EA032685B1

EA032685B1 - Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных соединений зеараленона, полинуклеотид, выделенный из него, а также содержащая полипептид добавка, его применение, а также способ

Info

Publication number: EA032685B1
Application number: EA201690471A
Authority: EA
Inventors: Себастьян Фрухауф; Михаэла Тамхесль; Мартин Пфеффер; Дитер Молль; Герд Шатцмаир; Ева Мария Биндер
Original assignee: Эрбер Акциенгезелльшафт
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2019-07-31
Also published as: US10076125B2; CR20160128A; AU2014311244A1; BR122020001707B1; AT514775A1; US11998027B2; BR112016004340B1; SG11201601355XA; US11910807B2; CN110527674A; ES2843788T3; NI201600028A; EP3495477A1; US10149489B2; EP3495476A1; IL244144A0; ECSP16012693A; ES2837422T3; EP3039135B1; EA037776B1

Abstract

Полипептид, гидролитически расщепляющий зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона и представляющий собой гидролазу с аминокислотной последовательностью из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-15 или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%, добавка, содержащая полипептид, а также изолированный выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, и способ гидролитического расщепления полипептидом зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона.

Description

Изобретение относится к полипептиду для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона, к изолированному полинуклеотиду, кодирующему полипептид такого рода, к добавке, содержащей полипептид такого рода, к применению полипептида такого рода, а также к способу для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона.

Микотоксины представляют собой вторичные метаболиты, продуцируемые нитевидными грибами. Важным представителем микотоксинов является распространенный во всем мире зеараленон (ZEN), ранее известный как токсин F-2, продуцируемый большинством грибов рода Fusarium. Эти грибы поражают, в частности, культурные растения, такие как различные виды зерновых, причем, как правило, грибковое поражение появляется перед сбором урожая, при этом рост грибов или продуцирование микотоксинов может происходить перед хранением или при ненадлежащем хранении, а также после сбора урожая. FAO оценивает, что во всем мире 25% сельскохозяйственных продуктов загрязнены микотоксинами, что ведет к значительным экономическим потерям. Во время исследования, проведенного в недавнее время, во всем мире с января 2009 года по декабрь 2011 года в целом была проанализирована 23 781 проба, причем 81% оказался положительным по меньшей мере на один микотоксин и 45% оказались положительными на ZEN. ZEN был найден также во всех регионах мира как во всех испытуемых зерновых и фуражных классах, таких как, например, кукуруза, соевая мука, пшеница, пшеничные отруби, DDGS (высушенная барда), так и в готовых кормовых смесях с частотой до 100%.

ZEN представляет собой нестероидный, эстрогенный макроциклический лактон, синтезируемый вследствие обмена веществ с участием поликетидов, имеющий структурную формулу

и называемый по номенклатуре ИЮПАК (2Е,1^)-15,17-дигидрокси-11-метил-12оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-7,13-дион.

Однако в природе встречается также большое число производных соединений ZEN, которые образуются благодаря ферментативной или химической модификации ZEN. Примерами тому являются гликозидные или сульфатсодержащие конъюгаты ZEN, которые образуются вследствие метаболизма в грибах, растениях или млекопитающих, а также метаболиты ZEN, которые образуются, в частности, в организме человека или животного. В последующем тексте под производными соединениями ZEN понимают как встречающиеся в природе, так и получающиеся вследствие химического или биохимического синтеза конъюгаты ZEN или метаболиты ZEN и предпочтительно α-зеараленол (α-ZEL; (2E,7R,11S)-7,15,17тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-13-он), β-зеараленол (βZEL; (2E,7S,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло [12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен13-он), α-зеараланол (α-ZAL; (7R, 1^)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло [12.4.0] октадека1(18),14,16-триен-13-он), β-зеараланол (β-ZAL; (7S, 11 S)-7,15,17-тригидрокси-11-\1ети.1-12оксабицикло[12.4.0]октадека-1(14),15,17-триен-13-он), зеараленон-14-сульфат (Z14S; [(2E, 11 S)-15гидрокси-11-метил-7,13-диоксо-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-17ил]гидросульфат), зеараленон-14-гликозид (Z14G; (2E,11 S)-15-гидрокси-11-метил-17-[(3R,4S,5S,6R)3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидропиран-2-ил]окси-12-оксабицикло[12.4.0]октадека1(18)2,14,16-тетраен-7,13-дион), а также зеараланон (ZAN; (1^)-15,17-дигидрокси-11-метил-12оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),14,16-триен-7,13-дион).

ZEN, также как и производные соединения ZEN, в первую очередь α-ZEL, β-ZEL, Z14S, α-ZAL, βZAL, Z14G и ZAN, вследствие своей высокой химической и физической стабильности могут быть обнаружены также в переработанных пищевых продуктах или кормах, таких, как, например, хлеб или пиво.

ZEN связывается с рецептором эстрогена и может обуславливать гормональные расстройства, причем он абсорбируется непосредственно после орального приема и превращается млекопитающими в два стереоизомерных метаболита α-ZEL или β-ZEL. При этом, например, α-ZEL, а также α-ZAL или ZAN, оказывают эстрогенное действие намного более сильное, чем ZEN. Конъюгированные производные соединения ZEN иногда проявляют эстрогенизм более низкий, чем ZEN, однако из этих производных соединений ZEN в пищеварительном тракте может вновь высвобождаться ZEN.

Хотя ZEN обладает относительно низкой острой токсичностью и имеет значение оральной LD₅₀ до 20000 мг/на кг массы тела, при длительном приеме может встречаться подострое и/или начальное хроническое токсическое действие, такое как, например, тератогенное, карциногенное, эстрогенное и иммуносупрессивное действие у животных или людей. Корм, загрязненный ZEN, ведет к нарушениям развития у млекопитающих, причем свиньи, в особенности молодые животные, являются крайне чувствительными по отношению к ZEN. Концентрации ZEN в корме больше 0,5 млн^-1 ведут к нарушениям развития, причем, например, концентрации больше 1,5 млн^-1 могут вести к гиперэстрогенизму у свиней, а концентра

- 1 032685 ции ZEN больше 12 млн¹ были ответственными за выкидыши у крупного рогатого скота. Так как зеараленон быстро абсорбируется слизистыми оболочками, в частности слизистой оболочкой желудка, а также полости рта, то необходима немедленная и, в первую очередь, количественная дезактивация. Уже через 30 мин после перорального введения ZEN он может быть обнаружен в крови. При этом применение изолированных ферментов по сравнению с микроорганизмами имеет преимущества, заключающиеся в более высокой удельной активности или в более быстром действии. Вследствие вредного действия ZEN в Европейском Союзе установлены обязательные верхние границы содержания ZEN в пищевых продуктах, а также рекомендованы верхние границы содержания ZEN в кормах (№ EC: 1881/2006).

Первичная стратегия для уменьшения загрязнения ZEN пищевых продуктов или кормов состоит в ограничении роста грибов, например, за счет соблюдения надлежащей сельскохозяйственной практики. С этой целью, в частности, семенной материал освобождают от вредителей и грибкового поражения, а сельскохозяйственные отходы своевременно удаляют с полей. При этом благодаря применению фунгицидов может быть уменьшен рост грибов в условиях поля. После сбора урожай должен храниться с остаточной влажностью меньше 15% и при низкой температуре для предотвращения роста грибов. При этом продукт, затронутый грибковым поражением, должен быть удален перед дальнейшей переработкой. Несмотря на этот перечень мероприятий I. Rodriges и K. Naehrer (2012) сообщили, что даже в регионах с наивысшими сельскохозяйственными стандартами, таких как США и Центральная Европа, в период с 2009 по 2011 год соответственно 29 и 39% проверенных проб кукурузы были загрязнены ZEN.

Другие возможности удаления ZEN из кормовых или пищевых продуктов предоставляет адсорбция или трансформация микотоксина. Для этого необходимо, чтобы связь микотоксина с адсорбентом была сильной и специфической в широкой области значений pH и оставалась стабильной в течение всего процесса пищеварения в желудочно-кишечном тракте. Хотя некоторые из адсорбентов небиологического происхождения, такие как, например, активированный уголь, силикаты или синтетические полимеры, такие, как холестирамин, могут быть эффективно использованы в случае афлатоксинов, их применение в случае других микотоксинов является ограниченным. Существенный недостаток адсорбирующих агентов представляет собой неспецифическая связь с другими молекулами, которые частным порядком являются существенными для питания. Адсорбенты биологического происхождения, такие как, например, дрожжи или дрожжевые экстракты, в литературе также описаны, однако имеют похожие ограничения как и адсорбенты небиологического происхождения.

Детоксификация ZEN за счет физической и химической обработки также ограничена. ZEN не может быть эффективно деактивирован термической обработкой, однако содержание ZEN может быть уменьшено экструдированием и обработкой окислительными агентами, например в течение 16 ч при 80°C 10%-ным раствором пероксида водорода, на 83,9%. Применение способов экструзии и окислительных агентов, таких как озон или пероксид водорода, при производстве кормов и пищевых продуктов является ограниченным вследствие высоких расходов, потери качества, относительно низкой эффективности и низкой специфичности.

Биотрансформация ZEN посредством микроорганизмов, таких как, например, штаммы Trichosporon mycotoxinivorans, Gliocladium roseum или Bacillus subtilis, или выделенных из них ферментов, таких как гидролазы или пероксидазы, описана, например, E. Vekiru et al. в Appl. and Environ. Microb., 2010, 76, 7, 2353-2359.

Из EP 0938575 B1 известны свойства бактерий вида Rhodococcus и Nocardia, предпочтительно R.globerulus, R.erythropolis и N.globerula в отношении расщепления ZEN.

Из WO 02/076205 может быть получена информация о расщепляющем ZEN действии ферментов, выделенных из Gliocladium roseum, в частности α/β-гидролазы, зеараленонгидролазы-1 (ZHD1), которая катализирует разложение ZEN посредством каталитической триады.

Из WO 2012/113827 можно получить информацию о рекомбинантных зеараленонгидролазах, а именно о расщепляющих ZEN ферментах, которые остаются стабильными в желудочно-кишечном тракте, в частности там описаны такие микроорганизмы, как Thermobifidia fusca, Streptomyces exfoliatus, Acidovorans delafieldii и Streptomyces sp.

Полипептиды или ферменты, которые могут гидролизовать ZEN и/или по меньшей мере одно производное соединение ZEN, также могут быть обозначены как зеараленонгидролазы.

Используемые далее термины относятся к профессиональному языку и соответственно, если не указано иное, используются в традиционном значении. Так, например, термин полинуклеотид относится к любым видам генетического материала любых длин и последовательностей, таких как, например, одинарная спираль и двойная спираль молекул ДНК и РНК, включая регуляторные элементы, структурные элементы, группы генов, плазмиды, полные геномы и их фрагменты. Термин полипептид охватывает белки, такие как, например, ферменты, антитела, а также полипептиды, содержащие до 500 аминокислот, такие как, например, пептидные ингибиторы, белковые домены, а также короткие полипептиды с малыми длинами последовательностей, например меньше 10 аминокислот, такие как рецепторы, лиганды, пептидные гормоны, метки и т.п. Термин позиция в полинуклеотиде или полипептиде относится к отдельному, специфическому основанию или аминокислоте в последовательности полинуклеотида или полипептида.

- 2 032685

Таким образом, настоящее изобретение направлено на разработку полипептида, с которым удается ZEN и/или по меньшей мере одно производное соединение ZEN быстро и надежно трансформировать в гидролизованный ZEN и/или в гидролизованные производные соединения ZEN. С целью решения этой задачи настоящее изобретение, по существу, отличается тем, что полипептид представляет собой гидролазу с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 115, или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%.

Термин идентичность последовательности соответственно настоящему изобретению относится к процентной идентичности последовательности. Для аминокислотных и нуклеотидных последовательностей идентичность последовательности может быть определена визуально, но предпочтительно ее рассчитывают посредством компьютерной программы. Сравнение последовательностей осуществляют также внутри участков последовательностей, причем в качестве участка следует понимать непрерывную последовательность опорной последовательности, и предпочтительно охватывают консервативную область последовательности.

В данном случае идентичность последовательностей устанавливают посредством программы NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (программа поиска основных локальных выравниваний)), предпочтительно программы BLASTP в случае полипептидов и программы BLASTN в случае полинуклеотидов, которые доступны для использования на интернет-странице National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Таким образом, две или несколько последовательностей можно сравнивать друг с другом по алгоритму Altschul et al. (1997, Nucleic. Acids. Res., 25:33893402). С этой целью в настоящем изобретении была использована программа в версии от 15 мая 2013 года. В качестве программных установок были приняты базовые установки и, в частности, для выравнивания аминокислотных последовательностей: max target sequence (максимальное число целевых последовательностей)=100; expected threshold (ожидаемый порог)=10; word size (длина слова)=3; matrix (матрица)=BLOSOM62; gap costs (штрафы за разрыв) = Existence (существование): 11; Extention (продолжение): 1; computational adjustment (вычислительная корректировка)=Conditional compositional score matrix adjustment (условная композиционная корректировка матрицы счета); а также для Word Size (длина слова) при выравнивании нуклеотидных последовательностей: 11; Expect value (ожидаемая значимость): 10; Gap costs (штрафы за разрыв): Existence (существование) = 5, Extension (продолжение) = 2; Filter (фильтр)=low complexity activated (активирована сложность низкого уровня); Match/Mismatch Scores (счет соответствий/несоответствий): 2, -3; Filter String (строка фильтра): L; m.

Выражения функциональный вариант полипептида или функциональный вариант относятся, вопервых, к аллельным вариантам полипептида и к функциональным фрагментам полипептида, а вовторых, к модификации полипептида, причем ферментативная функция, по существу, не изменяется. Термин аллельный вариант относится к полипептиду, который возникает благодаря одной или нескольким случайно происходящим в природе мутациям нуклеотидной последовательности и способствует изменению аминокислотной последовательности, причем на его ферментативную функцию влияние не оказывается. Модификации могут представлять собой, например, C- или N-концевые слияния с полипептидами или мутированные полипептиды, причем мутации могут быть получены заменой, вставкой или удалением по меньшей мере одной аминокислоты, предпочтительно сайт-специфическим мутагенезом или случайным мутагенезом, рекомбинацией и/или любым другим биоинженерным способом. Термины замена, инсерция и делеция являются традиционными в генной инженерии и используются специалистами в данной области техники в традиционно понимаемом значении. Выражение функциональный фрагмент относится к части или к частичной последовательности полипептида или к части или к частичной последовательности его функционального варианта, причем ферментативная функция по существу сохраняется. Ферментативная функция, по существу, сохраняется тогда, когда неизмененным остается механизм ферментативной реакции, т.е. микотоксин гидролизуется благодаря одному и тому же сайту, а удельная остаточная активность функционального варианта составляет по меньшей мере 5%, преимущественно по меньшей мере 10% и предпочтительно по меньшей мере 50% в расчете на изначальный полипептид. В случае полипептидов с аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 1-15 речь идет о функциональных аллельных вариантах друг с другом или одного и того же фермента, причем последовательности соответственно происходят из различных микроорганизмов. Это ясно видно из близкого сродства друг к другу, различимым образом определяемого по процентной идентичности последовательностей, а также из того факта, что все полипептиды воздействуют на ZEN и производные соединения ZEN по одному и тому же механизму разложения.

На основе сходства между собой аминокислотных последовательностей полипептидов с SEQ ID NO: 1-15 обеспечивается возможность того, что функциональный вариант одного из этих полипептидов обладает идентичностью последовательности по меньшей мере на 40% больше, чем один из задействованных полипептидов с SEQ ID NO: 1-15.

Благодаря выбору аминокислотной последовательности такого рода или ее функционального варианта обеспечивается поразительно быстрый и полный гидролиз ZEN и/или по меньшей мере одного про

- 3 032685 изводного соединения ZEN.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности или его функциональный вариант, причем функциональный вариант участка аминокислотной последовательности имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 84%, более предпочтительно по меньшей мере 92% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% и по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности выбран из группы аминокислотных последовательностей от +24 до + 50, от +52 до +77, от +79 до +87, от +89 до +145, от +150 до + 171, от +177 до +193, от +223 до +228, от +230 до +237, от + 239 до +247, от +249 до +255, от +257 до +261, от +263 до +270, от +272 до +279, от +297 до +301, от +303 до +313, от +24 до 328, от +1 до +328 последовательности с SEQ ID NO: 1. Благодаря наличию по меньшей мере одного консервативного участка аминокислотной последовательности такого рода удается разработать полипептид, который наряду с быстрым и полным гидролизом ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN обладает также особенно высокой активностью по сравнению с известными в настоящее время полипептидами, разлагающими ZEN.

Стабильно хорошие результаты удалось достигнуть тогда, когда соответственно другому варианту осуществления настоящего изобретения функциональный вариант содержал по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, выбранную из группы замен, делеций и инсерций одной или нескольких аминокислот.

Благодаря дальнейшей разработке настоящего изобретения, так что полипептид характеризуется удельной активностью, равной по меньшей мере 0,01 ед./мг, преимущественно по меньшей мере 0,1 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 1 ед./мг, и/или константой KM гидролитического расщепления ZEN, равной не более 50 мкМ, преимущественно не более 3,5 мкМ и предпочтительно не более 0,5 мкМ, и/или константой k_cat гидролитического расщепления ZEN, равной по меньшей мере 0,05 с^-1, преимущественно по меньшей мере 0,6 с^-1 и предпочтительно по меньшей мере 5 с^-1, и/или константой v_maxгидролитического расщепления ZEN, равной по меньшей мере 0,00001 мкМ^-1ю^-1, преимущественно по меньшей мере 0,0001 мкМ^-1ю^-1 и предпочтительно по меньшей мере 0,001 мкМ^-1ю^-1, ZEN и/или производные соединения ZEN могут быть особенно быстро и полностью гидролизованы и предпочтительно детоксифицированы.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 2, 5-7, 9, 11, 12 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, а pH-зависимая стабильность полипептида при pH 5,0 составляет по меньшей мере 15%, предпочтительно 50% и особенно предпочтительно по меньшей мере 90%. Благодаря другому варианту осуществления такого рода может быть обеспечено то, что полипептид будет расщеплять или детоксифицировать зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона также и в кислой среде, такой как, например, среда, имеющаяся в желудках млекопитающих. При этом pH-зависимую стабильность полипептидов определяют как процентную остаточную активность полипептидов при pH 5,0 по отношению к активности при соответствующем оптимальном значении pH.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 5-7, 9, 11 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, а полипептид обладает наиболее высокой ферментативной активностью в температурном интервале от 30 до 75°C, предпочтительно от 38 до 55°C и особенно предпочтительно от 38 до 52°C. Благодаря другому варианту осуществления такого рода по настоящему изобретению обеспечивается то, что зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона также и при мезофильных температурах, как, в частности, в случае температуры тела человека и сельскохозяйственных животных, гидролизуется или детоксифицируется полипептидом. Температуру, при которой полипептид обладает наибольшей ферментативной активностью, определяют как значение температурного оптимума полипептида.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 1, 5, 6, 9, 11, 12 и 15, или ее функциональный вариант, причем функциональный вариант имеет по меньшей мере 40% идентичности последовательности по сравнению по меньшей мере с одной из аминокислотных последовательностей, а полипептид является термически стабильным до температуры 90°C, предпочтительно 75°C и особенно предпочтительно 60°C. Благодаря этому обеспечивается то, что полипептид и собственно его ферментативная функция остаются, по существу, неизмененными при повышенной тепловой нагрузке, которая может иметь место, например, во время транспортировки в контейнере или во время гранулирования кормов. Термическую стабильность полипептидов определяют как температуру, при которой полипептиды после 15-минутной предварительной инкубации обладают 50%

- 4 032685 ной остаточной активностью по сравнению с активностью при соответствующем значении температурного оптимума.

Полипептид может быть выбран так, чтобы он представлял собой α/β-гидролазу, которая является приемлемой для независящего от кислорода и в отсутствие кофакторов гидролитического расщепления сложноэфирной группировки зеараленона и/или производных соединений ZEN, и содержал катализирующую гидролитическое расщепление аминокислотную триаду, состоящую из серина, аминокислоты с кислой реакцией, выбранной из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и предпочтительно из аспарагиновой кислоты, а также из гистидина, и представляющую собой каталитическую триаду, например S128, D264 и H303, причем позиционирование приведено относительно SEQ ID NO: 1.

Гидролиз ZEN и производных соединений ZEN каждым из полипептидов с SEQ ID NO: 1-15 происходит по сложноэфирной группе зеараленона или его производных соединений согласно следующему механизму реакции:

Гидролиз ZEN до неядовитого гидролизованного зеараленона (HZEN) или гидролизованных производных соединений ZEN происходит благодаря полипептидам по настоящему изобретению и предпочтительно α/β-гидролазам. Последующее декарбоксилирование HZEN до декарбоксилированного гидролизованного ZEN (DHZEN) или декарбоксилированных гидролизованных производных соединений ZEN происходит, как правило, спонтанно.

В частности, посредством указанной ранее каталитической триады удается полностью гидролизовать ZEN и производные соединения ZEN, причем реакция разложения характеризуется хорошей pHзависимой стабильностью, в частности в случае значений pH в кислой области.

Неожиданно было выявлено, что с полипептидом, который на участке последовательности, состоящем из 3 аминокислот перед серином и 3 аминокислот после серина указанной ранее каталитической триады, содержит по меньшей мере одну полярную аминокислоту, выбранную из Y, Q, N, T, K, R, E, D, и по меньшей мере одну неполярную аминокислоту, выбранную из F, M, L, I, V, A, G, P, удается достигать стабильно хорошие результаты и, кроме того, улучшить по меньшей мере одну ферментативнокинетическую характеристику.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид имеет по меньшей мере одну мутацию аминокислотной последовательности относительно SEQ ID NO: 1 по меньшей мере в одной из следующих позиций: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165,

169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212,

213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262,

263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311, 314,

317, 319, 321, 323, 325 и 326. Эти позиции следуют из различий последовательности полипептида с SEQ ID NO: 1 и особенно активных полипептидов с SEQ ID NO: 2-6, имеющих с этой последовательностью высокую степень идентичности. Благодаря тому, что полипептид с SEQ ID NO: 1 изменяют по меньшей мере в одной из этих позиций так, что получают варианты аминокислот последовательностей SEQ ID NO: 2-6 в этой позиции, удается показать, что эти позиции оказывают значительное влияние на ферментативно-кинетические характеристики полипептида, при этом комбинации последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, имеющих высокую степень идентичности последовательности, ведут к более высокой активности.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид имеет в аминокислотной последовательности по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G,

Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E,

E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K,

R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P,

S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P, относительно SEQ ID NO: 1. Полипептидом такого рода удается полностью гидролизовать и предпочтительно детоксифицировать ZEN в течение короткого времени, причем удельная активность полипептида составляет по меньшей мере 6,00 ед./мг, преимущест

- 5 032685 венно по меньшей мере 7,00 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 8,00 ед./мг. Размерность ед. или также единица представляет собой меру абсолютной каталитической активности и определяется по гидролизу 1 мкмоль ZEN в минуту при 32°C в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl (pH 8,2), причем под каталитической активностью понимают ферментативное превращение субстрата в определенных условиях реакции, а под удельной активностью понимают соотношение каталитической активности и массовой концентрации полипептида (масса на единицу объема).

Благодаря тому что полипептид сформирован так, что содержится по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов с SEQ ID NO: 32-50, удается разработать полипептиды, которые имеют удельную активность по меньшей мере 7,00 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 8,00 ед./мг. Неожиданно оказалось, что, когда содержится по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов с последовательностью с SEQ ID NO: 51-58, ферментативная активность полипептида, например, по сравнению с мотивом, содержащим 7 аминокислот, еще больше повышается. Еще более высокая удельная активность достигается тогда, когда содержится по меньшей мере один из следующих аминокислотных мотивов с последовательностью с SEQ ID NO: 59-69.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид имеет по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты по меньшей мере в одной позиции, причем консервативная замена аминокислоты выбрана из замен G на A или A на G, S, или V на I, L, A, T, S, или I на V, L, M, или L на I, M, V, или M на L, I, V, или P на A, S, N, или F на Y, W, H, или Y на F, W, H, или W на Y, F, H, или R на K, E, D, или K на R, E, D, или H на Q, N, S, или D на N, E, K, R, Q, или E на Q, D, K, R, N, или S на T, A, или T на S, V, A, или C на S, T, A, или N на D, Q, H, S, или Q на E, N, H, K, R. При этом выражение консервативная замена аминокислоты относится к замене одной аминокислоты другой аминокислотой, которая рассматривается специалистами в данной области техники в качестве консервативной, то есть обладающей похожими специфическими свойствами. Такие специфические свойства представляют собой, например, размеры, полярность, гидрофобность, заряд или константа pKs аминокислоты. Под консервативной мутацией понимают, например, замену одной аминокислоты с кислой реакцией другой аминокислотой с кислой реакцией, одной аминокислоты с щелочной реакцией другой аминокислотой с щелочной реакцией или одной аминокислоты с полярным характером другой аминокислотой с полярным характером.

Консервативной заменой аминокислот такого рода удается получать функциональные варианты полипептидов, удельная активность которых по сравнению с исходным полипептидом приблизительно равна по силе, однако предпочтительно выше по меньшей мере на 0,1 ед./мг.

Настоящее изобретение направлено также на разработку изолированного полинуклеотида, с которым удается получить полипептид для быстрого и надежного гидролитического расщепления ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN.

С целью решения этой задачи настоящее изобретение отличается тем, что изолированный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, причем полипептид обладает свойством гидролизовать зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, и нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере один полипептид по любому из пп.1-11 и/или нуклеотидная последовательность имеет степень идентичности последовательности по меньшей мере с одной из последовательностей, выбранных из группы последовательностей SEQ ID NO: 16-31, причем выбранная нуклеотидная последовательность составляет по меньшей мере 40%, и/или нуклеотидная последовательность в среднежестких условиях гибридизуется по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 16-31, и/или ее частичной последовательностью по меньшей мере из 200 нуклеотидов и предпочтительно по меньшей мере из 100 нуклеотидов, и/или комплементарной цепью нуклеотидной последовательности или ее частичной последовательностью.

Сверхэкспрессирующие нуклеотидные последовательности, предпочтительно их триплеты (кодоны), изменяются, как правило, в зависимости от клетки-хозяина, так что отклонение кодона оптимизируется в зависимости от клетки-хозяина. Результат этого состоит в том, что полинуклеотиды со степенью идентичности последовательности значительно меньше 80%, а также меньше 70% или меньше 60% также могут кодировать один и тот же полипептид. Сравнение последовательностей для определения степени идентичности последовательности должно осуществляться также внутри участков последовательностей, причем участок следует понимать в качестве непрерывной последовательности опорной последовательности. Длина участков последовательностей в случае нуклеотидных последовательностей, как правило, составляет от 15 до 600.

Посредством предложенных изолированных нуклеотидных последовательностей или участков последовательностей удается генерировать зонды из нуклеиновых кислот, длина которых, как правило, составляет по меньшей мере 15, 30, или 40 нуклеотидов. Благодаря таким зондам, которые, как правило, дополнительно метят, например, посредством ³H, ³²P, ³⁵S, биотина или авидина, могут быть при применении стандартных способов идентифицированы нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды с разлагающим действием в отношении ZEN и/или производных соединений ZEN. В качестве исходного материала для идентификации таких последовательностей могут быть использованы, на

- 6 032685 пример, ДНК, РНК или кДНК отдельных микроорганизмов, геномные библиотеки ДНК или библиотеки кДНК.

Для нуклеотидных последовательностей или нуклеотидных зондов с длинами по меньшей мере в 100 нуклеотидов среднежесткие условия определяют как предгибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5-кратном буферном растворе Na-ЭДТА с добавкой NaCl (SSPE, 0,9M NaCl, 60 мМ NaH₂PO₄, 6 мМ ЭДТА), содержащем 0,3% додецилсульфата натрия (SDS), 200 мкг/мл дефрагментированной и денатурированной ДНК спермиев лосося и 35% формамида, с последующим осуществлением саузерн-блоттинга в стандартных условиях, причем материал носителя в конце промывают три раза по 15 мин 2-кратным натрийхлоридно-цитратным буферным раствором SSC, 300 мМ NaCl и 30 мМ тринатрийцитрата, 0,2% SDS) при 55°C.

Для нуклеотидных последовательностей или нуклеотидных зондов с длинами от 15 до 100 нуклеотидов среднежесткие условия определяют как предгибридизацию и гибридизацию в буферном растворе, в который входят 0,9М NaCl, 0,09M раствор Tris-HCl с pH 7,6, 6 мМ ЭДТА, 0,5% NP-40, 1-кратный раствор Денхардта, 1 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ дигидрофосфата натрия, 0,1 мМ АТФ и 0,2 мг/мл РНК дрожжей, причем предгибридизацию и гибридизацию осуществляют при температуре ниже расчетной температуры плавления (Tm) на значение от 5 до 10°C, причем Tm определяют расчетом по Bolton и McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390). Затем осуществляют саузерн-блоттинг в стандартных условиях (J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). Материал носителя в конце промывают один раз в течение 15 мин 6-кратным буферным раствором SCC, содержащим 0,1% SDS, и два раза по 15 мин 6-кратным буферным раствором SSC соответственно при температуре ниже расчетной Tm на значение от 5 до 10°C.

Настоящее изобретение направлено также на разработку добавки, с которой достигается быстрое и надежное гидролитическое расщепление ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN в определенной или сложной матрице, такой как, например, корма или пищевые продукты.

С целью решения этой задачи разработана добавка, гидролитически расщепляющая зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, причем добавка содержит по меньшей мере один полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-15, или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%, и при необходимости содержит вспомогательные вещества.

С добавкой такого рода достигается биохимическое превращение ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN в гидролизованный ZEN и/или гидролизованное производное соединение ZEN. Эта добавка может быть использована также, например, для стереоселективного гидролиза ZEN и/или производных соединений ZEN в промышленном масштабе.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения добавка сформирована так, что вспомогательные вещества выбирают по меньшей мере из одного инертного носителя, а также при необходимости из других компонентов, таких как витамины и/или минеральные вещества, и/или ферменты, и/или другие компоненты для детоксификации микотоксинов. Благодаря применению добавки такого рода, например, в кормах или пищевых продуктах может быть обеспечено то, что содержащееся при некоторых условиях количество ZEN и/или производных соединений ZEN безопасно гидролизуется и предпочтительно детоксифицируется так, что вредное действие на организм субъекта, употребляющего этот корм или пищевой продукт, не оказывается.

При этом полипептид по настоящему изобретению может находиться также в ферментной композиции, которая наряду по меньшей мере с одним полипептидом по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один фермент, который, например, участвует в разложении протеинов, такой как, например, протеазы, или участвует в метаболизме крахмала или волокон, или жиров, или гликогена, такой как, например, амилаза, целлюлаза или глюканаза, а также, например, гидролазы, липолитические ферменты, маннозидазы, оксидазы, оксидоредуктазы, фитазы, ксиланазы и/или их комбинации.

Другие аспекты применения настоящего изобретения относятся к ферментным композициям, которые наряду по меньшей мере с одним полипептидом по настоящему изобретению дополнительно содержат по меньшей мере один компонент для детоксификации микотоксинов, такой как разлагающий микотоксины фермент, такой как, например, афлатоксиноксидаза, эрготамингидролазы, эрготаминамидазы, зеараленонэстеразы, зеараленонлактоназы, охратоксинамидазы, фумонизинкарбоксилэстеразы, фумонизинаминотрансферазы, аминополиоламинооксидазы, дезоксиниваленолэпоксидгидролазы, и/или содержат по меньшей мере один разлагающий микотоксины микроорганизм, такой как Bacillus subtilis, и/или по меньшей мере один связывающий микотоксины компонент, например бактериальные клеточные стенки или неорганические материалы, такие как бентонит.

Согласно особенно предпочтительному другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид содержится в добавке в концентрации не более 10000 ед./г, предпочтительно не более 1000 ед./г, более предпочтительно не более 100 ед./г и наиболее предпочтительно не более 10 ед./г, благодаря

- 7 032685 чему удается ZEN и/или производные соединения ZEN быстро и, в частности, уже перед их резорбцией в теле субъекта, употребляющего загрязненный корм или пищевой продукт, предпочтительно млекопитающего, превращать в нетоксичные или малотоксичные метаболиты, предпочтительно в HZEN и DHZEN.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения полипептид находится в капсулированной или покрытой форме, причем для капсулирования или покрывания могут быть использованы стандартные способы, такие как, например, способы, описанные в WO 92/12645. Благодаря капсулированию или покрыванию удается транспортировать полипептид без изменения, в частности без разложения и повреждения, к месту его применения, так что только после растворения защитной оболочки, например, в пищеварительном тракте животных полипептид начинает действовать, вследствие чего может быть достигнуто еще более целенаправленное, быстрое и полное разложение ZEN и/или производных соединений ZEN также и в кислых, обогащенных протеазой и анаэробных средах. При этом благодаря капсулированию или покрыванию удается повысить также термическую стабильность полипептидов в добавке.

Настоящее изобретение относится также к применению добавки для гидролитического расщепления зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона в кормах предпочтительно для свиней, домашней птицы и аквакультуры, в пищевых продуктах или в высушенной барде. Благодаря применению добавки по настоящему изобретению удается гидролизовать или детоксифицировать ZEN и/или производные соединения ZEN, содержащиеся в пищевом продукте или в корме, или в высушенной барде, причем детоксикация такого рода достигается уже при концентрации полипептидов около 1 ед./г загрязненного корма или пищевого продукта.

Настоящее изобретение направлено также на разработку способа, с которым удается обеспечить быстрое и надежное гидролитическое расщепление ZEN и/или по меньшей мере одного производного соединения ZEN.

С целью решения этой задачи способ осуществляют так, что зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона гидролизуют полипептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-15, или ее функциональным вариантом, причем идентичность последовательности между функциональным вариантом и по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 40%.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения способ осуществляют так, что полипептид используют в одной из добавок по настоящему изобретению.

Согласно другому предпочтительному варианту способ осуществляют так, что полипептид или добавку прибавляют к корму или пищевому продукту, загрязненному зеараленоном и/или по меньшей мере одним производным соединением зеараленона, так что загрязненный корм или пищевой продукт приводится в контакт с влагой, а полипептид или добавка гидролизуют зеараленон и/или по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, содержащиеся в загрязненном корме или пищевом продукте. В случае влажных кормов или пищевых продуктов, таких как пульпы или кашицы, гидролиз зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона будет происходить во влажном корме или пищевом продукте перед оральным приемом. Благодаря такому способу может быть обеспечено то, что вредящее действие зеараленона и производных соединений зеараленона на человека и животное устраняется в значительной степени. При этом в качестве влаги понимают присутствие воды или водосодержащих жидкостей, причем в их число входят также, например, слюна или другие жидкости, имеющиеся в пищеварительном тракте. В качестве пищеварительного тракта понимают полость рта, глотку (зев), пищевод и желудочно-кишечный тракт или их эквиваленты, причем в случае животных могут использоваться разные термины или в пищеварительном тракте животных могут отсутствовать отдельные компоненты.

Способ по настоящему изобретению может быть осуществлен также в варианте, когда корм или пищевой продукт гранулируют перед оральным приемом.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения способ осуществляют так, что гидролизуется по меньшей мере 70%, преимущественно по меньшей мере 80% и предпочтительно по меньшей мере 90% зеараленона и/или по меньшей мере одного производного соединения зеараленона. Благодаря этому может быть предотвращено подострое и/или начальное хроническое токсическое действие, такое как, например, тератогенное, карциногенное, эстрогенное и иммуносупрессивное действие у животных или людей.

В последующем описании настоящее изобретение более подробно поясняется примерами осуществления и фигурами. На фигурах показано на фиг. 1 показаны зависимости от времени степени разложения ZEN и увеличения количества метаболитов HZEN и DHZEN в случае полипептида с SEQ ID NO: 1, причем на фиг. 1A полипептид не имеет метки, на фиг. 1B полипептид имеет C-концевую метку 6His, а на фиг. 1C имеет N-концевую метку 6His;

на фиг. 2 - кинетика согласно уравнению Михаэлиса-Ментен в случае полипептида с SEQ ID NO: I;

на фиг. 3 - зависимости от времени степени разложения ZEN и увеличения количества метаболитов

- 8 032685

HZEN и DHZEN в случае очищенных полипептидов с SEQ ID NO: 1 (фиг. 3A), 2 (фиг. 3B), (фиг. 3C), 6 (фиг. 3D), 7 (фиг. 3E), 9 (фиг. 3F), (фиг. 3G), (фиг. 3H) и 15 (фиг. 3I), причем все последовательности имеют C-концевую метку 6His.

Пример 1. Модификация, клонирование и экспрессия полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые могут гидролитически расщеплять ZEN и/или по меньшей мере одно производное соединение ZEN.

Замены, инсерции или делеции аминокислот осуществляли мутацией нуклеотидных последовательностей посредством ПЦР с применением набора Quick-change Site-directed Mutagenesis Kits (компания Stratagene) согласно инструкции. Альтернативно этому были использованы также полные нуклеотидные последовательности (компания GeneArt). Нуклеотидные последовательности, генерированные с использованием набора для мутагенеза посредством ПЦР или полученные от компании GeneArt, необязательно дополнительно имели на аминокислотном уровне C- или N-концевую метку 6His и стандартными способами были интегрированы в экспрессирующие векторы для экспрессии в E.coli или P.pastoris, трансформированы в E.coli или P.pastoris, а также экспрессированы в E.coli или P.pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, second Edition, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor), причем для этой задачи может быть использована также любая другая приемлемая клетка-хозяин.

Термин экспрессирующий вектор относится к конструкции ДНК, которая в состоянии экспрессировать ген in vivo или in vitro. В частности, под конструкциями ДНК понимают также конструкции, которые являются приемлемыми для переноса нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в клетку-хозяин, чтобы там быть интегрированной в геном или свободно находиться в экстрахромосомальном пространстве и внутриклеточно экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, и при необходимости для вывода полипептида из клетки.

Термин клетка-хозяин относится ко всем клеткам, которые содержат сверхэкспрессирующую нуклеотидную последовательность или экспрессирующий вектор и могут продуцировать полипептид по настоящему изобретению. В частности, под прокариотическими и/или эукариотическими клетками предпочтительно понимают P.pastoris, E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, клетки растений и/или споры Bacillus, Trichoderma или Aspergillus.

Для определения каталитических свойств полипептидов использовали растворимый клеточный лизат в случае E.coli или надосадочную жидкость культуры в случае P.pastoris. Для определения констант KM, vmax, kcat и удельной активности полипептиды селективно концентрировали стандартными способами в хроматографических колонках с насадкой из никельсефарозы. Определение концентрации белка осуществляли стандартными способами, например способом BCA (Pierce BCA Protein Assay KitProd # 23225), однако предпочтительно определяли фотометрически с удельными коэффициентами поглощения для соответствующих белков, рассчитываемыми по программе ProtParam, доступной для использования по интернет-адресу http://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, p. 571-607).

Пример 2. Определение идентичности последовательности и консервативных участков аминокислотной последовательности.

Определение процентной идентичности последовательности по всей длине полипептидов с аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 1-15 относительно друг друга (табл. 1) осуществляли по программе BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (программа поиска основных локальных выравниваний)) и предпочтительно по программе BLASTP, которыми можно воспользоваться на интернетстранице National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Таким образом, две или несколько последовательностей можно сравнивать друг с другом по алгоритму Altschul et al. (1997, Nucleic. Acids. Res., (1997) 25:3389-3402). В качестве программных установок были приняты базовые установки и предпочтительно: max target sequence (максимальное число целевых последовательностей)=100; expected threshold (ожидаемый порог)=10; word size (длина слова)=3; matrix (матрица)=BLOSOM62; gap costs (штрафы за разрыв)=Existence (существование): 11; Extention (продолжение): 1; computational adjustment (вычислительная корректировка)=Conditional compositional score matrix adjustment (условная композиционная корректировка матрицы счета).

Для определения консервативных участков аминокислотных последовательностей полипептиды с SEQ ID NO: 1-6, имеющими идентичность последовательности по меньшей мере 70% по сравнению друг с другом, сравнивали посредством компьютерной программы COBALT (J.S. Papadopoulos und R. Agarwala, 2007, COBALT: constraint-based alignment tool for multiple protein sequences, Bioinformatics 23:107379) с использованием стандартных параметров и предпочтительно следующих параметров: (Gap penalties (штрафы за разрыв): -11, -1; End-Gap Penalties (штрафы за окончание разрыва): -5, -1; Use RPS BLAST (использование RPS BLAST): on (включено); Blast E-value (ожидаемая значимость): 0,003; Find Conserved columns and Recompute (нахождение консервативных столбцов и перерасчет): on (включено); use query Clusters (использование запроса кластеров): on (включено); word size (длина слова): 4; max Cluster distance (максимальное расстояние между кластерами): 0,8; Alphabet (алфавит): regular

- 9 032685 (нормальный); Homology conversation setting (задание связи гомологии): 3 bits (3 бита)). Результат этого анализа характеризует консервативные аминокислоты. В качестве консервативных участков аминокислотных последовательностей были определены следующие области, состоящие по меньшей мере из 5 следующих друг за другом консервативных аминокислот, а именно участки по сравнению с последовательностью с SEQ ID NO: 1: A - с позиции + 24 до позиции +50, B - с позиции +52 до позиции +77, C - с позиции +79 до позиции +87, D - с позиции +89 до позиции +145, Е - с позиции + 150 до позиции +171, F - с позиции +177 до позиции +193, G - с позиции +223 до позиции +228, H - с позиции +230 до позиции +237, I - с позиции +239 до позиции +247, J - с позиции +249 до позиции +255, K - с позиции +257 до позиции +261, L - с позиции +263 до позиции +270, M - с позиции +272 до позиции +279, N - с позиции +297 до позиции +301 и O - с позиции +303 до позиции +313.

Определение процентной идентичности последовательностей полипептидов по сравнению друг с другом, а также консервативных участков аминокислотных последовательностей отдельных полипептидов относительно консервативных участков аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 осуществляли соответственно описанному ранее. Результаты представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1 Процентная идентичность последовательностей полипептидов по сравнению друг с другом

	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 1		70%	71%	71%	71%	71%	64%
SEQ ID NO: 2	70%		81%	83%	81%	83%	63%
SEQ ID NO: 3	71%	81%		95%	99%	92%	60%
SEQ ID NO: 4	71%	83%	95%		95%	95%	60%
SEQ ID NO: 5	71%	81%	99%	95%		93%	60%
SEQ ID NO: 6	71%	83%	92%	95%	93%		61%
SEQ ID NO: 7	64%	63%	60%	60%	60%	61%
SEQ ID NO: 8	57%	54%	54%	53%	53%	53%	53%
SEQ ID NO: 9	50%	50%	53%	53%	53%	55%	51%
SEQ ID NO: 10	55%	52%	55%	54%	55%	53%	52%
SEQ ID NO: 11	53%	51%	53%	51%	51%	52%	54%
SEQ ID NO: 12	50%	49%	50%	50%	50%	49%	51%
SEQ ID NO: 13	55%	49%	51%	51%	51%	52%	54%
SEQ ID NO: 14	73%	65%	69%	70%	69%	68%	80%
SEQ ID NO: 15	79%	68%	71%	71%	71%	72%	63%

- 10 032685

	SEQ ID NO: 8	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 10	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 13	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 1	57%	50%	55%	53%	50%	55%	73%	79%
SEQ ID NO: 2	54%	50%	52%	51%	49%	49%	65%	68%
SEQ ID NO: 3	54%	53%	55%	53%	50%	51%	69%	71%
SEQ ID NO: 4	53%	53%	54%	51%	50%	51%	70%	71%
SEQ ID NO: 5	53%	53%	55%	51%	50%	51%	69%	71%
SEQ ID NO: 6	53%	55%	53%	52%	49%	52%	68%	72%
SEQ ID NO: 7	53%	51%	52%	54%	51%	54%	80%	63%
SEQ ID NO: 8		50%	49%	51%	49%	48%	83%	51%
SEQ ID NO: 9	50%		51%	52%	69%	51%	67%	51%
SEQ ID NO: 10	49%	51%		76%	52%	52%	63%	56%
SEQ ID NO: 11	41%	50%	76%		52%	51%	58%	52%
SEQ ID NO: 12	49%	52%	52%	52%		49%	71%	51%
SEQ ID NO: 13	48%	51%	52%	51%	49%		54%	53%
SEQ ID NO: 14	83%	67%	63%	58%	71%	55%		72%
SEQ ID NO: 15	51%	51%	56%	52%	51%	53%	72%

- 11 032685

Таблица 2

Процентная идентичность последовательностей консервативных участков аминокислотных последовательностей от A до O

	Идентичность последовательности относительнс	> SEQ ID
NO:	: 1
Полипептид	Участок A	Участок В	Участок С	Участок D	Участок Е	Участок F
SEQ	ID	NO:	1	100%	100%	100%	100%	100%	100
SEQ	ID	NO:	2	59, 6%	76,9%	88,9%	87,7%	77,3%	76,5
SEQ	ID	NO:	3	63,0%	76,9%	77,8%	89,5%	86, 4%	76,5
SEQ	ID	NO:	4	63,0%	80,8%	77,8%	91,2%	86, 4%	76,5
SEQ	ID	NO:	5	63,0%	76,9%	77,8%	87,7%	86, 4%	76,5
SEQ	ID	NO:	6	63,0%	80,8%	77,8%	91,2%	86, 4%	76,5
SEQ	ID	NO:	7	44,7%	69,2%	77,8%	78,9%	68,2%	64,7
SEQ	ID	NO:	8	40,7%	50,0%	66,7%	82,5%	59, 1%	64,7
SEQ	ID	NO:	9	51,9%	57,7%	55,6%	73,7%	45,5%	58,8
SEQ	ID	NO:	10	44,4%	61,5%	77,8%	75,4%	47,8%	76,5
SEQ	ID	NO:	11	44,4%	50,0%	66,7%	71,9%	43,5%	58,8
SEQ	ID	NO:	12	51,9%	53,8%	55,6%	71,9%	50, 0%	58,8
SEQ	ID	NO:	13	18,5%	61,5%	55,6%	77,2%	54,5%	52,9
SEQ	ID	NO:	14	55,6%	69,2%	77,8%	84,2%	54,5%	52,9
SEQ	ID	NO:	15	74,1%	86,7%	88,9%	89,0%	77,3%	88,2

	Идентичность последовательности относительнс	) SEQ ID
NO:	: 1
Полипептид	Участок	Участок	Участок	Участок	Участок	Участок
				G	Η	I	J	К	L
SEQ	ID	NO:	1	100%	100%	100%	100%	100%	100%
SEQ	ID	NO:	2	100%	87,5%	66, 7%	85,7%	80,0%	75,0%
SEQ	ID	NO:	3	100%	87,5%	77,8%	57,1%	80,0%	75,0%
SEQ	ID	NO:	4	100%	87,5%	77,8%	57,1%	80,0%	75,0%
SEQ	ID	NO:	5	100%	87,5%	77,8%	57,1%	80,0%	75,0%
SEQ	ID	NO:	6	100%	75,0%	77,8%	85,7%	80,0%	87,5%
SEQ	ID	NO:	7	100%	87,5%	66, 7%	71, 4%	100%	50,0%
SEQ	ID	NO:	8	100%	62,5%	44,4%	57,1%	80,0%	62,5%
SEQ	ID	NO:	9	100%	12,5%	44,4%	42, 9%	60,0%	62,5%

SEQ ID NO: 10	100%	62,5%	55,6%	71, 4%	80,0%	50,0%
SEQ ID NO: 11	100%	50, 0%	55, 6%	57,1%	80,0%	50,0%
SEQ ID NO: 12	100%	12,5%	22,2%	57,1%	80,0%	52,5%
SEQ ID NO: 13	100%	50, 0%	44, 4%	57,1%	80,0%	75,0%
SEQ ID NO: 14	0%	8,3%	0%	14,3%	0%	25,0%
SEQ ID NO: 15	100%	87,5%	100%	85,7%	100%	75,0%

- 12 032685

	Идентичность последовательности относительно SEQ ID NO: 1
Полипептид	Участок M	Участок N	Участок О
SEQ ID NO: 1	100%	100%	100%
SEQ ID NO: 2	87,5%	80, 0%	81, 8%
SEQ ID NO: 3	87, 0%	80, 0%	81, 8%
SEQ ID NO: 4	87,5%	80, 0%	81, 8%
SEQ ID NO: 5	87,5%	80, 0%	81, 8%
SEQ ID NO: 6	87,5%	80, 0%	72,7%
SEQ ID NO: 7	75, 0%	40, 0%	36, 4%
SEQ ID NO: 8	75, 0%	60, 0%	54,5%
SEQ ID NO: 9	62,5%	40, 0%	54,5%
SEQ ID NO: 10	62,5%	40, 0%	54,5%
SEQ ID NO: 11	75, 0%	40, 0%	54,5%
SEQ ID NO: 12	100%	40, 0%	54,5%
SEQ ID NO: 13	50, 0%	40, 0%	63, 6%
SEQ ID NO: 14	6, 2%	0%	0%
SEQ ID NO: 15	87,5%	80, 0%	63, 6%

Пример 3. Гидролиз ZEN полипептидами в клеточных лизатах.

Для определения способности расщеплять ZEN в нетоксичные или малотоксичные метаболиты HZEN и DHZEN был получен полипептид с SEQ ID NO: 1, кодированный нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 17, в качестве таковой, и с C-или N-концевой меткой 6His в E.coli, как описано в примере 1. Полипептиды с аминокислотными последовательностями с SEQ ID NO: 2-15, которые были кодированы нуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 18-31, были помечены меткой 6His только на C-концевом участке. 100 мл раствора культуры E.coli с оптической плотностью 2,0-2,5 (OD при 600 нм) разделяли центрифугированием при 4°C и ресуспендировали в 20 мл минеральной среды Бруннера (DSMZ microorganisms medium number 462, 2012). Клеточные суспензии после 3-кратной обработки во французском прессе при 20000 футах на кв. дюйм подвергали лизису. Полученные таким образом клеточные лизаты применяли с разбавлениями 1:10, 1:100 или 1:1000, которые получали с минеральной средой Бруннера, содержащей 0,1 мг/мл BSA (альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота). Для опытов по разложению ZEN к 9,9 мл минеральной среды Бруннера, содержащей 0,1 мг/мл BSA, прибавляли 0,1 мл разбавленного клеточного лизата и 31 мкл исходного раствора субстрата ZEN. Таким образом, в итоге клеточные лизаты разбавляли с соотношением 1:1000, 1:10000 или 1:100000. В качестве исходного раствора субстрата ZEN использовали 2,08 мМ раствор ZEN (40 об.% ACN + 60 об.% H₂O). Для получения этого раствора соответственно взвешивали и растворяли ZEN в кристаллической форме (стандарт биочистоты, компания Romer Labs, артикул № 001109, чистота не менее 98%). Расщепляемые смеси переносили в склянки вместимостью 25 мл и инкубировали при 25°C при встряхивании с частотой 100 об/мин в течение 120 ч. В моменты времени 0, 0,5, 1, 2, 5, 24, 47, 72 и 120 ч соответственно отбирали пробы объемом 1 мл, полипептиды инактивировали нагреванием в течение 10 мин при 99°C и хранили при -20°C. После размораживания проб нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием. ZEN, HZEN и DHZEN анализировали способом ЖХ-МС-МС. С этой целью метаболиты хроматографически разделяли посредством колонки Phenomenex Luna C18(2) с размерами 250x3 мм и с частицами крупностью 5 мкм. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил-вода с концентрацией муравьиной кислоты 1 мл/л. УФ-сигнал регистрировали при 270 нм. В качестве средства ионизации использовали ионизацию электрораспылением (ИЭР). ZEN, HZEN и DHZEN количественно определяют посредством Qtrap-ЖХ-МС-МС (жидкостной хромато-масс-спектрометр с тройным квадруполем, компания Applied Biosystems) в расширенном режиме. Не позже чем через 24 ч ни в одной из смесей невозможно было уже обнаружить существенное количество ZEN. Преобладающая часть, более 80%, ZEN была превращена в HZEN или DHZEN.

На фиг. 1 можно видеть зависимость от времени степени разложения ZEN и увеличения количества HZEN, а также DHZEN на примере разбавленного с соотношением 1:10000 раствора клеточного лизата в случае полипептида с SEQ ID NO: 1 как без метки (фиг. 1A), так и с C-концевой меткой 6His (фиг. 1B) и

- 13 032685

N-концевой меткой 6His (фиг. 1C). Из этого ясно следует, что, во-первых, превращение ZEN происходит непосредственно и полностью, так как уже в первых пробах (0 ч), которые были отобраны непосредственно после начала опыта, почти невозможно было больше детектировать ZEN, и, во-вторых, вследствие присоединение C- или N-концевой метки не происходило существенной потери активности.

Пример 4. Гидролиз производных соединений ZEN полипептидами в клеточных лизатах.

Для определения способности полипептидов наряду с ZEN превращать в нетоксичные или малотоксичные метаболиты также и производные соединения ZEN получали полипептиды с SEQ ID NO: 1-15 с C-концевыми метками His, как и описанные в примере 3, а в качестве клеточных лизатов при разложении использовали соответствующие синтетические нуклеотидные последовательности с SEQ ID NO: 17-31.

Опыты по разложению осуществляли согласно описанию примера 3, причем каждый полипептид был испытан с каждым из производных соединений ZEN, выбранных из группы α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, βZAL, Z14G, Z14S и ZAN. Клеточные лизаты применяли с общим разбавлением 1:10000. В качестве исходного раствора субстрата вместо 2,08 мМ раствора ZEN (40 об.% ACN + 60 об.% H₂O) применяли эквимолярные, т.е. 2,08 мМ растворы производных соединений ZEN. α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL и ZAN были получены от компании Sigma и применялись в качестве стандарта для анализа. Z14G и Z14S с чистотой по меньшей мере 90% были получены способами, описанными P. Krenn et al. (2007, Mykotoxin Research, 23, 4, 180-184) и M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523), и применялись в качестве стандарта для анализа. Другое отличие от примера 3 состояло в том, что отбирали только одну пробу и при этом через 24 ч. Уменьшение концентрации производных соединений ZEN в течение опыта по разложению количественно определяли способом ЖХ-МС-МС. α-ZEL, β-ZEL, Z14G и Z14S определяли способом M. Sulyok et al. (2010, Food Chemistry, 119, 408-416). α-ZAL, β-ZAL и ZAN определяли способом P. Songsermaskul et al. (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). Неожиданно было выявлено, что во всех опытах по разложению через 24 ч инкубации в наличии оставалось только от 0 до максимально 13% исходного количества производных соединений ZEN.

Пример 5. Удельная активность и ферментативно-кинетические характеристики полипептидов и их вариантов.

Определение удельной активности полипептидов и их вариантов осуществляли фотометрически, причем у всех примененных полипептидов была C-концевая метка 6His. Получение, обогащение и очистку полипептидов или их вариантов осуществляли соответственно описанию примера 1. Разложение ZEN до HZEN определяли по уменьшению поглощения при длине волны 315 нм. Молярные коэффициенты поглощения [ε] ZEN и HZEN были определены экспериментально и составили 0,0078895 и 0,0030857 л^мкмоль^-1юм^-1. Коэффициенты поглощения сильно зависят от значений pH, поэтому определение активности следует осуществлять всегда точно при таком же значении pH и предпочтительно в такой же матрице. Измерения осуществляли в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl с pH 8,2 в кварцевых кюветах в диапазоне длин волн от 200 до 2500 нм фотометром для видимой и ультрафиолетовой областей (Hitachi U-2001) при 32°C.

В качестве исходного раствора субстрата ZEN использовали 2,08 мМ раствор ZEN (40 об.% ACN + 60 об.% H₂O). Для получения этого раствора соответственно взвешивали и растворяли ZEN в кристаллической форме (стандарт биочистоты, компания Romer Labs, артикул № 001109, чистота не менее 98%). Получали разбавления субстрата ZEN (0,79, 1,57, 2,36, 3,14, 4,71, 6,28, 7,85, 9,42, 10,99, 12,56, 14,13, 15,71, 17,28, 18,85 мкМ) с 50 мМ раствором Tris-HCl с pH 8,2. Растворы полипептидов разбавляли 50 мМ буферным раствором Tris-HCl с pH 8,2 до конечной концентрации около 70 нг/мл. Разбавления субстрата ZEN подогревали на водяной бане до 32°C.

К 100 мкл соответствующего разбавления субстрата ZEN прибавляли 0,2 мкл раствора полипептида и через 5 мин определяли поглощение, причем для любой комбинации раствор полипептида - разбавление субстрата ZEN осуществляли по меньшей мере двухкратное определение.

С учетом коэффициентов поглощения ZEN и HZEN по повышению поглощения во времени рассчитывали скорость реакции для каждой концентрации субстрата.

Термины константа K_M или константа Михаэлиса-Ментен относятся к параметру для описания ферментативного сродства, выражаемому в [мкМ] или [мМ] и рассчитываемому посредством линеаризации по Хейнсу согласно H. Bisswang (2002, Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, Seite 19), причем для этого предпочтительно используют функцию Enzymkinetik, Single Substrat (кинетика ферментации, простой субстрат) программы SigmaPlot 12.0. Термины каталитическая постоянная ферментативной реакции или константа ke_at относятся к параметру для описания скорости превращения полипептида или фермента, выражаемому в [с^-1] и предпочтительно рассчитываемому посредством функции Enzymkinetik, Single Substrat программы SigmaPlot 12.0. Параметр максимальная скорость ферментативной реакции или константа v_max выражают в [мкМ/с] или [мМ/с] и определяют аналогично константе K_Mпосредством линеаризации по Хейнсу, причем для этого предпочтительно используют функцию Enzymkinetik, Single Substrat программы SigmaPlot 12.0.

Используя значения v_max и применяемой концентрации фермента, удельную активность рассчитывали по формуле

- 14 032685

Vmax [мкм/с] X 60 [с/мин]

Удельная активность [U/мг] =----------------------------концентрация фермента [мг/л] причем за единицу принимают гидролиз 1 мкмоль ZEN в минуту при 32°C в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl с pH 8,2.

Далее приведены исходные данные для определения характеристик ферментативной реакции K_M, v_max, k_cat, а также удельной активности на примере полипептида с SEQ ID NO: 1. В табл. 3 приведены значения скорости реакции при соответствующих концентрациях субстрата ZEN, для которых на фиг. 2 представлены соответствующие графики Михаэлиса-Ментен, а в табл. 4 приведены соответствующие ферментативно-кинетические характеристики. Концентрация применяемого раствора фермента составляла 68 нг/л.

Таблица 3

Скорости реакции полипептида с SEQ ID NO: 1 при различных концентрациях ZEN

Разбавление субстрата ZEN, мкМ	1-е измерение скорости реакции, мкМ/с	2-е измерение скорости реакции, мкМ/с
0, 79	0,0073	0,0071
1,57	0,0087	0,0082
2,36	0,0095	0,0080
3, 14	0,0101	0,0073
4,71	0,0103	0,0087
6,28	0,0096	0,0088
7,85	0,0084	0,0088
9, 42	0,0111	0,0087
10, 99	0,0093	0,0081
12,56	0,0100	0,0086
14,13	0,0089	0,0101

15, 71	0,0089	0,0090
17,28	0,0100	0,0074
18, 85	0,0100	0,0085

Таблица 4

Ферментативно-кинетические характеристики полипептида с SEQ ID NO: 1

	v_max, мкМ/с	К_м, мкМ	kcat, С’¹	Удельная активность, ед/мг
Измерение	1	2	1	2	1	2	1	2
Значение	0,00993	0,008756	0,2172	0,1898	5,44	4,79	8,76	7,73
Среднее значение	0,009343	0,2035	5,12	8,25

Значения удельной активности исследованных полипептидов составили 8,25 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 1, 10,56 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 2, 8,36 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 3, 8,33 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 4, 8,56 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 5, 9,95 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 6, 3,83 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 7, 2,57 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 8, 4,87 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 9, 5,12 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 10, 13,88 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 11, 2,78 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 12, 6,43 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 13, 3,33 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 14 и 7,76 ед./мг для последовательности SEQ ID NO: 15.

Значения удельной активности исследованных вариантов полипептидов приведены в табл. 5 и 6.

- 15 032685

Таблица 5 Удельная активность функциональных вариантов полипептида с SEQ ID NO: 1, консервативные участки аминокислотных последовательностей с одной или несколькими мутациями и идентичность последовательностей функциональных вариантов с исходной последовательностью с SEQ ID NO: 1

№	Мутации	Мутации в области	Идентичность по сравнению с SEQ ID NO: 1	Удельная активность, ед/мг
ZH1-A- 001	N25D	А	99, 7%	8,10
ZH1-A- 002	F27Y	А	99, 7%	7,93
ZH1-A- 003	F27H	А	99, 7%	7,78
ZH1-A- 004	R35K	А	99, 7%	8,98
ZH1-A- 005	R35Q	А	99, 7%	8,56
ZH1-A- 006	N25D/S29P/V42I/V43T	А	98,8%	7,84
ZH1-A- 007	126V/R31A/F32Y/F46Y	А	98,8%	8,61
ZH1-A- S02	N25D/I26V/F27Y/S29Р/ R31A/F32Y/R35K/V37A/ V42I/V43T/F46Y	А	96, 6%	8,73
ZH1-A- S03	N25D/I26V/F27H/S29P/ R31A/F32Y/R35Q/V42I/ V43T/F46Y	А	97,0%	8,52
ZH1-B- 001	D53G	В	99, 7%	8,10
ZH1-B- 002	N5 4M	В	99, 7%	8,41
ZH1-B- 003	N54R	В	99, 7%	8,33
ZH1-B- 004	S69G	В	99, 7%	8,06

- 16 032685

ZHl-B- 005	P72E	В	99, 7%	8, 65
ZH1-B- 006	P72R	В	99, 7%	8,78
ZH1-B- S02	N54M/L57V/L60I/S69G/ P72E/V73A	В	98,2%	8,51
ZH1-B- S03	D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A	В	98,2%	8,56
ZH1-B- S04	N54R/L57V/L60I/P72E/ V7 3A	В	98,5%	8, 96
ZH1-B- S14	N54R/L58V/L59P/L60V/ T64G/P72R/G75P/L77P	В	97, 6%	8, 68
ZH1-C- 001	N80H	С	99, 7%	8,24
ZH1-C- 002	N80D	С	99, 7%	8, 48
ZH1-C- 003	F84Y	С	99, 7%	8, 65
ZH1-C- S06	N80H/F84Y	С	9 9,4%	8,8 8
ZH1-C- S10	N80H/F84H	С	99,4%	8,32
ZH1-C- S14	E79R/N80D	С	99,4%	8, 45
ZH1-D- 001	T95S	D	99, 7%	8,53
ZH1-D- 002	R99K	D	99, 7%	8,25
ZH1-D- 003	V123I	D	99, 7%	8,17
ZH1-D- 004	A125G	D	99, 7%	8,36
ZH1-D- 005	G126A	D	99, 7%	8, 41
ZH1-D- 006	G130A	D	99, 7%	8, 69
ZH1-D- 007	G130V	D	99, 7%	8,54

- 17 032685

ZHl-D- 008	G131A	D	99, 7%	8,71
ZH1-D- 009	N127D	D	99, 7%	8,29
ZH1-D- 010	N127Q	D	99, 7%	8,34
ZH1-D- 011	A141S	D	99, 7%	8, 67
ZH1-D- 012	F106W	D	99, 7%	7,84
ZH1-D- 013	I118V	D	99, 7%	8,37
ZH1-D- 014	I118V/V123L	D	99,4%	8,55
ZH1-D- 015	I118V/K119R/L132V	D	99,1%	8, 86
ZH1-D- 016	W96Q/F106W/L116G/ V122A	D	98,8%	8, 65
ZH1-D- 017	Q91R/N105D/K119G/A141 S/M142K	D	98,5%	8, 46
ZH1-D- S02	T95S/T97A/R99K/I118V/ V123I/L132V/A141S	D	97,7%	8, 66
ZH1-D- S03	T95S/R99K/I118V/ K119R/L132V/A141S	D	98,2%	9, 32
ZH1-D- S04	T95S/R99K/I118V/ L132V/A141S	D	98,5%	9, 15
ZH1-D- S05	T95S/R99K/I114M/ I118V/K119R/L132V/ A141S	D	97,7%	8, 84
ZH1-D- S07	R99G/A115D/K119G/ P121T/V123I/A125S/ L132V/L133V/S138A/ Y140F/A141S/M142L	D	96, 3%	8,79
ZH1-D- S08	R93K/W96Q/R99G/D104N/ N105L/F106M/A115S/ V123I/A125S/G144N	D	97,0%	8, 86

- 18 032685

ZHl-D- S09	R99G/S102N/D104N/N105 T/F106W/L110V/V111E/ A115D/K119G/V122T/ V123L/L132V/L133I/ S138A/M142K	D	95,4%	8, 99
ZH1-D- S10	W96R/S102T/F1061/I114 L/A115S/L116G/K119G/ V122A/V123F/A125S/ A134S/Y140F/M142E	D	96, 0%	9, 12
ZH1-D- Sll	W96R/R99G/S102T/ F106V/I114L/A115D/ L116G/K119G/V122A/ V123F/A125S/N127L/ L133A/A134S/Y140F/ M142K	D	95,1%	8,54
ZH1-D- S12	S94T/R99G/S102T/ N105I/L110V/A115D/ K119G/P121E/V122T/ V123L/V124I/L133I/ A134G/S138A/Y14OF/ M142K	D	95,1%	8, 69
ZH1-D- S13	R93Q/R99G/N105T/ R112K/A115D/L116I/ A125S/N127L/L132V/ L133V/A134S/Y140F/ M142K	D	96, 0%	8, 47
ZH1-D- S14	Q91R/W96R/N105D/ I114L/I118V/K119R/ V122A/L132V/L137S	D	97,3%	8,55
ZH1-E- 001	Y165C	E	99, 7%	8, 46
ZH1-E- 002	Y165H	E	99, 7%	8,33
ZH1-E- 003	P163T	E	99, 7%	7 , 95
ZH1-E- 004	A154P/Y165C	E	99,4%	8,13

- 19 032685

ZHl-E- S02	P163T/A164T/Y165C/ V169I/L170R	E	98,5%	8, 83
ZH1-E- S05	A154P/Y165H/L170R	E	99,1%	9, 65
ZH1-F- 001	Y180F	F	99, 7%	8,35
ZH1-F- 002	D182T	F	99, 7%	8, 41
ZH1-F- 003	D182K	F	99, 7%	8,19
ZH1-F- 004	Y180F/R181V/I190V	F	99,1%	8,56
ZH1-F- S04	Y180F/D182T/F183Y/ I190V/G191S	F	98,5%	8,56
ZH1-F- S06	Y180F/D182T/F183Y/ I190V	F	98,8%	8, 64
ZH1-F- S10	E178A/R181V/D182К/ F183Y	F	98,8%	7,55
ZH1-H- 001	T236K	H	99, 7%	8,0 9
ZH1-H- 002	V237F	H	99, 7%	8,11
ZH1-H- 003	E234G	H	99, 7%	8,54
ZH1-H- S02	F233W	H	99, 7%	8,37
ZH1-H- S03	F233Y	H	99, 7%	8, 64
ZH1-H- S04	F233H	H	99, 7%	8,36
ZH1-H- S06	A231V/F233Y	H	99,4%	8,54
ZH1-H- S09	F232W/F233A/E234T/ G235D/L239A	H	98,5%	8, 83
ZH1-I- 001	H240N	I	99, 7%	8,54
ZH1-I- 002	H240S	I	99, 7%	8,79

- 20 032685

ZHl-I- 003	D244E/R245Y	I	99,4%	8, 42
ZH1-I- S02	D244E/R245Q/M246L	I	99,1%	8,36
ZH1-I- S03	H240N/D244E	I	99,4%	9,26
ZH1-I- S06	H240S/D244E	I	99,4%	9, 02
ZH1-I- S07	L239Q/H240T/R245Y	I	99,1%	8, 41
ZH1-J- 001	Q249R	J	99, 7%	8,36
ZH1-J- 002	T252V	J	99, 7%	7, 94
ZH1-J- S02	I254V	J	99, 7%	8,55
ZH1-J- S03	Q249R/K251N/I254V	J	99,1%	9, 03
ZH1-J- S07	T252V/I254M	J	99,4%	7,81
ZH1-J- S10	T252V/I254V	J	99,4%	7, 97
ZH1-K- S05	A2 60M	К	99, 7%	8, 64
ZH1-K- Sll	A260F	К	99, 7%	8, 82
ZH1-K- S13	A260S	К	99, 7%	9, 01
ZH1-L- 001	E266Y	L	99, 7%	8, 46
ZH1-L- 002	E266D	L	99, 7%	8,31
ZH1-L- 003	T262G	L	99, 7%	8,32
ZH1-L- 004	T262D/E266D	L	99,4%	8,56
ZH1-L- 005	T262G/I263T	L	99,4%	8, 68

- 21 032685

ZHl-L- S02	E266D/E269H	L	99,4%	8,59
ZH1-L- S04	I263T/E269N	L	99,4%	8,73
ZH1-L- S06	E269N	L	99, 7%	8, 69
ZH1-L- S13	E266Y/E269N	L	99,4%	8,33
ZH1-M- 001	L274M	M	99, 7%	8,29
ZH1-M- 002	L274C	M	99, 7%	8,37
ZH1-M- S02	L277E	M	99, 7%	8, 96
ZH1-M- S07	L274M/A279V	M	99,4%	8,23
ZH1-M- S08	L274T/L277F	M	99,4%	8, 63
ZH1-M- Sll	L274C/L277I	M	99,4%	8,51
ZH1-N- 001	H297L	N	99, 7%	8,27
ZH1-N- 002	H298V/L302S	N	99,4%	9, 03
ZH1-N- S02	H298V	N	99, 7%	8, 94
ZH1-N- S09	H298L/P299D	N	99,4%	8,37
ZH1-O- 001	L307Q	0	99, 7%	8, 62
ZH1-O- 002	F308S	0	99, 7%	8,57
ZH1-O- S02	L307Q/A311P	0	99,4%	8,34
ZH1-O- S03	L307Q/F308S	0	99,4%	8,74
ZH1-O- S06	L307Q/F308S/D309A	0	99,1%	9, 18

- 22 032685

ZHl- B/H-001	D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A/F233V/ E234G/V237F	B+H	97,3%	9,26
ZH1- C/D-001	N80H/F84Y/T95S/R99K/ I118V/K119R/L132V/ A141S	C+D	97, 6%	9, 31
ZH1- D/K-001	T95S/T97A/R99K/I118V/ V123I/L132V/A141S/ A2 60M	D+K	97, 6%	9,66
ZH1- D/M-001	T95S/T97A/R99K/I118V/ V123I/L132V/A141S/ L277E	D+M	97, 6%	10,63
ZH1- K/N-001	A260M/H298V	K+N	99, 4%	8, 94
ZH1- K/L-001	A260M/T262D/E266D/ E269H	K+L	98, 8%	9, 03
ZH1- K/L-002	A260M/T262G/I263T/ E269N	K+L	98, 8%	8, 84
ZH1- N/O-OOl	Q296A/H298V/L307Q/ A311P	N+O	98, 8%	9,26
ZH1- N/0-002	Q296E/H298V/L302S/ L307Q/F308S	N+O	98,5%	9,46
ZH1- C/D/ J-001	N80H/F84Y/T95S/R99K/ I118V/L132V/A141S/ Q249R/K251N/I254V	C+D+J	97, 0%	9, 97
ZH1- B/D/ K-001	D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A/T95S/R99K/ I114M/I118V/K119R/ L132V/A141S/A260M	B+D+K	95,7%	10,78
ZH-J/K/ L-001	I254V/I256L/A260M/ T262G/I263T/E269N	J+K+L	98,2%	9, 11
ZH1- J/K/ LM-001	I254V/I256L/A260M/ T262D/E266D/E269Н/ L271V	J+K+L+M	97,7%	9, 14

- 23 032685

ZHl- В/C/D/ J-002	E79R/N80D/D53G/N54R/ L57V/L60I/P72E/V73A/ W96R/R99G/S102T/ F106V/I114L/A115D/ L116G/K119G/V122A/ V123F/A125S/N127L/ L133A/A134S/Y140F/ M142K/T252V/I254V	B+C+D+J	92,1%	11,31
ZH1- DEL-001	ΔΡ212	-	99, 7%	8,56
ZH1- DEL-002	AG5/AT 6/AR7/AS 8/АЕ9/ ΔΆ10/ΔΆ11/ADI2/ΔΆ13/ AA14/AT15/AQ16/ ΔΆ17/AR18/AQl9	-	95,4%	8,37
ZH1- DEL-003	AN327/AD328	-	99,4%	8,27
ZH1- A/B/C- 001	N25D/I26V/F27Y/S29Р/ R31A/F32Y/R35K/V37A/ V42I/V43T/F46Y/N54R/ L5 8V/L5 9P/L60V/T 64G/ P72R/G75P/L77P/R99G/ S102N/D104N/N105T/ F106W/L110V/V111E/ A115D/K119G/V122T/ V123L/L132V/L133I/ S138A/M142K	A+B+C	89, 6%	9, 54

- 24 032685

ZH1- DEL/B/ С/D/ J-001	AG5/АТ6/AR7/AS 8/ΔΕ 9/ ΔΆ10/ΔΆ11/ADI2/ΔΆ13/ ΔΆ14/АТ15/AQ16/ΔΆ17/ ARI8/AQl9/ΔΡ212/ ΔΝ327/AD328/Е79R/ N80D/D53G/N54R/L57V/ L60I/P72E/V73A/W96R/ R99G/S102T/F106V/ I114L/A115D/L116G/ K119G/V122A/V123F/ A125S/N127L/L133A/ A134S/Y140F/M142K/ T252V/I254V	B+C+D+J	86, 6%	11,52
ZH1- DEL/A/ B/C/D/ J-001	AG 5/АТ6/AR7/AS 8/АЕ9/ ΔΆ10/ΔΆ11/ADI2/ΔΆ13/ ΔΆ14/AT15/AQ16/ΔΆ17/ ARI8/AQl9/ΔΡ212/ AN327/AD328/N25D/ 126V/F27Y/S29P/R31A/ F32Y/R35K/V37A/V42I/ V43T/F46Y/E79R/N80D/ D53G/N54R/L57V/L60I/ P72E/V73A/W96R/R99G/ S102T/F106V/I114L/ A115D/L116G/K119G/ V122A/V123F/A125S/ N127L/L133A/A134S/ Y140F/M142K/T252V/ I254V	A+B+C+ D+J	83,3%	10,92
ZH1-001	L302S	-	99, 7%	8,31

Позиции мутаций указаны относительно аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1. Идентичность последовательностей определена по программе BLAST соответственно описанию примера 2.

- 25 032685

Таблица 6

Значения удельной активности функциональных вариантов полипептида с SEQ ID NO: 2

Вариант	Мутации	Идентичность по сравнению с SEQ ID NO: 2	Удельная активность, ед/мг
ZH2-001	D3D(GTRSEAADAATQARQL)	93,6%	10, 15
ZH2-002	D8N/V9I/Y10F	99,0%	10, 42
ZH2-003	M37N/E55P/A56V/V101I/S124A/ F194FP/T146Р/Т147А/С148Y	97,0%	10,58
ZH2-004	S187P/S188A/P189K/M190A/ Al91M/R192Q/Y193L	97,7%	10, 43
ZH2-005	А262E/R263H/R265Q/L266D/ L267I/M268I/E269R	97,7%	10, 68
ZH2-006	D3D(GTRSEAADAATQARQL)/M37N/ E55P/A56V/V101I/S124A/F194FP/ Т146Р/Т147А/С148Y/S187Р/ SI88А/Р189К/М190А/А191М/ R192Q/Y193L/A262E/R263Н/ R265Q/L266D/L267I/M268I/E269R	86,1%	10,71

Позиции мутаций указаны относительно аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2. Идентичность последовательностей определена по программе BLAST соответственно описанию примера 2.

Пример 6. Разложение ZEN и производных соединений ZEN в загрязненной кукурузе.

Для определения способности полипептидов в сложной матрице и при низких значениях pH разлагать ZEN и производные соединения ZEN, встречающиеся естественным образом, к загрязненной кукурузе прибавляли с различными концентрациями каждый из полипептидов с SEQ ID NO: 1-6 и контролировали разложение ZEN и производных соединений ZEN.

Загрязненную кукурузу измельчали и использовали в опытах по разложению, причем исходная смесь состояла из 1 г измельченной загрязненной кукурузы, 8,9 мл 100 мМ ацетатного буферного раствора с pH 4,0 и 0,1 мл раствора полипептида. Получали обогащенные и очищенные растворы полипептидов соответственно описанию примера 5, причем их разбавляли до концентраций 10, 100 или 1000 микроединица/мл. Таким образом, в исходной смеси применяли в абсолютном значении 1 микроединицу (=1 микроединица на грамм кукурузы), 10 микроединиц (=10 микроединиц на грамм кукурузы) или 100 микроединиц (=100 микроединиц на грамм кукурузы). Расщепляемые смеси переносили в склянки вместимостью 25 мл и при инкубировали при 37°C при встряхивании с частотой 100 об/мин. Перед прибавлением фермента или после 1-часовой инкубации соответственно отбирали пробы объемом 1 мл, полипептид инактивировали нагреванием в течение 10 мин при 99°C и пробы хранили при -20°C. После размораживания проб нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием. Концентрации ZEN, а также производных соединений ZEN определяли способом ЖХ-МС-МС соответственно описанию M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). Содержание ZEN и производных соединений ZEN в указанной кукурузе составляло 238 млрд^-1 в случае ZEN, 15 млрд^-1 в случае α-ZEL, 23 млрд^-1 в случае β-ZEL, 32 млрд^-1 в случае Z14G и 81 млрд^-1 в случае Z14S. В табл. 7 представлено процентное уменьшение содержания ZEN и производных соединений ZEN в опытах по разложению.

- 26 032685

Таблица 7

Уменьшение содержания ZEN и производных соединений ZEN в процентах относительно начального содержания в опытах по разложению разными полипептидами в разных количествах

Полипептид	Количество в исходной смеси	ZEN	a-ZEL	β-ZEL	Z14G	Z14S
SEQ ID NO: 1	0,1 микроед.	83%	>80%	70%	78%	80%
1 микроед.	96%	>80%	76%	>80%	92%
10 микроед.	97%	>80%	>85%	>80%	94%
SEQ ID NO: 2	0,1 микроед.	87%	>80%	73%	>80%	84%
1 микроед.	97%	>80%	78%	>80%	90%
10 микроед.	99%	>80%	>85%	>80%	96%
SEQ ID NO: 3	0,1 микроед.	79%	79%	67%	73%	75%
1 микроед.	85%	>80%	72%	79%	82%
10 микроед.	92%	>80%	78%	>80%	88%
SEQ ID NO: 4	0,1 микроед.	82%	78%	65%	76%	80%
1 микроед.	89%	>80%	73%	>80%	86%

	10 микроед.	93%	>80%	82%	>80%	91%
SEQ ID NO: 5	0,1 микроед.	79%	76%	66%	78%	80%
1 микроед.	83%	>80%	73%	>80%	81%
10 микроед.	91%	>80%	79%	>80%	86%
SEQ ID NO: 6	0,1 микроед.	93%	>80%	75%	>80%	90%
1 микроед.	95%	>80%	82%	>80%	92%
10 микроед.	98%	>80%	>85%	>80%	96%

Пример 7. Добавки, содержащие полипептиды, для гидролитического расщепления ZEN и/или производных соединений ZEN.

Для получения добавок для гидролитического расщепления ZEN надосадочные жидкости после ферментации, содержащие экспрессированные P.pastoris полипептиды с SEQ ID NO: 1, 2, 6 и 13, посредством микрофильтрации и ультрафильтрации (граница отсечки: 10 кД) в стандартных условиях очищали и концентрировали до концентрации сухого вещества около 9 мас.%. Затем растворы, содержащие полипептиды, обрабатывали в распылительной сушилке, (Mini B290, компания Buchi) также в стандартных условиях до получения сухих порошков. Полученные четыре порошка далее обозначены как Z1, Z2, Z6 и Z13. Порошки Z1, Z2, Z6 или Z13 были смешаны в поворотном встряхивателе с бентонитом со средним размером частиц около 1 мкм в соотношении 1 мас.% добавки Z1, Z2, Z6 или Z13 и 99 мас.% бентонита. Полученные таким образом добавки были обозначены как добавки Z1.B, Z2.B, Z6.B и Z13.B. Порошки Z1, Z2, Z6 и Z13 также были смешаны в поворотном встряхивателе с бентонитом и концентратом витаминов и микроэлементов в соотношении 0,1 мас.% добавки Z1, Z2, Z6 или Z13, 0,9 мас.% концентрата витаминов и микроэлементов и 99 мас.% бентонита. Полученные таким образом добавки были обозначены как добавки Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS и Z13.BVS. Добавки Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS и Z13.BVS в расчете на 100 г содержали 200 мг сульфата железа, 50 мг сульфата меди, 130 мг оксида олова, 130 мг оксида марганца, 2,55 мг карбоната кальция, 160 мг витамина E, 6,5 мг витамина K3, 6,5 мг витамина B1, 1,14 мг витамина B2, 15 мг витамина B6, 0,15 мг витамина B12, 50 мг никотиновой кислоты, 30 мг пантотеновой кислоты и 5,3 мг фолиевой кислоты.

Добавки экстрагировали 50 мМ буферным раствором Tris-HCl с pH 8,2 в течение 30 мин и тем же самым буферным раствором разбавляли дальше так, чтобы конечная концентрация полипептида составила около 70 нг/мл.

Затем определяли расщепляющее зеараленон действие этих растворов соответственно описанию примера 5. Соответствующие значения активности составили 8,230 ед./г в случае Z1, 9,310 ед./г в случае Z2, 9,214 ед./г в случае Z6, 83 ед./г в случае Z1.B, 92 ед./г в случае Z2.B, 90 ед./г в случае Z2.C, 57 ед./г в случае Z13.B, 8 ед./г в случае Z1.BVS, 9 ед./г в случае Z2.BVS, 9 ед./г в случае Z6.BVS и 6 ед./г в случае Z13.BVS.

Способность разлагать производные соединения ZEN типа α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S и ZAN добавками Z1, Z2, Z6, Z13, Z1.B, Z2.B, Z6.B, Z13.B, Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS и Z13.BVS

- 27 032685 определяли соответственно описанию примера 4, однако вместо 100 мкл клеточного лизата применяли 100 мкл раствора полипептида с концентрацией полипептида около 70 нг/мл. После 6-часовой инкубации в форме негидролизованного производного соединения ZEN оставалось только не больше 15% от исходного количества.

Пример 8. Температурные оптимумы.

Для определения температурных оптимумов полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15 их клонировали с C-концевой меткой 6His соответственно описанию примера 1, экспрессировали в E.coli и очищали. В предварительных испытаниях для каждого полипептида определяли концентрацию, при которой в опытных условиях (буферный раствор Теорелла-Стенхагена (Teorell und Stenhagen. Ein Universalpuffer fur den pH-Bereich 2,0 bis 12.0. Biochem. Ztschrft., 1938, 299: S. 416-419) при pH 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA при 30°C) через 3 ч протекания опыта могло быть обеспечено полное превращение ZEN. Композиции применяли при найденных концентрациях в расщепляемых смесях для определения температурных оптимумов.

Испытания осуществляли в реакторе для ПЦР (компания Eppendorf) с функцией задания температурного градиента при значениях 20 +/- 10°C, 40 +/- 10°C и при необходимости 60 +/-10°C (10 значений температуры в соответствующей области; предварительно заданные значения температуры в реакторе для ПЦР). К исходным смесям прибавляли буферный раствор Теорелла-Стенхагена при соответствующем оптимальном значении pH, содержавший фермент с соответствующей концентрацией, а также 0,1 мг/мл BSA, и 5 млн^-1 ZEN. В качестве отрицательных контрольных проб использовали исходные смеси, содержавшие 0,1 мг/мл BSA и 5 млн^-1 ZEN без прибавления фермента. После инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч при соответствующей температуре инкубации отбирали пробы, инактивировали нагреванием в течение 10 мин при 99°C и хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ. ZEN, HZEN и DHZEN анализировали способом ВЭЖХ-ДМД. С этой целью метаболиты хроматографически разделяли посредством колонки Zorbax SB-Aq C18 с размерами 4,6x150 мм и с частицами крупностью 5 мкм. В качестве элюента использовали смесь метанол-вода с 5 мМ ацетата аммония. УФ-сигнал регистрировали при 274 нм. Количественное определение метаболитов осуществляли с привлечением параллельно анализируемых стандартных образцов. Определение температурных оптимумов осуществляли по найденным подъемам кривых разложения, причем температуру, при которой наблюдался наибольший подъем, принимали в качестве температурного оптимума. Значения температурных оптимумов представлены в табл. 8.

Таблица 8

Температурные оптимумы полипептидов

SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ	ID	SEQ	ID	SEQ	ID
NO: 1	NO: 2	NO: 5	NO: 6	NO: 7	NO: 9	NO:	11	NO:	12	NO:	15
38°С	41°C	50°C	51°C	31°C	35°C	50	°C	2 6°	C	41	°C

Пример 9. Термическая стабильность.

Для определения термической стабильности полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15 их клонировали с C-концевой меткой 6His соответственно описанию примера 1, экспрессировали в B.coli и очищали. Полипептиды инкубировали в реакторе для ПЦР с функцией задания градиента при соответствующем значении температурного оптимума +/- 10°C. Через 0, 15, 30 и 60 мин отбирали пробы каждой из исходных смесей при каждой из температур. Затем эти предварительно инкубированные пробы применяли в опытах по разложению в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при соответствующем оптимальном значении pH и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн^-1 ZEN в исходной смеси. В предварительных испытаниях для каждого полипептида определяли концентрацию, при которой в опытных условиях (буферный раствор Теорелла-Стенхагена при pH 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA при 30°C) через 3 ч протекания опыта могло быть обеспечено полное превращение ZEN. Соответствующие найденные значения концентрации фермента применяли в исходных смесях. Исходные расщепляемые смеси инкубировали при 30°C. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-ДМД соответственно описанию примера 8.

Термическую стабильность определяли как температуру, при которой полипептиды после 15минутной предварительной инкубации обладали 50%-ной остаточной активностью по сравнению с температурным оптимумом. В качестве меры активности принимали подъем кривых разложения. Значения термической стабильности представлены в табл. 9.

- 28 032685

Таблица 9

Термическая стабильность полипептидов (50%-ная остаточная активность после 15-минутной предварительной инкубации)

SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ	ID	SEQ ID	SEQ	ID
NO: 1	NO: 2	NO: 5	NO: 6	NO: 7	NO: 9	NO:	11	NO: 12	NO:	15
38°С	34°C	54°C	61°C	28°C	44°C	55	°C	4 0°C	49	°C

Пример 10. Оптимальные значения pH.

Для определения оптимальных значений pH полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15 их клонировали с C-концевой меткой 6His соответственно описанию примера 1, экспрессировали в E.coli и очищали. В предварительных испытаниях для каждого полипептида была определена концентрация, при которой в опытных условиях (буферный раствор Теорелла-Стенхагена при pH 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA при 30°C) через 3 ч протекания опыта могло быть обеспечено полное превращение ZEN. Соответствующие значения концентрации фермента применяли в исходных смесях. Исходные расщепляемые смеси помещали в буферный раствор Теорелла-Стенхагена при значениях pH, равных 3,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11,0 и 12,0. Исходные расщепляемые смеси с 0,1 мг/мл BSA и 5 млн^-1 ZEN инкубировали при 30°C. В качестве отрицательных контрольных проб использовали исходные смеси в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при pH 3,0, pH 7,0 и pH 12,0 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн^-1 ZEN. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХДМД соответственно описанию примера 8. Определение оптимальных значений pH осуществляли по найденным подъемам кривых разложения, причем значение pH, при котором наблюдался наибольший подъем, принимали в качестве оптимального значения pH. Оптимальные значения pH представлены в табл. 10.

Таблица 10

Оптимальные значения pH полипептидов

SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ	ID	SEQ	ID
NO: 1	NO: 2	NO: 5	NO: 6	NO: 7	NO: 9	NO: 11	NO:	12	NO:	15
8,2	8,5	7,0-8,0	7,0-7,5	7,5-8,5	7,0-7,5	8,0	7,0-	7,5	7,	5

Пример 11. Стабильность при pH 5,0.

Для определения pH-зависимой стабильности полипептиды по примеру 10 инкубировали в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при pH 5,0 и при соответствующем оптимальном значении pH в течение 1 ч при 25°C. Эти предварительно инкубированные пробы использовали в опытах по разложению с равными концентрациями соответствующего полипептида, использованными для определения оптимальных значений pH, в 100 мМ буферного раствора Tris-HCl при соответствующем оптимальном значении pH и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн^-1 ZEN в исходной смеси. Исходные смеси инкубировали при соответствующем температурном оптимуме. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-ДМД соответственно описанию примера 8. pH-зависимую стабильность определяли как процентную остаточную активность полипептидов при pH 5 по отношению к активности при соответствующем оптимальном значении pH. Значения pH-зависимой стабильности при pH 5,0 представлены в табл. 11.

Таблица 11 pH-зависимая стабильность полипептидов при pH 5,0

SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ	ID	SEQ ID	SEQ	ID	SEQ	ID
NO: 1	NO: 2	NO: 5	NO: 6	NO: 7	NO:	9	NO: 11	NO:	12	NO:	15
3%	17%	79%	80%	100%	22	δ	87%	98	δ	19	δ

Пример 12. Опыты по разложению ZEN.

Разложение ZEN до HZEN и DHZEN осуществляли на примере полипептидов с SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и 15. Исходные расщепляемые смеси получали в буферном растворе Теорелла-Стенхагена при pH 7,5 и с содержанием 0,1 мг/мл BSA и 5 млн^-1 ZEN. Исходные расщепляемые смеси инкубировали при 30°C. Отбор проб осуществляли после инкубации в течение 0, 0,5, 1, 2 и 3 ч. Затем полипептиды инактивировали нагреванием при 99°C в течение 10 мин и пробы хранили при -20°C. После размораживания пробы переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-ДМД соответственно описанию примера 8. Концентрацию полипептида выбирали так, чтобы полное разложение достигалось приблизительно через 3 ч. Кривые кинетики разложения представлены на фиг. 3, причем на оси у показаны концентрации ZEN, HZEN и DHZEN в микромолях в литре (мкмоль/л), а на оси x показаны дли

- 29 032685 тельность инкубации в часах (ч). мкМ означает микромолярный и соответствует размерности мкмоль/л.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Эрбер Акциенгезелльшафт <120> Полипептид для гидролитического расщепления зеараленона и/или производных зеараленона <130> P05341PCT <160>69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211>328 <212> ПРТ <213> Rhodococcus erythropolis <400>1

Met 1

Ala

Glu

Gly Thr 5

Arg

Ser Glu Ala Ala 10

Asp

Ala

Thr 15

Gln

Ala

Arg

Gln

Leu

Pro

Asp

Ser

Arg

Asn

Ile

Phe

Val

Ser

His

Arg

Phe

20

25

30

Pro

Glu

Arg

Gln

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Val

Met

Asn

Phe

Ala

Glu

35

40

45

Ala

Gly

Ser

Pro

Asp

Asn

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Gln

Thr

50

55

60

Gly

Ser

Trp

Ser

Tyr

Glu

Pro

Val

Met

Gly

Leu

Ala

Glu

Asn

65

70

75

80

Phe

His

Val

Phe

Ala

Val

Asp

Ile

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

Thr

Trp

85

90

95

Thr

Pro

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

100

105

110

Phe

Ile

Ala

Leu

Val

Ile

Lys

Arg

Pro

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

115

120

125

Ser

Gly

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ala

Met

Pro

Gly

130

135

140

Gln

Ile

Arg

Ala

Leu

Cys

Glu

Asp

Ala

Pro

Phe

Ala

Ser

Glu

145

150

155

160

- 30 032685

Leu

Val

Pro

Ala

Tyr Gly His 165

Ser

Val

Leu 170

Gln

Ala

Gly

Pro 175

Ala

Phe

Glu

Leu

Tyr

Arg

Asp

Phe

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Ile

Gly

Asp

180

185

190

Trp

Lys

Gly

Phe

Val

Glu

Ala

Lys

Ala

Ser

Pro

Ala

Lys

Ala

Met

195

200

205

Gln

Leu

Phe

Pro

Thr

Pro

Asp

Glu

Ala

Pro

Gln

Asn

Leu

Lys

Glu

Tyr

210

215

220

Asp

Pro

Glu

Trp

Gly

Arg

Ala

Phe

Glu

Gly

Thr

Val

Ala

Leu

His

225

230

235

240

Cys

Pro

His

Asp

Arg

Met

Leu

Ser

Gln

Val

Lys

Thr

Pro

Ile

Leu

Ile

245

250

255

Thr

His

Ala

Arg

Thr

Ile

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Glu

Leu

Gly

260

265

270

Ala

Leu

Ser

Asp

Leu

Gln

Ala

Glu

His

Ala

Gln

Asp

Ile

Arg

Ser

275

280

285

Ala

Gly

Val

Arg

Val

Asp

Tyr

Gln

Ser

His

Pro

Asp

Ala

Leu

His

Met

290

295

300

Met

His

Leu

Phe

Asp

Pro

Ala

Arg

Tyr

Ala

Glu

Ile

Leu

Thr

Ser

Trp

305

310

315

320

Ser

Ala

Thr

Leu

Pro

Ala

Asn

Asp

325

<210> 2 <211> 308 <212> ПРТ <213> Streptomyces violaceusniger <400> 2

Met 1

Ala

Asp

Pro

Ala Gln 5

Arg

Asp

Val

Tyr 10

Val

Pro

His

Ala

Tyr 15

Pro

Glu

Lys

Gln

Ala

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Thr

Met

Asn

Tyr

Ala

Glu

Ala

20

25

30

Gly

Glu

Pro

Asp

Met

Pro

Ala

Val

Leu

Ile

Pro

Glu

Gln

Thr

Gly

35

40

45

- 31 032685

Ser

Trp 50

Trp

Gly

Tyr Glu Glu 55

Ala

Met

Gly

Leu

Leu 60

Ala

Glu

Asn

Phe

His

Val

Tyr

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

Trp

Ala

65

70

75

80

Pro

Lys

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

Phe

85

90

95

Ile

Ala

Leu

Val

Lys

Arg

Pro

Val

Ile

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

100

105

110

Gly

Val

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ser

Met

Pro

Gly

Gln

115

120

125

Val

Arg

Gly

Ala

Leu

Cys

Glu

Asp

Ala

Pro

Phe

Ala

Ser

Glu

Leu

130

135

140

Val

Thr

Cys

Gly

His

Ser

Ile

Arg

Gln

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

145

150

155

160

Glu

Leu

Phe

Arg

Thr

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Val

Gly

Asp

Trp

165

170

175

Thr

Gly

Tyr

Cys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ser

Pro

Met

Ala

Arg

180

185

190

Tyr

Phe

Val

Ala

Asp

Glu

Ile

Pro

Gln

His

Met

Arg

Glu

Tyr

Asp

Pro

195

200

205

Glu

Trp

Ala

Arg

Ala

Phe

Trp

Glu

Gly

Thr

Val

Ala

Leu

His

Cys

Pro

210

215

220

His

Glu

Gln

Leu

Thr

Gln

Val

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Thr

His

225

230

235

240

His

Met

Arg

Asp

Ile

Asp

Pro

Asp

Thr

Gly

His

Leu

Val

Gly

Ala

Leu

245

250

255

Ser

Asp

Glu

Gln

Ala

Arg

Ala

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Ala

Gly

260

265

270

Val

Lys

Val

Asp

Tyr

Ala

Ser

Val

Pro

Asp

Ala

Leu

His

Met

His

275

280

285

Gln

Phe

Asp

Pro

Arg

Tyr

Val

Glu

Ile

Phe

Thr

Gln

Trp

Ala

290

295

300

- 32 032685

Thr Leu Ala Ala

305 <210>3 <211>309 <212> ПРТ <213> Streptomyces coelicolor <400>3

Met 1

Val

Thr

Ser

Pro 5

Ala

Leu

Arg

Asp

Val 10

His

Val

Pro

His

Ala 15

Tyr

Pro

Glu

Gln

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Thr

Met

Asn

Tyr

Ala

Glu

20

25

30

Ala

Gly

Asp

Pro

Gly

Arg

Pro

Ala

Val

Leu

Ile

Pro

Glu

Gln

Thr

35

40

45

Gly

Ser

Trp

Ser

Tyr

Glu

Ala

Met

Gly

Leu

Ala

Glu

His

50

55

60

Phe

His

Val

Tyr

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

Trp

65

70

75

80

Thr

Pro

Lys

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

85

90

95

Phe

Ile

Ala

Leu

Val

Arg

Pro

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

100

105

110

Ser

Gly

Val

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ser

Met

Pro

Gly

115

120

125

Gln

Ile

Arg

Gly

Val

Leu

Cys

Glu

Asp

Pro

Phe

Ala

Ser

Glu

130

135

140

Leu

Val

Pro

Ala

His

Gly

His

Ser

Val

Arg

Gln

Gly

Ala

Gly

Pro

Val

145

150

155

160

Phe

Glu

Leu

Phe

Arg

Thr

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Val

Gly

Asp

165

170

175

Trp

Glu

Gly

Phe

Arg

Ser

Ala

Asp

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Met

Ala

180

185

190

Arg

Ser

Phe

Val

Ala

Asp

Thr

Ile

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

195

200

205

- 33 032685

Pro

Glu 210

Trp

Ala

Arg Ala

Phe 215

Tyr Glu Gly

Thr

Val 220

Gly

Leu

Asn

Cys

Pro

His

Glu

Arg

Met

Leu

Asn

Arg

Val

Asn

Thr

Pro

Val

Leu

Thr

225

230

235

240

His

Met

Arg

Gly

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Asn

Leu

Gly

Ala

245

250

255

Leu

Ser

Asp

Glu

Gln

Ala

Gln

Val

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Ala

260

265

270

Gly

Val

Lys

Val

Asp

Tyr

Glu

Ser

Val

Pro

Asp

Ala

Ser

His

Met

275

280

285

His

Gln

Ser

Asp

Pro

Ala

Arg

Tyr

Ala

Glu

Ile

Leu

Thr

Pro

Trp

Thr

290

295

300

Ala

Leu

Ala

Pro

305

<210>

4

<211>

309

<212>

ПРТ

<213>

Streptomyces

rapamycinicus

<400>

4

Met

Val

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

Arg

Asp

Val

His

Val

Pro

His

Ala

Tyr

1

5

10

15

Pro

Glu

Gln

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Thr

Met

Asn

Tyr

Ala

Glu

20

25

30

Ala

Gly

Asp

Pro

Asp

Arg

Pro

Ala

Val

Leu

Ile

Pro

Glu

Gln

Thr

35

40

45

Gly

Ser

Trp

Ser

Tyr

Glu

Ala

Met

Gly

Leu

Ala

Glu

His

50

55

60

Phe

His

Val

Tyr

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

Trp

65

70

75

80

Thr

Pro

Lys

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

85

90

95

Phe

Ile

Ala

Leu

Val

Lys

Arg

Pro

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

100

105

110

- 34 032685

Ser

Gly

Gly Val 115

Leu

Ala

Trp 120

Leu

Ser Ala

Tyr

Ser 125

Met

Pro

Gly

Gln

Leu

Arg

Gly

Val

Leu

Cys

Glu

Asp

Pro

Phe

Ala

Ser

Glu

130

135

140

Leu

Val

Pro

Ala

His

Gly

His

Ser

Val

Arg

Gln

Gly

Ala

Gly

Pro

Val

145

150

155

160

Phe

Glu

Leu

Phe

Arg

Thr

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Val

Ser

Asp

165

170

175

Trp

Glu

Gly

Phe

Cys

Arg

Ala

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Met

Ala

180

185

190

Arg

Ser

Phe

Val

Ala

Asp

Gly

Ile

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

195

200

205

Pro

Glu

Trp

Ala

Arg

Ala

Phe

His

Glu

Gly

Thr

Val

Gly

Leu

Asn

Cys

210

215

220

Pro

His

Glu

Arg

Met

Leu

Gly

Arg

Val

Asn

Thr

Pro

Val

Leu

Thr

225

230

235

240

His

Met

Arg

Gly

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Asn

Leu

Gly

Ala

245

250

255

Leu

Ser

Asp

Glu

Gln

Ala

Gln

Ala

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Ala

260

265

270

Gly

Val

Arg

Val

Asp

Tyr

Glu

Ser

Val

Pro

Asp

Ala

Ser

His

Met

275

280

285

His

Gln

Ser

Asp

Pro

Ala

Arg

Tyr

Ala

Glu

Ile

Phe

Thr

Arg

Trp

Ala

290

295

300

Ala

Leu

Ala

Pro

305 <210>5 <211>309 <212> ПРТ <213> Streptomyces lividans <400>5

Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr

5 1015

- 35 032685

Pro

Glu

Gln

Gln 20

Val

Asp

Leu Gly

Glu 25

Ile

Thr Met

Asn

Tyr 30

Ala

Glu

Ala

Gly

Asp

Pro

Gly

Arg

Pro

Ala

Val

Leu

Ile

Pro

Glu

Gln

Thr

35

40

45

Gly

Ser

Trp

Ser

Tyr

Glu

Ala

Met

Gly

Leu

Ala

Glu

His

50

55

60

Phe

His

Val

Tyr

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

Trp

65

70

75

80

Thr

Pro

Lys

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

85

90

95

Phe

Met

Ala

Leu

Val

Arg

Pro

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

100

105

110

Ser

Gly

Val

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ser

Met

Pro

Gly

115

120

125

Gln

Ile

Arg

Gly

Val

Leu

Cys

Glu

Asp

Pro

Phe

Ala

Ser

Glu

130

135

140

Leu

Val

Pro

Ala

His

Gly

His

Ser

Val

Arg

Gln

Gly

Ala

Gly

Pro

Val

145

150

155

160

Phe

Glu

Leu

Phe

Arg

Thr

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Val

Gly

Asp

165

170

175

Trp

Glu

Gly

Phe

Arg

Ser

Ala

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Met

Ala

180

185

190

Arg

Ser

Phe

Val

Ala

Asp

Thr

Ile

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

195

200

205

Pro

Glu

Trp

Ala

Arg

Ala

Phe

Tyr

Glu

Gly

Thr

Val

Gly

Leu

Asn

Cys

210

215

220

Pro

His

Glu

Arg

Met

Leu

Asn

Arg

Val

Asn

Thr

Pro

Val

Leu

Thr

225

230

235

240

His

Met

Arg

Gly

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Asn

Leu

Gly

Ala

245

250

255

Leu

Ser

Asp

Glu

Gln

Ala

Gln

Ala

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Ala

260

265

270

- 36 032685

Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met
275	280	285

His Gln Ser Asp	Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Ala
290	295	300

Ala Ala Leu Ala Pro

305 <210> 6 <211> 309 <212> ПРТ <213> Streptomyces coelicoflavus <400> 6

Met 1

Val

Thr

Ser

Pro 5

Ala

Leu

Arg

Asp

Val 10

His

Val

Pro

His

Ala 15

Tyr

Pro

Glu

Gln

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Thr

Met

Asn

Tyr

Ala

Glu

20

25

30

Ala

Gly

Asp

Pro

Asp

Arg

Pro

Ala

Val

Leu

Ile

Pro

Glu

Gln

Thr

35

40

45

Gly

Ser

Trp

Ser

Tyr

Glu

Ala

Met

Gly

Leu

Ser

Glu

His

50

55

60

Phe

His

Val

Tyr

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

Trp

65

70

75

80

Thr

Pro

Lys

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

85

90

95

Phe

Ile

Ala

Leu

Val

Lys

Arg

Pro

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

100

105

110

Ser

Gly

Val

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ser

Met

Pro

Gly

115

120

125

Gln

Leu

Arg

Gly

Val

Leu

Cys

Glu

Asp

Pro

Phe

Ala

Ser

Glu

130

135

140

Leu

Val

Pro

Ala

His

Gly

His

Ser

Val

Arg

Gln

Gly

Ala

Gly

Pro

Val

145

150

155

160

Phe

Glu

Leu

Phe

Arg

Thr

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Val

Gly

Asp

165 170 175

- 37 032685

Trp

Glu

Gly

Phe 180

Cys

Arg Ala

Ala

Gly 185

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro 190

Met

Ala

Arg

Ser

Phe

Val

Ala

Asp

Gly

Ile

Pro

Gln

His

Leu

Gln

Glu

Tyr

Asp

195

200

205

Pro

Glu

Trp

Ala

Arg

Val

Phe

Tyr

Glu

Gly

Thr

Val

Gly

Leu

Ser

Cys

210

215

220

Pro

His

Glu

Arg

Met

Leu

Gly

Gln

Val

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Thr

225

230

235

240

His

Met

Arg

Gly

Ile

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Asn

Leu

Gly

Ala

245

250

255

Leu

Ser

Asp

Glu

Gln

Ala

Leu

Arg

Ala

Arg

Leu

Met

Asp

Ser

Ala

260

265

270

Gly

Val

Thr

Val

Asp

Tyr

Glu

Ser

Val

Pro

Asp

Ala

Ser

His

Met

275

280

285

His

Gln

Ser

Ala

Pro

Ala

Arg

Tyr

Val

Glu

Ile

Phe

Thr

Arg

Trp

Ala

290

295

300

Ala

Leu

Ala

Pro

305

<210>	7
<211>	300
<212>	ПРТ
<213>	Rhodococcus triatome
<400>	7

Met 1

Pro

His

Asp

Tyr 5

Glu

Lys

Leu

Val 10

Asp

Leu Gly

Glu

Ile Asp 15

Leu

Asn

Tyr

Ala

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Asp

Lys

Pro

Ala

Leu

20

25

30

Ile

Pro

Ser

Gln

Ser

Glu

Ser

Trp

Gly

Tyr

Glu

Ala

Met

Gly

35

40

45

Leu

Ala

Glu

Asp

Tyr

His

Val

Phe

Ala

Val

Asp

Met

Arg

Gly

Gln

50

55

60

Gly

Arg

Ser

Thr

Trp

Thr

Pro

Gly

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

70 75 80

- 38 032685

Asn

Asp

Leu

Val

Arg 85

Phe

Ile Asp

Leu

Val 90

Ile

Gly

Arg

Thr

Val 95

Ile

Val

Ser

Gly

Asn

Ser

Gly

Val

Ala

Trp

Leu

Ala

100

105

110

Phe

Ser

Leu

Pro

Gly

Gln

Val

Arg

Ala

Leu

Ala

Glu

Asp

Ala

Pro

115

120

125

Phe

Ala

Ser

Glu

Leu

Asp

Pro

Lys

Val

Gly

His

Thr

Ile

Arg

Gln

130

135

140

Ala

Gly

His

Ile

Phe

Val

Asn

Trp

Arg

Asp

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

145

150

155

160

Trp

Ser

Val

Gly

Asp

Tyr

Ala

Gly

Phe

Leu

Lys

Ala

Met

Lys

Ser

165

170

175

Glu

Val

Pro

Met

Leu

Arg

Gln

Val

Pro

Leu

Pro

Glu

Thr

Ala

Pro

Gln

180

185

190

Asn

Leu

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Trp

Ala

Arg

Ala

Phe

Tyr

Glu

Gly

195

200

205

Thr

Val

Ala

Gln

Thr

Cys

Pro

His

Asp

Tyr

Met

Leu

Ser

Gln

Val

Lys

210

215

220

Val

Pro

Met

Leu

Val

Thr

His

Ala

Arg

Met

Ile

Asp

Glu

Ala

Thr

225

230

235

240

Ser

Gly

Leu

Val

Gly

Ala

Met

Ser

Asp

Leu

Gln

Val

Gln

Lys

Ala

245

250

255

Glu

Ile

Arg

Gly

Thr

Gly

Val

Gln

Val

Asp

Val

Asp

Leu

Pro

260

265

270

Glu

Ala

Pro

His

Ile

Leu

His

Gln

Leu

Ala

Pro

Lys

Glu

Tyr

Val

Glu

275

280

285

Ile

Leu

Asn

Trp

Val

Glu

Lys

Leu

Pro

Val

290

295

300

<210>	8
<211>	307
<212>	ПРТ
<213>	Hirschia baltica

- 39 032685 <400> 8

Met 1

Ile

Gln

Asn

Asn 5

Lys

Thr

Ala

Pro

Tyr 10

Lys

Tyr

Lys

Glu

Lys 15

Leu

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Lys

Met

Asn

Tyr

Ile

Val

Ala

Gly

Ala

Asp

20

25

30

Val

Ser

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Gly

Gln

Thr

Glu

Ser

Trp

35

40

45

Gly

Phe

Glu

Ala

Ile

Glu

Lys

Leu

Glu

Ser

Asn

Phe

Gln

Val

Phe

50

55

60

Ala

Ile

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Lys

Ser

Thr

Gln

Thr

Pro

Gly

Arg

65

70

75

80

Tyr

Ser

Leu

Asn

Leu

Met

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

Phe

Ile

Ser

Leu

85

90

95

Val

Ile

Lys

Arg

Pro

Val

Ile

Val

Ser

Gly

Asn

Ser

Gly

Leu

100

105

110

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ala

Met

Pro

Asn

Gln

Ile

Arg

Ala

115

120

125

Ile

His

Cys

Glu

Asp

Ala

Pro

Phe

Thr

Ala

Glu

Lys

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Tyr

Gly

His

Ala

Ile

Gln

Ala

Gly

Pro

Ile

Phe

Ser

Leu

Met

145

150

155

160

Ser

Lys

Phe

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Ile

Asn

Trp

Glu

Gly

Leu

165

170

175

Lys

Ala

Gln

Ala

Lys

Asp

Thr

His

Pro

Ala

Asn

Lys

Met

Ile

Ser

180

185

190

Gln

Val

Glu

Gln

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Trp

195

200

205

Gly

Arg

Ala

Phe

Ile

Glu

Gly

Lys

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Pro

His

210

215

220

Thr

Leu

Ser

Asp

Ile

Lys

Thr

Pro

Met

Leu

Tyr

Thr

His

Met

225

230

235

240

Arg

Phe

Glu

Asp

Pro

Gln

Thr

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Thr

Ser

Asp

- 40 032685

245 250 255

Phe

Gln

Ala

Ser 260

Lys

Ile

Lys

Glu

Ile 265

Ala

Leu

Lys

Thr

Gly 270

Asn

Ser

Phe

Glu

Leu

Ile

Asp

Ala

Pro

Asp

Ala

Phe

His

Ser

Met

His

Glu

Ala

275

280

285

Asp

Pro

Gln

Arg

Phe

Val

Asp

Ile

Leu

Thr

Ser

Trp

Ile

Glu

Arg

Leu

290

295

300

Asn Leu Gln

305 <210> 9 <211> 321 <212> ПРТ <213> Nocardia brasiliensis <400> 9

Met 1

Gly

Ile

Ser

Glu 5

Ala

Ala Asp

Arg

Ala 10

Asp

Thr

Phe

Val

Ala 15

His

Lys

Phe

Glu

Gln

Leu

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Arg

Met

Asn

Tyr

20

25

30

Val

Ala

Gly

Asp

Pro

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Ala

35

40

45

Gln

Gly

Glu

Ser

Trp

Gly

Tyr

Glu

Asn

Ala

Ile

Thr

Leu

Ala

50

55

60

Asn

Asp

Phe

Arg

Val

Phe

Ala

Ile

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Ser

65

70

75

80

Thr

Trp

Thr

Pro

Gly

Arg

Tyr

Asn

Leu

Asn

Thr

Trp

Gly

Asn

Asp

Val

85

90

95

Glu

Arg

Phe

Ile

Asp

Leu

Val

Ile

Gly

Arg

Pro

Thr

Leu

Val

Ala

Gly

100

105

110

Asn

Ser

Gly

Val

Ile

Ala

Trp

Leu

Ala

Tyr

Ala

Lys

115

120

125

Pro

Gly

Gln

Ile

Arg

Gly

Ala

Met

Leu

Glu

Asp

Pro

Leu

Phe

Ala

130

135

140

Ser

Gln

Ala

Pro

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ile

Met

Gln

Thr

Leu

Gly

- 41 032685

145 150 155160

Pro

Ile

Phe

Val

Leu 165

Trp Ala

Lys

Trp

Leu 170

Gly

Pro

Gln

Trp

Ser 175

Val

Gly

Asp

Trp

Asp

Gly

Met

Val

Ala

Pro

Arg

Glu

Leu

Pro

Glu

180

185

190

Phe

Leu

His

Pro

Gly

Ile

Ala

Phe

Leu

Phe

Gly

Asp

Gly

Thr

Gly

Glu

195

200

205

Gly

Ala

Thr

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

210

215

220

Trp

Ala

Gln

Ala

Trp

Ala

Thr

Asp

Val

Ala

Asn

Ala

Gly

Cys

Asp

His

225

230

235

240

Ala

Thr

Met

Leu

Ala

Gln

Asn

Arg

Val

Pro

Val

Leu

Thr

His

245

250

255

Phe

His

Leu

Thr

Asp

Pro

Asp

Thr

Gly

Gln

Leu

Met

Gly

Ala

Met

Thr

260

265

270

Asp

Ile

Gln

Ala

Gln

Ala

Arg

Leu

Ala

Thr

Gly

Gln

275

280

285

Pro

Val

Thr

Phe

Thr

Ala

Leu

Asp

Ala

Pro

His

Thr

Met

His

Asp

Pro

290

295

300

Glu

Pro

Glu

Arg

Tyr

Phe

Glu

Val

Leu

Thr

Glu

Trp

Ala

Ser

Ala

Leu

305

310

315

320

Asp <210> 10 <211>319 <212> ПРТ <213> Mycobacterium vaccae <400>10

Met 1

Gly

Arg Tyr

Ala Gly Val 5

Phe Gly

Pro 10

His

Ala

Pro

Glu

Ser 15

Thr

Tyr

Val

Gly

His

Ala

Tyr

Pro

Glu

Gln

Leu

Phe

Asp

Thr

Gly

Glu

Val

20

25

30

Arg

Leu

Asn

Tyr

Ala

Val

Ala

Gly

Asp

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Leu

- 42 032685

Leu

Ile 50

Pro

Gly Gln Thr Glu 55

Ser Trp

Trp

Gly Tyr 60

Glu

Pro

Ala

Met

Gly

Leu

Ala

Glu

His

Phe

His

Val

His

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

65

70

75

80

Gln

Gly

Arg

Ser

Thr

Arg

Thr

Pro

Arg

Tyr

Thr

Leu

Asp

Asn

Ile

85

90

95

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

Phe

Leu

Asp

Gly

Val

Ile

Gly

Arg

Pro

Ala

100

105

110

Phe

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Gly

Leu

Ser

Ala

Trp

Leu

Ser

115

120

125

Ala

Phe

Ala

Glu

Pro

Gly

Gln

Val

Leu

Ala

Cys

Tyr

Glu

Asp

Pro

130

135

140

Pro

Phe

Ser

Glu

Leu

Asp

Pro

Val

Ile

Gly

Pro

Gly

Leu

Met

145

150

155

160

Ser

Thr

Val

Gly

Pro

Leu

Phe

Ala

Leu

Tyr

Val

Lys

Tyr

Leu

Gly

Asp

165

170

175

Gln

Trp

Ser

Ile

Gly

Asp

Trp

Asp

Gly

Phe

Val

Ala

Gly

Ala

Pro

Gln

180

185

190

Glu

Leu

Ala

Gly

Trp

Gln

Ala

His

Val

Ala

Leu

Ala

Gly

Thr

Ala

195

200

205

Glu

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Trp

Gly

Arg

Ala

210

215

220

Phe

Val

Gly

Thr

Phe

Thr

Gly

Cys

Pro

His

Gln

Val

Met

Leu

225

230

235

240

Ser

Gln

Val

Lys

Val

Pro

Val

Leu

Phe

Thr

His

Phe

Arg

Met

Leu

245

250

255

Asp

Glu

Ser

Gly

Ser

Leu

Ile

Gly

Ala

Thr

Asp

Gln

Ala

260

265

270

Ala

Arg

Val

Glu

Leu

Val

Glu

Asn

Ser

Gly

Ala

Pro

Leu

Thr

Tyr

275

280

285

- 43 032685

Arg Ser Phe Pro Met Met Gly His

290295

Ser Met His

Ala Gln Asp Pro Ala

300

Leu Phe Ala Gly Thr Leu Val Asp Trp Phe Thr Ala Ala Arg Ser 305 310315 <210> 11 <211>319 <212> ПРТ <213> Mycobacterium gilvum <400>11

Met 1

Gly

Arg Tyr Ala Gly 5

Val

Phe

Gly

Pro 10

His

Ala

Pro

Glu

Ala 15

Thr

Tyr

Val

Glu

His

Gly

Tyr

Pro

Glu

Arg

Leu

Phe

Asp

Thr

Gly

Glu

Val

20

25

30

Gln

Leu

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Asp

Ala

Pro

Leu

35

40

45

Leu

Ile

Pro

Gly

Gln

Ser

Glu

Ser

Trp

Gly

Tyr

Glu

Ala

Ile

50

55

60

Pro

Leu

Ala

Arg

His

Phe

His

Val

His

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

65

70

75

80

Gln

Gly

Arg

Ser

Thr

Arg

Thr

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

Asp

Asn

Val

85

90

95

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

Phe

Leu

Asp

Gly

Val

Ile

Gly

Arg

Pro

Ala

100

105

110

Phe

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Gly

Leu

Ala

Ser

Ala

Trp

Leu

Ser

115

120

125

Ala

Phe

Ala

Lys

Pro

Gly

Gln

Val

Ala

Cys

Trp

Glu

Asp

Pro

130

135

140

Pro

Phe

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Ile

Val

Gly

Pro

Ile

Thr

145

150

155

160

Asp

Ser

Ile

Gly

Pro

Leu

Phe

Gly

Met

Trp

Ala

Arg

Tyr

Leu

Gly

Asp

165

170

175

Gln

Trp

Ser

Val

Gly

Asp

Trp

Asp

Gly

Phe

Val

Ala

Val

Pro

Thr

180

185

190

- 44 032685

Glu

Leu

Ala 195

Asp

Trp

Gln

Ala

His 200

Val

Ala

Leu

Val

Val 205

Gly

Thr

Ala

Asp

Pro

Gln

Asn

Leu

Arg

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Trp

Gly

Lys

Ala

210

215

220

Phe

Ile

Thr

Gly

Thr

Phe

Ala

Ser

Cys

Pro

His

Val

Met

Leu

225

230

235

240

Ser

Lys

Val

Lys

Val

Pro

Val

Leu

Tyr

Thr

His

Phe

Arg

Met

Ile

245

250

255

Asp

Glu

Gly

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Cys

Ser

Asp

Ile

Gln

Ala

260

265

270

Gly

Arg

Val

Thr

Gln

Leu

Ala

Lys

Ser

Gly

Arg

Ser

Val

Thr

Tyr

275

280

285

Arg

Ser

Phe

Pro

Met

Ala

His

Ser

Met

His

Gly

Gln

Asp

Pro

Ala

290

295

300

Leu

Phe

Ser

Glu

Thr

Leu

Val

Glu

Trp

Phe

Ser

Arg

Phe

Thr

Gly

305

310

315

<210> 12 <211> 322 <212> ПРТ <213> Gordonia effusa <400> 12

Met 1

Pro

Lys

Ser

Glu 5

Ala Ala

Asp Arg

Ala Asp 10

Ser

Phe

Val

Ser 15

His

Asp

Phe

Lys

Glu

Asn

Ile

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Ile

Arg

Met

Asn

Tyr

20

25

30

Val

Gln

Gly

Asn

Lys

Ser

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Ala

35

40

45

Gln

Gly

Glu

Ser

Trp

Gly

Tyr

Glu

Ala

Ile

Pro

Leu

Ala

50

55

60

Lys

His

Phe

Gln

Val

Phe

Ala

Ile

Asp

Leu

Arg

Gly

Gln

Gly

Arg

Thr

65

70

75

80

Thr

Trp

Thr

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

Asp

Ile

Phe

Gly

Asn

Asp

Val

85

90

95

- 45 032685

Val

Arg

Phe

Ile 100

Asp

Leu

Val

Ile

Gly Arg 105

Glu

Thr

Leu

Ile 110

Ala

Gly

Asn

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Trp

Leu

Ala

Phe

Ala

Lys

115

120

125

Pro

Gly

Gln

Val

Arg

Ala

Val

Met

Leu

Glu

Asp

Pro

Leu

Phe

Ala

130

135

140

Ser

Glu

Ile

Arg

Pro

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ile

Trp

Gln

Gly

Leu

Gly

145

150

155

160

Pro

Met

Phe

Ala

Trp

Ala

Lys

Trp

Leu

Gly

Pro

Gln

Trp

Ser

Ile

165

170

175

Gly

Asp

Trp

Asp

Gly

Met

Val

Lys

Ala

Leu

Pro

Asp

Glu

Leu

Pro

Glu

180

185

190

Asp

Leu

Pro

Gly

Ile

Gly

Phe

Met

Leu

Gly

Asp

Gly

Glu

Ser

Asp

195

200

205

Gly

Ala

Pro

Thr

Pro

Gln

His

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

210

215

220

Trp

Gly

Ala

Ser

Trp

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Asn

Thr

Gly

Cys

Glu

His

225

230

235

240

Glu

Ala

Val

Ile

Ser

Gln

Val

Arg

Val

Pro

Val

Leu

Thr

His

245

250

255

Phe

Arg

Gln

Ile

Asn

Glu

Thr

Gly

His

Leu

Met

Gly

Ala

Leu

Ser

260

265

270

Asp

Leu

Gln

Ala

Gln

Val

Arg

His

Ile

Glu

Val

Ala

Gly

275

280

285

Gln

Glu

Val

Thr

Tyr

Val

Ser

Leu

Asp

Ala

Pro

His

Thr

Met

His

Glu

290

295

300

Pro

Gln

Pro

Glu

Arg

Tyr

Thr

Asp

Val

Leu

Asp

Trp

Val

Lys

305

310

315

320

Leu Gly

<210>	13
<211>	328
<212>	ПРТ

- 46 032685 <213> Togninia minima <400> 13

Met 1

Asn

Tyr

Ala

Thr Ala 5

Gly

Ser

Ser Asp 10

Lys

Pro

Ala

Leu

Leu 15

Leu

Val

Pro

Gly

Gln

Ser

Glu

Ser

Trp

Gly

Tyr

Glu

Met

Ala

Met

Trp

20

25

30

Leu

Lys

Asp

Tyr

Gln

Val

Phe

Ala

Val

Asp

Met

Arg

Gly

Gln

35

40

45

Gly

Gln

Ser

Thr

Trp

Thr

Pro

Gly

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Thr

Phe

Gly

50

55

60

Asn

Asp

Leu

Val

Lys

Phe

Ile

Asp

Ile

Val

Ile

Lys

Arg

Pro

Val

65

70

75

80

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Gly

Val

Ser

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

85

90

95

Phe

Ala

Lys

Pro

Gly

Gln

Ile

Arg

Ala

Val

Tyr

Glu

Asp

Pro

100

105

110

Leu

Phe

Ala

Ser

Gln

Ser

Lys

Pro

Ala

Ile

Gly

Gln

Ser

Val

Met

Gln

115

120

125

Thr

Val

Ala

Gly

Pro

Phe

Asn

Leu

Trp

Tyr

Lys

Trp

Leu

Gly

Ala

130

135

140

Gln

Trp

Thr

Ile

Gly

Asp

Gln

Ala

Gly

Met

Val

Ala

Met

Pro

Lys

145

150

155

160

Glu

Ile

Pro

Ala

Trp

Ile

Leu

Gln

Tyr

Leu

Gly

Asn

Thr

Ser

Gly

165

170

175

Pro

Thr

Gly

Leu

Asp

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Trp

Gly

180

185

190

His

Gly

Phe

Val

Ser

Gly

Thr

Val

Asp

Ala

Thr

Cys

Asp

His

Glu

Ala

195

200

205

Met

Leu

Thr

His

Val

Lys

Val

Pro

Val

Leu

Phe

Thr

His

Ser

Arg

210

215

220

Ala

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

Gly

Asn

Leu

Ile

Gly

Ser

Val

Ser

Asp

Thr

225

230

235

240

- 47 032685

Gln Val

Ser

Tyr

Ala 245

Gln Gly Leu

Ile

Thr 250

Thr

Asn

Gly

Asn

Gln 255

Ser

Phe

Thr

Leu

Lys

Asn

Phe

Pro

Leu

Ala

Ser

His

Asp

Met

His

Asn

Ser

260

265

270

Asp

Pro

Ala

Thr

Tyr

Val

Ser

Ala

Ile

Thr

Trp

Met

Ala

Ser

Leu

275

280

285

Gly

Ile

Gly

Ser

Ala

Val

Ile

Pro

Gly

Pro

Val

Lys

Val

Ala

Ser

Ala

290

295

300

Ser

Ala

Gln

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Pro

Ser

Cys

Thr

Ser

305

310

315

320

Thr

Ser

Ala

Pro

Ser

Thr

Gly

His

325

<210>

14

<211>

280

<212>

ПРТ

<213>

Actinosynnema mirum

<400>

14

Met

Thr

Val

Asp

Pro

Ala

Pro

Arg

Asp

Phe

Pro

Glu

Leu

1

5

10

15

Val

Asp

Leu

Gly

Glu

Val

Leu

Asn

His

Ala

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

20

25

30

Asp

Arg

Pro

Ala

Leu

Val

Pro

Val

Pro

Glu

Gln

Gly

Ser

Trp

35

40

45

Ser

Tyr

Glu

Arg

Val

Met

Pro

Leu

Pro

Ala

Arg

Asp

Phe

His

Val

Phe

50

55

60

Ala

Val

Asp

Leu

Arg

Gly

Arg

Gly

Arg

Ser

Thr

Arg

Thr

Pro

Arg

65

70

75

80

Tyr

Ser

Leu

Asp

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

Val

Arg

Phe

Leu

Ala

Leu

85

90

95

Val

Arg

Pro

Ala

Val

Ala

Gly

Asn

Ser

Gly

Val

100

105

110

Leu

Ala

Trp

Ser

Ala

Tyr

Ala

Met

Pro

Gly

Gln

Val

Arg

Ala

115

120

125

- 48 032685

Val

Leu 130

Leu

Glu

Asp

Pro

Pro 135

Leu

Phe

Ser

Ser Glu Leu 140

Thr

Pro

Val

Cys

Gly

Pro

Gly

Val

Arg

Gln

Ala

Gly

Pro

Leu

Phe

Glu

Leu

145

150

155

160

Ser

Thr

His

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Gly

Arg

Pro

Gly

Arg

Val

165

170

175

His

Gly

Val

Pro

Arg

Leu

Gly

Leu

Ala

Val

Arg

180

185

190

Val

Ala

Arg

Ala

Thr

Asp

Ala

Arg

Gly

Arg

Pro

Gly

Ala

195

200

205

Ala

Arg

Gly

Arg

Pro

Ala

Gly

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Arg

210

215

220

Gly

Arg

Glu

Arg

Thr

Gly

Thr

Val

Leu

Ser

Gly

Leu

Thr

225

230

235

240

Gly

Ser

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Gly

Arg

Cys

Arg

Lys

Pro

Phe

Arg

Leu

245

250

255

Arg

Gln

Trp

Ala

Gly

Ala

Arg

Gly

Pro

Arg

Gln

260

265

270

Ile

Arg

Ala

Asp

Val

Arg

Thr

Arg

275 280

<210> <211> <212> <213>

15 326 ПРТ Kutzneria albida

<400> 15

Met 1

Ser

Val

Pro

Val 5

Thr

Pro

Ser

Ala

Arg 10

Asn

Val

Phe Val

Pro 15

His

Ala

Phe

Pro

Glu

Lys

Gln

Ile

Asp

Leu

Gly

Glu

Val

Leu

Asn

Tyr

20

25

30

Ala

Glu

Ala

Gly

Thr

Pro

Asp

Lys

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

35

40

45

Gln

Thr

Gly

Ser

Trp

Ser

Tyr

Glu

Pro

Ala

Met

Gly

Leu

Ala

50

55

60

- 49 032685

Glu 65

His

Phe

His

Val

Phe 70

Ala Val

Asp

Leu

Arg 75

Gly Gln

Gly

Arg

Ser 80

Thr

Trp

Thr

Pro

Gly

Arg

Tyr

Ser

Leu

Asp

Asn

Phe

Gly

Asn

Asp

Leu

85

90

95

Val

Arg

Phe

Ile

Ala

Leu

Ala

Ile

Arg

Pro

Val

Ala

Gly

100

105

110

Cys

Ser

Gly

Val

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Ala

Tyr

Ala

Leu

115

120

125

Pro

Gly

Gln

Ile

Arg

Gly

Ala

Leu

Cys

Glu

Asp

Ala

Pro

Leu

Phe

Ala

130

135

140

Ser

Glu

Leu

Thr

Pro

Ala

His

Gly

His

Gly

Val

Arg

Gln

Gly

Ala

Gly

145

150

155

160

Pro

Val

Phe

Glu

Leu

Tyr

Arg

Asp

Tyr

Leu

Gly

Asp

Gln

Trp

Ser

Val

165

170

175

Gly

Asp

Trp

Ala

Gly

Leu

Val

Ala

Gln

Ala

Ser

Pro

Ala

Lys

180

185

190

Met

Ser

Leu

Phe

Lys

Met

Pro

Gly

Glu

Pro

Gln

Asn

Leu

Arg

195

200

205

Glu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Trp

Ala

Arg

Val

Phe

Glu

Gly

Thr

Val

Gly

210

215

220

Leu

His

Cys

Pro

His

Asp

Arg

Met

Leu

Ser

Gln

Val

Lys

Thr

Pro

Val

225

230

235

240

Leu

Ile

Thr

His

Ala

Arg

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Glu

Phe

245

250

255

Leu

Gly

Ala

Leu

Ser

Glu

Leu

Gln

Ala

Glu

Arg

Ala

Gln

Ala

Ile

260

265

270

Arg

Ala

Gly

Val

Pro

Val

Asp

Tyr

Gln

Ser

Phe

Pro

Asp

Ala

275

280

285

His

Ala

Met

His

Thr

Glu

Pro

Ala

Arg

Tyr

Ala

Val

Leu

Thr

290

295

300

Ala

Trp

Ala

Lys

Leu

Pro

Val

Ala

Asp

Thr

Ser

Pro

Ser

Ala

305 310 315 320

- 50 032685

Ala Ala Ser Ala His Val

325 <210> 16 <211> 987 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 1

<400> 16
atggccgaag	aaggaactag	gtccgaagca	gcggatgctg	ccacacaagc	gagacagcta	60
cccgattcgc	ggaacatctt	tgtctcgcac	cgatttccgg	aaaggcaggt	cgatctcggt	120
gaagtggtga	tgaacttcgc	ggaggcgggc	tctccggaca	acccggcact	gctcctcctc	180
cccgagcaga	ccgggtcgtg	gtggagttac	gagccagtga	tgggtcttct	ggcagagaac	240
tttcatgtct	ttgccgtcga	tatccgtggg	caaggtcgca	gtacctggac	gccacggcga	300
tacagcctgg	acaacttcgg	caatgatctg	gtgcgtttca	tcgctctggt	catcaagcgc	360
cctgtcgtcg	tggcagggaa	ctcctcgggg	gggctgctgg	ccgcctggct	ctcggcgtac	420
gcgatgcccg	gccagatccg	tgcagcattg	tgtgaggacg	caccgttctt	tgcgtcggag	480
ttggtccccg	catacggtca	ctcggttctg	caggcggcgg	gtccggcatt	cgagttgtac	540
cgggacttcc	tcggggacca	gtggtcgatt	ggggactgga	aagggttcgt	tgaggcagcc	600
aaagcgtcgc	cggcaaaggc	tatgcaatta	tttccgaccc	cggatgaggc	gccgcagaat	660
ctcaaggaat	acgacccgga	atgggggcgc	gcattcttcg	aagggactgt	ggcactgcac	720
tgcccacacg	acaggatgct	ctcgcaagtc	aagacaccaa	ttctcatcac	tcaccacgcg	780
cggacgatcg	accccgagac	gggcgagctg	ttgggcgcgc	tctccgacct	tcaggcagag	840
catgcgcagg	acatcattcg	gtctgcgggc	gttcgggtgg	actatcagtc	gcaccccgac	900
gcgcttcaca	tgatgcatct	gttcgatccc	gctcgttacg	cggagatctt	gacatcctgg	960
tccgcaacac	tgcctgcgaa	cgactag				987

<210> 17 <211> 987 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОРС была кодон-оптимизирована и, таким образом, отличалась от последовательности ДНК, встречающейся в природе.

<400> 17

- 51 032685

atggcagaag	aaggcacccg	tagcgaagca	gcagatgcag	caacccaggc	acgtcagctg	60
ccggatagcc	gtaacatttt	tgttagccat	cgttttccgg	aacgtcaggt	tgatctgggt	120
gaagttgtta	tgaattttgc	agaagcaggt	agtccggata	atccggcatt	actgctgctg	180
ccggaacaga	ccggtagttg	gtggtcttat	gaaccggtta	tgggtctgct	ggcagaaaac	240
tttcatgttt	ttgcagttga	tattcgtggt	cagggtcgta	gcacctggac	accgcgtcgt	300
tatagcctgg	ataattttgg	taatgatctg	gtgcgtttta	ttgccctggt	tattaaacgt	360
ccggttgttg	ttgcaggtaa	tagcagcggt	ggcctgctgg	ctgcatggct	gagcgcctat	420
gcaatgcctg	gtcagattcg	tgcagcactg	tgtgaagatg	caccgttttt	tgcaagcgaa	480
ctggttcctg	cctatggtca	tagcgttctg	caggcagcag	gtccggcatt	tgaactgtat	540
cgtgattttc	tgggtgatca	gtggtcaatt	ggtgattgga	aaggttttgt	tgaagcagca	600
aaagcaagtc	cggctaaagc	aatgcagctg	tttccgacac	cggatgaagc	accgcagaat	660
ctgaaagaat	atgatccgga	atggggtcgt	gcattttttg	aaggcaccgt	tgcactgcat	720
tgtccgcatg	atcgtatgct	gagccaggtt	aaaaccccga	ttctgattac	ccatcatgca	780
cgtaccatcg	atccggaaac	cggtgaactg	ctgggtgcac	tgagtgatct	gcaggccgaa	840
catgcacagg	atattattcg	tagtgccggt	gttcgtgttg	attatcagag	ccatcctgat	900
gcactgcaca	tgatgcacct	gtttgatccg	gcacgttatg	cagaaattct	gaccagttgg	960
agcgcaaccc	tgcctgcaaa	tgattaa				987

<210> 18 <211> 927 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 2 <400> 18

atggcagatc	cggcacagcg	tgatgtttat	gttccgcatg	catatccgga	aaaacaggca	60
gatctgggtg	aaattaccat	gaattatgcc	gaagccggtg	aacctgatat	gcctgcagtt	120
ctgctgattc	cggaacagac	cggtagttgg	tggggttatg	aagaagcaat	gggtctgctg	180
gcagaaaact	ttcatgttta	tgcagttgat	ctgcgtggtc	agggtcgtag	cagctgggca	240
ccgaaacgtt	atagcctgga	taattttggt	aatgatctgg	tgcgttttat	tgccctggtt	300
gttaaacgtc	cggttattgt	tgcaggtaat	agcagcggtg	gtgttctggc	agcatggctg	360

- 52 032685

agcgcatata	gcatgcctgg	tcaggttcgt	ggtgcactgt	gtgaagatgc	accgtttttt	420
gcaagcgaac	tggttaccac	ctgtggtcat	agcattcgtc	aggcagcagg	tccgatgttt	480
gaactgtttc	gtacctatct	gggcgatcag	tggtcagttg	gtgattggac	cggctattgt	540
cgtgcagcag	atgcaagcag	cagcccgatg	gcacgttatt	ttgttgcaga	tgaaattccg	600
cagcacatgc	gtgaatatga	tccggaatgg	gcacgtgcat	tttgggaagg	caccgttgca	660
ctgcattgtc	cgcatgaaca	gctgctgacc	caggttaaaa	caccggtgct	gctgacacat	720
cacatgcgcg	atattgatcc	tgataccggt	catctggttg	gtgccctgag	tgatgaacag	780
gcagcccgtg	cacgtctgct	gatggaaagt	gccggtgtta	aagttgatta	tgcaagcgtt	840
ccggatgcac	tgcacatgat	gcaccagttt	gatccgcctc	gttatgttga	aatctttacc	900
cagtgggcag	caaccctggc	agcataa				927
<210> 19 <211> 930 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> ОРС	была кодон-	-оптимизирована и, таким образом,	отличалась

от последовательности ДНК, встречающейся в природе.

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 3

<400> 19
atggttacca	gtccggcact	gcgtgatgtt	catgttccgc	atgcatatcc	ggaacagcag	60
gttgatctgg	gtgaaattac	catgaattat	gccgaagccg	gtgatccggg	tcgtccggca	120
gttctgctga	tcccggaaca	gaccggtagt	tggtggtctt	atgaagaagc	aatgggtctg	180
ctggcagaac	attttcatgt	ttatgcagtt	gatctgcgtg	gtcagggtcg	tagcagctgg	240
accccgaaac	gttatagcct	ggataatttt	ggtaatgatc	tggtgcgttt	tattgccctg	300
gttgttcgtc	gtccggttgt	tgttgcaggt	aatagcagcg	gtggtgttct	ggcagcatgg	360
ctgagcgcat	atagcatgcc	tggtcagatt	cgtggtgtgc	tgtgtgaaga	tccgcctttt	420
tttgcaagcg	aactggttcc	ggcacatggt	catagcgttc	gtcagggtgc	aggtccggtt	480
tttgaactgt	ttcgtaccta	tctgggcgat	cagtggtcag	ttggtgattg	ggaaggtttt	540
cgtagcgcag	cagatgcaag	cgcaagcccg	atggcacgta	gctttgttgc	agataccatt	600
ccgcagcatc	tgaaagaata	tgatccggaa	tgggcacgtg	cattttatga	aggcaccgtt	660
ggtctgaatt	gtccgcatga	acgtatgctg	aatcgtgtta	atacaccggt	gctgctgacc	720
catcacatgc	gtggcaccga	tccggaaacc	ggtaatctgc	tgggtgcact	gagtgatgaa	780

- 53 032685 caggcagcac aggtgcgtcg tctgatggaa agtgccggtg ttaaagttga ttatgaaagc gttccggatg caagccacat gatgcaccag agcgatccgg cacgttatgc agaaattctg accccgtgga ccgcagcact ggcaccgtaa

840

900

930 <210> 20 <211> 930 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 4 <400> 20

atggttacca	gtccggcact	gcgtgatgtt	catgttccgc	atgcatatcc	ggaacagcag	60
gttgatctgg	gtgaaattac	catgaattat	gccgaagccg	gtgatcctga	tcgtccggca	120
gttctgctga	tcccggaaca	gaccggtagt	tggtggtcat	atgaagaagc	aatgggtctg	180
ctggcagaac	attttcatgt	ttatgcagtt	gatctgcgtg	gtcagggtcg	tagcagctgg	240
accccgaaac	gttatagcct	ggataatttt	ggtaatgatc	tggtgcgttt	tattgccctg	300
gttgttaaac	gtccggttgt	tgttgcaggt	aatagcagcg	gtggtgttct	ggcagcatgg	360
ctgagcgcat	atagcatgcc	tggtcagctg	cgtggtgtgc	tgtgtgaaga	tccgcctttt	420
tttgcaagcg	aactggttcc	ggcacatggt	catagcgttc	gtcagggtgc	aggtccggtt	480
tttgaactgt	ttcgtaccta	tctgggcgat	cagtggtcag	ttagcgattg	ggaaggtttt	540
tgtcgtgcag	ccggtgcaag	cgcaagcccg	atggcacgta	gctttgttgc	agatggtatt	600
ccgcagcatc	tgaaagaata	tgatccggaa	tgggcacgtg	catttcatga	aggcaccgtt	660
ggtctgaatt	gtccgcatga	acgtatgctg	ggtcgtgtta	atacaccggt	gctgctgacc	720
catcatatgc	gtggcaccga	tccggaaacc	ggtaatctgc	tgggtgcact	gagtgatgaa	780
caggcagcac	aggcacgtct	gctgatggaa	agtgccggtg	ttcgtgttga	ttatgaaagc	840
gttccggatg	caagccatat	gatgcaccag	agcgatccgg	cacgttatgc	agaaatcttt	900
acccgttggg	cagcagccct	ggcaccgtaa				930

<210> 21 <211> 930 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОРС была кодон-оптимизирована и, таким образом, отличалась

- 54 032685 от последовательности ДНК, встречающейся в природе.

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 5

<400> 21
atggttacca	gtccggcact	gcgtgatgtt	catgttccgc	atgcatatcc	ggaacagcag	60
gttgatctgg	gtgaaattac	catgaattat	gccgaagccg	gtgatccggg	tcgtccggca	120
gttctgctga	tcccggaaca	gaccggtagt	tggtggtctt	atgaagaagc	aatgggtctg	180
ctggcagaac	attttcatgt	ttatgcagtt	gatctgcgtg	gtcagggtcg	tagcagctgg	240
accccgaaac	gttatagcct	ggataatttt	ggtaatgatc	tggtgcgttt	tatggcactg	300
gttgttcgtc	gtccggttgt	tgttgcaggt	aatagcagcg	gtggtgttct	ggcagcatgg	360
ctgagcgcat	atagcatgcc	tggtcagatt	cgtggtgtgc	tgtgtgaaga	tccgcctttt	420
tttgcaagcg	aactggttcc	ggcacatggt	catagcgttc	gtcagggtgc	aggtccggtt	480
tttgaactgt	ttcgtaccta	tctgggcgat	cagtggtcag	ttggtgattg	ggaaggtttt	540
cgtagcgcag	ccggtgcaag	cgcaagcccg	atggcacgta	gctttgttgc	agataccatt	600
ccgcagcatc	tgaaagaata	tgatccggaa	tgggcacgtg	cattttatga	aggcaccgtt	660
ggtctgaatt	gtccgcatga	acgtatgctg	aatcgtgtta	atacaccggt	gctgctgacc	720
catcacatgc	gtggcaccga	tccggaaacc	ggtaatctgc	tgggtgcact	gagtgatgaa	780
caggcagcac	aggcacgtcg	tctgatggaa	agtgccggtg	ttaaagttga	ttatgaaagc	840
gttccggatg	caagccacat	gatgcaccag	agcgatccgg	cacgttatgc	agaaattctg	900
accccgtggg	cagcagccct	ggcaccgtaa				930

<210> 22 <211> 930 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 6 <400> 22

atggttacca	gtccggcact	gcgtgatgtt	catgttccgc	atgcatatcc	ggaacagcag	60
gttgatctgg	gtgaaattac	catgaattat	gccgaagccg	gtgatcctga	tcgtccggca	120
gttctgctga	tcccggaaca	gaccggtagt	tggtggtctt	atgaagaagc	aatgggtctg	180

- 55 032685

ctgagcgaac	attttcatgt	ttatgcagtt	gatctgcgtg	gtcagggtcg	tagcagctgg	240
accccgaaac	gttatagcct	ggataatttt	ggtaatgatc	tggtgcgttt	tattgccctg	300
gttgttaaac	gtccggttgt	tgttgcaggt	aatagcagcg	gtggtgttct	ggcagcatgg	360
ctgagcgcat	atagcatgcc	tggtcagctg	cgtggtgtgc	tgtgtgaaga	tccgcctttt	420
tttgcaagcg	aactggttcc	ggcacatggt	catagcgttc	gtcagggtgc	aggtccggtt	480
tttgaactgt	ttcgtaccta	tctgggcgat	cagtggtcag	ttggtgattg	ggaaggtttt	540
tgtcgtgcag	ccggtgcaag	cgcaagcccg	atggcacgta	gctttgttgc	agatggtatt	600
ccgcagcatc	tgcaagaata	tgatccggaa	tgggcacgtg	ttttttatga	aggcaccgtt	660
ggtctgagct	gtccgcatga	acgtatgctg	ggtcaggtta	aaacaccggt	gctgctgacc	720
catcacatgc	gtggtatcga	tccggaaacc	ggtaatctgc	tgggtgcact	gagtgatgaa	780
caggccctgc	gtgcacgtcg	tctgatggat	agtgccggtg	ttaccgttga	ttatgaaagc	840
gttccggatg	caagccacat	gatgcaccag	agcgcaccgg	cacgttatgt	tgaaatcttt	900
acccgttggg	cagcagccct	ggcaccgtaa				930

<210> 23 <211> 903 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 7 <400> 23

atgccgcacg	attatgaaga	aaaactggtt	gatctgggcg	aaatcgatct	gaattatgca	60
gaagcaggta	gtccggataa	accggcactg	ctgctgattc	cgagccagag	cgaaagttgg	120
tggggctatg	aagaagcaat	gggtctgctg	gccgaagatt	atcatgtttt	tgcagttgat	180
atgcgtggtc	agggtcgtag	cacctggaca	ccgggtcgtt	atagcctgga	taattttggt	240
aatgatctgg	tgcgctttat	cgatctggtt	attggtcgta	ccgttattgt	tagcggtaat	300
agcagcggtg	gtgttgttgc	agcatggctg	gcagcattta	gcctgcctgg	tcaggttcgt	360
gcagcactgg	cagaagatgc	accgtttttt	gcaagcgaac	tggacccgaa	agtgggtcat	420
accattcgtc	aggcagcagg	tcatattttt	gttaactggc	gtgattatct	gggtgatcag	480
tggtcagttg	gtgattatgc	aggttttctg	aaagcaatga	aaagcagcga	agttccgatg	540
ctgcgtcagg	ttccgctgcc	ggaaaccgca	ccgcagaatc	tgctggaata	tgatccggaa	600

- 56 032685 tgggcacgtg cattttatga aggcaccgtt gcacagacct gtccgcatga ttatatgctg 660 agccaggtta aagtgcctat gctggttacc catcatgcac gtatgattga tgaagcaacc 720 agcggtctgg ttggtgcaat gagcgatctg caggttcaga aagcagcaga aattattcgt 780 ggcaccggtg ttcaggttga tgttgttgat ctgccggaag caccgcatat tctgcatcag 840 ctggcaccga aagaatatgt ggaaattctg aataactggg tggaaaaact gcctccggtt 900 taa 903 <210> 24 <211> 924 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 8 <400> 24

atgatccaga	acaataaaac	cgcaccgtat	aaatacaaag	aaaaactggt	tgatctgggc	60
gaaatcaaaa	tgaactatat	tgttgccggt	gcagatgtta	gtccggcact	gctgctgatt	120
ccgggtcaga	ccgaaagttg	gtggggtttt	gaagcagcaa	ttgagaaact	ggaaagcaac	180
tttcaggtgt	ttgcaattga	tctgcgtggt	cagggtaaaa	gcacccagac	accgggtcgt	240
tatagcctga	atctgatggg	taatgatctg	gttcgtttta	ttagcctggt	tattaaacgt	300
ccggttattg	ttagcggtaa	tagcagcggt	ggtctgctgg	cagcatggct	gagcgcctat	360
gcaatgccga	atcagattcg	tgcaattcat	tgtgaagatg	caccgttttt	taccgcagaa	420
aaagcaccgc	tgtatggtca	tgcaattcag	caggcagcag	gtccgatttt	tagcctgatg	480
agcaaatttc	tgggtgatca	gtggtcaatt	aacaattggg	aaggtctgaa	agcagcacag	540
gcaaaagata	cccatccggc	aaacaaaatg	attagccagg	ttgaacagcc	tccgcagcat	600
ctgaaagaat	atgatccgga	atggggtcgt	gcatttattg	aaggcaaatt	taacctgaac	660
agtccgcatc	ataccctgct	gagcgacatt	aaaaccccga	tgctgtatac	ccatcacatg	720
cgttttgaag	atccgcagac	aggtctgctg	attggtgcaa	ccagcgattt	tcaggcaagc	780
aaaatcaaag	aaattgccct	gaaaaccggc	aatagcttcg	aactgattga	tgcaccggat	840
gcatttcata	gtatgcatga	agccgatccg	cagcgttttg	ttgatattct	gaccagctgg	900
attgaacgtc	tgaatctgca	gtaa				924

- 57 032685 <210> 25 <211> 966 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 9 <400>25 atgggtatta gcgaagcagc agatcgtgca gatacctttg ttgcacataa atttgaagaa60 cagctggttg atctgggtga aattcgtatg aattatgttg cagccggtga tccgaccagt120 ccggcactgc tgctgattcc ggcacagggt gaaagttggt ggggttatga aaatgcaatt180 accctgctgg caaatgattt tcgtgttttt gcaattgatc tgcgtggtca gggtcgtagc240 acctggacac cgggtcgtta taatctgaat acctggggta atgatgtgga acgctttatt300 gatctggtta ttggtcgtcc gaccctggtt gcaggtaata gcagcggtgg tgttattgca360 gcatggctgg cagcctatgc aaaaccgggt cagattcgtg gtgcaatgct ggaagatccg420 cctctgtttg caagccaggc agcaccgcct tatggtccgg gtattatgca gaccctgggt480 ccgatttttg ttctgtgggc aaaatggctg ggtccgcagt ggtcagttgg tgattgggat540 ggtatggttg cagcggcacc gcgtgaactg ccggaatttc tgcatccggg tatcgcattt600 ctgtttggtg atggcaccgg tgaaggtgca gcagcaaccc ctccgcagca tctgaaagaa660 tatgatccgg aatgggcaca ggcatgggca accgatgttg caaatgcagg ttgtgatcat720 gcaaccatgc tggcacagaa tcgtgttccg gttctgctga cccatcattt tcatctgacc780 gatccggata caggccagct gatgggtgca atgaccgata ttcaggcaca gcaggcacgt840 cgtctgctgg cagcaaccgg tcagccggtt acctttaccg cactggatgc accgcatacc900 atgcatgatc ctgaacctga acgttatttt gaagttctga ccgaatgggc aagtgcactg960 gattaa966 <210> 26 <211>960 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature

- 58 032685 <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 10

<400> 26
atgggtcgtt	atgccggtgt	ttttggtccg	catgcaccgg	aaagcaccta	tgttggtcat	60
gcatatccgg	aacaactgtt	tgataccggt	gaagttcgtc	tgaattatgc	agttgccggt	120
gatgcaagcg	caagtccgct	gctgctgatt	ccgggtcaga	ccgaaagttg	gtggggttat	180
gaaccggcaa	tgggtctgct	ggcagaacat	tttcatgttc	atgcagttga	tctgcgtggt	240
cagggtcgta	gcacccgtac	accgcgtcgt	tataccctgg	ataatattgg	taatgatctg	300
gtgcgttttc	tggatggtgt	tattggtcgt	ccggcatttg	ttagcggtct	gagcagcggt	360
ggtctgctga	gcgcatggct	gagcgccttt	gcagaaccgg	gtcaggttct	ggcagcatgt	420
tatgaagatc	cgcctttttt	tagcagcgaa	ctggacccgg	tgattggtcc	gggtctgatg	480
agcaccgttg	gtccgctgtt	tgcactgtat	gttaaatatc	tgggtgatca	gtggtcaatt	540
ggtgattggg	atggttttgt	tgcaggcgca	ccgcaagaac	tggcaggttg	gcaggcacat	600
gttgcactgg	caggcggtac	agcagaaccg	cctcagcatc	tgaaagaata	tgatccggaa	660
tggggtcgtg	catttgttgg	tggcaccttt	accaccggtt	gtccgcatca	ggttatgctg	720
agccaggtta	aagttccggt	tctgtttacc	catcattttc	gtatgctgga	tgatgaaagc	780
ggtagcctga	ttggtgcagc	aaccgatgat	caggcagcac	gtgttgttga	actggttgaa	840
aatagtggtg	caccgctgac	ctatcgtagc	tttccgatga	tgggtcatag	tatgcatgca	900
caagatccgg	cactgtttgc	aggcaccctg	gttgattggt	ttaccgcagc	acgtagctaa	960

<210> 27 <211> 960 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 11 <400> 27

atgggtcgtt	atgccggtgt	ttttggtccg	catgcaccgg	aagcaaccta	tgttgaacat	60
ggttatccgg	aacgtctgtt	tgataccggt	gaagtgcagc	tgaattatgt	tgttgccggt	120
gatgcagcag	caccgcctct	gctgctgatt	ccgggtcaga	gcgaaagttg	gtggggttat	180
gaagcagcaa	ttccgctgct	ggcacgtcat	tttcatgttc	atgcagttga	tctgcgtggt	240
cagggtcgta	gcacccgtac	accgggtcgc	tataccctgg	ataatgttgg	taatgatctg	300

- 59 032685

gtgcgttttc	tggatggtgt	tattggtcgt	ccggcatttg	ttagcggtct	gagcagcggt	360
ggtctggcaa	gcgcatggct	gagcgcattt	gcaaaaccgg	gtcaggttgt	tgcagcatgt	420
tgggaagatc	cgcctttttt	tagcagcgaa	accgcaccga	ttgttggtcc	gcctattacc	480
gatagcattg	gtccgctgtt	tggtatgtgg	gcacgttatc	tgggtgatca	gtggtcagtt	540
ggtgattggg	atggttttgt	tgccgcagtt	ccgaccgaac	tggcagattg	gcaggcacat	600
gttgcactgg	ttgttggcac	cgcagatcct	ccgcagaatc	tgcgtgaata	tgatccggaa	660
tggggtaaag	catttattac	cggcaccttt	gcagcaagct	gtccgcatca	tgttatgctg	720
agcaaagtta	aagttccggt	tctgtatacc	catcactttc	gcatgattga	tgaaggtagt	780
ggtggtctga	ttggtgcatg	tagcgatatt	caggcaggtc	gtgttaccca	gctggcaaaa	840
tcaggtggtc	gtagcgttac	ctatcgtagc	tttccgatga	tggcacatag	catgcatggt	900
caagatccgg	cactgtttag	cgaaaccctg	gttgaatggt	ttagccgttt	taccggttaa	960

<210> 28 <211> 969 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 12

<400> 28
atgccgaaaa	gcgaagcagc	agatcgtgca	gatagctttg	ttagccatga	tttcaaagaa	60
aacattgtgg	atctgggcga	aatccgcatg	aattatgttg	ttcagggcaa	caaaaaaagt	120
ccggcactgc	tgctgattcc	ggcacagggt	gaaagttggt	ggggttatga	agcagcaatt	180
ccgctgctgg	caaaacattt	tcaggttttt	gcaattgatc	tgcgtggtca	gggtcgtacc	240
acctggacac	cgggtcgtta	taccctggat	atttttggta	atgatgtggt	gcgctttatc	300
gatctggtta	ttggtcgtga	aaccctgatt	gcaggtaata	gcagcggtgg	tctgattggt	360
gcatggctgg	cagcatttgc	aaaaccgggt	caggttcgtg	cagttatgct	ggaagatccg	420
cctctgtttg	caagcgaaat	tcgtccgcct	tatggtccgg	gtatttggca	gggtctgggt	480
ccgatgtttg	cagcatgggc	aaaatggctg	ggtccgcagt	ggtcaattgg	tgattgggat	540
ggtatggtta	aagcactgcc	ggatgaactg	ccggaagatc	tgctgcctgg	tattggtttt	600
atgctgggtg	atggtgaaag	tgatggtgca	gcaccgaccc	ctccgcagca	tctgaaagaa	660
tatgatccgg	aatggggtgc	aagctgggca	agcggttttg	ccaataccgg	ttgtgaacat	720

- 60 032685 gaagcagtta ttagccaggt gcgtgttccg gttctgctga cccatcattt tcgtcagatt 780 aatgaagaaa ccggtcatct gatgggtgca ctgagcgatc tgcaggcagc acaggttcgt 840 catatcattg aagaagttgc aggtcaagag gttacctatg ttagcctgga tgcaccgcat 900 accatgcatg aaccgcagcc ggaacgttat accgatgttc tgctggattg ggttaaaaaa 960 ctgggttaa 969 <210> 29 <211> 987 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 13 <400> 29

atgaattatg	caaccgcagg	tagcagcgat	aaaccggcac	tgctgctggt	tccgggtcag	60
agcgaaagtt	ggtggggtta	tgaaatggca	atgtggctgc	tgaaagatga	ttatcaggtt	120
tttgcagttg	atatgcgtgg	tcagggtcag	agtacctgga	caccgggtcg	ttatagcctg	180
gatacctttg	gtaatgatct	ggtgaaattc	atcgatatcg	tgattaaacg	tccggttgtt	240
gttagcggtc	tgagcagcgg	tggtgttgtg	agcgcatggc	tgagcgcatt	tgcaaaacct	300
ggtcagattc	gtgcagcagt	ttatgaagat	ccgcctctgt	ttgcaagcca	gagcaaaccg	360
gcaattggtc	agagtgttat	gcagaccgtt	gcaggtccgt	tttttaacct	gtggtataaa	420
tggctgggtg	cacagtggac	cattggtgat	caggcaggta	tggttgcagc	aatgccgaaa	480
gaaattccgg	catggattct	gcagtatctg	ggtaatacca	ccagtggtcc	gaccggtctg	540
gatctgacac	tgaatgaata	tgatccggaa	tggggtcatg	gttttgttag	tggcaccgtt	600
gatgcaacct	gtgatcatga	agcaatgctg	acccatgtta	aagttccggt	tctgtttacc	660
catcatagcc	gtgcaattga	tccgtatacc	ggtaatctga	ttggtagcgt	tagcgatacc	720
caggttagct	atgcacaggg	tctgattacc	accaatggca	atcagagctt	taccctgaaa	780
aactttccgc	tggcaagcca	tgatatgcat	aattctgatc	cggcaaccta	tgttagcgca	840
attaccacct	ggatggcaag	cctgggtatt	ggtagtgcag	ttattccggg	tccggttaaa	900
gttgcaagcg	caagcgcaca	ggttagcgca	gcaagcaccg	caccgcctag	ctgtaccagc	960
accagcgcac	cgagcaccgg	tcattaa				987

<210> 30

- 61 032685 <211> 843 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 14 <400> 30

atgaccgttg	ttgatccgcc	tgcaccgcgt	gattttccgg	aactgctggt	tgatctgggt	60
gaagttgttc	tgaatcatgc	agaagcaggt	agtccggatc	gtccggcact	ggttccggtg	120
ccggaacagg	gtggtagttg	gtggtcttat	gaacgtgtta	tgccgctgcc	tgcacgcgat	180
tttcatgttt	ttgcagttga	tctgcgtggt	cgtggtcgta	gcacccgtac	accgcgtcgt	240
tatagcctgg	atgattttgg	taatgatctg	gttcgttttc	tggccctggt	tgttcgccgt	300
ccggcagttg	ttgcaggtaa	tagcagcggt	ggtgttctgg	cagcatggtc	aagcgcctat	360
gcaatgcctg	gtcaggttcg	tgcagttctg	ctggaagatc	cgcctctgtt	tagcagcgaa	420
ctgacaccgg	tttgtggtcc	gggtgttcgt	caggcagcag	gtccgctgtt	tgaactgctg	480
agcacccatc	tgggcgatca	gtggggtggt	ggtcgtccgg	gtcgtgttca	tggtggcgtt	540
ccgcgtctgg	gtctggcagc	cgcagcagca	gttcgtgttg	cacgtcgtgc	agcagcaacc	600
gatgcacgtg	gtcgccctgg	tgcagcacgt	ggacgtcctg	ccggtgttgg	tggtgcagct	660
cgtcgcggtc	gcggtggtcg	tgaacgcacc	ggtacaacca	ccgttctgag	cggtctgacc	720
ggtagccgta	ccagcggcac	cggtcgttgt	cgtaaaccgt	ttcgtctgcg	tcagtggtgg	780
gcaggcggtg	cccgtggtcc	tcctccgcct	cgtcagattc	gcgcagatgt	tcgtacccgt	840

taa 843 <210> 31 <211> 981 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> misc_feature <223> Искусственная последовательность ДНК, кодирующая полипептид с SEQ ID NO: 15 <400> 31 atgagcgttc aaacaaattg ccggcattac cggttacccc atctgggtga tgctgctgcc gagcgcacgt agtggttctg ggaacagacc aatgtttttg aattatgcag ggtagttggt ttccgcatgc aagcaggtac ggtcttatga atttccagag accggataaa accggcaatg

120

180

- 62 032685

ggtctgctgg	cagaacattt	tcatgttttt	gcagttgatc	tgcgtggtca	gggtcgtagc	240
acctggacac	cgggtcgtta	tagcctggat	aattttggta	atgatctggt	gcgttttatt	300
gcactggcaa	ttcgtcgtcc	ggttgttgtt	gcaggttgta	gcagcggtgg	tgttctggca	360
gcatggctga	gcgcctatgc	actgcctggt	cagattcgtg	gtgcactgtg	tgaagatgca	420
ccgctgtttg	caagcgaact	gacaccggca	catggtcatg	gtgttcgtca	gggtgcaggt	480
ccggtttttg	aactgtatcg	tgattatctg	ggcgatcagt	ggtcagttgg	tgattgggca	540
ggtctggttg	cagcagcaca	ggcaagtccg	gcaaaaatga	tgagcctgtt	taaaatgcct	600
ggtgaaccgc	ctcagaatct	gcgtgaatat	gatccggaat	gggcacgtgt	tttttttgaa	660
ggcaccgttg	gtctgcattg	tccgcatgat	cgtatgctga	gccaggttaa	aacaccggtt	720
ctgattaccc	atcatgcacg	taccaccgat	ccggaaaccg	gtgaatttct	gggtgcactg	780
agcgaactgc	aggcagaacg	tgcacaggcc	attattcgtg	cagccggtgt	tccggttgat	840
tatcagagct	ttccggatgc	agcacatgca	atgcatacca	cagaaccggc	acgttatgca	900
gcagttctga	ccgcatgggc	agcaaaactg	cctccggttg	cagataccag	cccgtcagca	960
gcagcaagcg	cacatgttta	a				981

<210> 32 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(7) <400> 32

Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly

5

<210> <211> <212> <213>

33 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	33

- 63 032685

Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	34 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	34

Asp Ala Leu His Met Met His

1	5
<210> <211> <212> <213>	35 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	35

Ala Gly Asp Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	36 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	36

Ala Gly Asp Ser Ser Leu Gly

1	5
<210>	37

- 64 032685

<211> <212> <213>

7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	37

Ala Gly Gln Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	38 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	38

Ala Gly His Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	39 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	39

Ala Gly Ser Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	40 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

- 65 032685

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	40

Ser Gly Asn Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	41 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	41

Ser Gly Asp Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	42 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	42

Ser Gly Gln Ser Ser Gly Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	43 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>

ПЕПТИД (1)..(7)

- 66 032685 <400>43

Ser Gly His Ser Ser Gly Gly <210>44 <211>7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(7) <400>44

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly <210>45 <211>7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(7) <400>45

Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr <210>46 <211>7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(7) <400> 46

Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr

5

- 67 032685

<210> <211> <212> <213>

47 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	47

Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	48 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	48

Arg Gly Ile Asp Pro Glu Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	49 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	49

Asp Ala Leu His Met Met His

1	5
<210> <211> <212> <213>	50 7 ПРТ Искусственная последовательность

<220>

- 68 032685

<223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(7)
<400>	50

Asp Ala Ser His Met Met His

1	5
<210> <211> <212> <213>	51 11 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(11)
<400>	51

Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Leu Leu

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	52 11 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(11)
<400>	52

Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Leu

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	53 11 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>

ПЕПТИД (1)..(11)

- 69 032685 <400>53

His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu

510 <210>54 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(11) <400>54

His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His

510 <210>55 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(11) <400>55

His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn

510 <210>56 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(11) <400> 56

His Pro Asp Ala Leu His Met Met His Leu Phe

5 10

- 70 032685 <210> 57 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(11) <400>57

Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His Gln Phe

510 <210>58 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(11) <400>58

Val Pro Asp Ala Ser His Met Met His Gln Ser

510

<210> <211> <212> <213>

59 21 ПРТ Искусственная последовательность

<220> <223>

аминокислотный мотив

<220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(21) <400>59

Ile Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Leu Leu

5 1015

Ala Ala Trp Leu Ser <210> 60

- 71 032685 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(21) <400> 60

Val Lys Arg Pro Val Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Leu

5 10 15

Ala Ala Trp Leu Ser

<210>	61
<211>	21
<212>	ПРТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	аминокислотный мотив

<220>
<221>	ПЕПТИД
<222>	(1)..(21)	1
<400>	61
Val Arg	Arg Pro	Val	Val Val Ala Gly Asn Ser	Ser Gly Gly Val Leu
1		5	10	15

Ala Ala Trp Leu Ser

<210>	62
<211>	21
<212>	ПРТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	аминокислотный мотив

<220>
<221>	ПЕПТИД
<222>	(1)..(21)	1
<400>	62
Val Lys	Arg Pro	Val	Val Val Ala Gly Asn Ser	Ser Gly Gly Val Leu
1		5	10	15

- 72 032685

Ala Ala Trp Leu Ser <210> 63 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(21) <400>63

Ile Leu Ile Thr His His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu

5 1015

Leu Leu Gly Ala Leu <210>64 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(21) <400>64

Val Leu Leu Thr His His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His

5 1015

Leu Val Gly Ala Leu <210>65 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> аминокислотный мотив <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(21)

- 73 032685 <400> 65

Val Leu Leu Thr His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn

5 10 15

Leu Leu Gly Ala Leu

<210>	66
<211>	21
<212>	ПРТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	аминокислотный мотив

<220>
<221>	ПЕПТИД
<222>	(1)..(21)
<400>	66
Val Leu	Leu Thr	His His	Pro Asp Ala Leu His Met Met	His Leu Phe
1		5	10	15

Leu Leu Gly Ala Leu

<210>	67
<211>	21
<212>	ПРТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	аминокислотный мотив

<220>
<221>	ПЕПТИД
<222>	(1)..(21)
<400>	67
Val Asp	Tyr Gln	Ser His	Pro Asp Ala Leu His Met Met	His Leu Phe
1		5	10	15

Asp Pro Ala Arg Tyr

<210> <211> <212> <213>

68 21 ПРТ Искусственная последовательность

<220>

- 74 032685

<223>

аминокислотный мотив

<220> <221> <222>	ПЕПТИД (1)..(21)
<400>	68

Val Asp Tyr Ala Ser Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His

5 10

Gln Phe

Asp Pro Pro Arg Tyr <210> 69 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность

<220>
<221>	ПЕПТИД
<222>	(1)..(21)
<400>	69
Val Asp	Tyr Glu	Ser Val	Pro Asp Ala Ser His Met Met	His Gln Ser
1		5	10	15

Ala Pro Ala Arg Tyr

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид, способный расщеплять зеараленон и по меньшей мере одно производное соединение зеараленона, представляющий собой гидролазу с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или ее функциональный вариант, причем последовательность функционального варианта идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 84%.
2. Полипептид по п.1, содержащий по меньшей мере один консервативный участок или его функциональный вариант, причем аминокислотная последовательность варианта идентична по меньшей мере на 84%, более предпочтительно по меньшей мере на 92% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% и по меньшей мере один консервативный участок аминокислотной последовательности выбран из группы: от +24 до +50, от +52 до +77, от +79 до +87, от +89 до +145, от +150 до +171, от +177 до +193, от +223 до +228, от +230 до +237, от +239 до +247, от +249 до +255, от +257 до +261, от +263 до +270, от +272 до +279, от + 297 до +301, от +303 до +313, от +24 до 328, от +1 до +328 последовательности SEQ ID NO: 1.
3. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что функциональный вариант характеризуется модификацией аминокислот, выбранной из замен, делеций и инсерций соответственно одной или нескольких аминокислот.
4. Полипептид по любому из пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что имеет удельную активность, равную по меньшей мере 0,01 ед./мг, преимущественно по меньшей мере 0,1 ед./мг и предпочтительно по меньшей мере 1 ед./мг, и/или имеет константу K_M гидролитического расщепления зеараленона, равную не более 50 мкМ, преимущественно не более 3,5 мкМ и предпочтительно не более 0,5 мкМ, и/или имеет константу k_cat гидролитического расщепления зеараленона, равную по меньшей мере 0,05 с^-1, преимущественно по меньшей мере 0,6 с^-1 и предпочтительно по меньшей мере 5 с^-1, и/или имеет константу v_max гидролитического расщепления зеараленона, равную по меньшей мере 0,00001 мкМ^-1ю^-1, преимущественно по меньшей мере 0,0001 мкМ^-1ю^-1 и предпочтительно по меньшей мере 0,001 мкМ'¹-с’¹.

- 75 032685
5. Полипептид по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что обладает наиболее высокой ферментативной активностью в температурном интервале от 30 до 75°C, предпочтительно от 38 до 55°C и особенно предпочтительно от 38 до 52°C.
6. Полипептид по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что является термически стабильным до температуры 90°C, предпочтительно 75°C и особенно предпочтительно 60°C.
7. Полипептид по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что имеет по меньшей мере одну мутацию в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере в одной из позиций, выбранных из 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114,

118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194,

196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233,

238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284,

285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311, 314, 317, 319, 321, 323, 325 и 326.
8. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что он имеет по меньшей мере одну мутацию в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, выбранную из D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, Р72Е, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A и A326P.
9. Полипептид по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере один из аминокислотных мотивов, выбранных из группы последовательностей SEQ ID NO: 32-69.
10. Полипептид по п.8, отличающийся тем, что полипептид содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты по меньшей мере в одной позиции, причем указанная замена аминокислоты выбрана из замен G на A или A на G, S, или V на I, L, A, T, S, или I на V, L, M, или L на I, M, V, или M на L, I, V, или P на A, S, N, или F на Y, W, H, или Y на F, W, H, или W на Y, F, H, или R на K, E, D, или K на R, E, D, или H на Q, N, S, или D на N, E, K, R, Q, или E на Q, D, K, R, N, или S на T, A, или T на S, V, A, или C на S, T, A, или N на D, Q, H, S, или Q на E, N, H, K, R.
11. Добавка к кормам для свиней, домашней птицы или аквакультуры, к пищевым продуктам или к высушенной барде, способная гидролитически расщеплять зеараленон или по меньшей мере одно его производное, где добавка содержит по меньшей мере один полипептид по любому из пп.1-10 и вспомогательное вещество, включающее инертный носитель.
12. Добавка по п.11, отличающаяся тем, что вспомогательное вещество выбрано по меньшей мере из одного инертного носителя, а также при необходимости из других компонентов, таких как витамины, и/или минеральные вещества, и/или ферменты, и/или другие компоненты для детоксификации микотоксинов.
13. Добавка по п.11 или 12, отличающаяся тем, что содержит указанный полипептид по любому из пп.1-10 в концентрации не более 10000 ед./г, предпочтительно не более 1000 ед./г, более предпочтительно не более 100 ед./г и наиболее предпочтительно не более 10 ед./г.
14. Добавка по любому из пп.11-13, отличающаяся тем, что добавка находится в капсулированной или покрытой форме.
15. Применение добавки по любому из пп.11-14 для гидролитического расщепления зеараленона или по меньшей мере одного его производного в кормах, предпочтительно кормах для свиней, домашней птицы и аквакультуры, в пищевых продуктах или в высушенной барде.
16. Способ гидролитического расщепления зеараленона или по меньшей мере одного его производного, обеспечения контакта с полипептидом по любому из пп.1-10 и гидролитическое расщепление зеараленона или его производного.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что полипептид входит в состав добавки по любому из пп.11-14.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что полипептид или добавку добавляют к корму или пищевому продукту, загрязненному зеараленоном или по меньшей мере одним его производным.
19. Способ по любому из пп.16-18, отличающийся тем, что гидролизуется по меньшей мере 70%, преимущественно по меньшей мере 80% и предпочтительно по меньшей мере 90% зеараленона или по меньшей мере одного его производного.