aminoácidos. Una actividad específica todavía más elevada se alcanza cuando está contenido al menos uno de los siguientes motivos de aminoácidos con las secuencias ID NO 57 a 67.

De acuerdo con un perfeccionamiento de la invención, el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID NO 1 o al menos un fragmento funcional de la misma. Este polipéptido no sólo muestra una muy elevada actividad específica en la hidrólisis, en particular la destoxificación de ZEN y/o de derivados de ZEN, sino que, además, está en condiciones de mantener una actividad en un amplio intervalo de valores del pH tal como, p. ej., pH 4 a 9 y un intervalo de temperaturas entre 15 y 65 °C.

De acuerdo con un perfeccionamiento de la invención, el polipéptido contiene al menos una sustitución conservativa de aminoácidos en al menos una posición, y la sustitución conservativa de aminoácidos se elige de sustituciones de polipéptidos G a A; o A a G, S; o V a I, L, A, T, S; o I a V, L, M; o L a I, M, V; o M a L, I, V; o P a A, S, N; o F a Y, W, H; o Y a F, W, H; o W a Y, F, H; o R a K, E, D; o K a R, E, D; o H a Q, N, S; o D a N, E, K, R, Q; o E a Q, D, K, R, N; o S a T, A; o T a S, V, A; o C a S, T, A; o N a D, Q, H, S; o Q a E, N, H, K, R, refiriéndose la expresión sustitución conservativa de aminoácidos a la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que son considerados como conservativos por el experto en la materia, es decir, poseen las mismas propiedades específicas. Propiedades específicas de este tipo son, por ejemplo, su tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga o el valor pK del aminoácido. Por una mutación conservativa se entiende, por lo tanto, p. ej., una sustitución de un aminoácido de carácter ácido por otro aminoácido de carácter ácido, un aminoácido de carácter básico por otro aminoácido de carácter básico o un aminoácido polar por otro aminoácido polar.

Con sustituciones conservativas de aminoácidos de este tipo se consigue preparar variantes de polipéptidos, cuya actividad específica sea aproximadamente de igual intensidad en comparación con el polipéptido parental, pero preferiblemente pueda ser aumentada en al menos 0,1 U/mg.

La presente invención se dirige, además, a proporcionar un polinucleótido aislado con el que se consiga preparar un polipéptido para la disociación hidrolítica, rápida y fiable, de ZEN y/o de derivados de ZEN.

Para la solución de este problema, la invención se caracteriza porque la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que posee una propiedad hidrolizante de zearalenona y/o derivados de zearalenona, y/o presenta un grado de identidad de la secuencia con al menos el grupo P elegido de las secuencias de nucleótidos de la secuencia ID NO 15 o 16, de al menos 70%.

Secuencias de nucleótidos a expresar, en particular sus tripletes (codones) se modifican por norma general en función de la célula huésped, de modo que el codón Bias es optimizado en cada caso según la célula huésped. Esto resulta en que también polinucleótidos con un grado de identidad de la secuencia bastante inferior a 80%, pero también inferior a 70% o inferior a 60% puedan codificar uno y el mismo polipéptido. La comparación de las secuencias para la determinación del grado de identidad de la secuencia debe llevarse a cabo también dentro de segmentos de la secuencia, debiéndose entender un segmento como una secuencia general de la secuencia de referencia. La longitud de los segmentos de la secuencia asciende normalmente para secuencias de nucleótidos a 15 a 600.

Con ayuda de las secuencias de nucleótidos o segmentos de secuencia mencionados se consigue generar sondas de ácidos nucleicos que poseen una longitud de por norma general al menos 15, 30 o 40 nucleótidos. Con ayuda de sondas de este tipo que típicamente son marcadas de manera adicional, p. ej., mediante 3H, 32P, 35S, biotina o avidina, pueden identificarse, aplicando métodos convencionales, secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con un efecto degradante de ZEN y/o derivados de ZEN. Como material de partida para la identificación de secuencias de este tipo puede recurrirse, p. ej., a ADN, ARN o ADNc de microorganismos individuales, bancos de ADN genómicos o bancos de ADNc.

Para secuencias de nucleótidos o bien sondas de nucleótidos con una longitud de al menos 100 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad media se definen como pre-hibridación e hibridación a 42°C en tampón Na-EDTA mezclado con 5 veces NaCl (SSPE, NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM) que contiene dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,3%, 200 pg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 35%, seguido de condiciones de transferencia Southern convencionales (J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York), lavándose el material de soporte al final tres veces durante 15 minutos con tampón 2 X cloruro de sodio-citrato (SSC, NaCl 300 mM y citrato trisódico 30 mM, SDS al 0,2%) a 55°C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Para secuencias de nucleótidos o bien sondas de nucleótidos con una longitud de 15 nucleótidos a 100 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad media se definen como pre-hibridación e hibridación en tampón consistente en NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M pH = 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 al 0,5%, solución 1X de Denhardt, pirofosfato sódico 1 mM, dihidrógeno-fosfato sódico 1 mM, ATP 0,1 mM y 0,2 mg/ml de ARN de levadura, pre-hibridando e hibridando a una temperatura que se encuentra 5°C a 10°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) calculada, determinándose Tm mediante el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390). A continuación, el ensayo se continúa realizando en condiciones convencionales de transferencia Southern (J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). El material de soporte se lava al final una vez durante 15 minutos con tampón 6X SCC que contiene SDS al 0,1% y dos veces durante 15 minutos con tampón 6X SSC, en cada caso a 5°C hasta 10°C por debajo de la Tm calculada.

La presente invención se dirige, además, a proporcionar un aditivo con el que se consiga una disociación hidrolítica rápida y fiable de ZEN y/o de derivados de ZEN en una matriz definida o compleja tal como, por ejemplo, en alimentos para animales o alimentos.

Para la solución de este problema se emplea un polipéptido conforme a la invención, capacitado para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona. Con un aditivo de este tipo se consigue la transformación bioquímica de ZEN y/o de derivados de ZEN en ZEN hidrolizado y/o en derivados de ZEN hidrolizados. A este aditivo se puede recurrir, por ejemplo, también para la hidrólisis estereoselectiva de ZEN y/o de derivados de ZEN en procesos industriales.

En un perfeccionamiento preferido de la invención, el aditivo está configurado de modo que adicionalmente esté contenido al menos un soporte inerte, así como, eventualmente, otros componentes tales como vitaminas y/o sustancias minerales y/o enzimas y/u otros componentes para la destoxificación de micotoxinas. Mediante el empleo de un aditivo de este tipo se puede asegurar, por ejemplo, en alimentos para animales o alimentos, que las cantidades eventualmente contenidas de ZEN y/o de derivados de ZEN sean hidrolizadas, en particular destoxificadas con seguridad en la medida en que no se dé un efecto nocivo sobre el organismo del sujeto que recibe este alimento para animales o alimento.

En este caso, un polipéptido de acuerdo con la invención puede presentarse también en una preparación enzimática que, junto a al menos un polipéptido conforme a la invención, contenga adicionalmente al menos una enzima que participe, por ejemplo, en la degradación de proteínas tales como, p. ej., proteasas, o que participe en el metabolismo de almidón o fibras o grasa o glicógeno, tal como, p. ej., amilasa, celulasa o glucanasa, así como, por ejemplo, hidrolasas, enzimas lipolíticas, manosidasas, oxidasas, óxido-reductasas, fitasas, xilanasas y/o combinaciones de las mismas.

Otros sectores de aplicación de la invención son preparaciones enzimáticas que, junto a al menos un polipéptido de acuerdo con la invención, contienen al menos un componente para la destoxificación de micotoxinas, tal como una enzima degradante de micotoxinas tal como, p. ej., aflatoxina oxidasa, ergotamina hidrolasas, ergotamina amidasas, zearalenona esterasas, zearalenona lactonasas, ocratoxina amidasas, fumonisina carboxilesterasas, fumonisina aminotransferasas, aminopoliol aminooxidasas, desoxinivalenol epoxihidrolasas y/o al menos un microorganismo degradante de micotoxinas tal como Bacillus subtilis; y/o al menos un componente de unión a micotoxinas, por ejemplo paredes celulares microbianas o materiales inorgánicos tales como bentonitas.

De acuerdo con un perfeccionamiento particularmente preferido de la invención, el polipéptido está contenido en el aditivo en una concentración de a lo sumo 10.000 U/g, preferiblemente a lo sumo 1.000 U/g, más preferiblemente a lo sumo 100 U/g y lo más preferiblemente a lo sumo 10 U/g, con lo cual se consigue transformar ZEN y/o derivados de ZEN de forma rápida y, en particular ya antes de su resorción por parte del cuerpo de un sujeto que ingiere alimentos para animales o alimentos contaminados, en particular el ser humano o animal útil, en metabolitos no tóxicos o bien menos tóxicos, en particular HZEN y DHZEN.

De acuerdo con un perfeccionamiento de la invención, el polipéptido se presenta en forma encapsulada o recubierta, pudiendo recurrirse para la encapsulación o el recubrimiento a métodos convencionales tal como se describen, p. ej., en el documento WO 92/12645. Mediante la encapsulación o bien el recubrimiento se consigue transportar el polipéptido sin modificación, en particular sin degradación ni deterioro, a su lugar de uso, de modo que sólo después de la disolución de la envuelta protectora, por ejemplo en el tracto digestivo de animales, el polipéptido comienza a actuar, con lo cual puede conseguirse una degradación todavía más preestablecida, rápida y completa de ZEN y/o de derivados de ZEN, también en un medio ácido, rico en proteasas y anaerobio. Además, mediante la encapsulación o el recubrimiento se consigue aumentar la estabilidad a la temperatura de los polipéptidos en el aditivo.

La presente invención se dirige, además, a un uso del aditivo para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona en alimentos para animales, en particular para cerdos, aves de corral y el acuacultivo; en alimentos; o en granos secos de destilería con solubles. Mediante el uso de acuerdo con la invención del aditivo se consigue hidrolizar o bien destoxificar ZEN y/o derivados de ZEN contenidos en el alimento o alimento para animales

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

o bien en los granos secos de destilería con solubles, consiguiéndose una destoxificación de este tipo ya en el caso de concentraciones de polipéptidos de aproximadamente 1 U/g de alimento para animales o alimento contaminado.

La presente invención se dirige, además, a proporcionar un procedimiento con el que se posibilite una disociación hidrolítica rápida y fiable de ZEN y/o de derivados de ZEN por hidrólisis mediante un polipéptido.

Para la solución de este problema, el procedimiento se realiza de modo que zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona es hidrolizado por un polipéptido conforme a la invención y/o un aditivo conforme a la invención.

De acuerdo con un perfeccionamiento preferido, el procedimiento se realiza de modo que el polipéptido o el aditivo se mezcla con alimento para animales o alimento contaminado con zearalenona y/o con al menos un derivado de zearalenona, de modo que el alimento para animales o alimento contaminado se pone en contacto con humedad y de modo que el polipéptido o el aditivo hidroliza en el tracto digestivo la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona contenido en el alimento para animales o alimento contaminado. En el caso de alimentos para animales o alimentos húmedos, tales como mosto o purés, la hidrólisis de la zearalenona y/o del al menos un derivado de zearalenona tiene lugar antes de la ingesta oral en el alimento para animales o alimento húmedo. Mediante este procedimiento se puede garantizar que los efectos nocivos de zearalenona y/o de derivados de zearalenona sean muy ampliamente eliminados en el hombre y los animales. Por humedad se entiende en este caso la presencia de agua o de líquidos con contenido en agua, estando incluidos entre ellos también, p. ej., saliva u otros líquidos presentes en el tracto digestivo. Como tracto digestivo se define la cavidad bucal, la faringe, el esófago y el tracto gastrointestinal o equivalentes de los mismos, pudiendo presentarse diferentes denominaciones en el caso de animales o bien pudiendo no estar presentes componentes individuales en el tracto digestivo de animales.

El procedimiento de acuerdo con la invención puede realizarse también de modo que el alimento para animales o alimento se granula antes de la ingesta oral.

De acuerdo con un perfeccionamiento de la invención, el procedimiento se realiza de modo que con el mismo se hidrolizan al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, en particular al menos 90% de la zearalenona y/o de al menos un derivado de zearalenona.

La invención se explica a continuación con mayor detalle con ayuda de ejemplos de realización, así como dibujos. En estos, muestran:

La Fig. 1, la degradación en el tiempo de ZEN y el aumento de los metabolitos HZEN y DHZEN por parte del polipéptido con la SEQ ID NO: 1, en donde en la Fig. 1A, el polipéptido no está etiquetado, en la Fig. 1B posee una etiqueta 6xHis C-terminal y en la Fig. 1C posee una etiqueta 6xHis N-terminal,

La Fig. 2, la cinética de Michaelis-Menten del polipéptido con la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 1: Modificación, clonación y expresión de polinucleótidos que codifican polipéptidos con efecto hidrolizante de ZEN y/o derivados de ZEN

Sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos se llevaron a cabo mediante mutación de las secuencias de nucleótidos mediante PRC utilizando el kit “Quick-change Site directed Mutagenesis Kits” (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones. Alternativamente a ello, se adquirieron también secuencias de nucleótidos completas (Gene Art). Las secuencias de nucleótidos generadas mediante mutagénesis por PCR o bien adquiridas de Gene Art contenían en el plano de aminoácidos de manera opcional, adicionalmente, una etiqueta 6xHis C- o N-terminal y se integraron mediante métodos convencionales en vectores de expresión para la expresión en E. coli o P. pastoris, se transformaron en E. coli o P. pastoris, así como se expresaron en E. coli o P. pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, segunda Edición, ISBN-10: 1588294293, 2007; J.Sambrook et al. 2012, MolecularCloning, A Laboratory Manual 4a Edición, Cold Spring Harbor), pudiendo recurrirse para esta misión también a cualquier otra célula huésped adecuada.

La expresión “vector de expresión” se refiere a una construcción de ADN que está en condiciones de expresar in vivo o in vitro un gen. En particular, bajo la misma se entienden construcciones de ADN que son adecuadas para transferir a la célula huésped la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, con el fin de integrarla allí en el genoma o de presentarla libremente en el espacio extra-cromosómico y de expresar de manera intracelular la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y expulsar eventualmente de la célula el polipéptido.

La expresión “célula huésped” se refiere a las células que contienen una secuencia de nucleótidos a expresar o un vector de expresión y que están en condiciones de preparar una enzima o bien polipéptido conforme a la invención. En particular, bajo dicha expresión se entienden células procarióticas y/o eucarióticas, preferiblemente P. pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, células vegetales y/o esporas de Bacillus, Trichoderma o Aspergillus.

Para la determinación de las propiedades catalíticas de los polipéptidos se recurrió al lisado celular soluble en el

5

10

15

20

25

30

35

caso de E. coli, o bien al sobrenadante del cultivo en el caso de P. pastoris. Para la determinación del valor Km, de Vmáx, kcat y de la actividad específica, los polipéptidos se enriquecieron selectivamente mediante métodos convencionales mediante cromatografía sobre columnas de níquel-Sepharose. La determinación de la concentración de proteínas tuvo lugar mediante métodos convencionales, ya sea con el método BCA (Pierce BCA Protein Assay KitProd N° 33225), pero de preferencia fotométricamente con los coeficientes de extinción específicos para las respectivas proteínas que se calcularon con el programa “ProtParam”, disponible en línea en
http://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Herramientas de Identificación y Análisis de Proteínas en el Servidor ExPASy; (En) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, págs. 571 - 607).

Ejemplo 2: Determinación de la identidad de la secuencia, así como de las regiones conservadas.

La determinación de la identidad de la secuencia porcentual a lo largo de toda longitud de los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos con la secuencia ID-NOs 1 a 15 en relación entre sí (Tabla 1) se llevó a cabo con ayuda del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), en particular con BLASTP que puede ser tomado de la página web del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Con ello, es posible comparar dos o más secuencias entre sí según el algoritmo de Altschul et al.,1997 (Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402). Como ajustes del programa se recurrió a los ajustes base, pero en particular a “secuencia diana máx” = 100; “umbral esperado” = 10; “tamaño de la palabra” = 3; “matriz” = BLOSOM62; “costos de huecos” = “Existencia: 11; Extensión: 1”; “ajuste computacional” = “ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional”.

Para la determinación de las regiones conservadas de los polipéptidos con las secuencias ID NOs 1 a 6, estas secuencias, que poseen una identidad de la secuencia de al menos 70% entre sí, se compararon con ayuda del software COBalT (J.S. Papadopoulus y R. Agarwala, 2007, COBALT: herramienta de alineamiento múltiple de secuencias basada en restricciones, Bioinformatics 23: 1073-79), recurriendo a los parámetros convencionales, en particular a los parámetros (“Penalizaciones de huecos”: -11, -1; “Penalizaciones de Huecos Extremos”: -5, -1; “Uso de RPS BLAST”: conectado; “valor Blast E”: 0,003; “Encontrar columnas Conservadas y Re-ordenar”: conectado, “utilizar clusters de consulta”: conectado; “tamaño de la palabra”: 4; “distancia de posible cluster”: 0,8; “Alfabeto”: regular; “Ajuste de la conversación de homologías”: 3 bits). El resultado de este análisis representa los aminoácidos conservados. Como regiones conservadas se definieron las siguientes zonas de al menos 5 aminoácidos conservados consecutivos, a saber, en relación con la secuencia ID NO 1 región A de la posición +24 a la posición +50, B de +52 a +77, C de +79 a +87, D de +89 a +145, E de +150 a +171, F de +177 a +193, G de +223 a +228, H de +230 a + 237, I de +239 a +247, J de +249 a +255, K de +257 a +261, L de +263 a +270, M de +272 a +279, N de +297 a +301 y O de +303 a +313.

La determinación de la identidad porcentual de la secuencia de las regiones conservadas de las distintas secuencias con relación a la región conservada de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 (Tabla 2, columna 3 y columna 4) se llevó a cabo tal como se describe arriba, por medio del programa COBALT.

Tabla 1: Identidad porcentual de la secuencia a lo largo de toda la longitud del polipéptido y de dos regiones de D y G conservadas elegidas.

: Identidad de la secuencia con relación a SEQ ID-NO 1

Polipéptido: Polipéptido completo Región D conservada Región G conservada

SEQ ID-NO 1: 100% 100% 100%

SEQ ID-NO 2: 70% 87,7% 100%

SEQ ID-NO 3: 71% 89,5% 100%

SEQ ID-NO 4: 71% 91,2% 100%

SEQ ID-NO 5: 71% 87,7% 100%

SEQ ID-NO 6: 71% 91,2% 100%

SEQ ID-NO 7: 64% 78,9% 100%

SEQ ID-NO 8: 57% 82,5% 100%

SEQ ID-NO 9: 50% 73,7% 100%

SEQ ID-NO 10: 55% 75,4% 100%

SEQ ID-NO 11: 53% 71,9% 100%

SEQ ID-NO 12: 50% 71,9% 100%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

: Identidad de la secuencia con relación a SEQ ID-NO 1

SEQ ID-NO 13: 55% 77,2% 100%

SEQ ID-NO 14: 73% 84,2% 0%

Ejemplo 3: Hidrólisis de ZEN mediante polipéptidos en lisados celulares

Para la determinación de su capacidad de degradar ZEN en los metabolitos HZEN y DHZEN no tóxicos o bien menos tóxicos, se preparó el polipéptido con la SEQ ID NO 1, codificado por la secuencia de nucleótidos con la SEQ ID NO 15, como tal y con una etiqueta 6xHis C- o bien N-terminal en E. coli, tal como se describe en el Ejemplo 1. En cada caso 100 ml de un cultivo de E. coli con una densidad óptica (DO 600 nm) de 2,0 - 2,5 se recogieron mediante centrifugación a 4°C y se resuspendieron en 20 ml de medio mineral de Brunner (medio de microorganismos de DSMZ número 462, 2012). La suspensión de células se lisó mediante tratamiento durante 3 veces con una prensa French a 20.000 psi. El lisado celular, obtenido de esta manera, se empleó en una dilución 1:10, una dilución 1:100 o una dilución 1:1.000 que se preparó en medio mineral de Brunner, incluidos 0,1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino). Para un ensayo de degradación de ZEN se emplearon 9,9 ml de medio mineral de Brunner, incluidos 0,1 mg/ml de BSA, 0,1 ml de lisado celular diluido y 31 pl de solución madre de sustrato de ZEN. En total, los lisados celulares se diluyeron en la relación 1:1.000, 1:10.000 o bien 1:100.000. Como solución madre del sustrato de ZEN servía una solución de ZEN 2,08 mM (40% en vol. de ACN + 60% en vol. de H2O). Para la preparación de esta solución, ZEN se pesó y disolvió de manera correspondiente en forma cristalina (Biopure Standard de Romer Labs, Art. N° 001109, pureza al menos 98%). Cada una de las tandas de degradación se llevó a cabo en frasquitos de vidrio de 25 ml y se incubó a 25°C bajo agitación con 100 rpm durante un total de 120 h. En los momentos, 0; 0,5; 1; 2; 5; 24; 47; 72 y 120 h se recogió en cada caso una muestra de 1 ml, los polipéptidos se inactivaron por calor durante 10 min a 99 °C y se almacenaron a -20 °C. Después de la descongelación de las muestras, los componentes no solubles se separaron mediante centrifugación. ZEN, HZEN y DHZEN se analizaron mediante LC/MS/MS. Para ello, los metabolitos se separaron por cromatografía mediante una columna Phenomenex Luna C18(2) con las dimensiones 250 mm x 3 mm y un tamaño de partícula de 5 pm. Como eluyente servía una mezcla de acetonitrilo y agua con una concentración de aminoácidos de 1 ml/l. La señal UV se registró a 270 nm. Como fuente de ionización servía la ionización por proyección de electrones (ESI). ZEN, HZEN y DHZEN se cuantificaron mediante QTrap/LC/MS/MS (cuadrupolo triple, Applied Biosystems) en el “Modo potenciado”.

En la Fig. 1 se puede ver la degradación en el tiempo de ZEN y el aumento de HZEN, así como de DHZEN a modo de ejemplo para una solución de lisado celular diluida en la relación 1:10.000 para polipéptido no etiquetado (Fig. 1A), como también para polipéptido etiquetado con 6xHis C-terminal (Fig. 1B) y etiquetado con 6xHis N-terminal (Fig. 1C), con la SEQ ID NO 1. De ello se puede ver claramente que, en primer lugar, la reacción de ZEN tiene lugar de manera inmediata y completa, dado que ya en la 1a muestra (0 h) que se recogió inmediatamente después del inicio del ensayo, ya no se podía detectar casi ZEN alguna y 2. mediante la adición de una etiqueta, en posición C- o N-terminal, no se produjeron pérdidas de actividad dignas de mención.

Ejemplo 4: Hidrólisis de derivados de ZEN mediante polipéptidos en lisados celulares

Para la determinación de la capacidad de los polipéptidos de transformar junto a ZEN también derivados de ZEN en metabolitos no tóxicos o bien menos tóxicos, los polipéptidos con la secuencia ID NO 1 a 14, tal como se describe en el Ejemplo 3, se prepararon con la etiqueta His C-terminal y se emplearon como lisados celulares en el ensayo de degradación. Para la preparación de los polipéptidos con la secuencia ID NO 1 a 14, se recurrió a las respectivas secuencias de nucleótidos sintéticas con las secuencias ID NO 16 a 29.

Los ensayos de degradación se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo 3, sometiendo a ensayo cada uno de los polipéptidos con cada uno de los derivados de ZEN a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL, Z14G, Z14S y ZAN. Los lisados celulares se emplearon en una dilución total de 1:10.000. Como solución madre del sustrato se empleó, en lugar de una solución ZEN 2,08 mM (40% en vol. de ACN + 60% en vol. de H2O), soluciones equimolares, es decir, soluciones 2,08 mM de los derivados de ZEN. a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL y ZAN se adquirieron de Sigma y se emplearon como patrones para el análisis. Z14G y Z14S se prepararon con una pureza de al menos 90%, según los procedimientos tal como se describen en P. Krenn et al., 2007 (Micotoxin Research, 23, 4, 180-184 y M. Sulyok et al., Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523) y se emplearon como patrones para el análisis. Otra diferencia con el Ejemplo 3 es que únicamente se tomó una muestra después de 24 h. La reducción de la concentración de los derivados de zEn durante el ensayo de degradación se cuantificó mediante LC/MS/MS. a-ZEL, p-ZEL, Z14G y Z14S se midieron según el método de M. Sulyok et al. (2010, Food Chemistry, 119, 408-416); a-ZAL, p-ZAL, y ZaN se midieron según el método de P. Songsermaskul et al. (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). Sorprendentemente, se ha comprobado que después de 24 h de incubación ya sólo estaba presente 0 a como máximo 13% de las cantidades de partida de los derivados de ZEN.

Ejemplo 5: Actividad específica, así como parámetros de cinética enzimática de los polipéptidos, así como de

variantes de los mismos

La determinación de la actividad específica de los polipéptidos así como de variantes de los mismos tuvo lugar fotométricamente, presentando todos los polipéptidos empleados una etiqueta 6xHis C-terminal. La preparación, el enriquecimiento y la purificación de los polipéptidos o bien de variantes de los mismos tuvo lugar tal como se 5 describe en el Ejemplo 1. La degradación de ZEN en HZEN se midió a través de la disminución de la absorción a la longitud de onda de 315 nm. Los coeficientes de extinción molar [£] de ZEN y HZEN se determinaron experimentalmente y ascendieron a 0,0078895 L pmol"1 cm"1 y a 0,0030857 L pmor cm"1. Los coeficientes de extinción son fuertemente dependientes del pH y, por lo tanto, la medición de la actividad debe llevarse a cabo siempre a exactamente el mismo valor del pH y, preferiblemente, también en la misma matriz. Las mediciones se 10 llevaron a cabo en una solución tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2 en cubetas de cuarzo en un intervalo de longitudes de onda de 200 a 2500 nm en un fotómetro UV-VIS (Hitachi U-2001) a 32 °C.

Como solución madre del sustrato ZEN servía una solución de ZEN 2,08 mM (40% en vol. de ACN + 60% en vol. de H2O). Para la preparación de esta solución, ZEN se pesó y disolvió de manera correspondiente en forma cristalina (Biopure Standard de Romer Labs, Art. N° 001109, pureza al menos 98%). Las diluciones del sustrato de ZEN (0,79 15 |JM, 1,57 |JM, 2,36 pM, 3,14 pM, 4,71 pM, 6,28 pM, 7,85 pM, 9,42 pM, 10,99 pM, 12,56 pM, 14,13 pM, 15,71 pM, 17,28 pM, 18,85 pM) se prepararon con Tris-HCl 50 mM pH = 8,2. Las soluciones polipeptídicas se diluyeron con tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2 hasta una concentración final de aprox. 70 ng/ml. Las diluciones de sustrato ZEN se precalentaron en un baño de agua hasta 32 °C.

100 pl de la dilución de sustrato de ZEN respectiva se mezclaron con 0,2 pl de solución polipeptídica, y la absorción 20 se midió durante 5 min, midiéndose cada una de las combinaciones a base de solución peptídica - dilución de sustrato de ZEN al menos dos veces.

Teniendo en cuenta los coeficientes de extinción de ZEN y HZEN, a través del aumento de la absorción se calculó la velocidad de la reacción para cada una de las concentraciones de sustrato.

Las expresiones “valor Km” o “constante de Michaelis-Menten” se refieren a un parámetro para la descripción de la 25 actividad enzimática que posee las unidades [pM] o [mM] y se calcula con ayuda de la gráfica lineal de Hanes según H. Bisswang (2002, Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, página 19), utilizándose para ello preferiblemente la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. Las expresiones “constante catalítica de la reacción enzimática” o el “valor kcat” se refieren a un parámetro para la descripción de la tasa de conversión de un polipéptido o bien enzima que se indica en [s]-1 y preferiblemente se calcula con ayuda de la 30 función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa Sigma Plot 12.0. La “velocidad enzimática máxima” o el “valor vmáx” se indican en las unidades [pM/s] o [mM/s] y se determinan análogamente al valor Km con ayuda de la gráfica lineal de Hanes, utilizándose para ello preferiblemente la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0.

Mediante vmáx y la concentración enzimática empleada se calculó la actividad específica conforme a la fórmula

35

Actividad específica [U/mg] -

vmáx [pM/s] x 60 [s/min] Concentración enzimática [mg/l]

definiéndose una unidad como hidrólisis de 1 pmol de ZEN por minuto a 32°C en solución tampón Tris-HCl 50 mM, pH = 8,2.

Seguidamente se indican los datos en bruto para la determinación de los parámetros enzimáticos Km, vmáx, kcat, así como de la actividad específica a modo de ejemplo para el polipéptido con la secuencia ID NO 1. La Tabla 2 muestra 40 la velocidad de reacción a las concentraciones de sustrato de ZEN respectivas, la Fig. 2 las gráficas de Michaelis- Menten respectivas y en la Tabla 3 se indican los parámetros de cinética enzimática correspondientes. La solución enzimática empleada tenía una concentración de 68 ng/l.

Tabla 2. Velocidades de reacción del polipéptido con la secuencia ID NO 1 a diferentes concentraciones de ZEN

Dilución del sustrato de ZEN [pM]: Medición 1 de la velocidad de reacción [pM/s] Medición 2 de la velocidad de reacción [pM/s]

0,79: 0,0073 0,0071

1,57: 0,0087 0,0082

2,36: 0,0095 0,0080

3,14: 0,0101 0,0073

4,71: 0,0103 0,0087

6,28: 0,0096 0,0088

7,85: 0,0084 0,0088

9,42: 0,0111 0,0087

10,99: 0,0093 0,0081

12,56: 0,0100 0,0086

14,13: 0,0089 0,0101

15,71: 0,0089 0,0090

17,28: 0,0100 0,0074

18,85: 0,0100 0,0085

Tabla 3: Parámetros de cinética enzimática del polipéptido con la secuencia ID NO 1

: Vmáx [pM/s] Km [pM] kcat[s-1] Actividad esp. [U/mg]

Medición: 1 2 1 2 1 2 1 2

Valor: 0,00993 0,008756 0,2172 0,1898 5,44 4,79 8,76 7,73

Valor medio: 0,009343 0,2035 5,12 8,25

La actividad específica de los polipéptidos investigados asciende para la secuencia ID NO 1 a 8,25 U/mg, para la 5 secuencia ID NO 2 a 10,56 U/mg, para la secuencia ID NO 8 a 36 U/mg, para la secuencia ID NO 4 a 8,3 U/mg, para la secuencia ID NO 5 a 8,58 U/mg, para la secuencia ID NO 6 a 9,95 U/mg, para la secuencia ID NO 7 a 3,83 U/mg, para la secuencia ID NO 8 a 2,57 U/mg, para la secuencia ID NO 9 a 4,87 U/mg, para la secuencia ID NO 10 a 5,12 U/mg, para la secuencia ID NO 11 a 3,88 U/mg, para la secuencia ID NO 12 a 2,78 U/mg, para la secuencia ID NO 13 a 6,43 U/mg, para la secuencia ID NO 14 a 3,33 U/mg.

10 Las actividades específicas de las variantes de polipéptidos investigadas se enumeran en la Tabla 4 y la Tabla 5.

Tabla 4: Actividad específica de variantes del polipéptido con SEQ ID NO: 1, zona o zonas conservadas en las que se encuentran la o las mutaciones e identidades de las secuencias de las variantes con respecto a la secuencia parental con la secuencia ID NO 1. La posición de la o las mutaciones se indica con relación a la secuencia de aminoácidos con la secuencia ID NO 1. La identidad de la secuencia se determinó mediante BLAST, tal como se 15 describe en el Ejemplo 2.

Variante: Mutación(es) Mutación(es) en la zona Identidad con Secuencia ID-NO 1 Actividad esp. [U/mg]

ZH1-A-001: N25D A 99,7% 8,10

ZH1-A-002: F27Y A 99,7% 7,93

ZH1-A-003: F27H A 99,7% 7,78

ZH1-A-004: R35K A 99,7% 8,98

ZH1-A-005: R35Q A 99,7% 8,56

ZH1-A-006: N25D/S29P/V42I/V43T A 98,8% 7,84

ZH1-A-007: I26V/R31A/F32Y/F46Y A 98,8% 8,61

ZH1-A-S02: N25D/I26V/F27Y/S29P/R31A/F32Y/R35K/V37A/V42I/V43T/F46Y A 96,6% 8,73

ZH1-A-S03: N25D/I26V/F27H/S29P/R31A/F32Y/R35Q/V42I/V43T/F46Y A 97,0% 8,52

ZH1-B-001: D53G B 99,7% 8,10

ZH1-B-002: N54M B 99,7% 8,41

ZH1-B-003: N54R B 99,7% 8,33

ZH1-B-004: S69G B 99,7% 8,06

ZH1-B-005: P72E B 99,7% 8,65

ZH1-B-006: P72R B 99,7% 8,78

ZH1-B-S02: N54M/L57V/L60I/S69G/P72E/V73A B 98,2% 8,51

ZH1-B-S03: D53G/N54R/L57V/L60I/P72E/V73A B 98,2% 8,56

ZH1-B-S04: N54R/L57V/L60I/P72E/V73A B 98,5% 8,96

ZH1-B-S14: N54R/L58V/L59P/L60V/T64G/P72R/G75P/L77P B 97,6% 8,68

ZH1-C-001: N80H C 99,7% 8,24

ZH1-C-002: N80D C 99,7% 8,48

ZH1-C-003: F84Y C 99,7% 8,65

ZH1-C-S06: N80H/F84Y C 99,4% 8,88

ZH1-C-S10: N80H/F84H C 99,4% 8,32

ZH1-C-S14: E79R/N80D C 99,4% 8,45

ZH1-D-001: T95S D 99,7% 8,53

ZH1-D-002: R99K D 99,7% 8,25

ZH1-D-003: V123I D 99,7% 8,17

ZH1-D-004: A125G D 99,7% 8,36

ZH1-D-005: G126A D 99,7% 8,41

ZH1-D-006: G130A D 99,7% 8,69

ZH1-D-007: G130V D 99,7% 8,54

ZH1-D-008: G131A D 99,7% 8,71

ZH1-D-009: N127D D 99,7% 8,29

ZH1-D-010: N127Q D 99,7% 8,34

ZH1-D-011: A141S D 99,7% 8,67

ZH1-D-012: F106W D 99,7% 7,84

ZH1-D-013: I118V D 99,7% 8,37

ZH1-D-014: I118V/V123L D 99,4% 8,55

ZH1-D-015: I118V/K119R/L132V D 99,1% 8,86

ZH1-D-016: W96Q/F106W/L116G/V122A D 98,8% 8,65

ZH1-D-017: Q91R/N105D/K119G/A141S/M142K D 98,5% 8,46

ZH1-D-S02: T95S/T97A/R99K/I118V/V123I/L132V/A141S D 97,7% 8,66

ZH1-D-S03: T95S/R99K/1118V/K119R/L132V/A141S D 98,2% 9,32

ZH1-D-S04: T95S/R99K/I118V/L132V/A141S D 98,5% 9,15

ZH1-D-S05: T95S/R99K/I114M/I118V/K119R/L132V/A141S D 97,7% 8,84

ZH1-D-S07: R99G/A115D/K119G/P121T/V123I/A125S/L132V/L133V/S138A/Y140F/ A141S/M142L D 96,3% 8,79

ZH1-D-S08: R93K/W96Q/R99G/D104N/N105L/F106M/A115S/V123I/A125S/G144N D 97,0% 8,86

ZH1-D-S09: R99G/S102N/D104N/N105T/F106W/L110V/V111E/A115D/K119G/V122 T/V123L/L132V/L133I/S138A/M142K D 95,4% 8,99

ZH1-D-S10: W96R/S102T/F106I/I114L/ D 96,0% 9,12

: A115S/L116G/K119G/V122A/V123F/A125S/A134S/Y140F/M142E

ZH1-D-S11: W96R/R99G/S102T/F106V/I114L/A115D/L116G/K119G/V122A/V123F/ A125S/N127L/L133A/A134S/Y140F/M142K D 95,1% 8,54

ZH1-D-S12: S94T/R99G/S102T/N105I/L110V/A115D/K119G/P121E/V122T/V123L/V 124I/L133I/A134G/S138A/Y140F/M142K D 95,1% 8,69

ZH1-D-S13: R93Q/R99G/N105T/R112K/A115D/L116I/A125S/N127L/L132V/L133V/A 134S/Y140F/M142K D 96,0% 8,47

ZH1-D-S14: Q91R/W96R/N105D/I114L/I118V/K119R/V122A/L132V/L137S D 97,3% 8,55

ZH1-E-001: Y165C E 99,7% 8,46

ZH1-E-002: Y165H E 99,7% 8,33

ZH1-E-003: P163T E 99,7% 7,95

ZH1-E-004: A154P/Y165C E 99,4% 8,13

ZH1-E-S02: P163T/A164T/Y165C/V169I/L170R E 98,5% 8,83

ZH1-E-S05: A154P/Y165H/L170R E 99,1% 9,65

ZH1-F-001: Y180F F 99,7% 8,35

ZH1-F-002: D182T F 99,7% 8,41

ZH1-F-003: D182K F 99,7% 8,19

ZH1-F-004: Y180F/R181V/I190V F 99,1% 8,56

ZH1-F-S04: Y180F/D182T/F183Y/I190V/G191S F 98,5% 8,56

ZH1-F-S06: Y180F/D182T/F183Y/I190V F 98,8% 8,64

ZH1-F-S10: E178A/R181V/D182K/F183 F 98,8% 7,55

: Y

ZH1-H-001: T236K H 99,7% 8,09

ZH1-H-002: V237F H 99,7% 8,11

ZH1-H-003: E234G H 99,7% 8,54

ZH1-H-S02: F233W H 99,7% 8,37

ZH1-H-S03: F233Y H 99,7% 8,64

ZH1-H-S04: F233H H 99,7% 8,36

ZH1-H-S06: A231V/F233Y H 99,4% 8,54

ZH1-H-S09: F232W/F233A/E234T/G235D/L239A H 98,5% 8,83

ZH1-I-001: H240N I 99,7% 8,54

ZH1-I-002: H240S I 99,7% 8,79

ZH1-I-003: D244E/R245Y I 99,4% 8,42

ZH1-I-S02: D244E/R245Q/M246L I 99,1% 8,36

ZH1-I-S03: H240N/D244E I 99,4% 9,26

ZH1-I-S06: H240S/D244E I 99,4% 9,02

ZH1-I-S07: L239Q/H240T/R245Y I 99,1% 8,41

ZH1-J-001: Q249R J 99,7% 8,36

ZH1-J-002: T252V J 99,7% 7,94

ZH1-J-S02: I254V J 99,7% 8,55

ZH1-J-S03: Q249R/K251N/I254V J 99,1% 9,03

ZH1-J-S07: T252V/I254M J 99,4% 7,81

ZH1-J-S10: T252V/I254V J 99,4% 7,97

ZH1-K-S05: A260M K 99,7% 8,64

ZH1-K-S11: A260F K 99,7% 8,82

ZH1-K-S13: A260S K 99,7% 9,01

ZH1-L-001: E266Y L 99,7% 8,46

ZH1-L-002: E266D L 99,7% 8,31

ZH1-L-003: T262G L 99,7% 8,32

ZH1-L-004: T262D/E266D/ L 99,4% 8,56

ZH1-L-005: T262G/I263T/ L 99,4% 8,68

ZH1-L-S02: E266D/E269H L 99,4% 8,59

ZH1-L-S04: I263T/E269N L 99,4% 8,73

ZH1-L-S06: E269N L 99,7% 8,69

ZH1-L-S13: E266Y/E269N L 99,4% 8,33

ZH1-M-001: L274M M 99,7% 8,29

ZH1-M-002: L274C M 99,7% 8,37

ZH1-M-S02: L277E M 99,7% 8,96

ZH1-M-S07: L274M/A279V M 99,4% 8,23

ZH1-M-S08: L274T/L277F M 99,4% 8,63

ZH1-M-S11: L274C/L277I M 99,4% 8,51

ZH1-N-001: H297L N 99,7% 8,27

ZH1-N-002: H298V/L302S N 99,4% 9,03

ZH1-N-S02: H298V N 99,7% 8,94

ZH1-N-S09: H298L/P299D N 99,4% 8,37

ZH1-O-001: L307Q O 99,7% 8,62

ZH1-O-002: F308S O 99,7% 8,57

ZH1-O-S02: L307Q/A311P O 99,4% 8,34

ZH1-O-S03: L307Q/F308S O 99,4% 8,74

ZH1-O-S06: L307Q/F308S/D309A O 99,1% 9,18

ZH1-B/H-001: D53G/N54R/L57V/L60I/P72E/V73A/F233V/E234G/V237F B+H 97,3% 9,26

ZH1-C/D-001: N80H/F84Y/T95S/R99K/I118V/K119R/L132V/A141S C+D 97,6% 9,31

ZH1-D/K-001: T95S/T97A/R99K/I118V/V123I/L132V/A141S/A260M D+K 97,6% 9,66

ZH1-D/M-001: T95S/T97A/R99K/I118V/V123I/L132V/A141S/L277E D+M 97,6% 10,63

ZH1-K/N-001: A260M/H298V K+N 99,4% 8,94

ZH1-K/L-001: A260M/T262D/E266D/E269H K+L 98,8% 9,03

ZH1-K/L-002: A260M/T262G/I263T/E269N K+L 98,8% 8,84

ZH1-N/O-001: Q296A/H298V/L307Q/A311P N+O 98,8% 9,26

ZH1-N/O-002: Q296E/H298V/L302S/L307Q/F308S N+O 98,5% 9,46

ZH1-C/D/J- 001: N80H/F84Y/T95S/R99K/I118V/L132V/A141S/Q249R/K251N/I254V C+D+J 97,0% 9,97

ZH1-B/D/K- 001: D53G/N54R/L57V/L60I/P72E/V73A/T95S/R99K/I114M/I118V/K119R/L1 32V/A141S/A260M B+D+K 95,7% 10,78

ZH-J/K/L-001: I254V/I256L/A260M/T262G/I263T/E269N J+K+L 98,2% 9,11

ZH1-J/K/LM- 001: I254V/I256L/A260M/T262D/E266D/E269H/L271V J+K+L+M 97,7% 9,14

ZH1-B/C/D/J- 002: E79R/N80D/D53G/N54R/L57V/L60I/P72E/V73A/W96R/R99G/S102T/F1 06V/I114L/A115D/L116G/K119G/V122A/V123F/A125S/N127L/L133A/A 134S/Y140F/M142K/T252V/I254V B+C+D+J 92,1% 11,31

ZH1-DEL-001: AP212 - 99,7% 8,56

ZH1-DEL-002: AG5/AT6/AR7/AS8/AE9/AA10/AA11/AD12/AA13/AA14/AT15/AQ16/AA1 7/AR18/AQ19 - 95,4% 8,37

ZH1-DEL-003: AN327/AD328 - 99,4% 8,27

ZH1-A/B/C- 001: N25D/I26V/F27Y/S29P/R31A/F32Y/R35K/V37A/V42I/V43T/F46Y/N54R/ L58V/L59P/L60V/T64G/P72R/G75P/L77P/R99G/S102N/D104N/N105T/ F106W/L110V/V111E/A115D/K119G/V122T/V123L/L132V/L133I/S138A /M142K A+B+C 89,6% 9,54

ZH1- DEL/B/C/D/J- 001: AG5/AT6/AR7/AS8/AE9/AA10/AA11/AD12/AA13/AA14/AT15/AQ16/AA1 7/AR18/AQ19/AP212/AN327/AD328/E79R/N80D/D53G/N54R/L57V/L60 I/P72E/V73A/W96R/R99G/S102T/F106V/I114L/A115D/L116G/K119G/V 122A/V123F/A125S/N127L/L133A/A134S/Y140F/M142K/T252V/I254V B+C+D+J 86,6% 11,52

ZH1- DEL/A/B/C/D/J -001: AG5/AT6/AR7/AS8/AE9/AA10/AA11/AD12/AA13/AA14/AT15/AQ16/AA1 7/AR18/AQ19/AP212/AN327/AD328/N25D/I26V/F27Y/S29P/R31A/F32 Y/R35K/V37A/V42I/V43T/F46Y/E79R/N80D/D53G/N54R/L57V/L60I/P7 2E/V73A/W96R/R99G/S102T/F106V/I114L/A115D/L116G/K119G/V122 A/V123F/A125S/N127L/L133A/A134S/Y140F/M142K/T252V/I254V A+B+C+D+J 83,3% 10,92

ZH1-001: L302S - 99,7% 8,31

Tabla 5: Actividades específicas de variantes del polipéptido con la secuencia ID NO 2. La posición de la o las mutaciones se indica con relación a la secuencia de aminoácidos con la secuencia ID NO 2. Las identidades de la secuencia se determinaron mediante BLAST, tal como se describe en el Ejemplo 2.

Variante: Mutación(es) Identidad con Secuencia ID-NO 2 Actividad esp. [U/mg]

ZH2-001: D3D(GTRSEAADAATQARQL) 93,6% 10,15

ZH2-002: D8N/V9I/Y10F 99,0% 10,42

ZH2-003: M37N/E55P/A56V/V101I/S124A/F194FP/T146P/T147A/C148Y 97,0% 10,58

ZH2-004: S187P/S188A/P189K/M190A/A191M/R192Q/Y193L 97,7% 10,43

ZH2-005: A262E/R263H/R265Q/L266D/L267I/M268I/E269R 97,7% 10,68

ZH2-006: D3D(GTRSEAADAATQARQL)/M37N/E55P/A56V/V101I/S124A/F194FP/T146P/T147A/C148Y/S 187P/S188A/P189K/M190A/A191M/R192Q/Y193L/A262E/R263H/R265Q/L266D/L267I/M268I/E 269R 86,1% 10,71

5

Ejemplo 6: Degradación de ZEN y derivados de ZEN en maíz contaminado

Para la determinación de la capacidad de los polipéptidos de degradar ZEN y derivados de ZEN que se presentan de forma natural en una matriz compleja y a un valor de pH bajo, maíz contaminado se mezcló con diferentes concentraciones de en cada caso uno de los polipéptidos con la secuencia ID NO 1 a 6 y se vigiló la degradación de 10 ZEN y derivados de ZEN.

El maíz contaminado se molió y se empleó en el ensayo de degradación, consistiendo una tanda de 1 g de maíz molido y contaminado, 8,9 ml de tampón acetato 100 mM, pH = 4,0 y 0,1 ml de solución polipeptídica. Se prepararon soluciones polipeptídicas enriquecidas y purificadas tal como se describe en el Ejemplo 5, diluyéndose éstas hasta una concentración de 10 mU/ml, 100 mU/ml o bien 1.000 mU/ml. En la tanda se emplearon, por consiguiente, 15 absolutamente 1 mU (= 1 mU/g de maíz), 10 mU (= 10 mU/g de maíz), o bien 100 mU (= 100 mU/g de maíz). Cada una de las tandas de degradación se llevó a cabo en frasquitos de vidrio de 25 ml y se incubó a 37 °C bajo agitación con 100 rpm. Antes de la adición de la enzima o bien después de incubación durante 1 hora, se tomó en cada caso una muestra de 1 ml, el polipéptido se inactivó por calor durante 10 min a 99 °C y la muestra se almacenó a -20 °C. Después de la descongelación de la muestra, los componentes no solubles se separaron mediante centrifugación. 20 Concentraciones en ZEN, así como en derivados de ZEN se midieron mediante LC/MS/MS tal como se describe en M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). El contenido de ZEN y derivados de ZEN en este maíz ascendió para ZEN a 238 ppb, para a-ZEL a 15 ppb, para p-ZEL a 23 ppb, para Z14G a 32 ppb y para Z14S a 81 ppb. En la Tabla 6 se representa la disminución porcentual del contenido de ZEN y de derivados de ZEN en el ensayo de degradación.

5

10

15

20

25

30

Tabla 6: Reducción en porcentaje de ZEN y derivados de ZEN referida al contenido inicial del ensayo de degradación de diferentes polipéptidos y mezclas de polipéptidos

Polipéptido: Cantidad en la tanda ZEN a-ZEL p-ZEL Z14G Z14S

Secuencia ID NO 1: 0,1mU 83% >80% 70% 78% 80%

1mU: 96% >80% 76% >80% 92%

10mU: 97% >80% >85% >80% 94%

Secuencia ID NO 2: 0,1mU 87% >80% 73% >80% 84%

1mU: 97% >80% 78% >80% 90%

10mU: 99% >80% >85% >80% 96%

Secuencia ID NO 3: 0,1mU 79% 79% 67% 73% 75%

1mU: 85% >80% 72% 79% 82%

10mU: 92% >80% 78% >80% 88%

Secuencia ID NO 4: 0,1mU 82% 78% 65% 76% 80%

1mU: 89% >80% 73% >80% 86%

10mU: 93% >80% 82% >80% 91%

Secuencia ID NO 5: 0,1mU 79% 76% 66% 78% 80%

1mU: 83% >80% 73% >80% 81%

10mU: 91% >80% 79% >80% 86%

Secuencia ID NO 6: 0,1mU 93% >80% 75% >80% 90%

1mU: 95% >80% 82% >80% 92%

10mU: 98% >80% >85% >80% 96%

Ejemplo 7: Aditivos que contienen polipéptidos para la disociación hidrolítica de ZEN y/o derivados de ZEN

Para la preparación de aditivos para la disociación hidrolítica de ZEN, sobrenadantes de la fermentación de polipéptidos expresados mediante P. pastoris con la secuencia ID NO 1, secuencia ID NO 2, secuencia ID NO 6 y secuencia ID NO 13 se purificaron mediante microfiltración y ultrafiltración (límite de exclusión: 10 kDa) bajo condiciones convencionales y se concentraron hasta una concentración de sustancia seca de aproximadamente 9% en peso. A continuación, estas soluciones con contenido en polipéptidos se continuaron elaborando con un secador de pulverización (Mini B290 de Büchi), asimismo bajo condiciones convencionales, para formar polvos secos. Estos cuatro polvos se designaron sucesivamente como aditivos Z1, Z2, Z6 y Z13. Z1, Z2, Z6 o bien Z13 se mezclaron, además, con bentonita con un tamaño medio de grano de aprox. 1 pm, en una relación de 1% en peso de aditivo Z1, Z2, Z6 o bien Z13 y 99% en peso de bentonita en un agitador rotatorio Los aditivos, así contenidos, se designan aditivo Z1.B, aditivo Z2.B, Z6.B y Z13.B. Además, Z1, Z2, Z6 y Z13 se mezclaron con bentonita y en un concentrado de elementos traza de vitaminas en una relación de 0,1% en peso de aditivo Z1, Z2, Z6 o bien Z13, 0,9% en peso de concentrado de elementos traza de vitaminas y 99% en peso de bentonita en un agitador rotario. Los aditivos, así contenidos, se designaron aditivo Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS y Z13.BVS. 100 g de los aditivos Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS y Z13.BVS contenían 200 mg de sulfato de hierro, 50 mg de sulfato de cobre, 130 mg de óxido de estaño, 130 mg de óxido de manganeso, 2,55 mg de carbonato de calcio, 160 mg de vitamina E, 6,5 mg de vitamina K3, 6,5 mg de vitamina B1, 14 mg de vitamina B2, 15 mg de vitamina B6, 0,15 mg de vitamina B12, 150 mg de ácido nicotínico, 30 mg de ácido pantoténico y 5,3 mg de ácido fólico.

Los aditivos se extrajeron en un tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2 durante 30 minutos y se continuó diluyendo en el mismo tampón de modo que la concentración final de polipéptidos se encontraba en aprox. 70 ng/ml.

A continuación, se determinó el efecto degradante de zearalenona de estas soluciones tal como se describe en el Ejemplo 5. Las correspondientes actividades eran para Z18. 230 U/g, para Z29. 310 U/g, para Z69. 214 U/g, para Z1.B 83 U/g, para Z2.B 92U/g, para Z2.C 90 U/g, para Z13. B57 U/g, para Z1.BVS 8 U/g, para Z2.BVS 9 U/g, para Z6.BVS 9 U/g y para Z13.BVS 6U/g.

La capacidad para la degradación de los derivados de ZEN, a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL, Z14G, Z14S y ZAN por parte de los aditivos Z1, Z2, Z6, Z13, Z1.B, Z2.B, Z6.B, Z13.B, Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS y Z13.BVS se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 4, pero en lugar de 100 pl de un lisado celular se emplearon 100 pl de una solución polipeptídica con una concentración de polipéptidos de aprox. 70 ng/ml. Después de incubación durante 6

10

horas ya sólo estaba presente como máximo 15% de la cantidad de partida en forma de un derivado de ZEN no hidrolizado.

Listado de secuencias

<110> Erber Aktiengesellschaft

<120> Polipéptido para la escisión hidrolítica de derivados de zearalenona y/o zearalenona <130> P05342PCT <160> 67

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 328 <212> PRT

<213> Rhodococcus erythropolis <400> 1

Met Ala Glu Glu Gly Thr Arg Ser Glu Ala Ala Asp Ala Ala Thr Gln

15 10 15

Ala Arg Gln Leu Pro Asp ser Arg Asn lie Phe val Ser His Arg phe 20 25 30

Pro Glu Arg Gln val Asp Leu Gly Glu Val Val Met Asn Phe Ala Glu 35 40 45

Ala Gly Ser Pro Asp Asn Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Glu Gln Thr 50 55 60

Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Pro val Met Gl y Leu Leu Al a Glu Asn

65 70 75 80

Phe His val Phe Al a val Asp lie Arg Gly Gln Gly Arg Ser Thr Trp

85 90 95

Thr Pro Arg Arg Tyr ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu val Arg 100 105 110

Phe lie Ala Leu val lie Lys Arg Pro val val val Ala Gly Asn ser 115 120 125

Ser Gly Gly Leu Leu Al a Al a Trp Leu ser Al a Tyr Ala Met Pro Gly 130 135 140

Gln lie Arg Al a Al a Leu cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu

145 150 155 160

Leu val Pro Ala Tyr Gly His Ser Val Leu Gln Al a Al a Gly Pro Al a

165 170 175

Phe Glu Leu Tyr Arg Asp Phe Leu Gly Asp Gln Trp Ser lie Gly Asp 180 185 190

5

Trp: Lys Gly Phe val Glu Al a Al a


: 195 200

Gln: Leu Phe Pro Thr Pro ASp Glu

: 210 215

Asp: Pro Glu Trp Gly Arg Ala Phe

225: 230

cys: Pro Hi S Asp Arg Met Leu Ser




: 245

Thr: Hi s Hi S Ala Arg Thr lie Asp



: 260

Ala: Leu Ser Asp Leu Gln Ala Glu


: 275 280

Al a: Gly Val Arg val Asp Tyr Gl n

: 290 295

Met: HÍS Leu Phe Asp Pro Al a Arg

305: 310

Ser: Al a Thr Leu Pro Al a Asn Asp




: 325

Lys: Ala Ser Pro Al a Lys Ala Met




: 205

Ala: Pro Gln Asn Leu Lys Glu Tyr



: 220

Phe: Glu Gly Thr val Ala Leu Hi s


: 235 240

Gln: val Lys Thr Pro lie Leu lie

: 250 255

Pro: Glu Thr Gly Glu Leu Leu Gly

265: 270

Hi s: Ala Gln Asp lie lie Arg Ser



: 285

Ser: Hi s Pro Asp Al a Leu Hi s Met



: 300

Tyr: Ala Glu lie Leu Thr ser T rp

315 320

<210>2 <211> 308 <212> PRT

<213> Streptomyces violaceusniger <400>2

Met: Al a Asp Pro Ala Gln Arg Asp val Tyr val Pro Hi S Ala Tyr Pro

1: 5 10 15

Gl U: Lys Gln Al a Asp Leu Gly Glu lie Thr Met Asn Tyr Ala Glu Ala


: 20 25 30

Gly: Gl U Pro Asp Met Pro Al a Val Leu Leu lie pro Glu Gln Thr
Gly


: 35 40 45

Ser: Trp T rp Gly Tyr Glu Glu Al a Met Gly Leu Leu Al a Glu Asn Phe

: 50 55 60

Hi s: val Tyr Ala val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp Ala

65: 70 75 80

Pro: Lys Arg Tyr ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu val Arg Phe




: 85 90 95

lie: Al a Leu Val val Lys Arg Pro val lie val Ala Gly Asn Ser Ser



: 100

Gly
Gly: val Leu Al a Al a


: 115

val: Arg 130 Gl y Al a Leu Cys

Val: Thr Thr Cys Gly Hi s

145: 150

Glu: Leu Phe Arg Thr Tyr




: 165

Thr: Gly Tyr Cys Arg Al a



: 180

Tyr: Phe val Al a Asp Glu


: 195

Glu: Trp Al a Arg Al a Phe

: 210

Hi s: Glu Gln Leu Leu Thr

225: 230

Hi s: Met Arg Asp lie Asp




: 245

ser: Asp Glu Gln Ala Ala


: 260

val: Lys val Asp Tyr Ala

: 275

Gln: Phe Asp Pro Pro Arg

: 290

Thr: Leu Ala Al a

105

110

120

125

135

140

155

160

170

175

185

190

200

205

215

220

235

240

250

255

265

270

280

285

295

300

305

<210>3 <211> 309 <212> PRT

5 <213> Streptomyces coelicolor

<400>3

Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp val Hi s val Pro His Ala Tyr 15 10 15

pro Glu Gln Gln val Asp Leu Gly Glu lie Thr Met Asn Tyr Ala Glu 20 25 30

Ala: Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala val Leu Leu lie Pro Glu Gl n Thr


: 35 40 45

Gly: Ser T rp T rp Ser Tyr Glu Gl u Al a Met Gly Leu Leu Al a Glu Hi s

: 50 55 60

Phe: Hi S Val Tyr Al a Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg ser Ser Trp

65: 70 75 80

Thr: Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg




: 85 90 95

Phe: lie Ala Leu val Val Arg Arg Pro val val val Al a Gly Asn Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu ser Ala Tyr ser Met Pro Gly 115 120 125

Gln lie Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu 130 135 140

Leu: val Pro Al a Hi S Gly Hi s Ser val Arg Gln Gly Al a Gly Pro Val

145: 150 155 160

Phe: Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser val Gly Asp




: 165 170 175

Trp: Glu Gly Phe Arg Ser Al a Al a Asp Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala

180 185 190

Arg Ser Phe Val Al a Asp Thr lie Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp 195 200 205

Pro: Gl U Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr val Gly Leu Asn Cys

: 210 215 220

Pro: Hi S Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro val Leu Leu Thr

225: 230 235 240

His: Hi S Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Al a

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln val Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala 260 265 270

Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met 275 280 285

His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu lie Leu Thr Pro Trp Thr 290 295 300

Ala Ala Leu Ala Pro 305

<210>4

5 <211> 309

<212> PRT

<213> Streptomyces rapamycinicus <400> 4

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona, caracterizado por que el polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos con una secuencia ID NO 1 de al menos 70%, preferiblemente al menos 84%, en particular preferiblemente al menos 92% y lo más preferiblemente al menos 98%, o contiene un fragmento funcional del mismo.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado por que la variante presenta una modificación de aminoácidos elegida del grupo sustitución, deleción e inserción de uno o varios aminoácidos.
3. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la enzima presenta una actividad específica de al menos 0,01 U/mg, preferiblemente al menos 0,1 U/mg, en particular al menos 1 U/mg; y/o presenta un valor Km de la disociación hidrolítica de ZEN de a lo sumo 50 pM, preferiblemente a lo sumo 3,5 pM, en particular a lo sumo 0,5 pM; y/o posee un valor kcat de la disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,05 s-1, preferiblemente al menos 0,6 s-1, en particular al menos 5 s-1; y/o posee un valor vmáx de la disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,00001 pM-1s-1, preferiblemente al menos 0,0001 pM-1s-1, en particular al menos 0,001 pM-1s-1.
4. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que presenta al menos una mutación de la

secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia ID NO 1 en al menos una de las siguientes posiciones: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119,

123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198,

201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245,

246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296,

298, 302, 307, 308, 309, 311, 314, 317, 319, 321, 323, 325 y 326.
5. Polipéptido según la reivindicación 4, caracterizado por que el polipéptido presenta al menos una mutación

elegida del grupo: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E,

F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R,

L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V,

F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N,

I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P en la secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia ID NO 1.
6. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que está contenido al menos uno de los siguientes motivos de aminoácidos elegidos del grupo de la secuencia ID NO 30 a 67.
7. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que está contenida al menos una secuencia de aminoácidos de la secuencia ID NO 1 o al menos un fragmento funcional de la misma.
8. Polipéptido según la reivindicación 7, caracterizado por que el polipéptido contiene al menos una sustitución conservativa de aminoácidos en al menos una posición, y la sustitución conservativa de aminoácidos se elige de sustituciones de polipéptidos G a A; o A a G, S; o V a I, L, A, T, S; o I a V, L, M; o L a I, M, V; o M a L, I, V; o P a A, S, N; o F a Y, W, H; o Y a F, W, H; o W a Y, F, H; o R a K, E, D; o K a R, E, D; o H a Q, N, S; o D a N, E, K, R, Q; o E a Q, D, K, R, N; o S a T, A; o T a S, V, A; o C a S, T, A; o N a D, Q, H, S; o Q a E, N, H, K, R.
9. Polinuclóetrido aislado, caracterizado por que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que posee una propiedad hidrolizante de zearalenona y/o derivados de zearalenona y/o presenta un grado de identidad de la secuencia con al menos el grupo elegido de las secuencias de nucleótidos ID NO 15 o 16 de al menos 70%.
10. Aditivo, caracterizado por que está contenido al menos un polipéptido capacitado para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona según una de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Aditivo según la reivindicación 10, caracterizado por que adicionalmente están contenidos al menos un soporte inerte, así como, eventualmente, otros componentes tales como vitaminas y/o sustancias minerales y/o enzimas y/o otros componentes para la destoxificación de micotoxinas.
12. Aditivo según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por que el polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 8 está contenido en el aditivo en una concentración de a lo sumo 10.000 U/g, preferiblemente a lo sumo 1.000 U/g, más preferiblemente a lo sumo 100 U/g y lo más preferiblemente a lo sumo 10 U/g.
13. Aditivo según una de las reivindicaciones 10, 11 o 12, caracterizado por que el polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 8 está presente en forma encapsulada o recubierta.
14. Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de derivados de zearalenona, caracterizado por que zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona se hidroliza mediante un polipéptido según una de las

5 reivindicaciones 1 a 8 y/o un aditivo según una de las reivindicaciones 10 a 13.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por que el polipéptido o el aditivo se mezcla con un alimento para animales o alimento, que está contaminado con zearalenona y/o con al menos un derivado de zearalenona, por que un animal o un ser humano ingiere el alimento para animales o alimento contaminado y por que el polipéptido o el aditivo hidroliza en el tracto digestivo la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona

10 contenido en el alimento para animales o alimento contaminado, en donde en el caso de alimento para animales o alimento húmedo la hidrólisis de la zearalenona y/o del al menos un derivado de zearalenona puede tener lugar antes de la ingesta oral en el alimento para animales o alimento húmedo.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14 a 15, caracterizado por que se hidroliza al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, en particular al menos 90% de la zearalenona y/o del al menos un derivado de

15 zearalenona.

imagen1

[jjmoi/s] [jjmol/s]

Fig.2

0,012

0,010

0,008

0,006

0,004

0,002

0,000

imagen2

10

[mM]

15

Fig. 2A

20

0,012

0,010

0,008

0,006

0,004

0,002

0,000

imagen3

Fig. 2B

[MM]