BR122020001707B1 - Processo para a dissociação hidrolítica de zearalenona e/ou de pelo menos um derivado de zearalenona - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um polipeptídeo para a clivagem hidrolítica de zearalenona e/ou de no mínimo um derivado de zearalenona, o referido polipeptídeo sendo uma hidrolase tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 1 a 15 ou uma variante funcional da mesma, em que a sequência da variante funcional é no mínimo 40% idêntica a no mínimo uma das sequências de aminoácido. A presente invenção também refere-se a: um aditivo contendo o polipeptídeo; um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo; e um método para a clivagem hidrolítica de zearalenona e/ou de no mínimo um derivado de zearalenona usando o polipeptídeo.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo para clivagem hidrolítica de zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona, um polinucleotídeo isolado o qual codifica para um polipeptídeo semelhante bem como um aditivo contendo um polipeptídeo semelhante bem como um uso de um polipeptídeo semelhante bem como um método para clivagem hidrolítica de zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona.

[002] Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos filamentares. Um importante representante das micotoxinas é zearalenona (ZEN), a qual era previamente conhecida como toxina F-2, a qual é produzida por uma variedade de fungos Fusarium e pode ser encontrada em todo o mundo. Estes fungos infestam plantas cultivadas, entre outras, tais como vários tipos de grãos, em que a infestação fúngica geralmente ocorre antes da colheita quando o crescimento dos fungos e/ou a produção de micotoxinas pode ocorrer antes do armazenamento ou pode mesmo ocorrer depois da colheita, quer antes do armazenamento ou sob condições inadequadas de armazenamento. A FAO calculou que 25 % dos produtos agrários em todo o mundo estão contaminados com micotoxinas, deste modo resultando em substanciais perdas econômicas. Em um estudo internacional concluído recentemente, foram analisadas um total de 23.781 amostras a partir de janeiro de 2009 até dezembro de 2011, das quais 81 % testaram positivas para no mínimo uma micotoxina e 45 % testaram positivas para ZEN. ZEN foi encontrada em todas as regiões do mundo e em todos os tipos de grãos e forragens testados, tais como milho, farinha de soja, trigo, farelo de trigo, DDGS (grãos de destilaria secos com solúveis) bem como em misturas de rações animais acabadas com uma incidência de até 100 %.

[003] ZEN é uma lactona macrocíclica estrogênica não-esteroide com a seguinte fórmula estrutural, sintetizada por meio do caminho metabólico dos policetídeos:

[004] e seu nome de acordo com a nomenclatura IUPAC é (2E,11S)-15,17-diidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca- 1(18),2,14,16-tetraeno-7,13-diona.

[005] No entanto, uma variedade de derivados de ZEN também ocorrem na natureza e podem ser formados por modificações enzimáticas ou químicas da ZEN. Exemplos incluem conjugados de ZEN glicosídicos ou aqueles contendo sulfato, formados por fungos, plantas ou um metabolismo de mamífero bem como metabólitos de ZEN formados no organismo humano ou animal, entre outros. Os derivados de ZEN são entendidos abaixo como sendo conjugados de ZEN ou metabólitos de ZEN que ocorrem naturalmente ou são sintetizados por síntese química ou bioquímica porém em particular α-zearalenol (α-ZEL; (2E,7R,11S)-7,15,17-triidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca- 1(18),2,14,16-tetraen-13-ona), β-zearalenol (β-ZEL; (2E,7S,11S)- 7,15,17-triidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),2,14,16- tetraen-13-ona), α-zearalanol (α-ZAL; (7R,11S)-7,15,17-triidroxi-11- metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),14,16-trien-13-ona), β- zearalanol (β-ZAL; (7S,11S)-7,15,17-triidroxi-11-metil-12- oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(14),15,17-trien-13-ona), 14-sulfato de zearalenona (Z14S; [(2E,11S)-15-hidroxi-11-metil-7,13-dioxo-12- oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),2,14,16-tetraen-17-il] hidrogênio sulfato), zearalenona-14-glicosídeo (Z14G; (2E,11S)-15-hidroxi-11- metil-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-triidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxi-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18)2,14,16-tetraeno-7,13-diona) bem como zearalanona (ZAN; (11S)-15,17-diidroxi-11-metil-12- oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),14,16-trieno-7,13-diona).

[006] ZEN bem como derivados de ZEN, em particular α-ZEL, β- ZEL, Z14S, α-ZAL, β-ZAL, Z14G e ZAN também podem ser detectados em alimentos processados e produtos de ração animal, tais como pão ou cerveja devido a sua elevada estabilidade química e física.

[007] ZEN liga ao receptor estrogênico e pode causar disrupções hormonais, sendo absorvida imediatamente depois de ingestão oral e convertida pelos mamíferos em dois metabólitos estereoisoméricos α- ZEL e/ou β-ZEL. Por exemplo, α-ZEL mas também α-ZAL e/ou ZAN têm um efeito estrogênico muito mais forte do que a ZEN. Ao mesmo tempo, os derivados de ZEN conjugados têm uma atividade estrogênica menor do que a ZEN mas a ZEN pode ser liberada de novo a partir destes derivados de ZEN no trato digestivo sob algumas circunstâncias.

[008] Embora a ZEN tenha uma toxicidade aguda relativamente baixa e tenha uma LD50 oral de até 20.000 mg/kg de peso corporal, podem ocorrer efeitos tóxicos subagudos e/ou subcrônicos tais como efeitos teratogênicos, carcinogênicos, estrogênicos e imunossupressores em animais ou humanos com exposição prolongada. Ração contaminada com ZEN leva a transtornos do desenvolvimento em animais mamíferos, porém os porcos, em particular os leitões, são extremamente sensíveis à ZEN. Concentrações de ZEN de mais de 0,5 ppm na ração resultam em transtornos do desenvolvimento, e concentrações de mais de 1,5 ppm em porcos, por exemplo, podem resultar em hiperestrogenicidade, e concentrações de 12 ppm de ZEN têm sido consideradas responsáveis por abortamentos espontâneos em gado bovino. Como a zearalenona é absorvida rapidamente através das membranas mucosas, em particular através da mucosa gástrica bem como através da mucosa oral, é essencial desativação imediata e quantitativa. A ZEN pode ser detectada no sangue mesmo 30 minutos depois de administração oral. Neste caso, o uso de enzimas isoladas oferece algumas vantagens com respeito a microrganismos, tais como uma maior atividade específica ou um efeito mais rápido. Devido aos efeitos prejudiciais da ZEN, a União Europeia tem vinculado limites superiores para a ZEN em gêneros alimentícios bem como recomendações para limites superiores para a ZEN em produtos de ração animal (EC No. 1881/2006).

[009] A estratégia primária para redução da contaminação por ZEN de alimentos e produtos de ração animal é restringir o crescimento de fungos, por exemplo, mantendo "boa prática agrícola." Isto inclui, entre outras coisas, assegurar que a semente seja livre de pragas e de infestação por fungos ou que os produtos de resíduos agrícolas sejam removidos do campo prontamente. Além disso, o crescimento de fungos no campo pode ser reduzido através do uso de fungicidas. Depois da colheita, o material colhido deve armazenado em um nível de umidade residual de menos de 15 % e em uma temperatura baixa de modo a prevenir o crescimento de fungos. Do mesmo modo, o material contaminado por infestação por fungos deve ser removido antes de processamento adicional. Apesar da lista de medidas, I. Rodrigues e K. Naehrer (2012) reportaram que, mesmo em regiões com os padrões agrícolas mais elevados, tais como os Estados Unidos e a Europa Central nos anos de 2009 a 2011, 29 % e 39 % respectivamente, das amostras de milho testadas estavam contaminadas com ZEN.

[0010] Possibilidades adicionais para a remoção de ZEN a partir de gêneros alimentícios ou de produtos de ração animal incluem adsorção e/ou transformação da micotoxina. Isto requer que a ligação da micotoxina ao adsorvente deva ser forte e específica sobre uma ampla faixa de pH e deva permanecer estável no trato gastrointestinal. Embora alguns adsorventes não-biológicos tais como carbono ativado e silicatos ou polímeros sintéticos tais como colestiramina possam ser usados de modo eficaz para aflatoxinas, sua utilização para outras micotoxinas é limitada. A principal desvantagem dos adsorventes é a ligação inespecífica de outras moléculas, as quais são em alguns casos essenciais para a nutrição. Adsorventes biológicos tais como levedura ou extratos de leveduras também têm sido descritos na literatura, porém têm uma limitação similar à dos adsorventes não-biológicos.

[0011] A detoxificação da ZEN por tratamentos físicos e químicos também é limitada. A ZEN não pode ser desativada de modo eficaz por tratamento térmico, mas o teor de ZEN pode ser reduzido por 83,9 % por extrusão e tratamento com agentes oxidantes, por exemplo, por 16 horas a 80°C com solução a 10 % de peróxido de hidrogênio. O uso de métodos de extrusão e de agentes oxidantes tais como ozônio ou peróxido de hidrogênio na produção de gêneros alimentícios e de produtos de ração animal é limitado devido ao alto custo, à perda de qualidade e em alguns casos à baixa eficácia e à baixa especificidade.

[0012] A biotransformação de ZEN por meio de microrganismos tais como cepas de Trichosporon mycotoxinivorans, Gliocladium roseum ou Bacillus subtilis e/ou enzimas isoladas a partir das mesmas tais como hidrolases ou peroxidases é descrita, por exemplo, por E. Vekiru et al. em Appl. and Environ. Microb., 2010, 76, 7, 2353-2359.

[0013] O Requerimento de Patente Europeia No. EP 0 938 575 B1 descreveu propriedades de degradação de ZEN de bactérias do gênero Rhodococcus ou Nocardia, em particular R. globerulus, R. erythropolis e N. globerula.

[0014] O documento de Patente Internacional No. WO 02/076205 descreve o efeito de degradação de ZEN de enzimas isoladas a partir do Gliocladium roseum, incluindo α,β-hidrolase e zearalenona hidrolase 1 (ZHD1), as quais catalisam a degradação de ZEN por meio de uma tríade catalítica.

[0015] O documento de Patente Internacional No. WO 2012/113827 revela zonases recombinantes, isto é, enzimas que degradam ZEN e permanecem estáveis no trato gastrointestinal. Estas incluem microrganismos tais como Thermobifidia fusca, Streptomyces exfoliates, Acidovorans delafieldii e Streptomyces sp. em particular.

[0016] Polipeptídeos ou enzimas capazes de hidrolisar ZEN e/ou no mínimo um derivado de ZEN também podem ser designados como zonases.

[0017] Os termos usados nas partes que se seguem são tomados da linguagem técnica e cada um é usado nos significados tradicionais, a menos que algum ao contrário seja indicado. Deste modo, por exemplo, o termo "polinucleotídeo" refere-se a todos os tipos de material genético de todos os comprimentos e sequências tais como moléculas de RNA e de DNA de fita simples e de fita dupla, incluindo elementos reguladores, elementos estruturais, grupos de genes, plasmídeos, genomas inteiros e fragmentos dos mesmos. A designação "polipeptídeo" inclui proteínas tais como, por exemplo, enzimas, anticorpos bem como polipeptídeos com até 500 aminoácidos, tais como, por exemplo, inibidores de peptídeos, domínios de proteínas ou também polipeptídeos curtos com comprimentos de sequência curtos, por exemplo, menos de 10 aminoácidos, tais como receptores, ligantes, hormônios peptídicos, tags e semelhantes. A designação "posição" em um polinucleotídeo ou em um polipeptídeo refere-se a uma única base específica ou a um único aminoácido específico na sequência do polinucleotídeo ou do polipeptídeo.

[0018] A presente invenção tem agora por objetivo tornar disponível um polipeptídeo com o qual é possível transformar rapidamente e de modo confiável ZEN e/ou no mínimo um derivado de ZEN em ZEN hidrolisada e/ou em derivados de ZEN hidrolisados.

[0019] De modo a solucionar este problema, a presente invenção é caracterizada essencialmente em que o polipeptídeo é uma hidrolase com uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 1 a 15 ou uma variação funcional das mesmas, em que existe uma identidade de sequências de no mínimo 70 % entre a variante funcional e no mínimo uma das sequências de aminoácido.

[0020] O termo "identidade de sequências" de acordo com a presente invenção refere-se a uma percentagem de identidade de sequências. Para sequências de aminoácido e sequências de nucleotídeos, a identidade de sequências pode ser determinada visualmente, porém de modo preferencial é calculada por um programa de computação. A comparação de sequências também é realizada dentro de segmentos de sequências, em que o segmento é entendido como sendo uma sequência contínua da sequência de referência e de modo preferencial compreende uma região conservada da sequência.

[0021] No presente caso, a identidade de sequências foi determinada com a ajuda do programa NCBI BLAST (BLAST = Basic Logic Alignment Search Tool (N.T.: Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Lógico Básico)), em particular com BLASTP para polipeptídeos e BLASTN para polinucleotídeos, os quais estão disponíveis na homepage do National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Portanto é possível comparar duas ou mais sequências uma com a outra de acordo com o algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Para os fins desta invenção, os programas foram usados na versão de 15 de maio de 2013. As configurações básicas foram usadas como as configurações do programa, mas em particular para a comparação das sequências de aminoácidos: "sequência alvo máx" = 100; "limiar esperado" = 10; "tamanho de palavra" = 3; "matriz" = BLOSOM62; "custos de gap" = "existência: 11; extensão: 1"; "ajuste computacional" = "ajuste de matriz de escore composicional condicional" bem como para a comparação de sequências de nucleotídeos tamanho de palavra: 11; valor esperado: 10; custos de gap: existência = 5, extensão = 2; filtro = baixa complexidade ativada; escores de compatibilidade / incompatibilidade: 2 - 3; sequência de filtros: L; m.

[0022] Os termos "variante de polipeptídeo funcional" ou "variante funcional" referem-se em primeiro lugar a "variantes alélicas" do polipeptídeo e a "fragmentos funcionais" do polipeptídeo e em segundo lugar a "modificação" do polipeptídeo, em que a função enzimática é essencialmente inalterada. O termo "variante alélica" refere-se a um polipeptídeo formado por uma ou mais mutações que ocorrem naturalmente na sequência de nucleotídeos e causando uma modificação na sequência de aminoácidos, em que a função enzimática do mesmo não é afetada. "Modificações" podem ser, por exemplo, fusões de C- ou N-terminal com polipeptídeos ou polipeptídeos mutados, em que podem ser obtidas mutações por substituição, inserção ou deleção de no mínimo um aminoácido, em particular por mutagênese sítio-dirigida (site-directed mutagenesis), isto é, mutagênese aleatória, recombinação e/ou qualquer outro método de engenharia de proteína. Os termos "substituição," "inserção" e "deleção" são usados aqui nos significados comuns em engenharia genética, com os quais os versados na arte estão familiarizados. O termo "fragmento funcional" refere-se a uma parte ou uma subsequência de um polipeptídeo ou uma parte e/ou uma subsequência de uma variante funcional do mesmo, em que a função enzimática é essencialmente conservada. Uma função enzimática é conservada em particular quando o mecanismo de reação enzimática permanece inalterado, isto é, a micotoxina é hidrolisada na mesma localização, e a atividade residual específica da "variante funcional" monta a no mínimo 5 %, de modo preferencial no mínimo 10 %, especialmente no mínimo 10 %, e em particular no mínimo 50 %, com base no polipeptídeo original. Os polipeptídeos com as sequências de aminoácido que têm SEQ ID NOs: 1 a 15 são variantes alélicas funcionais ou umas das outras ou de uma e da mesma enzima, em que as sequências se originam de diferentes microrganismos. Isto é claramente reconhecível a partir da íntima relação de uma com a outra, medida por meio da percentagem de identidade de sequências, bem como pelo fato de que todos os polipeptídeos agem sob ZEN e sobre derivados de ZEN por meio dos mesmos mecanismos de degradação.

[0023] Devido à similaridade nas sequências de aminoácido dos polipeptídeos com SEQ ID NOs: 1 a 15 umas com as outras, é possível que uma variante funcional de um destes polipeptídeos possa ter uma identidade de sequências de no mínimo 40 %, com mais de um dos polipeptídeos reivindicados tendo SEQ ID NOs: 1 a 15.

[0024] Através da escolha de uma sequência de aminoácidos semelhante ou de uma variante funcional da mesma, foi detectada uma hidrólise surpreendentemente rápida e completa de ZEN e/ou no mínimo um derivado de ZEN.

[0025] Como corresponde a um desenvolvimento adicional preferencial da invenção, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos, a qual contém no mínimo um segmento de sequência de aminoácidos conservado ou uma variante funcional do mesmo, em que a variante funcional do segmento de sequência de aminoácidos tem uma identidade de sequências de no mínimo 70 %, de modo preferencial no mínimo 84 %, de modo mais preferencial no mínimo 92 % e de modo o mais preferencial no mínimo 98 %, e o no mínimo um segmento de sequência de aminoácidos conservado é selecionado entre o grupo de sequências de aminoácido +24 a +50, +52 a +77, +79 a +87, +89 a +145, +150 a +171, +177 a +193, +223 a +228, +230 a +237, +239 a +247, +249 a +255, +257 a +261, +263 a +270, +272 a +279, +297 a +301, +303 a +313, +24 a 328, +1 a +328 da sequência que tem a SEQ ID NO: 1. Devido à presença de no mínimo um segmento de sequência de aminoácidos conservado semelhante, se tornou possível tornar disponível um polipeptídeo o qual também tem, além da hidrólise rápida e completa de ZEN e/ou de no mínimo um derivado de ZEN, um valor de atividade particularmente elevado em comparação com os polipeptídeos de degradação de ZEN conhecidos previamente.

[0026] Resultados igualmente bons foram obtidos quando a variante funcional tem no mínimo uma modificação de aminoácido selecionada entre o grupo de substituição, deleção e inserção de um ou mais aminoácidos.

[0027] Se o polipeptídeo tiver uma atividade específica de no mínimo 0,01 U/mg, de modo preferencial no mínimo 0,1 U/mg, em particular no mínimo 1 U/mg; e/ou um valor de KM da clivagem hidrolítica de ZEN de no máximo 50 μM, de modo preferencial no máximo 3,5 μM, em particular no máximo 0,5 μM; e/ou um valor de kcat da clivagem hidrolítica de ZEN de no mínimo 0,05 s-1, de modo preferencial no mínimo 0,6 s-1, em particular no mínimo 5 s-1; e/ou um valor vmax da clivagem hidrolítica de ZEN de no mínimo 0,00001 μM-1 s-1, de modo preferencial no mínimo 0,0001 μM-1 s-1, em particular no mínimo 0,001 μM-1 s-1, então ZEN e/ou derivados de ZEN podem ser hidrolisados de modo especialmente rápido e completo, em particular sendo detoxificados.

[0028] Além disso, o polipeptídeo pode conter uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 5, 6 e 15 ou uma variante funcional das mesmas, em que a variante funcional tem no mínimo 70 % de identidade de sequências com no mínimo uma das sequências de aminoácido, e a estabilidade de pH do polipeptídeo em pH 5,0 monta a no mínimo 15 %, de modo preferencial 50 % e em particular de modo preferencial 90 %. Deste modo é possível assegurar que o polipeptídeo zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona venha a ser clivado e/ou detoxificado mesmo em um meio acidífero, tal como o estômago de mamíferos, por exemplo. A estabilidade de pH dos polipeptídeos é definida aqui como a percentagem de atividade residual dos polipeptídeos em pH 5,0 em relação à atividade no pH ótimo respectivo.

[0029] Além disso, o polipeptídeo pode conter uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 1, 5, 6 e 15 ou uma variante funcional das mesmas, em que a variante funcional tem no mínimo 70 % de identidade de sequências com no mínimo uma das sequências de aminoácido, de modo que o polipeptídeo tenha a maior atividade enzimática em uma faixa de temperatura entre 30°C e 75°C, de modo preferencial entre 38°C e 55°C, em particular de modo preferencial entre 38°C e 52°C. Isto assegura que a zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona também seja hidrolisado e/ou detoxificado pelo polipeptídeo mesmo em temperaturas mesofílicas, em particular na temperatura corporal de seres humanos e de animais de criação agrícola. A temperatura na qual o polipeptídeo tem a maior atividade enzimática é definida como a temperatura ótima do polipeptídeo.

[0030] Finalmente, o polipeptídeo pode ter uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 1, 5, 6 e 15 ou uma variante funcional da mesma, em que a variante funcional tem no mínimo 70 % de identidade de sequências com no mínimo uma das sequências de aminoácido, e o polipeptídeo é termicamente estável até uma temperatura de 90°C, de modo preferencial 75°C e em particular de modo preferencial 60°C. Isto assegura que o polipeptídeo e sua função enzimática vão permanecer essencialmente intactos mesmo sob estresse por temperatura elevada, tal como o que pode ocorrer, por exemplo, durante expedição em um container ou durante peletização de ração. A estabilidade térmica dos polipeptídeos é definida como a temperatura na qual, depois de 15 minutos de incubação preliminar, o polipeptídeo tem uma atividade residual de 50 % em comparação com a atividade na temperatura ótima respectiva.

[0031] O polipeptídeo pode ser selecionado de modo a que tenha uma α,β-hidrolase, a qual é adequada para clivagem hidrolítica do grupamento éster de zearalenona e/ou dos derivados de ZEN independente de oxigênio e livre de cofator, que tem uma tríade de aminoácidos que catalisa a clivagem hidrolítica e consiste de serina, um aminoácido acidífero selecionado entre ácido glutâmico e ácido aspártico, em particular ácido aspártico e histidina, e a tríade catalítica é, por exemplo, S128, D264 e H303, em que é mostrado o posicionamento em relação à SEQ ID NO: 1.

[0032] A hidrólise de ZEN e de derivados de ZEN têm êxito com qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1 a 15 sobre o grupamento éster da zearalenona ou de seus derivados de acordo com o seguinte mecanismo de reação:

[0033] A hidrólise de ZEN para formar zearalenona hidrolisada não- tóxica (HZEN) e/ou derivados de ZEN hidrolisada ocorre por meio de polipeptídeos de acordo com a invenção, em particular α,β-hidrolases. A descarboxilação adicional de HZEN para ZEN hidrolisada descarboxilada (DHZEN) e/ou derivados de ZEN hidrolisada descarboxilada é geralmente espontânea.

[0034] Em particular, por meio das tríades catalíticas acima mencionadas, é possível hidrolisar completamente ZEN e derivados de ZEN, em que a reação de degradação tem um bom efeito de estabilização do pH, em particular em um pH na faixa acidífera.

[0035] Foi visto que é possível atingir resultados uniformemente bons com um polipeptídeo que contém em um segmento de sequência consistindo de 3 aminoácidos antes da serina e 3 aminoácidos depois da serina da tríade catalítica acima mencionada, no mínimo um aminoácido polar selecionado entre Y, Q, N, T, K, R, E, D e no mínimo um aminoácido não-polar selecionado entre F, M, L, I, V, A, G, P, e também é possível aprimorar no mínimo um parâmetro cinético enzimático.

[0036] Em um refinamento preferencial da invenção, o polipeptídeo tem no mínimo uma mutação da sequência de aminoácidos com respeito à SEQ ID NO: 1 em no mínimo uma das seguintes posições: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311, 314, 317, 319, 321, 323, 325 e 326. Estas posições são derivadas das diferenças de sequências entre o polipeptídeo com a SEQ ID NO: 1 e o polipeptídeos tendo SEQ ID NOs: 2 a 6, os quais são especialmente ativos e têm um alto grau de identidade com esta sequência. Se o polipeptídeo com SEQ ID NO: 1 for modificado em no mínimo uma destas posições, de modo que as variantes de aminoácido de SEQ ID NOs: 2 a 6 possam ser retomadas nesta posição, é possível mostrar que estas posições têm uma influência significativa sobre os parâmetros cinéticos enzimáticos do polipeptídeo e que combinações da SEQ ID NO: 1 com a SEQ ID NOs: 2 a 6 também tendo um alto grau de identidade de sequências vai levar a maiores atividades.

[0037] De acordo com um refinamento da invenção, o polipeptídeo tem no mínimo uma mutação selecionada entre o grupo compreendendo: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, ΔP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P na sequência de aminoácidos com respeito à SEQ ID NO: 1. Com um polipeptídeo semelhante, é possível hidrolisar completamente ZEN dentro de um curto período de tempo, em particular para a detoxificar, em que a atividade específica do polipeptídeo monta a no mínimo 6,00 U/mg, de modo preferencial no mínimo 7,00 U/mg, em particular no mínimo 8,00 U/mg. A unidade "U" ou também "unidade" é uma medida da atividade catalítica absoluta e é definida pela hidrólise de 1 μmol de ZEN por minuto a 32°C em 50 mM de tampão de Tris-HCl (pH 8,2), em que "atividade catalítica" é entendida como se referindo à conversão enzimática de um substrato sob condições de reação definidas, e "atividade específica" é entendida como se referindo à proporção da atividade catalítica e a concentração de massa de polipeptídeo (massa por unidade de volume).

[0038] Se, de acordo com um refinamento da invenção, o polipeptídeo for incorporado de modo que no mínimo um dos seguintes motivos de aminoácido com uma sequência tendo SEQ ID NOs: 32 a 50 estiver contido no mesmo, então é possível tornar disponíveis polipeptídeos tendo uma atividade específica de no mínimo 7,00 U/mg, de modo preferencial no mínimo 8,00 U/mg. Surpreendentemente se descobriu que quando no mínimo um dos motivos de aminoácidos que se seguem com uma sequência tendo a SEQ ID NOs: 51 a 58 estiver contida no mesmo, a atividade enzimática do polipeptídeo é aumentada adicionalmente, por exemplo, em comparação com um motivo contendo 7 aminoácidos. Uma atividade específica ainda maior é obtida quando no mínimo um dos motivos de aminoácidos que se seguem tendo a sequência tendo a SEQ ID NOs: 59 a 69 estiver contida no mesmo.

[0039] Finalmente, o polipeptídeo pode conter no mínimo uma substituição de aminoácido conservadora em no mínimo uma posição, onde a substituição de aminoácido conservadora é selecionada entre substituições de G por A; ou A por G, S; ou V por I, L, A, T, S; ou I por V, L, M; ou L por I, M, V; ou M por L, I, V; ou P por A, S, N; ou F por Y, W, H; ou Y por F, W, H; ou W por Y, F, H; ou R por K, E, D; ou K por R, E, D; ou H por Q, N, S; ou D por N, E, K, R, Q; ou E por Q, D, K, R, N; ou S por T, A; ou T por S, V, A; ou C por S, T, A; ou N por D, Q, H, S; ou Q por E, N, H, K, R, em que a designação "substituição de aminoácido conservadora" refere-se à substituição de aminoácidos por outros aminoácidos considerados por aqueles versados na arte como sendo conservadores, isto é, tendo propriedades específicas similares. As propriedades específicas referidas incluem, por exemplo, o tamanho, a polaridade, a hidrofobicidade, a carga ou o valor de pKs do aminoácido. Uma mutação conservadora, por exemplo, é entendida como sendo uma substituição de um aminoácido acidífero por outro aminoácido acidífero, um aminoácido básico por outro aminoácido básico ou um aminoácido polar por outro aminoácido polar.

[0040] Com as substituições de aminoácido conservadoras referidas, é possível produzir variantes de polipeptídeos funcionais cuja atividade específica é aproximadamente a mesma em comparação com o polipeptídeo parental porém de modo preferencial é aumentada por no mínimo 0,1 U/mg.

[0041] A presente invenção tem por objetivo adicionalmente tornar disponível um polinucleotídeo isolado com o qual é possível sintetizar um polipeptídeo para clivagem hidrolítica rápida e confiável de ZEN e/ou de no mínimo um derivado de ZEN.

[0042] De modo a solucionar este problema, a invenção é caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo isolado pode ter uma sequência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem uma zearalenona e/ou a propriedade de hidrolisar no mínimo um derivado de zearalenona, e a sequência de nucleotídeos codifica para no mínimo um polipeptídeo de acordo com a invenção e/ou a sequência de nucleotídeos tem um grau de identidade de sequências de no mínimo 70% com uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 16 a 31 e/ou a sequência de nucleotídeos hidrolisa sob condições de restringência moderada com no mínimo uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 16 a 31 e/ou com uma subsequência das mesmas com no mínimo 200 nucleotídeos, em particular no mínimo 100 nucleotídeos e/ou com uma fita complementar da sequência de nucleotídeos ou subsequências da mesma.

[0043] Sequências de nucleotídeos a serem expressadas, em particular seus tripletos (códons) são geralmente alteradas dependendo da célula hospedeira de modo que a tendência dos códons é otimizada de acordo com a célula hospedeira. Isto resulta no fato de que mesmo polinucleotídeos tendo um grau de identidade de sequências de muito menos do que 80 %, porém ainda menos do que 70 % ou menos do que 60 % podem codificar para o mesmo polipeptídeo. A comparação de sequências para determinar o grau de identidade de sequências também deve ser realizada entre segmentos de sequências, em que uma seção deve ser entendida como uma sequência contínua da sequência de referência. O comprimento dos segmentos de sequência para sequências de nucleotídeos é normalmente de 15 a 600.

[0044] Com o auxílio das presentes sequências de nucleotídeos isoladas ou segmentos de sequências, é possível gerar sondas de ácido nucléico tendo uma extensão de geralmente no mínimo 15, 30 ou 40 nucleotídeos. Com as sondas referidas, as quais são tipicamente também marcadas, por exemplo, por 3H, 32P, 35S, biotina ou avidina, é possível, usando métodos de rotina, identificar sequências de nucleotídeos que codificam para polipeptídeos com a propriedade de degradação de ZEN e/ou de derivados de ZEN. Por exemplo, DNA, RNA ou cDNA de microrganismos individuais, bibliotecas de DNA genômico ou bibliotecas de cDNA podem ser usados como o material de partida para a identificação de semelhantes sequências.

[0045] Para sequências de nucleotídeos e/ou sondas de nucleotídeos com uma extensão de no mínimo 100 nucleotídeos, condições de restringência moderada são definidas como pré- hibridização e hibridização a 42°C em tampão de Na-EDTA provido com 5x NaCl (SPE, NaCl a 0,9 M, 60 mM de NaH2PO4, 6 mM de EDTA) contendo 0,3 % de sódio dodecil sulfato (SDS), 200 μg/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e 35 % de formamida seguidas por condições de Southern Blot de rotina, em que o material de veículo é lavado três vezes ao final por 15 minutos cada com 2x tampão citrato de cloreto de sódio (SSC, 300 mM de NaCl e 30 mM de citrato tri-sódico, 0,2 % de SDS) a 55°C.

[0046] Para sequências de nucleotídeos e/ou sondas de nucleotídeos com uma extensão de 15 nucleotídeos a 100 nucleotídeos, condições de restringência moderada são definidas como pré- hibridização e hibridização em tampão consistindo de NaCl a 0,9 M, Tris-HCl a 0,09 M pH = 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, 1 x solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de sódio dihidrogênio fosfato, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg/mL de RNA de levedura, em que a pré-hibridização e a hibridização são realizadas em uma temperatura de 5°C a 10°C abaixo do ponto de fusão calculado (Tm), onde a Tm é determinada por cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 48:1390). Depois disto, o experimento é continuado sob condições de Southern Blot de rotina (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). O material de veículo é lavado ao final uma vez por 15 minutos com 6x tampão de SCC [sic; SSC buffer] contendo 0,1 % de SDS e duas vezes por 15 minutos com 6x tampão de SSC cada uma a 5°C a 10°C sob a Tm calculada.

[0047] A presente invenção tem por objetivo adicionalmente tornar disponível um aditivo com o qual é possível atingir uma clivagem hidrolítica rápida e confiável de ZEN e/ou no mínimo um derivado de ZEN em uma matriz definida ou complexa, tal como, por exemplo, em alimento ou produtos de ração animal.

[0048] De modo a solucionar este problema, um aditivo que cliva hidroliticamente uma zearalenona e/ou no mínimo derivado de zearalenona é tornado disponível, em que o aditivo contém no mínimo um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 1 a 15 ou uma variante funcional da mesma, em que a identidade de sequências entre a variante funcional e no mínimo uma das sequências de aminoácido monta a no mínimo 70 %, e substâncias auxiliares também estão presentes.

[0049] Com um aditivo semelhante, é possível a conversão bioquímica de ZEN e/ou de no mínimo um derivado de ZEN para ZEN hidrolisada e/ou derivado de ZEN hidrolisada. Este aditivo também pode ser uado, por exemplo, para hidrólise estereosseletiva de ZEN e/ou derivados de ZEN em processos industriais.

[0050] Em um refinamento preferencial da invenção, o aditivo é incorporado de modo que as substâncias auxiliares são selecionadas entre no mínimo um veículo inerte bem como opcionalmente ingredientes adicionais, tais como vitaminas e/ou minerais e/ou enzimas e/ou componentes adicionais para detoxificação de micotoxinas. Devido ao uso de um aditivo semelhante, por exemplo, em gêneros alimentícios ou produtos de ração animal, é possível assegurar que quaisquer quantidades de ZEN e/ou de derivados de ZEN que possam estar presentes são hidrolisadas de modo confiável, em particular sendo detoxificadas na medida que não terão nenhum efeito prejudicial sobre o organismo do sujeito que consumir este gênero alimentício ou produto de ração animal.

[0051] Um polipeptídeo de acordo com a invenção aqui também pode estar presente em uma preparação enzimática, a qual adicionalmente contém no mínimo uma enzima além de no mínimo um polipeptídeo de acordo com a invenção, de tal modo que a enzima toma parte na degradação de proteínas, por exemplo, tais como proteases, ou desempenha um papel no metabolismo do amido ou fibra ou gordura ou glicogênio, tal como, por exemplo, amilase, celulase ou glucanases bem como, por exemplo, hidrolases, enzimas lipolíticas, manosidase, oxidases, oxidorredutases, fitases, xilanases e/ou combinações das mesmas.

[0052] Campos de utilização adicionais da invenção incluem preparações enzimáticas, as quais, além de no mínimo um polipeptídeo de acordo com a invenção, também contêm no mínimo um componente para detoxificação de micotoxinas, tais como uma enzima de degradação de micotoxina, por exemplo, aflatoxina oxidase, ergotamina hidrolases, ergotamina amidases, zearalenona esterases, zearalenona lactonases, ocratoxina amidases, fumonisina carboxil esterases, fumonisina aminotransferases, aminopoliol aminooxidases, desoxinivalenol epóxido hidrolases e/ou no mínimo um microrganismo de degradação de micotoxinas, tais como Bacillus subtilis e/ou no mínimo um componente de ligação de micotoxinas, por exemplo, paredes celulares microbianas ou materiais inorgânicos tais como bentonitas.

[0053] De acordo com um refinamento particularmente preferencial da invenção, no mínimo um polipeptídeo está presente no aditivo em uma concentração de no máximo 10.000 U/g, de modo preferencial no máximo 1000 U/g, de modo mais preferencial no máximo 100 U/g e de modo o mais preferencial no máximo 10 U/g, de modo que é possível converter ZEN e/ou derivados de ZEN rapidamente e em particular fazer isto já antes de serem absorvidos pelo corpo de um sujeito, em particular um mamífero consumindo um gênero alimentício contaminado ou produto de ração animal contaminado, convertendo os mesmos em metabólitos não-tóxicos ou menos tóxicos, em particular HZEN e DHZEN.

[0054] De acordo com um refinamento da invenção, o polipeptídeo está presente em forma encapsulada ou revestida, em que métodos de rotina tais como os descritos no documento de patente internacional No. WO 92/12645 podem ser usados para a encapsulação ou para o revestimento. Por encapsulação e/ou revestimento, é possível transportar o polipeptídeo sem qualquer modificação, em particular sem degradação ou dano, para seu sítio de uso, de modo que somente depois da concha protetora ter sido dissolvida no trato digestivo de animais, por exemplo, o polipeptídeo começa a agir de modo a que possa ser realizada uma degradação ainda mais direcionada, rápida e completa de ZEN e/ou de derivados de ZEN mesmo no meio acidífero rico em protease e anaeróbico. Além disso, também é possível através de encapsulação ou revestimento aumentar a estabilidade térmica dos polipeptídeos no aditivo.

[0055] A presente invenção tem por objetivo adicionalmente o uso de um aditivo contendo pelo menos um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 1 a 15 ou variante funcional das mesmas, em que a identidade de sequências entre a variante funcional e pelo menos uma das sequencias de aminoácido perfaz pelo menos 70%, para clivagem hidrolítica de zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona em produtos de ração animal, em particular para porcos, aves domésticas e agricultura, em gêneros alimentícios ou em grãos de destilaria secos e solúveis. Através do uso do aditivo de acordo com a invenção, é possível hidrolisar e/ou detoxificar a ZEN e/ou os derivados de ZEN contidos no gênero alimentício ou no produto de ração animal e/ou nos grãos de destilaria secos e solúveis, em que uma detoxificação semelhante é possível mesmo com concentrações de polipeptídeo de aproximadamente 1 U/g de gênero alimentício contaminado ou produto de ração animal contaminado.

[0056] A presente invenção adicionalmente tem por objetivo tornar disponível um método com o qual é tornada possível uma clivagem hidrolítica rápida e confiável de ZEN e/ou de no mínimo um derivado de ZEN.

[0057] De modo a atingir este objetivo, este método é realizado em um modo tal que zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo de SEQ ID NOs: 1 a 15 ou uma variante funcional da mesma é hidrolisada, em que a identidade de sequências entre a variante funcional e no mínimo uma das sequências de aminoácido monta a no mínimo 70 %.

[0058] De acordo com um refinamento da invenção o método é realizado em um modo tal que o polipeptídeo no mesmo é uado em um aditivo correspondente a esta invenção.

[0059] De acordo com outro refinamento preferencial, o método é realizado em um modo tal que o polipeptídeo ou o aditivo no mesmo é misturado com um gênero alimentício ou produto de ração animal contaminado com zearalenona e/ou com no mínimo um derivado de zearalenona; o gênero alimentício ou produto de ração animal contaminado é trazido em contato com umidade e o polipeptídeo ou o aditivo hidrolisa a zearalenona e/ou no mínimo um derivado de zearalenona contido no gênero alimentício ou produto de ração animal contaminado. No caso de gêneros alimentícios ou produtos de ração animal úmidos, tais como mistura ou pastas semi-fluidas, a hidrólise da zearalenona e/ou de no mínimo um derivado de zearalenona vai ocorrer no gênero alimentício ou produto de ração animal úmido antes de consumo oral. Devido a este método, é possível assegurar que os efeitos prejudiciais da zearalenona e de derivados de zearalenona sobre seres humanos e animais será em grande medida eliminado. Umidade aqui é entendido como se referindo à presença de água ou líquidos aquosos, os quais também incluem, por exemplo, saliva ou outros líquidos presentes no trato digestivo. O trato digestivo é definido como a cavidade oral, a faringe (garganta), o esôfago e o trato gastrointestinal ou equivalentes dos mesmos, em que pode haver diferentes designações para animais e/ou componentes individuais podem não ocorrer no trato digestivo de animais.

[0060] Método de acordo com a invenção também pode ser realizado em um modo tal que o gênero alimentício ou produto de ração animal é peletizado antes do consumo oral.

[0061] De acordo com um refinamento da invenção, o método é realizado de modo que no mínimo 70 %, de modo preferencial no mínimo 80 %, em particular no mínimo 90 % da zearalenona e/ou do no mínimo um derivado de zearalenona é hidrolisado. Portanto, efeitos tóxicos subagudos e/ou crônicos tais como efeitos teratogênicos, carcinogênicos, estrogênicos e imunossupressores em animais ou humanos, por exemplo, podem ser suprimidos.

[0062] A invenção é explicada em maiores detalhes abaixo com base em modalidades exemplares bem como desenhos, nos quais:

[0063] A Figura 1 mostra a degradação de ZEN e o aumento nos metabólitos HZEN e DHZEN ao longo do tempo para o polipeptídeo tendo a SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo na Figura 1A não foi marcado, na Figura 1B o polipeptídeo tem um tag de 6xHis C-terminal, e na Figura 1C o polipeptídeo tem um tag de 6xHis N-terminal,

[0064] A Figura 2 mostra a cinética de Michaelis-Menten do polipeptídeo com SEQ ID NO: 1,

[0065] A Figura 3 mostra a degradação de ZEN e o aumento nos metabólitos HZEN e DHZEN ao longo do tempo, devido a polipeptídeos purificados tendo a SEQ ID NOs: 1 (Figura 3A), 2 (Figura 3B), (Figura 3C), 6 (Figura 3D), 7 (Figura 3E), 9 (Figura 3F), (Figura 3G), (Figura 3H) e 15 (Figura 3I), em que todas as sequências têm um tag de 6xHis C- terminal.

Exemplo 1: Modificação, clonagem e expressão de polinucleotídeos que codificam para polipeptídeos os quais são capazes de clivagem hidrolítica de ZEN e/ou de no mínimo um derivado de ZEN

[0066] Substituições, inserções ou eliminações de aminoácidos foram realizadas por mutação das sequências de nucleotídeos por meio de PCR usando os kits da Stratagene do tipo "quick change site-directed mutagenesis kits" de acordo com as instruções. Como uma alternativa, sequências de nucleotídeos completas também foram ordenadas (GeneArt). As sequências de nucleotídeos geradas por meio de mutagênese de PCR e/ou ordenadas a partir de GeneArt opcionalmente também continham um tag de 6xHis C- ou N-terminal em um nível de aminoácido e foram integradas por meio de métodos de rotina em vetores de expressão para expressão em E. coli ou P. pastoris, transformadas em E. coli ou P. pastoris e expressadas em E. coli e P. pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, second edition, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor), em que qualquer outra célula hospedeira adequada também pode ser usada para esta tarefa.

[0067] A designação "vetor de expressão" refere-se a um constructo de DNA que é capaz de expressar um gene in vivo ou in vitro. Em particular isto é entendido como se referindo a constructos de DNA que são adequados para transferir a sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo para dentro da célula hospedeira de modo a integrar dentro do genoma aí ou a estar presente livremente no espaço extracromossômico e expressar a sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo intracelularmente e opcionalmente também remover o polipeptídeo da célula.

[0068] A designação "célula hospedeira" refere-se a todas as células que contêm ou uma sequência de nucleotídeos a ser expressada ou um vetor de expressão e são capazes de sintetizar um polipeptídeo de acordo com a invenção. Em particular isto é entendido como incluindo células procarióticas e/ou eucarióticas, preferencialmente P. pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, células vegetais e/ou esporos de Bacillus, Trichoderma ou Aspergillus.

[0069] O lisado celular solúvel no caso da E. coli e/ou o sobrenadante da cultura no caso da P. pastoris foi / foram usados para determinação das propriedades catalíticas dos polipeptídeos. De modo a determina o valor da KM, vmax, kcat e a atividade específica, os polipeptídeos foram seletivamente enriquecidos cromatograficamente por métodos de rotina sobre colunas de níquel-Sepharose. A determinação da concentração de proteína foi realizada por meio de métodos de rotina, quer sendo calculada pelo método BCA (Pierce BCA Protein Assay KitProd no. 23225) ou de modo preferencial fotometricamente com os coeficientes de extinção específicos para as proteínas respectivas que estão disponíveis online com o programa ProtParam em http://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607).

Exemplo 2: Determinação da identidade de sequências e dos segmentos de sequências de aminoácidos conservados

[0070] A determinação da percentagem de identidade de sequências com base no comprimento total do polipeptídeo dos polipeptídeos com as sequências de aminoácido tendo as SEQ ID NOs: 1 a 15 uma em relação à outra (Tabela 1) foi realizada com ajuda do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (N.T.: Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico)), em particular com BLASTP, o qual pode ser usado na homepage do National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Portanto é possível comparar duas ou mais sequências uma com a outra de acordo com o algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res. (1997), 25:3389-3402). As configurações básicas foram usadas como as configurações do programa em particular. No entanto: "sequência alvo máx" = 100; limiar esperado" = 10; "tamanho de palavra" = 3; "matriz" = BLOSOM62; "custos de gap" = "existência: 11; extensão: 1"; "ajuste computacional" = "ajuste de matriz de escore composicional condicional."

[0071] De modo a determinar os segmentos de sequências de aminoácidos conservados, os polipeptídeos tendo as SEQ ID NOs: 1 a 6, os quais têm uma identidade de sequências de no mínimo 70 % uma com a outra, foram comparados com a ajuda do software COBALT (J. S. Papadopoulos and R. Agarwala, 2007, COBALT: Constraint-Based Alignment Tool for Multiple Protein Sequences, Bioinformatics 23:107379) enquanto usando os parâmetros de rotina, em particular os parâmetros ("penalidades de gaps": -11, -1; " penalidades de end-gap ": -5, -1; "uso de RPS BLAST": ligado; "E-valor Blast": 0,003; "encontrar colunas conservadas e recomputar": ligado; "usar clusters de query ": ligado; "tamanho de palavra": 4; "pode agrupar distância (may cluster distance)": 0,8; "alfabeto": regular; "configuração de conversação de homologia": 3 bits). O resultado desta análise representa os aminoácidos conservados. As seguintes faixas de no mínimo cinco aminoácidos conservados sucessivos foram definidas como os segmentos de sequências de aminoácidos conservados, isto é, com respeito ao segmento que tem a SEQ ID NO: 1, os segmentos A a partir da posição +24 até a posição +50, B a partir da posição +52 até a posição +77, C a partir da posição +79 até a posição +87, D a partir da posição +89 até a posição +145, E a partir da posição +150 até a posição +171, F a partir da posição +177 até a posição +193, G a partir da posição +223 até a posição +228, H a partir da posição +230 até a posição +237, I a partir da posição +239 até a posição +247, J a partir da posição +249 até a posição +255, K a partir da posição +257 até a posição +261, L a partir da posição +263 até a posição +270, M a partir da posição +272 até a posição +279, N a partir da posição +297 até a posição +301 e O a partir da posição +303 até a posição +313.

[0072] As determinações da percentagem de identidade de sequências dos polipeptídeos uma para a outra e dos segmentos de sequências de aminoácidos conservados dos polipeptídeos individuais em relação aos segmentos de sequências de aminoácidos conservados da sequência tendo a SEQ ID NO: 1 foram formadas conforme descrito acima. Os resultados são apresentados nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1: Percentagem de identidade de sequências dos polipeptídeos uma para a outra.

Tabela 2: Percentagem de identidade de sequências dos segmentos de sequências de aminoácidos conservados A a O.

Exemplo 3: Hidrólise de ZEN por polipeptídeos em lisados celulares

[0073] De modo a determinar sua capacidade para degradar ZEN nos metabólitos não-tóxicos ou menos tóxicos HZEN e DHZEN, o polipeptídeo com a SEQ ID NO: 1, codificado pela sequência de nucleotídeos tendo a SEQ ID NO: 17 foi sintetizado como tal e com um tag de 6xHis C-terminal e/ou N-terminal em E. coli conforme descrito no exemplo 1. Os polipeptídeos com as sequências de aminoácido tendo a SEQ ID NOs: 2 a 15 os quais foram codificados pelas sequências de nucleotídeos tendo a SEQ ID NOs: 18 a 31, foram marcados com 6xHis exclusivamente no C-terminal. Porções de 100 mL de uma cultura de E. coli tendo uma densidade ótica (OD 600 nm) de 2,0 a 2,5 foram colhidas por centrifugação a 4°C e ressuspendidas em 20 mL de meio mineral de Brunner (DSMZ microorganisms medium number 462, 2012). As suspensões celulares foram lisadas tratando três vezes com uma prensa francesa (French press) a 20.000 psi. Os lisados celulares resultantes foram usados em uma diluição a 1:10, 1:100 ou 1:1000 preparada em meio mineral de Brunner incluindo 0,1 mg/mL de BSA (albumina sérica bovina). Para os experimentos de degradação de ZEN, foi usado 9,9 mL de meio mineral de Brunner, incluindo 0,1 mg/mL de BSA, 0,1 mL de lisado celular diluído e 31 μL de solução de matéria prima de substrato de ZEN. De um modo geral, os lisados celulares foram diluídos deste modo 1:1000, 1:10.000 e/ou 1:100.000. A solução de matéria prima de substrato de ZEN usada foi uma solução de ZEN a 2,08 mM (40 vol % de CAN + 60 vol % de H2O). De modo a preparar esta solução, ZEN em forma cristalina (Biopure Standard da Romer Labs, artigo no. 001109, pureza de no mínimo 98 %) foi pesada e dissolvida por conseguinte. Cada lote de degradação foi realizado em frascos de vidro de 25 mL e incubado a 25°C e 100 rpm por um total de 120 horas com agitação. Nos tempos de 0, 0,5, 1, 2, 5, 24, 47, 72 e 120 h, uma amostra de 1 mL foi tomada a cada vez, os polipeptídeos foram inativados termicamente por 10 minutos a 99°C e armazenados a -20°C. Depois de degelar a amostra, os constituintes insolúveis foram separados por centrifugação. ZEN, HZEN e DHZEN foram analisados por meio de LC/MS/MS. Para fazer isto, os metabólitos foram separados cromatograficamente sobre uma coluna Phenomenex Luna C18(2) tendo as dimensões de 250 mm x 3 mm e uma medida de partícula de 5 μm, usando como a fase móvel uma mistura de acetonitrilo e água com uma concentração de ácido fórmico de 1 mL/L. O sinal de UV a 270 nm foi registrado usando ionização por eletrospray (ESI) como a fonte ionizante. ZEN, HZEN e DHZEN foram quantificados por meio de QTrap/LC/MS/MS (triplo quadripolar, Applied Biosystems) no modo reforçado. Depois de 24 horas no máximo, quantidades substanciais de ZEN não podem mais ser detectadas em qualquer um dos lotes. A maior parte da ZEN, isto é, mais de 80 %, foi convertida em HZEN ou DHZEN.

[0074] A Figura 1 mostra a degradação de ZEN ao longo do tempo e o aumento em HZEN bem como DHZEN para uma solução de lisado celular diluída a 1:10.000 como um exemplo para polipeptídeo sem tag (Figura 1A) bem como para polipeptídeo com tag de 6xHis C-terminal (Figura 1B) e polipeptídeo com tag de 6xHis N-terminal (Figura 1C) com a SEQ ID NO: 1. Pode ser visto aqui claramente que 1) a reação de ZEN ocorre diretamente e completamente porque quase nenhuma ZEN pode ser detectada mais na primeira amostra (0 h), a qual foi tomada imediatamente depois do início do experimento, e 2) não ocorreram perdas de atividade mencionáveis como uma consequência da anexação de um tag, quer C-terminal ou N-terminal.

Exemplo 4: Hidrólise de derivados de ZEN por polipeptídeos em lisados celulares

[0075] De modo a determinar a capacidade dos polipeptídeos para também transformar derivados de ZEN, além de ZEN, em metabólitos não-tóxicos e/ou menos tóxicos, os polipeptídeos tendo SEQ ID NOs: 1 a 15 foram preparados conforme descrito no Exemplo 3 com tag de His C-terminal e as respectivas sequências de nucleotídeos sintéticas com as sequências tendo SEQ ID NOs: 17 a 31 foram usadas como os lisados celulares na degradação 15.

[0076] Os experimentos de degradação foram realizados conforme descrito no Exemplo 3, onde cada polipeptídeo foi testado com cada derivado de ZEN selecionado entre o grupo consistindo de α-ZEL, β- ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S e ZAN. Os lisados celulares foram usados em uma diluição total de 1:10.000. Ao invés de uma solução de ZEN a 2,08 mM (40 vol % de CAN + 60 vol % de H2O), soluções equimolares, isto é, soluções a 2,08 mM dos derivados de ZEN foram usadas como a solução de matéria prima de substrato. α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL e ZAN foram obtidos da Sigma e usados como padrões para a análise. Z14G e Z14S foram preparados em uma pureza de no mínimo 90 % de acordo com os métodos tais como os descritos por P. Krenn et al., 2007 (Mykotoxin Research, 23, 4, 180-184) e M. Sulyok et al., 2007 (Anal. Bioanal. Chem. 289, 1505-1523) e usados como padrões para a análise. Outra diferença em comparação com o Exemplo 3 é que somente foi tomada uma amostra, a saber depois de 24 horas. A redução na concentração dos derivados de ZEN durante o experimento de degradação foi quantificada por meio de LC/MS/MS. α- ZEL, β-ZEL, Z14G e Z14S foram medidos pelo método de M. Sulyok et al. (2010, Food Chemistry, 119, 408-416); α-ZAL, β-ZAL e ZAN foram medidos pelo método de P. Songsermaskul et al. (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). Surpreendentemente foi visto que somente 0 até máx. 13 % das quantidades iniciais dos derivados de ZEN estava presente depois de 24 horas de incubação em todos os experimentos de degradação.

Exemplo 5: Atividade específica e parâmetros cinéticos enzimáticos dos polipeptídeos bem como variantes dos mesmos

[0077] A atividade específica dos polipeptídeos e variantes dos mesmos foi determinada fotometricamente, em que todos os polipeptídeos usados tinham um tag de 6xHis C-terminal. A preparação, o enriquecimento e a purificação dos polipeptídeos e/ou variantes dos mesmos foram realizados conforme descrito no exemplo 1. A degradação de ZEN para HZEN foi medida com base na redução na absorção no comprimento de onda de 315 nm. Os coeficientes de extinção molar (e) de ZEN e HZEN foram determinados experimentalmente e foi visto que montavam a 0,0078895 L μmol-1 cm- 1 e 0,0030857 L μmol-1 cm-1. Os coeficientes de extinção têm uma forte dependência do pH, e portanto, a atividade deve ser sempre medida precisamente no mesmo pH e de modo preferencial também na mesma matriz. As medições foram realizadas em uma solução tampão a 50 mM de Tris-HCl pH = 8,2 em cuvetas de quartzo em uma faixa de comprimento de onda de 200 a 2500 nm em um fotômetro UV-VIS (Hitachi U-2001) a 32°C.

[0078] Uma solução a 2,08 mM de ZEN (40 vol % de ACN + 60 vol % de H2O) foi usada como a solução de matéria prima de substrato de ZEN. De modo a preparar esta solução, ZEN em forma cristalina (Biopure Standard da Romer Labs, artigo no. 001109, pureza de no mínimo 98 %) foi pesada e dissolvida, por conseguinte. As diluições de substrato de ZEN (0,79 μM, 1,57 μM, 2,36 μM, 3,14 μM, 4,71 μM, 6,28 μM, 7,85 μM, 9,42 μM, 10,99 μM, 12,56 μM, 14,13 μM, 15,71 μM, 17,28 μM e 18,85 μM) foram preparadas com 50 mM de Tris-HCl pH = 8,2. As soluções de polipeptídeos foram diluídas até uma concentração final de aproximadamente 70 ng/mL usando 50 mM de tampão de Tris-HCl pH = 8,2. As diluições de substrato de ZEN foram pré-aquecidas até 32°C em um banho de água.

[0079] Porções de 100 μL da diluição do substrato de ZEN respectivo foram misturadas com 0,2 μL de solução de polipeptídeos, e a absorção foi medida por 5 minutos, depois do que cada combinação de solução de polipeptídeos e diluição de substrato de ZEN foi medida no mínimo duas vezes.

[0080] Tendo em conta os coeficientes de extinção de ZEN e HZEN, a taxa da reação foi calculada para cada concentração de substância com base na inclinação na absorção ao longo do tempo.

[0081] As designações "valor de KM" ou "constante de Michaelis- Menten" referem-se a um parâmetro para descrever a afinidade enzimática das unidades μM ou mM, as quais são calculadas com o auxílio dos gráficos de Hanes lineares de acordo com H. Bisswang (2002, Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, page 19), em que a função "cinética enzimática, único substrato" no programa SigmaPlot 12.0 é usado de modo preferencial para este fim. As designações "constante catalítica da reação enzimática" ou "valor de kcat" referem-se a um parâmetro para descrever a taxa de conversão de um polipeptídeo e/ou de uma enzima, a qual é dada em s-1 e é calculada com de modo preferencial o auxílio da função "cinética enzimática, único substrato" do programa SigmaPlot 12.0. A " máxima taxa enzimática" ou "valor de vmax" é dada em unidades de μM/s ou mM/s e é determinada com o auxílio do gráfico de Hanes linear por analogia com o valor da KM, em que a função "cinética enzimática, único substrato" do programa SigmaPlot 12.0 é de modo preferencial usada para isto.

[0082] A atividade específica foi calculada por meio da vmax e da concentração enzimática usada de acordo com a equação

[0083] em que uma unidade é definida como hidrólise de 1 μmol de ZEN por minuto a 32°C em 50 mM de solução de tampão Tris-HCl, pH = 8,2.

[0084] Os dados brutos para determinação dos parâmetros enzimáticos KM, vmax, kcat e a atividade específica são dados abaixo para o polipeptídeo tendo a SEQ ID NO: 1. A Tabela 3 mostra as taxas de reação nas concentrações de substrato ZEN respectivas, ao passo que a Figura 2 mostra os gráficos de Michaelis-Menton respectivos e a Tabela 4 mostra os parâmetros cinéticos enzimáticos correspondentes. A solução enzimática que foi usada tinha uma concentração de 68 ng/L. Tabela 3: Taxas de reação do polipeptídeo com SEQ ID NO: 1 em diferentes concentrações de ZEN. Tabela 3: Taxas de reação do polipeptídeo com SEQ ID NO: 1 em diferentes concentrações de ZEN.

Tabela 4: Parâmetros cinéticos enzimáticos do polipeptídeo tendo SEQ ID NO: 1.

[0085] As atividades específicas dos polipeptídeos testados são de 8,25 U/mg para SEQ ID NO: 1, 10,56 U/mg para SEQ ID NO: 2, 8,36 U/mg para SEQ ID NO: 3, 8,33 U/mg para SEQ ID NO: 4, 8,56 U/mg para SEQ ID NO: 5, 9,95 U/mg para SEQ ID NO: 6, 3,83 U/mg para SEQ ID NO: 7, 2,57 U/mg para SEQ ID NO: 8, 4,87 U/mg para SEQ ID NO: 9, 5,12 U/mg para SEQ ID NO: 10, 3,88 U/mg para SEQ ID NO: 11, 2,78 U/mg para SEQ ID NO: 12, 6,43 U/mg para SEQ ID NO: 13, 3,33 U/mg para SEQ ID NO: 14 e 7,76 U/mg para SEQ ID NO: 15.

[0086] As atividades específicas das variantes de polipeptídeos testadas estão listadas na Tabela 5 e na Tabela 6. Tabela 5: Atividade específica de variantes funcionais dos polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 1; segmentos de sequências de aminoácidos conservados, nos quais a mutação é localizada / as mutações são localizadas, e identidade de sequências das variantes funcionais para a sequência parental tendo SEQ ID NO: 1. A posição das mutações é dada em relação à sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 1. A identidade de sequências foi determinada por meio de BLAST, conforme descrito no Exemplo 2.

Tabela 6: Atividades específicas de variantes funcionais do polipeptídeo tendo SEQ ID NO: 2. A posição da(s) mutação(mutações) é relativa à sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 2. A identidade de sequências foi determinada por meio de BLAST conforme descrito no Exemplo 2.

Exemplo 6: Degradação de ZEN e derivad os de ZEN em milho contaminado

[0087] De modo a determinar as capacidades dos polipeptídeos para degradar ZEN e derivados de ZEN que ocorrem naturalmente em uma matriz complexa e em um pH baixo, milho contaminado foi misturado com diferentes concentrações de um dos polipeptídeos tendo SEQ ID NOs: 1 a 6 e foi rastreada a degradação de ZEN e de derivados de ZEN.

[0088] O milho contaminado foi triturado e usado no experimento de degradação em que um lote consistiria de 1 g de milho contaminado triturado, 8,9 mL de tampão de acetato a 100 mM pH 4,0 e 0,1 mL de solução de polipeptídeos. Soluções de polipeptídeos enriquecidos e purificados foram preparadas conforme descrito no exemplo 5, diluindo as mesmas até uma concentração de 10 mU/mL, 100 mU/mL e/ou 1000 mU/mL. Portanto em quantidades absolutas 1 mU (= 1 mU por grama de milho), 10 mU (= 10 mU por grama de milho) e/ou 100 mU (= 100 mU por grama de milho) foram usados no lote. Cada lote de degradação foi realizado em 25 mL e incubado a 37°C e 100 rpm com agitação. Antes de adicionar a enzima e/ou depois de 1 hora de incubação, foi colhida uma amostra de 1 mL, o polipeptídeo foi inativado por calor a 99°C por 10 minutos e a amostra foi armazenada a -20°C. Depois de degelar a amostra, os constituintes insolúveis foram separados por centrifugação. As concentrações de ZEN e de derivados de ZEN foram medidas por meio de LC/MS/MS conforme descrito por M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). O teor de ZEN e de derivados de ZEN neste milho foi de 238 ppb para ZEN, 15 ppb para α-ZEL, 23 ppb para β-ZEL, 32 ppb para Z14G e 81 ppb para Z14S. A Tabela 7 mostra a percentagem de redução no teor de ZEN e de derivados de ZEN no experimento de degradação. Tabela 7: Redução em ZEN e derivados de ZEN em percentagem com base no teor inicial no experimento de degradação com diferentes polipeptídeos e quantidades de polipeptídeos.

Exemplo 7: Aditivos contendo polipeptídeo para clivagem hidrolítica de ZEN e/ou de derivados de ZEN

[0089] De modo a preparar aditivos para clivagem hidrolítica de ZEN, sobrenadantes da fermentação de polipeptídeos expressados por P. pastoris e tendo a SEQ ID NOs: 1, 2, 6 e 13 foram purificados por microfiltração e ultrafiltração (limite de exclusão: 10 kDa) sob condições de rotina e concentrados até uma concentração de substância a seco de aproximadamente 9 % em peso. Depois disso, estas soluções contendo polipeptídeos também foram processadas adicionalmente de modo a formar pós secos sob condições de rotina em uma secadora por pulverização (Mini B290 da Büchi). Estes quatro pós foram em seguida designados como Z1, Z2, Z6 e Z13. Z1, Z2, Z6 e/ou Z13 foram adicionalmente misturados com bentonita tendo uma medida de grão média de aproximadamente 1 μm em uma proporção de 1 % em peso de aditivos Z1, Z2, Z6 e/ou Z13 e 99 % em peso de bentonita em um agitador suspenso. Os aditivos resultantes são designados como aditivos Z1.B, Z2.B, Z6.B e Z13.B. Além disso, Z1, Z2, Z6 e Z13 foram misturados com bentonita e um concentrado de elementos traço de vitamina em uma proporção de 0,1 % em peso de aditivo Z1, Z2, Z6 e/ou Z13, 0,9 % em peso de concentrado de elementos traço de vitamina e 99 % em peso de bentonita em um agitador suspenso. Os aditivos resultantes foram designados como aditivo Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS e Z13.BVS. 100 g dos aditivos Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS e Z13.BVS continham 200 mg de sulfato de ferro, 50 mg de sulfato de cobre, 130 mg de óxido de zinco, 130 mg de óxido de manganês, 2,55 mg de carbonato de cálcio, 160 mg de vitamina E, 6,5 mg de vitamina K3, 6,5 mg de vitamina B1, 14 mg de vitamina B2, 15 mg de vitamina B6, 0,15 mg de vitamina B12, 150 mg de ácido nicotínico, 30 mg de ácido pantotênico e 5,3 mg de ácido fólico.

[0090] Os aditivos foram extraídos por 30 minutos em um tampão de Tris-HCl a 50 mM pH = 8,2 e diluídos adicionalmente no mesmo tampão de modo que a concentração final de polipeptídeo foi de aproximadamente 70 ng/mL.

[0091] Depois disso, o efeito de degradação de zearalenona destas soluções foi determinado conforme descrito no Exemplo 5. As atividades correspondentes foram 8,230 U/g para Z1, 9.310 U/g para Z2, 9.214 U/g para Z6, 83 U/g para Z1.B, 92 U/g para Z2.B, 90 U/g para Z2.C, 57 U/g para Z13.B, 8 U/g para Z1.BVS, 9 U/g para Z2.BVS, 9 U/g para Z6.BVS e 6 U/g para Z13.BVS.

[0092] A capacidade para degradar os derivados de ZEN α-ZEL, β- ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S e ZAN pelos aditivos Z1, Z2, Z6, Z13, Z1.B, Z2.B, Z6.B, Z13.B, Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS e Z13.BVS foi testada conforme descrito no Exemplo 4, porém ao invés de 100 μL de um lisado celular, foi usado 100 μL de uma solução de polipeptídeos com uma concentração de polipeptídeos de aproximadamente 70 ng/mL. Depois de incubação por 6 horas, somente máx. de 15 % da quantidade de partida estava presente como derivado de ZEN não hidrolisado.

Exemplo 8: Temperatura ótima

[0093] De modo a determinar a temperatura ótima dos polipeptídeos tendo SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 e 15, eles foram clonados com um tag de 6xHis C-terminal conforme descrito no exemplo 1, expressados em E. coli e purificados. Em experimentos preliminares, foi determinada a concentração na qual uma conversão completa de ZEN pode ser assegurada sob as condições experimentais (tampão de Teorell-Stenhagen (Teorell and Stenhagen, A universal buffer for the pH range of 2.0 to 12.0. Biochem Ztschrft, 1938, 299:416-419), pH 7,5 com 0,1 mg/mL de BSA a 30°C) depois de um tempo experimental de 3 horas. As preparações foram usadas nas concentrações determinadas deste modo nos lotes de degradação para determinar a temperatura ótima. Os experimentos foram realizados em um ciclador de PCR (PCR Cycler da Eppendorf) usando a função de gradiente de temperatura a 20°C ± 10°C, a 40°C ± 10°C e, caso necessário, a 60°C ± 10°C (10 temperaturas na respectiva faixa; temperaturas predefinidas pelo ciclador de PCR). Para os lotes, tampão de Teorell-Stenhagen foi misturado com a concentração de enzima correspondente e 0,1 mg/mL de BSA mais 5 ppm de ZEN no pH ótimo respectivo. Lotes com 0,1 mg/mL de BSA e 5 ppm de ZEN sem adição de uma enzima foram usados como controles negativos. Depois de um tempo de incubação de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h e 3 h, foi tomada uma amostra por temperatura de incubação, inativada termicamente por 10 minutos a 99°C e armazenada a -20°C. Depois de degelar, as amostras foram transferidas para frascos de HPLC. ZEN, HZEN e DHZEN foram analisados por HPLC-DAD. Para fazer isto os metabólitos foram separados cromatograficamente sobre uma coluna Zorbax SB-Aq C18 com as dimensões de 4,6 mm x 150 mm e uma medida de partícula de 5 μm. Uma mistura de metanol e água com 5 mM de acetato de amônio foi usada como a fase móvel. Foi registrado o sinal de UV a 274 nm. Os metabólitos foram quantificados incluindo séries de rotina incorporadas. As temperaturas ótimas foram determinadas com base nas inclinações determinadas para as curvas de degradação, em que a temperatura ótima foi definida como a temperatura na qual a inclinação foi a maior. A Tabela 8 mostra as temperaturas ótimas. Tabela 8: Temperaturas ótimas dos polipeptídeos.

Exemplo 9: Estabilidade térmica

[0094] De modo a determinar a estabilidade térmica dos polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 e 15, estes foram clonados com um tag de 6xHis C-terminal conforme descrito no Exemplo 1, expressados em E. coli e purificados. Em seguida foram incubados no ciclador de PCR com uma função de gradiente na temperatura ótima respectiva de ±10°C. Depois de 0 min, 15 min, 30 min e 60 min, uma amostra foi tomada por lote e por temperatura. Estas amostras pré-incubadas foram em seguida usadas em um experimento de degradação no tampão de Teorell-Stenhagen no pH ótimo respectivo com 0,1 mg/mL de BSA e 5 ppm de ZEN. Em experimentos preliminares, a concentração na qual pode ser assegurada uma reação completa de ZEN depois de uma duração experimental de 3 horas sob as condições experimentais (tampão de Teorell-Stenhagen, pH 7,5 com 0,1 mg/mL de BSA a 30°C) foi determinada para cada polipeptídeo. A concentração enzimática respectiva determinada deste modo foi usada nos lotes. Os lotes de degradação foram incubados a 30°C. Foi realizada amostragem depois de um tempo de incubação de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h e 3 h. Em seguida, os polipeptídeos foram inativados termicamente por 10 minutos a 99°C e as amostras foram armazenadas a -20°C. Depois de serem degeladas, as amostras foram transferidas para frascos de HPLC e analisadas por HPLC-DAD, conforme descrito no Exemplo 8.

[0095] Estabilidade térmica é definida como a temperatura na qual os polipeptídeos têm uma 50 % de atividade residual em comparação com a temperatura ótima depois de 15 minutos de pré-incubação. Como uma medida da atividade, é usada a inclinação nas curvas de degradação. As estabilidades de temperatura são mostradas na Tabela 9. Tabela 9: Estabilidade de temperatura dos polipeptídeos (50 % de atividade residual depois de pré-incubação por 15 minutos).

Exemplo 10: pH ótimo

[0096] De modo a determinar o pH ótimo dos polipeptídeos que têm SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 e 15, eles foram clonados com um tag de 6xHis C-terminal conforme descrito no Exemplo 1, expressados em E. coli e purificados. Em experimentos preliminares, a concentração na qual pode ser assegurada uma conversão completa de ZEN depois de uma duração experimental de 3 horas sob as condições experimentais foi determinada para cada polipeptídeo (tampão de Teorell-Stenhagen, pH 7,5 com 0,1 mg/mL de BSA a 30°C). A concentração de enzima respectiva foi usada nos lotes. Os lotes de degradação foram realizados em um tampão de Stenhagen em níveis de pH de 3,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11,0 e 12,0. Para os lotes de degradação com 0,1 mg/mL de BSA e 5 ppm de ZEN, foi feita incubação a 30°C. Lotes em tampão de Teorell- Stenhagen foram usados como os controles negativos em pH 3,0, pH 7,0 e pH 12,0 com 0,1 mg/mL de BSA e 5 ppm de ZEN. A amostragem foi realizada depois de um tempo de incubação de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h e 3 h. Em seguida os polipeptídeos foram inativados termicamente por 10 minutos a 99°C e as amostras foram armazenadas a -20°C. Depois de degelar, as amostras foram transferidas para frascos de HPLC e analisadas por HPLC-DAD conforme descrito no Exemplo 8. O pH ótimo foi determinado com base nas inclinações encontradas para as curvas de degradação, em que o pH no qual a inclinação foi a maior foi definido como o pH ótimo. A Tabela 10 mostra os níveis de pH ótimo. Tabela 10: pH ótimo dos polipeptídeos.

Exemplo 11: Es tabilidad e do pH em pH 5,0

[0097] De modo a determinar a estabilidade do pH, os polipeptídeos do Exemplo 10 foram incubados por uma hora a 25°C em tampão de Teorell-Stenhagen em pH 5,0 e no pH ótimo respectivo. Estas amostras pré-incubadas foram usadas em um experimento de degradação nas mesmas concentrações do polipeptídeo respectivo como as usadas para determinar o pH ótimo em 100 mM de tampão de Tris-HCl no pH ótimo respectivo com 0,1 mg/mL de BSA e 5 pm de ZEN no lote. Os lotes foram incubados na temperatura ótima respectiva. A amostragem foi realizada depois de um tempo de incubação de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h e 3 h. Em seguida os polipeptídeos foram inativados termicamente por 10 minutos a 99°C e as amostras foram armazenadas a -20°C. Depois de degelar, as amostras foram transferidas para frascos de HPLC e analisadas por meio de HPLC-DAD conforme descrito no Exemplo 8. A estabilidade do pH é definida como a percentagem de atividade residual dos polipeptídeos em pH 5,0 em relação à atividade no pH ótimo respectivo. As estabilidades de pH para 5,0 são mostradas na Tabela 11. Tabela 11: Estabilidade de pH dos polipeptídeos a pH 5,0.

Exemplo 12: Experimento de degradação de Z EN

[0098] A degradação de ZEN para HZEN e DHZEN foi realizada como um exemplo para os polipeptídeos com SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 e 15. Os lotes de degradação foram realizados em tampão de Teorell-Stenhagen pH 7,5 com 0,1 mg/mL de BSA e 5 ppm de ZEN. Os lotes de degradação foram incubados a 30°C. A amostragem foi realizada depois de um tempo de incubação de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h e 3 h. Em seguida os polipeptídeos foram inativado termicamente por 10 minutos a 99°C e as amostras foram armazenadas a -20°C. Depois de descongelar, as amostras foram transferidas para frascos de HPLC e analisadas por HPLC-DAD, conforme descrito no Exemplo 8. A concentração de polipeptídeos foi selecionada de modo a que fosse obtida completa degradação depois de aproximadamente 3 horas. A Figura 3 mostra a cinética de degradação, onde o eixo y mostra a concentração de ZEN, HZEN e DHZEN em micromoles por litro (μmol/L) e o eixo x mostra o tempo de incubação em horas (h).

[0099] μM denota micromolar e corresponde à unidade μmol/L.

Claims (4)

1. Processo para a dissociação hidrolítica de zearalenona e/ou de pelo menos um derivado de zearalenona, caracterizado pelo fato de que zearalenona e/ou pelo menos um derivado de zearalenona é/são hidrolisado(s) por um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou de uma variante funcional da mesma, em que a variante funcional compreende pelo menos uma mutação da sequência de aminoácidos, com relação a SEQ ID NO: 1, selecionada do grupo D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, ΔP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é usado em um aditivo para a dissociação hidrolítica de zearalenona e/ou pelo menos um derivado de zearalenona em rações para porcos, aves e aquacultura, em alimentos ou em grãos de destilaria secos e solúveis, em que o aditivo contem pelo menos um polipeptídeo com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante funcional da mesma, e substâncias auxiliares também estão presente; em que as substâncias auxiliares são selecionados de pelo menos um veículo inerte, vitaminas, minerais, enzimas selecionadas de proteases, amilase, celulase ou glucanases, hidrolases, enzimas lipolíticas, manosidase, oxidases, oxidorredutases, fitases, xilanases e/ou combinações das mesmas, e/ou componentes adicionais para desintoxicação de micotoxinas selecionados de aflatoxina oxidase, ergotamina hidrolases, ergotamina amidases, zearalenona esterases, zearalenona lactonases, ocratoxina amidases, fumonisina carboxil esterases, fumonisina aminotransferases, aminopoliol aminooxidases, desoxinivalenol epóxido hidrolases e/ou pelo menos um microrganismo de degradação de micotoxinas Bacillus subtilis e/ou pelo menos um componente de ligação de micotoxinas, selecionado de paredes celulares microbianas e bentonitas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou o aditivo é misturado com uma ração ou alimento contaminado com uma zearalenona e/ou com pelo menos um derivado de zearalenona; a ração ou alimento contaminado é posto em contato com umidade, e o polipeptídeo ou o aditivo hidrolisa a zearalenona ou o pelo menos um derivado de zearalenona contido na ração ou alimento contaminado.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, particularmente pelo menos 90% da zearalenona e/ou pelo menos um derivado de zearalenona é/são hidrolisado(s).

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