EA037776B1 - Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных соединений зеараленона, полинуклеотид, выделенный из него, а также содержащая полипептид добавка, его применение, а также способ - Google Patents
Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных соединений зеараленона, полинуклеотид, выделенный из него, а также содержащая полипептид добавка, его применение, а также способ Download PDFInfo
- Publication number
- EA037776B1 EA037776B1 EA201891967A EA201891967A EA037776B1 EA 037776 B1 EA037776 B1 EA 037776B1 EA 201891967 A EA201891967 A EA 201891967A EA 201891967 A EA201891967 A EA 201891967A EA 037776 B1 EA037776 B1 EA 037776B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- amino acid
- zearalenone
- zen
- Prior art date
Links
- MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N zearalenone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N 0.000 title claims abstract description 216
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 191
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 190
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 190
- MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N trans-Zearalenon Natural products O=C1OC(C)CCCC(=O)CCCC=CC2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 166
- 239000000654 additive Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims abstract description 18
- -1 zearalenone derivative compounds Chemical class 0.000 title claims description 22
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title abstract description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title abstract description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 63
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 18
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 18
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 14
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 claims description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 claims description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 102220057257 rs730881170 Human genes 0.000 claims description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 102220559475 Transmembrane protein 207_L57V_mutation Human genes 0.000 claims description 10
- 102220039969 rs138542210 Human genes 0.000 claims description 10
- 102220023191 rs387907511 Human genes 0.000 claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 9
- 102200060761 rs121918667 Human genes 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102220493139 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating_F32Y_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 7
- 102220615310 RIB43A-like with coiled-coils protein 2_V43T_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 102220362271 c.137T>A Human genes 0.000 claims description 7
- 102220164107 rs201867379 Human genes 0.000 claims description 7
- 102200026976 rs35086888 Human genes 0.000 claims description 7
- 102200067010 rs587621539 Human genes 0.000 claims description 7
- 102220491472 Matrix metalloproteinase-23_F84Y_mutation Human genes 0.000 claims description 6
- 102220415904 c.104G>A Human genes 0.000 claims description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 102220245300 rs1404795980 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 102200058101 rs63750592 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220085632 rs777158919 Human genes 0.000 claims description 4
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 4
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 claims description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 claims description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 3
- 102220470959 Amiloride-sensitive sodium channel subunit delta_D22A_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220579739 Cohesin subunit SA-1_S51D_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 102200115278 rs121918085 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220149728 rs886061035 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220518654 Enhancer of filamentation 1_R31A_mutation Human genes 0.000 claims 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 102220276898 rs1553350175 Human genes 0.000 claims 1
- 102220273027 rs1555734913 Human genes 0.000 claims 1
- 102220011641 rs201315884 Human genes 0.000 claims 1
- 102220321659 rs775267971 Human genes 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 13
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 102220094017 rs876659369 Human genes 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 10
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 102220194842 rs34886500 Human genes 0.000 description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 6
- 102220571206 Renin_R31A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102220258451 rs1553659648 Human genes 0.000 description 6
- 102200047004 rs61752063 Human genes 0.000 description 6
- 102220628338 ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1_I26V_mutation Human genes 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 5
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 5
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 102220613594 Potassium voltage-gated channel subfamily D member 3_E79R_mutation Human genes 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102220251543 rs141774369 Human genes 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102200108201 rs1042522 Human genes 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001149472 Clonostachys rosea Species 0.000 description 2
- 102220570114 Cytochrome P450 1B1_L77P_mutation Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102220465357 Interferon alpha-8_L58V_mutation Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- APJDQUGPCJRQRJ-LBPRGKRZSA-N Zearalanone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 APJDQUGPCJRQRJ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 2
- FPQFYIAXQDXNOR-QDKLYSGJSA-N alpha-Zearalenol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@H](O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 FPQFYIAXQDXNOR-QDKLYSGJSA-N 0.000 description 2
- KEOYKWIOAINZSQ-UHFFFAOYSA-N alpha-Zearalenol Natural products CC1CCCC(O)CCC=CCc2cc(O)cc(O)c2C(=O)O1 KEOYKWIOAINZSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- DWTTZBARDOXEAM-JSGCOSHPSA-N beta-Zearalanol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@@H](O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 DWTTZBARDOXEAM-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- FPQFYIAXQDXNOR-PMRAARRBSA-N beta-Zearalenol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@@H](O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 FPQFYIAXQDXNOR-PMRAARRBSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220417887 c.178T>G Human genes 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 231100000085 chronic toxic effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 2
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- AMWRITDGCCNYAT-UHFFFAOYSA-L hydroxy(oxo)manganese;manganese Chemical compound [Mn].O[Mn]=O.O[Mn]=O AMWRITDGCCNYAT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220253369 rs201879717 Human genes 0.000 description 2
- 102200066852 rs5918 Human genes 0.000 description 2
- 102220070930 rs794728599 Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- FPQFYIAXQDXNOR-UHFFFAOYSA-N 7beta-trans-zearalenol Natural products O=C1OC(C)CCCC(O)CCCC=CC2=CC(O)=CC(O)=C21 FPQFYIAXQDXNOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241001346367 Apiotrichum mycotoxinivorans Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000894568 Catharanthus roseus Catharanthine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102220587362 Cellular tumor antigen p53_S94T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001268 Cholestyramine Polymers 0.000 description 1
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710089042 Demethyl-4-deoxygadusol synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000035976 Developmental Disabilities Diseases 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 102000005486 Epoxide hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 108020002908 Epoxide hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000187653 Nocardia globerula Species 0.000 description 1
- 206010067572 Oestrogenic effect Diseases 0.000 description 1
- 101100492653 Oryza sativa subsp. japonica AT15 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033264 Ovarian hyperfunction Diseases 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102220495859 Putative protein ZBED10P_Y10F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 1
- 241001464989 Rhodococcus globerulus Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000693619 Starmerella bombicola Lactone esterase Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187439 Streptomyces exfoliatus Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- APJDQUGPCJRQRJ-UHFFFAOYSA-N Zearalanone Natural products O=C1OC(C)CCCC(=O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 APJDQUGPCJRQRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- DWTTZBARDOXEAM-GXTWGEPZSA-N alpha-Zearalanol Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCC[C@H](O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 DWTTZBARDOXEAM-GXTWGEPZSA-N 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DWTTZBARDOXEAM-UHFFFAOYSA-N beta-Zearalanol Natural products O=C1OC(C)CCCC(O)CCCCCC2=CC(O)=CC(O)=C21 DWTTZBARDOXEAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N deoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N 0.000 description 1
- 229930002954 deoxynivalenol Natural products 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 201000006564 estrogen excess Diseases 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- JWHAUXFOSRPERK-UHFFFAOYSA-N propafenone Chemical compound CCCNCC(O)COC1=CC=CC=C1C(=O)CCC1=CC=CC=C1 JWHAUXFOSRPERK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000203 propafenone Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 102220270830 rs1222477746 Human genes 0.000 description 1
- 102200011318 rs132630269 Human genes 0.000 description 1
- 102220297569 rs745842220 Human genes 0.000 description 1
- 102220117226 rs757227955 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- XMWGSPLTTNCSMB-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O XMWGSPLTTNCSMB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N tin dioxide Chemical compound O=[Sn]=O XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001887 tin oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N vomitoxin hydrate Natural products OCC12C(O)C(=O)C(C)=CC1OC1C(O)CC2(C)C11CO1 LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
- A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
- A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
- Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Birds (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Полипептид, гидролитически расщепляющий зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, и представляющий собой гидролазу с аминокислотной последовательностью из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-15 или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%, добавка, содержащая полипептид, а также изолированный выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, и способ гидролитического расщепления полипептидом зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона.
Description
Изобретение относится к полипептиду для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона, к изолированному полинуклеотиду, кодирующему полипептид такого рода, к добавке, содержащей полипептид такого рода, к применению полипептида такого рода, а также к способу для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона.
Микотоксины представляют собой вторичные метаболиты, продуцируемые нитевидными грибами. Важным представителем микотоксинов является распространенный во всем мире зеараленон (ZEN), ранее известный как токсин F-2, продуцируемый большинством грибов рода Fusarium. Эти грибы поражают, в частности, культурные растения, такие как различные виды зерновых, причем, как правило, грибковое поражение появляется перед сбором урожая, при этом рост грибов или продуцирование микотоксинов может происходить перед хранением или при ненадлежащем хранении, а также после сбора урожая. FAO оценивает, что во всем мире 25% сельскохозяйственных продуктов загрязнены микотоксинами, что ведет к значительным экономическим потерям. Во время исследования, проведенного в недавнее время во всем мире с января 2009 года по декабрь 2011 года, в целом была проанализирована 23781 проба, причем 81% оказался положительным по меньшей мере на один микотоксин и 45% оказались положительными на ZEN. ZEN был найден также во всех регионах мира как во всех испытуемых зерновых и фуражных классах, таких как, например, кукуруза, соевая мука, пшеница, пшеничные отруби, DDGS (высушенная барда), так и в готовых кормовых смесях с частотой до 100%.
ZEN представляет собой нестероидный, эстрогенный макроциклический лактон, синтезируемый вследствие обмена веществ с участием поликетидов, имеющий структурную формулу
и называемый по номенклатуре ИЮПАК (2Е,11S)-15,17-дигидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-7,13-дион.
Однако в природе встречается также большое число производных соединений ZEN, которые образуются благодаря ферментативной или химической модификации ZEN. Примерами тому являются гликозидные или сульфатсодержащие конъюгаты ZEN, которые образуются вследствие метаболизма в грибах, растениях или млекопитающих, а также метаболиты ZEN, которые образуются, в частности, в организме человека или животного. В последующем тексте под производными соединениями ZEN понимают как встречающиеся в природе, так и получающиеся вследствие химического или биохимического синтеза конъюгаты ZEN или метаболиты ZEN и предпочтительно α-зеараленол (α-ZEL; (2E,7R,11S)-7,15,17тригидрокси-11 -метил-12-оксабицикло [12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-13-он), β-зеараленол (βZEL; (2E,7S,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен13-он), α-зеараланол (α-ZAL; (7R,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека1(18),14,16-триен-13-он), β-зеараланол (β-ZAL; (7S,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(14), 15, 17-триен-13-он), зеараленон-14-сульфат (Z14S; [(2Е,11S)-15-гидрокси-11метил-7,13 -диоксо-12-оксабицикло [12.4.0] октадека-1(18),2,14,16-тетраен-17-ил] гидросульфат), зеараленон-14-гликозид (Z14G;(2Е,11S)-15-гидрокси-11-метил-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидропиран-2-ил]окси-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18)2,14,16-тетраен-7,13-дион), а также зеараланон (ZAN; (11S)-15,17-дигидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),14,16триен-7,13-дион).
ZEN, также как и производные соединения ZEN, в первую очередь α-ZEL, β-ZEL, Z14S, α-ZAL, βZAL, Z14G и ZAN, вследствие своей высокой химической и физической стабильности могут быть обнаружены также в переработанных пищевых продуктах или кормах, таких как, например, хлеб или пиво.
ZEN связывается с рецептором эстрогена и может обуславливать гормональные расстройства, причем он абсорбируется непосредственно после орального приема и превращается млекопитающими в два стереоизомерных метаболита α-ZEL или β-ZEL. При этом, например, α-ZEL, а также α-ZAL или ZAN, оказывают эстрогенное действие намного более сильное, чем ZEN. Конъюгированные производные соединения ZEN иногда проявляют эстрогенизм более низкий, чем ZEN, однако из этих производных соединений ZEN в пищеварительном тракте может вновь высвобождаться ZEN.
Хотя ZEN обладает относительно низкой острой токсичностью и имеет значение оральной LD50 до 20000 мг/на кг массы тела, при длительном приеме может встречаться подострое и/или начальное хроническое токсическое действие, такое как, например, тератогенное, карциногенное, эстрогенное и иммуносупрессивное действие у животных или людей. Корм, загрязненный ZEN, ведет к нарушениям развития у млекопитающих, причем свиньи, в особенности молодые животные, являются крайне чувствительными по отношению к ZEN. Концентрации ZEN в корме больше 0,5 млн-1 ведут к нарушениям развития, причем, например, концентрации больше 1,5 млн-1 могут вести к гиперэстрогенизму у свиней, а концентра- 1 037776 ции ZEN больше 12 млн-1 были ответственными за выкидыши у крупного рогатого скота. Так как зеараленон быстро абсорбируется слизистыми оболочками, в частности слизистой оболочкой желудка, а также полости рта, то необходима немедленная и, в первую очередь, количественная дезактивация. Уже через 30 мин после перорального введения ZEN он может быть обнаружен в крови. При этом применение изолированных ферментов по сравнению с микроорганизмами имеет преимущества, заключающиеся в более высокой удельной активности или в более быстром действии. Вследствие вредного действия ZEN в Европейском Союзе установлены обязательные верхние границы содержания ZEN в пищевых продуктах, а также рекомендованы верхние границы содержания ZEN в кормах (№ ЕС: 1881/2006).
Первичная стратегия для уменьшения загрязнения ZEN пищевых продуктов или кормов состоит в ограничении роста грибов, например, за счет соблюдения надлежащей сельскохозяйственной практики. С этой целью, в частности, семенной материал освобождают от вредителей и грибкового поражения, а сельскохозяйственные отходы своевременно удаляют с полей. При этом благодаря применению фунгицидов может быть уменьшен рост грибов в условиях поля. После сбора урожай должен храниться с остаточной влажностью меньше 15% и при низкой температуре для предотвращения роста грибов. При этом продукт, затронутый грибковым поражением, должен быть удален перед дальнейшей переработкой. Несмотря на этот перечень мероприятий, I. Rodriges и K. Naehrer (2012) сообщили, что даже в регионах с наивысшими сельскохозяйственными стандартами, таких как США и Центральная Европа, в период с 2009 по 2011 год соответственно 29 и 39% проверенных проб кукурузы были загрязнены ZEN.
Другие возможности удаления ZEN из кормовых или пищевых продуктов предоставляет адсорбция или трансформация микотоксина. Для этого необходимо, чтобы связь микотоксина с адсорбентом была сильной и специфической в широкой области значений рН и оставалась стабильной в течение всего процесса пищеварения в желудочно-кишечном тракте. Хотя некоторые из адсорбентов небиологического происхождения, такие как, например, активированный уголь, силикаты или синтетические полимеры, такие как холестирамин, могут быть эффективно использованы в случае афлатоксинов, их применение в случае других микотоксинов является ограниченным. Существенный недостаток адсорбирующих агентов представляет собой неспецифическая связь с другими молекулами, которые частным порядком являются существенными для питания. Адсорбенты биологического происхождения, такие как, например, дрожжи или дрожжевые экстракты, в литературе также описаны, однако имеют похожие ограничения как и адсорбенты небиологического происхождения.
Детоксификация ZEN за счет физической и химической обработки также ограничена. ZEN не может быть эффективно деактивирован термической обработкой, однако содержание ZEN может быть уменьшено экструдированием и обработкой окислительными агентами, например в течение 16 ч при 80°C 10%-ным раствором пероксида водорода, на 83,9%. Применение способов экструзии и окислительных агентов, таких как озон или пероксид водорода, при производстве кормов и пищевых продуктов является ограниченным вследствие высоких расходов, потери качества, относительно низкой эффективности и низкой специфичности.
Биотрансформация ZEN посредством микроорганизмов, таких как, например, штаммы Trichosporon mycotoxinivorans, Gliocladium roseum или Bacillus subtilis, или выделенных из них ферментов, таких как гидролазы или пероксидазы, описана, например, Е. Vekiru et al. в Appl. and Environ. Microb., 2010, 76, 7, 2353-2359.
Из ЕР 0938575 B1 известны свойства бактерий вида Rhodococcus и Nocardia, предпочтительно R.globerulus, R.erythropolis и N.globerula в отношении расщепления ZEN.
Из WO 02/076205 может быть получена информация о расщепляющем ZEN действии ферментов, выделенных из Gliocladium roseum, в частности α/β-гидролазы, зеараленонгидролазы-1 (ZHD1), которая катализирует разложение ZEN посредством каталитической триады.
Из WO 2012/113827 можно получить информацию о рекомбинантных зеараленонгидролазах, а именно о расщепляющих ZEN ферментах, которые остаются стабильными в желудочно-кишечном тракте, в частности, там описаны такие микроорганизмы, как Thermobifidia fusca, Streptomyces exfoliatus, Acidovorans delafieldii и Streptomyces sp.
Полипептиды или ферменты, которые могут гидролизовать ZEN и/или по меньшей мере одно производное соединение ZEN, также могут быть обозначены как зеараленонгидролазы.
Используемые далее термины относятся к профессиональному языку и соответственно, если не указано иное, используются в традиционном значении. Так, например, термин полинуклеотид относится к любым видам генетического материала любых длин и последовательностей, таких как, например, одинарная спираль и двойная спираль молекул ДНК и РНК, включая регуляторные элементы, структурные элементы, группы генов, плазмиды, полные геномы и их фрагменты. Термин полипептид охватывает белки, такие как, например, ферменты, антитела, а также полипептиды, содержащие до 500 аминокислот, такие как, например, пептидные ингибиторы, белковые домены, а также короткие полипептиды с малыми длинами последовательностей, например меньше 10 аминокислот, такие как рецепторы, лиганды, пептидные гормоны, метки и т.п. Термин позиция в полинуклеотиде или полипептиде относится к отдельному, специфическому основанию или аминокислоте в последовательности полинуклеотида или полипептида.
- 2 037776
Таким образом, настоящее изобретение направлено на разработку полипептида, с которым удается ZEN и/или по меньшей мере одно производное соединение ZEN быстро и надежно трансформировать в гидролизованный ZEN и/или в гидролизованные производные соединения ZEN. С целью решения этой задачи настоящее изобретение, по существу, отличается тем, что полипептид представляет собой гидролазу с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 115, или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%.
Термин идентичность последовательности соответственно настоящему изобретению относится к процентной идентичности последовательности. Для аминокислотных и нуклеотидных последовательностей идентичность последовательности может быть определена визуально, но предпочтительно ее рассчитывают посредством компьютерной программы. Сравнение последовательностей осуществляют также внутри участков последовательностей, причем в качестве участка следует понимать непрерывную последовательность опорной последовательности, и предпочтительно охватывают консервативную область последовательности.
В данном случае идентичность последовательностей устанавливают посредством программы NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (программа поиска основных локальных выравниваний)), предпочтительно программы BLASTP в случае полипептидов и программы BLASTN в случае полинуклеотидов, которые доступны для использования на интернет-странице National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Таким образом, две или несколько последовательностей можно сравнивать друг с другом по алгоритму Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:33893402). С этой целью в настоящем изобретении была использована программа в версии от 15 мая 2013 года. В качестве программных установок были приняты базовые установки и, в частности, для выравнивания аминокислотных последовательностей: max target sequence (максимальное число целевых последовательностей)=100; expected threshold (ожидаемый порог)=10; word size (длина слова)=3; matrix (маmрица)=BLOSOM62; gap costs (штрафы за разрыв)=Existence (существование): 11; Extention (продолжение): 1; computational adjustment (вычислительная корректировка)=Conditional compositional score matrix adjustment (условная композиционная корректировка матрицы счета); а также для Word Size (длина слова) при выравнивании нуклеотидных последовательностей: 11; Expect value (ожидаемая значимость): 10; Gap costs (штрафы за разрыв): Existence (существование)=5, Extension (продолжение)=2; Filter (фильтр)=low complexity activated (активирована сложность низкого уровня); Match/Mismatch Scores (счет соответствий/несоответствий): 2, -3; Filter String (строка фильтра): L; m.
Выражения функциональный вариант полипептида или функциональный вариант относятся, вопервых, к аллельным вариантам полипептида и к функциональным фрагментам полипептида, а вовторых, к модификации полипептида, причем ферментативная функция по существу не изменяется. Термин аллельный вариант относится к полипептиду, который возникает благодаря одной или нескольким случайно происходящим в природе мутациям нуклеотидной последовательности и способствует изменению аминокислотной последовательности, причем на его ферментативную функцию влияние не оказывается. Модификации могут представлять собой, например, С- или N-концевые слияния с полипептидами или мутированные полипептиды, причем мутации могут быть получены заменой, вставкой или удалением по меньшей мере одной аминокислоты, предпочтительно сайт-специфическим мутагенезом или случайным мутагенезом, рекомбинацией и/или любым другим биоинженерным способом. Термины замена, инсерция и делеция являются традиционными в генной инженерии и используются специалистами в данной области техники в традиционно понимаемом значении. Выражение функциональный фрагмент относится к части или к частичной последовательности полипептида или к части или к частичной последовательности его функционального варианта, причем ферментативная функция по существу сохраняется. Ферментативная функция по существу сохраняется тогда, когда неизмененным остается механизм ферментативной реакции, т.е. микотоксин гидролизуется благодаря одному и тому же сайту, а удельная остаточная активность функционального варианта составляет по меньшей мере 5%, преимущественно по меньшей мере 10% и предпочтительно по меньшей мере 50% в расчете на изначальный полипептид. В случае полипептидов с аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 1-15 речь идет о функциональных аллельных вариантах друг с другом или одного и того же фермента, причем последовательности соответственно происходят из различных микроорганизмов. Это ясно видно из близкого сродства друг к другу, различимым образом определяемого по процентной идентичности последовательностей, а также из того факта, что все полипептиды воздействуют на ZEN и производные соединения ZEN по одному и тому же механизму разложения.
На основе сходства между собой аминокислотных последовательностей полипептидов с SEQ ID NO: 1-15 обеспечивается возможность того, что функциональный вариант одного из этих полипептидов обладает идентичностью последовательности по меньшей мере на 40% больше, чем один из задействованных полипептидов с SEQ ID NO: 1-15.
Благодаря выбору аминокислотной последовательности такого рода или ее функционального варианта обеспечивается поразительно быстрый и полный гидролиз ZEN и/или по меньшей мере одного про
- 3 037776 изводного соединения ZEN.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности или его функциональный вариант, причем функциональный вариант участка аминокислотной последовательности имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 84%, более предпочтительно по меньшей мере 92% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% и по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности выбран из группы аминокислотных последовательностей от +24 до +50, от +52 до +77, от +79 до +87, от +89 до +145, от +150 до +171, от +177 до +193, от +223 до +228, от +230 до +237, от +239 до +247, от +249 до +255, от +257 до +261, от +263 до +270, от + 272 до +279, от +297 до +301, от +303 до +313, от +24 до 328, от +1 до +328 последовательности с SEQ ID NO: 1. Благодаря наличию по меньшей мере одного консервативного участка аминокислотной последовательности такого рода удается разработать полипептид, который наряду с быстрым и полным гидролизом ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN обладает также особенно высокой активностью по сравнению с известными в настоящее время полипептидами, разлагающими ZEN.
Стабильно хорошие результаты удалось достигнуть тогда, когда соответственно другому варианту осуществления настоящего изобретения функциональный вариант содержал по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, выбранную из группы замен, делеций и инсерций одной или нескольких аминокислот.
Благодаря дальнейшей разработке настоящего изобретения, так что полипептид характеризуется удельной активностью, равной по меньшей мере 0,01 ед./мг, преимущественно по меньшей мере 0,1 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 1 ед./мг, и/или константой KM гидролитического расщепления ZEN, равной не более 50 мкМ, преимущественно не более 3,5 мкМ и предпочтительно не более 0,5 мкМ, и/или константой kcat гидролитического расщепления ZEN, равной по меньшей мере 0,05 с-1, преимущественно по меньшей мере 0,6 с-1 и предпочтительно по меньшей мере 5 с-1, и/или константой vmax гидролитического расщепления ZEN, равной по меньшей мере 0,00001 мкМ-1-с-1, преимущественно по меньшей мере 0,0001 мкМ-1-с-1 и предпочтительно по меньшей мере 0,001 мкМ^-с'1, ZEN и/или производные соединения ZEN могут быть особенно быстро и полностью гидролизованы и предпочтительно детоксифицированы.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 2, 5-7, 9, 11, 12 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, а рН-зависимая стабильность полипептида при рН 5,0 составляет по меньшей мере 15%, предпочтительно 50% и особенно предпочтительно по меньшей мере 90%. Благодаря другому варианту осуществления такого рода может быть обеспечено то, что полипептид будет расщеплять или детоксифицировать зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона также и в кислой среде, такой, как, например, среда, имеющаяся в желудках млекопитающих. При этом рН-зависимую стабильность полипептидов определяют как процентную остаточную активность полипептидов при рН 5,0 по отношению к активности при соответствующем оптимальном значении рН.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 5-7, 9, 11 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, а полипептид обладает наиболее высокой ферментативной активностью в температурном интервале от 30 до 75°C, предпочтительно от 38 до 55°C и особенно предпочтительно от 38 до 52°C. Благодаря другому варианту осуществления такого рода по настоящему изобретению обеспечивается то, что зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона также и при мезофильных температурах, как, в частности, в случае температуры тела человека и сельскохозяйственных животных, гидролизуется или детоксифицируется полипептидом. Температуру, при которой полипептид обладает наибольшей ферментативной активностью, определяют как значение температурного оптимума полипептида.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 5, 6, 9, 11, 12 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, а полипептид является термически стабильным до температуры 90°C, предпочтительно 75°C и особенно предпочтительно 60°C. Благодаря этому обеспечивается то, что полипептид и собственно его ферментативная функция остаются по существу неизмененными при повышенной тепловой нагрузке, которая может иметь место, например, во время транспортировки в контейнере или во время гранулирования кормов. Термическую стабильность полипептидов определяют как темпе- 4 037776 ратуру, при которой полипептиды после 15-минутной предварительной инкубации обладают 50%-ной остаточной активностью по сравнению с активностью при соответствующем значении температурного оптимума.
Полипептид может быть выбран так, чтобы он представлял собой α/β-гидролазу, которая является приемлемой для независящего от кислорода и в отсутствие кофакторов гидролитического расщепления сложноэфирной группировки зеараленона и/или производных соединений ZEN, и содержал катализирующую гидролитическое расщепление аминокислотную триаду, состоящую из серина, аминокислоты с кислой реакцией, выбранной из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и предпочтительно из аспарагиновой кислоты, а также из гистидина, и представляющую собой каталитическую триаду, например S128, D264 и H303, причем позиционирование приведено относительно SEQ ID NO: 1.
Гидролиз ZEN и производных соединений ZEN каждым из полипептидов с SEQ ID NO: 1-15 происходит по сложноэфирной группе зеараленона или его производных соединений согласно следующему механизму реакции:
ZEN HZEN DHZEN -
Гидролиз ZEN до неядовитого гидролизованного зеараленона (HZEN) или гидролизованных производных соединений ZEN происходит благодаря полипептидам по настоящему изобретению и предпочтительно α/β-гидролазам. Последующее декарбоксилирование HZEN до декарбоксилированного гидролизованного ZEN (DHZEN) или декарбоксилированных гидролизованных производных соединений ZEN происходит, как правило, спонтанно.
В частности, посредством указанной ранее каталитической триады удается полностью гидролизовать ZEN и производные соединения ZEN, причем реакция разложения характеризуется хорошей рНзависимой стабильностью, в частности в случае значений рН в кислой области.
Неожиданно было выявлено, что с полипептидом, который на участке последовательности, состоящем из 3 аминокислот перед серином и 3 аминокислот после серина указанной ранее каталитической триады, содержит по меньшей мере одну полярную аминокислоту, выбранную из Y, Q, N, Т, K, R, E, D, и по меньшей мере одну неполярную аминокислоту, выбранную из F, M, L, I, V, A, G, Р, удается достигать стабильно хорошие результаты и, кроме того, улучшить по меньшей мере одну ферментативнокинетическую характеристику.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид имеет по меньшей мере одну мутацию аминокислотной последовательности относительно SEQ ID NO: 1 по меньшей мере в одной из следующих позиций: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165,
169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210,212,
213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260,262,
263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311,314,
317, 319, 321, 323, 325 и 326. Эти позиции следуют из различий последовательности полипептида с SEQ ID NO: 1 и особенно активных полипептидов с SEQ ID NO: 2-6, имеющих с этой последовательностью высокую степень идентичности. Благодаря тому что полипептид с SEQ ID NO: 1 изменяют по меньшей мере в одной из этих позиций так, что получают варианты аминокислот последовательностей SEQ ID NO: 2-6 в этой позиции, удается показать, что эти позиции оказывают значительное влияние на ферментативно-кинетические характеристики полипептида, при этом комбинации последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, имеющих высокую степень идентичности последовательности, ведут к более высокой активности.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид имеет в аминокислотной последовательности по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, Р72Е, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, Т97А, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, А154Р, Р163Т, А164Т, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, А176М, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, К194Е, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, Р204А, A205S, К2О6Р, А207М, М208А, Q209R, L210A, L210S, ΔΡ212, T213V, Р214А, Е216Т, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G,
Q249R, K251N, I254V, I256L, А260М, T262D, T262G, I263T, E266D, Е269Н, E269N, L271V, L277E,
Е280А, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K,
R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, А311Р, A314V, L317F, S319Q, S319P,
S319R, S321A, S321T, Т323А, Р325А, А326Р, относительно SEQ ID NO: 1. Полипептидом такого рода удается полностью гидролизовать и предпочтительно детоксифицировать ZEN в течение короткого вре- 5 037776 мени, причем удельная активность полипептида составляет по меньшей мере 6,00 ед./мг, преимущественно по меньшей мере 7,00 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 8,00 ед./мг. Размерность ед или также единица представляет собой меру абсолютной каталитической активности и определяется по гидролизу 1 мкмоль ZEN в минуту при 32°C в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl (рН 8,2), причем под каталитической активностью понимают ферментативное превращение субстрата в определенных условиях реакции, а под удельной активностью понимают соотношение каталитической активности и массовой концентрации полипептида (масса на единицу объема).
Благодаря тому что полипептид сформирован так, что содержится по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов с SEQ ID NO: 32-50, удается разработать полипептиды, которые имеют удельную активность по меньшей мере 7,00 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 8,00 ед./мг. Неожиданно оказалось, что когда содержится по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов с последовательностью с SEQ ID NO: 51-58, ферментативная активность полипептида, например, по сравнению с мотивом, содержащим 7 аминокислот, еще больше повышается. Еще более высокая удельная активность достигается тогда, когда содержится по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов с последовательностью с SEQ ID NO: 59-69.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид имеет по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты по меньшей мере в одной позиции, причем консервативная замена аминокислоты выбрана из замен G на А или А на G, S, или V на I, L, A, T, S, или I на V, L, М, или L на I, М, V, или M на L, I, V, или Р на A, S, N, или F на Y, W, Н, или Y на F, W, Н, или W на Y, F, Н, или R на K, Е, D, или K на R, Е, D, или Н на Q, N, S, или D на N, Е, K, R, Q, или Е на Q, D, K, R, N, или S на Т, А, или Т на S, V, А, или С на S, Т, А, или N на D, Q, H, S, или Q на Е, N, Н, K, R. При этом выражение консервативная замена аминокислоты относится к замене одной аминокислоты другой аминокислотой, которая рассматривается специалистами в данной области техники в качестве консервативной, то есть обладающей похожими специфическими свойствами. Такие специфические свойства представляют собой, например, размеры, полярность, гидрофобность, заряд или константа pKs аминокислоты. Под консервативной мутацией понимают, например, замену одной аминокислоты с кислой реакцией другой аминокислотой с кислой реакцией, одной аминокислоты с щелочной реакцией другой аминокислотой с щелочной реакцией или одной аминокислоты с полярным характером другой аминокислотой с полярным характером.
Консервативной заменой аминокислот такого рода удается получать функциональные варианты полипептидов, удельная активность которых по сравнению с исходным полипептидом приблизительно равна по силе, однако предпочтительно выше по меньшей мере на 0,1 ед./мг.
Настоящее изобретение направлено также на разработку изолированного полинуклеотида, с которым удается получить полипептид для быстрого и надежного гидролитического расщепления ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN.
С целью решения этой задачи настоящее изобретение отличается тем, что изолированный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, причем полипептид обладает свойством гидролизовать зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, и нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере один полипептид по любому из пп.1-11 и/или нуклеотидная последовательность имеет степень идентичности последовательности по меньшей мере с одной из последовательностей, выбранных из группы последовательностей SEQ ID NO: 16-31, причем выбранная нуклеотидная последовательность составляет по меньшей мере 40%, и/или нуклеотидная последовательность в среднежестких условиях гибридизуется по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 16-31, и/или ее частичной последовательностью по меньшей мере из 200 нуклеотидов и предпочтительно по меньшей мере из 100 нуклеотидов, и/или комплементарной цепью нуклеотидной последовательности или ее частичной последовательностью.
Сверхэкспрессирующие нуклеотидные последовательности, предпочтительно их триплеты (кодоны), изменяются, как правило, в зависимости от клетки-хозяина, так что отклонение кодона оптимизируется в зависимости от клетки-хозяина. Результат этого состоит в том, что полинуклеотиды со степенью идентичности последовательности значительно меньше 80%, а также меньше 70% или меньше 60% также могут кодировать один и тот же полипептид. Сравнение последовательностей для определения степени идентичности последовательности должно осуществляться также внутри участков последовательностей, причем участок следует понимать в качестве непрерывной последовательности опорной последовательности. Длина участков последовательностей в случае нуклеотидных последовательностей, как правило, составляет от 15 до 600.
Посредством предложенных изолированных нуклеотидных последовательностей или участков последовательностей удается генерировать зонды из нуклеиновых кислот, длина которых, как правило, составляет по меньшей мере 15, 30, или 40 нуклеотидов. Благодаря таким зондам, которые, как правило, дополнительно метят, например, посредством 3Н, 32Р, 35S, биотина или авидина, могут быть при применении стандартных способов идентифицированы нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды с разлагающим действием в отношении ZEN и/или производных соединений ZEN. В каче- 6 037776 стве исходного материала для идентификации таких последовательностей могут быть использованы, например, ДНК, РНК или кДНК отдельных микроорганизмов, геномные библиотеки ДНК или библиотеки кДНК.
Для нуклеотидных последовательностей или нуклеотидных зондов с длинами по меньшей мере в 100 нуклеотидов среднежесткие условия определяют как предгибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5-кратном буферном растворе Na-ЭДТА с добавкой NaCl (SSPE, 0,9М NaCl, 60 мМ NaH2PO4, 6 мМ ЭДТА), содержащем 0,3% додецилсульфата натрия (SDS), 200 мкг/мл дефрагментированной и денатурированной ДНК спермиев лосося и 35% формамида, с последующим осуществлением саузерн-блоттинга в стандартных условиях, причем материал носителя в конце промывают три раза по 15 мин 2-кратным натрийхлоридно-цитратным буферным раствором SSC, 300 мМ NaCl и 30 мМ тринатрийцитрата, 0,2% SDS) при 55°C.
Для нуклеотидных последовательностей или нуклеотидных зондов с длинами от 15 до 100 нуклеотидов среднежесткие условия определяют как предгибридизацию и гибридизацию в буферном растворе, в который входят 0,9М NaCl, 0,09M раствор Tris-HCl с рН 7,6, 6 мМ ЭДТА, 0,5% NP-40, 1-кратный раствор Денхардта, 1 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ дигидрофосфата натрия, 0,1 мМ АТФ и 0,2 мг/мл РНК дрожжей, причем предгибридизацию и гибридизацию осуществляют при температуре ниже расчетной температуры плавления (Tm) на значение от 5 до 10°C, причем Tm определяют расчетом по Bolton и McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390). Затем осуществляют саузерн-блоттинг в стандартных условиях (J. Sambrook, E.F. Fritsch und Т. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). Материал носителя в конце промывают один раз в течение 15 мин 6-кратным буферным раствором SCC, содержащим 0,1% SDS, и два раза по 15 мин 6-кратным буферным раствором SSC соответственно при температуре ниже расчетной Tm на значение от 5 до 10°C.
Настоящее изобретение направлено также на разработку добавки, с которой достигается быстрое и надежное гидролитическое расщепление ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN в определенной или сложной матрице, такой как, например, корма или пищевые продукты.
С целью решения этой задачи разработана добавка, гидролитически расщепляющая зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, причем добавка содержит по меньшей мере один полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-15, или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%, и при необходимости содержит вспомогательные вещества.
С добавкой такого рода достигается биохимическое превращение ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN в гидролизованный ZEN и/или гидролизованное производное соединение ZEN. Эта добавка может быть использована также, например, для стереоселективного гидролиза ZEN и/или производных соединений ZEN в промышленном масштабе.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения добавка сформирована так, что вспомогательные вещества выбирают по меньшей мере из одного инертного носителя, а также при необходимости из других компонентов, таких как витамины и/или минеральные вещества, и/или ферменты, и/или другие компоненты для детоксификации микотоксинов. Благодаря применению добавки такого рода, например, в кормах или пищевых продуктах может быть обеспечено то, что содержащееся при некоторых условиях количество ZEN и/или производных соединений ZEN безопасно гидролизуется и предпочтительно детоксифицируется так, что вредное действие на организм субъекта, употребляющего этот корм или пищевой продукт, не оказывается.
При этом полипептид по изобретению может находиться также в ферментной композиции, которая наряду по меньшей мере с одним полипептидом по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один фермент, который, например, участвует в разложении протеинов, такой, как, например, протеазы, или участвует в метаболизме крахмала или волокон, или жиров, или гликогена, такой как, например, амилаза, целлюлаза или глюканаза, а также, например, гидролазы, липолитические ферменты, маннозидазы, оксидазы, оксидоредуктазы, фитазы, ксиланазы и/или их комбинации.
Другие аспекты применения настоящего изобретения относятся к ферментным композициям, которые наряду по меньшей мере с одним полипептидом по настоящему изобретению дополнительно содержат по меньшей мере один компонент для детоксификации микотоксинов, такой как разлагающий микотоксины фермент, такой как, например, афлатоксиноксидаза, эрготамингидролазы, эрготаминамидазы, зеараленонэстеразы, зеараленонлактоназы, охратоксинамидазы, фумонизинкарбоксилэстеразы, фумонизинаминотрансферазы, аминополиоламинооксидазы, дезоксиниваленолэпоксидгидролазы, и/или содержат по меньшей мере один разлагающий микотоксины микроорганизм, такой как Bacillus subtilis, и/или по меньшей мере один связывающий микотоксины компонент, например бактериальные клеточные стенки или неорганические материалы, такие как бентонит.
Согласно особенно предпочтительному другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержится в добавке в концентрации не более 10000 ед./г, предпочтительно не более 1000 ед./г, более предпочтительно не более 100 ед./г и наиболее предпочтительно не более 10 ед./г, благодаря
- 7 037776 чему удается ZEN и/или производные соединения ZEN быстро и, в частности, уже перед их резорбцией в теле субъекта, употребляющего загрязненный корм или пищевой продукт, предпочтительно млекопитающего, превращать в нетоксичные или малотоксичные метаболиты, предпочтительно в HZEN и
DHZEN.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид находится в капсулированной или покрытой форме, причем для капсулирования или покрывания могут быть использованы стандартные способы, такие как, например, способы, описанные в WO 92/12645. Благодаря капсулированию или покрыванию удается транспортировать полипептид без изменения, в частности без разложения и повреждения, к месту его применения, так что только после растворения защитной оболочки, например, в пищеварительном тракте животных полипептид начинает действовать, вследствие чего может быть достигнуто еще более целенаправленное, быстрое и полное разложение ZEN и/или производных соединений ZEN также и в кислых, обогащенных протеазой и анаэробных средах. При этом благодаря капсулированию или покрыванию удается повысить также термическую стабильность полипептидов в добавке.
Настоящее изобретение относится также к применению добавки для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона в кормах предпочтительно для свиней, домашней птицы и аквакультуры, в пищевых продуктах или в высушенной барде. Благодаря применению добавки по настоящему изобретению удается гидролизовать или детоксифицировать ZEN и/или производные соединения ZEN, содержащиеся в пищевом продукте или в корме, или в высушенной барде, причем детоксикация такого рода достигается уже при концентрации полипептидов около 1 ед./г загрязненного корма или пищевого продукта.
Настоящее изобретение направлено также на разработку способа, с которым удается обеспечить быстрое и надежное гидролитическое расщепление ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN.
С целью решения этой задачи способ осуществляют так, что зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона гидролизуют полипептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-15, или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения способ осуществляют так, что полипептид используют в одной из добавок по настоящему изобретению.
Согласно другому предпочтительному варианту способ осуществляют так, что полипептид или добавку прибавляют к корму или пищевому продукту, загрязненному зеараленоном и/или по меньшей мере одним производным соединением зеараленона, так что загрязненный корм или пищевой продукт приводится в контакт с влагой, а полипептид или добавка гидролизуют зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, содержащиеся в загрязненном корме или пищевом продукте. В случае влажных кормов или пищевых продуктов, таких как пульпы или кашицы, гидролиз зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона будет происходить во влажном корме или пищевом продукте перед оральным приемом. Благодаря такому способу может быть обеспечено то, что вредящее действие зеараленона и производных соединений зеараленона на человека и животное устраняется в значительной степени. При этом в качестве влаги понимают присутствие воды или водосодержащих жидкостей, причем в их число входят также, например, слюна или другие жидкости, имеющиеся в пищеварительном тракте. В качестве пищеварительного тракта понимают полость рта, глотку (зев), пищевод и желудочно-кишечный тракт или их эквиваленты, причем в случае животных могут использоваться разные термины или в пищеварительном тракте животных могут отсутствовать отдельные компоненты.
Способ по настоящему изобретению может быть осуществлен также в варианте, когда корм или пищевой продукт гранулируют перед оральным приемом.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения способ осуществляют так, что гидролизуется по меньшей мере 70%, преимущественно по меньшей мере 80% и предпочтительно по меньшей мере 90% зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона. Благодаря этому может быть предотвращено подострое и/или начальное хроническое токсическое действие, такое как, например, тератогенное, карциногенное, эстрогенное и иммуносупрессивное действие у животных или людей.
В последующем описании настоящее изобретение более подробно поясняется примерами осуществления и фигурами. На фигурах показано:
на фиг. 1 показаны зависимости от времени степени разложения ZEN и увеличения количества метаболитов HZEN и DHZEN в случае полипептида с SEQ ID NO: 1, причем на фиг. 1А полипептид не имеет метки, на фиг. 1В полипептид имеет С-концевую метку 6His, а на фиг. 1С имеет N-концевую метку 6His;
на фиг. 2 - кинетика согласно уравнению Михаэлиса-Ментен в случае полипептида с SEQ ID NO: 1;
на фиг. 3 - зависимости от времени степени разложения ZEN и увеличения количества метаболитов
- 8 037776
HZEN и DHZEN в случае очищенных полипептидов с SEQ ID NO: 1 (фиг. 3A), 2 (фиг. 3B), (фиг. 3C), 6 (фиг. 3D), 7 (фиг. 3E), 9 (фиг. 3F), (фиг. 3G), (фиг. 3H) и 15 (фиг. 3I), причем все последовательности имеют С-концевую метку 6His.
Пример 1. Модификация, клонирование и экспрессия полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые могут гидролитически расщеплять ZEN и/или по меньшей мере одно производное соединение ZEN.
Замены, инсерции или делеции аминокислот осуществляли мутацией нуклеотидных последовательностей посредством ПЦР с применением набора Quick-change Site-directed Mutagenesis Kits (компания Stratagene) согласно инструкции. Альтернативно этому были использованы также полные нуклеотидные последовательности (компания GeneArt). Нуклеотидные последовательности, генерированные с использованием набора для мутагенеза посредством ПЦР или полученные от компании GeneArt, необязательно дополнительно имели на аминокислотном уровне С-или N-концевую метку 6His и стандартными способами были интегрированы в экспрессирующие векторы для экспрессии в Е.coli или P.pastoris, трансформированы в Е.coli или P.pastoris, a также экспрессированы в Е.coli или P.pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, second Edition, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor), причем для этой задачи может быть использована также любая другая приемлемая клетка-хозяин.
Термин экспрессирующий вектор относится к конструкции ДНК, которая в состоянии экспрессировать ген in vivo или in vitro. В частности, под конструкциями ДНК понимают также конструкции, которые являются приемлемыми для переноса нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в клетку-хозяин, чтобы там быть интегрированной в геном или свободно находиться в экстрахромосомальном пространстве и внутриклеточно экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, и при необходимости для вывода полипептида из клетки.
Термин клетка-хозяин относится ко всем клеткам, которые содержат сверхэкспрессирующую нуклеотидную последовательность или экспрессирующий вектор и могут продуцировать полипептид по настоящему изобретению. В частности, под прокариотическими и/или эукариотическими клетками предпочтительно понимают P.pastoris, Е.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, клетки растений и/или споры Bacillus, Trichoderma или Aspergillus.
Для определения каталитических свойств полипептидов использовали растворимый клеточный лизат в случае Е.coli или надосадочную жидкость культуры в случае P.pastoris. Для определения констант KM, vmax, kcat и удельной активности полипептиды селективно концентрировали стандартными способами в хроматографических колонках с насадкой из никельсефарозы. Определение концентрации белка осуществляли стандартными способами, например способом ВСА (Pierce BCA Protein Assay KitProd # 23225), однако предпочтительно определяли фотометрически с удельными коэффициентами поглощения для соответствующих белков, рассчитываемыми по программе ProtParam, доступной для использования по интернет-адресу http://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607).
Пример 2. Определение идентичности последовательности и консервативных участков аминокислотной последовательности.
Определение процентной идентичности последовательности по всей длине полипептидов с аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 1-15 относительно друг друга (табл. 1) осуществляли по программе BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (программа поиска основных локальных выравниваний)) и предпочтительно по программе BLASTP, которыми можно воспользоваться на интернетстранице National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Таким образом, две или несколько последовательностей можно сравнивать друг с другом по алгоритму Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., (1997) 25:3389-3402). В качестве программных установок были приняты базовые установки и предпочтительно: max target sequence (максимальное число целевых последовательностей)=100; expected threshold (ожидаемый порог)=10; word size (длина слова)=3; matrix (матрица)=BLOSOM62; gap costs (штрафы за разрыв)-'Existence (существование): 11; Extention (продолжение): 1; computational adjustment (вычислительная корректировка)=Conditional compositional score matrix adjustment (условная композиционная корректировка матрицы счета).
Для определения консервативных участков аминокислотных последовательностей полипептиды с SEQ ID NO: 1-6, имеющими идентичность последовательности по меньшей мере 70% по сравнению друг с другом, сравнивали посредством компьютерной программы COBALT (J.S. Papadopoulos und R. Agarwala, 2007, COBALT: constraint-based alignment tool for multiple protein sequences, Bioinformatics 23:107379) с использованием стандартных параметров и предпочтительно следующих параметров: (Gap penalties (штрафы за разрыв): -11, -1; End-Gap Penalties (штрафы за окончание разрыва): -5, -1; Use RPS BLAST (использование RPS BLAST): on (включено); Blast E-value (ожидаемая значимость): 0,003; Find Conserved columns and Recompute (нахождение консервативных столбцов и перерасчет): on (включено); use query Clusters (использование запроса кластеров): on (включено); word size (длина слова): 4; max Cluster distance (максимальное расстояние между кластерами): 0,8; Alphabet (алфавит): regular
- 9 037776 (нормальный); Homology conversation setting (задание связи гомологии): 3 bits (3 бита)). Результат этого анализа характеризует консервативные аминокислоты. В качестве консервативных участков аминокислотных последовательностей были определены следующие области, состоящие по меньшей мере из 5 следующих друг за другом консервативных аминокислот, а именно участки по сравнению с последовательностью с SEQ ID NO: 1: А - с позиции +24 до позиции +50, В - с позиции +52 до позиции +77, С - с позиции +79 до позиции +87, D - с позиции +89 до позиции +145, Е - с позиции +150 до позиции +171, F - с позиции +177 до позиции +193, G - с позиции +223 до позиции +228, Н - с позиции +230 до позиции +237, I - c позиции +239 до позиции +247, J - с позиции +249 до позиции +255, K - с позиции +257 до позиции +261, L - с позиции +263 до позиции +270, M - с позиции +272 до позиции +279, N - с позиции +297 до позиции +301 и O - с позиции +303 до позиции +313.
Определение процентной идентичности последовательностей полипептидов по сравнению друг с другом, а также консервативных участков аминокислотных последовательностей отдельных полипептидов относительно консервативных участков аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 осуществляли соответственно описанному ранее. Результаты представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Процентная идентичность последовательностей полипептидов по сравнению друг с другом
| SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 3 | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 7 | |
| SEQ ID NO: 1 | — | 70% | 71% | 71% | 71% | 71% | 64% |
| SEQ ID NO: 2 | 70% | — | 81% | 83% | 81% | 83% | 63% |
| SEQ ID NO: 3 | 71% | 81% | — | 95% | 99% | 92% | 60% |
| SEQ ID NO: 4 | 71% | 83% | 95% | — | 95% | 95% | 60% |
| SEQ ID NO: 5 | 71% | 81% | 99% | 95% | — | 93% | 60% |
| SEQ ID NO: 6 | 71% | 83% | 92% | 95% | 93% | — | 61% |
- 10 037776
| SEQ ID NO: 7 | 64% | 63% | 60% | 60% | 60% | 61% | — |
| SEQ ID NO: 8 | 57% | 54% | 54% | 53% | 53% | 53% | 53% |
| SEQ ID NO: 9 | 50% | 50% | 53% | 53% | 53% | 55% | 51% |
| SEQ ID NO: 10 | 55% | 52% | 55% | 54% | 55% | 53% | 52% |
| SEQ ID NO: 11 | 53% | 51% | 53% | 51% | 51% | 52% | 54% |
| SEQ ID NO: 12 | 50% | 49% | 50% | 50% | 50% | 49% | 51% |
| SEQ ID NO: 13 | 55% | 49% | 51% | 51% | 51% | 52% | 54% |
| SEQ ID NO: 14 | 73% | 65% | 69% | 70% | 69% | 68% | 80% |
| SEQ ID NO: 15 | 79% | 68% | 71% | 71% | 71% | 72% | 63% |
| SEQ ID NO: 8 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 15 | |
| SEQ ID NO: 1 | 57% | 50% | 55% | 53% | 50% | 55% | 73% | 79% |
| SEQ ID NO: 2 | 54% | 50% | 52% | 51% | 49% | 49% | 65% | 68% |
| SEQ ID NO: 3 | 54% | 53% | 55% | 53% | 50% | 51% | 69% | 71% |
| SEQ ID NO: 4 | 53% | 53% | 54% | 51% | 50% | 51% | 70% | 71% |
| SEQ ID NO: 5 | 53% | 53% | 55% | 51% | 50% | 51% | 69% | 71% |
| SEQ ID NO: 6 | 53% | 55% | 53% | 52% | 49% | 52% | 68% | 72% |
| SEQ ID NO: 7 | 53% | 51% | 52% | 54% | 51% | 54% | 80% | 63% |
| SEQ ID NO: 8 | - | 50% | 49% | 51% | 49% | 48% | 83% | 51% |
- 11 037776
| SEQ ID NO: 9 | 50% | — | 51% | 52% | 69% | 51% | 67% | 51% |
| SEQ ID NO: 10 | 49% | 51% | — | 76% | 52% | 52% | 63% | 56% |
| SEQ ID NO: 11 | 41% | 50% | 76% | — | 52% | 51% | 58% | 52% |
| SEQ ID NO: 12 | 49% | 52% | 52% | 52% | — | 49% | 71% | 51% |
| SEQ ID NO: 13 | 48% | 51% | 52% | 51% | 49% | — | 54% | 53% |
| SEQ ID NO: 14 | 83% | 67% | 63% | 58% | 71% | 55% | — | 72% |
| SEQ ID NO: 15 | 51% | 51% | 56% | 52% | 51% | 53% | 72% | — |
Таблица 2. Процентная идентичность последовательностей консервативных участков аминокислотных последовательностей от А до О
| Идентичность последовательности относительно SEQ ID NO: 1 | ||||||
| Полипептид | Участок A | Участок В | Участок С | Участок D | Участок Е | Участок F |
| SEQ ID NO: 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100 |
| SEQ ID NO: 2 | 59, 6% | 76, 9% | 88,9% | 87,7% | 77,3% | 76,5 |
| SEQ ID NO: 3 | 63,0% | 76, 9% | 77,8% | 89,5% | 86, 4% | 76,5 |
| SEQ ID NO: 4 | 63,0% | 80,8% | 77,8% | 91,2% | 86, 4% | 76,5 |
| SEQ ID NO: 5 | 63,0% | 76, 9% | 77,8% | 87,7% | 86, 4% | 76,5 |
| SEQ ID NO: 6 | 63,0% | 80,8% | 77,8% | 91,2% | 86, 4% | 76,5 |
| SEQ ID NO: 7 | 44,7% | 69,2% | 77,8% | 78,9% | 68,2% | 64,7 |
| SEQ ID NO: 8 | 40,7% | 50,0% | 66,7% | 82,5% | 59, 1% | 64,7 |
| SEQ ID NO: 9 | 51,9% | 57,7% | 55,6% | 73,7% | 45,5% | 58,8 |
| SEQ ID NO: 10 | 44,4% | 61,5% | 77,8% | 75,4% | 47,8% | 76,5 |
| SEQ ID NO: 11 | 44,4% | 50,0% | 66,7% | 71, 9% | 43,5% | 58,8 |
| SEQ ID NO: 12 | 51,9% | 53,8% | 55,6% | 71, 9% | 50, 0% | 58,8 |
| SEQ ID NO: 13 | 18,5% | 61,5% | 55, 6% | 77,2% | 54,5% | 52,9 |
| SEQ ID NO: 14 | 55,6% | 69,2% | 77,8% | 84,2% | 54,5% | 52,9 |
| SEQ ID NO: 15 | 74,1% | 86,7% | 88,9% | 89, 0% | 77,3% | 88,2 |
- 12 037776
| Идентичность последовательности относительно SEQ ID NO: 1 | |||||||||
| Полипептид | Участок G | Участок H | Участок I | Участок J | Участок К | Участок L | |||
| SEQ | ID | NO: | 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
| SEQ | ID | NO: | 2 | 100% | 87,5% | 66,7% | 85,7% | 80,0% | 75,0% |
| SEQ | ID | NO: | 3 | 100% | 87,5% | 77,8% | 57,1% | 80,0% | 75,0% |
| SEQ | ID | NO: | 4 | 100% | 87,5% | 77,8% | 57,1% | 80,0% | 75,0% |
| SEQ | ID | NO: | 5 | 100% | 87,5% | 77,8% | 57,1% | 80,0% | 75,0% |
| SEQ | ID | NO: | 6 | 100% | 75,0% | 77,8% | 85,7% | 80,0% | 87,5% |
| SEQ | ID | NO: | 7 | 100% | 87,5% | 66,7% | 71,4% | 100% | 50,0% |
| SEQ | ID | NO: | 8 | 100% | 62,5% | 44,4% | 57,1% | 80,0% | 62,5% |
| SEQ | ID | NO: | 9 | 100% | 12,5% | 44,4% | 42,9% | 60,0% | 62,5% |
| SEQ | ID | NO: | 10 | 100% | 62,5% | 55,6% | 71,4% | 80,0% | 50,0% |
| SEQ | ID | NO: | 11 | 100% | 50, 0% | 55,6% | 57,1% | 80,0% | 50,0% |
| SEQ | ID | NO: | 12 | 100% | 12,5% | 22,2% | 57,1% | 80,0% | 52,5% |
| SEQ | ID | NO: | 13 | 100% | 50, 0% | 44,4% | 57,1% | 80,0% | 75,0% |
| SEQ | ID | NO: | 14 | 0% | 8,3% | 0% | 14,3% | 0% | 25,0% |
| SEQ | ID | NO: | 15 | 100% | 87,5% | 100% | 85,7% | 100% | 75,0% |
| Идентичность последовательности | ||||||
| относительно SEQ | ID NO: 1 | |||||
| Полипептид | Участок Μ | Участок Ν | Участок О | |||
| SEQ | ID | NO: | 1 | 100% | 100% | 100% |
| SEQ | ID | NO: | 2 | 87,5% | 80, 0% | 81,8% |
| SEQ | ID | NO: | 3 | 87,0% | 80, 0% | 81,8% |
| SEQ | ID | NO: | 4 | 87,5% | 80, 0% | 81,8% |
| SEQ | ID | NO: | 5 | 87,5% | 80, 0% | 81,8% |
| SEQ | ID | NO: | 6 | 87,5% | 80, 0% | 72,7% |
| SEQ | ID | NO: | 7 | 75, 0% | 40, 0% | 36, 4% |
| SEQ | ID | NO: | 8 | 75, 0% | 60, 0% | 54,5% |
| SEQ | ID | NO: | 9 | 62,5% | 40, 0% | 54,5% |
| SEQ | ID | NO: | 10 | 62,5% | 40, 0% | 54,5% |
| SEQ | ID | NO: | 11 | 75, 0% | 40, 0% | 54,5% |
| SEQ | ID | NO: | 12 | 100% | 40, 0% | 54,5% |
| SEQ | ID | NO: | 13 | 50, 0% | 40, 0% | 63, 6% |
| SEQ | ID | NO: | 14 | 6, 2% | 0% | 0% |
| SEQ | ID | NO: | 15 | 87,5% | 80, 0% | 63, 6% |
Пример 3. Гидролиз ZEN полипептидами в клеточных лизатах.
Для определения способности расщеплять ZEN в нетоксичные или малотоксичные метаболиты HZEN и DHZEN был получен полипептид с SEQ ID NO: 1, кодированный нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 17, в качестве таковой, и с С- или N-концевой меткой 6His в Е.coli, как описано в примере 1. Полипептиды с аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 2-15, которые были кодированы нуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 18-31, были помечены меткой 6His только на С-концевом участке. 100 мл раствора культуры Е.coli с оптической плотностью 2,0-2,5 (0D при 600 нм) разделяли центрифугированием при 4°C и ресуспендировали в 20 мл минеральной среды Бруннера (DSMZ microorganisms medium number 462, 2012). Клеточные суспензии после 3-кратной обработки во французском прессе при 20000 футах на кв. дюйм подвергали лизису. Полученные таким образом клеточные лизаты применяли с разбавлениями 1:10, 1:100 или 1:1000, которые получали с минеральной средой Бруннера, содержащей 0,1 мг/мл BSA (альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота). Для
- 13 037776 опытов по разложению ZEN к 9,9 мл минеральной среды Бруннера, содержащей 0,1 мг/мл BSA, прибавляли 0,1 мл разбавленного клеточного лизата и 31 мкл исходного раствора субстрата ZEN. Таким образом, в итоге клеточные лизаты разбавляли с соотношением 1:1000, 1:10000 или 1:100000. В качестве исходного раствора субстрата ZEN использовали 2,08 мМ раствор ZEN (40 об.% ACN + 60 об.% H2O). Для получения этого раствора соответственно взвешивали и растворяли ZEN в кристаллической форме (стандарт биочистоты, компания Romer Labs, артикул № 001109, чистота не менее 98%). Расщепляемые смеси переносили в склянки вместимостью 25 мл и инкубировали при 25°C при встряхивании с частотой 100 об/мин в течение 120 ч. В моменты времени 0, 0,5, 1, 2, 5, 24, 47, 72 и 120 ч соответственно отбирали пробы объемом 1 мл, полипептиды инактивировали нагреванием в течение 10 мин при 99°C и хранили при -20°C. После размораживания проб нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием. ZEN, HZEN и DHZEN анализировали способом ЖХ-МС-МС. С этой целью метаболиты хроматографически разделяли посредством колонки Phenomenex Luna C18(2) с размерами 250x3 мм и с частицами крупностью 5 мкм. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил-вода с концентрацией муравьиной кислоты 1 мл/л. УФ-сигнал регистрировали при 270 нм. В качестве средства ионизации использовали ионизацию электрораспылением (ИЭР). ZEN, HZEN и DHZEN количественно определяют посредством Qtrap-ЖХ-МС-МС (жидкостной хромато-масс-спектрометр с тройным квадруполем, компания Applied Biosystems) в расширенном режиме. Не позже чем через 24 ч ни в одной из смесей невозможно было уже обнаружить существенное количество ZEN. Преобладающая часть, более 80%, ZEN была превращена в HZEN или DHZEN.
На фиг. 1 можно видеть зависимость от времени степени разложения ZEN и увеличения количества HZEN, а также DHZEN на примере разбавленного с соотношением 1:10000 раствора клеточного лизата в случае полипептида с SEQ ID NO: 1 как без метки (фиг. 1А), так и с С-концевой меткой 6His (фиг. 1В) и N-концевой меткой 6His (фиг. 1С). Из этого ясно следует, что, во-первых, превращение ZEN происходит непосредственно и полностью, так как уже в первых пробах (0 ч), которые были отобраны непосредственно после начала опыта, почти невозможно было больше детектировать ZEN, и, во-вторых, вследствие присоединение С- или N-концевой метки не происходило существенной потери активности.
Пример 4. Гидролиз производных соединений ZEN полипептидами в клеточных лизатах.
Для определения способности полипептидов наряду с ZEN превращать в нетоксичные или малотоксичные метаболиты также и производные соединения ZEN получали полипептиды с SEQ ID NO: 1-15 с С-концевыми метками His, как и описанные в примере 3, а в качестве клеточных лизатов при разложении использовали соответствующие синтетические нуклеотидные последовательности с SEQ ID NO: 17-31.
Опыты по разложению осуществляли согласно описанию примера 3, причем каждый полипептид был испытан с каждым из производных соединений ZEN, выбранных из группы α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S и ZAN. Клеточные лизаты применяли с общим разбавлением 1:10000. В качестве исходного раствора субстрата вместо 2,08 мМ раствора ZEN (40 об.% ACN + 60 об.% Н2О) применяли эквимолярные, т.е. 2,08 мМ растворы производных соединений ZEN. α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL и ZAN были получены от компании Sigma и применялись в качестве стандарта для анализа. Z14G и Z14S с чистотой по меньшей мере 90% были получены способами, описанными P. Krenn et al. (2007, Mykotoxin Research, 23, 4, 180-184) и M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523), и применялись в качестве стандарта для анализа. Другое отличие от примера 3 состояло в том, что отбирали только одну пробу и при этом через 24 ч. Уменьшение концентрации производных соединений ZEN в течение опыта по разложению количественно определяли способом ЖХ-МС-МС. α-ZEL, β-ZEL, Z14G и Z14S определяли способом М. Sulyok et al. (2010, Food Chemistry, 119, 408-416). α-ZAL, β-ZAL и ZAN определяли способом Р. Songsermaskul et al. (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). Неожиданно было выявлено, что во всех опытах по разложению через 24 ч инкубации в наличии оставалось только от 0 до максимально 13% исходного количества производных соединений ZEN.
Пример 5. Удельная активность и ферментативно-кинетические характеристики полипептидов и их вариантов.
Определение удельной активности полипептидов и их вариантов осуществляли фотометрически, причем у всех примененных полипептидов была С-концевая метка 6His. Получение, обогащение и очистку полипептидов или их вариантов осуществляли соответственно описанию примера 1. Разложение ZEN до HZEN определяли по уменьшению поглощения при длине волны 315 нм. Молярные коэффициенты поглощения [ε] ZEN и HZEN были определены экспериментально и составили 0,0078895 и 0,0030857 л-мкмоль-1-см-1. Коэффициенты поглощения сильно зависят от значений рН, поэтому определение активности следует осуществлять всегда точно при таком же значении рН и предпочтительно в такой же матрице. Измерения осуществляли в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl с рН 8,2 в кварцевых кюветах в диапазоне длин волн от 200 до 2500 нм фотометром для видимой и ультрафиолетовой областей (Hitachi U-2001) при 32°C.
В качестве исходного раствора субстрата ZEN использовали 2,08 мМ раствор ZEN (40 об.% ACN + 60 об.% Н2О). Для получения этого раствора соответственно взвешивали и растворяли ZEN в кристаллической форме (стандарт биочистоты, компания Romer Labs, артикул № 001109, чистота не менее 98%).
- 14 037776
Получали разбавления субстрата ZEN (0,79, 1,57, 2,36, 3,14, 4,71, 6,28, 7,85, 9,42, 10,99, 12,56, 14,13,
15,71, 17,28, 18,85 мкМ) с 50 мМ раствором Tris-HCl с рН 8,2. Растворы полипептидов разбавляли 50 мМ буферным раствором Tris-HCl с рН 8,2 до конечной концентрации около 70 нг/мл. Разбавления субстрата
ZEN подогревали на водяной бане до 32°C.
К 100 мкл соответствующего разбавления субстрата ZEN прибавляли 0,2 мкл раствора полипептида и через 5 мин определяли поглощение, причем для любой комбинации раствор полипептида разбавление субстрата ZEN осуществляли по меньшей мере двухкратное определение.
С учетом коэффициентов поглощения ZEN и HZEN по повышению поглощения во времени рассчитывали скорость реакции для каждой концентрации субстрата.
Термины константа KM или константа Михаэлиса-Ментен относятся к параметру для описания ферментативного сродства, выражаемому в [мкМ] или [мМ] и рассчитываемому посредством линеаризации по Хейнсу согласно Н. Bisswang (2002, Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, Seite 19), причем для этого предпочтительно используют функцию Enzymkinetik, Single Substrat (кинетика ферментации, простой субстрат) программы SigmaPlot 12.0. Термины каталитическая постоянная ферментативной реакции или константа kcat относятся к параметру для описания скорости превращения полипептида или фермента, выражаемому в [с-1] и предпочтительно рассчитываемому посредством функции Enzymkinetik, Single Substrat программы SigmaPlot 12.0. Параметр максимальная скорость ферментативной реакции или константа vmax выражают в [мкМ/с] или [мМ/с] и определяют аналогично константе KM посредством линеаризации по Хейнсу, причем для этого предпочтительно используют функцию Enzymkinetik, Single Substrat программы SigmaPlot 12.0.
Используя значения vmax и применяемой концентрации фермента, удельную активность рассчитывали по формуле vmax [мкМ/с] -60 [с/мин] удельная активность [ед/мг] = ________________________________ концентрация фермента [мг/л] причем за единицу принимают гидролиз 1 мкмоль ZEN в минуту при 32°C в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl с рН 8,2.
Далее приведены исходные данные для определения характеристик ферментативной реакции KM, vmax, kcat, а также удельной активности на примере полипептида с SEQ ID NO: 1. В табл. 3 приведены значения скорости реакции при соответствующих концентрациях субстрата ZEN, для которых на фиг. 2 представлены соответствующие графики Михаэлиса-Ментен, а в табл. 4 приведены соответствующие ферментативно-кинетические характеристики. Концентрация применяемого раствора фермента составляла 68 нг/л.
Таблица 3. Скорости реакции полипептида с SEQ ID NO: 1 при различных концентрациях ZEN
| Разбавление субстрата ZEN, мкМ | 1-е измерение скорости реакции, мкМ/ с | 2-е измерение скорости реакции, мкМ/с |
| 0,79 | 0,0073 | 0,0071 |
| 1,57 | 0,0087 | 0,0082 |
| 2,36 | 0,0095 | 0,0080 |
| 3, 14 | 0,0101 | 0,0073 |
| 4,71 | 0,0103 | 0,0087 |
| 6,28 | 0,0096 | 0,0088 |
| 7,85 | 0,0084 | 0,0088 |
| 9, 42 | 0,0111 | 0,0087 |
| 10, 99 | 0,0093 | 0,0081 |
| 12,56 | 0,0100 | 0,0086 |
| 14, 13 | 0,0089 | 0,0101 |
| 15,71 | 0,0089 | 0,0090 |
| 17,28 | 0,0100 | 0,0074 |
| 18,85 | 0,0100 | 0,0085 |
- 15 037776
Таблица 4. Ферментативно-кинетические характеристики полипептида с SEQ ID NO: 1
| Vmax, МКМ/с | Км, мкМ | kcat, С-1 | Удельная активность, ед/мг | |||||
| Измерение | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| Значение | 0,00993 | 0,008756 | 0,2172 | 0,1898 | 5,44 | 4,79 | 8,76 | 7,73 |
| Среднее значение | 0,009343 | 0,2035 | 5, 12 | 8,25 |
Значения удельной активности исследованных полипептидов составили 8,25 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 1, 10,56 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 2, 8,36 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 3, 8,33 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 4, 8,56 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 5, 9,95 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 6, 3,83 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 7, 2,57 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 8, 4,87 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 9, 5,12 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 10, 13,88 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 11, 2,78 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 12, 6,43 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 13, 3,33 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 14 и 7,76 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 15.
Значения удельной активности исследованных вариантов полипептидов приведены в табл. 5 и 6. Таблица 5. Удельная активность функциональных вариантов полипептида с SEQ ID NO: 1, консервативные участки аминокислотных последовательностей с одной или несколькими мутациями и идентичность последовательностей функциональных вариантов с исходной последовательностью с SEQ ID NO: 1
| № | Мутации | Мутации в области | Идентичность по сравнению с SEQ ID NO: 1 | Удельная активность, ед/мг |
| ZH1-A-001 | N25D | А | 99,7% | 8,10 |
| ZH1-A-002 | F27Y | А | 99,7% | 7,93 |
| ZH1-A-003 | F27H | А | 99,7% | 7,78 |
| ZH1-A-004 | R35K | А | 99,7% | 8,98 |
| ZH1-A-005 | R35Q | А | 99,7% | 8,56 |
| ZH1-A-006 | N25D/S29P/V42I/V43T | А | 98,8% | 7,84 |
| ZH1-A-007 | 126V/R31A/F32Y/F46Y | А | 98,8% | 8, 61 |
| ZH1-A-S02 | N25D/I26V/F27Y/S29Р/ R31A/F32Y/R35K/V37A/ V42I/V43T/F46Y | А | 96, 6% | 8,73 |
| ZH1-A-S03 | N25D/I26V/F27H/S29Р/ R31A/F32Y/R35Q/V42I/ V43T/F46Y | А | 97,0% | 8,52 |
| ZH1-B-001 | D53G | В | 99,7% | 8,10 |
| ZH1-B-002 | N54M | В | 99,7% | 8,41 |
| ZH1-B-003 | N54R | В | 99,7% | 8,33 |
| ZH1-B-004 | S69G | В | 99,7% | 8,06 |
| ZH1-B-005 | Р72Е | В | 99,7% | 8,65 |
| ZH1-B-006 | P72R | В | 99,7% | 8,78 |
| ZH1-B-S02 | N54M/L57V/L60I/S69G/ P72E/V73A | В | 98,2% | 8,51 |
| ZH1-B-S03 | D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A | В | 98,2% | 8,56 |
| ZH1-B-S04 | N54R/L57V/L60I/P72E/ V73A | В | 98,5% | 8, 96 |
- 16 037776
| ZH1-B-S14 | N54R/L58V/L59P/L60V/ T64G/P72R/G75P/L77P | В | 97,6% | 8, 68 |
| ZHI-C-001 | N80H | C | 99,7% | 8,24 |
| ZHI-C-002 | N80D | C | 99,7% | 8,48 |
| ZHI-C-003 | F84Y | C | 99,7% | 8,65 |
| ZH1-C-S06 | N80H/F84Y | C | 99, 4% | 8,88 |
| ZH1-C-S10 | N80H/F84H | C | 99, 4% | 8,32 |
| ZH1-C-S14 | E79R/N80D | C | 99, 4% | 8,45 |
| ZHI-D-001 | T95S | D | 99,7% | 8,53 |
| ZHI-D-002 | R99K | D | 99,7% | 8,25 |
| ZHI-D-003 | V123I | D | 99,7% | 8,17 |
| ZHI-D-004 | A125G | D | 99,7% | 8,36 |
| ZHI-D-005 | G126A | D | 99,7% | 8,41 |
| ZHI-D-006 | G130A | D | 99,7% | 8,69 |
| ZHI-D-007 | G130V | D | 99,7% | 8,54 |
| ZHI-D-008 | G131A | D | 99,7% | 8,71 |
| ZHI-D-009 | N127D | D | 99,7% | 8,29 |
| ZHI-D-010 | N127Q | D | 99,7% | 8,34 |
| ZHI-D-011 | A141S | D | 99,7% | 8, 67 |
| ZHI-D-012 | F106W | D | 99,7% | 7,84 |
| ZHI-D-013 | I118V | D | 99,7% | 8,37 |
| ZHI-D-014 | I118V/V123L | D | 99, 4% | 8,55 |
| ZHI-D-015 | I118V/K119R/L132V | D | 99, 1% | 8,86 |
| ZHI-D-016 | W96Q/F106W/L116G/ V122A | D | 98,8% | 8, 65 |
| ZHI-D-017 | Q91R/N105D/K119G/A141 S/M142K | D | 98,5% | 8,46 |
| ZH1-D-S02 | T95S/T97A/R99K/I118V/ V123I/L132V/A141S | D | 97,7% | 8,66 |
| ZH1-D-S03 | T95S/R99K/I118V/ K119R/L132V/A141S | D | 98,2% | 9, 32 |
| ZH1-D-S04 | T95S/R99K/I118V/ L132V/A141S | D | 98,5% | 9, 15 |
| ZH1-D-S05 | T95S/R99K/I114M/ I118V/K119R/L132V/ A141S | D | 97,7% | 8,84 |
| ZH1-D-S07 | R99G/A115D/K119G/ P121T/V123I/A125S/ | D | 96,3% | 8,79 |
- 17 037776
| L132V/L133V/S138A/ Y140F/A141S/M142L | ||||
| ZH1-D-S08 | R93K/W96Q/R99G/D104N/ N105L/F106M/A115S/ V123I/A125S/G144N | D | 97,0% | 8,86 |
| ZH1-D-S09 | R99G/S102N/D104N/N105 T/F106W/L110V/V111E/ A115D/K119G/V122T/ V123L/L132V/L133I/ S138A/M142K | D | 95,4% | 8, 99 |
| ZH1-D-S10 | W96R/S102T/F1061/1114 L/A115S/L116G/K119G/ V122A/V123F/A125S/ A134S/Y140F/M142E | D | 96,0% | 9, 12 |
| ZH1-D-S11 | W96R/R99G/S102T/ F106V/I114L/A115D/ L116G/K119G/V122A/ V123F/A125S/N127L/ L133A/A134S/Y140F/ M142K | D | 95,1% | 8,54 |
| ZH1-D-S12 | S94T/R99G/S102T/ N105I/L110V/A115D/ K119G/P121E/V122T/ V123L/V124I/L133I/ A134G/S138A/Y140F/ M142K | D | 95,1% | 8, 69 |
| ZH1-D-S13 | R93Q/R99G/N105T/ R112K/A115D/L116I/ A125S/N127L/L132V/ L133V/A134S/Y140F/ M142K | D | 96,0% | 8,47 |
| ZH1-D-S14 | Q91R/W96R/N105D/ I114L/I118V/K119R/ V122A/L132V/L137S | D | 97,3% | 8,55 |
| ZH1-E-001 | Y165C | E | 99,7% | 8,46 |
| ZH1-E-002 | Y165H | E | 99,7% | 8,33 |
| ZH1-E-003 | P163T | E | 99,7% | 7 , 95 |
| ZH1-E-004 | A154P/Y165C | E | 99, 4% | 8,13 |
- 18 037776
| ZH1-E-S02 | P163T/A164T/Y165C/ V169I/L170R | E | 98,5% | 8, 83 |
| ZH1-E-S05 | A154P/Yl65H/L17OR | E | 99, 1% | 9, 65 |
| ZH1-F-001 | Y180F | F | 99,7% | 8,35 |
| ZH1-F-002 | D182T | F | 99,7% | 8, 41 |
| ZH1-F-003 | D182K | F | 99,7% | 8,19 |
| ZH1-F-004 | Y180F/R181V/I190V | F | 99, 1% | 8,56 |
| ZH1-F-S04 | Y180F/D182T/F183Y/ I190V/G191S | F | 98,5% | 8,56 |
| ZH1-F-S06 | Y180F/D182T/F183Y/ I190V | F | 98,8% | 8, 64 |
| ZH1-F-S10 | E178A/R181V/D182K/ F183Y | F | 98,8% | 7,55 |
| ZH1-H-001 | T236K | H | 99,7% | 8,09 |
| ZH1-H-002 | V237F | H | 99,7% | 8,11 |
| ZH1-H-003 | E234G | H | 99,7% | 8,54 |
| ZH1-H-S02 | F233W | H | 99,7% | 8,37 |
| ZH1-H-S03 | F233Y | H | 99,7% | 8, 64 |
| ZH1-H-S04 | F233H | H | 99,7% | 8,36 |
| ZH1-H-S06 | A231V/F233Y | H | 99, 4% | 8,54 |
| ZH1-H-S09 | F232W/F233A/E234T/ G235D/L239A | H | 98,5% | 8, 83 |
| ZHI-I-001 | H240N | I | 99,7% | 8,54 |
| ZHI-I-002 | H240S | I | 99,7% | 8,79 |
| ZHI-I-003 | D244E/R245Y | I | 99, 4% | 8, 42 |
| ZH1-I-S02 | D244E/R245Q/M246L | I | 99, 1% | 8,36 |
| ZH1-I-S03 | H240N/D244E | I | 99, 4% | 9,26 |
| ZH1-I-S06 | H240S/D244E | I | 99, 4% | 9, 02 |
| ZH1-I-S07 | L239Q/H240T/R245Y | I | 99, 1% | 8,41 |
| ZH1-J-001 | Q249R | J | 99,7% | 8,36 |
| ZH1-J-002 | T252V | J | 99,7% | 7, 94 |
| ZH1-J-S02 | I254V | J | 99,7% | 8,55 |
| ZH1-J-S03 | Q249R/K251N/I254V | J | 99, 1% | 9,03 |
| ZH1-J-S07 | T252V/I254M | J | 99, 4% | 7,81 |
| ZH1-J-S10 | T252V/I254V | J | 99, 4% | 7, 97 |
| ZH1-K-S05 | A260M | К | 99,7% | 8, 64 |
| ZH1-K-S11 | A260F | К | 99,7% | 8, 82 |
| ZH1-K-S13 | A260S | К | 99,7% | 9, 01 |
- 19 037776
| ZHl-L-001 | E266Y | L | 99,7% | 8,46 |
| ZH1-L-002 | E266D | L | 99,7% | 8,31 |
| ZH1-L-003 | T262G | L | 99,7% | 8,32 |
| ZH1-L-004 | T262D/E266D | L | 99, 4% | 8,56 |
| ZH1-L-005 | T262G/I263T | L | 99, 4% | 8, 68 |
| ZH1-L-S02 | E266D/E269H | L | 99, 4% | 8,59 |
| ZH1-L-S04 | I263T/E269N | L | 99, 4% | 8,73 |
| ZH1-L-S06 | E269N | L | 99,7% | 8, 69 |
| ZH1-L-S13 | E266Y/E269N | L | 99, 4% | 8,33 |
| ZHI-M-001 | L274M | M | 99, 7% | 8,29 |
| ZHI-M-002 | L274C | M | 99,7% | 8,37 |
| ZH1-M-S02 | L277E | M | 99,7% | 8,96 |
| ZH1-M-S07 | L274M/A279V | M | 99, 4% | 8,23 |
| ZH1-M-S08 | L274T/L277F | M | 99, 4% | 8, 63 |
| ZH1-M-S11 | L274C/L277I | M | 99, 4% | 8,51 |
| ZH1-N-001 | H297L | N | 99,7% | 8,27 |
| ZH1-N-002 | H298V/L302S | N | 99, 4% | 9, 03 |
| ZH1-N-S02 | H298V | N | 99,7% | 8, 94 |
| ZH1-N-S09 | H298L/P299D | N | 99, 4% | 8,37 |
| ZH1-0-OO1 | L307Q | 0 | 99,7% | 8, 62 |
| ZH1-O-002 | F308S | 0 | 99,7% | 8,57 |
| ZH1-O-S02 | L307Q/A311P | 0 | 99, 4% | 8,34 |
| ZH1-O-S03 | L307Q/F308S | 0 | 99, 4% | 8,74 |
| ZH1-O-S06 | L307Q/F308S/D309A | 0 | 99, 1% | 9,18 |
| ZH1-B/H- 001 | D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A/F233V/ E234G/V237F | B+H | 97,3% | 9,26 |
| ZH1-C/D- 001 | N80H/F84Y/T95S/R99K/ I118V/K119R/L132V/ A141S | C+D | 97, 6% | 9, 31 |
| ZH1-D/K- 001 | T95S/T97A/R99K/I118V/ V123I/L132V/A141S/ A260M | D+K | 97, 6% | 9, 66 |
| ZH1-D/M- 001 | T95S/T97A/R99K/I118V/ V123I/L132V/A141S/ L277E | D+M | 97, 6% | 10, 63 |
| ZH1-K/N- 001 | A260M/H298V | K+N | 99, 4% | 8, 94 |
- 20 037776
| ZH1-K/L- 001 | A2 60M/T262D/E266D/ E269H | K+L | 98,8% | 9, 03 |
| ZH1-K/L- 002 | A260M/T262G/I263T/ E269N | K+L | 98,8% | 8, 84 |
| ZH1-N/O- 001 | Q296A/H298V/L307Q/ A311P | N+O | 98,8% | 9,26 |
| ZH1-N/O- 002 | Q296E/H298V/L302S/ L307Q/F308S | N+O | 98,5% | 9,46 |
| ZH1-C/D/ J-001 | N80H/F84Y/T95S/R99K/ I118V/L132V/A141S/ Q249R/K251N/I254V | C+D+J | 97,0% | 9, 97 |
| ZH1-B/D/ K-001 | D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A/T95S/R99K/ I114M/I118V/K119R/ L132V/A141S/A260M | B+D+K | 95,7% | 10,78 |
| ZH-J/K/ L-001 | 1254V/1256L/A260М/ T262G/I263T/E269N | J+K+L | 98,2% | 9,11 |
| ZH1-J/K/ LM-001 | 1254V/1256L/A260М/ T262D/E266D/E269Н/ L271V | J+K+L+M | 97,7% | 9,14 |
| ZH1- B/C/D/ J-002 | E79R/N80D/D53G/N54R/ L57V/L60I/P72E/V73A/ W96R/R99G/S102T/ F106V/I114L/A115D/ L116G/K119G/V122A/ V123F/A125S/N127L/ L133A/A134S/Y140F/ M142K/T252V/I254V | B+C+D+J | 92,1% | 11,31 |
| ZH1-DEL- 001 | ΔΡ212 | - | 99,7% | 8,56 |
| ZH1-DEL- 002 | AG5/ΔΤ6/AR7/AS8/ΔΕ9/ ΔΆ10/ΔΆ11/Δϋ12/ΔΆ13/ ΔΆ14/ΔΤ15/Δ016/ ΔΆ17/ΔΡ18/Δ019 | - | 95,4% | 8,37 |
| ZH1-DEL- 003 | ΔΝ327/ΔΒ328 | - | 99,4% | 8,27 |
| ZH1- A/B/C-001 | N25D/I26V/F27Y/S29Р/ R31A/F32Y/R35K/V37A/ | A+B+C | 89, 6% | 9,54 |
- 21 037776
| V42I/V43T/F46Y/N54R/ L58V/L59P/L60V/T64G/ P72R/G75P/L77P/R99G/ S102N/D104N/N105T/ F106W/L110V/V111E/ A115D/K119G/V122T/ V123L/L132V/L133I/ S138A/M142K | ||||
| ZH1- DEL/B/ С/D/ J-001 | AG5/ΔΤ6/AR7/AS8/ΔΕ9/ ΔΆ10/ΔΆ11/Δϋ12/ΔΆ13/ AA14/AT15/AQ16/AA17/ AR18/AQ19/AP212/ AN327/AD328/E79R/ N80D/D53G/N54R/L57V/ L60I/P72E/V73A/W96R/ R99G/S102T/F106V/ I114L/A115D/L116G/ K119G/V122A/V123F/ A125S/N127L/L133A/ A134S/Y140F/M142K/ T252V/I254V | B+C+D+J | 86, 6% | 11,52 |
| ZH1- DEL/A/ B/C/D/ J-001 | AG5/АТ6/AR7/AS8/ΔΕ9/ ΔΆ10/ΔΆ11/Δϋ12/ΔΆ13/ ΔΆ14/ΔΤ15/Δ016/ΔΆ17/ ΔΡ18/ΔΟ19/ΔΡ212/ ΔΝ327/Δϋ328/Ν25ϋ/ I26V/F27Y/S29P/R31A/ F32Y/R35K/V37A/V42I/ V43T/F46Y/E79R/N80D/ D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A/W96R/R99G/ S102T/F106V/I114L/ A115D/L116G/K119G/ V122A/V123F/A125S/ N127L/L133A/A134S/ Y140F/M142K/T252V/ I254V | A+B+C+ D+J | 83,3% | 10, 92 |
| ZH1-001 | L302S | - | 99,7% | 8,31 |
Позиции мутаций указаны относительно аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1. Идентичность последовательностей определена по программе BLAST соответственно описанию примера 2.
- 22 037776
Таблица 6. Значения удельной активности функциональных вариантов полипептида с SEQ ID NO: 2
| Вариант | Мутации | Идентичность по сравнению с SEQ ID NO: 2 | Удельная активность, ед/мг |
| ΖΗ2-001 | D3D(GTRSEAADAATQARQL) | 93, 6% | 10,15 |
| ΖΗ2-002 | D8N/V9I/Y10F | 99, 0% | 10,42 |
| ΖΗ2-003 | Μ37Ν/Ε55Р/А56V/V1011/S12 4А/ F194FP/T146Р/Т147А/С148Υ | 97,0% | 10,58 |
| ΖΗ2-004 | S187P/S188A/P189K/M190A/ A191M/R192Q/Y193L | 97,7% | 10,43 |
| ΖΗ2-005 | А262E/R263H/R265Q/L266D/ L2671/М2 68Ι/Ε269R | 97,7% | 10,68 |
| ΖΗ2-006 | D3D(GTRSEAADAATQARQL)/M37N/ Е55Р/А56V/V101I/S124A/F194FP/ Т146Р/Т147А/С148Y/S187Р/ SI88А/Р189К/М190А/А191М/ RI92Q/Y193L/A262E/R263Н/ R265Q/L266D/L2671/М2 681/Е269R | 86, 1% | 10,71 |
Позиции мутаций указаны: относительно аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2. Идентичность последовательностей определена по программе BLAST соответственно описанию примера 2.
Пример 6. Разложение ZEN и производных соединений ZEN в загрязненной кукурузе.
Для определения способности полипептидов в сложной матрице и при низких значениях рН разлагать ZEN и производные соединения ZEN, встречающиеся естественным образом, к загрязненной кукурузе прибавляли с различными концентрациями каждый из полипептидов с SEQ ID NO: 1-6 и контролировали разложение ZEN и производных соединений ZEN.
Загрязненную кукурузу измельчали и использовали в опытах по разложению, причем исходная смесь состояла из 1 г измельченной загрязненной кукурузы, 8,9 мл 100 мМ ацетатного буферного раствора с рН 4,0 и 0,1 мл раствора полипептида. Получали обогащенные и очищенные растворы полипептидов соответственно описанию примера 5, причем их разбавляли до концентраций 10, 100 или 1000 микроединица/мл. Т аким образом, в исходной смеси применяли в абсолютном значении 1 микроединицу (=1 микроединица на грамм кукурузы), 10 микроединиц (=10 микроединиц на грамм кукурузы) или 100 микроединиц (=100 микроединиц на грамм кукурузы). Расщепляемые смеси переносили в склянки вместимостью 25 мл и инкубировали при 37°C при встряхивании с частотой 100 об/мин. Перед прибавлением фермента или после 1-часовой инкубации соответственно отбирали пробы объемом 1 мл, полипептид инактивировали нагреванием в течение 10 мин при 99°C и пробы хранили при -20°C. После размораживания проб нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием. Концентрации ZEN, a также производных соединений ZEN определяли способом ЖХ-МС-МС соответственно описанию М. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). Содержание ZEN и производных соединений ZEN в указанной кукурузе составляло 238 млрд-1 в случае ZEN, 15 млрд-1 в случае α-ZEL, 23 млрд-1 в случае βZEL, 32 млрд-1 в случае Z14G и 81 млрд-1 в случае Z14S. В табл. 7 представлено процентное уменьшение содержания ZEN и производных соединений ZEN в опытах по разложению.
- 23 037776
Таблица 7. Уменьшение содержания ZEN и производных соединений ZEN в процентах относительно начального содержания в опытах по разложению разными полипептидами в разных количествах
| Полипептид | Количество в исходной смеси | ZEN | a-ZEL | β-ZEL | Z14G | Z14S |
| SEQ ID NO: 1 | 0,1 микроед. | 83% | >80% | 70% | 78% | 80% |
| 1 микроед. | 96% | >80% | 76% | >80% | 92% | |
| 10 микроед. | 97% | >80% | >85% | >80% | 94% | |
| SEQ ID NO: 2 | 0,1 микроед. | 87% | >80% | 73% | >80% | 84% |
| 1 микроед. | 97% | >80% | 78% | >80% | 90% | |
| 10 микроед. | 99% | >80% | >85% | >80% | 96% | |
| SEQ ID NO: 3 | 0,1 микроед. | 79% | 79% | 67% | 73% | 75% |
| 1 микроед. | 85% | >80% | 72% | 79% | 82% | |
| 10 микроед. | 92% | >80% | 78% | >80% | 88% | |
| SEQ ID NO: 4 | 0,1 микроед. | 82% | 78% | 65% | 76% | 80% |
| 1 микроед. | 89% | >80% | 73% | >80% | 86% | |
| 10 микроед. | 93% | >80% | 82% | >80% | 91% | |
| SEQ ID NO: 5 | 0,1 микроед. | 79% | 76% | 66% | 78% | 80% |
| 1 микроед. | 83% | >80% | 73% | >80% | 81% | |
| 10 микроед. | 91% | >80% | 79% | >80% | 86% | |
| SEQ ID NO: 6 | 0,1 микроед. | 93% | >80% | 75% | >80% | 90% |
| 1 микроед. | 95% | >80% | 82% | >80% | 92% | |
| 10 микроед. | 98% | >80% | >85% | >80% | 96% |
Пример 7. Добавки, содержащие полипептиды, для гидролитического расщепления ZEN и/или производных соединений ZEN.
Для получения добавок для гидролитического расщепления ZEN надосадочные жидкости после ферментации, содержащие экспрессированные P.pastoris полипептиды с SEQ ID NO: 1, 2, 6 и 13, посредством микрофильтрации и ультрафильтрации (граница отсечки: 10 кД) в стандартных условиях очищали и концентрировали до концентрации сухого вещества около 9 мас.%. Затем растворы, содержащие полипептиды, обрабатывали в распылительной сушилке (Mini B290, компания Buchi) также в стандартных условиях до получения сухих порошков. Полученные четыре порошка далее обозначены как Z1, Z2, Z6 и Z13. Порошки Z1, Z2, Z6 или Z13 были смешаны в поворотном встряхивателе с бентонитом со средним размером частиц около 1 мкм в соотношении 1 мас.% добавки Z1, Z2, Z6 или Z13 и 99 мас.% бентонита. Полученные таким образом добавки были обозначены как добавки Z1.B, Z2.B, Z6.B и Z13.B. Порошки Z1, Z2, Z6 и Z13 также были смешаны в поворотном встряхивателе с бентонитом и концентратом витаминов и микроэлементов в соотношении 0,1 мас.% добавки Z1, Z2, Z6 или Z13, 0,9 мас.% концентрата витаминов и микроэлементов и 99 мас.% бентонита. Полученные таким образом добавки были обозначены как добавки Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS и Z13.BVS. Добавки Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS и Z13.BVS в расчете на 100 г содержали 200 мг сульфата железа, 50 мг сульфата меди, 130 мг оксида олова, 130 мг оксида марганца, 2,55 мг карбоната кальция, 160 мг витамина Е, 6,5 мг витамина K3, 6,5 мг витамина В1, 1,14 мг витамина В2, 15 мг витамина B6, 0,15 мг витамина В12, 50 мг никотиновой кислоты, 30 мг пантотеновой кислоты и 5,3 мг фолиевой кислоты.
Добавки экстрагировали 50 мМ буферным раствором Tris-HCl с рН 8,2 в течение 30 мин и тем же самым буферным раствором разбавляли дальше так, чтобы конечная концентрация полипептида составила около 70 нг/мл.
Затем определяли расщепляющее зеараленон действие этих растворов соответственно описанию примера 5. Соответствующие значения активности составили 8,230 ед./г в случае Z1, 9,310 ед./г в случае Z2, 9,214 ед./г в случае Z6, 83 ед./г в случае Z1.B, 92 ед./г в случае Z2.B, 90 ед./г в случае Z2.C, 57 ед./г в случае Z13.B, 8 ед./г в случае Z1.BVS, 9 ед./г в случае Z2.BVS, 9 ед./г в случае Z6.BVS и 6 ед./г в случае Z13.BVS.
Способность разлагать производные соединения ZEN типа α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S и ZAN добавками Z1, Z2, Z6, Z13, Z1.B, Z2.B, Z6.B, Z13.B, Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS и Z13.BVS определяли соответственно описанию примера 4, однако вместо 100 мкл клеточного лизата применяли
- 24 037776
100 мкл раствора полипептида с концентрацией полипептида около 70 нг/мл. После 6-часовой инкубации в форме негидролизованного производного соединения ZEN оставалось только не больше 15% от исходного количества.
Пример 8. Температурные оптимумы.
Для определения температурных оптимумов полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15 их клонировали с С-концевой меткой 6His соответственно описанию примера 1, экспрессировали в Е.coli и очищали. В предварительных испытаниях для каждого полипептида определяли концентрацию, при которой в опытных условиях (буферный раствор Теорелла-Стенхагена (Teorell und Stenhagen. Ein Universalpuffer fur den pH-Bereich 2,0 bis 12.0. Biochem. Ztschrft., 1938, 299: S. 416-419) при рН 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA при 30°C) через 3 ч протекания опыта могло быть обеспечено полное превращение ZEN. Композиции применяли при найденных концентрациях в расщепляемых смесях для определения температурных оптимумов. Испытания осуществляли в реакторе для ПЦР (компания Eppendorf) с функцией задания температурного градиента при значениях 20+/-10°C, 40+/-10°C и при необходимости 60+/-10°C (10 значений температуры в соответствующей области; предварительно заданные значения температуры в реакторе для ПЦР). К исходным смесям прибавляли буферный раствор ТеореллаСтенхагена при соответствующем оптимальном значении рН, содержавший фермент с соответствующей концентрацией, а также 0,1 мг/мл BSA, и 5 млн-1 ZEN. В качестве отрицательных контрольных проб использовали исходные смеси, содержавшие 0,1 мг/мл BSA и 5 млн-1 ZEN без прибавления фермента. После инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч при соответствующей температуре инкубации отбирали пробы, инактивировали нагреванием в течение 10 мин при 99°C и хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ. ZEN, HZEN и DHZEN анализировали способом ВЭЖХ-ДМД. С этой целью метаболиты хроматографически разделяли посредством колонки Zorbax SB-Aq С18 с размерами 4,6x150 мм и с частицами крупностью 5 мкм. В качестве элюента использовали смесь метанол-вода с 5 мМ ацетата аммония. УФ-сигнал регистрировали при 274 нм. Количественное определение метаболитов осуществляли с привлечением параллельно анализируемых стандартных образцов. Определение температурных оптимумов осуществляли по найденным подъемам кривых разложения, причем температуру, при которой наблюдался наибольший подъем, принимали в качестве температурного оптимума. Значения температурных оптимумов представлены в табл. 8.
Таблица 8. Температурные оптимумы полипептидов
| SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 15 |
| 38°C | 41°C | 50°C | 51°C | 31°C | 35°C | 50°C | 26°C | 41°C |
Пример 9. Термическая стабильность.
Для определения термической стабильности полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15 их клонировали с С-концевой меткой 6His соответственно описанию примера 1, экспрессировали в Е.coli и очищали. Полипептиды инкубировали в реакторе для ПЦР с функцией задания градиента при соответствующем значении температурного оптимума +/-10°C. Через 0, 15, 30 и 60 мин отбирали пробы каждой из исходных смесей при каждой из температур. Затем эти предварительно инкубированные пробы применяли в опытах по разложению в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при соответствующем оптимальном значении рН и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн-1 ZEN в исходной смеси. В предварительных испытаниях для каждого полипептида определяли концентрацию, при которой в опытных условиях (буферный раствор Теорелла-Стенхагена при рН 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA при 30°C) через 3 ч протекания опыта могло быть обеспечено полное превращение ZEN. Соответствующие найденные значения концентрации фермента применяли в исходных смесях. Исходные расщепляемые смеси инкубировали при 30°C. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-ДМД соответственно описанию примера 8.
Термическую стабильность определяли как температуру, при которой полипептиды после 15минутной предварительной инкубации обладали 50%-ной остаточной активностью по сравнению с температурным оптимумом. В качестве меры активности принимали подъем кривых разложения. Значения термической стабильности представлены в табл. 9.
Таблица 9. Термическая стабильность полипептидов (50%-ная остаточная активность после 15-минутной предварительной инкубации)
| SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 15 |
| 38°C | 34°C | 54°C | 61°C | 28°C | 44°C | 55°C | 40°C | 49°C |
Пример 10. Оптимальные значения рН.
Для определения оптимальных значений рН полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15
- 25 037776 их клонировали с С-концевой меткой 6His соответственно описанию примера 1, экспрессировали в E.coli и очищали. В предварительных испытаниях для каждого полипептида была определена концентрация, при которой в опытных условиях (буферный раствор Теорелла-Стенхагена при рН 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA при 30°C) через 3 ч протекания опыта могло быть обеспечено полное превращение ZEN. Соответствующие значения концентрации фермента применяли в исходных смесях. Исходные расщепляемые смеси помещали в буферный раствор Теорелла-Стенхагена при значениях рН, равных 3,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11,0 и 12,0. Исходные расщепляемые смеси с 0,1 мг/мл BSA и 5 млн-1 ZEN инкубировали при 30°C. В качестве отрицательных контрольных проб использовали исходные смеси в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при рН 3,0, рН 7,0 и рН 12,0 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн-1 ZEN. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХДМД соответственно описанию примера 8. Определение оптимальных значений рН осуществляли по найденным подъемам кривых разложения, причем значение рН, при котором наблюдался наибольший подъем, принимали в качестве оптимального значения рН. Оптимальные значения рН представлены в табл. 10.
Таблица 10. Оптимальные значения рН полипептидов
| SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 15 |
| 8,2 | 8,5 | 7,0-8,0 | 7,0-7,5 | 7,5-8,5 | 7,0-7,5 | 8,0 | 7,0-7,5 | 7,5 |
Пример 11. Стабильность при рН 5,0.
Для определения рН-зависимой стабильности полипептиды по примеру 10 инкубировали в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при рН 5,0 и при соответствующем оптимальном значении рН в течение 1 ч при 25°C. Эти предварительно инкубированные пробы использовали в опытах по разложению с равными концентрациями соответствующего полипептида, использованными для определения оптимальных значений рН, в 100 мМ буферного раствора Tris-HCl при соответствующем оптимальном значении рН и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн-1 ZEN в исходной смеси. Исходные смеси инкубировали при соответствующем температурном оптимуме. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-ДМД соответственно описанию примера 8. рН-зависимую стабильность определяли как процентную остаточную активность полипептидов при рН 5 по отношению к активности при соответствующем оптимальном значении рН. Значения рН-зависимой стабильности при рН 5,0 представлены в табл. 11.
Таблица 11. рН-зависимая стабильность полипептидов при рН 5,0
| SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 6 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 15 |
| 3% | 17% | 79% | 80% | 100% | 22% | 87% | 98% | 19% |
Пример 12. Опыты по разложению ZEN.
Разложение ZEN до HZEN и DHZEN осуществляли на примере полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15. Исходные расщепляемые смеси получали в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при рН 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн-1 ZEN. Исходные расщепляемые смеси инкубировали при 30°C. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-ДМД соответственно описанию примера 8. Концентрацию полипептида выбирали так, чтобы полное разложение достигалось приблизительно через 3 ч. Кривые кинетики разложения представлены на фиг. 3, причем на оси у показаны концентрации ZEN, HZEN и DHZEN в микромолях в литре (мкмоль/л), а на оси x показаны длительность инкубации в часах (ч).
* мкМ означает микромолярный и соответствует размерности мкмоль/л.
Claims (20)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Добавка, которая гидролитически расщепляет зераленон и/или по меньшей мере одно производное зеараленона для получения продуктов питания для свиней, птицы или аквакультуры для добавления к пищевым продуктам или к высушенной барде, где добавка содержит по меньшей мере один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 2-15, или ее функциональный вариант, где идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 70%, а также присутствуют вспомогательные вещества.- 26 037776
- 2. Добавка по п.1, где вспомогательные вещества выбраны из по меньшей мере одного инертного носителя, а также необязательных дополнительных ингредиентов, таких как витамины, и/или минералы, и/или ферменты, и/или другие компоненты для детоксификации микотоксинов.
- 3. Добавка по п.1 или 2, где по меньшей мере один полипептид по любому из пп. 1 или 2 присутствует в добавке в концентрации не более 10000 ед./г, предпочтительно не более 1000 ед./г, более предпочтительно не более 100 ед./г и наиболее предпочтительно не более 10 ед./г.
- 4. Добавка по любому из пп.1, 2 или 3, где добавка присутствует в капсулированной или покрытой форме.
- 5. Применение добавки по любому из пп.1-4 для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного зеараленона в кормах, предпочтительно для свиней, птицы или аквакультуры, или в пищевых продуктах, или в высушенной барде.
- 6. Способ гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного зеараленона, отличающийся тем, что зеараленон и/или по меньшей мере одно производное зеараленона гидролизуется по меньшей мере одним полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 2-15 или их функционального варианта, где идентичность последовательности между функциональным вариантом и аминокислотной последовательностью составляет по меньшей мере 70%.
- 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что по меньшей мере один полипептид применяют в добавке по любому из пп.1-4.
- 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что по меньшей мере один полипептид или добавку смешивают с пищевым продуктом или кормом для животного, загрязненным зеараленоном и/или по меньшей мере одним производным зеараленона; загрязненный пищевой продукт или корм для животного приводят в контакт с влагой, а полипептид или добавка гидролизует зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, содержащееся в загрязненном пищевом продукте или корме для животного.
- 9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 90% зеараленона и/или по меньшей мере одного производного зеараленона гидролизуется.
- 10. Применение полипептида для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона, отличающееся тем, что полипептид представляет собой гидролазу с аминокислотной последовательностью, выбранную из группы SEQ ID NO: 2-15, или ее функциональный вариант, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью составляет по меньшей мере 70%.
- 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что полипептид содержит по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности или его функциональный вариант, причем функциональный вариант участка аминокислотной последовательности имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 84%, более предпочтительно по меньшей мере 92% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% и по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности выбран из группы аминокислотных последовательностей от +24 до +50, от +52 до +77, от +79 до +87, от +89 до +145, от +150 до +171, от +177 до +193, от +223 до +228, от +230 до +237, от +239 до +247, от +249 до +255, от +257 до +261, от +263 до +270, от +272 до +279, от +297 до +301, от +303 до +313, от +24 до 328, от +1 до +328 последовательности с SEQ ID NO: 1.
- 12. Применение по п.10 или 11, отличающееся тем, что функциональный вариант имеет по меньшей мере одну модификацию аминокислот, выбранную из группы замен, делеций и инсерций соответственно одной или нескольких аминокислот.
- 13. Применение по любому из пп.10, 11 или 12, отличающееся тем, что полипептид имеет удельную активность, равную по меньшей мере 0,01 ед./мг, преимущественно по меньшей мере 0,1 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 1 ед./мг, и/или имеет константу KM гидролитического расщепления зеараленона, равную не более 50 мкМ, преимущественно не более 3,5 мкМ и предпочтительно не более 0,5 мкМ, и/или имеет константу kcat гидролитического расщепления зеараленона, равную по меньшей мере 0,05 с-1, преимущественно по меньшей мере 0,6 с-1 и предпочтительно по меньшей мере 5 с-1, и/или имеет константу vmax гидролитического расщепления зеараленона, равную по меньшей мере 0,00001 мкМ'1-с'1, преимущественно по меньшей мере 0,0001 мкМ-1-с-1 и предпочтительно по меньшей мере 0,001 мкМ'1-с'1.
- 14. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что полипептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 9, 11 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, и стабильность рН полипептида при рН 5,0 составляет по меньшей мере 15%, предпочтительно 50% и, в частности, предпочтительно 90%.
- 15. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что полипептид содержит аминокис-- 27 037776 лотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 9, 11 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, и полипептид обладает наиболее высокой ферментативной активностью в температурном интервале от 30 до 75°C, предпочтительно от 38 до 55°C и особенно предпочтительно от 38 до 52°C.
- 16. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 2, 5, 6, 9, 11 и 15, или ее функционального варианта, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, и полипептид является термически стабильным до температуры 90°C, предпочтительно 75°C и особенно предпочтительно 60°C.
- 17. Применение по любому из пп.10-16, отличающееся тем, что полипептид имеет по меньшей мере одну мутацию аминокислотной последовательности относительно SEQ ID NO: 1 по меньшей мере в одной из следующих позиций, выбранных из группы: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165,169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212,213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262,263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311, 314,317, 319, 321, 323, 325 и 326.
- 18. Применение по п.17, отличающееся тем, что полипептид имеет по меньшей мере одну мутацию аминокислотной последовательности относительно SEQ ID NO: 1, выбранную из группы: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, Р72Е, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, Т97А, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, А154Р, Р163Т, А164Т, Y165C,Y165H, V169I, L170R, A172G, А176М, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, К194Т, К194Е,F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, Р204А, A205S, К2О6Р, А207М, М208А,Q209R, L210A, L210S, ΔΡ212, T213V, Р214А, Е216Т, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q,G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N,S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, А260М, T262D, T262G, I263T, E266D, Е269Н, E269N, L271V,L277E, Е280А, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D,R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, А311Р, A314V, L317F, S319Q,S319P, S319R, S321A, S321T, Т323А, Р325А, А326Р.
- 19. Применение по любому из пп.10-17, отличающееся тем, что полипептид содержит по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов, выбранных из группы последовательностей SEQ ID NO: 32-69.
- 20. Применение по п.18, отличающееся тем, что полипептид содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты по меньшей мере в одной позиции, а консервативная замена аминокислоты выбрана из замен G на А, или А на G, S, или V на I, L, A, T, S, или I на V, L, М, или L на I, М, V, или М на L, I, V, или Р на A, S, N, или F на Y, W, Н, или Y на F, W, Н, или W на Y, F, Н, или R на K, Е, D, или K на R, E, D, или Н на Q, N, S, или D на N, Е, K, R, Q, или Е на Q, D, K, R, N, или S на Т, А, или Т на S, V, А, или С на S, Т, А, или N на D, Q, H, S, или Q на Е, N, Н, K, R.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ATA667/2013A AT514775B1 (de) | 2013-08-28 | 2013-08-28 | Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201891967A1 EA201891967A1 (ru) | 2019-02-28 |
| EA037776B1 true EA037776B1 (ru) | 2021-05-20 |
Family
ID=51662974
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201891967A EA037776B1 (ru) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных соединений зеараленона, полинуклеотид, выделенный из него, а также содержащая полипептид добавка, его применение, а также способ |
| EA201690471A EA032685B1 (ru) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных соединений зеараленона, полинуклеотид, выделенный из него, а также содержащая полипептид добавка, его применение, а также способ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201690471A EA032685B1 (ru) | 2013-08-28 | 2014-08-27 | Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных соединений зеараленона, полинуклеотид, выделенный из него, а также содержащая полипептид добавка, его применение, а также способ |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US10149489B2 (ru) |
| EP (8) | EP3495477B1 (ru) |
| JP (3) | JP6526671B2 (ru) |
| KR (2) | KR102215533B1 (ru) |
| CN (7) | CN110499304A (ru) |
| AT (1) | AT514775B1 (ru) |
| AU (2) | AU2014311244B2 (ru) |
| BR (2) | BR112016004340B1 (ru) |
| CA (1) | CA2922178C (ru) |
| CL (2) | CL2016000464A1 (ru) |
| CR (2) | CR20160128A (ru) |
| DK (7) | DK3495477T3 (ru) |
| DO (1) | DOP2016000051A (ru) |
| EA (2) | EA037776B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP16012693A (ru) |
| ES (7) | ES2840305T3 (ru) |
| HK (1) | HK1226101A1 (ru) |
| HU (2) | HUE038188T2 (ru) |
| IL (1) | IL244144B (ru) |
| MX (1) | MX371487B (ru) |
| MY (1) | MY171604A (ru) |
| NI (1) | NI201600028A (ru) |
| PE (2) | PE20220389A1 (ru) |
| PH (1) | PH12016500377A1 (ru) |
| PL (2) | PL3039135T3 (ru) |
| PT (2) | PT3039135T (ru) |
| SG (2) | SG10201900355RA (ru) |
| UA (1) | UA118681C2 (ru) |
| WO (2) | WO2015027259A2 (ru) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT514775B1 (de) * | 2013-08-28 | 2017-11-15 | Erber Ag | Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid |
| AT516457B1 (de) * | 2014-11-07 | 2017-03-15 | Erber Ag | Polypeptid zur enzymatischen Detoxifizierung von Zearalenon, sowie isoliertes Polynukleotid, sowie Zusatzstoff, Verwendung und Verfahren desselben |
| CN104804070B (zh) * | 2015-04-13 | 2018-03-02 | 南昌大学 | 可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其应用 |
| CN104788543B (zh) * | 2015-04-13 | 2018-03-02 | 南昌大学 | 一种基于多肽的玉米赤霉烯酮抗体模拟物及其应用 |
| HRP20240421T1 (hr) | 2015-08-03 | 2024-06-21 | Monsanto Technology Llc | Postupci i pripravci za otpornost biljaka na herbicide |
| US10378023B2 (en) | 2015-09-01 | 2019-08-13 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
| PE20190838A1 (es) | 2016-07-29 | 2019-06-17 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para la expresion genica en plantas |
| CN108251399B (zh) * | 2016-12-29 | 2020-08-21 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 伏马毒素降解酶、编码基因、重组载体、细胞、添加剂及其应用 |
| BR112020002029A2 (pt) | 2017-07-31 | 2020-10-06 | Poet Research, Inc. | remediação de toxinas em correntes de processo de biorrefinaria |
| CN109825484B (zh) * | 2017-11-23 | 2022-06-28 | 吉林中粮生化有限公司 | 玉米赤霉烯酮水解酶zhd101突变体及利用该突变体水解玉米赤霉烯酮的方法 |
| LU100899B1 (en) * | 2018-07-31 | 2020-02-03 | Erber Ag | Means and methods for cleavage of zearalenone |
| CN110777128A (zh) * | 2018-07-31 | 2020-02-11 | 奥地利商艾尔柏有限公司 | 用于裂解玉米赤霉烯酮的手段和方法 |
| WO2020025580A1 (en) * | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Erber Aktiengesellschaft | Means and methods for cleavage of zearalenone |
| CN110029095B (zh) * | 2019-04-15 | 2022-06-07 | 南京工业大学 | 一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用 |
| CN110592046B (zh) * | 2019-09-30 | 2022-03-15 | 湖北大学 | 玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用 |
| CN110819608B (zh) * | 2019-10-29 | 2022-03-15 | 湖北大学 | 一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法 |
| US20210403841A1 (en) | 2020-03-12 | 2021-12-30 | Poet Research, Inc. | Enzymatic degradation of mycotoxins during grain processing |
| CN114292828A (zh) * | 2020-10-08 | 2022-04-08 | 爱尔伯股份公司 | 具有提高的温度稳定性的四聚体α/β水解酶变体及其使用和生产方法 |
| CN112760300B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-08-30 | 潍坊康地恩生物科技有限公司 | 一种黄曲霉毒素降解酶突变体及其生产菌株 |
| CN114774386B (zh) * | 2022-03-11 | 2024-02-02 | 暨南大学 | 一种对胃蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶 |
| CN114774385B (zh) * | 2022-03-11 | 2024-02-02 | 暨南大学 | 一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003053161A1 (de) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Erber Aktiengesellschaft | Mikroorganismus zur biologischen entgiftung von mykotoxinen, nämlich ochratoxinen und/oder zearalenonen, sowie verfahren und verwendung hiefür |
| WO2012113827A1 (en) * | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Eucodis Bioscience Gmbh | Feed processing enzymes |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK13491D0 (da) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | Novo Nordisk As | Anvendelse af et enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling af et forderstof i tabletform |
| US5846812A (en) * | 1996-11-22 | 1998-12-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Zearalenone detoxification compositions and methods |
| PL343506A1 (en) * | 1999-02-10 | 2001-08-27 | Dsm Nv | Granulates containing feed-enzymes |
| AR028977A1 (es) * | 2000-07-13 | 2003-05-28 | Syngenta Participations Ag | Genes de lipoxigenasa, promotores, peptidos de transito y proteinas de los mismos |
| US6812380B2 (en) * | 2001-03-27 | 2004-11-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of zearalenone detoxification |
| WO2002099142A2 (de) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | Wilhelm Holzapfel | Actinomyceten zum abbau von aflatoxin b1, ochratoxin a und/oder zearalenon |
| JP2004000130A (ja) | 2002-03-25 | 2004-01-08 | Inst Of Physical & Chemical Res | ゼアラレノン解毒酵素遺伝子及び該遺伝子を導入した形質転換体 |
| US20060008888A1 (en) * | 2004-07-07 | 2006-01-12 | Kragh Karsten M | Polypeptide |
| KR101280811B1 (ko) | 2010-11-15 | 2013-07-02 | (주)진바이오텍 | 제아라레논 분해 활성을 갖는 미생물, 이를 이용한 제아라레논 분해 방법 및 사료첨가제 |
| CN102199581B (zh) * | 2011-03-31 | 2013-02-06 | 国家粮食局科学研究院 | 一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用 |
| AT514775B1 (de) * | 2013-08-28 | 2017-11-15 | Erber Ag | Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und/oder Zearalenon Derivaten, isoliertes Polynukleotid davon sowie Zusatzstoff enthaltend das Polypeptid |
-
2013
- 2013-08-28 AT ATA667/2013A patent/AT514775B1/de active
-
2014
- 2014-08-27 BR BR112016004340-5A patent/BR112016004340B1/pt active IP Right Grant
- 2014-08-27 MY MYPI2016700612A patent/MY171604A/en unknown
- 2014-08-27 DK DK19152573.2T patent/DK3495477T3/da active
- 2014-08-27 ES ES19152332T patent/ES2840305T3/es active Active
- 2014-08-27 DK DK19152484.2T patent/DK3495476T3/da active
- 2014-08-27 PE PE2020001602A patent/PE20220389A1/es unknown
- 2014-08-27 WO PCT/AT2014/000165 patent/WO2015027259A2/de active Application Filing
- 2014-08-27 EA EA201891967A patent/EA037776B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-08-27 CN CN201910861359.0A patent/CN110499304A/zh active Pending
- 2014-08-27 EP EP19152573.2A patent/EP3495477B1/de active Active
- 2014-08-27 JP JP2016537048A patent/JP6526671B2/ja active Active
- 2014-08-27 CR CR20160128A patent/CR20160128A/es unknown
- 2014-08-27 SG SG10201900355RA patent/SG10201900355RA/en unknown
- 2014-08-27 EP EP19152160.8A patent/EP3495474B1/de active Active
- 2014-08-27 CN CN201480055221.7A patent/CN105705637A/zh active Pending
- 2014-08-27 WO PCT/AT2014/000164 patent/WO2015027258A2/de active Application Filing
- 2014-08-27 MX MX2016002636A patent/MX371487B/es active IP Right Grant
- 2014-08-27 HU HUE14783532A patent/HUE038188T2/hu unknown
- 2014-08-27 KR KR1020207003360A patent/KR102215533B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-27 EP EP19152381.0A patent/EP3498830B1/de active Active
- 2014-08-27 ES ES14783532.6T patent/ES2675026T3/es active Active
- 2014-08-27 PL PL14783532T patent/PL3039135T3/pl unknown
- 2014-08-27 PL PL19152082T patent/PL3495473T3/pl unknown
- 2014-08-27 CN CN201910861330.2A patent/CN110527674A/zh active Pending
- 2014-08-27 CN CN201910861350.XA patent/CN110527676A/zh active Pending
- 2014-08-27 DK DK19152332.3T patent/DK3495475T3/da active
- 2014-08-27 EP EP19152082.4A patent/EP3495473B1/de active Active
- 2014-08-27 EP EP19152332.3A patent/EP3495475B1/de active Active
- 2014-08-27 DK DK19152160.8T patent/DK3495474T3/da active
- 2014-08-27 US US14/914,671 patent/US10149489B2/en active Active
- 2014-08-27 CN CN201610373145.5A patent/CN106085983A/zh active Pending
- 2014-08-27 CN CN201910861349.7A patent/CN110527675A/zh active Pending
- 2014-08-27 DK DK19152082.4T patent/DK3495473T3/da active
- 2014-08-27 EP EP14783532.6A patent/EP3039135B1/de active Active
- 2014-08-27 ES ES19152484T patent/ES2843788T3/es active Active
- 2014-08-27 HU HUE19152082A patent/HUE052623T2/hu unknown
- 2014-08-27 KR KR1020167008042A patent/KR102075752B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-27 ES ES19152082T patent/ES2840303T3/es active Active
- 2014-08-27 EA EA201690471A patent/EA032685B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-08-27 CR CR20200234A patent/CR20200234A/es unknown
- 2014-08-27 ES ES19152573T patent/ES2843204T3/es active Active
- 2014-08-27 EP EP19152484.2A patent/EP3495476B1/de active Active
- 2014-08-27 ES ES19152160T patent/ES2837422T3/es active Active
- 2014-08-27 BR BR122020001707-4A patent/BR122020001707B1/pt active IP Right Grant
- 2014-08-27 UA UAA201603121A patent/UA118681C2/uk unknown
- 2014-08-27 DK DK19152381.0T patent/DK3498830T3/da active
- 2014-08-27 CN CN201910861336.XA patent/CN110499303A/zh active Pending
- 2014-08-27 ES ES19152381T patent/ES2840306T3/es active Active
- 2014-08-27 AU AU2014311244A patent/AU2014311244B2/en active Active
- 2014-08-27 CA CA2922178A patent/CA2922178C/en active Active
- 2014-08-27 SG SG11201601355XA patent/SG11201601355XA/en unknown
- 2014-08-27 PT PT147835326T patent/PT3039135T/pt unknown
- 2014-08-27 DK DK14783532.6T patent/DK3039135T3/en active
- 2014-08-27 EP EP14781432.1A patent/EP3039134B1/de not_active Not-in-force
- 2014-08-27 PT PT191520824T patent/PT3495473T/pt unknown
- 2014-08-28 PE PE2016000319A patent/PE20160243A1/es unknown
-
2016
- 2016-02-16 IL IL244144A patent/IL244144B/en active IP Right Grant
- 2016-02-18 DO DO2016000051A patent/DOP2016000051A/es unknown
- 2016-02-19 NI NI201600028A patent/NI201600028A/es unknown
- 2016-02-26 US US15/054,232 patent/US10076125B2/en active Active
- 2016-02-26 PH PH12016500377A patent/PH12016500377A1/en unknown
- 2016-02-29 CL CL2016000464A patent/CL2016000464A1/es unknown
- 2016-03-28 EC ECIEPI201612693A patent/ECSP16012693A/es unknown
- 2016-12-22 HK HK16114603A patent/HK1226101A1/zh unknown
-
2018
- 2018-10-16 US US16/161,266 patent/US10779556B2/en active Active
- 2018-12-27 JP JP2018244394A patent/JP2019088287A/ja active Pending
-
2019
- 2019-05-20 CL CL2019001365A patent/CL2019001365A1/es unknown
-
2020
- 2020-04-13 JP JP2020071453A patent/JP7138674B2/ja active Active
- 2020-06-12 AU AU2020203904A patent/AU2020203904B2/en active Active
- 2020-07-21 US US16/934,179 patent/US11324235B2/en active Active
-
2021
- 2021-12-20 US US17/555,731 patent/US11910807B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-01 US US17/829,416 patent/US11998027B2/en active Active
- 2022-06-01 US US17/829,431 patent/US11998028B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003053161A1 (de) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Erber Aktiengesellschaft | Mikroorganismus zur biologischen entgiftung von mykotoxinen, nämlich ochratoxinen und/oder zearalenonen, sowie verfahren und verwendung hiefür |
| WO2012113827A1 (en) * | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Eucodis Bioscience Gmbh | Feed processing enzymes |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| "Cellulose Solvents: For Analysis, Shaping and Chemical Modification", vol. 1031, 26 February 2010, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, Washington, DC, ISBN: 9780841200074, ISSN: 00976156, article I. RODRIGUES, E. M. BINDER, G. SCHATZMAYR: "Microorganisms and their enzymes for detoxifying mycotoxins posing a risk to livestock animals", pages: 107 - 117, XP055103712, DOI: 10.1021/bk-2009-1031.ch008 * |
| DATABASE UniProt [online] "SubName: Full=Alpha/beta hydrolase {ECO:0000313|EMBL:EME22619.1};", XP002734871, retrieved from EBI * |
| DATABASE UniProt [online] "SubName: Full=Alpha/beta hydrolase fold containing protein {ECO:0000313|EMBL:AEM80235.1};", XP002732830, retrieved from EBI * |
| DATABASE UniProt [online] "SubName: Full=Hydrolase {ECO:0000313|EMBL:AHH94730.1};", XP002732829, retrieved from EBI * |
| DATABASE UniProt [online] "SubName: Full=Hydrolase {ECO:0000313|EMBL:EHN79176.1};", XP002734870, retrieved from EBI * |
| DATABASE UniProt [online] "SubName: Full=Uncharacterized protein {ECO:0000313|EMBL:ACU38472.1}; Flags: Precursor;", XP002734872, retrieved from EBI * |
| TAKAHASHI-ANDO N. ET AL.: "A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone: enzyme purification and gene cloning", BIOCHEMICAL JOURNAL, PUBLISHED BY PORTLAND PRESS ON BEHALF OF THE BIOCHEMICAL SOCIETY., GB, vol. 365, 1 July 2002 (2002-07-01), GB, pages 1 - 6, XP002967677, ISSN: 0264-6021, DOI: 10.1042/BJ20020450 * |
| YUANSHAN YU; LIPING QIU; HUI WU; YUQIAN TANG; FURAO LAI; YIGANG YU: "Oxidation of zearalenone by extracellular enzymes fromSM04 into smaller estrogenic products", WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 27, no. 11, 26 April 2011 (2011-04-26), Do, pages 2675 - 2681, XP019959940, ISSN: 1573-0972, DOI: 10.1007/s11274-011-0741-3 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11998027B2 (en) | Polypeptide for hydrolytic cleavage of zearalenone and/or zearalenone derivatives, isolated polynucleotide thereof as well as a polypeptide containing an additive, use of same as well as a process | |
| RU2720517C2 (ru) | Варианты полипептидов, расщепляющих фузариотоксины, содержащая их добавка, их применение и способ расщепления фузариотоксинов | |
| NZ717021B2 (en) | Polypeptide for hydrolytic cleavage of zearalenone and/or zearalenone derivatives, isolated polynucleotide thereof as well as a polypeptide containing an additive, use of same as well as a process |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |