KR20160044040A - 제아랄레논 및/또는 자아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 폴리펩티드, 이의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 함유하는 첨가제, 상기 폴리펩티드의 용도 및 방법 - Google Patents

제아랄레논 및/또는 자아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 폴리펩티드, 이의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 함유하는 첨가제, 상기 폴리펩티드의 용도 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해로 절단하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가 서열 ID 번호 1 내지 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 갖는 하이드롤라제이며, 작용성 변이체의 서열이 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 40% 동일한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 폴리펩티드를 함유하는 첨가제; 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드; 및 폴리펩티드를 이용하여 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논을 가수분해 절단하는 방법에 관한 것이다.

Description

제아랄레논 및/또는 자아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 폴리펩티드, 이의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 함유하는 첨가제, 상기 폴리펩티드의 용도 및 방법 {POLYPEPTIDE FOR THE HYDROLYTIC CLEAVAGE OF ZEARALENONE AND/OR ZEARALENONE DERIVATIVES, ISOLATED POLYNUCLEOTIDE THEREOF, AND ADDITIVE CONTAINING POLYPEPTIDE, USE OF SAID POLYPEPTIDE AND METHOD}
본 발명은 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 물론 이러한 폴리펩티드를 함유하는 첨가제, 및 이러한 폴리펩티드의 용도 및 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 방법에 관한 것이다.
마이코톡신은 실모양 진균류에 의해 생성된 이차 대사산물이다. 중요한 대표적인 마이코톡신은 제아랄레논 (ZEN)이며, 이는 F-2 톡신으로서 이전에 공지되어 있으며, 이는 다양한 푸사리움 (Fusarium ) 진균에 의해 생성되며, 전 세계에 걸쳐 발견될 수 있다. 이러한 진균류는 특히 배양된 식물, 예컨대, 다양한 유형의 곡물에서 우글거리며, 여기에서 진균류의 성장 및/또는 마이코톡신 생성이 저장 전에 발생할 수 있는 경우 또는 심지어 수확 후, 저장 전 또는 부적절한 저장 조건하에서 발생할 수 있는 경우 진균류 침입은 수확 전에 일반적으로 발생한다. FAO는 전 세계에 걸친 농업 작물의 25%가 마이코톡신으로 오염되어, 상당한 경제적 손실을 초래하는 것으로 추정하였다. 최근에 완료된 국제 연구에서, 2009년 1월부터 2011년 12월까지 총 23,781개의 샘플이 분석되었으며, 이중 81%는 적어도 하나의 마이코톡신에 대해 양성으로 평가되며, 45%는 ZEN에 대해 양성으로 평가된다. ZEN은 세계 모든 지역 및 평가된 모든 유형의 곡물 및 목초 예컨대, 옥수수, 콩가루, 밀, 밀기울, DDGS (주정 혼합박)는 물론 마무리된 동물 먹이 혼합물에서 100% 이하의 발생률로 발견되었다.
ZEN은 폴리켑티드 대사 경로에 의해 합성된 하기 구조식을 갖는 비스테로이드 에스트로겐 마크로시클릭 락톤이며, IUPAC 명명법에 따른 이의 명칭은 (2E,11S)-15,17-디하이드록시-11-메틸-12-옥사-바이시클로[12.4.0]옥타데카-1(18),2,14,16-테트라엔-7,13-디온이다:
Figure pct00001
그러나, 다양한 ZEN 유도체가 또한 자연에서 발생하며, ZEN의 효소적 또는 화학적 변형에 의해 형성될 수 있다. 예로는 진균류, 식물 또는 포유동물 대사에 의해 형성된 글리코시드 ZEN 컨쥬게이트 또는 설페이트를 함유하는 이러한 컨쥬게이트는 물론 특히, 인간 또는 동물 유기체에서 형성된 ZEN 대사산물을 포함한다. ZEN 유도체는 자연적으로 발생하거나 화학적 또는 생화학적 합성에 의해 합성되는 ZEN 컨쥬게이트 또는 ZEN 대사산물인 것으로 하기에서 이해되며, 특히, α-제아랄레놀 (α-ZEL; (2E,7R,11S)-7,15,17-트리하이드록시-11-메틸-12-옥사바이시클로-[12.4.0]-옥타데카-1(18),2,14,16-테트라엔-13-온), β-제아랄레놀 (β-ZEL; (2E,7S,11S)-7,15,17-트리하이드록시-11-메틸-12-옥사-바이시클로[12.4.0]옥타데카-1(18),2,14,16-테트라엔-13-온), α-제아랄라놀 (α-ZAL; (7R,11S)-7,15,17-트리하이드록시-11-메틸-12-옥사바이시클로[12.4.0]옥타데카-1(18),14,16-트리엔-13-온), β-제아랄라놀 (β-ZAL; (7S,11S)-7,15,17-트리하이드록시-11-메틸-12-옥사바이시클로[12.4.0]옥타데카-1(14),15,17--트리엔-13-온), 제아랄레논 14-설페이트 (Z14S; [(2E,11S)-15-하이드록시-11-메틸-7,13-디옥소-12-옥사바이시클로[12.4.0]옥타데카-1(18),2,14,16-테트라엔-17-일] 하이드로겐 설페이트), 제아랄레논-14-글리코시드 (Z14G; (2E,11S)-15-하이드록시-11-메틸-17-[(3R,4S,5S,6R)--3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)-테트라-하이드로피란-2-일]옥시-12-옥사바이시클로[12.4.0]옥타데카-1(18)2,14,16-테트라엔-7,13-디온) 및 제아랄라논 (ZAN; (11S)-15,17-디하이드록시-11-메틸-12-옥사-바이시클로-[12.4.0]-옥타데카-1(18),14,16-트리엔-7,13-디온)이다.
ZEN 및 ZEN 유도체, 특히, α-ZEL, β-ZEL, Z14S, α-ZAL, β-ZAL, Z14G 및 ZAN은 또한, 이들의 높은 화학적 및 물리적 안정성으로 인해 처리된 식품 및 동물 먹이 제품 예컨대, 빵 또는 맥주에서 검출될 수 있다.
ZEN은 에스트로겐 수용체에 결합하며, 호르몬 파괴를 초래할 수 있으며, 이는 경구 섭취 직 후 흡수되며 포유동물에 의해 2개의 입체이성질체 대사산물 α-ZEL 및/또는 β-ZEL으로 전환된다. 예를 들어, α-ZEL는 물론 또한, α-ZAL 및/또는 ZAN은 ZEN보다 더욱 강한 에스트로겐 효과를 갖는다. 한편, 컨쥬게이팅된 ZEN 유도체는 ZEN보다 더 낮은 에스트로겐 활성을 가지나, ZEN은 일부 환경하에 소화관에서 이들 ZEN 유도체로부터 다시 방출될 수 있다.
ZEN이 비교적 낮은 급성 독성을 가지며, 20,000 mg/kg 체중 이하의 경구 LD50를 가지나, 아급성 및/또는 아만성의 독성 효과 예컨대, 기형발생, 발암, 에스트로겐 및 면역억제 효과가 연장되게 노출된 동물 또는 인간에서 발생할 수 있다. ZEN으로 오염된 음식은 포유 동물에서 발달 장애를 초래하는데, 돼지 특히, 돼지 새끼는 ZEN에 극도로 민감하다. 음식 중 0.5 ppm 초과의 ZEN 농도는 발달 장애를 초래하며, 예를 들어, 돼지에서의 1.5 ppm 초과의 농도는 하이퍼에스테로겐성을 초래할 수 있으며, 12 ppm 농도의 ZEN은 소에서 계속되는 낙태의 원인이 되었다. 제아랄레논은 점막을 통해 특히, 위점막은 물론 구강 점막을 통해 신속하게 흡수되기 때문에, 즉각적이고 정량적 불활성화가 필수적이다. ZEN은 경구 투여 후 심지어 30분에 혈액중에 검출될 수 있다. 이러한 경우, 분리된 효소의 사용은 미생물과 관련하여 일부 이점 예컨대, 더 높은 특이 활성 또는 더 빠른 효과를 제공한다. ZEN의 해로운 효과로 인해, 유럽 연합은 식품에서 ZEN에 대한 법적 구속력의 상한치는 물론 동물 사료에서 ZEN의 상한치에 대한 권고치를 갖는다 (EC No. 1881/2006).
식품 및 동물 먹이 제품의 ZEN 오염을 감소시키기 위한 주요 전략은 예를 들어, "농산물 우수관리 제도"를 유지함으로써 진균류의 성장을 제한하는 것이다. 이는 특히, 씨앗에 해충 및 진균류 침입이 없거나 농업 폐기물 제품이 현장에서 신속히 제거됨을 보장하는 것을 포함한다. 또한, 현장에서 진균류 성장은 살진균제의 사용을 통해 감소될 수 있다. 수확 후, 수확된 물질은 15% 미만의 잔류 수분율 수준 및 저온으로 저장되어 진균류의 성장을 방지해야 한다. 마찬가지로, 진균류 침입에 의해 오염된 물질은 추가의 가공전에 제거되어야 한다. 조치 목록에도 불구하고, 아이. 로드리게스 (I. Rodriges) 및 케이. 내러 (K. Naehrer) (2012)는, 2009년에서 2011년까지 심지어 가장 높은 농림 규격을 갖는 지역 예컨대, 미국 및 중앙 유럽에서도 각각 29% 및 39%의 검사된 옥수수 샘플이 ZEN으로 오염되었음을 보고하였다.
식품 또는 동물 먹이 제품으로부터 ZEN 제거를 위한 추가의 가능성은 마이코톡신의 흡착 및/또는 변형을 포함한다. 이는 마이코톡신의 흡착제로서의 결합이 넓은 pH 범위에 걸쳐 강하고 특이적이어야 하며, 위장관에서 안정적으로 유지되어야 함을 요구하고 있다. 일부 비생물학적 흡착제 예컨대, 활성탄 및 실리케이트 또는 합성 폴리머 예컨대, 콜레스티라민이 아플라톡신에 대해 효과적으로 사용될 수 있지만, 기타 마이코톡신에 대한 이들의 사용은 제한된다. 흡착제의 주요 단점은 일부 경우에 영양에 필수적인 다른 분자로의 비특이적 결합이다. 생물학적 흡착제 예컨대, 효모 또는 효모 추출물이 또한 문헌에 기술되어 있으나, 비생물학적 흡착제의 한계와 유사한 한계를 갖는다.
물리적 및 화학적 처리에 의한 ZEN의 탈독소화가 또한 제한된다. ZEN은 열 처리에 의해 효과적으로 불활성화될 수 없으나, ZEN 함량은 산화제 예를 들어, 10% 과산화수소 용액으로 16시간 동안 80℃에서 압출 및 처리함으로써 83.9% 만큼 감소될 수 있다. 식품 및 동물 먹이 제품의 생산에서 압출 방법 및 산화제 예컨대, 오존 또는 과산화수소의 사용은 높은 비용, 품질의 손실 및 일부 경우에, 낮은 효능 및 낮은 특이성으로 인해 제한된다.
미생물 예컨대, 트리초스포론 마이코톡시니보란스 (Trichosporon mycotoxinivorans), 글리오클라디움 로세움 (Gliocladium roseum) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 및/또는 이들로부터 분리된 효소 예컨대, 하이드롤라제 또는 퍼옥시다제에 의한 ZEN의 생변형 (biotransformation)은 예를 들어 문헌 [E. Vekiru et al. in Appl. and Environ. Microb., 2010, 76, 7, 2353-2359]에 기술되어 있다.
EP 0 938 575 B1은 속 로도코커스 (Rhodococcus) 또는 노카르디아 (Nocardia) 특히, R. 글로베룰루스 (R. globerulus), R. 에리트로폴리스 (R. erythropolis) 및 N. 글로베룰라 (N. globerula)의 박테리아의 ZEN-분해 특성을 기술하였다.
WO 02/076205는 촉매 트리아드 (triad)에 의한 ZEN의 분해를 촉매작용하는 α,β-하이드롤라제 및 제아랄레논 하이드롤라제 1 (ZHD1)를 포함하는 글리오클라디움 로세움 (Gliocladium roseum)으로부터 분리된 효소의 ZEN-분해 효과를 기술한다.
WO 2012/113827은 재조합 조나제 즉, ZEN을 분해하고 위장관에서 안정한채 유지되는 효소를 기술한다. 이들은 미생물 예컨대, 특히 써모비피디아 푸스카 (Thermobifidia fusca), 스트렙토마이세스 엑소폴리에이트 (Streptomyces exfoliates), 아시도보란스 델라피엘디이 (Acidovorans delafieldii) 및 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.)을 포함한다.
ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체를 가수분해할 수 있는 폴리펩티드 또는 효소가 또한 조나제로서 명명될 수 있다.
이하에 사용된 용어는 기술 용어로부터 취해진 것이며, 각각은 상반되는 무언가가 언급되지 않는 한 전통적인 의미로 사용된다. 따라서, 예를 들어, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 조절 요소, 구조 요소, 유전자 군, 플라스미드, 전체 게놈 및 이의 단편을 포함하는, 모든 유형의 모든 길이의 유전자 물질 및 서열 예컨대, 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 및 RNA 분자에 관한 것이다. 명칭 "폴리펩티드"는 단백질 예컨대, 예를 들어, 효소, 항체 및 500개 이하의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 예컨대, 예를 들어, 펩티드 억제제, 단백질의 도메인 또는 또한 짧은 서열 길이 예를 들어, 10개 미만의 아미노산을 갖는 짧은 폴리펩티드, 예컨대, 수용체, 리간드, 펩티드 호르몬, 태그 및 기타 등등을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 명칭 "위치"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열에서 단일 특이적 염기 또는 아미노산에 관한 것이다.
이제 본 발명은 폴리펩티드를 이용 가능하게 만드는 것을 목적으로 하며, 이러한 폴리펩티드를 이용하여 ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체를 가수분해된 ZEN 및/또는 가수분해된 ZEN 유도체로 신속하게 믿을만하게 변형시키는 것이 가능하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 폴리펩티드가 서열 ID 번호 1 내지 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 갖는 하이드롤라제이며, 작용성 변이체와 아미노산 서열중 적어도 하나 간의 서열 동일성이 적어도 70%임을 근본적으로 특징으로 한다.
본 발명에 따른 용어 "서열 동일성"은 서열 동일성 백분율에 관한 것이다. 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 있어서, 서열 동일성은 육안으로 측정될 수 있으나, 바람직하게는 컴퓨터 프로그램에 의해 계산된다. 서열 비교는 또한 서열 세그먼트 내에서 수행되며, 세그먼트는 기준 서열의 연속 서열인 것으로 이해되며, 바람직하게는 서열의 보존된 부위를 포함한다.
본 건의 경우, 서열 동일성은 NCBI BLAST 프로그램 (BLAST = Basic Logic Alignment Search Tool) 특히, 폴리펩티드에 있어서는 BLASTP 및 폴리뉴클레오티드에 있어서는 BLASTN의 도움으로 측정되며, 이들은 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 홈페이지에서 입수가능하다. 따라서, 알츌 (Altschul) 등 [1997 (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)]의 알고리즘에 따라 2개 이상의 서열을 서로 비교하는 것이 가능하다. 본 발명의 이러한 목적에 있어서, 프로그램은 2013년 5월 15일 버젼으로 사용하였다. 기본 세팅이 프로그램 세팅으로서 사용되었으며, 특히 아미노산 서열 비교에 있어서 "최대 표적 서열" = 100; "예측 문턱값" = 10' "워드 크기" = 3; "매트릭스" = BLOSOM62; "캡 코스트 (gap costs)" = "존재: 11; 확장: 1"; "컴퓨터 조정" = "조건부 조성 스코어 매트릭스 조정" 및 뉴클레오티드 서열 비교에 있어서, 워드 크기: 11; 예상 값: 10; 갭 코스트: 존재 = 5, 확장 = 2; 필터 = 활성화된 낮은 복잡도; 매치/미스매치 스코어: 2-3; 필터 스트링: L; m이 사용되었다.
용어 "작용성 폴리펩티드 변이체" 또는 "작용성 변이체"는 먼저 폴리펩티드의 "대립 변이체" 및 폴리펩티드의 "작용성 단편"에 관한 것이며, 두 번째로는 폴리펩티드의 "변경"에 관한 것이며, 여기에서 효소 작용은 근본적으로 변화되지 않는다. 용어 "대립 변이체"는 뉴클레오티드 서열에서 돌연변이(들)를 자연적으로 발생시키고 아미노산 서열에서 변경을 초래함으로써 형성된 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기에서 이의 효소 작용은 영향을 받지 않는다. "변경"은 예를 들어, 폴리펩티드 또는 돌연변이된 폴리펩티드를 지닌 C- 또는 N-말단 융합일 수 있으며, 여기에서 돌연변이는 적어도 하나의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실, 특히, 부위-특이적 돌연변이유발, 즉, 임의 돌연변이유발, 재조합 및/또는 임의의 기타 단백질 조작 방법에 의해 획득될 수 있다. 용어 "치환", "삽입" 및 "결실"은 유전자 조작에서 당업자에게 친숙한 공통된 의미로 본원에서 사용된다. 용어 "작용 단편"은 폴리펩티드의 일부 또는 서브서열 또는 이의 작용성 변이체의 일부 및/또는 서브서열을 지칭하며, 여기에서 효소 작용은 근본적으로 유지된다. 효소 작용은 특히, 효소 반응 메카니즘이 변화되지 않은채 유지되는 경우 보존되며 즉, 마이코톡신은 동일한 위치에서 가수분해되며, 특정 잔여 활성 "작용성 변이체"는 원래 폴리펩티드를 기준으로 하여 적어도 5%, 바람직하게는, 적어도 10%, 특히 적어도 10% 및 특히 적어도 50%에 해당한다. 서열 ID 번호 1 내지 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 서로의 또는 하나의 및 동일한 효소의 작용성 대립유전자 변이체이며, 여기에서 서열은 다양한 미생물로부터 기원한다. 이는 서열 동일성 백분율에 의해 측정되는 서로 간의 밀접한 관계 및 모든 폴리펩티드가 동일한 분해 메카니즘에 의해 ZEN 및 ZEN 유도체에 작용한다는 점으로부터 분명히 인지 가능하다.
서열 ID 번호 1 내지 15를 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 서로에 대한 유사성으로 인해, 이들 폴리펩티드 중 하나의 작용성 변이체는 서열 ID 번호 1 내지 15를 갖는 청구된 폴리펩티드 중 하나 초과와 적어도 40%의 서열 동일성을 가질 수 있음이 가능하다.
이러한 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체의 선택을 통해, ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체의 놀랍게도 신속하고 완전한 가수분해가 검출되었다.
본 발명의 바람직한 추가의 개발에 상응하는 바와 같이, 폴리펩티드는 적어도 하나의 보존된 아미노산 서열 세그먼트 또는 이의 작용성 변이체를 함유하는 아미노산 서열을 가지며, 아미노산 서열 세그먼트의 작용성 변이체는 적어도 70%, 바람직하게는, 적어도 84%, 더욱 바람직하게는, 적어도 92% 및 가장 바람직하게는, 적어도 98%의 서열 동일성을 가지며, 적어도 하나의 보존된 아미노산 서열 세그먼트는 서열 ID 번호 1을 갖는 서열의 아미노산 서열 +24 내지 +50, +52 내지 +77, +79 내지 +87, +89 내지 +145, +150 내지 +171, +177 내지 +193, +223 내지 +228, +230 내지 +237, +239 내지 +247, +249 내지 +255, +257 내지 +261, +263 내지 +270, +272 내지 +279, +297 내지 +301, +303 내지 +313, +24 내지 328, +1 내지 +328의 군으로부터 선택된다. 적어도 하나의 이러한 보존된 아미노산 서열 세그먼트의 존재로 인해, ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체의 신속하고 완전한 가수분해 이외에, 또한 사전에 공지된 ZEN 분해 폴리펩티드와 비교하여 특히 높은 활성 값을 갖는 폴리펩티드를 이용 가능하게 하는 것이 가능하였다.
본 발명의 추가의 작용성 개발에 따르면, 작용성 변이체가 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및 삽입의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변경을 갖는 경우 동등하게 우수한 결과가 달성되었다.
폴리펩티드가 적어도 0.01 U/mg, 바람직하게는, 적어도 0.1　U/mg, 특히 적어도 1 U/mg의 특이 활성; 및/또는 최대 50　μM, 바람직하게는, 최대 3.5 μM, 특히 최대 0.5 μM의 ZEN의 가수분해 절단의 KM 값; 및/또는 적어도 0.05 s-1, 바람직하게는, 적어도 0.6 s-1, 특히, 적어도 5 s-1의 ZEN의 가수분해 절단의 kcat 값; 및/또는 적어도 0.00001 μM- 1 s-1, 바람직하게는, 적어도 0.0001 μM-1 s-1, 특히, 적어도 0.001 μM- 1 s-1의 ZEN의 가수분해 절단의 vmax 값을 갖는 방식으로 본 발명을 추가로 개발함으로써, ZEN 및/또는 ZEN 유도체는 특히 신속하고 완전하게 가수분해될 수 있으며, 특히 탈독소화된다.
추가로, 폴리펩티드는 서열 ID 번호 2, 5 내지 7, 9, 11, 12 및 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 함유할 수 있으며, 여기에서 작용 변이는 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 40% 서열 동일성을 가지며, pH 5.0에서의 폴리펩티드의 pH 안정성은 적어도 15　%, 바람직하게는, 50　% 및 특히, 바람직하게는, 90　%에 해당한다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체가 예를 들어, 포유동물 위와 같은 산성 매질에서도 절단되고/거나 탈독소화될 것임을 보장하는 것이 가능하다. 폴리펩티드의 pH 안정성은 각각 최적의 pH에서의 활성과 관련하여 pH 5.0에서의 폴리펩티드의 잔여 활성도 백분율로서 본원에서 규정된다.
본 발명의 추가의 개발에 따르면, 폴리펩티드는 서열 ID 번호 1,2, 5 내지 7, 9, 11, 12 및 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 함유할 수 있으며, 여기에서 작용성 변이체는 아미노산 서열 중 적어도 하나와의 적어도 40%의 서열 동일성을 가져서, 폴리펩티드는 30℃ 내지 75℃, 바람직하게는, 38℃ 내지 55℃, 특히, 바람직하게는, 38℃ 내지 52℃의 온도 범위에서 가장 높은 효소 활성을 갖는다. 이러한 종류의 추가의 개발에 의해, 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체는 또한 중온성 온도 특히, 인간 및 농장 동물의 체온에서도 폴리펩티드에 의해 가수분해되고/거나 탈독소화됨이 보장된다. 폴리펩티드가 가장 높은 효소 활성을 갖는 온도가 폴리펩티드의 최적 온도로서 규정된다.
본 발명의 추가의 개발에 따르면, 폴리펩티드는 서열 ID 번호 1, 5, 6, 9, 11, 12 및 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 가지며, 작용성 변이체는 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 40%의 서열 동일성을 가지며, 폴리펩티드는 90℃, 바람직하게는, 75℃ 및 특히, 바람직하게는, 60℃의 온도 이하에서 열적으로 안정적이다. 이는 폴리펩티드 및 이의 효소 작용이 예를 들어, 컨테이너에서 해상 운송 동안 또는 먹이의 펠렛화 동안 발생할 수 있는 것과 같은 증가된 온도 스트레스 하에서도 근본적으로 온전한 채 유지될 것임을 보장한다. 폴리펩티드의 열 안정성은, 15분의 예비 인큐베이션 후, 폴리펩티드가 각 최적 온도에서의 활성과 비교하여 50%의 잔여 활성을 갖는 온도로서 규정된다.
폴리펩티드는 α,β-하이드롤라제를 갖도록 선택될 수 있으며, 이는 제아랄레논 및/또는 ZEN 유도체의 에스테르 기의 산소-독립적 및 보조인자-비함유 가수분해 절단에 적합하며, 가수분해 절단을 촉매하고 세린, 글루탐산과 아스파르트산으로부터 선택된 산성 아미노산 특히, 아스파트르산 및 히스티딘으로 구성된 아미노산 트리아드를 가지며, 이러한 촉매 트리아드는 예를 들어, S128, D264 및 H303이며, 여기에서 서열 ID 번호 1과 관련하여 정위가 도시된다.
ZEN 및 ZEN 유도체의 가수분해는 하기 반응 메카니즘에 따라 제아랄레논 또는 이의 유도체의 에스테르 기 상에서 서열 ID 번호 1 내지 15의 폴리펩티드 중 임의의 폴리펩티드로 성공한다:
Figure pct00002
ZEN이 가수분해되어 비독성의 가수분해된 제아랄레논 (HZEN) 및/또는 가수분해된 ZEN 유도체를 형성하는 것은 본 발명에 따른 폴리펩티드 특히, α,β-하이드롤라제에 의해 발생한다. HZEN의 탈카르복실화된 가수분해 ZEN (DHZEN) 및/또는 탈카르복실화된 가수분해 ZEN 유도체로의 추가의 탈카르복실화는 일반적으로 저절로 발생한다.
특히, 상기 언급된 촉매 트리아드에 의해, ZEN 및 ZEN 유도체를 완전히 가수분해하는 것이 가능하며, 여기에서 분해 반응은 특히, 산성 범위의 pH에서 우수한 pH 안정화 효과를 갖는다.
놀랍게도, 상기 언급된 촉매 트리아드의 세린 앞에 3개의 아미노산 및 세린 뒤의 3개 아미노산으로 구성된 서열 세그먼트에서 Y, Q, N, T, K, R, E, D로부터 선택된 적어도 하나의 극성 아미노산 및 F, M, L, I, V, A, G, P로부터 선택된 적어도 하나의 비극성 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 사용하여 균일하게 우수한 결과를 달성하는 것이 가능하며, 적어도 하나의 효소 동력학적 계수를 증가시키는 것이 또한 가능함을 발견하였다.
본 발명의 바람직한 개선에서, 폴리펩티드는 하기 위치 중 적어도 하나에서 서열 ID 번호 1에 대한 아미노산 서열의 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311, 314, 317, 319, 321, 323, 325 및 326. 이들 위치는 SEQ ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드와 특히 활성이며 이 서열과 높은 정도의 동일성을 갖는 서열 ID 번호 2 내지 6을 갖는 폴리펩티드 간의 서열 차이로부터 유래된다. 서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드가 이들 위치 중 적어도 하나에서 변경되어 서열 ID 번호 2 내지 6의 아미노산 변이가 이 위치에서 취해질 수 있는 경우, 이들 위치는 폴리펩티드의 효소 반응속도 계수에 유의한 영향을 끼치며, 서열 ID 번호 1과 또한 추가로 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 서열 ID 번호 2 내지 6의 조합은 더 높은 활성으로 이어질 것임을 입증하는 것이 가능하다.
본 발명의 한 개선에 따르면, 폴리펩티드는 서열 ID 번호 1과 관련하여 아미노산 서열에서 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, ΔP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P. 이러한 폴리펩티드를 이용하여, 짧은 기간 내에 ZEN을 완전히 가수분해 하는 것이 가능하며, 특히 이를 탈독소화하는 것이 가능하며, 여기에서 폴리펩티드의 특이 활성은 적어도 6.00 U/mg, 바람직하게는, 적어도 7.00 U/mg, 특히, 적어도 8.00 U/mg에 해당한다. 단위 "U" 또는 또한 "유닛"은 절대 촉매 활성의 척도이며, 50 mM Tris-HCl 완충제 (pH 8.2)중 32℃에서 분 당 1 μmol ZEN의 가수분해로 규정되며, 여기에서 "촉매 활성"은 규정된 반응 조건하에 기질의 효소적 전환을 나타내는 것으로 이해되며, "특이 활성"은 촉매 활성도 및 폴리펩티드 질량 농도의 비 (부피 유닛 당 질량)를 나타내는 것으로 이해된다.
서열 ID 번호 32 내지 50의 서열을 갖는 하기 아미노산 모티프 중 적어도 하나가 함유되도록 폴리펩티드가 구현되는 경우, 그러면 적어도 l7.00 U/mg, 바람직하게는, 적어도 8.00 U/mg의 특이 활성을 갖는 폴리펩티드를 이용가능하게 하는 것이 가능하다. 서열 ID 번호 51 내지 58의 서열을 갖는 하기 아미노산 모티프 중 적어도 하나가 폴리펩티드에 함유되는 경우, 폴리펩티드의 효소 활성은 예를 들어, 7개 아미노산을 함유하는 모티프와 비교하여 더욱 증가함이 놀랍게도 밝혀졌다. 서열 ID 번호 59 내지 69의 서열을 갖는 아미노산 모티프 중 적어도 하나가 폴리펩티드에 함유되는 경우 심지어 더 높은 특이 활성이 달성된다.
마지막으로, 본 발명의 추가의 개발에 따르면, 폴리펩티드는 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 보존성 아미노산 치환을 함유하며, 여기에서 보존성 아미노산 치환은 G의 A로; 또는 A의 G, S로; 또는 V의 I, L, A, T, S로; 또는 I의 V, L, M으로; 또는 L의 I, M, V로; 또는 M의 L, I, V로; 또는 P의 A, S, N으로; 또는 F의 Y, W, H로; 또는 Y의 F, W, H로; 또는 W의 Y, F, H로; 또는 R의 K, E, D로; 또는 K의 R, E, D로; 또는 H의 Q, N, S로; 또는 D의 N, E, K, R, Q로; 또는 E의 Q, D, K, R, N으로; 또는 S의 T, A로; 또는 T의 S, V, A로; 또는 C의 S, T, A로; 또는 N의 D, Q, H, S로; 또는 Q의 E, N, H, K, R로의 치환으로부터 선택되며, 여기에서 명칭 "보존성 아미노산 치환"은 보존성인 것 즉, 유사한 특이적 특성을 갖는 것으로서 당업자에 의해 간주되는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환에 관한 것이다. 이러한 특이적 특성은 예를 들어, 아미노산의 크기, 극성, 소수성, 전하 또는 pKs 값을 포함한다. 예를 들어, 보존성 돌연변이는 하나의 산성 아미노산의 또 다른 산성 아미노산으로, 염기성 아미노산의 또 다른 염기성 아미노산으로, 또는 극성 아미노산의 또 다른 극성 아미노산으로의 치환인 것으로 이해된다.
이러한 보존성 아미노산 치환을 이용하여, 특이 활성이 어미 폴리펩티드와 비교하여 대략적으로 동일하나, 바람직하게는 적어도 0.1 U/mg 만큼 증가하는 작용성 폴리펩티드 변이체를 생성하는 것이 가능하다.
본 발명은 추가적으로 분리된 폴리뉴클레오티드를 이용 가능하게 하는 것을 목적으로 하며, 이러한 폴리뉴클레오티드를 사용하여 ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체의 신속하고 신뢰가능한 가수분해 절단을 위한 폴리펩티드를 합성하는 것이 가능하다.
본 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 분리된 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 여기에서 폴리펩티드는 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 가수분해 특성을 가지며, 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하고/거나 뉴클레오티드 서열은 서열 ID 번호 16 내지 31의 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 정도를 가지며/거나 서열 ID 번호 16 내지 31의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및/또는 적어도 200개 뉴클레오티드, 특히, 적어도 100개 뉴클레오티드를 갖는 이의 서브서열 및/또는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 서브서열의 상보적 가닥을 갖는 뉴클레오티드 서열이 중간의 엄격한 조건하에서 가수분해함을 특징으로 한다.
발현되는 뉴클레오티드 서열 특히, 이들의 트리플렛 (코돈)은 일반적으로 숙주 세포에 따라 변경되어 코돈 바이어스가 숙주 세포에 따라 최적화된다. 이는 심지어 80%보다 훨씬 미만, 그러나 심지어 70% 미만 또는 60% 미만의 서열 동일성 정도를 갖는 폴리뉴클레오티드가 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 점을 야기한다. 서열 동일성 정도를 측정하기 위한 서열 비교는 또한 서열 세그먼트 내에서 수행되어야 하며, 여기에서 한 섹션은 기준 서열의 연속 서열로서 이해되어야 한다. 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 세그먼트의 길이는 일반적으로 15 내지 600개이다.
본 분리된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 세그먼트의 도움으로, 일반적으로 적어도 15, 30 또는 40개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 핵산 프로브를 생성시키는 것이 가능하다. 또한, 예를 들어, 3H, 32P, 35S, 바이오틴 또는 아비딘에 의해 전형적으로 라벨링되는 이러한 프로브를 사용하여, 표준 방법을 이용함으로써 ZEN 및/또는 ZEN 유도체 분해 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 식별하는 것이 가능하다. 예를 들어, 개별적 미생물, 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터의 DNA, RNA 또는 cDNA는 이러한 서열 식별을 위한 출발 물질로서 이용될 수 있다.
적어도 100개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열 및/또는 뉴클레오티드 프로브에 있어서, 중간의 엄격한 조건은 0.3　% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 200　μg/mL 전단되고 변성된 연어 정자 DNA 및 35　% 포름아미드를 함유하는 5x NaCl (SPE, 0.9M NaCl, 60　mM　NaH2PO4, 6 mM EDTA)이 제공된 Na-EDTA 완충제 중에서 42℃에서의 사전하이브리드화 및 하이브리드화에 이은, 담체 물질이 2x 소듐 클로라이드 시트레이트 완충제 (SSC, 300mM NaCl 및 30　mM 트리소듐 시트레이트, 0.2　% SDS)로 55℃에서 각각 15분 동안 말기에 3회 세척되는 표준 서던 블롯 조건으로서 규정된다.
15개 뉴클레오티드 내지 100개 뉴클레오티드 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열 및/또는 뉴클레오티드 프로브에 있어서, 중간의 엄격한 조건은 0.9M NaCl, 0.09M Tris-HCl pH = 7.6, 6 mM EDTA, 0.5　% NP-40, 1x 덴하르트 용액, 1 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM 소듐 디히드로겐 포스페이트, 0.1 mM ATP 및 0.2 mg/mL 효모 RNA로 구성된 완충제에서의 사전하이브리드화 및 하이브리드화로서 규정되며, 여기에서 사전하이브리드화 및 하이브리드화는 계산된 용융점 (Tm) 보다 5℃ 내지 10℃ 아래 온도에서 수행되며, 여기에서 Tm은 볼튼 (Bolton) 및 맥카시 (McCarthy) (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 48:1390)에 따른 계산에 의해 결정된다. 그 후, 실험은 표준 서던 블롯 조건 하에서 계속된다 (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). 담체 물질은 말기에 0.1　% SDS를 함유하는 6x SCC 완충제 [sic; SSC 완충제]로 15분 동안 1회 및 계산된 Tm 보다 5℃ 내지 10℃ 아래에서 각각 6x SSC 완충제로 15분 동안 2회 세척된다.
본 발명은 첨가제를 이용가능하게 하는 것을 추가적으로 목적으로 하며, 이를 이용하여 규정된 또는 복합 매트릭스 예컨대, 예를 들어, 식품 또는 동물 먹이 제품에서 ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체의 신속하고 신뢰가능한 가수분해 절단을 달성하는 것이 가능하다.
이러한 목표를 달성하기 위해, 제아랄레논 및/또는 적어도 제아랄레논 유도체를 가수분해로 절단하는 첨가제가 이용 가능하며, 여기에서 첨가제는 서열 ID 번호 1 내지 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 함유하며, 작용성 변이체와 아미노산 서열 중 적어도 하나 간의 서열 동일성이 적어도 70%에 해당하며, 보조 물질이 또한 존재한다.
이러한 첨가제를 이용하여, ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체의 가수분해된 ZEN 및/또는 가수분해된 ZEN 유도체로의 생화학적 전환이 가능하다. 이러한 첨가제는 또한 예를 들어, 공업적 과정에서 ZEN 및/또는 ZEN 유도체의 입체선택적 가수분해에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 개선에서, 첨가제는 보조 물질이 적어도 하나의 불활성 담체는 물론 선택적으로 추가적인 성분 예컨대, 비타민 및/또는 미네랄 및/또는 효소 및/또는 마이코톡신의 탈독소화를 위한 추가적 성분으로부터 선택되도록 포함된다. 예를 들어, 식품 또는 동물 먹이 제품에서 이러한 첨가제의 사용으로 인해, 존재할 수 있는 임의의 양의 ZEN 및/또는 ZEN 유도체는 확실하게 가수분해되는, 특히 이들이 이러한 식품 또는 동물 먹이 제품을 소모하는 대상체의 기관에 해로운 영향을 끼치지 않을 정도로 탈독소화되는 것을 보장하는 것이 가능하다.
본원에서 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 효소 제조물로 존재할 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드 이외에 적어도 하나의 효소를 추가적으로 함유하여 예를 들어, 프로테아제와 같은 효소는 단백질의 분해에 관여하거나, 예를 들어, 아밀라제, 셀룰라제 또는 글루카나제는 물론 예를 들어, 하이드롤라제, 지질분해 효소, 만노시다제, 옥시다제, 산화환원효소, 피타제, 자일라나제 및/또는 이의 조합물과 같은 단백질은 전분 또는 섬유 또는 지방 또는 글리코겐의 대사에서 역할을 수행한다.
본 발명의 추가적인 사용 분야는 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드 이외에, 마이코톡신의 탈독소화를 위한 적어도 하나의 성분, 예컨대, 마이코톡신-분해 효소 예를 들어, 아플라톡신 옥시다제, 에르고타민 하이드롤라제, 에르고타민 아미다제, 제아랄레논 에스테라제, 제아랄레논 락토나제, 오크라톡신 아미다제, 푸모니신 카르복실 에스테라제, 푸모니신 아미노트랜스퍼라제, 아미노폴리올 아미노옥시다제, 데옥시니발레놀 에폭시드 하이드롤라제 및/또는 적어도 하나의 마이코톡신-분해 미생물 예컨대, 바실러스 서브틸리스 및/또는 적어도 하나의 마이코톡신-결합 성분 예를 들어, 미생물 세포 벽 또는 무기 물질 예컨대, 벤토나이트를 또한 포함하는 효소 제조물을 포함한다.
본 발명의 한 특히 바람직한 개선에 따르면, 폴리펩티드는 최대 10,000　U/g, 바람직하게는, 최대 1000　U/g, 더욱 바람직하게는, 최대 100　U/g 및 가장 바람직하게는, 최대 10　U/g의 농도로 존재하여, ZEN 및/또는 ZEN 유도체를 이들이 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품을 소비하는 대상체 특히, 포유동물의 신체에 의해 흡수되기 전에 이미 신속하게 그리고 특히 전환시키는 것이 가능하며, 이들을 비독성 또는 덜 독성인 대사 산물 특히, HZEN 및 DHZEN으로 전환시키는 것이 가능하다.
본 발명의 개선에 따르면, 폴리펩티드는 캡술화된 또는 코팅된 형태로 존재하며, 여기에서 WO 92/12645에 기술된 것과 같은 표준 방법은 캡슐화 또는 코팅에 사용될 수 있다. 캡슐화 및/또는 코팅에 의해, 임의의 변화 없이 특히, 분해 또는 손상 없이 폴리펩티드를 이의 사용 부위로 수송하는 것이 가능하여, 예를 들어, 보호 쉘이 동물의 소화관에서 용해된 후에만 폴리펩티드가 작동하기 시작하여 ZEN 및/또는 ZEN 유도체의 심지어 더욱 표적화되고, 신속하고 완전한 분해가 심지어 산성 프로테아제-풍부 및 혐기성 매질에서 달성될 수 있다. 또한, 캡슐화 또는 코팅을 통해 첨가제 중 폴리펩티드의 열 안정성을 증가시키는 것이 또한 가능하다.
본 발명은 동물 먹이 제품 특히, 돼지, 가금류 및 농작물, 식품 또는 주정 혼합박에서 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 첨가제의 사용을 추가적으로 목적으로 한다. 본 발명에 따른 첨가제의 사용을 위해, 식품 또는 동물 먹이 제품 및/또는 주정 혼합박에 함유된 ZEN 및/또는 ZEN 유도체를 가수분해하고/거나 탈독소화하는 것이 가능하며, 여기에서 이러한 탈독소화는 심지어 대략 1 U/g 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품의 폴리펩티드 농도로 가능하다.
본 발명은 ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체의 신속하고 신뢰할만한 가수분해 절단이 가능하게 되는 방법을 이용가능하게 하는 것을 추가적으로 목적으로 한다.
이러한 목표를 달성하기 위해, 본 방법은 서열 ID 번호 1 내지 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 갖는 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체가 가수분해되는 방식으로 수행되며, 여기에서 작용성 변이체와 아미노산 서열 중 적어도 하나 간의 서열 동일성은 적어도 40%에 해당한다.
본 발명의 한 개선에 따르면, 방법은 여기에서의 폴리펩티드가 본 발명에 상응하는 첨가제에 사용되는 방식으로 수행된다.
또 다른 바람직한 개선에 따르면, 방법은 여기에서의 폴리펩티드 또는 첨가제가 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체로 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품과 혼합되며; 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품을 수분과 접촉되게 하고, 폴리펩티드 또는 첨가제가 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품에 함유된 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해하는 방식으로 수행된다. 습윤의 식품 또는 동물 먹이 제품 예컨대, 매쉬 또는 슬러리의 경우에, 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 가수분해는 경구 섭취 전에 습윤 식품 또는 동물 먹이 제품에서 발생할 것이다. 이러한 방법으로 인해, 인간 및 동물에 대한 제아랄레논 및 제아랄레논 유도체의 해로운 효과가 크게 제거될 것임을 보장하는 것이 가능하다. 여기에서 수분은 물 또는 수성 액체의 존재를 나타내는 것으로 이해되며, 이는 또한 예를 들어, 소화관에 존재하는 타액 또는 기타 액체를 포함한다. 소화관은 구강, 인두 (목구멍), 식도 및 위장관 및 이의 동등물로서 규정되며, 여기에서 동물에 대해 다양한 명칭이 존재할 수 있고/거나 개별적인 구성성분은 동물의 소화관에서 발생하지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 식품 또는 동물 먹이 제품이 경구 섭취 전에 펠렛화되는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 한 개선에 따르면, 방법은 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 적어도 70　%, 바람직하게는, 적어도 80　% 특히, 적어도 90　%가 가수분해되도록 수행된다. 따라서, 동물 또는 인간에서 아급성 및/또는 만성 독성 효과 예컨대, 예를 들어, 기형발생, 발암, 에스트로겐 및 면역억제 효과가 억제될 수 있다.
본 발명은 예시적인 구체예 및 도면을 기반으로 하여 하기에 더욱 상세히 설명된다:
도 1은 서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드에 있어서 시간에 따른 ZEN의 분해 및 대사산물 HZEN 및 DHZEN의 증가를 보여주며, 여기에서 도 1a에서 폴리펩티드는 태깅되지 않았으며, 도 1b에서 폴리펩티드는 C-말단 6xHis 태그를 가지며, 도 1c에서, 폴리펩티드는 N-말단 6xHis 태그를 갖는다.
도 2는 서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드의 미카엘리스-멘텐 반응속도 (Michaelis-Menten kinetics)를 보여준다.
도 3은 서열 ID 번호 1 (도 3a), 2 (도 3b), (도 3c), 6 (도 3d), 7 (도 3e), 9 (도 3f), (도 3g), (도 3h) 및 15 (도 3i)를 갖는 정제된 폴리펩티드로 인해 시간에 따른 ZEN의 분해 및 대사산물 HZEN 및 DHZEN의 증가를 보여주며, 모든 서열은 C-말단 6xHis 태그를 갖는다.
실시예 1: ZEN 및/또는 적어도 하나의 ZEN 유도체를 가수분해 절단할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변경, 클로닝 및 발현
아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 설명서에 따라 "신속 변화 부위-특이적 돌연변이유발 키트 (quick change site-directed mutagenesis kits)" (Stratagene)를 사용하여 PCR에 의해 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 수행하였다. 대안으로서, 완전한 뉴클레오티드 서열을 또한 주문하였다 (GeneArt). PCR 돌연변이유발에 의해 생성되고/거나 GeneArt로부터 주문한 뉴클레오티드 서열은 선택적으로, 또한 아미노산 수준 상에 C- 또는 N-말단 6xHis 태그를 함유하였으며, E. 콜라이 또는 P. 파스토리스 (P. pastoris)에서의 발현을 위한 발현 벡터 내로 표준 방법에 의해 통합시키고, E. 콜라이 또는 P. 파스토리스에서 형질전환시키고, E. 콜라이 및 P. 파스토리스에서 발현시켰으며 (J.　M. Cregg, Pichia Protocols, second edition, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor), 여기에서 임의의 기타 적합한 숙주 세포가 또한, 이러한 작업에 사용될 수 있다.
명칭 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내에서 유전자를 발현할 수 있는 DNA 작제물에 관한 것이다. 특히, 이는 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 전달하여 거기의 게놈으로 통합시키거나 염색체외 공간에서 자유롭게 존재하게 하여 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열을 세포내에서 발현시키고 선택적으로 또한, 세포로부터 폴리펩티드를 제거하기에 적합한 DNA 작제물을 나타내는 것으로 이해된다.
명칭 "숙주 세포"는 발현될 뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터를 함유하며 본 발명에 따른 폴리펩티드를 합성할 수 있는 모든 세포를 지칭한다. 특히, 이는 원핵 및/또는 진핵 세포, 바람직하게는, P. 파스토리스, E. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스, 한세눌라 (Hansenula), 트리초데르마 (Trichoderma), 락토바실러스, 아스퍼길러스 (Aspergillus), 식물 세포 및/또는 바실러스, 트리초데르마 또는 아스퍼길러스의 포자를 포함하는 것으로 이해된다.
E. 콜라이의 경우에 가용성 세포 용해물 및/또는 P. 파스토리스의 경우 배양 상청액을 폴리펩티드의 촉매 특성을 측정하는데 이용하였다. KM 값, vmax, kcat 및 특이 활성을 측정하기 위해, 폴리펩티드를 니켈-세파로스 칼럼 위에서 표준 방법에 의해 크로마토그래피로 선택적으로 풍부하게 하였다. 단백질 농도의 측정은 BCA 방법 (Pierce BCA Protein Assay KitProd #23225)에 의해 또는 바람직하게는, http://web.expasy.org/protparam에서의 ProtParam 프로그램을 사용하여 온라인에서 입수 가능한 각 단백질에 대한 특정 흡광 계수를 이용하여 광도 측정에 의해 계산하는 표준 방법에 의해 수행하였다 (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607).
실시예 2: 서열 동일성 및 보존된 아미노산 서열 세그먼트의 측정
서열 ID 번호 1 내지 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 전체 폴리펩티드 길이를 기반으로 하여 서로에 대한 서열 동일성 백분율의 측정 (표 1)을 BLAST 프로그램 (Basic Local Alignment Search Tool), 특히, BLASTP의 도움으로 수행하였으며, 이는 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 홈페이지에서 이용할 수 있다. 따라서, 알츌 등 [1997 (Nucleic Acids Res. (1997), 25:3389-3402)]의 알고리즘에 따라 2개 이상의 서열을 서로 비교하는 것이 가능하다. 기본 세팅이 특히 프로그램 세팅으로서 사용되었다. 그러나: "최대 표적 서열" = 100; "예측 문턱값" = 10; "워드 크기" = 3; "매트릭스" = BLOSOM62; "캡 코스트" = "존재: 11; 확장: 1"; "컴퓨터 조절" = "조건부 조성 스코어 매트릭스 조절."
보존된 아미노산 서열 세그먼트를 측정하기 위해, 서로에 대한 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열 ID 번호 1 내지 6을 갖는 폴리펩티드를 COBALT 소프트웨어의 도움으로 표준 변수 특히, 변수 ("갭 페널티": -11, -1; "말단-갭 페널티": -5, -1; "RPS BLAST 사용": 온; "Blast E-값": 0.003; "보존된 칼럼 발견 및 리컴퓨트": 온; "의문 클러스터 사용": 온; "워드 크기": 4; "메이 클러스터 간격 (may cluster distance)": 0,8; "알파벳": 규칙적; "상동성 컨버세이션 세팅": 3 비트)를 사용하면서 비교하였다 (J. S. Papadopoulos and R. Agarwala, 2007, COBALT: Constraint-Based Alignment Tool for Multiple Protein Sequences, Bioinformatics 23:1073-79). 본 분석의 결과는 보존된 아미노산을 나타낸다. 적어도 5개의 연속 보존된 아미노산의 하기 범위는 서열 ID 번호 1을 갖는 세그먼트에 있어서, 보존된 아미노산 서열 세그먼트 즉, 위치 +24 내지 위치 +50의 세그먼트 A, 위치 +52 내지 위치 +77의 B, 위치 +79 내지 위치 +87의 C, 위치 +89 내지 위치 +145의 D, 위치 +150 내지 위치 +171의 E, 위치 +177 내지 위치 +193의 F, 위치 +223 내지 위치 +228의 G, 위치 +230 내지 위치 +237의 H, 위치 +239 내지 위치 +247의 I, 위치 +249 내지 위치 +255의 J, 위치 +257 내지 위치 +261의 K, 위치 +263 내지 위치 +270의 L, 위치 +272 내지 위치 +279의 M, 위치 +297 내지 위치 +301의 N 및 위치 +303 내지 위치 +313의 O로서 규정하였다.
서열 ID 번호 1을 갖는 서열의 보존된 아미노산 서열 세그먼트와 관련하여 서로에 대한 폴리펩티드 및 개별 폴리펩티드의 보존된 아미노산 서열 세그먼트의 서열 동일성 백분율의 측정은 상기 기술된 바와 같이 이루어졌다. 결과는 표 1 및 2에 제시되어 있다.
표 1: 폴리펩티드 서로에 대한 폴리펩티드의 서열 동일성 백분율
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
표 2: 보존된 아미노산 서열 세그먼트 A 내지 O의 서열 동일성 백분율
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 3: 세포 용해물에서 폴리펩티드에 의한 ZEN의 가수분해
비독성 또는 덜 독성의 대사산물 HZEN 및 DHZEN으로 ZEN을 분해하는 이들의 능력을 측정하기 위해, 서열 ID 번호 17을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열 ID 번호 1을 지닌 폴리펩티드를 실시예 1에 기술된 바와 같이 E. 콜라이에서 C-말단 및/또는 N-말단 6xHis 태그를 사용하여 그와 같이 합성하였다. 서열 ID 번호 18 내지 31을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열 ID 번호 2 내지 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 C-말단에서 6xHis로 배타적으로 라벨링시켰다. 2.0-2.5의 광밀도 (OD　600　nm)를 갖는 E. 콜라이 배양물의 일부 100 mL를 4℃에서 원심분리에 의해 채취하고, 20　mL 브루너 (Brunner) 미네랄 배지에서 재현탁시켰다 (DSMZ 미생물 배지 번호 462, 2012). 세포 현탁액을 20,000 psi에서 프렌치 프레스에서 3회 처리함으로써 용해시켰다. 생성된 세포 용해물을 0.1 mg/mL BSA (소 혈청 알부민)을 포함하는 브루너 미네랄 배지에서 제조된 1:10, 1:100 또는 1:1000 희석액에 사용하였다. ZEN 분해 실험에 있어서, 0.1　mg/mL BSA, 0.1　mL 희석된 세포 용해물 및 31 μL ZEN 기질 원액을 포함하는 9.9 mL 브루너 미네랄 배지를 사용하였다. 대체로, 이와 세포 용해물을 1:1000, 1:10,000 및/또는 1:100,000로 희석하였다. 사용된 ZEN 기질 원액은 2.08 mM ZEN 용액 (40　vol　%　CAN + 60 vol　% H2O)이었다. 이러한 용액을 제조하기 위해, 결정질 형태의 ZEN (Biopure Standard from Romer Labs, 물품 번호 001109, 순도 적어도 98%)의 중량을 측정하고 그에 따라 용해시켰다. 각 분해 배치를 25　mL 유리 바이알에서 수행하고, 진탕하면서 총 120시간 동안 100rpm 및 25℃에서 인큐베이션하였다. 0, 0.5, 1, 2, 5, 24, 47, 72 및 120 h에서, 1　mL의 샘플을 각 시점에서 취하고, 폴리펩티드를 10분 동안 99℃에서 열 불활성화시키고 -20℃에서 저장하였다. 샘플을 해동시킨 후, 불용성 구성분을 원심분리에 의해 분리하였다. ZEN, HZEN 및 DHZEN를 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. 이렇게 하기 위해, 1 mL/L의 포름산 농축물과 아세토니트릴-물 혼합물을 이동상으로서 사용하여 250 mm x 3 mm 치수 및 5　μm의 입자 크기를 갖는 Phenomenex Luna C18(2) 칼럼에서 크로마토그래피로 대사산물을 분리하였다. 270 nm에서의 UV 시그널을 이온화 소스로서 전기분사 이온화 (ESI)를 사용하여 기록하였다. ZEN, HZEN 및 DHZEN을 QTrap/LC/MS/MS (트리플 쿼드루폴 (triple quadrupole), Applied Biosystems)에 의해 증강된 모드로 정량화하였다. 늦어도 24시간 후, 어느 배치에서도 실질적인 양의 ZEN은 더 이상 검출될 수 없었다. 대부분의 ZEN 즉, 80% 초과가 HZEN 또는 DHZEN으로 전환되었다.
도 1은 서열 ID 번호 1을 갖는 비태깅된 (도 1a) 것은 물론 C-말단 6xHis 태깅된 (도 1b) 및 N-말단 6xHis 태깅된 (도 1c) 폴리펩티드에 대한 예로서 1:10,000 희석된 세포 용해물 용액에 대한 HZEN 및 DHZEN의 증가 및 시간에 따른 ZEN의 분해를 보여준다. 1) ZEN이 실험 시작 직후에 취해진 제 1 샘플에서 더 이상 거의 관찰되지 않기 때문에 ZEN의 반응이 직접적이고 완전하게 발생하며 (0 h), 2) C-말단 또는 N-말단이든지 태그의 부착 결과 활성의 언급가능한 손실이 발생되지 않았음이 여기에서 분명히 확인될 수 있다.
실시예 4: 세포 용해물에서 폴리펩티드에 의한 ZEN 유도체의 가수분해
ZEN에 더하여 ZEN 유도체를 비독성 및/또는 덜 독성인 대사산물로 또한 변형시킬 수 있는 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해, 서열 ID 번호 1 내지 15를 갖는 폴리펩티드를 C-말단 His 태그를 갖는 것으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하고, 서열 ID 번호 17 내지 31의 서열을 갖는 각 합성 뉴클레오티드 서열을 분해 15에서 세포 용해물로서 사용하였다.
분해 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 여기에서 각 폴리펩티드를 α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S 및 ZAN으로 구성된 군으로부터 선택된 각 ZEN 유도체로 평가하였다. 세포 용해물을 1:10,000의 전체 희석으로 사용하였다. 2.08 mM ZEN 용액 (40 vol　% CAN + 60 vol　% H2O) 대신에, ZEN 유도체의 등몰 즉, 2.08 mM 용액을 기질 스톡액으로서 사용하였다. α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL 및 ZAN을 Sigma로부터 획득하고 분석을 위한 표준으로서 사용하였다. Z14G 및 Z14S를 피. 크렌 (P. Krenn) 등 [2007 (Mykotoxin Research, 23, 4, 180-184)] 및 엠. 술욕 (M. Sulyok) 등 [2007 (Anal. Bioanal. Chem. 289, 1505-1523)]에 의해 기술된 것과 같은 방법에 따라 적어도 90%의 순도로 제조하고, 분석을 위한 표준으로서 사용하였다. 실시예 3과 비교하여 또 다른 차이는 즉 24시간 후 단지 하나의 샘플을 취한다는 점이다. 분해 실험 동안 ZEN 유도체 농도의 감소는 LC/MS/MS에 의해 정량화하였다. α-ZEL, β-ZEL, Z14G 및 Z14S를 엠. 술욕 등의 방법에 의해 측정하였다(2010, Food Chemistry, 119, 408-416); α-ZAL, β-ZAL 및 ZAN을 피. 송세르마스쿨 (P. Songsermaskul) 등의 방법에 의해 측정하였다 (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). ZEN 유도체의 출발 양의 단지 0 내지 최대 13%가 모든 분해 실험에서 24시간 인큐베이션 후에 존재하였음이 놀랍게도 밝혀졌다.
실시예 5: 폴리펩티드는 물론 이의 변이체의 특이 활성 및 효소 반응속도 계수
폴리펩티드 및 이의 변이체의 특이 활성은 광도 측정에 의해 측정하며, 사용된 모든 폴리펩티드는 C-말단 6xHig 태그를 가졌다. 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체의 제조, 풍부화 및 정제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. ZEN으로의 HZEN의 분해는 315 nm의 파장에서 흡수 감소를 기반으로 측정하였다. ZEN 및 HZEN의 몰 흡광 계수 (ε)는 실험으로 측정하고, 0.0078895 L μmol-1 cm-1 및 0.0030857 L μmol- 1 cm-1에 해당하는 것으로 밝혀졌다. 흡광 계수는 pH에 매우 의존적이며, 따라서 활성은 항상 동일한 pH 및 바람직하게는, 또한 동일한 매트릭스에서 정확하게 측정되어야 한다. 측정은 32℃에서의 UV-VIS 광도계 (Hitachi U-2001)에서 200 내지 2500 nm의 파장 범위에서 석영 큐벳중의 50 mM Tris-HCl pH = 8.2 완충제 용액에서 수행하였다.
2.08 mM ZEN 용액 (40 vol　% ACN + 60 vol　% H2O)을 ZEN 기질 스톡액으로서 사용하였다. 이러한 용액을 제조하기 위해, 결정질 형태의 ZEN (Biopure Standard from Romer Labs, 물품 번호 001109, 순도 적어도 98%)의 중량을 측정하고 그에 따라 용해시켰다. ZEN 기질 희석물 (0.79 μM, 1.57 μM, 2.36 μM, 3.14 μM, 4.71 μM, 6.28 μM, 7.85 μM, 9.42 μM, 10.99 μM, 12.56 μM, 14.13 μM, 15.71 μM, 17.28 μM 및 18.85　μM)을 50 mM Tris-HCl pH = 8.2를 사용하여 제조하였다. 폴리펩티드 용액을 50 mM Tris-HCl 완충제 pH = 8.2를 사용하여 대략 70 ng/mL의 최종 농도로 희석하였다. ZEN 기질 희석물을 수조에서 32℃로 예열하였다.
각 ZEN 기질 희석물의 100 μL 부분을 0.2 μL 폴리펩티드 용액과 혼합하고, 흡광을 5분 동안 측정하고, 폴리펩티드 용액과 ZEN 기질 희석물의 각 조합물을 적어도 2회 측정하였다.
ZEN 및 HZEN의 흡광 계수를 고려하여, 반응 속도를 시간에 따른 흡광의 기울기를 기반으로 하여 각 물질 농도에 대해 계산하였다.
명칭 "KM 값" 또는 "미카엘리스-멘텐 상수"는 μM 또는 mM 단위의 효소 친화도를 기술하기 위한 변수에 관한 것이며, 이는 H. 비스왕 (H. Bisswang) (2002, En-zy-me Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, page 19)에 따른 선형 Hanes 플롯의 도움으로 계산되며, 여기에서 SigmaPlot 12.0 프로그램에서 함수 "효소-반응 속도, 단일 기질"이 바람직하게는, 이러한 목적을 위해 사용된다. 명칭 "효소 반응의 촉매 상수" 또는 "kcat 값"은 폴리펩티드 및/또는 효소의 전환율을 기술하기 위한 변수에 관한 것이며, 이는 s-1로서 제공되며, 바람직하게는 SigmaPlot 12.0 프로그램의 "효소-반응속도, 단일 기질" 함수의 도움으로 계산된다. "최대 효소 속도" 또는 "v-max 값"은 μM/s 또는 mM/s의 단위로 제시되며, KM 값을 이용한 유추에 의해 선형 Hanes 플롯의 도움으로 측정되며, 여기에서 SigmaPlot 12.0 프로그램의 함수 "효소 반응속도, 단일 기질"은 바람직하게는 이를 위해 사용된다.
특이 활성은 하기 식에 따라 사용된 효소 농도 및 vmax에 의해 계산하였다:
Figure pct00009
상기 식에서, 1 단위는 50 mM Tris-HCl 완충 용액 (pH = 8.2) 중 32℃에서 분 당 1 μMol ZEN의 가수분해로서 정의된다.
서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드에 있어서 효소 변수 KM, vmax, kcat 및 특이 활성의 결정을 위한 미처리 데이터는 하기에 제시된다. 표 3은 각 ZEN 기질 농도에서의 반응 속도를 보여주는 반면, 도 2는 각 미카엘리스-멘톤 그래프를 보여주며, 표 4는 상응하는 효소 반응속도 계수를 보여준다. 사용된 효소 용액의 농도는 68 ng/L이었다.
표 3: 다양한 ZEN 농도에서 서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드의 반응 속도
Figure pct00010
표 4: 서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드의 효소 반응속도 변수
Figure pct00011
평가된 폴리펩티드의 특이 활성은 서열 ID 번호 1에 있어서 8.25 U/mg, 서열 ID 번호 2에 있어서 10.56 U/mg, 서열 ID 번호 3에 있어서 8.36 U/mg, 서열 ID 번호 4에 있어서 8.33 U/mg, 서열 ID 번호 5에 있어서 8.56 U/mg, 서열 ID 번호 6에 있어서 9.95 U/mg, 서열 ID 번호 7에 있어서 3.83 U/mg, 서열 ID 번호 8에 있어서 2.57 U/mg, 서열 ID 번호 9에 있어서 4.87 U/mg, 서열 ID 번호 10에 있어서 5.12 U/mg, 서열 ID 번호 11에 있어서 3.88 U/mg, 서열 ID 번호 12에 있어서 2.78 U/mg, 서열 ID 번호 13에 있어서 6.43 U/mg, 서열 ID 번호 14에 있어서 3.33 U/mg 및 서열 ID 번호 15에 있어서 7.76 U/mg이다.
평가된 폴리펩티드 변이체의 특이 활성은 표 5 및 표 6에 기록되어 있다.
표 5: 서열 ID 번호 1을 갖는 폴리펩티드의 작용성 변이체의 특이 활성; 돌연변이(들)가 위치하는 보존된 아미노산 서열 세그먼트 및 서열 ID 번호 1을 갖는 어미 서열에 대한 작용성 변이체의 서열 동일성. 돌연변이의 위치는 서열 ID 번호 1을 갖는 아미노산 서열과 관련하여 제시된다. 서열 동일성은 실시예 2에 기술된 바와 같이 BLAST에 의해 측정하였다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
표 6: 서열 ID 번호 2를 갖는 폴리펩티드의 작용성 변이체의 특이 활성. 돌연변이(들)의 위치는 서열 ID 번호 2를 갖는 아미노산 서열에 관한 것이다. 서열 동일성은 실시예 2에 기술된 바와 같이 BLAST에 의해 측정하였다.
Figure pct00019
실시예 6: 오염된 옥수수에서 ZEN 및 ZEN 유도체의 분해
복합 매트릭스 및 낮은 pH에서 자연 발생 ZEN 및 ZEN 유도체를 분해하는 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해, 오염된 옥수수를 다양한 농도의 서열 ID 번호 1 내지 6을 갖는 폴리펩티드 중 하나와 혼합하고, ZEN 및 ZEN 유도체의 분해를 추적하였다.
오염된 옥수수를 분쇄하고 분해 실험에 사용하고, 여기에서 배치는 1g 분쇄된 오염 옥수수, 8.9 mL 100 mM 아세테이트 완충제 pH　4.0 및 0.1 mL 폴리펩티드 용액으로 구성될 것이다. 풍부해지고 정제된 폴리펩티드 용액을 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하여, 이들을 10 mU/mL, 100　mU/mL 및/또는 1000 mU/mL의 농도로 희석하였다. 따라서, 절대량에서, 1 mU (= 옥수수 그램 당 1 mU), 10 mU (= 옥수수 그램 당 10 mU) 및/또는 100 mU (= 옥수수 그램 당 100 mU)를 배치에 사용하였다. 각 분해 배치를 25 mL로 수행하고 37℃에서 100 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 효소의 첨가 전 및/또는 1시간의 인큐베이션 후, 1 mL의 샘플을 취하고, 폴리펩티드를 10분 동안 99℃에서 열 불활성화시키고, 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 샘플을 해동시킨 후, 불용성 구성분을 원심분리에 의해 분리하였다. ZEN 및 ZEN 유도체의 농도를 M. 술욕 등에 의해 기술된 바와 같이 LC/MS/MS에 의해 측정하였다 (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). 이러한 옥수수 중에서 ZEN 및 ZEN 유도체 함량은 ZEN에 있어서 238 ppb, α-ZEL에 있어서 15 ppb, β-ZEL에 있어서 23 ppb, Z14G에 있어서 32 ppb 및 Z14S에 있어서 81 ppb이었다. 표 7은 분해 실험에서 ZEN 및 ZEN 유도체 함량의 감소 백분율을 보여준다.
표 7: 다양한 폴리펩티드 및 폴리펩티드의 양을 이용하여 분해 실험에서 출발 함량을 기반으로 ZEN 및 ZEN 유도체 백분율의 감소
Figure pct00020
실시예 7: ZEN 및/또는 ZEN 유도체의 가수분해 절단에 있어서 폴리펩티드를 함유하는 첨가제
ZEN의 가수분해 절단을 위한 첨가제를 제조하기 위해, P. 파스토리스에 의해 발현되고 서열 ID 번호 1, 2, 6 및 13을 갖는 폴리펩티드의 발효 상청액을 표준 조건하에서 미세여과 및 한외여과 (배제 한계: 10 kDa)에 의해 정제하고 대략 9 중량%의 건조 물질 농도 이하로 농축시켰다. 그 후, 이러한 폴리펩티드-함유 용액을 또한 추가로 처리하여 분무 건조기에서 표준 조건하에 건조 분말을 형성시켰다 (Mini B290 from Buechi). 이들 네개의 분말을 후속하여 Z1, Z2, Z6 및 Z13으로서 명명하였다. Z1, Z2, Z6 및/또는 Z13을 오버헤드 진탕기에서 1 중량%의 첨가제 Z1, Z2, Z6 및/또는 Z13 및 99 중량%의 벤토나이트의 비로 대략 1 μM의 평균 그레인 크기를 갖는 벤토나이트와 추가적으로 혼합하였다. 생성 첨가제를 첨가제 Z1.B, Z2.B, Z6.B 및 Z13.B로서 명명하였다. 또한, Z1, Z2, Z6 및 Z13을 0.1 중량%의 첨가제 Z1, Z2, Z6 및/또는 Z13, 0.9 중량%의 비타민 미량 원소 농축물 및 99 중량%의 벤토나이트의 비로 벤토나이트 및 비타민 미량 원소 농축물과 오버헤드 진탕기에서 혼합하였다. 생성 첨가제를 첨가제 Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS 및 Z13.BVS로서 명명하였다. 100 g의 첨가제 Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS 및 Z13.BVS는 200 mg 황산철, 50　mg 황산구리, 130 mg 산화아연, 130 mg 산화망간, 2.55 mg 탄산칼슘, 160 mg 비타민 E, 6.5 mg 비타민 K3, 6.5 mg 비타민 B1, 14 mg 비타민 B2, 15 mg 비타민 B6, 0.15 mg 비타민 B12, 150 mg 니코틴산, 30 mg 판토텐산 및 5.3 mg 엽산을 함유하였다.
첨가제를 50 mM Tris-HCl 완충제 pH = 8.2에서 30분 동안 추출하고 동일한 완충제에서 추가로 희석하여 최종 농도의 폴리펩티드는 대략 70 ng/mL이었다.
그 후, 이들 용액의 제아랄레논-분해 효과는 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정하였다. 상응하는 활성은 Z1에 있어서 8.230 U/g, Z2에 있어서 9.310 U/g, Z6에 있어서 9.214 U/g, Z1.B에 있어서 83 U/g, Z2.B에 있어서 92 U/g, Z2.C에 있어서 90 U/g, Z13.B에 있어서 57 U/g, Z1.BVS에 있어서 8 U/g, Z2.BVS에 있어서 9 U/g, Z6.BVS에 있어서 9 U/g 및 Z13.BVS에 있어서 6 U/g이었다.
첨가제 Z1, Z2, Z6, Z13, Z1.B, Z2.B, Z6.B, Z13.B, Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS 및 Z13.BVS에 의한 ZEN 유도체 α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL, β-ZAL, Z14G, Z14S 및 ZAN을 분해하는 능력은 실시예 4에 기술된 바와 같이 평가되나, 100　μL의 세포 용해물 대신에, 대략 70 ng/mL의 폴리펩티드 농도를 갖는 100 μL의 폴리펩티드 용액을 사용하였다. 6시간 동안 인큐베이션시킨 후, 출발량의 단지 최대 15%가 비가수분해된 ZEN 유도체로서 존재하였다.
실시예 8: 최적 온도
SEQ ID 번호 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 및 15를 갖는 폴리펩티드의 최적 온도를 측정하기 위해, C-말단 6xHis 태그를 갖는 이들은 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝하고, E. 콜라이에서 발현시키고 정제하였다. 예비 실험에서, 실험 조건하에서 ZEN의 완전한 전환이 보장될 수 있는 농도를 3시간의 실험 시간 후 측정하였다 (Teorell-Stenhagen 완충제 (Teorell and Stenhagen, 2.0 내지 12.0의 pH 범위에 있어서 보편적인 완충제. Biochem Ztschrft, 1938, 299:416-419), pH 7.5 및 0.1 mg/mL BSA, 30℃). 최적 온도를 측정하기 위한 분해 배치에서 이렇게 측정된 농도의 제조물을 사용하였다. 실험은 20℃　±　10℃, 40℃　±　10℃ 및, 필요에 따라, 60℃　±　10℃에서의 온도 구배 함수를 사용하여 PCR 사이클러 (Eppendorf)에서 수행하였다 (각 범위의 10개 온도; PCR 사이클러에 의해 사전 규정된 온도). 배치에 있어서, Teorell-Stenhagen 완충제를 각 최적 pH에서 상응하는 효소 농축물 및 0.1 mg/mL BSA 플러스 5 ppm ZEN과 혼합하였다. 효소 첨가 없이 0.1 mg/mL BSA 및 5 ppm ZEN을 갖는 배치를 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h 및 3 h 인큐베이션 시간 후, 샘플을 인큐베이션 온도 당 취하고, 10분 동안 99℃에서 열 불활성화시키고 -20℃에서 저장하였다. 해동 후, 샘플을 HPLC 바이알로 옮겼다. ZEN, HZEN 및 DHZEN을 HPLC-DAD에 의해 분석하였다. 이렇게 하기 위해, 대사산물을 치수 4.6 mm x 150 mm 및 5 μM의 입자 크기를 갖는 Zorbax SB-Aq C18 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 5 mM 암모늄 아세테이트와의 메탄올-물 혼합물을 이동 상으로서 사용하였다. 274 nm에서의 UV 시그널을 기록하였다. 대사산물을 연행된 표준 시리즈 (entrained standard series)를 포함시킴으로써 정량화하였다. 분해 곡석에 대해 측정된 기울기를 기반으로 하여 최적 온도를 결정하고, 여기에서 최적 온도는 기울기가 최대치인 온도로서 규정된다. 표 8은 최적 온도를 보여준다.
표 8: 폴리펩티드의 최적 온도
Figure pct00021
실시예 9: 열 안정성
SEQ ID 번호 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 및 15를 갖는 폴리펩티드의 열 안정성을 측정하기 위해, C-말단 6xHis 태그를 갖는 이들을 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝하고, E. 콜라이에서 발현시키고 정제하였다. 이어서, 각 최적 온도 ±　10℃에서의 구배 함수를 사용하여 이들을 PCR 사이클러에서 인큐베이션하였다. 0 min, 15 min, 30　min 및 60 min 후, 하나의 샘플을 배치당 및 온도 당 취하였다. 그 후, 이들 사전 인큐베이션된 샘플을 각 최적 pH에서 0.1 mg/mL BSA 및 5 ppm ZEN을 사용하여 Teorell-Stenhagen 완충제에서 분해 실험에 사용하였다. 예비 실험에서, 실험 조건(Teorell-Stenhagen 완충제, pH 7.5 및 0.1 mg/mL BSA, 30℃)하에 3시간의 실험 기간 후 ZEN의 완전한 전환이 보장될 수 있는 농도를 각 폴리펩티드에 있어서 측정하였다. 이렇게 하여 측정된 각 효소 농축물을 배치에 사용하였다. 분해 배치를 30℃에서 인큐베이션하였다. 샘플링을 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h 및 3 h 인큐베이션 시간 후 수행하였다. 그 후, 폴리펩티드를 99℃에서 10분 동안 열-불활성화시키고, 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 해동 후, 샘플을 HPLC 바이알로 옮기고 실시예 8에 기술된 바와 같이 HPLC-DAD에 의해 분석하였다.
열 안정성은 폴리펩티드가 15분의 사전-인큐베이션 후 최적 온도와 비교하여 50% 잔여 활성을 갖는 온도로서 규정된다. 활성의 척도로서, 분해 곡선의 기울기를 이용하였다. 온도 안정성은 표 9에 제시되어 있다.
표 9: 폴리펩티드의 열 안정성 (15분의 사전-인큐베이션 후 50% 잔여 활성)
Figure pct00022
실시예 10: 최적 pH
SEQ ID 번호 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 및 15를 갖는 폴리펩티드의 최적의 pH를 측정하기 위해, C-말단 6xHis 태그를 갖는 이들을 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝하고, E. 콜라이에서 발현시키고 정제하였다. 예비 실험에서, 실험 조건하에 3시간의 실험 기간 후 ZEN의 완전한 전환이 보장될 수 있는 농도를 각 폴리펩티드에 있어서 측정하였다 (Teorell-Stenhagen 완충제, pH 7.5 및 0.1 mg/mL BSA, 30℃). 각 효소 농축물을 배치에 사용하였다. 분해 배치를 Stenhagen 완충제에서 3.0, 4.0, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 11.0 및 12.0의 pH 수준에서 수행하였다. 0.1　mg/mL BSA 및 5　ppm ZEN을 갖는 분해 배치에 있어서, 인큐베이션을 30℃에서 수행하였다. 0.1 mg/mL BSA 및 5　ppm ZEN을 갖는 Teorell-Stenhagen 완충제 중의 배치를 pH 3.0, pH 7.0 및 pH 12.0에서 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h 및 3　h의 인큐베이션 시간 후 샘플링을 수행하였다. 그 후, 폴리펩티드를 99℃에서 10분 동안 열-불활성화시키고, 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 해동 후, 샘플을 HPLC 바이알로 옮기고 실시예 8에 기술된 바와 같이 HPLC-DAD에 의해 분석하였다. 최적 pH를 분해 곡선에 있어서 발견된 기울기를 기반으로 하여 결정하고, 기울기가 최대가 되는 pH를 최적 pH로서 규정하였다. 표 10은 최적 pH 수준을 보여준다.
표 10: 폴리펩티드의 최적 pH
Figure pct00023
실시예 11: pH 5.0에서의 pH 안정성
pH 안정성을 측정하기 위해, 실시예 10으로부터의 폴리펩티드를 각 최적 pH에서 pH 5.0에서의 Teorell-Stenhagen 완충제 중에 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이들 사전-인큐베이션된 샘플을 배치중에서 0.1 mg/mL BSA 및 5 pm ZEN을 사용한 각 최적 pH에서, 100 mM Tris-HCl 완충제 중의 최적 pH를 측정하는데 사용된 것과 동일한 각 폴리펩티드 농도로 분해 실험에 사용하였다. 배치를 각 최적 온도에서 인큐베이션하였다. 샘플링을 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h 및 3 h 인큐베이션 시간 후 수행하였다. 그 후, 폴리펩티드를 99℃에서 10분 동안 열 불활성화시키고, 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 해동 후, 샘플을 HPLC 바이알로 옮기고 실시예 8에 기술된 바와 같이 HPLC-DAD에 의해 분석하였다. pH 안정성을 각 최적 pH에서 활성과 관련하여 pH 5.0에서의 폴리펩티드의 잔여 활성 백분율로서 규정하였다. 5.0에 대한 pH 안정성이 표 11에 제시되어 있다.
표 11: pH 5.0에서 폴리펩티드의 pH 안정성
Figure pct00024
실시예 12: ZEN 분해 실험
ZEN의 HZEN 및 DHZEN으로의 분해는 서열 ID 번호 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12 및 15를 갖는 폴리펩티드에 있어서 예로서 수행하였다. 0.1 mg/mL BSA 및 5 ppm ZEN을 갖는 분해 배치는 Teorell-Stenhagen 완충제 pH 7.5에서 수행하였다. 분해 배치를 30℃에서 인큐베이션하였다. 샘플링을 0　h, 0.5 h, 1 h, 2 h 및 3 h 인큐베이션 시간 후 수행하였다. 그 후, 폴리펩티드를 99℃에서 10분 동안 열 불활성화시키고, 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 해동 후, 샘플을 HPLC 바이알로 옮기고 실시예 8에 기술된 바와 같이 HPLC-DAD에 의해 분석하였다. 대략 3시간 후 완전한 분해가 달성되도록 폴리펩티드 농도를 선택하였다. 도 3은 분해 반응속도를 보여주며, 여기에서 y 축은 리터당 마이크로몰 (μMol/L) 농도의 ZEN, HZEN 및 DHZEN을 보여주며, x 축은 인큐베이션 시간 (h)을 보여준다.
* μM은 마이크로몰을 의미하며, 단위μmol/L에 상응한다.
SEQUENCE LISTING <110> Erber Aktiengesellschaft <120> Polypeptid zur hydrolytischen Spaltung von Zearalenon und / oder Zearalenon Derivaten <130> P05341PCT <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 328 <212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis <400> 1 Met Ala Glu Glu Gly Thr Arg Ser Glu Ala Ala Asp Ala Ala Thr Gln 1 5 10 15 Ala Arg Gln Leu Pro Asp Ser Arg Asn Ile Phe Val Ser His Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Arg Gln Val Asp Leu Gly Glu Val Val Met Asn Phe Ala Glu 35 40 45 Ala Gly Ser Pro Asp Asn Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Glu Gln Thr 50 55 60 Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Pro Val Met Gly Leu Leu Ala Glu Asn 65 70 75 80 Phe His Val Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Gln Gly Arg Ser Thr Trp 85 90 95 Thr Pro Arg Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg 100 105 110 Phe Ile Ala Leu Val Ile Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ala Met Pro Gly 130 135 140 Gln Ile Arg Ala Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu 145 150 155 160 Leu Val Pro Ala Tyr Gly His Ser Val Leu Gln Ala Ala Gly Pro Ala 165 170 175 Phe Glu Leu Tyr Arg Asp Phe Leu Gly Asp Gln Trp Ser Ile Gly Asp 180 185 190 Trp Lys Gly Phe Val Glu Ala Ala Lys Ala Ser Pro Ala Lys Ala Met 195 200 205 Gln Leu Phe Pro Thr Pro Asp Glu Ala Pro Gln Asn Leu Lys Glu Tyr 210 215 220 Asp Pro Glu Trp Gly Arg Ala Phe Phe Glu Gly Thr Val Ala Leu His 225 230 235 240 Cys Pro His Asp Arg Met Leu Ser Gln Val Lys Thr Pro Ile Leu Ile 245 250 255 Thr His His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu Leu Leu Gly 260 265 270 Ala Leu Ser Asp Leu Gln Ala Glu His Ala Gln Asp Ile Ile Arg Ser 275 280 285 Ala Gly Val Arg Val Asp Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Leu His Met 290 295 300 Met His Leu Phe Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Ser Trp 305 310 315 320 Ser Ala Thr Leu Pro Ala Asn Asp 325 <210> 2 <211> 308 <212> PRT <213> Streptomyces violaceusniger <400> 2 Met Ala Asp Pro Ala Gln Arg Asp Val Tyr Val Pro His Ala Tyr Pro 1 5 10 15 Glu Lys Gln Ala Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu Ala 20 25 30 Gly Glu Pro Asp Met Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr Gly 35 40 45 Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu Asn Phe 50 55 60 His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp Ala 65 70 75 80 Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg Phe 85 90 95 Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser 100 105 110 Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly Gln 115 120 125 Val Arg Gly Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu Leu 130 135 140 Val Thr Thr Cys Gly His Ser Ile Arg Gln Ala Ala Gly Pro Met Phe 145 150 155 160 Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp Trp 165 170 175 Thr Gly Tyr Cys Arg Ala Ala Asp Ala Ser Ser Ser Pro Met Ala Arg 180 185 190 Tyr Phe Val Ala Asp Glu Ile Pro Gln His Met Arg Glu Tyr Asp Pro 195 200 205 Glu Trp Ala Arg Ala Phe Trp Glu Gly Thr Val Ala Leu His Cys Pro 210 215 220 His Glu Gln Leu Leu Thr Gln Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr His 225 230 235 240 His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His Leu Val Gly Ala Leu 245 250 255 Ser Asp Glu Gln Ala Ala Arg Ala Arg Leu Leu Met Glu Ser Ala Gly 260 265 270 Val Lys Val Asp Tyr Ala Ser Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His 275 280 285 Gln Phe Asp Pro Pro Arg Tyr Val Glu Ile Phe Thr Gln Trp Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Ala Ala 305 <210> 3 <211> 309 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 3 Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu 20 25 30 Ala Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr 35 40 45 Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His 50 55 60 Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp 65 70 75 80 Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg 85 90 95 Phe Ile Ala Leu Val Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly 115 120 125 Gln Ile Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu 130 135 140 Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val 145 150 155 160 Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp 165 170 175 Trp Glu Gly Phe Arg Ser Ala Ala Asp Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala 180 185 190 Arg Ser Phe Val Ala Asp Thr Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp 195 200 205 Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys 210 215 220 Pro His Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr 225 230 235 240 His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala 245 250 255 Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Val Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala 260 265 270 Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met 275 280 285 His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Thr 290 295 300 Ala Ala Leu Ala Pro 305 <210> 4 <211> 309 <212> PRT <213> Streptomyces rapamycinicus <400> 4 Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu 20 25 30 Ala Gly Asp Pro Asp Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr 35 40 45 Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His 50 55 60 Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp 65 70 75 80 Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg 85 90 95 Phe Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly 115 120 125 Gln Leu Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu 130 135 140 Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val 145 150 155 160 Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Ser Asp 165 170 175 Trp Glu Gly Phe Cys Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala 180 185 190 Arg Ser Phe Val Ala Asp Gly Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp 195 200 205 Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe His Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys 210 215 220 Pro His Glu Arg Met Leu Gly Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr 225 230 235 240 His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala 245 250 255 Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Leu Met Glu Ser Ala 260 265 270 Gly Val Arg Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met 275 280 285 His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Phe Thr Arg Trp Ala 290 295 300 Ala Ala Leu Ala Pro 305 <210> 5 <211> 309 <212> PRT <213> Streptomyces lividans <400> 5 Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu 20 25 30 Ala Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr 35 40 45 Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His 50 55 60 Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp 65 70 75 80 Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg 85 90 95 Phe Met Ala Leu Val Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly 115 120 125 Gln Ile Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu 130 135 140 Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val 145 150 155 160 Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp 165 170 175 Trp Glu Gly Phe Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala 180 185 190 Arg Ser Phe Val Ala Asp Thr Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp 195 200 205 Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys 210 215 220 Pro His Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr 225 230 235 240 His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala 245 250 255 Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala 260 265 270 Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met 275 280 285 His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Ala 290 295 300 Ala Ala Leu Ala Pro 305 <210> 6 <211> 309 <212> PRT <213> Streptomyces coelicoflavus <400> 6 Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu 20 25 30 Ala Gly Asp Pro Asp Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr 35 40 45 Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ser Glu His 50 55 60 Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp 65 70 75 80 Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg 85 90 95 Phe Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser 100 105 110 Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly 115 120 125 Gln Leu Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu 130 135 140 Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val 145 150 155 160 Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp 165 170 175 Trp Glu Gly Phe Cys Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala 180 185 190 Arg Ser Phe Val Ala Asp Gly Ile Pro Gln His Leu Gln Glu Tyr Asp 195 200 205 Pro Glu Trp Ala Arg Val Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Ser Cys 210 215 220 Pro His Glu Arg Met Leu Gly Gln Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr 225 230 235 240 His His Met Arg Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala 245 250 255 Leu Ser Asp Glu Gln Ala Leu Arg Ala Arg Arg Leu Met Asp Ser Ala 260 265 270 Gly Val Thr Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met 275 280 285 His Gln Ser Ala Pro Ala Arg Tyr Val Glu Ile Phe Thr Arg Trp Ala 290 295 300 Ala Ala Leu Ala Pro 305 <210> 7 <211> 300 <212> PRT <213> Rhodococcus triatome <400> 7 Met Pro His Asp Tyr Glu Glu Lys Leu Val Asp Leu Gly Glu Ile Asp 1 5 10 15 Leu Asn Tyr Ala Glu Ala Gly Ser Pro Asp Lys Pro Ala Leu Leu Leu 20 25 30 Ile Pro Ser Gln Ser Glu Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Glu Ala Met Gly 35 40 45 Leu Leu Ala Glu Asp Tyr His Val Phe Ala Val Asp Met Arg Gly Gln 50 55 60 Gly Arg Ser Thr Trp Thr Pro Gly Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly 65 70 75 80 Asn Asp Leu Val Arg Phe Ile Asp Leu Val Ile Gly Arg Thr Val Ile 85 90 95 Val Ser Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Val Ala Ala Trp Leu Ala Ala 100 105 110 Phe Ser Leu Pro Gly Gln Val Arg Ala Ala Leu Ala Glu Asp Ala Pro 115 120 125 Phe Phe Ala Ser Glu Leu Asp Pro Lys Val Gly His Thr Ile Arg Gln 130 135 140 Ala Ala Gly His Ile Phe Val Asn Trp Arg Asp Tyr Leu Gly Asp Gln 145 150 155 160 Trp Ser Val Gly Asp Tyr Ala Gly Phe Leu Lys Ala Met Lys Ser Ser 165 170 175 Glu Val Pro Met Leu Arg Gln Val Pro Leu Pro Glu Thr Ala Pro Gln 180 185 190 Asn Leu Leu Glu Tyr Asp Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly 195 200 205 Thr Val Ala Gln Thr Cys Pro His Asp Tyr Met Leu Ser Gln Val Lys 210 215 220 Val Pro Met Leu Val Thr His His Ala Arg Met Ile Asp Glu Ala Thr 225 230 235 240 Ser Gly Leu Val Gly Ala Met Ser Asp Leu Gln Val Gln Lys Ala Ala 245 250 255 Glu Ile Ile Arg Gly Thr Gly Val Gln Val Asp Val Val Asp Leu Pro 260 265 270 Glu Ala Pro His Ile Leu His Gln Leu Ala Pro Lys Glu Tyr Val Glu 275 280 285 Ile Leu Asn Asn Trp Val Glu Lys Leu Pro Pro Val 290 295 300 <210> 8 <211> 307 <212> PRT <213> Hirschia baltica <400> 8 Met Ile Gln Asn Asn Lys Thr Ala Pro Tyr Lys Tyr Lys Glu Lys Leu 1 5 10 15 Val Asp Leu Gly Glu Ile Lys Met Asn Tyr Ile Val Ala Gly Ala Asp 20 25 30 Val Ser Pro Ala Leu Leu Leu Ile Pro Gly Gln Thr Glu Ser Trp Trp 35 40 45 Gly Phe Glu Ala Ala Ile Glu Lys Leu Glu Ser Asn Phe Gln Val Phe 50 55 60 Ala Ile Asp Leu Arg Gly Gln Gly Lys Ser Thr Gln Thr Pro Gly Arg 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Asn Leu Met Gly Asn Asp Leu Val Arg Phe Ile Ser Leu 85 90 95 Val Ile Lys Arg Pro Val Ile Val Ser Gly Asn Ser Ser Gly Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ala Met Pro Asn Gln Ile Arg Ala 115 120 125 Ile His Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Thr Ala Glu Lys Ala Pro Leu 130 135 140 Tyr Gly His Ala Ile Gln Gln Ala Ala Gly Pro Ile Phe Ser Leu Met 145 150 155 160 Ser Lys Phe Leu Gly Asp Gln Trp Ser Ile Asn Asn Trp Glu Gly Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Gln Ala Lys Asp Thr His Pro Ala Asn Lys Met Ile Ser 180 185 190 Gln Val Glu Gln Pro Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp Pro Glu Trp 195 200 205 Gly Arg Ala Phe Ile Glu Gly Lys Phe Asn Leu Asn Ser Pro His His 210 215 220 Thr Leu Leu Ser Asp Ile Lys Thr Pro Met Leu Tyr Thr His His Met 225 230 235 240 Arg Phe Glu Asp Pro Gln Thr Gly Leu Leu Ile Gly Ala Thr Ser Asp 245 250 255 Phe Gln Ala Ser Lys Ile Lys Glu Ile Ala Leu Lys Thr Gly Asn Ser 260 265 270 Phe Glu Leu Ile Asp Ala Pro Asp Ala Phe His Ser Met His Glu Ala 275 280 285 Asp Pro Gln Arg Phe Val Asp Ile Leu Thr Ser Trp Ile Glu Arg Leu 290 295 300 Asn Leu Gln 305 <210> 9 <211> 321 <212> PRT <213> Nocardia brasiliensis <400> 9 Met Gly Ile Ser Glu Ala Ala Asp Arg Ala Asp Thr Phe Val Ala His 1 5 10 15 Lys Phe Glu Glu Gln Leu Val Asp Leu Gly Glu Ile Arg Met Asn Tyr 20 25 30 Val Ala Ala Gly Asp Pro Thr Ser Pro Ala Leu Leu Leu Ile Pro Ala 35 40 45 Gln Gly Glu Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Asn Ala Ile Thr Leu Leu Ala 50 55 60 Asn Asp Phe Arg Val Phe Ala Ile Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser 65 70 75 80 Thr Trp Thr Pro Gly Arg Tyr Asn Leu Asn Thr Trp Gly Asn Asp Val 85 90 95 Glu Arg Phe Ile Asp Leu Val Ile Gly Arg Pro Thr Leu Val Ala Gly 100 105 110 Asn Ser Ser Gly Gly Val Ile Ala Ala Trp Leu Ala Ala Tyr Ala Lys 115 120 125 Pro Gly Gln Ile Arg Gly Ala Met Leu Glu Asp Pro Pro Leu Phe Ala 130 135 140 Ser Gln Ala Ala Pro Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Met Gln Thr Leu Gly 145 150 155 160 Pro Ile Phe Val Leu Trp Ala Lys Trp Leu Gly Pro Gln Trp Ser Val 165 170 175 Gly Asp Trp Asp Gly Met Val Ala Ala Ala Pro Arg Glu Leu Pro Glu 180 185 190 Phe Leu His Pro Gly Ile Ala Phe Leu Phe Gly Asp Gly Thr Gly Glu 195 200 205 Gly Ala Ala Ala Thr Pro Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp Pro Glu 210 215 220 Trp Ala Gln Ala Trp Ala Thr Asp Val Ala Asn Ala Gly Cys Asp His 225 230 235 240 Ala Thr Met Leu Ala Gln Asn Arg Val Pro Val Leu Leu Thr His His 245 250 255 Phe His Leu Thr Asp Pro Asp Thr Gly Gln Leu Met Gly Ala Met Thr 260 265 270 Asp Ile Gln Ala Gln Gln Ala Arg Arg Leu Leu Ala Ala Thr Gly Gln 275 280 285 Pro Val Thr Phe Thr Ala Leu Asp Ala Pro His Thr Met His Asp Pro 290 295 300 Glu Pro Glu Arg Tyr Phe Glu Val Leu Thr Glu Trp Ala Ser Ala Leu 305 310 315 320 Asp <210> 10 <211> 319 <212> PRT <213> Mycobacterium vaccae <400> 10 Met Gly Arg Tyr Ala Gly Val Phe Gly Pro His Ala Pro Glu Ser Thr 1 5 10 15 Tyr Val Gly His Ala Tyr Pro Glu Gln Leu Phe Asp Thr Gly Glu Val 20 25 30 Arg Leu Asn Tyr Ala Val Ala Gly Asp Ala Ser Ala Ser Pro Leu Leu 35 40 45 Leu Ile Pro Gly Gln Thr Glu Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Pro Ala Met 50 55 60 Gly Leu Leu Ala Glu His Phe His Val His Ala Val Asp Leu Arg Gly 65 70 75 80 Gln Gly Arg Ser Thr Arg Thr Pro Arg Arg Tyr Thr Leu Asp Asn Ile 85 90 95 Gly Asn Asp Leu Val Arg Phe Leu Asp Gly Val Ile Gly Arg Pro Ala 100 105 110 Phe Val Ser Gly Leu Ser Ser Gly Gly Leu Leu Ser Ala Trp Leu Ser 115 120 125 Ala Phe Ala Glu Pro Gly Gln Val Leu Ala Ala Cys Tyr Glu Asp Pro 130 135 140 Pro Phe Phe Ser Ser Glu Leu Asp Pro Val Ile Gly Pro Gly Leu Met 145 150 155 160 Ser Thr Val Gly Pro Leu Phe Ala Leu Tyr Val Lys Tyr Leu Gly Asp 165 170 175 Gln Trp Ser Ile Gly Asp Trp Asp Gly Phe Val Ala Gly Ala Pro Gln 180 185 190 Glu Leu Ala Gly Trp Gln Ala His Val Ala Leu Ala Gly Gly Thr Ala 195 200 205 Glu Pro Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp Pro Glu Trp Gly Arg Ala 210 215 220 Phe Val Gly Gly Thr Phe Thr Thr Gly Cys Pro His Gln Val Met Leu 225 230 235 240 Ser Gln Val Lys Val Pro Val Leu Phe Thr His His Phe Arg Met Leu 245 250 255 Asp Asp Glu Ser Gly Ser Leu Ile Gly Ala Ala Thr Asp Asp Gln Ala 260 265 270 Ala Arg Val Val Glu Leu Val Glu Asn Ser Gly Ala Pro Leu Thr Tyr 275 280 285 Arg Ser Phe Pro Met Met Gly His Ser Met His Ala Gln Asp Pro Ala 290 295 300 Leu Phe Ala Gly Thr Leu Val Asp Trp Phe Thr Ala Ala Arg Ser 305 310 315 <210> 11 <211> 319 <212> PRT <213> Mycobacterium gilvum <400> 11 Met Gly Arg Tyr Ala Gly Val Phe Gly Pro His Ala Pro Glu Ala Thr 1 5 10 15 Tyr Val Glu His Gly Tyr Pro Glu Arg Leu Phe Asp Thr Gly Glu Val 20 25 30 Gln Leu Asn Tyr Val Val Ala Gly Asp Ala Ala Ala Pro Pro Leu Leu 35 40 45 Leu Ile Pro Gly Gln Ser Glu Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Ala Ala Ile 50 55 60 Pro Leu Leu Ala Arg 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Lys Ser Gly Gly Arg Ser Val Thr Tyr 275 280 285 Arg Ser Phe Pro Met Met Ala His Ser Met His Gly Gln Asp Pro Ala 290 295 300 Leu Phe Ser Glu Thr Leu Val Glu Trp Phe Ser Arg Phe Thr Gly 305 310 315 <210> 12 <211> 322 <212> PRT <213> Gordonia effusa <400> 12 Met Pro Lys Ser Glu Ala Ala Asp Arg Ala Asp Ser Phe Val Ser His 1 5 10 15 Asp Phe Lys Glu Asn Ile Val Asp Leu Gly Glu Ile Arg Met Asn Tyr 20 25 30 Val Val Gln Gly Asn Lys Lys Ser Pro Ala Leu Leu Leu Ile Pro Ala 35 40 45 Gln Gly Glu Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Ala Ala Ile Pro Leu Leu Ala 50 55 60 Lys His Phe Gln Val Phe Ala Ile Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Thr 65 70 75 80 Thr Trp Thr Pro Gly Arg Tyr Thr Leu Asp Ile Phe Gly Asn Asp Val 85 90 95 Val Arg Phe Ile Asp Leu Val Ile Gly Arg Glu Thr Leu Ile Ala Gly 100 105 110 Asn Ser Ser Gly Gly Leu Ile Gly Ala Trp Leu Ala Ala Phe Ala Lys 115 120 125 Pro Gly Gln Val Arg Ala Val Met Leu Glu Asp Pro Pro Leu Phe Ala 130 135 140 Ser Glu Ile Arg Pro Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Trp Gln Gly Leu Gly 145 150 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Lys Asp Asp Tyr Gln Val Phe Ala Val Asp Met Arg Gly Gln 35 40 45 Gly Gln Ser Thr Trp Thr Pro Gly Arg Tyr Ser Leu Asp Thr Phe Gly 50 55 60 Asn Asp Leu Val Lys Phe Ile Asp Ile Val Ile Lys Arg Pro Val Val 65 70 75 80 Val Ser Gly Leu Ser Ser Gly Gly Val Val Ser Ala Trp Leu Ser Ala 85 90 95 Phe Ala Lys Pro Gly Gln Ile Arg Ala Ala Val Tyr Glu Asp Pro Pro 100 105 110 Leu Phe Ala Ser Gln Ser Lys Pro Ala Ile Gly Gln Ser Val Met Gln 115 120 125 Thr Val Ala Gly Pro Phe Phe Asn Leu Trp Tyr Lys Trp Leu Gly Ala 130 135 140 Gln Trp Thr Ile Gly Asp Gln Ala Gly Met Val Ala Ala Met Pro Lys 145 150 155 160 Glu Ile Pro Ala Trp Ile Leu Gln Tyr Leu Gly Asn Thr Thr Ser Gly 165 170 175 Pro Thr Gly Leu Asp Leu Thr Leu Asn Glu Tyr Asp Pro Glu Trp Gly 180 185 190 His Gly Phe Val Ser Gly Thr Val Asp Ala Thr Cys Asp His Glu Ala 195 200 205 Met Leu Thr His Val Lys Val Pro Val Leu Phe Thr His His Ser Arg 210 215 220 Ala Ile Asp Pro Tyr Thr Gly Asn Leu Ile Gly Ser Val Ser Asp Thr 225 230 235 240 Gln Val Ser Tyr Ala Gln Gly Leu Ile Thr Thr Asn Gly Asn Gln Ser 245 250 255 Phe Thr Leu Lys Asn Phe Pro Leu Ala Ser His Asp Met His Asn Ser 260 265 270 Asp Pro Ala Thr Tyr Val Ser Ala Ile Thr Thr Trp Met Ala Ser Leu 275 280 285 Gly Ile Gly Ser Ala Val Ile Pro Gly Pro Val Lys Val Ala Ser Ala 290 295 300 Ser Ala Gln Val Ser Ala Ala Ser Thr Ala Pro Pro Ser Cys Thr Ser 305 310 315 320 Thr Ser Ala Pro Ser Thr Gly His 325 <210> 14 <211> 280 <212> PRT <213> Actinosynnema mirum <400> 14 Met Thr Val Val Asp Pro Pro Ala Pro Arg Asp Phe Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Leu Gly Glu Val Val Leu Asn His Ala Glu Ala Gly Ser Pro 20 25 30 Asp Arg Pro Ala Leu Val Pro Val Pro Glu Gln Gly Gly Ser Trp Trp 35 40 45 Ser Tyr Glu Arg Val Met Pro Leu Pro Ala Arg Asp Phe His Val Phe 50 55 60 Ala Val Asp Leu Arg Gly Arg Gly Arg Ser Thr Arg Thr Pro Arg Arg 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Asp Asp Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg Phe Leu Ala Leu 85 90 95 Val Val Arg Arg Pro Ala Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val 100 105 110 Leu Ala Ala Trp Ser Ser Ala Tyr Ala Met Pro Gly Gln Val Arg Ala 115 120 125 Val Leu Leu Glu Asp Pro Pro Leu Phe Ser Ser Glu Leu Thr Pro Val 130 135 140 Cys Gly Pro Gly Val Arg Gln Ala Ala Gly Pro Leu Phe Glu Leu Leu 145 150 155 160 Ser Thr His Leu Gly Asp Gln Trp Gly Gly Gly Arg Pro Gly Arg Val 165 170 175 His Gly Gly Val Pro Arg Leu Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Val Arg 180 185 190 Val Ala Arg Arg Ala Ala Ala Thr Asp Ala Arg Gly Arg Pro Gly Ala 195 200 205 Ala Arg Gly Arg Pro Ala Gly Val Gly Gly Ala Ala Arg Arg Gly Arg 210 215 220 Gly Gly Arg Glu Arg Thr Gly Thr Thr Thr Val Leu Ser Gly Leu Thr 225 230 235 240 Gly Ser Arg Thr Ser Gly Thr Gly Arg Cys Arg Lys Pro Phe Arg Leu 245 250 255 Arg Gln Trp Trp Ala Gly Gly Ala Arg Gly Pro Pro Pro Pro Arg Gln 260 265 270 Ile Arg Ala Asp Val Arg Thr Arg 275 280 <210> 15 <211> 326 <212> PRT <213> Kutzneria albida <400> 15 Met Ser Val Pro Val Thr Pro Ser Ala Arg Asn Val Phe Val Pro His 1 5 10 15 Ala Phe Pro Glu Lys Gln Ile Asp Leu Gly Glu Val Val Leu Asn Tyr 20 25 30 Ala Glu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Glu 35 40 45 Gln Thr Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Pro Ala Met Gly Leu Leu Ala 50 55 60 Glu His Phe His Val Phe Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser 65 70 75 80 Thr Trp Thr Pro Gly Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu 85 90 95 Val Arg Phe Ile Ala Leu Ala Ile Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly 100 105 110 Cys Ser Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ala Leu 115 120 125 Pro Gly Gln Ile Arg Gly Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Leu Phe Ala 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Pro Ala His Gly His Gly Val Arg Gln Gly Ala Gly 145 150 155 160 Pro Val Phe Glu Leu Tyr Arg Asp Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val 165 170 175 Gly Asp Trp Ala Gly Leu Val Ala Ala Ala Gln Ala Ser Pro Ala Lys 180 185 190 Met Met Ser Leu Phe Lys Met Pro Gly Glu Pro Pro Gln Asn Leu Arg 195 200 205 Glu Tyr Asp Pro Glu Trp Ala Arg Val Phe Phe Glu Gly Thr Val Gly 210 215 220 Leu His Cys Pro His Asp Arg Met Leu Ser Gln Val Lys Thr Pro Val 225 230 235 240 Leu Ile Thr His His Ala Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Gly Glu Phe 245 250 255 Leu Gly Ala Leu Ser Glu Leu Gln Ala Glu Arg Ala Gln Ala Ile Ile 260 265 270 Arg Ala Ala Gly Val Pro Val Asp Tyr Gln Ser Phe Pro Asp Ala Ala 275 280 285 His Ala Met His Thr Thr Glu Pro Ala Arg Tyr Ala Ala Val Leu Thr 290 295 300 Ala Trp Ala Ala Lys Leu Pro Pro Val Ala Asp Thr Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ser Ala His Val 325 <210> 16 <211> 987 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 1 <400> 16 atggccgaag aaggaactag gtccgaagca gcggatgctg ccacacaagc gagacagcta 60 cccgattcgc ggaacatctt tgtctcgcac cgatttccgg aaaggcaggt cgatctcggt 120 gaagtggtga tgaacttcgc ggaggcgggc tctccggaca acccggcact gctcctcctc 180 cccgagcaga ccgggtcgtg gtggagttac gagccagtga tgggtcttct ggcagagaac 240 tttcatgtct ttgccgtcga tatccgtggg caaggtcgca gtacctggac gccacggcga 300 tacagcctgg acaacttcgg caatgatctg gtgcgtttca tcgctctggt catcaagcgc 360 cctgtcgtcg tggcagggaa ctcctcgggg gggctgctgg ccgcctggct ctcggcgtac 420 gcgatgcccg gccagatccg tgcagcattg tgtgaggacg caccgttctt tgcgtcggag 480 ttggtccccg catacggtca ctcggttctg caggcggcgg gtccggcatt cgagttgtac 540 cgggacttcc tcggggacca gtggtcgatt ggggactgga aagggttcgt tgaggcagcc 600 aaagcgtcgc cggcaaaggc tatgcaatta tttccgaccc cggatgaggc gccgcagaat 660 ctcaaggaat acgacccgga atgggggcgc gcattcttcg aagggactgt ggcactgcac 720 tgcccacacg acaggatgct ctcgcaagtc aagacaccaa ttctcatcac tcaccacgcg 780 cggacgatcg accccgagac gggcgagctg ttgggcgcgc tctccgacct tcaggcagag 840 catgcgcagg acatcattcg gtctgcgggc gttcgggtgg actatcagtc gcaccccgac 900 gcgcttcaca tgatgcatct gttcgatccc gctcgttacg cggagatctt gacatcctgg 960 tccgcaacac tgcctgcgaa cgactag 987 <210> 17 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <400> 17 atggcagaag aaggcacccg tagcgaagca gcagatgcag caacccaggc acgtcagctg 60 ccggatagcc gtaacatttt tgttagccat cgttttccgg aacgtcaggt tgatctgggt 120 gaagttgtta tgaattttgc agaagcaggt agtccggata atccggcatt actgctgctg 180 ccggaacaga ccggtagttg gtggtcttat gaaccggtta tgggtctgct ggcagaaaac 240 tttcatgttt ttgcagttga tattcgtggt cagggtcgta gcacctggac accgcgtcgt 300 tatagcctgg ataattttgg taatgatctg gtgcgtttta ttgccctggt tattaaacgt 360 ccggttgttg ttgcaggtaa tagcagcggt ggcctgctgg ctgcatggct gagcgcctat 420 gcaatgcctg gtcagattcg tgcagcactg tgtgaagatg caccgttttt tgcaagcgaa 480 ctggttcctg cctatggtca tagcgttctg caggcagcag gtccggcatt tgaactgtat 540 cgtgattttc tgggtgatca gtggtcaatt ggtgattgga aaggttttgt tgaagcagca 600 aaagcaagtc cggctaaagc aatgcagctg tttccgacac cggatgaagc accgcagaat 660 ctgaaagaat atgatccgga atggggtcgt gcattttttg aaggcaccgt tgcactgcat 720 tgtccgcatg atcgtatgct gagccaggtt aaaaccccga ttctgattac ccatcatgca 780 cgtaccatcg atccggaaac cggtgaactg ctgggtgcac tgagtgatct gcaggccgaa 840 catgcacagg atattattcg tagtgccggt gttcgtgttg attatcagag ccatcctgat 900 gcactgcaca tgatgcacct gtttgatccg gcacgttatg cagaaattct gaccagttgg 960 agcgcaaccc tgcctgcaaa tgattaa 987 <210> 18 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 2 <400> 18 atggcagatc cggcacagcg tgatgtttat gttccgcatg catatccgga aaaacaggca 60 gatctgggtg aaattaccat gaattatgcc gaagccggtg aacctgatat gcctgcagtt 120 ctgctgattc cggaacagac cggtagttgg tggggttatg aagaagcaat gggtctgctg 180 gcagaaaact ttcatgttta tgcagttgat ctgcgtggtc agggtcgtag cagctgggca 240 ccgaaacgtt atagcctgga taattttggt aatgatctgg tgcgttttat tgccctggtt 300 gttaaacgtc cggttattgt tgcaggtaat agcagcggtg gtgttctggc agcatggctg 360 agcgcatata gcatgcctgg tcaggttcgt ggtgcactgt gtgaagatgc accgtttttt 420 gcaagcgaac tggttaccac ctgtggtcat agcattcgtc aggcagcagg tccgatgttt 480 gaactgtttc gtacctatct gggcgatcag tggtcagttg gtgattggac cggctattgt 540 cgtgcagcag atgcaagcag cagcccgatg gcacgttatt ttgttgcaga tgaaattccg 600 cagcacatgc gtgaatatga tccggaatgg gcacgtgcat tttgggaagg caccgttgca 660 ctgcattgtc cgcatgaaca gctgctgacc caggttaaaa caccggtgct gctgacacat 720 cacatgcgcg atattgatcc tgataccggt catctggttg gtgccctgag tgatgaacag 780 gcagcccgtg cacgtctgct gatggaaagt gccggtgtta aagttgatta tgcaagcgtt 840 ccggatgcac tgcacatgat gcaccagttt gatccgcctc gttatgttga aatctttacc 900 cagtgggcag caaccctggc agcataa 927 <210> 19 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 3 <400> 19 atggttacca gtccggcact gcgtgatgtt catgttccgc atgcatatcc ggaacagcag 60 gttgatctgg gtgaaattac catgaattat gccgaagccg gtgatccggg tcgtccggca 120 gttctgctga tcccggaaca gaccggtagt tggtggtctt atgaagaagc aatgggtctg 180 ctggcagaac attttcatgt ttatgcagtt gatctgcgtg gtcagggtcg tagcagctgg 240 accccgaaac gttatagcct ggataatttt ggtaatgatc tggtgcgttt tattgccctg 300 gttgttcgtc gtccggttgt tgttgcaggt aatagcagcg gtggtgttct ggcagcatgg 360 ctgagcgcat atagcatgcc tggtcagatt cgtggtgtgc tgtgtgaaga tccgcctttt 420 tttgcaagcg aactggttcc ggcacatggt catagcgttc gtcagggtgc aggtccggtt 480 tttgaactgt ttcgtaccta tctgggcgat cagtggtcag ttggtgattg ggaaggtttt 540 cgtagcgcag cagatgcaag cgcaagcccg atggcacgta gctttgttgc agataccatt 600 ccgcagcatc tgaaagaata tgatccggaa tgggcacgtg cattttatga aggcaccgtt 660 ggtctgaatt gtccgcatga acgtatgctg aatcgtgtta atacaccggt gctgctgacc 720 catcacatgc gtggcaccga tccggaaacc ggtaatctgc tgggtgcact gagtgatgaa 780 caggcagcac aggtgcgtcg tctgatggaa agtgccggtg ttaaagttga ttatgaaagc 840 gttccggatg caagccacat gatgcaccag agcgatccgg cacgttatgc agaaattctg 900 accccgtgga ccgcagcact ggcaccgtaa 930 <210> 20 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 4 <400> 20 atggttacca gtccggcact gcgtgatgtt catgttccgc atgcatatcc ggaacagcag 60 gttgatctgg gtgaaattac catgaattat gccgaagccg gtgatcctga tcgtccggca 120 gttctgctga tcccggaaca gaccggtagt tggtggtcat atgaagaagc aatgggtctg 180 ctggcagaac attttcatgt ttatgcagtt gatctgcgtg gtcagggtcg tagcagctgg 240 accccgaaac gttatagcct ggataatttt ggtaatgatc tggtgcgttt tattgccctg 300 gttgttaaac gtccggttgt tgttgcaggt aatagcagcg gtggtgttct ggcagcatgg 360 ctgagcgcat atagcatgcc tggtcagctg cgtggtgtgc tgtgtgaaga tccgcctttt 420 tttgcaagcg aactggttcc ggcacatggt catagcgttc gtcagggtgc aggtccggtt 480 tttgaactgt ttcgtaccta tctgggcgat cagtggtcag ttagcgattg ggaaggtttt 540 tgtcgtgcag ccggtgcaag cgcaagcccg atggcacgta gctttgttgc agatggtatt 600 ccgcagcatc tgaaagaata tgatccggaa tgggcacgtg catttcatga aggcaccgtt 660 ggtctgaatt gtccgcatga acgtatgctg ggtcgtgtta atacaccggt gctgctgacc 720 catcatatgc gtggcaccga tccggaaacc ggtaatctgc tgggtgcact gagtgatgaa 780 caggcagcac aggcacgtct gctgatggaa agtgccggtg ttcgtgttga ttatgaaagc 840 gttccggatg caagccatat gatgcaccag agcgatccgg cacgttatgc agaaatcttt 900 acccgttggg cagcagccct ggcaccgtaa 930 <210> 21 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 5 <400> 21 atggttacca gtccggcact gcgtgatgtt catgttccgc atgcatatcc ggaacagcag 60 gttgatctgg gtgaaattac catgaattat gccgaagccg gtgatccggg tcgtccggca 120 gttctgctga tcccggaaca gaccggtagt tggtggtctt atgaagaagc aatgggtctg 180 ctggcagaac attttcatgt ttatgcagtt gatctgcgtg gtcagggtcg tagcagctgg 240 accccgaaac gttatagcct ggataatttt ggtaatgatc tggtgcgttt tatggcactg 300 gttgttcgtc gtccggttgt tgttgcaggt aatagcagcg gtggtgttct ggcagcatgg 360 ctgagcgcat atagcatgcc tggtcagatt cgtggtgtgc tgtgtgaaga tccgcctttt 420 tttgcaagcg aactggttcc ggcacatggt catagcgttc gtcagggtgc aggtccggtt 480 tttgaactgt ttcgtaccta tctgggcgat cagtggtcag ttggtgattg ggaaggtttt 540 cgtagcgcag ccggtgcaag cgcaagcccg atggcacgta gctttgttgc agataccatt 600 ccgcagcatc tgaaagaata tgatccggaa tgggcacgtg cattttatga aggcaccgtt 660 ggtctgaatt gtccgcatga acgtatgctg aatcgtgtta atacaccggt gctgctgacc 720 catcacatgc gtggcaccga tccggaaacc ggtaatctgc tgggtgcact gagtgatgaa 780 caggcagcac aggcacgtcg tctgatggaa agtgccggtg ttaaagttga ttatgaaagc 840 gttccggatg caagccacat gatgcaccag agcgatccgg cacgttatgc agaaattctg 900 accccgtggg cagcagccct ggcaccgtaa 930 <210> 22 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 6 <400> 22 atggttacca gtccggcact gcgtgatgtt catgttccgc atgcatatcc ggaacagcag 60 gttgatctgg gtgaaattac catgaattat gccgaagccg gtgatcctga tcgtccggca 120 gttctgctga tcccggaaca gaccggtagt tggtggtctt atgaagaagc aatgggtctg 180 ctgagcgaac attttcatgt ttatgcagtt gatctgcgtg gtcagggtcg tagcagctgg 240 accccgaaac gttatagcct ggataatttt ggtaatgatc tggtgcgttt tattgccctg 300 gttgttaaac gtccggttgt tgttgcaggt aatagcagcg gtggtgttct ggcagcatgg 360 ctgagcgcat atagcatgcc tggtcagctg cgtggtgtgc tgtgtgaaga tccgcctttt 420 tttgcaagcg aactggttcc ggcacatggt catagcgttc gtcagggtgc aggtccggtt 480 tttgaactgt ttcgtaccta tctgggcgat cagtggtcag ttggtgattg ggaaggtttt 540 tgtcgtgcag ccggtgcaag cgcaagcccg atggcacgta gctttgttgc agatggtatt 600 ccgcagcatc tgcaagaata tgatccggaa tgggcacgtg ttttttatga aggcaccgtt 660 ggtctgagct gtccgcatga acgtatgctg ggtcaggtta aaacaccggt gctgctgacc 720 catcacatgc gtggtatcga tccggaaacc ggtaatctgc tgggtgcact gagtgatgaa 780 caggccctgc gtgcacgtcg tctgatggat agtgccggtg ttaccgttga ttatgaaagc 840 gttccggatg caagccacat gatgcaccag agcgcaccgg cacgttatgt tgaaatcttt 900 acccgttggg cagcagccct ggcaccgtaa 930 <210> 23 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 7 <400> 23 atgccgcacg attatgaaga aaaactggtt gatctgggcg aaatcgatct gaattatgca 60 gaagcaggta gtccggataa accggcactg ctgctgattc cgagccagag cgaaagttgg 120 tggggctatg aagaagcaat gggtctgctg gccgaagatt atcatgtttt tgcagttgat 180 atgcgtggtc agggtcgtag cacctggaca ccgggtcgtt atagcctgga taattttggt 240 aatgatctgg tgcgctttat cgatctggtt attggtcgta ccgttattgt tagcggtaat 300 agcagcggtg gtgttgttgc agcatggctg gcagcattta gcctgcctgg tcaggttcgt 360 gcagcactgg cagaagatgc accgtttttt gcaagcgaac tggacccgaa agtgggtcat 420 accattcgtc aggcagcagg tcatattttt gttaactggc gtgattatct gggtgatcag 480 tggtcagttg gtgattatgc aggttttctg aaagcaatga aaagcagcga agttccgatg 540 ctgcgtcagg ttccgctgcc ggaaaccgca ccgcagaatc tgctggaata tgatccggaa 600 tgggcacgtg cattttatga aggcaccgtt gcacagacct gtccgcatga ttatatgctg 660 agccaggtta aagtgcctat gctggttacc catcatgcac gtatgattga tgaagcaacc 720 agcggtctgg ttggtgcaat gagcgatctg caggttcaga aagcagcaga aattattcgt 780 ggcaccggtg ttcaggttga tgttgttgat ctgccggaag caccgcatat tctgcatcag 840 ctggcaccga aagaatatgt ggaaattctg aataactggg tggaaaaact gcctccggtt 900 taa 903 <210> 24 <211> 924 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 8 <400> 24 atgatccaga acaataaaac cgcaccgtat aaatacaaag aaaaactggt tgatctgggc 60 gaaatcaaaa tgaactatat tgttgccggt gcagatgtta gtccggcact gctgctgatt 120 ccgggtcaga ccgaaagttg gtggggtttt gaagcagcaa ttgagaaact ggaaagcaac 180 tttcaggtgt ttgcaattga tctgcgtggt cagggtaaaa gcacccagac accgggtcgt 240 tatagcctga atctgatggg taatgatctg gttcgtttta ttagcctggt tattaaacgt 300 ccggttattg ttagcggtaa tagcagcggt ggtctgctgg cagcatggct gagcgcctat 360 gcaatgccga atcagattcg tgcaattcat tgtgaagatg caccgttttt taccgcagaa 420 aaagcaccgc tgtatggtca tgcaattcag caggcagcag gtccgatttt tagcctgatg 480 agcaaatttc tgggtgatca gtggtcaatt aacaattggg aaggtctgaa agcagcacag 540 gcaaaagata cccatccggc aaacaaaatg attagccagg ttgaacagcc tccgcagcat 600 ctgaaagaat atgatccgga atggggtcgt gcatttattg aaggcaaatt taacctgaac 660 agtccgcatc ataccctgct gagcgacatt aaaaccccga tgctgtatac ccatcacatg 720 cgttttgaag atccgcagac aggtctgctg attggtgcaa ccagcgattt tcaggcaagc 780 aaaatcaaag aaattgccct gaaaaccggc aatagcttcg aactgattga tgcaccggat 840 gcatttcata gtatgcatga agccgatccg cagcgttttg ttgatattct gaccagctgg 900 attgaacgtc tgaatctgca gtaa 924 <210> 25 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 9 <400> 25 atgggtatta gcgaagcagc agatcgtgca gatacctttg ttgcacataa atttgaagaa 60 cagctggttg atctgggtga aattcgtatg aattatgttg cagccggtga tccgaccagt 120 ccggcactgc tgctgattcc ggcacagggt gaaagttggt ggggttatga aaatgcaatt 180 accctgctgg caaatgattt tcgtgttttt gcaattgatc tgcgtggtca gggtcgtagc 240 acctggacac cgggtcgtta taatctgaat acctggggta atgatgtgga acgctttatt 300 gatctggtta ttggtcgtcc gaccctggtt gcaggtaata gcagcggtgg tgttattgca 360 gcatggctgg cagcctatgc aaaaccgggt cagattcgtg gtgcaatgct ggaagatccg 420 cctctgtttg caagccaggc agcaccgcct tatggtccgg gtattatgca gaccctgggt 480 ccgatttttg ttctgtgggc aaaatggctg ggtccgcagt ggtcagttgg tgattgggat 540 ggtatggttg cagcggcacc gcgtgaactg ccggaatttc tgcatccggg tatcgcattt 600 ctgtttggtg atggcaccgg tgaaggtgca gcagcaaccc ctccgcagca tctgaaagaa 660 tatgatccgg aatgggcaca ggcatgggca accgatgttg caaatgcagg ttgtgatcat 720 gcaaccatgc tggcacagaa tcgtgttccg gttctgctga cccatcattt tcatctgacc 780 gatccggata caggccagct gatgggtgca atgaccgata ttcaggcaca gcaggcacgt 840 cgtctgctgg cagcaaccgg tcagccggtt acctttaccg cactggatgc accgcatacc 900 atgcatgatc ctgaacctga acgttatttt gaagttctga ccgaatgggc aagtgcactg 960 gattaa 966 <210> 26 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 10 <400> 26 atgggtcgtt atgccggtgt ttttggtccg catgcaccgg aaagcaccta tgttggtcat 60 gcatatccgg aacaactgtt tgataccggt gaagttcgtc tgaattatgc agttgccggt 120 gatgcaagcg caagtccgct gctgctgatt ccgggtcaga ccgaaagttg gtggggttat 180 gaaccggcaa tgggtctgct ggcagaacat tttcatgttc atgcagttga tctgcgtggt 240 cagggtcgta gcacccgtac accgcgtcgt tataccctgg ataatattgg taatgatctg 300 gtgcgttttc tggatggtgt tattggtcgt ccggcatttg ttagcggtct gagcagcggt 360 ggtctgctga gcgcatggct gagcgccttt gcagaaccgg gtcaggttct ggcagcatgt 420 tatgaagatc cgcctttttt tagcagcgaa ctggacccgg tgattggtcc gggtctgatg 480 agcaccgttg gtccgctgtt tgcactgtat gttaaatatc tgggtgatca gtggtcaatt 540 ggtgattggg atggttttgt tgcaggcgca ccgcaagaac tggcaggttg gcaggcacat 600 gttgcactgg caggcggtac agcagaaccg cctcagcatc tgaaagaata tgatccggaa 660 tggggtcgtg catttgttgg tggcaccttt accaccggtt gtccgcatca ggttatgctg 720 agccaggtta aagttccggt tctgtttacc catcattttc gtatgctgga tgatgaaagc 780 ggtagcctga ttggtgcagc aaccgatgat caggcagcac gtgttgttga actggttgaa 840 aatagtggtg caccgctgac ctatcgtagc tttccgatga tgggtcatag tatgcatgca 900 caagatccgg cactgtttgc aggcaccctg gttgattggt ttaccgcagc acgtagctaa 960 <210> 27 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 11 <400> 27 atgggtcgtt atgccggtgt ttttggtccg catgcaccgg aagcaaccta tgttgaacat 60 ggttatccgg aacgtctgtt tgataccggt gaagtgcagc tgaattatgt tgttgccggt 120 gatgcagcag caccgcctct gctgctgatt ccgggtcaga gcgaaagttg gtggggttat 180 gaagcagcaa ttccgctgct ggcacgtcat tttcatgttc atgcagttga tctgcgtggt 240 cagggtcgta gcacccgtac accgggtcgc tataccctgg ataatgttgg taatgatctg 300 gtgcgttttc tggatggtgt tattggtcgt ccggcatttg ttagcggtct gagcagcggt 360 ggtctggcaa gcgcatggct gagcgcattt gcaaaaccgg gtcaggttgt tgcagcatgt 420 tgggaagatc cgcctttttt tagcagcgaa accgcaccga ttgttggtcc gcctattacc 480 gatagcattg gtccgctgtt tggtatgtgg gcacgttatc tgggtgatca gtggtcagtt 540 ggtgattggg atggttttgt tgccgcagtt ccgaccgaac tggcagattg gcaggcacat 600 gttgcactgg ttgttggcac cgcagatcct ccgcagaatc tgcgtgaata tgatccggaa 660 tggggtaaag catttattac cggcaccttt gcagcaagct gtccgcatca tgttatgctg 720 agcaaagtta aagttccggt tctgtatacc catcactttc gcatgattga tgaaggtagt 780 ggtggtctga ttggtgcatg tagcgatatt caggcaggtc gtgttaccca gctggcaaaa 840 tcaggtggtc gtagcgttac ctatcgtagc tttccgatga tggcacatag catgcatggt 900 caagatccgg cactgtttag cgaaaccctg gttgaatggt ttagccgttt taccggttaa 960 <210> 28 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 12 <400> 28 atgccgaaaa gcgaagcagc agatcgtgca gatagctttg ttagccatga tttcaaagaa 60 aacattgtgg atctgggcga aatccgcatg aattatgttg ttcagggcaa caaaaaaagt 120 ccggcactgc tgctgattcc ggcacagggt gaaagttggt ggggttatga agcagcaatt 180 ccgctgctgg caaaacattt tcaggttttt gcaattgatc tgcgtggtca gggtcgtacc 240 acctggacac cgggtcgtta taccctggat atttttggta atgatgtggt gcgctttatc 300 gatctggtta ttggtcgtga aaccctgatt gcaggtaata gcagcggtgg tctgattggt 360 gcatggctgg cagcatttgc aaaaccgggt caggttcgtg cagttatgct ggaagatccg 420 cctctgtttg caagcgaaat tcgtccgcct tatggtccgg gtatttggca gggtctgggt 480 ccgatgtttg cagcatgggc aaaatggctg ggtccgcagt ggtcaattgg tgattgggat 540 ggtatggtta aagcactgcc ggatgaactg ccggaagatc tgctgcctgg tattggtttt 600 atgctgggtg atggtgaaag tgatggtgca gcaccgaccc ctccgcagca tctgaaagaa 660 tatgatccgg aatggggtgc aagctgggca agcggttttg ccaataccgg ttgtgaacat 720 gaagcagtta ttagccaggt gcgtgttccg gttctgctga cccatcattt tcgtcagatt 780 aatgaagaaa ccggtcatct gatgggtgca ctgagcgatc tgcaggcagc acaggttcgt 840 catatcattg aagaagttgc aggtcaagag gttacctatg ttagcctgga tgcaccgcat 900 accatgcatg aaccgcagcc ggaacgttat accgatgttc tgctggattg ggttaaaaaa 960 ctgggttaa 969 <210> 29 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 13 <400> 29 atgaattatg caaccgcagg tagcagcgat aaaccggcac tgctgctggt tccgggtcag 60 agcgaaagtt ggtggggtta tgaaatggca atgtggctgc tgaaagatga ttatcaggtt 120 tttgcagttg atatgcgtgg tcagggtcag agtacctgga caccgggtcg ttatagcctg 180 gatacctttg gtaatgatct ggtgaaattc atcgatatcg tgattaaacg tccggttgtt 240 gttagcggtc tgagcagcgg tggtgttgtg agcgcatggc tgagcgcatt tgcaaaacct 300 ggtcagattc gtgcagcagt ttatgaagat ccgcctctgt ttgcaagcca gagcaaaccg 360 gcaattggtc agagtgttat gcagaccgtt gcaggtccgt tttttaacct gtggtataaa 420 tggctgggtg cacagtggac cattggtgat caggcaggta tggttgcagc aatgccgaaa 480 gaaattccgg catggattct gcagtatctg ggtaatacca ccagtggtcc gaccggtctg 540 gatctgacac tgaatgaata tgatccggaa tggggtcatg gttttgttag tggcaccgtt 600 gatgcaacct gtgatcatga agcaatgctg acccatgtta aagttccggt tctgtttacc 660 catcatagcc gtgcaattga tccgtatacc ggtaatctga ttggtagcgt tagcgatacc 720 caggttagct atgcacaggg tctgattacc accaatggca atcagagctt taccctgaaa 780 aactttccgc tggcaagcca tgatatgcat aattctgatc cggcaaccta tgttagcgca 840 attaccacct ggatggcaag cctgggtatt ggtagtgcag ttattccggg tccggttaaa 900 gttgcaagcg caagcgcaca ggttagcgca gcaagcaccg caccgcctag ctgtaccagc 960 accagcgcac cgagcaccgg tcattaa 987 <210> 30 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ORF was codon optimized and thus differce from natural occuring DNA sequence. <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 14 <400> 30 atgaccgttg ttgatccgcc tgcaccgcgt gattttccgg aactgctggt tgatctgggt 60 gaagttgttc tgaatcatgc agaagcaggt agtccggatc gtccggcact ggttccggtg 120 ccggaacagg gtggtagttg gtggtcttat gaacgtgtta tgccgctgcc tgcacgcgat 180 tttcatgttt ttgcagttga tctgcgtggt cgtggtcgta gcacccgtac accgcgtcgt 240 tatagcctgg atgattttgg taatgatctg gttcgttttc tggccctggt tgttcgccgt 300 ccggcagttg ttgcaggtaa tagcagcggt ggtgttctgg cagcatggtc aagcgcctat 360 gcaatgcctg gtcaggttcg tgcagttctg ctggaagatc cgcctctgtt tagcagcgaa 420 ctgacaccgg tttgtggtcc gggtgttcgt caggcagcag gtccgctgtt tgaactgctg 480 agcacccatc tgggcgatca gtggggtggt ggtcgtccgg gtcgtgttca tggtggcgtt 540 ccgcgtctgg gtctggcagc cgcagcagca gttcgtgttg cacgtcgtgc agcagcaacc 600 gatgcacgtg gtcgccctgg tgcagcacgt ggacgtcctg ccggtgttgg tggtgcagct 660 cgtcgcggtc gcggtggtcg tgaacgcacc ggtacaacca ccgttctgag cggtctgacc 720 ggtagccgta ccagcggcac cggtcgttgt cgtaaaccgt ttcgtctgcg tcagtggtgg 780 gcaggcggtg cccgtggtcc tcctccgcct cgtcagattc gcgcagatgt tcgtacccgt 840 taa 843 <210> 31 <211> 981 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <221> misc_feature <223> Artificial DNA sequence encodes polypeptid with SEQ ID NO: 15 <400> 31 atgagcgttc cggttacccc gagcgcacgt aatgtttttg ttccgcatgc atttccagag 60 aaacaaattg atctgggtga agtggttctg aattatgcag aagcaggtac accggataaa 120 ccggcattac tgctgctgcc ggaacagacc ggtagttggt ggtcttatga accggcaatg 180 ggtctgctgg cagaacattt tcatgttttt gcagttgatc tgcgtggtca gggtcgtagc 240 acctggacac cgggtcgtta tagcctggat aattttggta atgatctggt gcgttttatt 300 gcactggcaa ttcgtcgtcc ggttgttgtt gcaggttgta gcagcggtgg tgttctggca 360 gcatggctga gcgcctatgc actgcctggt cagattcgtg gtgcactgtg tgaagatgca 420 ccgctgtttg caagcgaact gacaccggca catggtcatg gtgttcgtca gggtgcaggt 480 ccggtttttg aactgtatcg tgattatctg ggcgatcagt ggtcagttgg tgattgggca 540 ggtctggttg cagcagcaca ggcaagtccg gcaaaaatga tgagcctgtt taaaatgcct 600 ggtgaaccgc ctcagaatct gcgtgaatat gatccggaat gggcacgtgt tttttttgaa 660 ggcaccgttg gtctgcattg tccgcatgat cgtatgctga gccaggttaa aacaccggtt 720 ctgattaccc atcatgcacg taccaccgat ccggaaaccg gtgaatttct gggtgcactg 780 agcgaactgc aggcagaacg tgcacaggcc attattcgtg cagccggtgt tccggttgat 840 tatcagagct ttccggatgc agcacatgca atgcatacca cagaaccggc acgttatgca 900 gcagttctga ccgcatgggc agcaaaactg cctccggttg cagataccag cccgtcagca 960 gcagcaagcg cacatgttta a 981 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 32 Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 33 Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 34 Asp Ala Leu His Met Met His 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 35 Ala Gly Asp Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 36 Ala Gly Asp Ser Ser Leu Gly 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 37 Ala Gly Gln Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 38 Ala Gly His Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 39 Ala Gly Ser Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 40 Ser Gly Asn Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 41 Ser Gly Asp Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 42 Ser Gly Gln Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 43 Ser Gly His Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 44 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 45 Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 46 Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 47 Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 48 Arg Gly Ile Asp Pro Glu Thr 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 49 Asp Ala Leu His Met Met His 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 50 Asp Ala Ser His Met Met His 1 5 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 51 Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 52 Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Leu 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 53 His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 54 His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 55 His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 56 His Pro Asp Ala Leu His Met Met His Leu Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 57 Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His Gln Phe 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 58 Val Pro Asp Ala Ser His Met Met His Gln Ser 1 5 10 <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 59 Ile Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Trp Leu Ser 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 60 Val Lys Arg Pro Val Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Trp Leu Ser 20 <210> 61 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 61 Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Trp Leu Ser 20 <210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 62 Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser Ser Gly Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Trp Leu Ser 20 <210> 63 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 63 Ile Leu Ile Thr His His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ala Leu 20 <210> 64 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 64 Val Leu Leu Thr His His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His 1 5 10 15 Leu Val Gly Ala Leu 20 <210> 65 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 65 Val Leu Leu Thr His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ala Leu 20 <210> 66 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 66 Val Leu Leu Thr His His Pro Asp Ala Leu His Met Met His Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ala Leu 20 <210> 67 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 67 Val Asp Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Leu His Met Met His Leu Phe 1 5 10 15 Asp Pro Ala Arg Tyr 20 <210> 68 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid motif <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 68 Val Asp Tyr Ala Ser Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His Gln Phe 1 5 10 15 Asp Pro Pro Arg Tyr 20 <210> 69 <211> 21 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <400> 69 Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met His Gln Ser 1 5 10 15 Ala Pro Ala Arg Tyr 20

Claims (22)

  1. 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해로 절단하는 폴리펩티드로서, 폴리펩티드가 서열 ID 번호 1 내지 15의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 작용성 유도체를 갖는 하이드롤라제이며, 작용성 변이체와 아미노산 서열 중 적어도 하나 간에 적어도 40%의 서열 동일성이 존재함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 하나의 보존된 아미노산 서열 세그먼트 또는 이의 작용성 변이체를 지니며, 아미노산 서열 세그먼트의 작용성 변이체는 적어도 70　%, 바람직하게는, 적어도 84　%, 더욱 바람직하게는, 적어도 92　% 및 가장 바람직하게는, 적어도 98　%의 서열 동일성을 가지며, 적어도 하나의 보존된 아미노산 서열 세그먼트는 서열 ID 번호 1을 갖는 서열의 아미노산 서열 +24 내지 +50, +52 내지 +77, +79 내지 +87, +89 내지 +145, +150 내지 +171, +177 내지 +193, +223 내지 +228, +230 내지 +237, +239 내지 +247, +249 내지 +255, +257 내지 +261, +263 내지 +270, +272 내지 +279, +297 내지 +301, +303 내지 +313, +24 내지 328, +1 내지 +328의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 작용성 변이체가 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및 삽입의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변경을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 0.01 U/mg, 바람직하게는, 적어도 0.1　U/mg, 특히, 적어도 1 U/mg의 특이 활성; 및/또는 최대 50　μM, 바람직하게는, 최대 3.5 μM, 특히, 최대 0.5 μM의 ZEN의 가수분해 절단의 KM 값; 및/또는 적어도 0.05 s-1, 바람직하게는, 적어도 0.6 s-1, 특히, 적어도 5 s-1의 ZEN의 가수분해 절단의 kcat 값; 및/또는 적어도 0.00001 μM- 1 s-1의 ZEN의 가수분해 절단의 vmax 값을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 ID 번호 2, 5 내지 7, 9, 11, 12 및 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 함유할 수 있으며, 작용성 변이체는 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 40%의 서열 동일성을 지니며, pH 5.0에서 폴리펩티드의 pH 안정성은 적어도 15　%, 바람직하게는, 50　% 및 특히, 바람직하게는, 90　%에 해당함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 ID 번호 1, 2, 5 내지 7, 9, 11, 12 및 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 함유하며, 작용성 변이체는 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 40% 서열 동일성을 가져서, 폴리펩티드가 30℃ 내지 75℃, 바람직하게는, 38℃ 내지 55℃, 특히, 바람직하게는, 38℃ 내지 52℃의 온도 범위에서 가장 높은 효소 활성을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 ID 번호 1, 5, 6, 9, 11, 12 및 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 가지며, 작용성 변이체는 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 40%의 서열 동일성을 가져서 폴리펩티드가 90℃, 바람직하게는, 75℃ 및 특히, 바람직하게는, 60℃의 온도 이하에서 열적으로 안정함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311, 314, 317, 319, 321, 323, 325 및 326의 군으로부터 선택된 위치 중 적어도 하나에서 서열 ID 번호 1과 관련하여 아미노산 서열의 적어도 하나의 돌연변이를 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 8항에 있어서, D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, ΔP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P의 군으로부터 선택된, 서열 ID 번호 1과 관련하여 아미노산 서열의 적어도 하나의 돌연변이를 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 ID 번호 32 내지 69의 군으로부터 선택된 아미노산 모티프 중 적어도 하나를 함유함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제 9항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 보존성 아미노산 치환을 가지며, 보존성 아미노산 치환은 G의 A로; 또는 A의 G, S로; 또는 V의 I, L, A, T, S로; 또는 I의 V, L, M으로; 또는 L의 I, M, V로; 또는 M의 L, I, V로; 또는 P의 A, S, N으로; 또는 F의 Y, W, H로; 또는 Y의 F, W, H로; 또는 W의 Y, F, H로; 또는 R의 K, E, D로; 또는 K의 R, E, D로; 또는 H의 Q, N, S로; 또는 D의 N, E, K, R, Q로; 또는 E의 Q, D, K, R, N으로; 또는 S의 T, A로; 또는 T의 S, V, A로; 또는 C의 S, T, A로; 또는 N의 D, Q, H, S로; 또는 Q의 E, N, H, K, R로의 치환으로부터 선택됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 뉴클레오티드 서열이 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드로부터 코딩되고/거나 뉴클레오티드 서열이 서열 ID 번호 16 내지 31을 갖는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 정도를 가지며/거나 뉴클레오티드 서열이 중간의 엄격한 조건하에서 서열 ID 번호 16 내지 31의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및/또는 적어도 200개 뉴클레오티드, 특히 적어도 100개 뉴클레오티드를 갖는 이의 서브서열 (subsequence) 및/또는 이러한 뉴클레오티드 서열 또는 이의 서브서열의 상보적 가닥과 혼성화됨을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해로 절단하는 첨가제로서, 첨가제가 서열 ID 번호 1 내지 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 가지며, 작용성 변이체와 아미노산 서열의 적어도 하나의 서열 동일성은 적어도 40%에 해당하며, 보조 물질이 또한 존재함을 특징으로 하는 첨가제.
  14. 제 13항에 있어서, 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드가 첨가제에 함유됨을 특징으로 하는 첨가제.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 보조 물질이 적어도 하나의 불활성 담체 뿐만 아니라 선택적인 추가 성분 예컨대, 비타민 및/또는 미네랄 및/또는 효소 및/또는 마이코톡신을 탈독소화시키기 위한 기타 성분으로부터 선택됨을 특징으로 하는 첨가제.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드가 최대 10,000 U/g, 바람직하게는, 최대 1000 U/g, 더욱 바람직하게는, 최대 100　U/g 및 가장 바람직하게는, 최대 10 U/g의 농도로 첨가제중에 존재함을 특징으로 하는 첨가제.
  17. 제 13항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서, 첨가제가 캡슐화되거나 코팅된 형태로 존재함을 특징으로 하는 첨가제.
  18. 특히 돼지, 가금류 또는 수산 양식물을 위한 먹이 제품 또는 식품에서 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 가수분해 절단을 위한 제 13항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 따른 첨가제의 용도.
  19. 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해 절단하기 위한 방법으로서, 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체가 서열 ID 번호 1 내지 15의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 작용성 변이체를 갖는 폴리펩티드에 의해 가수분해되며, 작용성 변이체와 아미노산 서열 중 적어도 하나 간의 서열 동일성이 적어도 40%임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 폴리펩티드가 제 14항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 따른 첨가제에 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 폴리펩티드 또는 첨가제가 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체로 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품과 혼합되고; 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품이 수분과 접촉되게 하고, 폴리펩티드 또는 첨가제가 오염된 식품 또는 동물 먹이 제품에 존재하는 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체를 가수분해함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 제아랄레논 및/또는 적어도 하나의 제아랄레논 유도체의 적어도 70　%, 바람직하게는, 적어도 80　%, 특히, 적어도 90　%가 가수분해됨을 특징으로 하는 방법.

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