ES2709577T3 - Preparación de conjugados de maitansinoides y anticuerpos mediante un proceso de una sola etapa - Google Patents

Preparación de conjugados de maitansinoides y anticuerpos mediante un proceso de una sola etapa Download PDF

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Abstract

Un proceso para preparar un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende la etapa de: (a) poner en contacto un anticuerpo con un maitansinoide para formar una primera mezcla que comprende el anticuerpo y el maitansinoide, después poner en contacto la primera mezcla con un reactivo de reticulación bifuncional que comprende un conector, en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para proporcionar una segunda mezcla que comprende (i) el conjugado de anticuerpo y maitansinoide, donde el anticuerpo está acoplado químicamente a través del conector al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre, y (iii) subproductos de reacción.

Description

DESCRIPCION
Preparacion de conjugados de maitansinoides y anticuerpos mediante un proceso de una sola etapa
Referenda cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/468.997, presentada el 29 de marzo de 2011 y la solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/468.981, presentada el 29 de marzo de 2011.
Antecedentes de la invencion
Los conjugados de anticuerpos y farmacos (ADC, por sus siglas en ingles) que resultan utiles en el tratamiento de cancer y otras enfermedades estan compuestos comunmente por tres elementos distintos: un agente de union celular, un conector y un agente citotoxico. El metodo convencional para conjugar un agente de union celular, tales como un anticuerpo, con un agente citotoxico, emplea dos etapas de reaccion distintas con el anticuerpo. En la primera etapa de reaccion (la etapa de modificacion), el anticuerpo se hace reaccionar con un conector heterobifuncional para producir un anticuerpo modificado por conector. El producto de anticuerpo modificado despues se purifica opcionalmente del exceso de conector o de reactivo de conector hidrolizado. En la segunda etapa de reaccion (la etapa de conjugacion), el anticuerpo modificado con conector se hace reaccionar con el agente citotoxico que contiene un grupo reactivo, tales como tiol, para generar el conjugado de anticuerpo y agente citotoxico, el cual nuevamente se purifica en una etapa de purificacion adicional.
Los procesos que se han descrito previamente para la fabricacion de los conjugados de anticuerpo y agente citotoxico son complejos porque estan cargados de etapas que son engorrosas de realizar o producen inmunoconjugados que son menos puros o menos estables que los optimos deseados. Por lo tanto, serla conveniente modificar o eliminar una o mas etapas de fabricacion a la vez que se mejora la calidad del producto, tales como la pureza y/o la estabilidad.
En vista de lo anterior, existe la necesidad en la tecnica de desarrollar procesos mejorados para preparar conjugados de agente de union celular y agente citotoxico que tengan una pureza sustancialmente alta, y que puedan prepararse evitando etapas engorrosas, y mediante la reduction del tiempo y del costo para el usuario. La invencion proporciona un proceso del mismo tipo. Estas y otras ventajas de la invencion, as! como otras caracterlsticas de la invencion, seran evidentes a partir de la description de la invencion que se proporciona en el presente documento.
Breve sumario de la invencion
La invencion proporciona un proceso para preparar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico es decir, un conjugado de maitansinoide y anticuerpo que comprende la etapa de poner en contacto un agente de union celular es decir, un maitansinoide con un agente citotoxico es decir, un anticuerpo para formar una primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico, y despues poner en contacto la primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico con un reactivo de reticulation bifuncional que comprende un conector, en una solution que tiene un pH de 4 a 9, para proporcionar una mezcla que comprende (i) el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico, donde el agente de union celular se acopla qulmicamente a traves del conector al agente citotoxico, (ii) agente citotoxico libre y (iii) subproductos de reaccion. El proceso puede comprender adicionalmente la etapa de purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico purificado.
Los procesos de la presente invencion proporcionan un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico con alta pureza y/o estabilidad. Para lograr la alta pureza y/o estabilidad del conjugado, es esencial que el agente citotoxico se ponga en contacto con el agente de union celular primero para formar una mezcla que comprenda el agente de union celular y el agente citotoxico, antes de que la mezcla se ponga en contacto con un reactivo de reticulacion bifuncional.
La presente invencion incluye tambien un conjugado que comprende un agente de union celular que se acopla qulmicamente a un agente citotoxico preparado de acuerdo con los procesos descritos en el presente documento.
Basandose en la divulgation que se contiene en el presente documento, la presente invencion proporciona un proceso para preparar un conjugado de maitansinoide y anticuerpo que comprende la etapa de: (a) poner en contacto un anticuerpo con un maitansinoide para formar una primera mezcla que comprende el anticuerpo y el maitansinoide, despues poner en contacto la primera mezcla con un reactivo de reticulacion bifuncional que comprende un conector, en una solucion que tiene un pH de 4 a 9 para proporcionar una segunda mezcla que comprende (i) el conjugado de maitansinoide y anticuerpo, donde el anticuerpo se acopla qulmicamente a traves del conector al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) subproductos de la reaccion.
La presente invencion y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion proporciona un proceso de una etapa para preparar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico es decir, un conjugado de maitansinoide y anticuerpo. El proceso comprende poner en contacto un agente de union celular (es decir, un anticuerpo) con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide para formar una primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico, y despues poner en contacto la primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico con un reactivo de reticulacion bifuncional que comprende un conector, en una solucion que tiene un pH de 4 a 9, para proporcionar una segunda mezcla que comprende el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico, agente citotoxico libre y subproductos de reaccion, donde el agente de union celular se acopla qulmicamente al agente citotoxico a traves del conector. La segunda mezcla despues se somete a purification para proporcionar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico purificado.
En una realization, la puesta en contacto se efectua proporcionando el agente de union celular, despues poniendo en contacto el agente de union celular con el agente citotoxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico, y despues poniendo en contacto la primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico con el reactivo de reticulacion bifuncional. Por ejemplo, en una realizacion, el agente de union celular se proporciona en un recipiente de reaccion, el agente citotoxico se anade al recipiente de reaccion (que entra de la misma manera en contacto con el agente de union celular), y despues se anade el reactivo de reticulacion bifuncional a la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico (que entra de la misma manera en contacto con la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico). En una realizacion, se proporciona el agente de union celular en un recipiente de reaccion, y se anade el agente citotoxico al recipiente de reaccion inmediatamente despues de colocar el agente de union celular al recipiente. En otra realizacion, se proporciona el agente de union celular en un recipiente de reaccion, y el agente citotoxico se anade al recipiente de reaccion despues de un intervalo de tiempo despues de proporcionar el agente de union celular en el recipiente (por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1 dla o mas despues de proporcionar el agente de union celular en el receptaculo). El agente citotoxico pude anadirse rapidamente (es decir, dentro de un intervalo de tiempo corto, tales como aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos) o lentamente (tales como mediante el uso de una bomba).
La mezcla que comprende un agente de union celular y un agente citotoxico puede despues ponerse en contacto con el reactivo de reticulacion bifuncional, ya sea inmediatamente despues de poner en contacto el agente de union celular con el agente citotoxico o en un momento posterior (por ejemplo, aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 8 horas o mas) despues de poner en contacto el agente de union celular con el agente citotoxico. Por ejemplo, en una realizacion, el reactivo de reticulacion bifuncional se anade a la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico inmediatamente despues de la adicion del agente citotoxico al recipiente de reaccion que comprende el agente de union celular. De manera alternativa, la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico puede ponerse en contacto con el reactivo de reticulacion bifuncional aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas o mas despues de poner en contacto el agente de union celular con el agente citotoxico.
En otra realizacion, el agente citotoxico y el agente bifuncional se anaden a traves de multiples ciclos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o mas ciclos). Por ejemplo, la invencion proporciona un proceso que comprende las etapas de: a) poner en contacto un agente de union celular es decir, un anticuerpo con el agente citotoxico es decir, un maitansinoide para formar una primera mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico; y despues poner en contacto la primera mezcla con un reactivo de reticulacion bifuncional que comprende un conector, en una solucion que tiene un pH de 4 a 9 para proporcionar una segunda mezcla que comprende el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico, agente citotoxico libre, y subproductos de reaccion, donde el agente de union celular esta acoplado qulmicamente a traves del conector al agente citotoxico; b) poner en contacto la segunda mezcla con el agente citotoxico para formar una tercera mezcla; y despues poner en contacto la tercera mezcla con el reactivo de reticulacion bifuncional a un pH de 4 a 9 para proporcionar una cuarta mezcla; y c) purificar la cuarta mezcla para proporcionar el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico purificado. En una realizacion, la etapa b) se lleva a cabo despues de un intervalo de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas o mas) despues de la etapa a). En otra realizacion, la etapa b) puede repetirse varias veces (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o mas veces) antes de llevar a cabo la etapa c). La etapa b) adicional puede llevarse a cabo despues de un intervalo de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas o mas) despues de la etapa b) inicial.
En otra realizacion, el reactivo de reticulacion bifuncional se anade antes de que se completa la adicion del agente citotoxico. Por ejemplo, en una realizacion, el agente citotoxico se anade al agente de union celular de manera continua durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas o mas) para formar una mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico. Antes de que la adicion del agente citotoxico este completa, se anade el reactivo de reticulacion bifuncional a la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico, con la condicion de que el agente citotoxico este en todo momento en exceso molar respecto al reactivo de reticulacion bifuncional. En una realizacion, el reactivo de reticulacion bifuncional se anade de manera continua durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, o mas).
Despues de que la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico se pone en contacto con el reactivo de reticulacion bifuncional, la reaccion se deja continuar durante aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas o mas (por ejemplo, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 45 horas o aproximadamente 48 horas).
La puesta en contacto el agente de union celular con el agente citotoxico y despues el reactivo de reticulacion bifuncional (es decir, la etapa de reaccion) se produce en una solucion que tiene un pH de 4 a 9 (por ejemplo, 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5 o 9). En una realizacion, la etapa de reaccion se produce en una solucion que tiene un pH de aproximadamente 6 o menos (por ejemplo, 4 a aproximadamente 6, 4 a aproximadamente 5,5, o aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5).
En otra realizacion, el proceso de la invencion comprende poner en contacto un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues un reactivo de reticulacion bifuncional en una solucion que tiene un pH de aproximadamente 6 o mas (por ejemplo, aproximadamente 6 a 9, aproximadamente 6 a aproximadamente 7, aproximadamente 7 a 9, aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5, aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,0 a 9,0, o aproximadamente 8,5 a 9,0). Por ejemplo, el proceso de la invencion comprende poner en contacto un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y un reactivo de reticulacion bifuncional en una solucion que tiene un pH de aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,1, aproximadamente 8,2, aproximadamente 8,3, aproximadamente 8,4, aproximadamente 8,5, aproximadamente 8,6, aproximadamente 8,7, aproximadamente 8,8, aproximadamente 8,9 o 9,0. En una realizacion especlfica, el proceso de la invencion comprende poner un agente de union celular es decir, un anticuerpo en contacto con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y un reactivo de reticulacion bifuncional en una solucion con un pH de aproximadamente 7,8 (por ejemplo, un pH de 7,6 a 8,0 o un pH de 7,7 a 7,9).
El proceso de la invencion comprende llevar a cabo la reaccion en una sola etapa (es decir, poner en contacto un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues un reactivo de reticulacion bifuncional) a cualquier temperatura adecuada conocida en la tecnica. Por ejemplo, la reaccion en una sola etapa puede ocurrir a aproximadamente 20 °C o menos (por ejemplo, aproximadamente -10 °C (con la condicion de que se evite que la solucion se congele, por ejemplo, mediante la presencia de un disolvente organico usado para disolver el agente citotoxico y el reactivo de reticulacion bifuncional) a aproximadamente 20 °C, aproximadamente 0 °C a aproximadamente 18 °C, aproximadamente 4 °C a aproximadamente 16 °C), a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C), o a una temperatura elevada (por ejemplo, aproximadamente 30 °C a aproximadamente 37 °C). En una realizacion, la puesta en contacto de un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y un reactivo de reticulacion bifuncional se produce a una temperatura de aproximadamente 16 °C a aproximadamente 24 °C (por ejemplo, aproximadamente 16 °C, aproximadamente 17 °C, aproximadamente 18 °C, aproximadamente 19 °C, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 21 °C, aproximadamente 22 °C, aproximadamente 23 °C, aproximadamente 24 °C o aproximadamente 25 °C).
En otra realizacion, la puesta en contacto de un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional se produce a una temperatura de aproximadamente 15 °C o menos (por ejemplo, aproximadamente -10 °C a aproximadamente 15 °C, o de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 15 °C). En este sentido, el proceso de la invencion comprende poner un agente de union celular es decir, un anticuerpo en contacto con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional a una temperatura de 15 °C, aproximadamente 14 °C, aproximadamente 13 °C, aproximadamente 12 °C, aproximadamente 11 °C, aproximadamente 10 °C, aproximadamente 9 °C, aproximadamente 8 °C, aproximadamente 7 °C, aproximadamente 6 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 4 °C, aproximadamente 3 °C, aproximadamente 2 °C, aproximadamente 1 °C, aproximadamente 0 °C, aproximadamente -1 °C, aproximadamente -2 °C, aproximadamente -3 °C, aproximadamente -4 °C, aproximadamente -5 °C, aproximadamente -6 °C, aproximadamente -7 °C, aproximadamente -8 °C, aproximadamente -9 °C, o aproximadamente -10 °C, con la condicion de que se evite que la solucion se congele, por ejemplo, mediante la presencia de disolvente o disolventes organicos usados para disolver el reactivo de reticulacion bifuncional. En una realization, el proceso de la invention comprende poner un agente de union celular es decir, un anticuerpo en contacto con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional a una temperatura de aproximadamente -10 °C a aproximadamente 15 °C, aproximadamente 0 °C a aproximadamente 15 °C, aproximadamente 0 °C a aproximadamente 10 °C, aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C, aproximadamente 5 °C a aproximadamente 15 °C, aproximadamente 10 °C a aproximadamente 15 °C, o aproximadamente 5 °C a aproximadamente 10 °C. En otra realizacion, el proceso de la invencion comprende poner un agente de union celular es decir, un anticuerpo en contacto con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional a una temperatura de aproximadamente 10 °C (por ejemplo, una temperatura de 8 °C a 12 °C o una temperatura de 9 °C a 11 °C).
En una realizacion, el proceso de la invencion comprende poner un agente de union celular es decir, un anticuerpo en contacto con un agente citotoxico: es decir, un maitansinoide y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional en una solucion con un pH alto (por ejemplo, aproximadamente 7 o mayor) a una baja temperatura (por ejemplo aproximadamente 15 °C o menor). Por ejemplo, en una realizacion, el proceso de la invencion comprende poner un agente de union celular es decir, un anticuerpo en contacto con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional en una solucion con un pH de aproximadamente 7,5 a una temperatura de aproximadamente 15 °C, en una solucion con un pH de aproximadamente 7,8 a una temperatura de aproximadamente 10 °C, en una solucion con un pH de 8,2 a una temperatura de aproximadamente 0 °C o en una solucion con un pH de 8,5 a una temperatura de aproximadamente 0 °C. En otra realizacion, el proceso de la invencion comprende poner un agente de union celular en contacto con un agente citotoxico y despues con un reactivo de reticulacion bifuncional en una solucion con un pH de 7,0 a 8,5 (por ejemplo, un pH de 7,5 a 8,0) a una temperatura de 5 °C a 15 °C.
En una realizacion, el proceso de la invencion comprende adicionalmente una etapa de inactivation para inactivar cualquier agente citotoxico sin reaccionar y/o reactivo de reticulacion bifuncional sin reaccionar. La etapa de inactivacion se lleva a cabo antes de la purification del agente de union celular y el agente citotoxico. Por ejemplo, el proceso de la invencion comprende (a) poner en contacto a un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide para formar una mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico, y despues poner en contacto la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico con un reactivo de reticulacion bifuncional, que comprende un conector, en una solucion con un pH de 4 a 9 para proporcionar una mezcla que comprende (i) el congujado de agente de union celular y agente citotoxico, donde el agente de union celular esta acoplado qulmicamente al agente citotoxico mediante el conector, (ii) agente citotoxico libre y (iii) subproductos de la reaction, (b) inactivar la mezcla preparada en la etapa (a) para inactivar cualquier agente citotoxico sin reaccionar y/o cualquier reactivo de reticulacion bifuncional sin reaccionar, y (c) purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico.
En una realizacion, la mezcla se inactiva mediante la puesta en contacto de la mezcla con un reactivo de inactivacion. Tales como se usa en el presente documento, el "reactivo de inactivacion" se refiere a un reactivo que reacciona con el reactivo de reticulacion bifuncional y/o el agente citotoxico libre.
En una realizacion, los reactivos de inactivacion de maleimida o haloacetamida, tales como acido 4-maleimidobutlrico, acido 3-maleimidopropionico, N-etilmaleimida, yodoacetamida o acido yodoacetamidopropionico, pueden usarse para asegurarse de que se inactive cualquier grupo sin reaccionar (tales como tiol) en el agente citotoxico. La etapa de inactivacion puede ayudar a prevenir la dimerization del agente citotoxico, en particular del agente citotoxico que tiene un grupo tiol sin reaccionar (tales como DM1). El agente citotoxico dimerizado puede ser diflcil de retirar. La etapa de inactivacion tambien puede minimizar cualquier reaccion de intercambio tiol-disulfuro no deseada con los grupos disulfuro de anticuerpos naturales. Despues de la inactivacion con reactivos de inactivacion de tiol cargados y polares (tales como acido 4-maleimidobutlrico o acido 3-maleimidopropionico), el exceso de agente citotoxico sin reaccionar se convierte en un aducto soluble en agua cargado y polar, que puede separarse facilmente del conjugado unido covalentemente durante la etapa de purificacion. Tambien puede emplearse la inactivacion con reactivos de inactivacion de tiol neutros y no polares.
En una realizacion, la mezcla se inactiva poniendo en contacto la mezcla con un reactivo de inactivacion que reacciona con el reactivo de reticulacion bifuncional sin reaccionar. Por ejemplo, pueden anadirse nucleofilos a la mezcla para inactivar cualquier reactivo de reticulacion bifuncional sin reaccionar. El nucleofilo es preferentemente un grupo amino que contiene nucleofilos, tales como lisina, taurina o hidroxilamina.
En una realizacion preferida, la reaccion (es decir, poner en contacto un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues un reactivo de reticulacion bifuncional) se deja avanzar hasta completar antes de poner en contacto la mezcla con un reactivo de inactivacion. En este aspecto, el agente de inactivacion se anade a la mezcla entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 48 horas (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 25 horas a aproximadamente 48 horas) despues de que se ponga en contacto a la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico con el reactivo de reticulacion bifuncional.
El proceso de la invencion puede incluir opcionalmente la adicion de sacarosa a la etapa de reaccion (es decir, poner en contacto a un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y un reactivo de reticulacion bifuncional) para aumentar la solubilidad y recuperacion de los conjugados de agente de union celular y agentes citotoxicos. De forma deseable, la sacarosa se anade en una concentracion de aproximadamente el 0,1 % (p/v) a aproximadamente el 20 % (p/v) (por ejemplo, aproximadamente el 0,1 % (p/v), el 1 % (p/v), el 5 % (p/v), el 10 % (p/v), el 15 % (p/v), o el 20 % (p/v)). Preferentemente, la sacarosa se anade en una concentracion de aproximadamente el 1 % (p/v) a aproximadamente el 10 % (p/v) (por ejemplo, aproximadamente el 0,5 % (p/v), aproximadamente el 1 % (p/v), aproximadamente el 1,5 % (p/v), aproximadamente el 2 % (p/v), aproximadamente el 3 % (p/v), aproximadamente el 4 % (p/v), aproximadamente el 5 % (p/v), aproximadamente el 6 % (p/v), aproximadamente el 7 % (p/v), aproximadamente el 8 % (p/v), aproximadamente el 9 % (p/v), aproximadamente el 10 % (p/v), o aproximadamente el 11 % (p/v)). A su vez, la etapa de reaccion tambien puede comprender la adicion de un agente tamponante. Puede utilizarse cualquier agente tamponante adecuado conocido en la tecnica. Los agentes tamponantes adecuados incluyen, por ejemplo, un tampon de citrato, un tampon de acetato, un tampon de succinato y un tampon de fosfato. En una realizacion, el agente tamponante se selecciona del grupo que consiste en HEPPSO (acido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-hidroxipropanosulfonico)), POPSO (deshidrato de piperazina-1,4-bis-(acido 2-hidroxi-propano-sulfonico)), HEPES (acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfonico), HEPPS (EPPS) (acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-propanosulfonico), TES (acido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfonico) y combinaciones de los mismos.
Despues de la etapa de reaccion, el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico se somete a una etapa de purificacion. En este sentido, el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico puede purificarse a partir de los otros componentes de la mezcla (por ejemplo, agente citotoxico libre y subproductos de reaccion) usando filtracion de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en ingles), el cual es un proceso de filtracion de flujo tangencial en base a membranas, cromatografla de no adsorcion, cromatografla de adsorcion, filtracion de adsorcion, precipitacion selectiva, o cualquier otro proceso de purificacion adecuada, as! como combinaciones de los mismos. En una realizacion de la invencion, el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico se purifica usando una unica etapa de purificacion (por ejemplo, TFF). Preferentemente, el conjugado se purifica e intercambia en la formulacion adecuada usando una unica etapa de purificacion (por ejemplo, TFF). En otra realizacion de la invencion, el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico se purifica usando dos etapas de purificacion secuenciales. Por ejemplo, el conjugado puede primero purificarse mediante precipitacion selectiva, filtracion de adsorcion, cromatografla de adsorcion o cromatografla de no adsorcion, seguida de purificacion con TFF. Un experto en la materia entendera que la purificacion del conjugado de agente citotoxico y agente de union celular permite que se aisle un conjugado estable que comprende el agente de union celular acoplado quimicamente al agente citotoxico.
Puede utilizarse cualquier sistema adecuado de TFF para la purificacion, incluyendo un sistema tipo Pellicon (Milipore, Billerica, MA), un sistema de casete Sartocon (Sartorius AG, Edgewood, NY), y un sistema de tipo Centrasette (Pall Corp., East Hills, NY).
Puede utilizarse cualquier resina adecuada para cromatografla de adsorcion para la purificacion. Las resinas para cromatografla por adsorcion que se prefieren incluyen cromatografla con hidroxiapatita, cromatografla hidrofobica inducida por carga (HCIC), cromatografla de interaccion hidrofobica (HIC), cromatografla de intercambio ionico, cromatografla de intercambio ionico de modo mixto, cromatografla de afinidad por iones metalicos inmovilizados (IMAC), cromatografla usando pigmentos como ligandos, cromatografla de afinidad, cromatografla de fase inversa, y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de resinas adecuadas para hidroxiapatita incluyen ceramicas de hidroxiapatita (CHT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), hidroxiapatita HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY) y ceramicas de fluorapatito (CFT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Un ejemplo de una resina adecuada para HCIC es la resina MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, NY). Los ejemplos de resinas adecuadas para HIC incluyen resinas de Butyl-Sepharose, Hexyl-Sepaharose, Phenyl-Sepaharose, y Octyl Sepharose (todas de GE Healthcare, Piscataway, NJ), asi como resinas de metilo Macro-prep y t-butilo Macro-Prep (Biorad Laboratories, Hercules, CA). Los ejemplos de resinas de intercambio ionico adecuadas incluyen SP-Sepharose, CM-Sepharose, y Q-Sepharose (todas de Ge Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas S Unosphere (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Los ejemplos de intercambiadores ionicos mixtos adecuados incluyen resinas Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg NJ). Los ejemplos de resinas para IMAC adecuadas incluyen resinas Sepharose de quelacion (GE Healthcare, Piscataway, NJ), y resinas Profinity para IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los ejemplos de resinas para ligandos de pigmentos incluyen resinas Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas Affi-gel Blue (Bio­ Rad Laboratories, Hercules, CA). Los ejemplos de resinas de afinidad adecuadas incluyen resinas Protein A Sepharose (por ejemplo, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), donde el agente de union celular es un anticuerpo, y resinas de afinidad a la lectina, por ejemplo resinas Lentil Lectin Sepharose (GE Healthcare, Piscataway,
NJ), donde el agente de union celular presenta sitios de union de union de lectina adecuados. De manera alternativa,
se puede utilizar un anticuerpo especlfico para el agente de union celular. Dicho anticuerpo se puede inmovilizar a,
por ejemplo, una resina Sepharose 4 Fast Flow (GE, Healthcare, Piscataway, NJ). Los ejemplos de resinas adecuadas
para fase invertida incluyen resinas C4, C8 y C18 (Grace Vydac, Hesperia, CA).
Puede utilizarse cualquier resina adecuada para cromatografla de no adsorcion para la purificacion. Los ejemplos de
resinas adecuadas para cromatografla de no adsorcion incluyen, pero no se limitan a, SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, resinas SEPHACRYL™ (por ejemplo, S-200 y S-300), resinas SUPERDEX™ (por ejemplo, SUPERDEX™ 75 y
SUPERDEX™ 200), resinas BIO-GEL® (por ejemplo, P-6, P-10, P-30, P-60, y P-100) y otras conocidas para los
expertos en la tecnica.
En una realizacion, el proceso de la invencion comprende tambien una etapa de retencion para liberar los conectores
acoplados de manera inestable del agente de union celular. La etapa de retencion comprende retener la mezcla antes
de la purificacion del conjugado de agente de union celular y agente citotoxico (por ejemplo, despues de la etapa de
reaccion, entre la etapa de reaccion y la etapa de inactivacion, o despues de la etapa de inactivacion). Por ejemplo, el
proceso de la invencion comprende (a) poner en contacto a un agente de union celular es decir, un anticuerpo con un
agente citotoxico es decir, un maitansinoide para formar una mezcla que comprende el agente de union celular y el
agente citotoxico; y despues poner en contacto la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente
citotoxico con un reactivo de reticulacion bifuncional, el cual proporciona un conector, en una solucion con un pH de 4
a 9 para proporcionar una mezcla que comprende (i) el congujado de agente de union celular y agente citotoxico,
donde el agente de union celular esta acoplado qulmicamente al agente citotoxico mediante el conector, (ii) agente
citotoxico libre y (iii) subproductos de la reaccion, (b) retener la mezcla tales como se preparo en la etapa (a) para
liberar los conectores unidos de forma inestable del agente de union celular, y (c) purificar la mezcla para proporcionar
un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico purificado.
En otra realizacion, el proceso de la invencion comprende (a) poner en contacto a un agente de union celular es decir,
un anticuerpo con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide para formar una mezcla que comprende el agente
de union celular y el agente citotoxico, y despues poner en contacto la mezcla que comprende el agente de union
celular y el agente citotoxico con un reactivo de reticulacion bifuncional, el cual proporciona un conector, en una
solucion con un pH de 4 a 9 para proporcionar una mezcla que comprende (i) el congujado de agente de union celular
y agente citotoxico, donde el agente de union celular esta acoplado qulmicamente al agente citotoxico mediante el
conector, (ii) agente citotoxico libre y (iii) subproductos de la reaccion, (b) inactivar la mezcla preparada en la etapa (a)
para inactivar todo agente citotoxico sin reaccionar y/o reactivo de reticulacion bifuncional sin reaccionar, (c) retener
la mezcla tales como se preparo en la etapa (b) para liberar los conectores unidos de forma inestable del agente de
union celular, y (d) purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico
purificado.
De manera alternativa, la etapa de retencion puede tener lugar despues de la purificacion del conjugado de agente de
union celular y agente citotoxico, y ser seguida de una etapa de purificacion adicional.
En una realizacion preferida, la reaccion (es decir, poner en contacto un agente de union celular es decir, un anticuerpo
con un agente citotoxico es decir, un maitansinoide y despues un reactivo de reticulacion bifuncional) se puede
completar antes de la etapa de retencion. En este aspecto, la etapa de retencion se puede llevar a cabo
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2
horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas,
aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas,
aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 ho aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 ho aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 ho aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 24 horas a aproximadamente 48 horas)
despues de que se ponga en contacto a la mezcla que comprende el agente de union celular y el agente citotoxico
con el reactivo de reticulacion bifuncional.
La etapa de retencion comprende mantener la solucion a una temperatura adecuada (por ejemplo, entre
aproximadamente 0 °C y aproximadamente 37 °C) durante un perlodo adecuado de tiempo (por ejemplo de
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas,
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 8 horas o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas)
para liberar los conectores acoplados de manera inestable del agente de union celular sin liberar cantidades
considerables de los conectores acoplados de manera estable al agente de union celular. En una realizacion, la etapa
de retencion comprende mantener la solucion a aproximadamente 20 °C o menos (por ejemplo, de aproximadamente
0 °C a aproximadamente 18 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 16 °C), a temperatura ambiente (por
ejemplo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente
25 °C), o a temperaturas elevadas (por ejemplo de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 37 °C). En una
realizacion, la etapa de retencion comprende mantener la solucion a una temperatura de aproximadamente 16 °C a
aproximadamente 24 °C (por ejemplo, aproximadamente 15 °C, aproximadamente 16 °C, aproximadamente 17 °C, aproximadamente 18 °C, aproximadamente 19 °C, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 21 °C, aproximadamente 22 °C, aproximadamente 23 °C, aproximadamente 24 °C, o aproximadamente 25 °C). En otra realizacion, la etapa de retencion comprende mantener la solucion a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C (por ejemplo, aproximadamente 0 °C, aproximadamente 1 °C, aproximadamente 2 °C, aproximadamente 3 °C, aproximadamente 4 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 6 °C, aproximadamente 7 °C, aproximadamente 8 °C, aproximadamente 9 °C, o aproximadamente 10 °C). En otra realizacion, la etapa de retencion comprende mantener la solucion a una temperatura de alrededor 37 °C (por ejemplo, aproximadamente 34 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 36 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 38 °C, aproximadamente 39 °C, o aproximadamente 40 °C).
La duracion de la etapa de retencion depende de la temperatura y del pH a los cuales se lleve a cabo la etapa de retencion. Por ejemplo, la duracion de la etapa de retencion puede reducirse considerablemente si la etapa de retencion se lleva a cabo a temperaturas elevadas, donde la temperatura maxima esta limitada por la estabilidad del conjugado de agente de union celular y agente citotoxico. La etapa de retencion puede comprender mantener la solucion por alrededor 1 hora a aproximadamente 1 dla (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 22 horas, o aproximadamente 24 horas), de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 14 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 16 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 dlas, aproximadamente 3 dlas, aproximadamente 4 dlas, aproximadamente 5 dlas, aproximadamente 6 dlas, o aproximadamente 7 dlas), o de aproximadamente 1 dla a aproximadamente 1 semana.
En una realizacion, la etapa de retencion comprende mantener la solucion a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C por un perlodo de al menos aproximadamente 12 horas hasta una semana. En otra realizacion, la etapa de retencion comprende mantener la solucion a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C durante la noche (por ejemplo, aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas, preferentemente aproximadamente 20 horas).
El valor de pH para la etapa de retencion es preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 10. En una realizacion, el valor de pH para la etapa de retencion es de aproximadamente 4 o mas, pero menor que aproximadamente 6 (por ejemplo 4 a 5.9) o aproximadamente 5 o mas, pero menor que aproximadamente 6 (por ejemplo, 5 a 5.9). En otra realizacion, los valores de pH para la etapa de retencion varlan de entre aproximadamente 6 a aproximadamente 10 (por ejemplo, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8). Por ejemplo, los valores de pH para la etapa de retencion pueden ser aproximadamente 6, aproximadamente 6.5, aproximadamente 7, aproximadamente 7.5, aproximadamente 8, aproximadamente 8.5, aproximadamente 9, aproximadamente 9.5, o aproximadamente 10.
En realizaciones especlficas, la etapa de retencion puede comprender incubar la mezcla a 25 °C a un pH de aproximadamente 6-7,5 por aproximadamente 12 horas a aproximadamente 1 semana, incubar la mezcla a 4 °C a un pH de aproximadamente 4,5-5,9 por aproximadamente 5 horas a aproximadamente 5 dlas, o incubar la mezcla a 25 °C a un pH de aproximadamente 4,5-5,9 por aproximadamente 5 horas a aproximadamente 1 dla.
La invencion proporciona un proceso para la preparacion de composiciones de conjugados estables que comprenden un agente de union celular es decir, un anticuerpo acoplado qulmicamente a un agente citotoxico es decir, un maitansinoide, donde las composiciones se encuentran sustancialmente libres de conjugados inestables. En este sentido, la invencion proporciona un proceso para preparar un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico de pureza y estabilidad considerablemente altas. Dichas composiciones pueden usarse para tratar enfermedades dada la elevada pureza y estabilidad de los conjugados. Se describen composiciones que comprenden un agente de union celular, como un anticuerpo, acoplado qulmicamente a un agente citotoxico, como un maitansinoide, en, por ejemplo, la patente de EE.UU. 7.374.762. En un aspecto de la invencion, un conjugado de agente de union celular y agente citotoxico de pureza considerablemente alta tiene una o mas de las siguientes caracterlsticas: (a) mas que aproximadamente 90 % (por ejemplo, mas que o aproximadamente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %), preferentemente mas que aproximadamente 95 %, de las especies del conjugado son monomericas, (b) el nivel de conectores sin conjugar en la preparacion del conjugado es menos que aproximadamente 10 % (por ejemplo, menos que o igual a aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o 0 %) (con relacion al total de conectores), (c) menos que 10 % de las especies del conjugado presentan reticulacion (por ejemplo, menos que o igual a aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o 0 %), (d) el nivel de agente citotoxico libre en la preparacion del conjugado es menos que aproximadamente 2 % (por ejemplo, menos que o igual a aproximadamente 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, o 0 %) (mol/mol con relacion al total de agente citotoxico), y/o (e) no presenta un aumento considerable en el nivel de agente citotoxico libre cuando se almacena (por ejemplo, despues de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 1 ano, aproximadamente 2 anos, aproximadamente 3 anos, alrededor 4 anos o aproximadamente 5 anos). Un "aumento considerable" en los niveles de agente citotoxico libre significa que, despues de cierto tiempo de almacenamiento (por ejemplo, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 1 ano, aproximadamente 2 anos, aproximadamente 3 anos, aproximadamente 4 anos o aproximadamente 5 anos), el aumento en el nivel de agente citotoxico es menor que aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,3 %, aproximadamente 0,4 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,6 %, aproximadamente 0,7 %, aproximadamente 0,8 %, aproximadamente 0,9 %, aproximadamente 1,0 %, aproximadamente 1,1 %, aproximadamente 1,2 %, aproximadamente 1,3 %, aproximadamente 1,4 %, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 1,6 %, aproximadamente 1,7 %, aproximadamente 1,8 %, aproximadamente 1,9 %, aproximadamente 2,0 %, aproximadamente 2,2 %, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 2,7 %, aproximadamente 3,0 %, aproximadamente 3,2 %, aproximadamente 3,5 %, aproximadamente 3,7 %, o aproximadamente 4,0 %.
Como se utiliza en el presente documento, la frase "conector sin conjugar" se refiere al agente de union celular que se enlaza, mediante enlaces covalentes, al reactivo de reticulacion bifuncional, donde el agente de union celular no se encuentra enlazado mediante enlaces covalentes al agente citotoxico por medio del conector del reactivo de reticulacion bifuncional (es decir, el "conector sin conjugar" puede representarse como CBA-L, donde CBA representa el agente de union celular y L representa el reactivo de reticulacion bifuncional. Por el contrario, el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico se puede representar como CBA-L-D, donde D representa al agente citotoxico).
En una realizacion, la razon molar promedio del agente citotoxico al agente de union celular en el conjugado de agente de union celular y agente citotoxico es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,5 (por ejemplo, de aproximadamente 2,5, de aproximadamente 2,6, de aproximadamente 2,7, de aproximadamente 2,8, de aproximadamente 2,9, de aproximadamente 3,0, de aproximadamente 3,1, de aproximadamente 3,3, de aproximadamente 3,4, de aproximadamente 3,5, de aproximadamente 3,6, de aproximadamente 3,7, de aproximadamente 3,8, de aproximadamente 3,9, de aproximadamente 4,0, de aproximadamente 4,1, de aproximadamente 4,2, de aproximadamente 4,3, de aproximadamente 4,4, de aproximadamente 4,5), de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 4,2 o de aproximadamente 4,5 a 5,5 (por ejemplo, de aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,6, de aproximadamente 4,7, de aproximadamente 4,8, de aproximadamente 4,9, de aproximadamente 5,0, de aproximadamente 5,1, de aproximadamente 5,2, de aproximadamente 5,3, de aproximadamente 5,4 o de aproximadamente 5,5).
La presente invencion proporciona un proceso mas eficaz para preparar composiciones de conjugados estables que comprenden un agente de union celular es decir, un anticuerpo que se acopla qulmicamente a un agente citotoxico es decir, un maitansinoide. En una realizacion, en comparacion con los procesos tradicionales para la preparacion de conjugados de un agente de union celular y un agente citotoxico, se necesita menor cantidad de agente citotoxico para alcanzar la misma razon molar promedio de agente citotoxico a agente de union celular para los conjugados.
Los agentes de union celular adecuados incluyen anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos).
Cuando el agente de union celular es un anticuerpo, se une a un antlgeno que es un polipeptido o un glicotopo y puede ser una molecula transmembrana (por ejemplo, receptor) o un ligando como un factor de crecimiento. Los antlgenos ejemplares incluyen moleculas tales como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona de estimulacion de la tiroides; lipoprotelnas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona follculo-estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulacion como el factor vmc, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes como la Protelna C; factor natriuretico auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, como uroquinasa u orina humana o activador de plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada al momento de la activacion normalmente expresada y secretada por celulas T); protelna inflamatoria de macrofago humana (MIP-1-alfa); una albumina serica, como albumina serica humana; sustancia inhibidora Muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; peptido asociado con la gonadotropina de ratones; una protelna microbiana, como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antlgeno asociado con el linfocito T citotoxico (CTLA), como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; protelna A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico, como un factor neurotrofico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento de nervios como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento de transformacion (TGF) como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-pb4 o TGF-p5; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I y IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral); protelnas de union al factor de crecimiento tipo insulina; EpCAM; GD3; FLt 3; PSmA; PSCA; Mu C1; Mu C16; STEa P; CEA; TENB2; receptores EphA; receptores EphB; receptor de folato; FOLR1; mesotelina; cripto; alfavbeta6; integrinas; VEGF; VEGFR; receptor EGFR de tarnsferrina; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; protelnas CD como CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 o un anticuerpo que se une a uno o mas antlgenos asociados con tumores o receptores de la superficie celular descritos en la Publication de EE.UU. N.° 2008/0171040 o la Publicacion de EE.UU. N.° 2008/0305044; eritropoyetina; factores osteoinductivos; immunotoxinas; una protelna morfogenetica osea (BMP); un interferon, como interferon alfa, beta y gamma; factores de estimulacion de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de celulas T; protelnas de membrana superficial; factor de aceleracion del deterioro; antlgenos virales como, por ejemplo, una parte de la envoltura del VIH; protelnas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; protelnas reguladoras; integrinas, como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antlgeno asociado con tumores como el receptor de HER2, HER3 o HER4; endoglina; c-Met; IGF1R; antlgenos prostaticos como PCA3, PSA, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, TMEFF2 y STEAP1; LGR5; B7H4; y fragmentos de cualquiera de los polipeptidos listados anteriormente.
Adicionalmente puede usarse GM-CSF, que se une a celulas mieloides, como agente de union celular para celulas enfermas de leucemia mielogena aguda. La IL-2 que se une a celulas T activadas se puede usar para la prevention del rechazo de injertos en trasplantes, para la terapia y la prevencion de la enfermedad de injerto contra el huesped y para el tratamiento de leucemia aguda de celulas T. Se pueden usar MSH que se unen a melanocitos, se puede usar para el tratamiento del melanoma, as! como anticuerpos dirigidos hacia melanomas. El acido folico se puede usar para dirigirse al receptor de folato expresado en tumores de ovarios y de otro tipo. El factor de crecimiento epidermico se puede usar para dirigirse a canceres escamosos como el de pulmon y el de cabeza y cuello. La somatostatina se puede usar para dirigirse a neuroblastomas y otros tipos tumorales.
El termino "anticuerpo" como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier inmunoglobulina, cualquier fragmento de inmunoglobulina, como Fab, Fab', F(ab')2, dsFv, sFv, minicuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos (Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960), Kim et al., Mol, Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006)), o inmunoglobulina quimerica, que se pueden unir a un antlgeno en la superficie de una celula (por ejemplo, que contiene una region determinante de complementariedad (CDR)). Se puede utilizar cualquier anticuerpo adecuado como el agente de union celular. Un experto en la materia entendera que la selection de un anticuerpo apropiado dependera de la poblacion celular diana. En este sentido, el tipo y numero de moleculas de la superficie celular (es decir, antlgenos) que se expresan selectivamente en una poblacion celular particular (tlpica y preferiblemente una poblacion celular enferma) regira la seleccion de un anticuerpo apropiado para ser utilizado en la composition inventiva. Se conocen los perfiles de expresion de la superficie celular para varios tipos celulares, incluyendo tipos de celulas tumorales, o, en caso de desconocerse, estos se pueden determinar utilizando tecnicas de rutina de biologla molecular e histoqulmica.
El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, pero preferentemente es un anticuerpo monoclonal. Como se utiliza en el presente documento, anticuerpo "policlonal" hace referencia a poblaciones heterogeneas de moleculas de anticuerpos, tlpicamente encontradas en suero de animales inmunizados. Anticuerpo "monoclonal" se refiere a poblaciones homogeneas de moleculas de anticuerpos que son especlficas para un antlgeno particular. Tlpicamente, los anticuerpos monoclonales son producidos por un clon simple de linfocitos B ("celulas B"). Se pueden obtener anticuerpos monoclonales utilizando varias tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, incluyendo tecnologla estandar de hibridoma (vease, por ejemplo, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). En resumen, el metodo de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales suele implicar inyectar a cualquier animal adecuado, tlpica y preferentemente un raton, un antlgeno (es decir, un "inmunogeno"). Despues el animal es sacrificado, y los linfocitos B que se alslan de su bazo se fusionan con las celulas de mieloma humano. Se produce una celula hlbrida (es decir, un "hibridoma"), la cual prolifera indefinidamente y secreta, de forma continua, titulaciones elevadas de anticuerpos con la especificidad deseada in vitro. Se puede utilizar cualquier metodo apropiado conocido en la tecnica para identificar celulas hibridoma que producen un anticuerpo con la especificidad deseada. Dichos metodos incluyen, por ejemplo, el ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), analisis de transferencia Western y radioinmunoensayo. La poblacion de hibridomas se analiza para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una unica especie de anticuerpo para el antlgeno. Dado que cada hibridoma es un clon derivado de la fusion con un unico linfocito B, todas las moleculas de anticuerpo que produce son identicas en cuanto a su estructura, incluyendo sus sitios de union al antlgeno y su isotipo. Tambien se pueden generar anticuerpos monoclonales utilizando otras tecnicas adecuadas incluyendo tecnologla de hibridoma-EBV (vease, por ejemplo Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2): 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121: 140-67 (1986)), sistemas de vectores de expresion bacteriofagos (vease, por ejemplo, Huse et al., Science, 246: 1275-81 (1989)), o bibliotecas de expresion en fagos que comprenden fragmentos de anticuerpos, como Fab y scFv (region variable de cadena simple) (vease, por ejemplo las patentes de EE.UU. 5.885.793 y 5.969.108, y las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales WO 92/01047 y WO 99/06587).
El anticuerpo monoclonal puede aislarse de o producirse en cualquier animal adecuado, pero preferentemente se produce en un mamifero, mas preferentemente un raton o un humano, y mas preferentemente un humano. Se conocen en la tecnica y se describen en el presente documento metodos para producir un anticuerpo en ratones. En lo que respecta a anticuerpos humanos, el experto en la tecnica entendera que se pueden aislar anticuerpos policlonales del suero de sujetos humanos vacunados o inmunizados con el antigeno adecuado. De manera alternativa, se pueden generar anticuerpos humanos adaptando tecnicas conocidas para producir anticuerpos humanos en animales que no son humanos, como ratones (vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, y la publicacion de solicitud de patente de EE.u U. N.° 2002/0197266 A1).
Mientras que son la opcion ideal para aplicaciones terapeuticas en humanos, los anticuerpos humanos, en especial los anticuerpos monoclonales humanos, son tipicamente mas dificiles de generar que los anticuerpos monoclonales de raton. Los anticuerpos monoclonales de raton, sin embargo, inducen una rapida respuesta de anticuerpos del huesped cuando se administran a humanos, lo que puede reducir el potencial diagnostico o terapeutico del conjugado de anticuerpo y agente citotoxico. Para evitar estas complicaciones, preferentemente un anticuerpo monoclonal no es considerado "extrano" por el sistema inmunitario humano.
Con este fin, puede utilizarse la expresion en fagos para generar el anticuerpo. En este sentido, las bibliotecas de fagos que codifican dominios variables (V) de union a antigenos para anticuerpos pueden generarse utilizando tecnicas de rutina de la biologia molecular y el ADN recombinante (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001)). Se seleccionan regiones variables de codificacion de fagos con la especificidad deseada para la union especifica al antigeno deseado, y se reconstituyen anticuerpos humanos completos que comprenden el dominio variable seleccionado. Se introducen secuencias de acido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido a una linea celular adecuada, como una celula de mieloma utilizada para la produccion de hibridomas, de manera tal que la celula secrete anticuerpos humanos con las caracteristicas de anticuerpos monoclonales (vease, por ejemplo, Janeway et al., supra, Huse et al., supra, y la patente de EE.UU. 6,265,150). De manera alternativa, se pueden generar anticuerpos monoclonales con ratones que sean transgenicos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada especificos para humanos. Dichos metodos son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 5.545.806 y 5.569.825 y en Janeway et al., supra.
Mas preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "humanizado" es uno en que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal de raton, que forman los lazos de union del anticuerpo, se injertan al marco de una molecula de anticuerpo humano. Dadas las similitudes en los marcos de los anticuerpos de raton y de humano, se acepta mayoritariamente en la tecnica que este metodo produce un anticuerpo monoclonal que es antigenicamente identico al anticuerpo humano, pero se une al mismo antigeno que el anticuerpo monoclonal de raton del que se derivaron las secuencias de CDR. Se describen detalladamente metodos conocidos en la tecnica para generar anticuerpos humanizados, por ejemplo, en Janeway et al., supra, las patentes de EE.UU. 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la patente europea n.° 0239400 B1, y la patente del Reino Unido n.° 2188638. Tambien se pueden generar anticuerpos humanizados utilizando la tecnologia de revestimiento de anticuerpos que se describe en la patente de EE.UU. 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235: 959-973 (1994). Mientras que el anticuerpo utilizado en el conjugado de la composicion inventiva es, mas preferentemente, un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal humano y un anticuerpo monoclonal de raton, como se describe anteriormente, tambien se encuentran dentro del alcance de la invencion.
Tambien se incluyen dentro del alcance de la invencion fragmentos de anticuerpos que tienen al menos un sitios de union de antigeno y que por lo tanto reconocen y se unen a al menos un antigeno o receptor que se encuentra en la superficie de la celula diana. En este sentido, la escision proteolitica de una molecula de anticuerpo intacta puede producir multiples fragmentos de anticuerpos que mantienen la capacidad de reconocer y unirse a antigenos. Por ejemplo, la digestion limitada de una molecula de anticuerpo con la papaina de proteasa tipicamente produce tres fragmentos, dos de los cuales son identicos y se los llama fragmentos Fab, ya que pueden mantener la actividad de union a antigenos de la molecula madre de anticuerpo. La escision de una molecula de anticuerpo con la enzima pepsina suele producir dos fragmentos de anticuerpo, uno de los cuales mantiene ambos brazos de union a antigenos de la molecula de anticuerpo, y por lo tanto se lo llama fragmento F(ab')2. La reduction de un fragmento F(ab')2 con ditiotereitol o mercaptoetilamina produce el fragmento que se llama fragmento Fab'. Se puede generar un fragmento de anticuerpo de region variable de cadena sencilla (sFv), que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unido a un domino V de una cadena ligera de anticuerpo mediante un peptido sintetico, utilizando tecnicas de rutina de tecnologia de ADN recombinante (vease, por ejemplo Janeway et al., supra). De manera similar, se pueden preparar fragmentos de region variable estabilizados con disulfuro (dsFv) usando tecnologia de ADN recombinante (vease, por ejemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7: 697-704 (1994)). Sin embargo, en el contexto de la invencion los fragmentos de anticuerpo no se ven limitados a estos ejemplos de tipos de fragmentos de anticuerpos. Se puede utilizar todo fragmento de anticuerpo adecuado que reconozca y se una a un receptor o antigeno deseado de la superficie de una celula. Los fragmentos de anticuerpos se describen adicionalmente, por ejemplo, en Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983), Spring et al., J. Immunol., 113: 470-478 (1974), y Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960). La union entre anticuerpos y antigenos se puede analizar utilizando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica como, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitacion y ensayos de inhibicion competitiva (vease, por ejemplo, Janeway et al., supra, y la publicacion de solicitud de patente de e E.UU. n.° 2002/0197266 A1).
A su vez, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimerico o un fragmento de union al antlgeno del mismo. Con "quimerico" quiere decirse que el anticuerpo comprende al menos dos inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas, obtenidas o derivadas de al menos dos especies diferentes (por ejemplo, dos inmunoglobulinas diferentes, como una region constante de inmunoglobulina humana combinada con una region variable de inmunoglobulina murina). El anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo de domino (dAb) o un fragmento de union al antlgeno del mismo como, por ejemplo, un anticuerpo camelido (vease, por ejemplo, Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3: 752, (1996)), o un anticuerpo de tiburon, como, por ejemplo, un nuevo receptor de antlgenos (IgNAR) (vease, por ejemplo, Greenberg et al., Nature, 374: 168 (1995), y Stanfield et al., Science, 305: 1770-1773 (2004)).
Puede usarse cualquier anticuerpo adecuado en el contexto de la invencion. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal J5 es un anticuerpo IgG2a murino que es especlfico para el antlgeno de leucemia linfoblastica aguda comun (CALLA) (Ritz et al., Nature, 283: 583-585 (1980)), y se puede utilizar para dirigirse a las celulas que expresan CALLA (por ejemplo, celulas de leucemia linfoblastica aguda). El anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une especlficamente a el antlgeno CD33 (Griffin et al., Leukemia Res., 8: 521 (1984)), y se puede utilizar para combatir celulas que expresan CD33 (por ejemplo celulas de leucemia mielogena aguda (AML)).
De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 (tambien llamado B4) es un anticuerpo IgG1 murino que se une al antlgeno CD19 en linfocitos B (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983)), y se puede utilizar para combatir linfocitos B o celulas enfermas que expresen CD19 (por ejemplo, celulas de linfoma no-Hodgkin y celulas de leucemia linfocltica cronica). el N901 es un anticuerpo monoclonal murino que se une al antlgeno CD56 (molecula de adhesion celular neural) presente en celulas de origen neuroendocrino, incluyendo tumores de pulmon de celulas pequenas, que pueden ser usadas en el conjugado para dirigir farmacos a celulas de origen neuroendocrino. Los anticuerpos J5, MY9 y B4 preferentemente se revisten o humanizan antes de ser utilizados como parte del conjugado. El revestimiento o la humanizacion de anticuerpos se describe, por ejemplo, en Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-73 (1994).
Ademas, el anticuerpo monoclonal C242 se une al antlgeno CanAg (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU.
5.552.293), y se puede utilizar para dirigir el conjugado a tumores que expresan CanAg, como pueden ser el cancer colorrectal, cancer pancreatico, cancer de pulmon de celulas no pequenas, y cancer gastrico. El HuC242 es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal C242 (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.552.293). El hibridoma a partir del cual se forma el HuC242 se encuentra registrado con el numero de identification ECACC 90012601. El HuC242 se puede preparar utilizando metodos de injerto de CDR (vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU.
5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762) o tecnologla de revestimiento (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.639.641). El HuC242 se puede utilizar para dirigir al conjugado hacia celulas tumorales que expresan el antlgeno CanAg como, por ejemplo, celulas de cancer colorrectal, pancreatico, de pulmon de celulas no microclticas y gastrico.
Para combatir celulas de cancer de ovario y cancer de prostata, puede utilizarse un anticuerpo anti-MUC1 como el agente de union celular en el conjugado. Los anticuerpos anti-MUC1 incluyen, por ejemplo, anti-HMFG-2 (vease, por ejemplo, Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981)), hCTM01 (vease, por ejemplo, van Hof et al., Cancer Res., 56: 5179-5185 (1996)), y DS6. Las celulas de cancer de prostata tambien pueden combatirse con el conjugado utilizando un antlgeno prostatico especlfico de membrana (PSMA) como el agente de union celular, como un J591 (vease, por ejemplo, Liu et al., Cancer Res., 57: 3629-3634 (1997)). Ademas, las celulas cancerosas que expresan el antlgeno Her2, tales como los canceres de seno, de prostata y de ovario, se pueden combatir con el conjugado usando anticuerpos anti-Her2, por ejemplo, trastuzumab, como el agente de union celular. Las celulas que expresan el factor de crecimiento epidermico (EGFR) y sus variantes, como un mutante por deletion tipo III, EGFRvIII, pueden combatirse con el conjugado usando anticuerpos anti-EGFR. Los anticuerpos anti-EGFR se describen en las solicitudes internacionales de patente n.° PCT/US11/058385 y PCT/US11/058378. Se describen anticuerpos anti-EGFRvIII en las patentes de EE.UU. 7.736.644 y 7.628.986, y en las publicaciones de solicitud de EE.UU.
2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790, y 2009/0155282. Los anticuerpos anti-IGF-IR que se unen al receptor de factor de crecimiento similar a la insulina, como los que se describen en la patente de EE.UU.
7.982.024, tambien se pueden usar en el conjugado. Tambien pueden usarse en el conjugado los anticuerpos que se unen a CD27L, Cripto, CD138, CD38, EphA2, integrinas, CD37, folato, CD20, PSGR, NGEP, PSCA, TMEFF2, STEAP1, endoglina, y Her3.
En una realization, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huN901, huMy9-6, huB4, huC242, un anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzumab), bivatuzumab, sibrotuzumab, rituximab, huDS6, anticuerpos antimesotelina descritos en la publicacion de solicitud de patente internacional WO 2010/124797 (como MF-T), anticuerpos anti-cripto descritos en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 2010/0093980 (como huB3F6), anticuerpos anti-CD138 descritos en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 2007/0183971 (como huB-B4), anticuerpos anti-EGFR descritos en las solicitudes de patente internacional n.° PCT/US11/058385 y PCT/US11/058378 (como EGFR-7), anticuerpos anti-EGFRvIII descritos en las patentes de EE.UU. 7.736.644 y 7.628.986 y las publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 y 2009/0155282, los anticuerpos humanizados EphA2 descritos en las publicaciones de solicitudes internacionales de patentes WO 2011/039721 y WO 2011/039724 (como 2H11R35R74); anticuerpos anti CD38 descritos en la publication de solicitud de patente internacional WO 2008/047242 (como hu38SB19), anticuerpos antifolato descritos en la publicacion de solicitud de patente internacional WO 2011/106528 y la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 2012/0009181 (por ejemplo, huMov19), anticuerpos anti-IGF1R descritos en las patentes de EE.UU. 5.958.872, 6.596.743, y 7.982.024; anticuerpos anti-CD37 descritos en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 2011/0256153 (por ejemplo, huCD37-3); anticuerpos anti-integrina av06 descritos en la publicacion de solicitud de EE.UU. 2006/0127407 (por ejemplo, CNTO95); y anticuerpos anti-Her3 descritos en la publicacion de solicitud de patente internacional w O 2012/019024.
Los anticuerpos particularmente preferidos son los anticuerpos monoclonales humanizados que se describen en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, huN901, huMy9-6, huB4, huC242, un anticuerpo monoclonal humanizado anti-Her2 (por ejemplo, trastuzumab), bivatuzumab, sibrotuzumab, CNTO95, huDS6, y rituximab (vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.639.641 y 5.665.357, la solicitud de patente de EE.UU. provisional n.° 60/424.332 (que esta conectada con la patente de EE.UU. 7.557.189), la publicacion de solicitud de patente internacional (PCT) WO 02/16401, Pedersen et al., supra, Roguska et al., supra, Liu et al., supra, Nadler et al., supra, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994), y Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)). Se conocen en la tecnica otros anticuerpos monoclonales humanizados y pueden utilizarse en relation con la invention.
En una realization, el agente de union celular es un anticuerpo anti-folato humanizado o un fragmento de antfgeno del mismo que se une especfficamente a un receptor de folato humano 1, donde el anticuerpo comprende: (a) un CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN; un CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3; y un CDR3 de cadena pesada que comprende YDg SrAMDY; y (b) un c Dr 1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH; un CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA; y un CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT; donde Xaa1 se selecciona de K, Q, H, y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N y R; y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. Preferentemente, la secuencia de CDR2 de cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG.
En otra realizacion, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o un fragmento de union al antfgeno del mismo que se une especfficamente al receptor de folato humano 1, que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de
Figure imgf000013_0001
En otra realizacion, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o un fragmento de union a antfgeno del mismo codificado por el ADN del plasmido registrado en el ATCC el 7 de abril de 2010, y que tiene como n.° de deposito en el ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra realizacion, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de union al antfgeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente un 90 %, un 95 %, un 99 % o un 100 % identica a
Figure imgf000013_0002
y un dominio variable de cadena ligera al menos aproximadamente un 90 %, un 95 %, un 99 % o un 100 % identico a
Figure imgf000014_0002
El agente citotoxico es un maitansinoide, incluyendo maitansinol y analogos de maitansinol. Los maitansinoides son compuestos que inhiben la formation de microtubulos y son altamente toxicos para las celulas mamfferas. Los ejemplos de analogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromatico modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 4.256.746, 4.294.757, 4.307.016, 4.313.946, 4.315.929, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.362.663, 4.364.866, 4.424.219, 4.371.533, 4.450.254, 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545 y 6.333.410.
Los ejemplos de analogos de maitansinol con un anillo aromatico modificado incluyen: (1) C-19-decloro (patente de EE.u U. 4.256.746) (preparado por reduction LAH de ansamitocina P2), (2) C-20-hidroxi (o C-20-demetilo) /-C-19-decloro (patentes de EE.UU. 4.361.650 y 4.307.016) (preparadas mediante desmetilacion utilizando Streptomyces o Actinomyces o decloracion utilizando LAH), y (3) C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /-decloro (patente de EE.UU.
4.294.757) (preparada mediante acilacion utilizando cloruros de acilo).
Los ejemplos de analogos de maitansinol con modificaciones de las posiciones que no son anillos aromaticos incluyen: (1) C-9-SH (patente de EE.UU. 4.424.219) (preparada mediante la reaction de maitansinol con H2S o P2S5), (2) C-14-alcoximetil (demetoxi/CH2OR) (patente de EE.UU. 4.331.598), (3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de EE.UU. 4.450.254) (preparada a partir de Nocardia), (4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente de EE.UU.
4.364.866) (preparada mediante la conversion de maitansinol por Streptomyces), (5) C-15-metoxi (patentes de EE.UU.
4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora), (6) C-18-N-demetilo (patentes de EE.UU. 4.362.663 y 4.322.348) (preparada mediante la desmetilacion de maitansinol por medio de Streptomyces), y (7) 4,5-deoxi (patente de EE.UU.
4.371.533) (preparada mediante reduccion de tricloruro de titanio/LAH de maitansinol).
En una realization preferida de la invention, el conjugado utiliza el maitansinoide DM1 que contiene tiol, tambien conocido como N2 ’-desacetil-N2 ’-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maitansina, como agente citotoxico. La estructura de DM1 esta representada por la formula (I):
Figure imgf000014_0001
En otra realizacion preferida de la invencion, el conjugado utiliza el maitansinoide DM4 que contiene tiol, tambien conocido como N2’-desacetil-N2’-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, como agente citotoxico. La estructura de DM4 esta representada por la formula (II):
Figure imgf000015_0001
Pueden usarse otros maitansinoides en el contexto de la invencion, incluyendo, por ejemplo, maitansinoides que contienen tiol o disulfuro que tienen una sustitucion mono o dialquilo en el atomo de carbono que porta el atomo de azufre. Se prefiere particularmente un maitansinoide que tiene en la posicion C-3 (a) funcionalidad de hidroximetilo C-14, hidroxi C-15 o desmetilo C-20 y (b) una cadena lateral de aminoacido acilada con un grupo acilo que tiene un grupo sulfhidrilo impedido, donde el atomo de carbono del grupo acilo que tiene la funcionalidad de tiol tiene uno o dos sustituyentes, dichos sustituyentes son CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y adicionalmente donde uno de los sustituyentes puede ser H, y donde el grupo acilo tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres atomos de carbono entre la funcionalidad de carbonilo y el atomo de azufre.
Los maitansinoides adicionales que pueden usarse en el contexto de la invencion incluyen los compuestos representados por la formula (III):
Figure imgf000015_0002
donde Y' representa (CR7R8) l(CR9=CR10)p(C=C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)s Bt(CR3R4)nCR1R2SZ,
donde R1 y R2 son cada uno independientemente CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico con 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 tambien puede ser H,
donde A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene de 3-10 atomos de carbono, arilo simple o sustituido, o un aromatico heterocfclico, o un radical de heterocicloalquilo,
donde R3 , R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , R9 , R10 , R11 y R12 son cada uno independientemente H, CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico con 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo,
donde l, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente cero o un entero de 1 a 5, con la condition de que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en ningun momento, y donde Z es H, SR o COR, donde R es un alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico con 3 a 10 atomos de carbono, o un arilo simple o sustituido o un aromatico heterocfclico, o un radical de heterocicloalquilo.
Las realizaciones preferidas de la formula (III) incluyen compuestos de la formula (III) donde (a) Ri es H, R2 es metilo y Z es H, (b) R i y R2 son metilo y Z es H, (c) Ri es H, R2 es metilo, y Z es -SCH 3 , y (d) Ri y R2 son metilo, y Z es -SCH3.
Dichos maitansinoides adicionales tambien incluyen compuestos representados por la formula (IV-L), (IV-D) o (IV-D, L):
Figure imgf000016_0001
donde Y representa (CR7 R8)l(CR5R6)m(CR3 R4)nCR i R2SZ, donde R i y R2 son cada uno independientemente CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de i a i0 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a i0 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 tambien puede ser H,
donde R3 , R4 , R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de i a i0 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a i0 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo,
donde l, m y n son cada uno independientemente un entero de i a 5, y ademas n puede ser cero, donde Z es H, SR, o COR donde R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de i a i0 atomos de carbono, alquilo o alquenilo cfclico que tiene de 3 a i0 atomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y
donde May representa un maitansinoide que porta una cadena lateral en C-3, hidroximetilo C-i4, hidroxi C -i5 o desmetilo C-20.
Las realizaciones preferidas de las formulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) incluyen compuestos de las formulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) donde (a) Ri es H, R2 es metilo, R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno i , n es 0, y Z es H, (b) R i y R2 son metilo, R5 , R6 , R7 , R8 son cada uno H, l y m son i , n es 0, y Z es H, (c) R i es H, R2 es metilo, R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno i , n es 0, y Z es -SCH3 , o (d) R i y R2 son metilo, R5 , R6 , R7 , R8 son cada uno H, l y m son i , n es 0, y Z es -SCH 3.
Preferentemente el agente citotoxico esta representado por la formula (IV-L).
Los maitansinoides adicionales preferidos tambien incluyen compuestos representados por la formula (V):
Figure imgf000016_0002
i6
donde Y represents (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3 R4)nCR i R2SZ,
donde Ri y R2 son cada una independientemente CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 tambien puede ser H,
donde R3 , R4, R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo,
donde l, m y n son cada uno independientemente un entero de 1 a 5, y ademas n puede ser cero,
y
donde Z es H, SR, o COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo.
Las realizaciones preferidas de la formula (V) incluyen compuestos de la formula (V) donde (a) R1 es H, R2 es metilo, R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es H, (b) R1 y R2 son metilo, R5 , R6 , R7 , R8 son cada uno H; l y m son 1; n es 0; y Z es H; (c) R1 es H, R2 es metilo; R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH 3 , o (d) R1 y R2 son metilo, R5 , R6 , R7 , R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es -SCH 3.
Los maitansinoides preferidos incluyen compuestos representados por la formula (VI-L), (VI-D), o (VI-D,L):
Figure imgf000017_0001
donde Y2 representa (CR7R8)l(CR5 R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2 ,
donde R1 y R2 son cada uno independientemente CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 tambien puede ser H,
donde R3 , R4 , R5 , R6 , R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal o cfclico que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, donde l, m y n son cada uno independientemente un entero de 1 a 5, y ademas n puede ser cero,
donde Z2 es SR, o COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cfclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un aromatico heterocfclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde May es la estructura macrocfclica de anillo del maitansinoide.
Los maitansinoides adicionales preferidos incluyen compuestos representados por la formula (VII):
Figure imgf000017_0002
donde Y2’ represents (CR7R8)i(CR9=CRi 0)p(C=C)qAo(CR5R6)mDu(CRi i =CRi 2)r(C=C)s Bt(CR3R4)nCRi R2SZ2 , donde Ri y R2 son cada uno independientemente CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal o ramificado de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo clclico con 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heteroclclico o un radical de heterocicloalquilo, y R2 tambien puede ser H,
donde A, B, D son cada uno independientemente cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, arilo simpe o sustituido, o un aromatico heteroclclico, o un radical de heterocicloalquilo, donde R3 , R4, R5 , R6, R7 , R8 , R9, R10 , R11 y R12 son cada uno independientemente H, CH3 , C2 H5 , alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o clclico con 3 a 10 atomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromatico heteroclclico o un radical de heterocicloalquilo,
donde l, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente cero o un entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en ningun momento, y
donde Z2 es SR o -COR, donde R es un alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o clclico con 3 a 10 atomos de carbono, o un arilo simple o sustituido o un aromatico heteroclclico, o un radical de heterocicloalquilo.
Las realizaciones preferidas de la formula (VII) incluyen compuestos de la formula (VII), donde Ri es H y R2 es metilo.
Los conjugados de agente de union celular y agente citotoxico pueden prepararse mediante metodos in vitro. Para poder unir un agente citotoxico al anticuerpo se usa un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados son conocidos en la tecnica e incluyen grupos disulfuro, grupos de acidos labiles, grupos fotolabiles, grupos de peptidasa labiles, y grupos de esterasa labiles, as! como grupos de enlace no escindibles. Por ejemplo, el agente de union celular puede estar acoplado qulmicamente al agente citotoxico por medio de enlaces qulmicos seleccionados del grupo que consiste en enlaces disulfuro, enlaces acidos labiles, enlaces fotolabiles, enlaces peptidasa labiles, enlaces tioeter y enlaces esterasa labiles.
De acuerdo con la invention, el agente de union celular se enlaza a un agente citotoxico por medio de un reactivo de reticulation bifuncional. Tales como se usa en el presente documento, un "reactivo de reticulation bifuncional" se refiere a un reactivo que posee dos grupos reactivos, uno de los cuales es capaz de reaccionar con un agente de union celular mientras que el otro es capaz de reaccionar con el agente citotoxico para unir el agente de union celular con el agente citotoxico, formando as! un conjugado.
Puede usarse cualquier reactivo de reticulacion bifuncional adecuado en conexion con la invencion, mientras el reactivo conector proporcione la retention del agente terapeutico, por ejemplo, citotoxicidad, y las caracterlsticas objetivo del agente citotoxico y del agente de union celular, respectivamente, sin toxicidad indebida. Preferentemente, la molecula conectora une al agente citotoxico con el agente de union celular a traves de enlaces qulmicos (tales como se describio anteriormente), de manera que el agente citotoxico y el agente de union celular se acoplen qulmicamente, (por ejemplo, unidos covalentemente) entre ellos.
En una realization, el reactivo de reticulacion bifuncional comprende conectores no escindibles. Un conector no escindible es cualquier resto qulmico que sea capaz de unir un agente citotoxico, tales como un maitansinoide, un taxano o un analogo de CC-1065, con un agente de union celular de forma estable y covalente. Por lo tanto, los conectores no escindibles son esencialmente resistentes a la escision inducida por acido, escision inducida por luz, escision inducida por peptidasa, escision inducida por esterasa y escision de enlace de disulfuro, en condiciones en las que el agente citotoxico o el agente de union a la celula permanece activo.
Los reactivos de reticulacion adecuados que forman conectores no escindibles entre un agente citotoxico y el agente de union celular son conocidos en la tecnica. En una realizacion, el agente citotoxico esta unido a un agente de union celular a traves de un enlace tioeter. Los ejemplos de conectores no escindibles incluyen conectores que tienen un resto basado en haloacetilo o maleimido para la reaction con el agente citotoxico. Dichos agentes de reticulacion bifuncionales son conocidos en la tecnica (veanse las publicaciones de patente de EE.UU. N° 2010/0129314, 2009/0274713, 2008/0050310, 20050169933, 2009/0274713, 2010/0129314 y aquellas disponibles de Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA) e incluyen, pero no se limitan a, 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), que es un analogo de “cadena larga” de SMCC (LC-SMCC), ester de N-succinimidilo del acido K-maleimidoundecanoico (KMUA), ester de N'succinimidilo del acido Y-maleimidobutlrico (GMBS), ester de N-hidroxisuccinimida del acido £-maleimidocaproico (EMCS), ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), ester de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), 4-(p-maleimidofenil)-butirato de N-succinimidilo (SMPB) y N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Los reactivos de reticulacion que comprenden un resto basado en halocetilo incluyen N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA), y 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP), bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2 , BM(PEO)3 , ester de N-(b-maleimidopropiloxi)succinimida (BMPS), acido 5-maleimidovalerico NHS, HBVS, acido 4-(4-N-maleimidofenil)-butlrico hidrazida^HCl (MPBH), Succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobismaleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihodroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), 4-(N-maleimido-metil)ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), ester de m Maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), ester de N-(Y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida (sulfo-GMBS), ester de N-(e-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido (sulfo-EMCS), ester de N-(kmaleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida (sulfo-KMUS), 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMPB), CX1-1, sulfo-Mal y PEGn-Mal. Preferentemente, el reactivo de reticulacion bifuncional es SMCC.
Figure imgf000019_0001
En una realizacion, el reactivo conector es un conector escindible. Los ejemplos de conectores escindibles adecuados incluyen conectores de disulfuro, conectores labiles de acido, conectores fotolabiles, conectores labiles de peptidasa y conectores labiles de estearasa. Los conectores que contienen disulfuro son conectores escindibles a traves del intercambio de disulfuro, que puede ocurrir en condiciones fisiologicas. Los conectores labiles de acido son conectores escindibles a pH acido. Por ejemplo, determinados compartimentos intracelulares, tales como endosomas y lisosomas, tienen un pH acido (pH 4-5), y proporcionan condiciones adecuadas para escindir conectores labiles de acido. Los conectores fotolabiles son utiles en la superfine corporal y en muchas cavidades corporales que son accesibles a la luz. Asimismo, la luz infrarroja puede penetrar el tejido. Los conectores labiles de peptidasa pueden usarse para escindir determinados peptidos dentro o fuera de las celulas (vease por ejemplo, Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 626-629 (1982), y Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989)). En una realizacion, el conector escindible se escinde bajo condiciones moderadas, es decir, condiciones dentro de una celula en la que la actividad del agente citotoxico no se ve afectada.
En otra realizacion, el agente citotoxico esta enlazado a un agente de union celular es decir, un anticuerpo a traves de un enlace de disulfuro. La molecula conectora comprende un grupo qulmico reactivo que puede reaccionar con el agente de union celular. Los grupos qulmicos reactivos preferidos para su reaccion con el agente de union celular son esteres de N-succinimidilo y esteres de N-sulfosuccinimidilo. Adicionalmente la molecula conectora comprende un grupo qulmico reactivo, preferentemente un grupo ditiopiridilo, que puede reaccionar con el agente citotoxico para formar un enlace disulfuro. Los reactivos de reticulacion bifuncionales que permiten el enlace del agente de union celular con el agente citotoxico a traves de los enlaces disulfuro son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, 3- (2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (vease, por ejemplo, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB) (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.563.304), 4- (2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) (vease, por ejemplo, numero de Registro CAS 341498-08-6), y N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) (vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de EE.UU. N.° 2009/0274713). En la tecnica se conocen otros reactivos de reticulacion bifuncionales que pueden usarse para introducir grupos disulfuro y se describen en las patentes de EE.UU. 6.913.748, 6.716.821 y en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. 2009/0274713 y 2010/0129314.
Otros reactivos de reticulacion que carecen de un atomo de azufre que forman conectores no escindibles pueden usarse tambien en el metodo de la invencion. Dichos conectores pueden derivar de restos a base de acido dicarboxllico. Los restos a base de acido dicarboxllico adecuados incluyen, pero no se limitan a, acidos a,wdicarboxllicos de la formula general (IX):
HOOC-Xi-Yn-Zm-COOH
(IX),
donde X es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 20 atomos de carbono, Y es un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo con 3 a 10 atomos de carbono, Z es un grupo aromatico sustituido o no sustituido con 6 a 10 atomos de carbono, o un grupo heteroclclico sustituido o no sustituido donde el heteroatomo se selecciona de N, O o S, y donde l, m y n son cada uno 0 o 1, siempre que l, m y n no sean todos cero al mismo tiempo.
Muchos de los conectores no escindibles divulgados en el presente documento se describen en detalle en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 2005/0169933 A1.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion pero, por supuesto, no deberlan entenderse como que limitan de manera alguna su alcance.
Ejemplo 1
Se hizo reaccionar el anticuerpo CD37-3 humanizado con el reactivo de reticulacion heterobifuncional SMCC y el maitansinoide DM1 usando un proceso descrito previamente (por ejemplo La patente de EE.UU. 5-208-020), as! como el proceso de una etapa que es el objeto de la presente solicitud.
Para el proceso descrito previamente, huCD37-3 (15 mg/ml) se hizo reaccionar primero con SMCC (exceso molar de 6,5 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo) para formar el anticuerpo modificado. La reaccion de modificacion se llevo a cabo a 16 °C en tampon de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,9) que contenla EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante 90 minutos. La reaccion se inactivo con acetato 1 M para ajustar el pH a 4,5 y el anticuerpo modificado se purifico usando una columna de resina Sephadex G-25F equilibrada y eluida con acetato de sodio 20 mM (pH 4,5) que contenla EDTA 2 mM. Despues de la purificacion, el anticuerpo modificado (5 mg/ml) se hizo reaccionar con el maitansinoide DM1 (exceso molar de 6,8 veces en relacion con la cantidad de anticuerpo; exceso de 1,3 veces en relacion con la cantidad medida de conector en el anticuerpo) para formar el anticuerpo conjugado. La reaccion de conjugacion se llevo a cabo a 20 °C en tampon de acetato de sodio 20 mM (pH 5,0) que contenla EDTA 2 mM y DMA al 5 % durante aproximadamente 20 horas. La mezcla de reaccion se purifico usando una columna de resina Sephadex G-25F equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0).
Para el proceso de la invencion, huCD37-3 (2,5 mg/ml) se mezclo con DM1 (exceso molar de 6,2 veces en relacion con la cantidad de anticuerpo) y despues con SMCC (exceso de 5,2 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo). La reaccion se llevo a cabo a 20 °C en tampon EPPS [acido 4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinpropanosulfonico] 50 mM (pH 8,1) que contenla EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante aproximadamente 2 horas. La reaccion se inactivo mediante la adicion de acetato 1 M para ajustar el pH a 5,0, Despues la mezcla de reaccion se retuvo a 2 - 8 °C durante aproximadamente 20 horas. Despues de la retencion, la mezcla de reaccion se filtro a traves de un filtro de PVDF de 0,2 |jm y se purifico y sometio a diafiltracion en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0) usando filtracion de flujo tangencial (TFF).
El conjugado derivado de los dos procesos se analizo mediante: espectroscopla UV para verificar la concentracion y la carga de agente citotoxico (relacion de maitansinoide respecto al anticuerpo, MAR); espectrometrla de masas para determinar el nivel de conector no conjugado; electroforesis SDS PAGE reducida para determinar el nivel de la especie no reducible; y SEC-HPLC para determinar el monomero conjugado; y estabilidad durante el almacenamiento respecto a la liberacion de maitansinoide libre y monomero del conjugado.
La concentracion y la relacion de maitansinoide respecto al anticuerpo (MAR) se determinaron mediante la medicion de la absorbancia del conjugado a 252 y 280 nm en un espectrofotometro UV-VIS y usando los coeficientes de extincion molar de DM1 y del anticuerpo a las dos longitudes de onda, para calcular las concentraciones molares del anticuerpo y de DM1.
El nivel de conector no conjugado de los conjugados se analizo mediante espectrometrla de masas: se midieron las areas de pico de la especie conjugada individual (incluyendo conjugados con o sin conectores no conjugados); se calculo el nivel de conector no conjugado mediante la proporcion de la suma de areas que contenlan conectores no conjugados (pesada mediante el numero de conectores) respecto a la suma de areas de todas las especies conjugadas (tambien pesada mediante el numero de conectores).
El nivel de especies no reducibles de los conjugados se analizo mediante electroforesis en gel SDS reducida: se midieron las areas pico de las especies de conjugados individuales reducidas (incluyendo cadena ligera reducida, cadena pesada reducida, cadena ligera-ligera reticulada, cadena ligera-pesada reticulada, etc.); en nivel de especies no reducibles se calculo mediante la proporcion de la suma de areas de especies no reducibles respecto a la suma de las areas de todas las especies.
El nivel de monomeros de los conjugados se analizo mediante HPLC de exclusion por tamano: las areas pico de especies de bajo peso molecular, monomeros, dlmeros y anadidos se midieron usando un detector de absorbancia a una longitud de onda de 252 nm o 280 nm; el nivel de monomero se calculo mediante la proportion de area de monomero respecto al area total.
La cantidad de maitansinoide libre presente en el conjugado se analizo mediante HPLC en doble columna (columnas HiSep y C18): las areas pico del total de especies de maitansinoide libre (eluido en el gradiente e identificado en comparacion con el tiempo de elusion con estandares conocidos) se midieron usando un detector de absorbancia a una longitud de onda de 252 nm; la cantidad de maitansinoide libre se calculo usando una curva estandar generada por las areas pico de la cantidad conocida de estandares.
Como se muestra en la Tabla 1 a continuation, el conjugado elaborado usando el proceso de la invention fue superior al elaborado usando el proceso previamente descrito, con respecto al conector no conjugado, especie no reducible y monomero del conjugado. A su vez, la estabilidad del conjugado elaborado mediante el proceso de la invencion resulto considerablemente superior con respecto a la liberation de maitansinoide libre despues de su almacenamiento durante cinco meses a 4 °C. Los niveles de monomeros de los conjugados elaborados mediante ambos procesos resultaron estables.
Tabla 1. Comparacion de propiedades clave del conjugado CD37-3 elaborado mediante el proceso de la invencion en
Figure imgf000021_0001
Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran un proceso mejorado para preparar conjugados de agente de union celular y agente citotoxico que tienen una pureza considerablemente alta. Ademas de las mejoras a la pureza y estabilidad del conjugado utilizando el proceso de la invencion, tambien se presentan mejoras en los tiempos de procesamiento y conveniencia, como resultado de la elimination de dos etapas del proceso (la reaction de modification y la purification del anticuerpo modificado).
Ejemplo 2
El anticuerpo huMov19 receptor de folato humanizado (vease la publication de solicitud de EE.UU. 2012/0009181) se hizo reaccionar con el reactivo de reticulation bifuncional sulfo-SPDB y el maitansinoide DM4 usando dos procesos descritos previamente, as! como el proceso mejorado que es el sujeto de la presente solicitud.
Para el Proceso A descrito anteriormente (proceso de dos etapas, por ejemplo Chari et al., US 5.208.020), se hizo reaccionar el anticuerpo huMov19 (20 mg/ml) en primer lugar con sulfo-SPDB (exceso molar de 5,7 veces en relation a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA, dimetilacetamida) para formar el anticuerpo modificado. La reaccion de modificacion se llevo a cabo a 20 °C en un tampon de EPPS (4-(acido 2-hidroxietil)piperazin-1-propansulfonico) 50 mM (pH 8,1) con 5 % DMA durante 180 minutos. El anticuerpo modificado se purifico usando una columna de resina Sephadex G-25F equilibrada y eluida en EPPS 50 mM (pH 8,1) con EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) 2 mM. Despues de la purificacion, el anticuerpo modificado (5,0 mg/ml) se hizo reaccionar con el maitansinoide DM4 (Disuelto en DMA; exceso molar de 9,7 veces en relacion a la cantidad del anticuerpo; exceso de 1,7 veces en relacion con la cantidad medida de conector en el anticuerpo) para formar el anticuerpo conjugado. La reaccion de conjugation se llevo a cabo a temperatura ambiente en EPPS 50 mM (pH 8,1) que contenla EDTA 2mM y DMA al 5 % durante aproximadamente 18 horas. Despues, la mezcla de reaccion se purifico usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0).
Para el Proceso B descrito anteriormente (proceso en un solo recipiente, Dai et al., patente de EE.UU. 7.811.572), se hizo reaccionar el anticuerpo huMov19 (10 mg/ml) en primer lugar con sulfo-SPDB (exceso molar de 4,9 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) para formar el anticuerpo modificado. La reaccion de modificacion se llevo a cabo a 20 °C en tampon de EPPS 50 mM (pH 7,5) que contenla EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante 60 minutos. El anticuerpo modificado no se purifico previo a la reaccion de conjugacion. En su lugar, el anticuerpo modificado sin purificar se hizo reaccionar a 10 mg/ml con el maitansinoide DM4 (exceso molar de 8,3 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) para formar el anticuerpo conjugado. La reaccion de conjugacion se llevo a cabo a temperatura ambiente en tampon EPPS 50 mM (pH 7,5) que contenla EDTA 2mM y DMA al 10 % durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reaccion se purifico usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0).
Para el proceso de la invencion en que se utilizo Sephadex G-25 (Proceso C, proceso en una sola etapa) para purificar el conjugado, se mezclo anticuerpo huMov19 (6,0 mg/ml) con DM4 (exceso molar de 9,7 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) y despues se anadio sulfo-SPDB (exceso molar de 5,7 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA). La reaccion se llevo a cabo a 20 °C en tampon de EPPS 50 mM (pH 8,1) que contenla EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante aproximadamente 20 horas. La mezcla de reaccion se purifico usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0).
Para el proceso de la invencion en que se utilizo filtracion de flujo tangencial (TFF) (Proceso D, proceso en una sola etapa) para purificar el conjugado, se mezclo anticuerpo huMov19 (5,0 mg/ml) con DM4 (exceso molar de 10,2 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) y despues con sulfo-SPDB (exceso molar de 6,0 veces en relacion a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA). La reaccion se llevo a cabo a 20 °C en tampon de EPPS 50 mM (pH 8,5) que contenla EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante aproximadamente 20 horas. Despues, la mezcla de reaccion se purifico y se lo sometio a diafiltracion utilizando una TFF en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0).
El conjugado derivado de los diferentes procesos se analizo mediante: Espectroscopla UV (para concentration y la relacion de maitansinoide respecto a anticuerpo, MAR); HPLC de fase inversa para determinar los maitansinoides libres; Espectrometrla de masas para la determination de niveles de conectores sin conjugar perfil de distribution de masa; electroforesis SDS PAGE reducida para determinar el nivel de especies no reducibles; electroforesis SDS PAGE no reducida para la determinacion del nivel de fragmentation; SEC-HPLC para determinar los monomeros del conjugado. La estabilidad durante el almacenamiento se evaluo en lo que refiere al monomero del conjugado y la liberation de maitansinoide libre. Se suministra information adicional sobre las metodologlas anallticas en el Ejemplo 1,
Como se muestra en la Tabla 2, a continuation, el conjugado elaborado usando el proceso de la invencion fue superior al elaborado usando los procesos previamente descritos con respecto al monomero. El conjugado elaborado utilizando los procesos de un recipiente y una etapa en que la purification final del conjugado se realizo utilizando Sephadex G-25, Procesos B y C, respectivamente, presentaron un nivel mas alto de maitansinoide libre que el conjugado elaborado utilizando el proceso de dos etapas, Proceso A. Sin embargo, cuando se utilizo un proceso de purificacion final diferente, TFF (Proceso D), el nivel de maitansinoide libre fue muy bajo y comparable con el encontrado en los procesos de dos etapas, ambos despues de la purificacion inicial y despues del almacenamiento a 4 °C durante seis semanas. En lo que respecta a los otros atributos importantes del conjugado (por ejemplo fragmentacion, especies no reducibles, perfil de distribucion de masa y conector sin conjugar), el conjugado elaborado utilizando el proceso de la invencion fue equivalente al elaborado mediante los procesos descritos anteriormente.
Tabla 2. Comparacion de propiedades clave del conjugado huMov19 elaborado mediante el proceso de la invencion n m r i n n r n ri r .
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
* Purificado con Sephadex G-25
** Purificado utilizando TFF
Los resultados de los experimented reflejados en este ejemplo demuestran un proceso mejorado para preparar conjugados de agente de union celular y agente citotoxico que tienen una pureza considerablemente alta. Ademas de las mejoras a la pureza y estabilidad del conjugado utilizando el proceso de la invencion, tambien se presentan mejoras en los tiempos de procesamiento y conveniencia, como resultado de la eliminacion de dos etapas del proceso (la reaccion de modificacion y la purificacion del anticuerpo modificado).
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra que el proceso en una sola etapa que se describe en el presente documento puede utilizarse para elaborar conjugados a partir de diversos conectores y agentes citotoxicos de maitansinoide.
El anticuerpo humanizado huN901 se mezclo con maitansinoide (DM1 o DM4) y despues con un conector (Sulfo-SMCC, SMCC, SPDB, o SPP). La reaccion se realizo a 20 °C en tampon de fosfato 50 mM (pH 7,5) que contenla EDTA 2 mM y 10 % DMA durante aproximadamente 20-24 horas. La mezcla de reaccion despues se purifico usando una columna de resina G25F Sephadex, equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5,0).
Como se muestra en la Tabla 3 a continuation, la reaccion en una sola etapa puede realizarse con diferentes combinaciones de conector y maitansinoide y producir un conjugado con buenos niveles de MAR y de monomeros.
T l . El r i n n iliz n if r n m in i n n r m i n in i
Figure imgf000023_0002
El uso de los terminos “un”, “una” y “el” y referentes similares utilizados en el contexto de la description de la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se deben interpretar como abarcativos tanto del singular como del plural, salvo que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. Los terminos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como terminos abiertos (esto es, como que significan "que incluye, pero no se limitan a"), a menos que se indique lo contrario. La mention de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como un metodo taquigrafico para referirse individualmente a cada valor separado que esta dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los metodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado, salvo que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cualquiera de los ejemplos o las expresiones de ejemplo (por ejemplo, "tales como") que se proporcionan en el presente documento, pretende meramente esclarecer la invencion y no representa una limitation al alcance de la invencion, a menos que se reivindique lo contrario. No se debe interpretar ninguna expresion en la memoria descriptiva como una indication de que algun elemento no reivindicado es esencial para la puesta en practica de la invencion.
Las realizaciones preferidas de la misma invencion se describen en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para desarrollar la invencion. Las variaciones de esas realizaciones preferidas seran evidentes para los expertos en la tecnica tras la lectura de la descripcion que antecede. Los inventores esperan que los expertos utilicen tales variaciones segun sea apropiado y pretenden que la invencion se practique de una forma diferente a la que se describe especlficamente en el presente documento. Por lo tanto, la presente invencion incluye todas las modificaciones y los equivalentes de la materia mencionada en las reivindicaciones adjuntas al presente documento segun permita la legislation pertinente. Adicionalmente, toda combination de los elementos listados anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos se encuentra incluida en la invencion, salvo que se indique lo contrario en el presente documento o que lo contradiga claramente el contexto.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para preparar un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende la etapa de:
(a) poner en contacto un anticuerpo con un maitansinoide para formar una primera mezcla que comprende el anticuerpo y el maitansinoide, despues poner en contacto la primera mezcla con un reactivo de reticulacion bifuncional que comprende un conector, en una solucion que tiene un pH de 4 a 9 para proporcionar una segunda mezcla que comprende (i) el conjugado de anticuerpo y maitansinoide, donde el anticuerpo esta acoplado qulmicamente a traves del conector al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre, y (iii) subproductos de reaccion.
2. El proceso de la reivindicacion 1, donde el proceso comprende adicionalmente la etapa de:
(b) purificar la segunda mezcla que comprende el conjugado de anticuerpo y maitansinoide para proporcionar un conjugado de anticuerpo y maitansinoide purificado.
3. El proceso de la reivindicacion 2, done la segunda mezcla se purifica al someter la mezcla a filtracion de flujo tangencial, precipitacion selectiva, filtracion de adsorcion, cromatografla de adsorcion, cromatografla de no adsorcion o una combinacion de las mismas, para purificar el conjugado de anticuerpo y maitansinoide del maitansinoide libre y de los subproductos de reaccion, preferentemente la segunda mezcla se purifica al someter la mezcla a filtracion de flujo tangencia.
4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la puesta en contacto en la etapa (a) se efectua proporcionando el agente de union celular en un recipiente de reaccion, anadiendo el maitansinoide al recipiente de reaccion para formar la primera mezcla que comprende el anticuerpo y el maitansinoide, y despues anadiendo el reactivo de reticulacion bifuncional a la primera mezcla.
5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, que comprende adicionalmente retener la segunda mezcla entre las etapas (a) - (b) para liberar los conectores unidos de manera inestable del anticuerpo y/o inactivar la segunda mezcla entre las etapas (a) - (b) para inactivar cualquier maitansinoide sin reaccionar y/o reactivo de reticulacion bifuncional sin reaccionar.
6. El proceso de la reivindicacion 5, donde la segunda mezcla se retiene durante aproximadamente 20 horas a una temperatura de 2° C a 8° C.
7. El proceso de la reivindicacion 5, donde la mezcla se inactiva poniendo en contacto de la segunda mezcla con un reactivo de inactivacion que reacciona con el maitansinoide libre.
8. El proceso de la reivindicacion 7, donde el reactivo de inactivacion se selecciona del grupo que consiste en acido 4-maleimidobutlrico, acido 3-maleimidopropionico, N-etilmaleimida, yodoacetamida y acido yodoacetamidopropionico.
9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el contacto en la etapa (a) se produce en una solucion que tiene un pH de 7 a 9.
10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el contacto en la etapa (a) se produce a una temperatura de 16 °C a 24 °C o de 0 °C a 15 °C.
11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, preferentemente un anticuerpo monoclonal humanizado.
12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huN901, huMy9-6, huB4, huC242, trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, CNTO95, huDS6, rituximab, anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD27L, anti-EGFRvlll, Cripto, anti-CD138, anti-CD38, anti-EphA2, anticuerpo dirigido a integrina, anti-CD37, anti-folato, anti-Her3 y anti-IGFIR.
13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el maitansinoide es N2’-desacetil-N2’-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1) o N2’-desacetil-N2’-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4).
14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el anticuerpo esta acoplado qulmicamente al maitansinoide por medio de enlaces qulmicos seleccionados del grupo que consiste en enlaces disulfuro, enlaces acidos labiles, enlaces fotolabiles, enlaces peptidasa labiles, enlaces tioeter y enlaces estearasa labiles.
15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el reactivo de reticulacion bifuncional comprende un resto de ester de N-succinimidilo, un resto de ester de N-sulfosuccinimidilo, un resto a base de maleimido o un resto a base de haloacetilo, preferentemente el reactivo de reticulacion bifuncional se selecciona del grupo que consiste en SPDP, SPP, SPd B, sulfo-SPDB, SMCC, PEG-mal, sulfo-Mal y CX1-1; donde
PEG-Mal es:
Figure imgf000032_0001
sulfo-Mal es
Figure imgf000032_0002
y CX1-1 es:
Figure imgf000032_0003
16. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde la solucion en la etapa (a) comprende sacarosa y/o un agente tamponante seleccionado del grupo que consiste en un tampon citrato, un tampon acetato, un tampon succinato, un tampon fosfato, HEPPSO (acido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-hidroxipropanosulfonico)), POPSO (deshidrato de piperazina-1,4-bis-(acido 2-hidroxi-propano-sulfonico)), HEPES (acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfonico), HEPPS (EPPS) (acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-propanosulfonico), TES (acido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfonico) y una combination de los mismos.
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