ES2840306T3 - Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona por medio de un polipéptido que disocia hidrolíticamente, caracterizado porque se hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona con el polipéptido, que es una hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de secuencias ID nº 10 y 11, en particular la secuencia ID nº 11 o una variante funcional de la misma, en donde hay una identidad de secuencia de al menos el 70% entre la variante funcional y al menos una de las secuencias de aminoácidos.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o derivados de zearalenona mediante un polinucleótido, así como el uso
La presente invención se refiere a un procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o de al menos un derivado de zearalenona con un polipéptido, así como un aditivo que contiene un polipéptido de ese tipo y también a un uso de un polipéptido de ese tipo.
Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos. Un representante importante de las mismas es la zearalenona (ZEN), difundida por todo el mundo, anteriormente conocida como toxina F-2, que es producida por una pluralidad de hongos del género Fusarium. Estos hongos infectan, entre otros, plantas de cultivo tales como distintos tipos de cereales, manifestándose la micosis del hongo por norma general antes de la cosecha, en donde el crecimiento del hongo o bien la producción de micotoxinas puede tener lugar antes y/o, en el caso de un almacenamiento no apropiado, también después de la cosecha. La FAO estima que el 25% de los productos agrícolas en todo el mundo están contaminados con micotoxinas, lo que provoca pérdidas económicas considerables. En un estudio global realizado recientemente, se analizaron un total de 23.781 muestras entre enero de 2009 y diciembre de 2011, con un 81% de pruebas positivas para al menos una micotoxina y un 45% positivas para ZEN. ZEN se puede encontrar en todas las regiones del mundo, así como en todas las clases de cereales y alimentos para animales analizados, como maíz, harina de soja, trigo, salvado de trigo, DDGS (granos secos de destilería con solubles) y en mezclas de alimentos para animales ya preparados con una frecuencia de hasta el 100%.
ZEN es una lactona macrocíclica, estrogénica, no esteroidea, sintetizada a través de la vía metabólica de los policétidos, con la fórmula estructural:
y el nombre de la nomenclatura IUPAC (2E,11S)-15,17-dihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-I (18),2,14,16-tetraeno-7,13-diona.
Sin embargo, también se encuentran en la naturaleza una gran cantidad de derivados de ZEN, que están formados por modificaciones enzimáticas o químicas de ZEN. Ejemplos de los mismos son conjugados de ZEN glucosídicos o que contienen sulfato, que se forman en hongos, plantas o el metabolismo de mamíferos, así como metabolitos de ZEN, que se forman en el organismo humano o animal, entre otros. A continuación, por derivados de ZEN se entienden conjugados de ZEN o metabolitos de ZEN que se presentan en la naturaleza o están preparados mediante síntesis química o bioquímica, pero en especial a-zearalenol (a-ZEL; (2E,7R,11 S)-7,15,17-trihidroxi-11 -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18),2,14,16-tetraen-13-ona), p-zearalenol (p-ZEL; (2E,7S,11S)-7,15,17-trihidroxi-11-metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),2,14,16-tetraen-13-ona), a-zearalanol (a-ZAL; (7R,11 S)-7,15,17-trihidroxi-I I -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18), 14,16-trien-13-ona), p-zearalanol (p-ZAL; (7S,11 S)-7,15,17-trihidroxi-11 -metil-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (14),15,17-trien-13-ona), zearalenon-14-sulfato (Z14S; [(2e,11 S)-15-hidroxi-11 -metil-7,13-dioxo-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),2,14,16-tetraen-17-il]hidrogenosulfato), zearalenon-14-glucósido (Z14G; (2E,11S)-15-hidroxi-11-metil-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxi-12-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-1(18)2,14,16-tetraeno-7,13-diona), así como zearalanona (ZAN; (11 s)-15,17-dihidroxi-11 -metil-12-oxa-biciclo[12.4.0]octadeca-1 (18),14,16-trieno-7,13-diona).
ZEN, así como los derivados de ZEN, especialmente a-ZEL, p-ZEL, Z14S, a-ZAL, p-ZAL, Z14G y ZAN, pueden detectarse también, en virtud de su elevada estabilidad química y física, en alimentos o alimentos para animales procesados, tales como, p. ej., pan o cerveza.
ZEN se une al receptor de estrógenos y puede causar alteraciones hormonales, por lo que es absorbida inmediatamente después de la ingestión y se transforma en los mamíferos en los dos metabolitos estereoisoméricos a-ZEL y p-ZEL. En este caso, p. ej., a-ZEL, pero también a-ZAL o ZAN, tienen un efecto estrogénico mucho más fuerte que ZEN. Los derivados de ZEN conjugados a veces tienen una estrogenicidad menor que ZEN, pero a partir de estos derivados de ZEN se puede liberar de nuevo ZEN en el tracto digestivo.
Aunque ZEN tiene una toxicidad aguda relativamente baja y un valor de DL50 oral de hasta 20.000 mg/kg de peso corporal, en caso de una ingesta prolongada pueden aparecer efectos tóxicos subagudos y/o subcrónicos, como por ejemplo, efectos teratogénicos, carcinógenos, estrogénicos e inmunosupresores en animales o seres humanos. Los alimentos para animales contaminados con ZEN provocan trastornos del desarrollo en mamíferos, siendo los cerdos y, especialmente los animales jóvenes, extremadamente sensibles a ZEN. Concentraciones de ZEN en alimento para animales superiores a 0,5 ppm conducen a trastornos del desarrollo, p. ej., concentraciones superiores a 1,5 ppm pueden provocar hiperestrogenicidad en los cerdos y concentraciones de 12 ppm de ZEN se han hecho responsables
de abortos en el ganado vacuno. Dado que la zearalenona se absorbe rápidamente a través de las membranas mucosas, en particular a través de la mucosa gástrica pero también la oral, es necesaria una desactivación inmediata y, sobre todo, cuantitativa. Tan solo 30 minutos después de la administración oral de ZEN, ésta ya se puede detectar en la sangre. En este caso, el uso de enzimas aisladas tiene ventajas sobre los microorganismos, como una mayor actividad específica o un efecto más rápido. Debido a los efectos nocivos de ZEN, en la Unión Europea existen límites superiores de ZEN, que son vinculantes para los alimentos, así como recomendaciones para límites superiores de ZEN en los alimentos para animales (EC NO: 1881/2006).
La estrategia principal para reducir la contaminación de los alimentos o piensos con ZEN, es restringir el crecimiento de los hongos, por ejemplo, cumpliendo las "buenas prácticas agrícolas". Esto incluye, entre otras cosas, que las semillas estén exentas de agentes patógenos e infecciones con hongos, o que los productos de desecho agrícolas se eliminen a tiempo de los campos. Además, a través del uso de fungicidas se puede reducir el crecimiento de los hongos en el campo. Después de la cosecha, el material cosechado se debe almacenar con una humedad residual inferior al 15% y una temperatura baja para evitar el crecimiento de los hongos. Cualquier material contaminado por hongos también se debe eliminar antes de continuar con el tratamiento posterior. A pesar de esta lista de medidas, I. Rodriges y K. Naehrer (2012) informaron que incluso en regiones con los más altos estándares agrícolas, como Estados Unidos y Europa Central, en los años 2009 a 2011 el 29% o el 39%, respectivamente, de las muestras de maíz analizadas estaban contaminadas con ZEN.
Otras opciones para eliminar ZEN de los piensos o los alimentos son la adsorción o la transformación de la micotoxina. Para ello, es necesario que la unión de la micotoxina al adsorbente sea fuerte y específica en un intervalo amplio de pH y se conserve estable en la zona gastrointestinal durante todo el proceso digestivo. Aunque algunos agentes de adsorción no biológicos, p. ej., el carbón activado, los silicatos o los polímeros sintéticos, como la colestiramina, se pueden utilizar eficazmente para las aflatoxinas; su uso para otras micotoxinas está limitado. La principal desventaja de los agentes de adsorción es la unión inespecífica de otras moléculas, algunas de las cuales son esenciales para la alimentación. Los agentes de adsorción biológicos, p. ej., extractos de levadura o levadura también se describen en las publicaciones, pero tienen una limitación similar a la de los agentes de adsorción no biológicos.
La eliminación de la toxicidad de ZEN mediante tratamientos físicos y químicos también está limitada. Mediante un tratamiento térmico, ZEN no puede ser desactivada de manera efectiva, no obstante, el contenido en ZEN se puede reducir en un 83,9% mediante extrusión y tratamiento con agentes oxidantes, p. ej., durante 16 h a 80°C con una solución de peróxido de hidrógeno al 10%. El empleo de procedimientos de extrusión y agentes oxidantes, tales como ozono o peróxido de hidrógeno, en la preparación de piensos y alimentos está limitado en virtud de los elevados costes, la pérdida de calidad, la eficiencia parcialmente baja y la escasa especificidad.
También la biotransformación de ZEN mediante microorganismos tales como, p. ej., cepas de Trichosporon mycotoxinivorans, Gliocladium roseumo Bacillus subtilis o enzimas aisladas a partir de las mismas, tales como hidrolasas o peroxidasas, se ha descrito, p. ej., en E. Vekiru et al., en Appl. and Environ, Microb. 2010, 76, 7, 2353-2359.
A partir del documento EP 0938575 B1 se han dado a conocer propiedades para la degradación de ZEN que poseen bacterias del género Rhodococcus y Nocardia, especialmente R. globerulus, R. erythropolis y N. globerula.
A partir del documento WO 02/076205 se puede deducir el efecto de degradación de ZEN a partir de enzimas aisladas a partir de Gliocladium roseum, entre otras la hidrolasa a/p, la zearalenona hidrolasa 1 (ZHD1), que catalizan la degradación de ZEN mediante una tríada catalítica.
A partir del documento WO 2012/113827 se extraen zonasas recombinantes, es decir, enzimas degradantes de ZEN, que permanecen estables en el tracto gastrointestinal, en particular se describen microorganismos tales como Thermobifidia fusca, Streptomyces exfoliatus, Acidovorans delafieldii y Streptomyces sp.
A partir de la base de datos UniProt del 16 de noviembre de 2011, "SubName: Full=Alpha/beta hydrolase fold containing protein {ECO:0000313|EMBL:AEM80235.1}", que se encuentra con el número de orden de EBI. UNIPROT :G2P9U4, se puede deducir una secuencia proteica de una hidrolasa a/p, pero sobre la que no se da ninguna información sobre sus posibles usos o propiedades.
Los polipéptidos o enzimas que son capaces de hidrolizar ZEN y/o al menos un derivado de ZEN, también se pueden denominar zonasas.
Los términos y expresiones utilizados a continuación se han tomado de la terminología técnica y se utilizan con los significados convencionales, a menos que se indique lo contrario. Por tanto, el término "polinucleótido" se refiere a cualquier tipo de material genético de cualquier longitud y secuencia, como p. ej., moléculas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario, incluyendo elementos reguladores, elementos estructurales, grupos de genes, plásmidos, genomas completos y fragmentos de los mismos. El término "polipéptido" incluye proteínas, como por ejemplo, enzimas, anticuerpos así como polipéptidos con hasta 500 aminoácidos, como por ejemplo, inhibidores de péptidos, dominios de proteínas, pero también polipéptidos cortos con longitudes de secuencia cortas, por ejemplo, menos de 10 aminoácidos, tales como receptores, ligandos, hormonas peptídicas, marcadores y similares El término "posición" en un polinucleótido o un polipéptido se refiere a una base o un aminoácido único y específico en la secuencia del polinucleótido o del polipéptido.
La presente invención tiene como objeto proporcionar un procedimiento con el que sea posible una disociación hidrolítica rápida y fiable de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN.
Para resolver esta tarea, la presente invención se caracteriza esencialmente porque la zearalenona y/o al menos un derivado de la zearalenona se hidroliza a través del polipéptido que es una hidrolasa con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de secuencias ID n° 10 y 11, en particular la secuencia ID n° 11 o una variante funcional de la misma, en donde una identidad de secuencia entre la variante funcional y al menos una de las secuencias de aminoácidos, es de al menos el 70%.
La expresión "identidad de secuencia" de acuerdo con la presente invención, se refiere a un porcentaje de identidad de secuencia. Para las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos, la identidad de secuencia se puede determinar visualmente, pero preferiblemente se calcula con un programa informático. La comparación de secuencias también se lleva a cabo dentro de segmentos de una secuencia, entendiéndose que un segmento es una secuencia continua de la secuencia de referencia y que preferiblemente comprende una región conservada de la secuencia.
En el presente caso, la identidad de secuencia se determinó con la ayuda del programa NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), en particular con BLASTP para polipéptidos y BLASTN para polinucleótidos, que está disponible en la página principal del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este permite comparar dos o más secuencias entre sí según el algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Para los fines de esta invención, se utilizaron los programas con la versión del 15 de mayo de 2013. Como ajustes del programa se utilizó la configuración básica, pero en particular para la comparación de secuencias de aminoácidos: "secuencia diana máxima" = 100; "umbral esperado" = 10; "tamaño de palabra" = 3; "matriz" = BLOSOM62; "costes por hueco" = "Existencia: 11; Extensión: 1"; "ajuste informático" = "Ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional"; así como para la comparación de secuencias de nucleótidos, tamaño de palabra: 11; valor esperado: 10; costes por hueco: Existencia = 5, Extensión = 2; Filtro = baja complejidad activada; puntuaciones de coincidencia/no coincidencia: 2, -3; cadena de filtro: L; m.
Las expresiones "variante funcional del polipéptido" o "variante funcional" se refieren, por un lado, a "variantes alélicas" del polipéptido y a "fragmentos funcionales" del polipéptido, y por otro lado a una "modificación" del polipéptido, en donde la función enzimática permanece esencialmente sin alterar. La expresión "variante alélica" se refiere a un polipéptido que ha surgido por una o varias mutaciones de la secuencia de nucleótidos que ocurren de forma aleatoria en la naturaleza y que provocan un cambio en la secuencia de aminoácidos, sin que ello influya en la función enzimática. Las "modificaciones" pueden ser, por ejemplo, fusiones del extremo C-terminal o N-terminal con polipéptidos o polipéptidos mutados, en donde se pueden obtener mutaciones mediante sustitución, inserción o deleción de al menos un aminoácido, en particular mediante mutagénesis específica del sitio o mutagénesis aleatoria, recombinación y/o cualquier otro método de modificación genética de proteínas. Los términos sustitución, inserción y deleción se utilizan en el sentido habitual en la tecnología genética y con los que está familiarizado el experto en la materia. La expresión "fragmento funcional" se refiere a una parte o una secuencia parcial de un polipéptido o una parte o una secuencia parcial de una variante funcional del mismo, en donde se conserva esencialmente la función enzimática. Una función enzimática se conserva esencialmente cuando el mecanismo de reacción enzimática permanece sin cambios, es decir, la micotoxina se hidroliza en el mismo lugar y la actividad residual específica "variante funcional" asciende al menos al 5%, preferiblemente al menos al 10%, en particular al menos al 50%, con respecto al polipéptido original.
Mediante la elección de una secuencia de aminoácidos de ese tipo, o una variante funcional de la misma, se constató una hidrólisis sorprendentemente rápida y completa de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN.
Como corresponde a un desarrollo adicional preferido de la invención, la disociación hidrolítica se lleva a cabo con un polipéptido que contiene al menos un segmento de la secuencia de aminoácidos conservada o una variante funcional de la misma, en donde la variante funcional del segmento de secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos un 70%, preferiblemente al menos un 84%, más preferiblemente al menos un 92% y lo más preferiblemente al menos un 98% y al menos un segmento de secuencia de aminoácidos conservada se selecciona a partir del grupo de secuencias de aminoácidos 79 a 87, 89 a 145, 177 a 193, 223 a 228, 249 a 255, 257 a 261, 272 a 279 de la secuencia con la secuencia ID n° 1. A través de la presencia de al menos uno de tales segmentos de secuencia de aminoácidos conservada, es posible proporcionar un polipéptido que, además de la hidrólisis rápida y completa de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN, también tiene un valor de actividad particularmente elevado, en comparación con los polipéptidos degradadores de ZEN conocidos hasta la fecha.
Se podrían lograr resultados igualmente buenos si la variante funcional mostrase al menos una modificación de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en una sustitución, deleción e inserción de uno o varios aminoácidos.
Dado que el polipéptido muestra una actividad específica de al menos 0,01 U/mg, preferiblemente al menos 0,1 U/mg, en particular al menos 1 U/mg; y/o un valor Km de disociación hidrolítica de ZEN de como máximo 50 pM, preferiblemente como máximo 3,5 pM, en particular como máximo 0,5 pM; y/o posee un valor kcat de disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,05 s-1, preferiblemente al menos 0,6 s-1, en particular al menos 5 s-1 y/o posee un valor vmáx de disociación hidrolítica de ZEN de al menos 0,00001 pM-1 s-1, preferiblemente al menos 0,0001 pM-1 s-1,
en particular al menos 0,001 pM-1 s-1, ZEN y/o los derivados de ZEN se pueden hidrolizar, en particular eliminar la toxicidad, de una manera particularmente rápida y completa.
El polipéptido se puede seleccionar de modo que sea una hidrolasa a/p adecuada para una disociación hidrolítica sin necesidad de oxígeno y exenta de cofactores, de la agrupación éster de zearalenona y/o de los derivados de ZEN, que presenta una tríada de aminoácidos que cataliza la disociación hidrolítica que consiste en serina, un aminoácido ácido seleccionado a partir de ácido glutámico y ácido aspártico, en particular ácido aspártico, así como histidina, y que es la tríada catalítica, por ejemplo, S128, D264 y H303, en donde el posicionamiento es con relación a la secuencia ID n° 1.
La hidrólisis de ZEN y de los derivados de ZEN se realiza con éxito con cada uno de los polipéptidos de secuencias ID n° 1 a 15, en el grupo éster de la zearalenona o de sus derivados, de acuerdo con el siguiente mecanismo de reacción:
La hidrólisis de ZEN para proporcionar zearalenona hidrolizada no tóxica (HZEN) o a derivados de ZEN hidrolizados, se lleva a cabo a través de los polipéptidos de acuerdo con la invención, en particular las hidrolasas a/p. La descarboxilación adicional de HZEN a ZEN descarboxilada, hidrolizada (DHZEN) o a derivados de ZEN hidrolizados, descarboxilados generalmente tiene lugar de forma espontánea.
En particular, es posible hidrolizar completamente ZEN y los derivados de ZEN por medio de la tríada catalítica mencionada anteriormente, en donde la reacción de degradación tiene una buena estabilidad frente al pH, en particular a valores de pH en el intervalo ácido.
Además, se ha encontrado que con un polipéptido que contiene en uno de los 3 aminoácidos antes de la serina y 3 aminoácidos después de la serina del segmento de secuencia que consiste en la tríada catalítica mencionada anteriormente, al menos un aminoácido polar seleccionado a partir de Y, Q, N, T, K , R, E, D y al menos un aminoácido no polar seleccionado a partir de F, M, L, I, V, A, G, P, se consiguen buenos resultados constantes y como mínimo también mejorar un parámetro de la cinética enzimática.
En un desarrollo adicional preferido de la invención, el procedimiento se lleva a cabo con un polipéptido que tiene al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia ID n° 1, en al menos una de las siguientes posiciones 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311,314, 317, 319, 321,323, 325 y 326.
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invención, el procedimiento se lleva a cabo con un polipéptido que tiene al menos una mutación seleccionada a partir del grupo: D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27h , S29P, r31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, I118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P en la secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia ID n° 1. Con un polipéptido de ese tipo, ZEN se puede hidrolizar completamente, en particular perder la toxicidad, en poco tiempo, en donde la actividad específica del polipéptido es de al menos 6,00 U/mg, preferiblemente de al menos 7,00 U/mg, en particular de al menos 8,00 U/mg. La unidad "U" o también "unidad" es una medida de la actividad catalítica absoluta y se define por la hidrólisis de 1 pMol de ZEN por minuto a 32°C en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,2), en donde: por "actividad catalítica" se entiende la conversión enzimática de un sustrato en condiciones de reacción definidas y por "actividad específica" se entiende la relación entre la actividad catalítica y la concentración en masa de polipéptido (masa por unidad de volumen).
Finalmente, el polipéptido puede contener al menos una sustitución de aminoácidos conservadora en al menos una posición, en donde la sustitución de aminoácidos conservadora se selecciona a partir de sustituciones de G a A; o de A a G, S; o de V a I, L, A, T, S; o de I a V, L, M; o de L a I, M, V; o de M a L, I, V; o de P a A, S, N; o de F a Y, W, H; o de Y a F, W, H; o de W a Y, F, H; o de R a K, E, D; o de K a R, E, D; o de H a Q, N, S; o de D a N, E, K, R, Q; o de E a Q, D, K, R, N; o de S a T, A; o de T a S, V, A; o de C a S, T, A; o de N a D, Q, H, S; o de Q a E, N, H, K, R. En donde la denominación sustitución conservadora de aminoácidos se refiere a la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que un experto en la técnica considera conservadora, es decir, que tiene propiedades específicas
similares. Tales propiedades específicas son, por ejemplo, el tamaño, la polaridad, la hidrofobicidad, la carga o el valor pKa del aminoácido. Por mutación conservadora se entiende, por ejemplo, una sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido polar por otro aminoácido polar.
Con tales sustituciones conservadoras de aminoácidos, es posible preparar variantes polipeptídicas funcionales, cuya actividad específica es aproximadamente igual de fuerte que la del polipéptido original, pero preferiblemente aumenta en al menos 0,1 U/mg.
Al llevar a cabo el procedimiento de tal manera que el polipéptido se emplea en un aditivo que contiene un adyuvante para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona, para alimentos para animales para cerdos, aves de corral y acuicultura, en alimentos o granos secos de destilería con solubles, tiene lugar la conversión bioquímica de ZEN y/o de al menos un derivado de ZEN a ZEN hidrolizada y/o a un derivado de ZEN hidrolizado. El procedimiento también se puede usar, por ejemplo, para la hidrólisis estereoselectiva de ZEN y/o de derivados de ZEN en procesos industriales.
En un desarrollo adicional preferido de la invención, el procedimiento se desarrolla de tal manera que los aditivos se seleccionan al menos a partir de un vehículo inerte así como, dado el caso, de otros componentes como vitaminas y/o minerales y/o enzimas y/u otros componentes para eliminar la toxicidad de las micotoxinas. De esta forma se puede garantizar, por ejemplo, en piensos o alimentos, que las cantidades posiblemente contenidas de ZEN y/o derivados de ZEN se hidrolizan con seguridad, en particular dejan de ser tóxicas, hasta tal punto que no existe ningún efecto nocivo sobre el organismo del sujeto que ingiere ese pienso o alimento.
Para ello, también puede estar presente un polipéptido en una preparación enzimática que, además de contener al menos un polipéptido, también contiene al menos una enzima que está implicada, por ejemplo, en la degradación de proteínas, como por ejemplo, proteasas, o que está implicada en el metabolismo del almidón o de fibra o grasa o glucógeno, como por ejemplo, una amilasa, celulasa o glucanasa, así como, por ejemplo, hidrolasas, enzimas lipolíticas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, fitasas, xilanasas y/o combinaciones de las mismas.
Otras áreas de aplicación son preparaciones enzimáticas que, además de al menos un polipéptido, también contienen al menos un componente para eliminar la toxicidad de las micotoxinas, tal como una enzima que degrada micotoxinas, como por ejemplo, alfatoxina oxidasa, ergotamina hidrolasas, ergotamina amidasas, zearalenona esterasas, zearalenona lactonasas, ocratoxina amidasas, fumonisina carboxilesterasas, fumonisina aminotransferasas, aminopoliol aminoxidasas, desoxinivalenol epóxido hidrolasas; y/o al menos un microorganismo que degrada micotoxinas, como Bacillus subtilis; y/o que contienen al menos un componente que se une a micotoxinas, por ejemplo, paredes celulares de microbios o materiales inorgánicos como bentonitas.
De acuerdo con un desarrollo adicional particularmente preferido de la invención, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que se emplea al menos un polipéptido en el aditivo en una concentración de como máximo 10.000 U/g, preferiblemente como máximo 1.000 U/g, más preferiblemente como máximo 100 U/g y lo más preferiblemente como máximo 10 U/g, con lo que es posible convertir rápidamente ZEN y/o derivados de z En en metabolitos no tóxicos o menos tóxicos, en particular HZEN y DHZEN, antes de su resorción en el organismo de un sujeto consumidor de pienso o alimentos contaminados, en particular un mamífero.
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invención, el aditivo está en forma encapsulada o recubierta, pudiéndose recurrir para la encapsulación o el recubrimiento a métodos convencionales, como se describen por ejemplo, en el documento WO 92/12645. Mediante la encapsulación o el recubrimiento se puede transportar el polipéptido a su lugar de uso sin cambios, en particular sin una degradación ni deterioro, de modo que el polipéptido solo comienza a actuar después de que la cubierta protectora se ha disuelto, por ejemplo, en el tracto digestivo de los animales, con lo cual se puede conseguir una degradación todavía más dirigida, rápida y completa de ZEN y/o de los derivados de ZEN, también en un medio ácido, rico en proteasas y anaerobio. Además, mediante la encapsulación o el recubrimiento se consigue aumentar la estabilidad térmica de los polipéptidos en el aditivo.
De acuerdo con un desarrollo adicional preferido, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que el polipéptido o el aditivo se mezcla con un alimento o pienso contaminado con zearalenona y/o con al menos un derivado de zearalenona, de manera que el alimento o el pienso contaminado entra en contacto con humedad, y el polipéptido o el aditivo hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona contenidos en el pienso o el alimento contaminado. En el caso de piensos o alimentos húmedos, tales como caldos fermentados o papillas, la hidrólisis de la zearalenona y/o del al menos un derivado de zearalenona tiene lugar antes de la ingestión oral del pienso o el alimento húmedo. Con este procedimiento se asegura que se eliminan en gran medida los efectos nocivos de la zearalenona y de los derivados de la zearalenona sobre los seres humanos y los animales. En este contexto, se entiende que humedad significa la presencia de agua o de líquidos con contenido en agua, estando incluidos entre ellos también, p. ej., la saliva u otros líquidos presentes en el tracto digestivo. Como tracto digestivo se define la cavidad bucal, la faringe (garganta), el esófago y el tracto gastrointestinal o equivalentes de los mismos, pudiéndose presentar diferentes denominaciones en el caso de animales o bien pudiendo no estar presentes componentes individuales en el tracto digestivo de animales.
El procedimiento inventivo también se puede llevar a cabo de tal manera que el pienso o el alimento se granula antes de la ingestión oral.
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invención, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que se hidroliza al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, en particular al menos el 90% de la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona. De este modo se pueden evitar efectos tóxicos subagudos y/o subcrónicos, tales como efectos teratogénicos, carcinógenos, estrogénicos e inmunosupresores en animales o seres humanos.
La presente invención tiene como objeto además el uso de un aditivo que contiene al menos un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de secuencias ID n° 10 y 11 o una variante funcional de las mismas, en donde una identidad de secuencia entre la variante funcional y al menos una de las secuencias de aminoácidos es de al menos el 70%, para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona en piensos, en particular para cerdos, aves y acuicultura, en alimentos o en granos secos de destilería con solubles. Mediante el uso del aditivo de acuerdo con la invención, se consigue hidrolizar o eliminar la toxicidad de ZEN y/o de los derivados de ZEN contenidos en el alimento o pienso o en granos secos de destilería con solubles, en donde se produce una pérdida de toxicidad de este tipo ya con concentraciones de polipéptido de aproximadamente 1 U/g de pienso o alimento contaminado.
La invención se explica a continuación con mayor detalle con ayuda de ejemplos de realización, así como dibujos. En estos, se muestra:
Fig. 1, que no forma parte de la invención, la degradación a lo largo del tiempo de ZEN y el aumento de los metabolitos HZEN y DHZEN a través del polipéptido con la secuencia ID n° 1, en donde en la Fig. 1A el polipéptido no está marcado, en la Fig. 1B el polipéptido tiene un marcador 6xHis C-terminal y en la Fig. 1C un marcador 6xHis N-terminal,
Fig. 2, que no forma parte de la invención, la cinética de Michaelis-Menten del polipéptido con la secuencia ID n° 1,
Fig. 3, la degradación de ZEN a lo largo del tiempo y el aumento de los metabolitos HZEN y DHZEN debido a los polipéptidos purificados con las secuencias ID n° 1 (Fig. 3A) y 11 (Fig. 3G), en donde todas las secuencias tienen un marcador 6xHis C-terminal.
Ejemplo 1: Modificación, clonación y expresión de polinucleótidos que codifican polipéptidos que pueden disociar hidrolíticamente ZEN y/o al menos un derivado de ZEN.
Las sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos se llevaron a cabo mediante una mutación de las secuencias de nucleótidos con una PCR, utilizando el "kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick-change" (Stratagene) siguiendo las instrucciones. Alternativamente, se obtuvieron también secuencias de nucleótidos completas (GeneArt). Las secuencias de nucleótidos generadas mediante mutagénesis con PCR u obtenidas en GeneArt contenían además opcionalmente un marcador 6xHis C-terminal o N-terminal a nivel de aminoácidos y se integraron mediante métodos convencionales en vectores de expresión para una expresión en E. coli o P. pastoris, se transformaron en E. coli o P. pastoris y se expresaron en E. coli o P. pastoris (J.M. Cregg, Pichia Protocols, segunda edición, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al.. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4a edición, Cold Spring Harbor), en donde para este estudio también se podía recurrir a cualquier otra célula hospedadora adecuada.
La expresión "vector de expresión" se refiere a una estructura artificial de ADN que es capaz de expresar un gen in vivo o in vitro. En particular, bajo esa denominación se entienden estructuras artificiales de ADN que son adecuadas para transferir la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido a la célula hospedadora, con el fin de integrarla allí en el genoma o dejarla libre en el espacio extracromosómico y expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de forma intracelular y, si es necesario, expulsar el polipéptido desde la célula.
La expresión "célula hospedadora" se refiere a todas las células que contienen o bien una secuencia de nucleótidos que se va a expresar o bien un vector de expresión y son capaces de producir un polipéptido de acuerdo con la invención. En particular, se entienden células procariotas y/o eucariotas, preferentemente P. pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, células vegetales y/o esporas de Bacillus, Trichoderma o Aspergillus.
El lisado celular soluble en el caso de E. coli o el material sobrenadante del cultivo en el caso de P. pastoris, se utilizaron para determinar las propiedades catalíticas de los polipéptidos. Para determinar el valor Km, vmáx, kcat y la actividad específica, los polipéptidos se enriquecieron selectivamente usando métodos convencionales de forma cromatográfica sobre columnas de níquel-sefarosa. La concentración de proteína se determinó usando métodos convencionales, ya fuera con el método BCA (Pierce BCA Protein Assay KitProd n° 23225), pero preferiblemente fotométricamente con los coeficientes de extinción específicos para las respectivas proteínas, que se calcularon con el programa "ProtParam" disponible en línea en http://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (compilador): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607).
Ejemplo 2: Determinación de la identidad de secuencia así como los segmentos de secuencias de aminoácidos conservados
La determinación del porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de toda longitud de los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos con las secuencias ID n° 1 a 15 relativamente entre sí (Tabla 1), se llevó a cabo con ayuda del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), en particular con BLASTP que está disponible en la página principal del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Con ello es posible comparar dos o más secuencias entre sí según el algoritmo de Altschul et al., 1997 (Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402). Como ajustes del programa se recurrió a la configuración básica, pero en particular a “secuencia diana máx” = 100; “umbral esperado” = 10; “tamaño de la palabra” = 3; “matriz” = BLOSOM62; “costes por hueco” = “Existencia: 11; Extensión: 1” ; “ajuste computacional” = “ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional”.
Para determinar los segmentos de secuencias de aminoácidos conservados, se determinaron los polipéptidos con las secuencias ID n° 1 a 6, que tenían una identidad de secuencia de al menos un 70% entre sí, utilizando el programa informático COBALT (J.S. Papadopoulos y R. Agarwala, 2007, COBALT: constraint-based alignment tool for multiple protein sequences, Bioinformatics 23:1073-79), utilizando los parámetros convencionales, en particular los parámetros (“Penalizaciones por hueco”: -11, -1; “Penalizaciones por hueco terminal”: -5, -1; “Uso de RPS BLAST”: activado; “valor Blast E” : 0,003; “Encontrar columnas conservadas y volver a calcular”: activado, “utilizar búsqueda de agrupaciones”: activado; “tamaño de la palabra” : 4; “distancia de posible agrupación”: 0,8; “Alfabeto”: regular; “Ajuste de la conversación de homologías” : 3 bits). El resultado de este análisis representa los aminoácidos conservados. Como segmentos de secuencias de aminoácidos conservados se definieron las siguientes regiones con al menos 5 aminoácidos conservados consecutivos, a saber, en relación con la secuencia ID n° 1, los segmentos A desde la posición 24 a la posición 50, B desde la posición 52 a la posición 77, C desde la posición 79 a la posición 87, D desde la posición 89 a la posición 145, E desde la posición 150 a la posición 171, F desde la posición 177 a la posición 193, G desde la posición 223 a la posición 228, H desde la posición 230 a la posición 237, I desde la posición 239 a la posición 247, J desde la posición 249 a la posición 255, K desde la posición 257 a la posición 261, L desde la posición 263 a la posición 270, M desde la posición 272 a la posición 279, N desde la posición 297 a la posición 301 y O desde la posición 303 a la posición 313.
Las determinaciones del porcentaje de identidad de secuencia de los polipéptidos entre sí y de los segmentos de secuencias de aminoácidos conservados de los polipéptidos individuales con respecto a los segmentos de secuencia de aminoácidos conservados de la secuencia ID n° 1, se llevaron a cabo a modo de ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2.
Tabla 1: Porcentaje de identidad de secuencia de los polipéptidos entre sí
Tabla 2: Porcentaje de identidad de secuencia de los segmentos de secuencia de aminoácidos conservados A a O.
Ejemplo 3: Hidrólisis de ZEN mediante polipéptidos en lisados celulares
Para determinar su capacidad para degradar ZEN en los metabolitos no tóxicos o menos tóxicos HZEN y DHZEN, se preparó el polipéptido con la secuencia ID n° 1, codificada por la secuencia de nucleótidos con el n° de secuencia ID 17, como tal y con un marcador 6xHis en el extremo C-terminal o N-terminal en E. coli, como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos con las secuencias ID n° 10 y 11, que se codificaban con las secuencias de nucleótidos con las secuencias ID n° 26 y 27, se marcaron con 6xHis solo en los extremos C-terminales. Se recogieron 100 ml de cada cultivo de E. coli con una densidad óptica (DO600 nm) de 2,0-2,5 mediante centrifugación a 4°C y se resuspendieron en 20 ml de medio mineral Brunner (medio para microorganismos de DSMZ número 462, 2012). Las suspensiones celulares se lisaron mediante un tratamiento con una prensa francesa, 3 veces a 20.000 psi. Los lisados celulares obtenidos de ese modo se utilizaron en una dilución 1:10, 1:100 o 1:1.000, que se había preparado en medio mineral Brunner que incluía 0,1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino). Para los experimentos de degradación de ZEN se utilizaron 9,9 ml de medio mineral Brunner que incluía 0,1 mg/ml de BSA, 0,1 ml de lisado celular diluido y 31 pl de solución madre de sustrato ZEN. En total, los lisados celulares se diluyeron de este modo 1:1.000, 1:10.000 o 1:100.000. Una solución de ZEN 2,08 mM (40% en volumen de ACN 60% en volumen de H2O) servía como solución madre de sustrato ZEN. Para preparar esta solución, se pesó y se disolvió
adecuadamente ZEN en forma cristalina (Biopure Standard de Romer Labs, Art. n° 001109, al menos 98% de pureza). Cada lote de degradación se llevó a cabo en viales de vidrio de 25 ml y se incubó a 25°C con agitación a 100 rpm durante un total de 120 h. En los puntos temporales 0; 0,5; 1; 2; 5; 24; 47; 72 y 120 h se tomó en cada caso una muestra de 1 ml, los polipéptidos se inactivaron con calor durante 10 min a 99°C y se almacenaron a -20°C. Después de la descongelación, se separaron de las muestras los componentes insolubles mediante centrifugación. Se analizaron ZEN, HZEN y DHZEN mediante LC/MS/MS. Para ello, los metabolitos se separaron cromatográficamente utilizando una columna Phenomenex Luna C18(2) con unas dimensiones de 250 mm x 3 mm y un tamaño de partícula de 5 pm. Una mezcla de acetonitrilo-agua con una concentración de ácido fórmico de 1 ml/l servía como fase móvil. Se registró la señal UV a 270 nm. La ionización mediante electropulverización (ESI) sirvió como fuente de ionización. Se cuantificaron ZEN, HZEN y DHZEN usando QTrap/LC/MS/MS (triple cuadrupolo, Applied Biosystems) en "modo mejorado". Después de 24 horas como máximo, ya no se podían detectar cantidades significativas de ZEN en ninguno de los lotes. La mayoría, más del 80%, de ZEN se había convertido en HZEN o DHZEN.
En la Fig. 1, que no forma parte de la invención, se observa a modo de ejemplo la degradación temporal de ZEN y el aumento de HZEN y DHZEN para una solución de lisado celular diluido 1:10.000, tanto para un polipéptido con SEQ ID n° 1 sin marcar (Fig. 1A), como uno marcado con 6xHis en el extremo C-terminal (Fig. 1B) y uno marcado con 6xHis en el extremo N-terminal (Fig. 1C). De esto se desprende claramente, 1° que la conversión de ZEN tiene lugar de forma inmediata y completa, ya que casi no se pudo detectar ZEN en la primera muestra (0 h), que se tomó inmediatamente después del inicio de la prueba, y 2° a través de la adición de un marcador, C-terminal o N-terminal, no había pérdidas significativas de la actividad.
Ejemplo 4: Hidrólisis de derivados de ZEN mediante polipéptidos en lisados celulares
Para determinar la capacidad de los polipéptidos para transformar tanto ZEN como derivados de ZEN en metabolitos no tóxicos o menos tóxicos, se prepararon los polipéptidos con las secuencias ID n° 1, 10 y 11, tal y como se describe en el Ejemplo 3, con un marcador His C-terminal y como lisados celulares en la degradación se emplearon las respectivas secuencias de nucleótidos sintéticos con las secuencias ID n° 17, 26 y 27.
Los experimentos de degradación se llevaron a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 3, sometiendo a ensayo cada polipéptido con cada derivado de ZEN seleccionado a partir del grupo a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL, Z14G, Z14S y ZAN. Los lisados celulares se utilizaron en una dilución total de 1:10.000. Como solución madre de sustrato, en lugar de una solución de ZEN 2,08 mM (40% en volumen de ACN 60% en volumen de H2O), se utilizaron soluciones equimolares, es decir, soluciones 2,08 mM de los derivados de ZEN. a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL y ZAN se adquirieron en Sigma y se utilizaron como patrones para el análisis. Z14G y Z14S se obtuvieron con una pureza de al menos el 90% de acuerdo con los procedimientos tal y como se describen en P. Krenn et al., 2007 (Micotoxin Research, 23, 4, 180-184) y M. Sulyok et al., 2007 (Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523) y se emplearon como patrones para el análisis. Otra diferencia con el Ejemplo 3 es que únicamente se tomó una muestra después de 24 h. La reducción de la concentración de los derivados de ZEN durante el ensayo de degradación se cuantificó mediante LC/MS/MS. a-ZEL, p-ZEL, Z14G y Z14S se midieron según el método de M. Sulyok et al. (2010, Food Chemistry, 119, 408-416); a-ZAL, p-ZAL y ZAN se midieron según el método de P. Songsermaskul et al. (2011, J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 97, 155-161). Sorprendentemente, se ha comprobado que después de 24 h de incubación solo estaba presente desde 0 a como máximo un 13% de las cantidades de partida de derivados de ZEN.
Ejemplo 5: Actividad específica, así como parámetros de cinética enzimática de los polipéptidos y de sus variantes
La determinación de la actividad específica de los polipéptidos, así como de variantes de los mismos tuvo lugar fotométricamente, presentando todos los polipéptidos empleados un marcador 6xHis C-terminal. La preparación, el enriquecimiento y la purificación de los polipéptidos o bien de variantes de los mismos, se realizaron tal y como se describe en el Ejemplo 1. La degradación de ZEN en HZEN se midió a través de la disminución de la adsorción con una longitud de onda de 315 nm. Los coeficientes de extinción molar [s] de ZEN y HZEN se determinaron experimentalmente y ascendían a 0,0078895 L pmol-1 cm-1 y a 0,0030857 L pmol-1 cm-1. Los coeficientes de extinción son fuertemente dependientes del pH y, por lo tanto, la medición de la actividad debe llevarse a cabo siempre exactamente con el mismo valor del pH y, preferiblemente, también en la misma matriz. Las mediciones se llevaron a cabo en una solución tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2, en cubetas de cuarzo, en un intervalo de longitudes de onda de 200 a 2500 nm, en un fotómetro UV-VIS (Hitachi U-2001) a 32°C.
Como solución madre de sustrato ZEN servía una solución de ZEN 2,08 mM (40% en vol. de ACN 60% en vol. de H2O). Para la preparación de esta solución, ZEN se pesó y se disolvió de manera correspondiente en forma cristalina (Biopure Standard de Romer Labs, Art. n° 001109, al menos 98% de pureza). Las diluciones del sustrato ZEN (0,79 pM, 1,57 pM, 2,36 pM, 3,14 pM, 4,71 pM, 6,28 pM, 7,85 pM, 9,42 pM, 10,99 pM, 12,56 pM, 14,13 pM, 15,71 pM, 17,28 pM, 18,85 pM) se prepararon con Tris-HCl 50 mM pH = 8,2. Las soluciones polipeptídicas se diluyeron con tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2, hasta tener una concentración final de aprox. 70 ng/ml. Las diluciones de sustrato ZEN se calentaron previamente en un baño de agua a 32°C.
Se mezclaron 100 pl de la dilución de sustrato ZEN respectiva con 0,2 pl de la solución polipeptídica, y la absorción se midió durante 5 min, midiéndose cada una de las combinaciones a base de solución polipeptídica - dilución de sustrato ZEN al menos dos veces.
Teniendo en cuenta los coeficientes de extinción de ZEN y HZEN, a través del aumento de la absorción a lo largo del tiempo, se calculó la velocidad de la reacción para cada una de las concentraciones de sustrato.
Las expresiones “valor Km” o “constante de Michaelis-Menten” se refieren a un parámetro para describir la afinidad enzimática que poseen las unidades [pM] o [mM] y se calcula con ayuda del diagrama lineal de Hanes según H. Bisswang (2002, Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-X, página 19), utilizándose para ello preferiblemente la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. Las expresiones “constante catalítica de la reacción enzimática” o el “valor kcat” se refieren a un parámetro para describir la tasa de conversión de un polipéptido o bien una enzima, que se indica en [s]-1 y preferiblemente se calcula con ayuda de la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. La “velocidad enzimática máxima” o el “valor vmáx” se indica en las unidades [pM/s] o [mM/s] y se determina de forma análoga al valor Km con ayuda del diagrama lineal de Hanes, utilizando para ello preferiblemente la función “Cinética Enzimática, Sustrato Individual” del programa SigmaPlot 12.0. Por medio de vmáx y la concentración de enzima utilizada, se calculó la actividad específica según la fórmula vmáx [pM /s] x 60 [s/m in]
Actividad específica [U/mg] =
Concentración de enzima [m g/l]
en donde una unidad se define como la hidrólisis de ZEN 1 pmol por minuto a 32°C en solución tampón Tris-HCl 50 mM, pH = 8,2.
A continuación, se indican los datos sin procesar para la determinación de los parámetros enzimáticos Km, vmáx, kcat, así como la actividad específica, a modo de ejemplo para el polipéptido con la secuencia ID n° 1. La Tabla 3 muestra las velocidades de reacción con las concentraciones de sustrato ZEN respectivas, la Fig. 2 muestra las gráficas de Michaelis-Menten respectivas y en la Tabla 4 se indican los parámetros de cinética enzimática correspondientes. La solución enzimática empleada tenía una concentración de 68 ng/l.
Tabla 3: Velocidades de reacción del polipéptido con la SEQ ID n°: 1 con diferentes concentraciones de ZEN.
Tabla 4: Parámetros de la cinética enzimática del polipéptido con la secuencia ID n° 1.
Las actividades específicas de los polipéptidos examinados son para la secuencia ID n° 1, 8,25 U/mg, para la secuencia ID n° 10, 5,12 U/mg, para la secuencia ID n° 11,3,88 U/mg.
Ejemplo 6: Degradación de ZEN y derivados de ZEN en maíz contaminado
Para la determinación de la capacidad de los polipéptidos para degradar ZEN y derivados de ZEN que se presentan de forma natural en una matriz compleja y a un valor de pH bajo, se mezcló maíz contaminado a modo de ejemplo con diferentes concentraciones de, en cada caso, uno de los polipéptidos con las secuencias ID n° 1 a 6 y se controló la degradación de ZEN y derivados de ZEN.
El maíz contaminado se molió y se empleó en el ensayo de degradación, consistiendo cada lote en 1 g de maíz molido y contaminado, 8,9 ml de tampón acetato 100 mM, pH = 4,0 y 0,1 ml de solución polipeptídica. Se prepararon soluciones polipeptídicas enriquecidas y purificadas, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 5, diluyéndose éstas hasta una concentración de 10 mU/ml, 100 mU/ml o bien 1.000 mU/ml. En el lote se empleó, por consiguiente, de forma absoluta 1 mU (= 1 mU/g de maíz), 10 mU (= 10 mU/g de maíz) o bien 100 mU (= 100 mU/g de maíz). Cada lote de degradación se llevó a cabo en 25 ml y se incubó a 37°C con agitación a 100 rpm. Antes de la adición de la enzima o bien después de incubar durante 1 hora, se tomó en cada caso una muestra de 1 ml, el polipéptido se inactivó térmicamente durante 10 min a 99°C y la muestra se almacenó a -20 °C. Después de la descongelación de la muestra, los componentes no solubles se separaron mediante centrifugación. Se midieron las concentraciones de ZEN, así como de los derivados de ZEN mediante LC/MS/MS tal y como se describe en M. Sulyok et al. (2007, Anal. Bioanal. Chem., 289, 1505-1523). El contenido en ZEN y derivados de ZEN en ese maíz ascendía para ZEN a 238 ppb, para a-ZEL a 15 ppb, para p-ZEL a 23 ppb, para Z14G a 32 ppb y para Z14S a 81 ppb. En la Tabla 5 se presenta el porcentaje de disminución del contenido en ZEN y derivados de ZEN en el ensayo de degradación.
Tabla 5: Porcentaje de reducción de ZEN y de los derivados de ZEN referido al contenido inicial del ensayo de degradación de diferentes polipéptidos y cantidades de polipéptidos.
Ejemplo 7: Aditivos que contienen polipéptido para la disociación hidrolítica de ZEN y/o de derivados de ZEN
Para la preparación de los aditivos para la disociación hidrolítica de ZEN, se purificaron a modo de ejemplo materiales sobrenadantes de la fermentación de polipéptidos expresados mediante P. pastoris con las secuencias ID n° 1,2, 6 y 13, mediante microfiltración y ultrafiltración (límite de exclusión: 10 kDa) en condiciones convencionales y se concentraron hasta tener una concentración de sustancia seca de aproximadamente 9% en peso. A continuación, esas soluciones con contenido en polipéptidos se continuaron elaborando con un secador de pulverización (Mini B290 de Büchi), asimismo en condiciones convencionales, para formar polvos secos. Esos cuatro polvos se denominaron
sucesivamente Z1, Z2, Z6 y Z13. Z1, Z2, Z6 o bien Z13 se mezclaron, además, con bentonita con un tamaño medio de grano de aprox. 1 |um, en una relación de 1% en peso de aditivo Z1, Z2, Z6 o bien Z13 y 99% en peso de bentonita, en un agitador rotatorio Los aditivos, así contenidos, se denominaron aditivo Z1.B, Z2.B, Z6.B y Z13.B. Además, Z1, Z2, Z6 y Z13 se mezclaron con bentonita y un concentrado de elementos traza y vitaminas en una relación de 0,1% en peso de aditivo Z1, Z2, Z6 o bien Z13, 0,9% en peso de concentrado de elementos traza y vitaminas y 99% en peso de bentonita en un agitador rotario. Los aditivos, así contenidos, se denominaron aditivo Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS y Z13.BVS. En 100 g de los aditivos Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS y Z13.BVS estaban contenidos 200 mg de sulfato de hierro, 50 mg de sulfato de cobre, 130 mg de óxido de estaño, 130 mg de óxido de manganeso, 2,55 mg de carbonato de calcio, 160 mg de vitamina E, 6,5 mg de vitamina K3, 6,5 mg de vitamina B1, 14 mg de vitamina B2, 15 mg de vitamina B6, 0,15 mg de vitamina B12, 150 mg de ácido nicotínico, 30 mg de ácido pantoténico y 5,3 mg de ácido fólico.
Los aditivos se extrajeron en un tampón Tris-HCl 50 mM pH = 8,2 durante 30 minutos y se continuaron diluyendo en el mismo tampón, de modo que la concentración final de polipéptido era de aprox. 70 ng/ml.
A continuación, se determinó el efecto degradante de la zearalenona de esas soluciones, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 5. Las correspondientes actividades eran para Z1 8,230 U/g, para Z2 9,310 U/g, para Z6 9,214 U/g, para Z1.B 83 U/g, para Z2.B 92 U/g, para Z2.C 90 U/g, para Z13.B 57 U/g, para Z1.BVS 8 U/g, para Z2.bVs 9 U/g, para Z6.BVS 9 U/g y para Z13.BVS 6 U/g.
La capacidad para degradar los derivados de ZEN, a-ZEL, p-ZEL, a-ZAL, p-ZAL, Z14G, Z14S y ZAN mediante los aditivos Z1, Z2, Z6, Z13, Z1.B, Z2.B, Z6.B, Z13.B, Z1.BVS, Z2.BVS, Z6.BVS y Z13.BVS, se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 4, pero en lugar de 100 |ul de un lisado celular, se emplearon 100 |ul de una solución polipeptídica con una concentración de polipéptido de aprox. 70 ng/ml. Después de incubar durante 6 horas, solo estaba presente como máximo un 15% de la cantidad de partida en forma de un derivado de ZEN no hidrolizado.
Ejemplo 8: Temperatura óptima
Para determinar la temperatura óptima de los polipéptidos con las SEQ ID n° 1 y 11, éstos se clonaron con un marcador 6xHis C-terminal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se expresaron en E. coli y se purificaron. En pruebas preliminares, se determinó la concentración para cada polipéptido en las condiciones de la prueba (tampón Teorell Stenhagen (Teorell und Stenhagen, Ein Universalpuffer für den pH-Bereich 2.0 bis 12.0. Biochem Ztschrft, 1938, 299: S. 416-419), pH 7,5, con 0,1 mg/ml de BSA a 30°C) que podía garantizar una conversión completa de ZEN después de una duración de la prueba de 3 h. Las preparaciones se utilizaron en las concentraciones determinadas en los lotes de degradación para determinar la temperatura óptima. Las pruebas se realizaron en un aparato ciclador de PCR (Eppendorf) utilizando la función de gradiente de temperatura a 20°C /- 10°C, a 40°C /- 10°C y, si era necesario, a 60°C /- 10°C (10 temperaturas en cada intervalo respectivo; temperaturas predefinidas por el aparato ciclador de PCR). Para los lotes, se mezcló tampón Teorell-Stenhagen con la concentración de enzima apropiada, así como con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN, con cada pH óptimo respectivo. Los lotes con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN sin adición de enzima sirvieron como controles negativos. Después de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h y 3 h de tiempo de incubación, se tomó una muestra para cada temperatura de incubación, se inactivó térmicamente durante 10 min a 99°C y se almacenó a -20°C. Después de descongelar, las muestras se transfirieron a viales de HPLC. Se analizaron ZEN, HZEN y DHZEN usando HPLC-DAD. Para ello, los metabolitos se separaron cromatográficamente utilizando una columna Zorbax SB-Aq C18 con unas dimensiones de 4,6 mm x 150 mm y un tamaño de partícula de 5 |um. Una mezcla de metanol-agua con acetato de amonio 5 mM, servía como fase móvil. Se registró la señal UV a 274 nm. Los metabolitos se cuantificaron utilizando la inclusión de series estándar. Las temperaturas óptimas se determinaron usando las pendientes determinadas de las curvas de degradación, en donde la temperatura a la que la pendiente era mayor, se definió como la temperatura óptima. Las temperaturas óptimas se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6: Temperatura óptima de los polipéptidos
Ejemplo 9: Estabilidad térmica
Para determinar la estabilidad térmica de los polipéptidos con las SEQ ID n° 1 y 11, éstos se clonaron con un marcador 6xHis C-terminal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se expresaron en E. coli y se purificaron. Se incubaron en un aparato ciclador de PCR con función de gradiente con la temperatura óptima respectiva /- 10°C. Después de 0 min, 15 min, 30 min y 60 min, se tomó una muestra de cada lote y cada temperatura. Esas muestras preincubadas se usaron luego en una prueba de degradación en tampón Teorell-Stenhagen al pH óptimo respectivo, con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN en el lote. En pruebas preliminares, se había determinado para cada polipéptido la concentración a la que, en las condiciones de la prueba (tampón Teorell Stenhagen, pH 7,5, con 0,1 mg/ml de BSA a 30°C), se podía garantizar una conversión completa de ZEN después de una duración de la prueba de 3 horas. La concentración de enzima determinada en cada caso se utilizó en los lotes. Los lotes de degradación se incubaron a 30°C. Las muestras se tomaron después de unos tiempos de incubación de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h y 3 h. A continuación, los polipéptidos se
inactivaron térmicamente a 99°C durante 10 min y las muestras se almacenaron a -20°C. Después de descongelar, las muestras se transfirieron a viales de HPLC y se analizaron usando HPLC-DAD como se ha descrito en el Ejemplo 8.
La estabilidad térmica se define como la temperatura a la que los polipéptidos tienen una actividad residual del 50% después de 15 minutos de preincubación, en comparación con la temperatura óptima. La pendiente de las curvas de degradación se utiliza como medida de la actividad. Las estabilidades térmicas se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Estabilidades térmicas de los polipéptidos (50% de actividad residual después de 15 minutos de preincubación)
Ejemplo 10: pH óptimo
Para determinar el pH óptimo de los polipéptidos con las SEQ ID n° 1 y 11, éstos se clonaron con un marcador 6xHis C-terminal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se expresaron en E. coli y se purificaron. En pruebas preliminares, se determinó la concentración de cada polipéptido a la que, en las condiciones de la prueba (tampón Teorell Stenhagen, pH 7,5, con 0,1 mg/ml de BSA a 30°C), se podía garantizar una conversión completa de ZEN después de una duración de la prueba de 3 horas. La concentración de enzima en cada caso se utilizó en los lotes. Los lotes de degradación estaban en tampón Teorell-Stenhagen con valores de pH de 3,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11,0 y 12,0. Los lotes de degradación con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN se incubaron a 30°C. Se utilizaron como controles negativos lotes en tampón Teorell-Stenhagen a pH 3,0, pH 7,0 y pH 12,0 con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN. Se tomaron muestras después de tiempos de incubación de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h y 3 h. A continuación, los polipéptidos se inactivaron térmicamente a 99°C durante 10 min y las muestras se almacenaron a -20°C. Después de descongelar, las muestras se transfirieron a viales de HPLC y se analizaron usando HPLC-DAD como se ha descrito en el Ejemplo 8. Los pH óptimos se determinaron utilizando las pendientes determinadas de las curvas de degradación, en donde el valor del pH con el que la pendiente era mayor, se definía como el pH óptimo. Los pH óptimos se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8: pH óptimos de los polipéptidos
Ejemplo 11: Estabilidad frente al pH a pH 5,0
Para determinar la estabilidad frente al pH, los polipéptidos del Ejemplo 10 se incubaron en tampón Teorell-Stenhagen a pH 5,0 y con el pH óptimo respectivo durante 1 h a 25°C. Esas muestras preincubadas se utilizaron en un experimento de degradación con las mismas concentraciones del polipéptido respectivo que se habían utilizado para determinar el pH óptimo en tampón Tris-HCl 100 mM con cada pH óptimo, con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN en el lote. Los lotes se incubaron a la temperatura óptima respectiva. Se tomaron muestras después de tiempos de incubación de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h y 3 h. A continuación, los polipéptidos se inactivaron térmicamente a 99°C durante 10 min y las muestras se almacenaron a -20°C. Después de descongelar, las muestras se transfirieron a viales de HPLC y se analizaron usando HPLC-DAD como se ha descrito en el Ejemplo 8. La estabilidad frente al pH se define como el porcentaje de actividad residual de los polipéptidos a pH 5,0 con respecto a la actividad con cada pH óptimo respectivo. Las estabilidades frente al pH para pH 5,0 se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9: Estabilidad frente al pH de los polipéptidos a pH 5,0
Ejemplo 12: Ensayo de degradación de ZEN
La degradación de ZEN a HZEN y DHZEN se realizó a modo de ejemplo para los polipéptidos con las secuencias ID n° 1 y 11 . Los lotes de degradación se llevaron a cabo en tampón Teorell Stenhagen, pH 7,5, con 0,1 mg/ml de BSA y 5 ppm de ZEN. Los lotes de degradación se incubaron a 30°C. Se tomaron muestras después de tiempos de incubación de 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h y 3 h. A continuación, los polipéptidos se inactivaron térmicamente a 99°C durante 10 min y las muestras se almacenaron a -20°C. Después de descongelar, las muestras se transfirieron a viales de
Claims (11)
1. Procedimiento para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona por medio de un polipéptido que disocia hidrolíticamente, caracterizado porque se hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona con el polipéptido, que es una hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de secuencias ID n° 10 y 11, en particular la secuencia ID n° 11 o una variante funcional de la misma, en donde hay una identidad de secuencia de al menos el 70% entre la variante funcional y al menos una de las secuencias de aminoácidos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido contiene al menos un segmento de secuencia de aminoácidos conservado o una variante funcional del mismo, en donde la variante funcional del segmento de secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos un 70%, preferiblemente al menos un 84%, más preferiblemente al menos un 92% y lo más preferiblemente al menos un 98%, y el al menos un segmento de secuencia de aminoácidos conservado se selecciona a partir del grupo de secuencias de aminoácidos 79 a 87, 89 a 145, 177 a 193, 223 a 228, 249 a 255, 257 a 261, 272 a 279 de la secuencia que tiene la secuencia ID n° 1.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia ID n° 1 en al menos una de las siguientes posiciones seleccionadas a partir del grupo: 22, 23, 25, 26, 27, 29, 31,32, 35, 37, 42, 43, 46, 51, 53, 54, 57, 60, 69, 72, 73, 78, 80, 84, 88, 95, 97, 99, 114, 118, 119, 123, 132, 141, 146, 148, 149, 154, 163, 164, 165, 169, 170, 172, 176, 180, 182, 183, 190, 191, 194, 196, 197, 198, 201, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 213, 214, 216, 217, 220, 221, 222, 229, 231, 233, 238, 240, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 254, 256, 260, 262, 263, 266, 269, 271, 277, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 292, 296, 298, 302, 307, 308, 309, 311,314, 317, 319, 321,323, 325 y 326.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos una mutación de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia ID n° 1 seleccionada a partir del grupo D22A, S23Q, S23L, N25D, I26V, F27Y, F27H, S29P, R31A, F32Y, R35K, R35Q, V37A, V42I, V43T, F46Y, S51E, S51D, D53G, N54M, N54R, L57V, L60I, S69G, P72E, V73A, A78S, N80H, F84Y, I88L, T95S, T97A, R99K, I114M, 1118V, K119R, V123I, L132V, A141S, I146V, I146L, A148G, A149V, A154P, P163T, A164T, Y165C, Y165H, V169I, L170R, A172G, A176M, A176V, Y180F, D182T, F183Y, I190V, G191S, K194T, K194E, F196Y, V197C, V197R, E198R, E198S, K201D, K201G, P204S, P204A, A205S, K206P, A207M, M208A, Q209R, L210A, L210S, AP212, T213V, P214A, E216T, E216G, A217I, N220H, L221M, K222R, K222Q, G229A, A231V, F233W, F233Y, F233H, A238G, H240N, H240S, D244E, R245Q, M246L, S248T, S248N, S248G, Q249R, K251N, I254V, I256L, A260M, T262D, T262G, I263T, E266D, E269H, E269N, L271V, L277E, E280A, E280L, H281R, H281Q, A282V, Q283R, D284L, D284R, I285L, I286M, R287E, R287D, R292K, R292T, Q296A, Q296E, H298V, L302S, L307Q, F308S, D309A, A311 P, A314V, L317F, S319Q, S319P, S319R, S321A, S321T, T323A, P325A, A326P.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polipéptido se utiliza en un aditivo que contiene un adyuvante que disocia la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona para piensos para cerdos, aves de corral y acuicultura, en alimentos o en granos secos de destilería con solubles.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque los adyuvantes contenidos en el aditivo se seleccionan a partir de al menos un vehículo inerte, así como ingredientes adicionales opcionales, tales como vitaminas y/o minerales y/o enzimas y/u otros componentes para eliminar la toxicidad de las micotoxinas.
7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque el polipéptido está contenido en el aditivo en una concentración de como máximo 10.000 U/g, preferiblemente como máximo 1000 U/g, más preferiblemente como máximo 100 U/g y lo más preferiblemente como máximo 10 U/g.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, 6 o 7, caracterizado porque el aditivo se emplea en forma encapsulada o recubierta.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el polipéptido o el aditivo se mezcla con un producto alimenticio o pienso contaminado con zearalenona y/o con al menos un derivado de zearalenona, porque el producto alimenticio o el pienso contaminado se pone en contacto con humedad y porque el polipéptido o el aditivo hidroliza la zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona presente en el producto alimenticio o el pienso contaminado.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se hidroliza al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, en particular al menos el 90% de la zearalenona y/o de al menos un derivado de zearalenona.
11. Uso de un aditivo que contiene al menos un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de secuencias ID n° 10 y 11, en particular la secuencia ID n° 11 o una variante funcional de la misma, en donde una identidad de secuencia entre la variante funcional y al menos una de las secuencias de aminoácidos es de al menos el 70%, para la disociación hidrolítica de zearalenona y/o al menos un derivado de zearalenona en piensos, en particular para cerdos, aves y acuicultura, en alimentos o en granos secos de destilería con solubles.
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