MX2013011215A - Preparacion de conjugados de maitansinoides y anticuerpos mediante un proceso de una etapa. - Google Patents

Preparacion de conjugados de maitansinoides y anticuerpos mediante un proceso de una etapa.

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Abstract

La invención proporciona un proceso de una etapa para preparar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico que comprende poner en contacto un agente de unión celular con un agente citotóxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, y poner en contacto la primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con un reactivo de reticulación bifuncional que proporciona un enlazador, en una solución que tiene un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9, para proporcionar una segunda mezcla que comprende el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico, donde el agente de unión celular se acopla químicamente a través del enlazador al agente citotóxico, agente citotóxico libre y subproductos de reacción. La segunda mezcla luego se somete opcionalmente a purificación para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico purificado.

Description

PREPARACIÓN DE CONJUGADOS DE MAITANSINOIDES Y ANTICUERPOS MEDIANTE UN PROCESO DE UNA ETAPA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense N.° 61/468, 997, presentada el 29 de marzo de 2011, la cual se incorporan mediante esta referencia.
INCORPORACIÓN MEDIANTE ESTA REFERENCIA DE MATERIAL PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE Se incorpora en la presente mediante esta referencia un listado de secuencias de nucleótido/ aminoácidos legible en computadora identificado como sigue: Un archivo ASCII de 9,233 Bytes (Texto) nombrado "710088SequenceListing.TXT" creado el 3 de abril de 2013.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los conjugados de anticuerpos y fármacos (ADC) que resultan útiles en el tratamiento de cáncer y otras enfermedades, suelen componerse de tres elementos diferenciados: agentes de unión celular, un enlazador y un agente citotóxico. El método convencional para conjugar un agente de unión celular, tal como un anticuerpo, con un agente citotóxico, emplea dos etapas de reacción distintas con el anticuerpo. En la primera etapa de reacción (la etapa de modificación), el anticuerpo se hace reaccionar con un enlazador heterobifuncional para producir un anticuerpo modificado por enlazador. El producto de anticuerpo modificado entonces se purifica opcionalmente del exceso de enlazador o de reactivo de enlazador hidrolizado. En la segunda etapa de reacción (la etapa de conjugación), el anticuerpo modificado con enlazador se hace reaccionar con el agente citotóxico que contiene un grupo reactivo, tal como tiol, para generar el conjugado de anticuerpo y agente citotóxico, el cual nuevamente se purifica en una etapa de purificación adicional.
Los procesos que se han descrito previamente para la elaboración de los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico son complejos porque están cargados de etapas que son engorrosas de realizar o producen inmunoconj ugados que son menos puros o menos estables que los óptimos deseados. Por lo tanto, sería conveniente modificar o eliminar una o más etapas de elaboración a la vez que se mejora la calidad del producto, tal como la pureza y/o la estabilidad.
En vista de lo antemencionado, existe la necesidad en la técnica de desarrollar procesos mejorados para preparar conjugados de agente de unión celular y agente citotóxico que tengan una pureza sustancialmente alta, y que se puedan preparar evitando etapas engorrosas, y mediante la reducción del tiempo y del costo para el usuario. La invención proporciona un proceso de este tipo. Estas y otras ventajas de la invención, asi como otras características inventivas, se desprenderán de la descripción de la invención que se proporciona en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un proceso para preparar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico que comprende la etapa de poner en contacto un agente de unión celular con un agente citotóxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, y luego poner en contacto la primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con un reactivo de reticulación bifuncional que comprende un enlazador, en una solución que tiene un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9, para proporcionar una mezcla que comprende (i) el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico, donde el agente de unión celular se acopla químicamente a través del enlazador al agente citotóxico, (ii) agente citotóxico libre y (iii) subproductos de reacción. El proceso puede comprender adicionalmente la etapa de purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico purificado.
Los procesos de la presente invención proporcionan un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico con alta pureza y/o estabilidad. Para lograr la alta pureza y/o estabilidad del conjugado, es esencial que el agente citotóxico se ponga en contacto con el agente de unión celular primero para formar una mezcla que comprenda el agente de unión celular y el agente citotóxico, antes de que la mezcla se ponga en contacto con un reactivo de reticulación bifuncional.
La presente invención incluye también un conjugado que comprende un agente de unión celular que se acopla químicamente a un agente citotóxico preparado conforme a los proceso descritos en la presente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un proceso de una etapa para preparar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico. El proceso comprende poner en contacto un agente de unión celular (por ejemplo, un anticuerpo) con un agente citotóxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, y luego poner en contacto la primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con un reactivo de reticulación bifuncional que comprende un enlazador, en una solución que tiene un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9, para proporcionar una segunda mezcla que comprende el conjugado de agente de unión celular y agente citotoxico, agente citotoxico libre y subproductos de reacción, donde el agente de unión celular se acopla químicamente al agente citotoxico a través del enlazador. La segunda mezcla luego se somete a purificación para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotoxico purificado.
En una modalidad, la puesta en contacto se efectúa mediante la proporción del agente de unión celular, luego se pone en contacto en agente de unión celular con el agente citotoxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotoxico, y luego se pone en contacto la primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotoxico con el reactivo de reticulación bifuncional. Por ejemplo, en una modalidad, el agente de unión celular se coloca en un recipiente de reacción, el agente citotoxico se agrega al recipiente de reacción (que entra de esta manera en contacto con el agente de unión celular), y luego se agrega el reactivo de reticulación bifuncional a la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotoxico (que entra de esta manera en contacto con la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotoxico). En una modalidad, se proporciona el agente de unión celular en un recipiente de reacción, y se agrega el agente citotóxico al recipiente de reacción inmediatamente después de colocar el agente de unión celular al recipiente. En otra modalidad, se coloca el agente de unión celular en un recipiente de reacción, y el agente citotóxico se agrega al recipiente de reacción después de un intervalo de tiempo luego de colocar el agente de unión celular en el recipiente (por ejemplo, alrededor de 5 minutos, alrededor de 10 minutos, alrededor de 20 minutos, alrededor de 30 minutos, alrededor de 40 minutos, alrededor de 50 minutos, alrededor de 1 hora, alrededor de 1 día o más después de ¦ colocar el agente de unión celular en el receptáculo) . El agente citotóxico se pude agregar rápidamente (es decir, dentro de un intervalo de tiempo corto, tal como alrededor de 5 minutos, alrededor de 10 minutos) o lentamente (tal como mediante el uso de una bomba ) .
La mezcla que comprende un agente de unión celular y un agente citotóxico puede entonces ponerse en contacto con el reactivo de reticulación bifuncional, ya sea inmediatamente después de poner en contacto el agente de unión celular con el agente citotóxico o en un momento posterior (por ejemplo, alrededor de 5 minutos 'a alrededor de 8 horas o más) después de poner en contacto el agente de unión celular con el agente citotóxico. Por ejemplo, en una modalidad, el reactivo de reticulación bifuncional se agrega a la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico inmediatamente después de la adición del agente citotóxico al recipiente de reacción que comprende el agente de unión celular. De manera alternativa, la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico puede ponerse en contacto con el reactivo de reticulación bifuncional alrededor de 5 minutos, alrededor de 10 minutos, alrededor de 20 minutos, alrededor de 30 minutos, alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, alrededor de 4 horas, alrededor de 5 horas, alrededor de 6 horas, alrededor de 7 horas, alrededor de 8 horas o más después de poner en contacto el agente de unión celular con el agente citotóxico.
En otra modalidad, el agente citotóxico y el agente bifuncional se agregan en múltiples ciclos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más ciclos) . Por ejemplo, la invención proporciona un proceso que comprende las etapas de: a) poner en contacto el agente de unión celular con el agente citotóxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico; y luego poner en contacto la primera mezcla con un reactivo de reticulación bifuncional que comprende un enlazador, en una solución que tiene un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 para proporcionar una segunda mezcla que comprende el conjugado de g agente de unión celular y agente citotóxico, agente citotóxico libre, y subproductos de reacción, donde el agente de unión celular está acoplado químicamente a través del enlazador al agente citotóxico; b) poner en contacto la segunda mezcla con el agente citotóxico para formar una tercera mezcla; y luego poner en contacto la tercera mezcla con el reactivo de reticulación bifuncional a un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 para proporcionar una cuarta mezcla; y c) purificar la cuarta mezcla para proporcionar el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico purificado. En una modalidad, la etapa b) se lleva a cabo después de un intervalo de tiempo (por ejemplo, alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas o más) después de la etapa a). En otra modalidad, la etapa b) se puede repetir varias veces (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más veces) antes de llevar a cabo la etapa c) . La etapa b) adicional se puede llevar a cabo después de un intervalo de tiempo (por ejemplo, alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas o más) después de la etapa b) inicial.
En otra modalidad, el reactivo de reticulación bifuncional se agrega después de que se completa la adición del agente citotóxico. Por ejemplo, en una modalidad, el agente citotóxico se agrega al agente de unión celular de manera continua durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante alrededor de 5 minutos, alrededor de 10 minutos, alrededor de 30 minutos, alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas o más) para formar una mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico. Antes de que la adición del agente citotóxico esté completa, se agrega el reactivo de reticulación bifuncional a la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, siempre que el agente citotóxico esté en todo momento en exceso molar respecto al reactivo de reticulación bifuncional. En una modalidad, el reactivo de reticulación bifuncional se agrega de manera continua durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante alrededor de 5 minutos, alrededor de 10 minutos, alrededor de 30 minutos, alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, o más ) .
Después de que la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico se pone en contacto con el reactivo de reticulación bifuncional, la reacción se deja continuar durante alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, alrededor de 4 horas, alrededor de 5 horas, alrededor de 6 horas, alrededor de 7 horas, alrededor de 8 horas, alrededor de 9 horas, alrededor de 10 horas, alrededor de 11 horas, alrededor de 12 horas, alrededor de 13 horas, alrededor de 14 horas, alrededor de 15 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 17 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 19 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas o más (por ejemplo, alrededor de 30 horas, alrededor de 35 horas, alrededor de 40 horas, alrededor de 45 horas o alrededor de 48 horas).
La puesta en contacto el agente de unión celular con el agente citotóxico y luego el reactivo de reticulación bifuncional (es decir, la etapa de reacción) ocurre en una solución que' tiene un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 (por ejemplo, alrededor de 4, alrededor de 4.5, alrededor de 5, alrededor de 5.5, alrededor de 6, alrededor de 6.5, alrededor de 7, alrededor de 7.5, alrededor de 8, alrededor de 8.5, o alrededor de 9). En una modalidad, la etapa de reacción ocurre en una solución que tiene un pH de alrededor de 6 o menos (por ejemplo, alrededor de 4 a alrededor de 6, alrededor de 4 a alrededor de 5.5, o alrededor de 4.5 a alrededor de 5.5).
En otra modalidad, el proceso de la invención comprende poner en contacto un agente de unión celular con un agente citotóxico y luego un reactivo de reticulación bifuncional en una solución que tiene un pH de alrededor de 6 o más (por ejemplo, alrededor de 6 a alrededor de 9, alrededor de 6 a alrededor de 7, alrededor de 7 a alrededor de 9, alrededor de 7 a alrededor de 8.5, alrededor de 7.5 a alrededor de 8.5, alrededor de 7.5 a alrededor de 8.0, alrededor de 8.0 a alrededor de 9.0, o alrededor de 8.5 a alrededor de 9.0). Por ejemplo, el proceso de la invención comprende poner en contacto el agente de unión celular con un agente citotóxico y un reactivo de reticulación bifuncional en una solución que tiene un pH de alrededor de 6.0, alrededor de 6.1, alrededor de 6.2, alrededor de 6.3, alrededor de 6.4, alrededor de 6.5, alrededor de 6.6, alrededor de 6.7, alrededor de 6.8, alrededor de 6.9, alrededor de 7.0, alrededor de 7.1, alrededor de 7.2, alrededor de 7.3, alrededor de 7.4, alrededor de 7.5, alrededor de 7.6, alrededor de 7.7, alrededor de 7.8, alrededor de 7.9, alrededor de 8.0, alrededor de 8.1, alrededor de 8.2, alrededor de 8.3, alrededor de 8.4, alrededor de 8.5, alrededor de 8.6, alrededor de 8.7, alrededor de 8.8, alrededor de 8.9 o alrededor de 9.0. En una modalidad especifica, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y un reactivo de reticulación bifuncional en una solución con un pH de alrededor de 7.8 (p. e . , un pH de 7.6 a 8.0 o un pH de 7.7 a 7.9).
El proceso de la invención comprende llevar a cabo la reacción en una etapa (es decir, poner en contacto un agente de unión celular con un agente citotoxico y luego un reactivo de reticulación bifuncional) a cualquier temperatura adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, la reacción de un paso puede ocurrir a alrededor de 20 °C o menos (por ejemplo, alrededor de -10 °C (siempre que no se permita que la solución se congele, por ejemplo, mediante la presencia de un solvente orgánico usado para disolver el agente citotóxico y el reactivo de reticulación bifuncional) a alrededor 20 °C, alrededor- de 0 °C a alrededor de 18 °C, alrededor de 4 °C a alrededor de 16 °C) , a temperatura ambiente (por ejemplo, alrededor de 20 °C a alrededor de 30 °C, o alrededor de 20 °C a alrededor de 25 °C) , o a una temperatura elevada (por ejemplo, alrededor de 30 °C a alrededor de 37 °C) . En una modalidad, la puesta en contacto de un agente de unión celular con un agente citotóxico y un reactivo de reticulación bifuncional ocurre a una temperatura de alrededor de 16 °C a alrededor de 24 °C (por ejemplo, alrededor de 16 °C, alrededor de 17 °C, alrededor de 18 °C, alrededor de 19 °C, alrededor de 20 °C, alrededor de 21 °C, alrededor de 22 °C, alrededor de 23 °C, alrededor de 24 °C o alrededor de 25 °C) .
En otra modalidad, la puesta en contacto de un agente de unión celular con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional ocurre a una temperatura de alrededor de 15 °C o menos (por ejemplo, alrededor de -10 °C a alrededor de 15 °C, o de alrededor de 0 °C a alrededor de 15 °C) . En este sentido, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional a una temperatura de 15 °C, alrededor de 14 °C, alrededor de 13 °C, alrededor de 12 °C, alrededor de 11 °C, alrededor de 10 °C, alrededor de 9 °C, alrededor de 8 °C, alrededor de 7 °C, alrededor de 6 °C, alrededor de 5 °C, alrededor de 4 °C, alrededor de 3 °C, alrededor de 2 °C, alrededor de 1 °C, alrededor de 0 °C, alrededor de -1 °C, alrededor de -2 °C, alrededor de -3 °C, alrededor de -4 °C, alrededor de -5 °C, alrededor de -6 °C, alrededor de -7 °C, alrededor de -8 °C, alrededor de -9 °C, o alrededor de -10 °C, siempre que se evite que la solución se congele, p. ej . , mediante la presencia de solventes orgánicos usados para disolver el reactivo de reticulación bifuncional. En una modalidad, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional a una temperatura de alrededor de -10 °C a alrededor de 15 °C, alrededor de 0 °C a alrededor de 15 °C, alrededor de 0 °C a alrededor de 10 °C, alrededor de 0 °C a alrededor de 5 °C, alrededor de 5 °C a alrededor de 15 °C, alrededor de 10 °C a alrededor de 15 °C, o alrededor de 5 °C a alrededor de 10 °C. En otra modalidad, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional a una temperatura de alrededor de 10 °C (p. ej . , una temperatura de 8 °C a 12 °C o una temperatura de 9 °C a 11 °C) .
En una modalidad, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional en una solución con un pH alto (p. ej . , alrededor de 7 o mayor) a una baja temperatura (p. ej . alrededor de 15 °C o menor). Por ejemplo, en una modalidad, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional en una solución con un pH de alrededor de 7.5 a una temperatura de alrededor de 15 °C, en una solución con un pH de alrededor de 7.8 a una temperatura de alrededor de 10 °C, en una solución con un pH de 8.2 a una temperatura de alrededor de 0 °C o en una solución con un pH de 8.5 a una temperatura de alrededor de 0 °C. En otra modalidad, el proceso inventivo comprende poner un agente de unión celular en contacto con un agente citotóxico y luego con un reactivo de reticulación bifuncional en una solución con un pH 7.0 a 8.5 (p. ej . Un pH de 7.5 a 8.0) a una temperatura 5 °C a 15 °C.
En una modalidad, el proceso de la invención comprende adicionalmente una etapa de inactivación para inactivar cualquier agente citotóxico sin reaccionar y/o reactivo de reticulación bifuncional sin reaccionar. La etapa de inactivación se lleva a cabo antes de la purificación del agente de unión celular y agente citotóxico. Por ejemplo, el proceso de la invención comprende (a) poner en contacto a un agente de unión celular con un agente citotóxico para formar una mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, y después poner en contacto la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con un reactivo de reticulación bifuncional, que comprende un enlazador, en una solución con un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 para proporcionar una mezcla que comprende (i) el congujado de agente de unión celular y agente citotóxico, donde el agente de unión celular está acoplado químicamente al agente citotóxico mediante el enlazador, (ii) agente citotóxico libre y (iii) subproductos de la reacción, (b) inactivar la mezcla preparada, en la etapa (a) para inactivar cualquier agente citotóxico sin reaccionar y/o cualquier reactivo de reticulación bifuncional sin reaccionar, y (c) purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotoxico.
En una modalidad, la mezcla se inactiva mediante la puesta en contacto de la mezcla con un reactivo de inactivación. Tal como se usa en la presente, el "reactivo de inactivación" se refiere a un reactivo que reacciona con el reactivo de reticulación bifuncional y/o el agente citotóxico libre .
En una modalidad, los reactivos de inactivación de maleimida o haloacetamida, tal como ácido 4-maleimidobutírico, ácido 3-maleimidopropiónico, N-etilmaleimida, yodoacetamida o ácido yodoacetamidopropionico, pueden usarse para asegurarse de que se inactive cualquier grupo sin reaccionar (tal como tiol) en el agente citotóxico. La etapa de inactivación puede ayudar a prevenir la dimerización del agente citotóxico, en particular del agente citotóxico que tiene un grupo tiol sin reaccionar (tal como DM1). El agente citotóxico dimerizado puede ser difícil de eliminar. La etapa de inactivación también puede minimizar cualquier reacción de intercambio tiol-disul furo no deseada con los grupos disulfuro de anticuerpos naturales. Luego de la inactivación con reactivos de inactivación de tiol cargados y polares (tales como ácido 4 -maleimidobutí rico o ácido 3-maleimidopropiónico), el exceso de agente citotóxico sin reaccionar se convierte en un aducto soluble en agua cargado y polar, que puede separarse fácilmente del con ugado enlazado de manera covalente durante la etapa de purificación. También puede emplearse la inactivación con reactivos de inactivación de tiol neutros y no polares.
En una modalidad, la mezcla se inactiva mediante la puesta en contacto de la mezcla con un reactivo de inactivación que reacciona con el reactivo de reticulación bifuncional sin reaccionar. Por ejemplo, pueden agregarse nucleófilos a la mezcla para inactivar cualquier reactivo de reticulación bifuncional sin reaccionar. El nucleófilo es preferentemente un grupo amino que contiene nucleófilos, tal como lisina, taurina o hidroxilamina .
En una modalidad preferida, la reacción (es decir, poner en contacto el agente de unión celular con un agente citotóxicó y después un reactivo de reticulación bifuncional) se puede completar antes de poner en contacto la mezcla con un reactivo de inactivación. En este aspecto, el agente de inactivación se agrega a la mezcla entre alrededor de 1 hora y alrededor de 48 horas (p. e . , alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, alrededor de 4 horas, alrededor de 5 horas, alrededor de 6 horas, alrededor de 7 horas, alrededor de 8 horas, alrededor de 9 horas, alrededor de 10 horas, alrededor de 11 horas, alrededor de 12 horas, alrededor de 13 horas, alrededor de 14 horas, alrededor de 15 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 17 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 19 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas, o alrededor de 25 horas a alrededor de 48 horas) después de que se ponga en contacto a la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con el reactivo de reticulación bifuncional.
El proceso inventivo puede incluir opcionalmente la adición de sacarosa a la etapa de reacción (es decir, poner en contacto a un agente de unión celular con un agente citotóxico y un reactivo de reticulación bifuncional) para aumentar la solubilidad y recuperación de los conjugados de agente de unión celular y agentes citotóxicos. Preferentemente, la sacarosa se agrega en una concentración de alrededor de 0.1% (p/v) a alrededor de 20% (p/v) (p. ej . , alrededor de 0.1% (p/v), 1% (p/v), 5% (p/v), 10% (p/v), 15% (p/v) , o 20% (p/v) ) . Preferentemente, la sacarosa se agrega en una concentración de alrededor de 1% (p/v) a alrededor de 10% (p/v) (p. ej . , alrededor de 0.5% (p/v), alrededor de 1% (p/v), alrededor de 1.5% (p/v), alrededor de 2% (p/v), alrededor de 3% (p/v), alrededor de 4% (p/v), alrededor de 5% (p/v), alrededor de 6% (p/v), alrededor de 7% (p/v), alrededor de 8% (p/v), alrededor de 9% (p/v), alrededor de 10% (p/v), o alrededor de 11% (p/v)). A su vez, la etapa de reacción también puede comprender la adición de un agente amortiguador. Puede utilizarse cualquier agente amortiguador adecuado conocido en la técnica. Pueden ser agentes amortiguadores, por ejemplo, un amortiguador de citrato, un amortiguador de acetato, un amortiguador de succinato y un amortiguador de fosfato. En una modalidad, el agente amortiguador se selecciona del grup.o que consiste en HEPPSO (ácido N- ( 2-hidroxietil )piperazina-N'-(2-hidroxipropanosulfónico ) ) , POPSO (dehidrato de piperazina-1 , 4-bis- ( ácido 2-hidroxi-propano-sul fónico )) , HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-l-etanosulfónico) , HEPPS (EPPS) (ácido 4- ( 2-hidroxietil ) piperazina-l-propanosul fónico ) , TES (ácido N- [ tris ( hidroximetil ) metil ] -2-aminoetanosul fónico ) , y combinaciones de estos.
Luego de la etapa de reacción, el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico se somete a una etapa de purificación. En este sentido, la el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico se puede purificar de los otros componentes de la mezcla (p. ej . , agente citotóxico libre y subproductos de reacción) usando filtración de flujo tangencial (TFF), el cual es un proceso de filtración de flujo tangencial en base a membranas, cromatografía de no adsorción, cromatografía de adsorción, filtración de adsorción, precipitación selectiva, o cualquier otro proceso de purificación adecuada, así como una combinación de estos.
En una modalidad- de la invención, el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico se purifica usando una única etapa de purificación (por ejemplo, TFF). Preferentemente, el conjugado se purifica e intercambia en la formulación adecuada usando una única etapa de purificación (por ejemplo, TFF). En otra modalidad de la invención, el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico se purifica usando dos etapas de purificación secuenciales . Por ejemplo, el conjugado puede primero purificarse mediante precipitación selectiva, filtración de adsorción, cromatografía de adsorción o cromatografía de no adsorción, seguida de purificación con TFF. Un experto en la técnica entenderá que la purificación del conjugado de agente citotóxico y agente de unión celular permite que se aisle un conjugado estable que comprende el agente de unión celular acoplado químicamente al agente citotóxico.
Se puede utilizar cualquier sistema adecuado de TFF para la purificación, incluyendo un sistema tipo Pellicon (Milipore, Billerica, MA) , un sistema de cásete Sartocon (Sartorius AG, Edgewood, NY ) , y un sistema de tipo Centrasette (Pall Corp., East Hills, NY) .
Se puede utilizar cualquier resina adecuada para cromatografía de adsorción para la purificación. Las resinas para cromatografía por adsorción que se prefieren incluyen cromatografía con hidroxiapatito, cromatografía hidrofóbica inducida por carga (HCIC), cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio iónico de modo mixto, cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC), cromatografía usando pigmentos como ligandos, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, y combinaciones de estas. Los ejemplos de resinas adecuadas para hidroxiapatito incluyen cerámicas de hidroxiapatito (CHT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) , hidroxiapatito HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY ) y cerámicas de fluorapatito (CFT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . Un ejemplo de una resina adecuada para HCIC es la resina MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, NY ) . Los ejemplos de resinas adecuadas para HIC incluyen resinas de Butyl-Sepharose, Hexyl-Sepaharose, Phenyl-Sepaharose, y Octyl Sepharose (todas de GE Healthcare, Piscataway, NJ) , así como resinas de metilo Macro-prep y t-butilo Macro-Prep (Biorad Laboratories, Hercules, CA) . Los ejemplos de resinas de intercambio iónico adecuadas incluyen SP-Sepharose, CM-Sepharose, y Q-Sepharose (todas de GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas S Unosphere (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . Los ejemplos de intercambiadores iónicos mixtos adecuados incluyen resinas Bakerbond ABx ( JT Baker, Phillipsburg NJ). Los ejemplos de resinas para IMAC adecuadas incluyen resinas Sepharose de quelación (GE Healthcare, Piscataway, NJ) , y resinas Profinity para IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . Los ejemplos de resinas para ligandos de pigmentos incluyen resinas Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . Los ejemplos de resinas de afinidad adecuadas incluyen resinas Protein A Sepharose (p. ej . , MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), donde el agente de unión celular es un anticuerpo, y resinas de afinidad a la lectina, p. ej . resinas Lentil Lectin Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) , donde el agente de unión celular presenta sitios de unión de unión de lectina adecuados. De manera alternativa, se puede utilizar un anticuerpo especifico para el agente de unión celular. Dicho anticuerpo se puede inmovilizar a, por ejemplo, una resina Sepharose 4 Fast Flow (GE, Healthcare, Piscataway, NJ) . Los ejemplos de resinas adecuadas para fase invertida incluyen resinas C4, C8 y C18 (Grace Vydac, Hesperia, CA) .
Se puede utilizar cualquier resina adecuada para cromatografía de no adsorción para la purificación. Los ejemplos de resinas adecuadas para cromatografía de no adsorción incluyen, de modo no taxativo, SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, resinas SEPHACRYL™ (p. e . , S-200 y S-300), resinas SUPERDEX™ (p. e . , SUPERDEX™ 75 y SUPERDEX™ 200), resinas BIO-GEL® (p. ej . , P-6, P-10, P-30, P-60, y P-100) y otras conocidas para los expertos en la técnica.
En una modalidad, el proceso inventivo comprende también una etapa de retención para liberar los enlazadores acoplados de manera inestable del agente de unión celular. La etapa de retención comprende retener la mezcla antes de la purificación del conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico (por ejemplo, después de la etapa de reacción, entre la etapa de reacción y la etapa de inactivación, o después de la etapa de inactivación). Por ejemplo, el proceso de la invención comprende (a) poner en contacto a un agente de unión celular con un agente citotóxico para formar una mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico; y después poner en contacto la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con un reactivo de reticulación bifuncional, el cual proporciona un enlazador, en una solución con un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 para proporcionar una mezcla que comprende (i) el conguj ado de agente de unión celular y agente citotóxico, donde el agente de unión celular está acoplado químicamente al agente citotóxico mediante el enlazador, (ii) agente citotóxico libre y (iii) subproductos de la reacción, (b) retener la mezcla tal como se preparó en la etapa (a) para liberar los enlazadores unidos de forma inestable del agente de unión celular, y (c) purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico purificado .
En otra modalidad, el proceso de la invención comprende (a) poner en contacto a un agente de unión celular con un agente citotóxico para formar una mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, y después poner en contacto la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con un reactivo de reticulación bifuncional, el cual proporciona un enlazador, en una solución con un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 para proporcionar una mezcla que comprende (i) el congu ado de agente de unión celular y agente citotóxico, donde el agente de unión celular está acoplado químicamente al agente citotóxico mediante el enlazador, (ii) agente citotóxico libre y (iii) subproductos de la reacción, (b) inactivar la mezcla preparada en la etapa (a) para inactivar todo agente citotóxico sin reaccionar y/o reactivo de reticulación bifuncional sin reaccionar, (c) retener la mezcla tal como se preparó en la etapa (b) para liberar los enlazadores unidos de forma inestable del agente de unión celular, y (d) purificar la mezcla para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotoxico purificado.
De manera alternativa, la etapa de retención puede tener lugar después de la purificación del con ugado de agente de unión celular y agente citotoxico, y ser seguida por una etapa de purificación adicional.
En una modalidad preferida, la reacción (es decir, poner en contacto un' agente de unión celular con un agente citotoxico y después un reactivo de reticulación bifuncional) se puede completar antes de la etapa de retención. En este aspecto, la etapa de retención se puede llevar a cabo alrededor de 1 hora a alrededor de 48 horas (p. e . , alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, alrededor de 4 horas, alrededor de 5 horas, alrededor de 6 horas, alrededor de 7 horas, alrededor de 8 horas, alrededor de 9 horas, alrededor de 10 horas, alrededor de 11 horas, alrededor de 12 horas, alrededor de 13 horas, alrededor de 14 horas, alrededor de 15 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 17 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 19 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas, o alrededor de 24 horas a alrededor de 48 horas) después de que se ponga en contacto a la mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico con el reactivo de reticulación bifuncional.
La etapa de retención comprende mantener la solución a una temperatura adecuada (p. ej . , entre alrededor de 0 °C y alrededor de 37 °C) durante un periodo adecuado de tiempo (p. ej . de alrededor de 1 hora a alrededor de 1 semana, alrededor de 1 hora a alrededor de 24 horas, alrededor de 1 hora a alrededor de 8 horas o de alrededor de 1 hora a alrededor de 4 horas) para liberar los enlazadores acoplados de manera inestable del agente de unión celular sin liberar cantidades considerables de los enlazadores acoplados de manera estable al agente de unión celular. En una modalidad, la etapa de retención comprende mantener la solución a alrededor de 20 °C o menos (p. ej . , de alrededor de 0 °C a alrededor de 18 °C, de alrededor de 4 °C a alrededor de 16 °C) , a temperatura ambiente (p. ej . de alrededor de 20 °C a alrededor de 30 °C o de alrededor de 20 °C a alrededor de 25 °C), o a temperaturas elevadas (p. e . de alrededor de 30 °C a alrededor de 37 °C) . En una modalidad, la etapa de retención comprende mantener la solución a una temperatura de alrededor de 16 °C a alrededor de 24 °C (p. ej . , alrededor de 15 °C, alrededor de 16 °C, alrededor de 17 °C, alrededor de 18 °C, alrededor de 19 °C, alrededor de 20 °C, alrededor de 21 °C, alrededor de 22 °C, alrededor de 23 °C, alrededor de 24 °C, o alrededor de 25 °C). En otra modalidad, la etapa de retención comprende mantener la solución a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 8 °C (p. ej . , alrededor de 0 °C, alrededor de 1 °C, alrededor de 2 °C, alrededor de 3 °C, alrededor de 4 °C, alrededor de 5 °C, alrededor de 6 °C, alrededor de 7 °C, alrededor de 8 °C, alrededor de 9 °C, o alrededor de 10 °C) . En otra modalidad, la etapa de retención comprende mantener la solución a una temperatura de alrededor 37 °C (p. ej . , alrededor de 34 °C, alrededor de 35 °C, alrededor de 36 °C, alrededor de 37 °C, alrededor de 38 °C, alrededor de 39 °C, o alrededor de 40 °C) .
La duración de la etapa de retención depende de la temperatura y del pH a los cuales se lleve a cabo la etapa de retención. Por ejemplo, la duración de la etapa de retención puede reducirse considerablemente si la etapa de retención se lleva a cabo a temperaturas elevadas, donde la temperatura máxima está limitada por la estabilidad del conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico. La etapa de retención puede comprender mantener la solución por alrededor 1 hora a alrededor de 1 día (p. ej . , alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, alrededor de 4 horas, alrededor de 5 horas, alrededor de 6 horas, alrededor de 7 horas, alrededor de 8 horas, alrededor de 9 horas, alrededor de 10 horas, alrededor de 12 horas, alrededor de 14 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 22 horas, o alrededor de 24 horas), de alrededor de 10 horas a alrededor de 24 horas, de alrededor de 12 horas a alrededor de 24 horas, de alrededor de 14 horas a alrededor de 24 horas, de alrededor de 16 horas a alrededor de 24 horas, de alrededor de 18 horas a alrededor de 24 horas, de alrededor de 20 horas a alrededor de 24 horas, de alrededor de 5 horas a alrededor de 1 semana, de alrededor de 20 horas a alrededor de 1 semana, de alrededor de 12 horas a alrededor de 1 semana (p. e . , alrededor de 12 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 24 horas, alrededor de 2 días, alrededor de 3 días, alrededor de 4 días, alrededor de 5 días, alrededor de 6 días, o alrededor de 7 días), o de alrededor de 1 día a alrededor de 1 semana.
En una modalidad, la etapa de retención comprende mantener la solución a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 8 °C por un período de al menos alrededor de 12 horas hasta una. semana. En otra modalidad, la etapa de retención comprende mantener la solución a una temperatura de alrededor de 2 °C a alrededor de 8 °C durante la noche (p. ej . , alrededor de 12 a alrededor de 24 horas, preferentemente alrededor de 20 horas).
El valor de pH para la etapa de retención es preferentemente de alrededor de 4 a alrededor de 10. En una modalidad, el valor de pH para la etapa de retención es de alrededor de 4 o más, pero menor que alrededor de 6 (p. e . 4 a 5.9) o alrededor de 5 o más, pero menor que alrededor de 6 (p. ej . , 5 a 5.9). En otra modalidad, los valores de pH para la etapa de retención varian de entre alrededor de 6 a alrededor de 10 (p. ej . , de alrededor de 6.5 a alrededor de 9, de alrededor de 6 a alrededor de 8). Por ejemplo, los valores de pH para la etapa de retención pueden ser alrededor de 6, alrededor de 6.5, alrededor de 7, alrededor de 7.5, alrededor de 8, alrededor de 8.5, alrededor de 9, alrededor de 9.5, o alrededor de 10.
En modalidades especificas, la etapa de retención puede comprender incubar la mezcla a 25 °C a un pH de alrededor de 6-7.5 por alrededor de 12 horas a alrededor de 1 semana, incubar la mezcla a 4 °C a un pH de alrededor de 4.5-5.9 por alrededor de 5 horas a alrededor de 5 dias, o incubar la mezcla a 25 °C a un pH de alrededor de 4.5-5.9 por alrededor de 5 horas a alrededor de 1 día.
La invención proporciona un proceso para la preparación de composiciones de conjugados estables que comprenden un agente de unión celular acoplado químicamente a un agente citotóxico, donde las composiciones se encuentran sustancialmente libres de conjugados inestables. En este sentido, la invención proporciona un proceso para preparar un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico de pureza y estabilidad considerablemente altas. Dichas composiciones pueden usarse para tratar enfermedades dada la elevada pureza y estabilidad de los conjugados. Se describen composiciones que comprenden un agente de unión celular, como un anticuerpo, acoplado químicamente a un agente citotóxico, como un maitansinoide, en, por ejemplo, la patente estadounidense 7,374,762, cuya entera descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. En un aspecto de la invención, un conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico de pureza considerablemente alta tiene una o más de las siguientes características: (a) más >que alrededor de 90 % (p. ej . , más que o alrededor de 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %), preferentemente más que alrededor de 95 , de las especies del conjugado son monoméricas, (b) el nivel de enlazadores sin conjugar en la preparación del conjugado es menos que alrededor de 10 % (p. ej . , menos que o igual a alrededor de 9 % , 8 % , 7 % , 6 % , 5 % , 4 % , 3 % , 2 %, 1 %, o 0 %) (con relación al total de enlazadores), (c) menos que 10 % de las especies del conjugado presentan reticulación (p. ej . , menos que o igual a alrededor de 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o O %), (d) el nivel de agente citotóxico libre en la preparación del con ugado es menos que alrededor de 2 % (p. ej . , menos que o igual a alrededor de 1.5 %, 1.4 %, 1.3 %, 1.2 %, 1.1 %, 1.0 %, 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, o 0 %) (mol/mol con relación al total de agente citotóxico), y/o (e) no presenta un aumento considerable en el nivel de agente citotóxico libre cuando se almacena (p. ej . , después de alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas, alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor 4 años o alrededor de 5 años). Un "aumento considerable" en los niveles de agente citotóxico libre significa que, después de cierto tiempo de almacenamiento (por ejemplo, alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas, alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años o alrededor de 5 años), el aumento en el nivel de agente citotóxico es menor que alrededor de 0.1 %, alrededor de 0.2 % , alrededor de 0.3 %, alrededor de 0.4 %, alrededor de 0.5 %, alrededor de 0.6 %, alrededor de 0.7 %, alrededor de 0.8 %, alrededor de 0.9 %, alrededor de 1.0 %f alrededor de 1.1 %, alrededor de 1.2 %, alrededor de 1.3 %, alrededor de 1.4 %, alrededor de 1.5 %, alrededor de 1.6 , alrededor de 1.7 %, alrededor de 1.8 %, alrededor de 1.9 %, alrededor de 2.0 %, alrededor de 2.2 %, alrededor de 2.5 %, alrededor de 2.7 %, alrededor de 3.0 %, alrededor de 3.2 %, alrededor de 3.5 %, alrededor de 3.7 %, o alrededor de 4.0 % .
Como se utiliza en la presente, el término "enlazador sin conjugar" se refiere al agente de unión celular que se enlaza, mediante enlaces covalentes, al reactivo de reticulación bifuncional, donde el agente de unión celular no se encuentra enlazado mediante enlaces covalentes al agente citotóxico por medio del enlazador del reactivo de reticulacón bifuncional (es decir, el "enlazador sin conjugar" puede representarse como CBA-L, donde CBA representa el agente de unión celular y L representa el reactivo de reticulación bifuncional. Por el contrario, el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico se puede representar como CBA-L-D, donde D representa al agente citotóxico).
En una modalidad, la razón molar promedio del agente citotóxico al agente de unión celular en el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico es de alrededor de 1 a alrededor de 10, de alrededor de 2 a alrededor de 7, de alrededor de 3 a alrededor de 5, de alrededor de 2.5 a alrededor de 4.5 (p. ej . , de alrededor de 2.5, de alrededor de 2.6, de alrededor de 2.7, de alrededor de 2.8, de alrededor de 2.9, de alrededor de 3.0, de alrededor de 3.1, de alrededor de 3.3, de alrededor de 3.4, de alrededor de 3.5, de alrededor de 3.6, de alrededor de 3.7, de alrededor de 3.8, de alrededor de 3.9, de alrededor de 4.0, de alrededor de 4.1, de alrededor de 4.2, de alrededor de 4.3, de alrededor de 4.4, de alrededor de 4.5), de alrededor de 3.0 a alrededor de 4.0, de alrededor de 3.2 a alrededor de 4.2 ode alrededor de 4.5 a 5.5 (p. e . , de alrededor de 4.5, de alrededor de 4.6, de alrededor de 4.7, de alrededor de 4.8, de alrededor de 4.9, de alrededor de 5.0, de alrededor de 5.1, de alrededor de 5.2, de alrededor de 5.3, de alrededor de 5.4 o de alrededor de 5.5).
La presente invención proporciona un proceso más eficaz para preparar composiciones de conjugados estables que comprenden un agente de unión celular que se acopla químicamente a un agente citotóxico. En una modalidad, en comparación con los procesos tradicionales para la preparación de conjugados de un agente de unión celular y un agente citotóxico, se necesita menor cantidad de agente citotóxico para alcanzar la misma razón molar promedio de agente citotóxico a agente de unión celular para los conj ugados .
El agente de unión celular puede ser cualquier agente adecuado que se una a una célular típica y preferentemente una célula animal (p. ej . una célula humana). Preferentemente, el agente de unión celular es un péptido o un polipéptido. Entre los agentes de unión celular adecuados se incluyen, por ejemplo, anticuerpos (p. ej . anticuerpos monoclonales y fragmentos de estos), interferones (p. ej . alfa., beta., gamma.), linfocinas (p. ej . , IL-2, IL-3, IL-4, IL-6), hormonas (p. ej . insulina, TRH (hormona de liberación de tirotropina ) , MSH (hormona estimuladora de melanocitos ) , hormonas esteroides, como andrógenos y estrógenos), factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF y GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)), moléculas transportadoras de nutrientes (p. ej . transíerrina ) , vitaminas (p. ej . , folato) y cualquier otro agente o molécula que se una de forma específica a una molécula diana en la superficie de una célula .
Cuando el agente de unión celular es un anticuerpo, se une a un antígeno que es un polipéptido o un glicotopo y puede ser una molécula de transmembrana (p. ej . , receptor) o un. ligando como un factor de crecimiento. Los ejemplos de antígenos incluyen moléculas como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea ; hormona de estimulación de la tiroides; lipoproteinas ; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona folículo-estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación como el factor vrac, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von illebrand; factores anticoagulantes como la Proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, como urocinasa u orina humana o activador de plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada al momento de la activación normalmente expresada y secretada por células T); proteína inflamatoria de macrófago humana (MI P-l-al fa ) ; una albúmina sérica, como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora Muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado con la gonadotropina de ratones; una proteína microbiana, como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado con el linfocito T citotóxico (CTLA), como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides ; un factor neurotrófico , como un factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrófina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento de nervios como NGF-ß; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento de transformación (TGF) como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-ß? , TGF-P2, TGF-p3, TGF-pb4 o TGF-ßd; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I y IGF-II); des(l- 3)-IGF-I (IGF-I cerebral); proteínas de unión al factor de crecimiento tipo insulina; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; receptores EphA; receptores EphB; receptor de ' folato; FOLR1; mesotelina; cripto; · alfavbeta6; integrinas; VEGF; VEGFR; receptor EGFR de tarnsferrina; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; proteínas CD 'como CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 o un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados con tumores o receptores de la superficie celular descritos en la Publicación estadounidense N.° 2008/0171040 o la Publicación estadounidense N.° 2008/0305044 y se incorporan en su totalidad mediante esta referencia; eritropoyetina ; factores osteoinductivos ; immunotoxinas ; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, como interferón alfa, beta y gamma; factores de estimulación de colonias (CSF), p. ej . , M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), p. ej . , IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor de aceleración del deterioro; antígenos virales como, por ejemplo, una parte de la envoltura del VIH; proteínas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado cón tumores como el receptor de HER2, HER3 o HER4; endoglina; c-Met; IGF1R; antígenos prostáticos como PCA3, PSA, PSGR, NGE , PSMA, PSCA, TMEFF2 y STEAP1; LGR5; B7H4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos antedichos .
Adicionalmente se puede usar GM-CSF, que se une a células mieloides, como agente de unión celular para células enfermas de leucemia mielógena aguda. La IL-2 que se une a células T activadas se puede usar para la prevención del rechazo de injertos en trasplantes, para la terapia y la prevención de la enfermedad de injerto contra el huésped y para el tratamiento de leucemia aguda de células T. Se pueden usar MSH que se unen a melanocitos, se puede usar para el tratamiento del melanoma, así como anticuerpos dirigidos hacia melanomas. El ácido fólico se puede usar para dirigirse al receptor de folato expresado en tumores de ovarios y de otro tipo. El factor de crecimiento epidérmico se puede usar para dirigirse a cánceres escamosos como el de pulmón y el de cabeza y cuello. La somatostatina se puede usar para dirigirse a neuroblastomas y otros tipos tumorales.
Los cánceres de mama y testículos se pueden combatir de forma exitosa con estrógenos (o análogos de estrógenos) o androgenos (o análogos de androgenos), respectivamente, como agentes de unión a celular.
El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier inmunoglobulina, cualquier fragmento de inmunoglobulina, como Fab, Fab' , F(ab')2, dsFv, sFv, minicuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos (Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983); Spring et ál . J. Immunol . 113: 470-478 (1974); Nisonoff et ál. Arch. Bíochem. Biophys. 89: 230-244 (1960), im et ál., Mol, Cáncer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Cárter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006)), o inmunoglobulina quimérica, que se pueden unir a un antígeno en la superficie de una célula (p. ej . , que contiene una región determinante de complementariedad (CDR) ) . Se puede utilizar cualquier anticuerpo adecuado como el agente de unión celular. Un experto en la técnica entenderá que la selección de un anticuerpo apropiado dependerá de la población celular diana. En este sentido, el tipo y número de •moléculas de la superficie celular (es decir, antigenos) que se expresan selectivamente en una población celular particular (típica y preferiblemente una población celular enferma) regirá la selección de un anticuerpo apropiado para ser utilizado en la composición inventiva. Se conocen los perfiles de expresión de la superficie celular para varios tipos . celulares , incluyendo tipos de células tumorales, o, en caso de desconocerse, estos se pueden determinar utilizando técnicas de rutina de biología molecular e histoquímica .
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales , pero preferentemente se trata de anticuerpos monoclonales. Como se utiliza en la presente, anticuerpo "policlonal" hace referencia a poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos, típicamente encontradas en suero de animales inmunizados. Anticuerpo "monoclonal" se refiere a poblaciones homogéneas de moléculas de anticuerpos que son específicas para un antígeno particular. Típicamente, los anticuerpos monoclonales son producidos por un clon simple de linfocitos B ("células B" ) . Se pueden obtener anticuerpos monoclonales utilizando varias técnica conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo tecnología estándar de hibridoma (véase, p. ej . , Kóhler and Milstein, Eur . J. Im unol . , 5: 511-519 (1976), Harlow y Lañe (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et ál. (eds.), Immunobíology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). En resumen, el método de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales suele implicar inyectar a' cualquier animal adecuado, típica y preferentemente un ratón, un antígeno (es decir, un " inmunógeno" ) . Luego el animal es sacrificado, y los linfocitos B que se aislan de su bazo se fusionan con las célula de mieloma humano. Se produce una célula híbrida (es decir, un "hibridoma"), la cual prolifera indefinidamente y secreta, de forma continua, titulaciones elevadas de anticuerpos con la especificidad deseada in vítro. Se puede utilizar cualquier método apropiado conocido en la técnica para identificar células hibridoma que producen un anticuerpo con la especificidad deseada. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), análisis de transferencia Western y radioinmunoensayo . La población de hibridomas se analiza para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una única especie de anticuerpo para el antígeno. Dado que cada hibridoma es un clon derivado de la fusión con un único linfocito B, todas las moléculas de anticuerpo que produce son idénticas en cuanto a su estructura, incluyendo su sitios de unión al antígeno y su isotipo. También se pueden generar anticuerpos monoclonales utilizando otras técnicas adecuadas incluyendo tecnología de hibridoma-EBV (véase, p. ej . Haskard y Archer, J. Immunol . Methods, 74(2): 361-67 (1984), y Roder et ál., Methods Enzymol . , 121: 140-67 (1986)), sistemas de vectores de expresión bacteriófagos (véase, p. ej . , Huse et ál., Science, 246: 1275-81 (1989)), o bibliotecas de expresión en fagos que comprenden fragmentos de anticuerpos, como Fab y scFv (región variable de cadena simple) (véase, p. ej . las patentes estadounidenses 5,885,793 y 5,969,108, y las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales WO 92/01047 y WO 99/06587).
El anticuerpo monoclonal se puede aislar de cualquier animal adecuado, o producir a partir de este, pero preferentemente se produce en un mamífero, más preferentemente un ratón o un humano, y más preferentemente un humano. Se conocen en la técnica y se describen en la presente métodos para producir un anticuerpo en ratones. En lo que respecta a anticuerpos humanos, el experto en la técnica entenderá que se pueden aislar anticuerpos policlonales del suero de sujetos humanos vacunados o inmunizados con el antígeno adecuado. De manera alternativa, se pueden generar anticuerpos humanos adaptando técnicas conocidas para producir anticuerpos humanos en animales que no son humanos, como ratones (véase, p. ej . , las patentes estadounidenses 5,545,806, 5,569,825 y 5,714,352, y la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2002/0197266 Al ) .
Mientras que son la opción ideal para aplicaciones terapéuticas en humanos, los anticuerpos humanos, en especial los anticuerpos monoclonales humanos, son típicamente más difíciles de generar que los anticuerpos monoclonales de ratón. Los anticuerpos monoclonales de ratón, sin embargo, inducen una rápida respuesta de anticuerpos del huésped cuando se administran a humanos, lo que puede reducir el potencial diagnóstico o terapéutico del conjugado de anticuerpo y agente citotóxico. Para evitar estas complicaciones, preferentemente un anticuerpo monoclonal no es considerado "extraño" por el sistema inmunitario humano.
Con este fin, la expresión en fagos se puede utilizar para generar el anticuerpo. En este sentido, las bibliotecas de fagos que codifican dominios variables (V) de unión a antígenos para anticuerpos pueden generarse utilizando técnicas de rutina de la biología . molecular y el ADN recombinante (véase, p. ej . , Sambrook et ál. ( eds . ) , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001)). Se seleccionan regiones variables de codificación de fagos con la especificidad deseada para la unión específica a el antigeno deseado, y se reconstituyen anticuerpos humanos completos que comprenden el dominio variable seleccionado. Se introducen secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido a una linea celular adecuada, como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridomas, de manera tal que la célula secrete anticuerpos humanos con las características de anticuerpos monoclonales (véase, p'. e . , Janeway et ál., supra, Huse et ál., supra, y la patente estadounidense 6,265,150). De manera alternativa, se pueden generar anticuerpos monoclonales con ratones que sean transgénicos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada específicos para humanos. Dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patente estadounidenses 5,545,806 y 5,569,825 y en Janeway et ál . , supra .
Más preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo "humanizado" es uno en que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal de ratón, que forman los lazos de unión del anticuerpo, se injertan al marco de una molécula de anticuerpo humano. Dadas las similitudes en los marcos de los anticuerpos de ratón y de humano, se acepta mayoritariamente en la técnica que este método produce un anticuerpo monoclonal que es antigénicamente idéntico al anticuerpo humano, pero se une al mismo antígeno que el anticuerpo monoclonal de ratón del que se derivaron las secuencias de CDR. Se describen detalladamente métodos conocidos en la técnica para generar anticuerpos humanizados, por ejemplo, en Janeway et ál., supra, las patentes estadounidenses 5,225,539, 5,585,089 y 5,693,761, la patente europea n.° 0239400 Bl, y la patente del Reino Unido n.° 2188638. También se pueden generar anticuerpos humanizados utilizando la tecnología de revestimiento de anticuerpos que se describe en la patente estadounidense 5,639, 641 y Pedersen et ál . , J. Mol. Biol . , 235: 959-973 (1994). Mientras que el anticuerpo utilizado en el conjugado de la composición inventiva es, más preferentemente, un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal humano y un anticuerpo monoclonal de ratón, como se describe anteriormente, también se encuentran dentro del alcance de la invención.
También se incluyen dentro del alcance de la invención fragmentos de anticuerpos que tienen al menos un sitios de unión de antígeno y que por lo tanto reconocen y se unen a al menos un antígeno o receptor que se encuentra en la superficie de la célula diana. En este sentido, la escisión proteolítica de una molécula de anticuerpo intacta puede producir múltiples fragmentos de anticuerpos que. mantienen la capacidad de reconocer y unirse a antígenos. Por ejemplo, la digestión limitada de una molécula de anticuerpo con la papaína de proteasa típicamente produce tres fragmentos, dos de los cuales son idénticos y se los llama fragmentos Fab, ya que pueden mantener la actividad de unión a antígenos de la molécula madre de anticuerpo. La escisión de una molécula de anticuerpo con la enzima pepsina suele producir dos fragmentos de anticuerpo, uno de los cuales mantiene ambos brazos de unión a antígenos de la molécula' de anticuerpo, y por lo tanto se lo llama fragmento F ( ab ' ) 2. La reducción de un fragmento F(ab')2 con ditiotereitol o mercaptoetilamina produce el fragmento que se llama fragmento Fab'. Se puede generar un fragmento de anticuerpo de región variable de cadena sencilla (sFv), que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unido a un domino V de una cadena ligera de anticuerpo mediante un péptido sintético, utilizando técnicas de rutina de tecnología de ADN recombinante (véase, p. ej . Janeway et ál . , supra) . De manera similar, se pueden preparar fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) usando tecnología de ADN recombinante (véase, p. e . , Reiter et ál., Protein Engineeríng, 7: 697-704 (1994)). Sin embargo, en el contexto de la invención los fragmentos de anticuerpo no se ven limitados a estos ejemplos de tipos de fragmentos de anticuerpos. Se puede utilizar todo fragmento de anticuerpo adecuado que reconozca y se una a un receptor o antigeno deseado de la superficie de una célula. Los fragmentos de anticuerpos se describen adicionalmente, por ejemplo, en Parham, J. Im unol . , 131: 2895-2902 (1983), Spring et ál., J. Immunol., 113: 470-478 (1974), y Nisonoff et ál., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960). La unión entre anticuerpos y antigenos se puede analizar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica como, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, p. ej . , Janeway et ál., supra, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0197266 Al ) .
A su vez, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión al antígeno de este. Con "quimérico" se quiere decir que el anticuerpo comprende al menos dos inmunoglobulinas , o fragmentos de estas, obtenidas o derivadas de al menos dos especies diferentes (p. ej . , dos inmunoglobulinas diferentes, como una región constante de inmunoglobulina humana combinada con una región variable de inmunoglobulina murina). El anticuerpo también puede ser un anticuerpo de domino (dAb) o un fragmento de unión al antigeno de este como, por ejemplo, un anticuerpo camélido (véase, p. ej . , Desmyter et ál . , Nature Struct. Biol . , 3: 752, (1996)), o un anticuerpo de tiburón, como, por ejemplo, un nuevo receptor de antígenos (IgNAR) (véase, p. ej . , Greenberg et ál . , Nature, 374: 168 (1995), y Stanfield et ál., Science, 305: 1770-1773 (2004)).
Se puede usar cualquier anticuerpo adecuado en el contexto de la invención. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal J5 es un anticuerpo IgG2a murino qué es especifico para el antigeno de leucemia linfoblástica aguda común (CALLA) (Ritz et ál . , Nature, 283: 583-585 (1980)), y se puede utilizar para dirigirse a las células que expresan CALLA (p. ej . , células de leucemia linfoblástica aguda). El anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgGl murino que se une específicamente a el antígeno CD33 (Griffin et ál., Leukemia Res., 8: 521 (1984)), y se puede utilizar para combatir células que expresan CD33 (p. ej . células de leucemia mielógena aguda (AML) ) .
De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 (también llamado B4 ) es un anticuerpo IgGl murino que se une al antígeno CD19 en linfocitos B {Nadler et ál., J. I munol . , 131: 244-250 (1983)), y se puede utilizar para combatir linfocitos B o células enfermas que expresen CD19 (p. ej . , células de linfoma no-Hodgkin y células de leucemia linfocítica crónica), el N901 es un anticuerpo monoclonal murino que se une al antígeno CD56 (molécula de adhesión celular neural) presente en células de origen neuroendocrino, incluyendo tumores de pulmón de células pequeñas, que pueden ser usadas en el conjugado para dirigir fármacos a células de origen neuroendocrino. Los anticuerpos J5, MY9 y B4 preferentemente se revisten o humanizan antes de ser utilizados como parte del conjugado. El revestimiento o la humanización de anticuerpos se describe, por ejemplo, en Roguska et ál., Proc. Nati. ñcad. Sci . USA, 91: 969-73 (1994).
Además, el anticuerpo monoclonal C242 se une al antigeno CanAg (véase, p. ej . , la patente estadounidense 5,552,293), y se puede utilizar para dirigir el- conjugado a tumores que expresan CanAg, como pueden ser el cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y cáncer gástrico. El HuC242 es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal C242 (véase, p. ej . , la patente estadounidense 5,552,293). El hibridoma a partir del cual se forma el HuC242 se encuentra registrado con el número de identificación ECACC 90012601. El HuC242 se puede preparar utilizando métodos de injerto de CDR (véase, p. ej . , las patentes estadounidenses 5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762) o tecnología de revestimiento (véase, p. ej . , la patente estadounidense 5,639,641). El HuC242 se puede utilizar para dirigir al conjugado hacia células tumorales que expresan el antigeno CanAg como, por ejemplo, células de cáncer colorrectal, pancreático, de pulmón de células no pequeñas y gástrico .
Para combatir células de cáncer de ovario y cáncer de próstata, se puede utilizar un anticuerpo anti-MUCl como el agente de unión celular en el conjugado. Los anticuerpos anti-MUCl incluyen, por ejemplo, anti-HMFG-2 (véase, p. ej . , Taylor-Papadimitriou et ál., Int. J. Cáncer, 28: 17-21 (1981 ) ) , hCTMOl (véase, p. ej . , van Hof et ál . , Cáncer Res., 56: 5179-5185 (1996)), y DS6. Las células de cáncer de próstata también pueden combatirse con el conjugado utilizando un antigeno prostético especifico de membrana (PSMA) como el agente de unión celular, como un J591 (véase, p. ej., Liu et ál., Cáncer Res., 57: 3629-3634 (1997)). Además, las células cancerosas que expresan el antigeno Her2, tal como los cánceres de seno, de próstata y de ovario, se pueden combatir con el conjugado usando anticuerpos anti-Her2, p. ej . , trastuzumab, como el agente de unión celular. Las células que expresan el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y sus variantes, como un mutante por deleción tipo III, EGFRvIII, se pueden combatir con el conjugado usando anticuerpos anti-EGFR. Los anticuerpos anti-EGFR se describen en las solicitudes internacionales de patente n.° PCT/US11/058385 y PCT/US11/ 058378. Se describen anticuerpos anti-EGFRvIII en las patentes estadounidenses 7,736,644 y 7,628,986, y en las publicaciones de solicitud estadounidenses 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790, y 2009/0155282. Los anticuerpos anti-IGF-IR que se unen al receptor de factor de crecimiento similar a la insulina, como los que se describen en la patente estadounidense 7,982,024, también se pueden usar en el conjugado. También se pueden usar en el conjugado los anticuerpos que se unen a CD27L, Cripto, CD138, CD38, EphA2, integrinas, CD37, folato, CD20, PSGR, NGEP, PSCA, TMEFF2, STEAP1, endoglina, y Her3.
En una modalidad, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huN901, huMy9-6, huB4, huC242, un anticuerpo anti-HER2 (p. ej . , trastuzumab ) , bivatuzumab, sibrotuzumab, rituximab, huDS6, anticuerpos anti-mesotelina descritos en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2010/124797 (como MF-T ) , anticuerpos anti-cripto descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2010/0093980 (como huB3F6), anticuerpos anti-CD138 descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2007/0183971 (como huB-B4 ) , anticuerpos anti-EGFR descritos en las solicitudes de patente internacional n.° PCT/US11/058385 y PCT/US11/ 058378 (como EGFR-7 ) , anticuerpos anti-EGFRvIII descritos en las patentes estadounidenses 7,736,644 y 7,628,986 y las publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 y 2009/0155282, los anticuerpos humanizados EphA2 descritos en las publicaciones de solicitudes internacionales de patentes WO 2011/039721 y WO 2011/039724 (como 2H11R35R74); anticuerpos anti CD38 descritos en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2008/047242 (como hu38SB19), anticuerpos anti-folato descritos en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2011/106528 y la publicación de solicitud de patente estadounidense 2012/0009181 (p. ej . , huMovl9), anticuerpos anti-IGFIR descritos en las patentes estadounidenses 5,958,872, 6,596,743, y 7,982,024; anticuerpos anti-CD37 descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2011/0256153 (p. ej . , huCD37-3); anticuerpos anti-integrina a?ßß descritos en la publicación de solicitud estadounidense 2006/0127407 (p. ej . , CNT095); y anticuerpos anti-Her3 descritos en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2012/019024.
Los anticuerpos particularmente preferidos son los anticuerpos monoclonales humanizados que se describen en la presente. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, huN901, huMy9-6, huB4, huC242, un anticuerpo monoclonal humanizado anti-Her2 (p. e . , trastuzumab ) , bivatuzumab, sibrotuzumab, CNT095, huDS6, y rituximab (véase, p. e . , las patentes estadounidenses 5,639,641 y 5,665,357, la solicitud de patente estadounidense provisional n.° 60/424,332 (qué está conectada con la patente estadounidense 7,557,189), la publicación de solicitud de patente internacional (PCT) WO 02/16401, Pedersen et ál., supra, Roguska et ál . , supra, Liu et ál . , supra, Nadler et ál., supra, Colomer et ál . , Cáncer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et ál., Eur . J. Cáncer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et ál . , J. Clin. Oncol . , 12: 1193-1203 (1994), y Maloney et ál., Blood, 90: 2188-2195 (1997) ). Se conocen en la técnica otros anticuerpos monoclonales humanizados y estos se pueden utilizar en relación con la invención.
En una modalidad, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-folato humanizado o un fragmento de antigeno de este que se une específicamente a un receptor de folato humano 1, donde el anticuerpo comprende: (a) un CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN ( SEQ ID NO:l); un CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDT FYNQXaalFXaa2Xaa3 (SEQ ID NO: 2); y un CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); y (b) un CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:4); un CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (SEQ ID NO: 5); y un CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (SEQ ID NO: 6); donde Xaal se selecciona de , Q, H, y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N y R; y Xaa3 se selecciona de G, E, · T, S, A y V. Preferentemente, la secuencia de CDR2 de cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:7).
En otra modalidad, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al receptor de folato humano 1, que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos QVQLVQSGAEW PGASVKISCKASGYTFTGYFMNWV QSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYN QKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT VDK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCAAADVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEY CKVSNKALPAPIE IS A GQPREPQVYTLPPSRDELT NQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS LTVD SR QQGNVFSCS VMHEALHNHYTQ SLSLSPGK (SEQ ID NO:8).
En otra modalidad, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno de este codificado por el ADN del plásmido registrado en el ATCC el 7 de abril de 2010, y que tiene como n.° de depósito en el ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antigeno de este que comprende un dominio variable de cadena pesada al menos alrededor de 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a QVQLVQSGAEW PGASVKISC ASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYN QKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9), y un dominio variable de cadena ligera al menos alrededor de 90%, 95%, 99% o 100% idéntico a DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO : 10 ) ; o DIVLTQSPL3LAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 11 ) .
Mientras que el agente de unión celular es preferentemente un anticuerpo, el agente de unión celular también puede ser una molécula que no sea un anticuerpo. Las moléculas no anticuerpos adecuadas incluyen, por ejemplo, interferones (p. ej . , interferones alfa, beta o gama), linfocinas (p. e . interleucina 2 (IL-2), IL-3, IL-4 o IL-6), hormonas (p. ej . insulina), factores de crecimiento (p. ej . , EGF, TGF-alfa, FGF y VEGF) , factor estimulante de colonias (p. ej . G-CSF, M-CSF, y GM-CSF (véase, p. ej . , Burgess, Immunology Today, 5:155-158 (1984)), somatostatina, y transferrina (véase, p. ej . , O'Keefe et ál., J. Biol . Chem. , 260: 932-937 (1985)). Por ejemplo, se puede utilizar GM-CSF, que se une a células mieloides, como un agente de unión celular para dirigirse a células de leucemia mielógena aguda. Además, la IL-2 que se une a células T activadas se puede usar para . la prevención del rechazo de injertos en trasplantes, para la terapia y la prevención de la enfermedad de injerto contra el huésped y para el tratamiento de leucemia aguda de células T. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) se puede usar para dirigirse a cánceres escamosos como el cáncer de pulmón y el cáncer de cabeza y cuello. La somatostatina se puede usar para dirigirse a células de neuroblastomas y otros tipos de células tumorales.
El conjugado puede comprender cualesquiera agentes citotóxicos adecuados. Un "agente citotóxico", como se usa en la presente, se refiere a cualquier compuesto que resulte en la muerte de una célula, induzca la muerte de una célula, o disminuya la viabilidad de una célula. Los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, maitansinoides y ansamitocinas conjugables (véase, por. ejemplo, la solicitu de patente internacional n.° PCT/US11/59131 presentada el 3 de noviembre de 2011), taxoides, CC-1065 y análogos de CC-1065, y dolastatina y análogos de dolastatina. En una modalidad preferida de la invención, el agente citotóxico es un maitansinoide , incluyendo maitansinol y análogos de maitansinol. Los maitansinoides son compuestos que inhiben la formación de microtúbulos y son altamente tóxicos para las célula mamiferas. Los e emplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 4,256,746, 4,294,757, 4,307,016, 4,313,946, 4,315,929, 4,322,348, 4,331,598, 4,361,650, 4,362,663, 4,364,866, 4/424,219, 4,371,533, 4,450,254, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545, y 6,333,410.
Los ejemplos de análogos de maitansinol con un anillo aromático modificado incluyen: (1) C-19-decloro (patente estadounidense 4,256,746) (preparado por reducción LAH de ansamitocina P2 ) , (2) C-20-hidroxi (o C-20-demetilo ) +/-C-19- decloro (patentes estadounidenses 4,361,650 y 4,307,016) (preparadas mediante desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o declorinación utilizando LAH), y (3) C-20-¦ demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (patente estadounidense 4,294,757) (preparada mediante acilación utilizando cloruros de acilo).
Los ejemplos de análogos de maitansinol con modificaciones de las posiciones que no son anillos aromáticos incluyen: (1) C-9-SH (patente estadounidense 4,424,219) (preparada mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5), (2) C-14-alcoximetil (demetoxi/CH20R) (patente estadounidense 4,331,598), (3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH20H o CH20Ac) (patente estadounidense 4, 450, 254) (preparada a partir de Nocardia) , (4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente estadounidense 4,364,866) (preparada mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces) , (5) C-15-metoxi (patentes estadounidenses 4,313,946 y 4,315,929) (aislado de Trewia nudiflora) , (6) C-18-N-demetilo (patentes estadounidenses 4,362,663 y 4,322,348) (preparada mediante la demetilación de maitansinol por medio de Streptomyces) , y (7) 4,5-deoxi (patente estadounidense 4,371,533) (preparada mediante reducción de tricloruro de titanio/LAH de maitansinol ) .
En una modalidad preferida de la invención, el conjugado utiliza el maitansinoide DM1 que contiene tiol, también conocido como N2 ' -deacetil-N2 ' - ( 3-mercapto-l-oxopropyl ) -maitansina , como agente citotóxico. La estructura de DM1 está representada por la fórmula (I): conjugado utiliza el maitansinoide DM4 que contiene tiol, también conocido como N2' -deacetil-N2 ' - ( 4-metil-4-mercapto-l-oxopentil ) -maitansina , como agente citotóxico. La estructura de DM4 está representada por la fórmula (II): (II) Pueden usarse otros maitansinoides en el contexto de la invención, incluyendo, por ejemplo, maitansinoides que contienen tiol o disulfuro que tienen una sustitución mono o dialquilo en el átomo de carbono que porta el átomo de azufre. Se prefiere particularmente un maitansinoide que tiene en la posición C-3 (a) funcionalidad de hidroximetilo C-14, hidroxi C-15 o desmetilo C-20 y (b) una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que tiene un grupo sulfhidrilo impedido, donde el átomo de carbono del grupo acilo que tiene la funcionalidad de tiol tiene uno o dos sustituyentes, dichos sustituyentes son CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, y adicionalmente donde uno de los sustituyentes puede ser H, y donde el grupo acilo tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad de carbonilo y el átomo de azufre.
Los maitansinoides adicionales que pueden usarse en el contexto de la invención incluyen los compuestos representados por la fórmula (III): donde Y' representa ( CR7R8 ) 1 ( CR9=CR10 ) p ( C=C ) qAo ( CR5R6 ) mDu ( CRl1=CR12 ) r ( C=C ) sBt ( CR3 R4 ) nCRlR2SZ, donde Rl y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico con 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 también puede ser H, donde A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene de 3-10 átomos de carbono, árilo simple o sustituido, o un aromático heterocíclico, o un radical de heterocicloalquilo, donde R3, R4, R5, R6, R7 , R8, R9, RIO, Rll y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o ciclico con 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterociclico o un radical de heterocicloalquilo, donde 1, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente cero o un entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de 1, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en ningún momento, ydonde Z es H, SR o COR, donde R es un alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o ciclico con 3 a 10 átomos de carbono, o un arilo simple o sustituido o un aromático heterociclico, o un radical de heterocicloalquilo.
Las modalidades preferidas de la fórmula (III) incluyen compuestos de la fórmula (III) donde (a) Rl es H, R2 es metilo y Z es H, (b) Rl y R2 son metilo y Z es H, (c) Rl es H, R2 es metilo,, y Z es -SCH3, y (d) Rl y R2 son metilo, y Z es -SCH3.
Dichos maitansinoides adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (IV-L), (IV-D) o (IV-D, L) : (IV-L) (IV-D) (IV-D, L) donde Rl y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterociclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 también puede ser H, donde R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 .a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un aromático heterociclico o un radical de heterocicloalquilo, donde 1, m y n son cada uno independientemente un entero de 1 a 5, y además n puede ser cero, donde Z es H, SR, o COR donde R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un aromático heterociclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde May representa un maitansinoide que porta una cadena lateral en C-3, hidroximetilo C-14, hidroxi C-15 o desmetilo C-20.
Las modalidades preferidas de las fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) incluyen compuestos de las fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) donde '(a) Rl es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, 1 y m son cada uno 1, n es 0, y Z es H, (b) Rl y R2 son metilo, R5, R6, R7 , R8 son cada uno H, 1 y m son 1, n es 0, y Z es H, (c) Rl es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, 1 y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3, o (d) Rl y R2 son metilo, R5, R6, R7 , R8 son cada uno H, 1 y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
Preferentemente el agente citotóxico está representado por la fórmula (IV-L).
Los maitansinoides adicionales preferidos también incluyen compuestos representados por la fórmula (V) : (V) donde Y representa ( CR7R8 ) 1 ( CR5R6 ) m ( CR3R4 ) nCRlR2SZ , donde Rl y R2 son cada una independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 también puede ser H, donde R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un aromático heterociclico o un radical de heterocicloalquilo, donde 1, m y n son cada uno independientemente un entero de 1 a 5, y además n puede ser cero, y donde Z es H, SR, o COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalqüilo .
Las modalidades preferidas de la fórmula (V) incluyen compuestos de la fórmula (V) donde (a) Rl es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, 1 y m son cada uno 1, n es 0, y Z es H, (b) Rl y R2 son metilo, R5, R6, R7 , R8 son cada uno H; 1 y m son 1; n es 0; y Z es H; (c) Rl es H, R2 es metilo; R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, 1 y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3, o (d) Rl y R2 son metilo, R5, R6, R7,¦ R8 son cada uno H, 1 y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
Los maitansinoides preferidos incluyen compuestos representados por la fórmula (VI-L), (VI-D) , o (VI-D,L): (VI-L) (VI-D) (VI-D, L), donde Y2 representa ( CR7R8 ) 1 (CR5R6 ) m( CR3R4 ) nCRlR2SZ2 , donde Rl y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde R2 también puede ser H, donde R3, R4 , R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o»alquenilo lineal o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, donde 1, m y n son cada uno independientemente un entero de 1 a 5, y además n puede ser cero, donde Z2 es SR, o COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, y donde May es la estructura macrocíclica de anillo del maitansinoide .
Los maitansinoides adicionales preferidos incluyen compuestos representados por la fórmula (VII): (VII) , donde Y2' representa ( CR7R8 ) 1 ( CR9=CR10 ) p ( C=C ) qAo ( CR5R6 ) mDu ( CRl1=C 12 ) r ( C=C ) sBt ( CR3 R4 ) nCRlR2SZ2, donde Rl y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico con 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterociclico o un radical de heterocicloalquilo, y R2 también puede ser H, donde A, B, D son cada uno independientemente cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, arilo simpe o sustituido, o un aromático heterociclico, o un ¦ radical de heterocicloalquilo, donde R3, R , R5, R6, R7 , R8, R9, RIO, Rll y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico con 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un aromático heterocíclico o un radical de heterocicloalquilo, donde 1, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente cero o un entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de 1, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en ningún momento, y donde Z2 es SR o -COR, donde R es un alquilo o alquenilo lineal de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico con 3 a 10 átomos de carbono, o un arilo simple o sustituido o un aromático heterocíclico, o un radical de heterocicloalquilo.
Las modalidades preferidas de la fórmula (VII) incluyen compuestos de la fórmula (VII), donde Rl es H y R2 es metilo.
Además de maitansinoides , el agente citotóxico usado en el con ugado puede ser un taxano o un derivado de estos. Los taxanos son una familia de compuestos que incluye paclitaxel (Taxol®) , un producto citotóxico natural, y docetaxel (Taxotere®) , un derivado semisintético, los cuales se usan ampliamente en el tratamiento del cáncer. Los taxanos son venenos del huso mitótico que inhiben la despolimerización de la tubulina, lo cual da como resultado la muerte celular.
Mientras que docetaxel y paclitaxel son agentes útiles en el tratamiento del cáncer, su actividad antitumoral es limitada debido a su toxicidad no específica respecto a las células normales. Además, los compuestos como el paclitaxel y docetaxel no son lo suficientemente potentes por sí mismos para ser usados en conjugados de agentes de unión celular.
Un taxano preferido para su uso en la preparación de un conjugado citotoxico es el taxano de la fórmula (VIII): (VIII) Los métodos para sintetizar taxanos que pueden usarse en el contexto de la invención, junto con los métodos para conjugar taxanos con agentes de unión celular tal como anticuerpos, se describen en detalle "en las patentes estadounidenses 5,416,064, 5,475,092, 6,340,701, 6,372,738, 6,436,931, 6,596,757, 6,706,708, 6,716,821 y 7,390,898.
El citotóxico puede ser CC-1065 o un derivado de esta. CC-1065 es un antibiótico antitumoral potente aislado a partir del caldo de cultivo de Streptomyces zelensis . CC-1065 es alrededor de 1000 veces más potente in vitro que los fármacos anticancerosos usados comúnmente, tales como doxorrubicina, metotrexato y vincristina (Bhuyan et ál . , Cáncer Res., 42: 3532-3537 (1982)). CC-1065 y sus análogos se divulgan en las patentes estadounidenses 5,585,499, 5,846,545, 6,340,701 y 6,372,738. La potencia citotóxica de CC-1065 se correlaciona con su actividad alquilante y su actividad de unión al ADN y de intercalación del ADN. Estas dos actividades se ubican en partes separadas de la molécula. A este respecto, la actividad alquilante está contenida en la subunidad de ciclopropapirroloindol (CPI) y la actividad de unión al ADN se ubica en las dos subunidades de pirroloindol de CC-1065.
Varios análogos de CC-1065 son conocidos en la técnica y también se puede usar como agente citotóxico en el conjugado (véase, por ejemplo, Warpehoski et ál., J. Med. Chem., 31: 590-603 (1988)). Se han desarrollado una serie de análogos de CC-1065 en los cuales el resto de CPI se reemplaza por un resto de ciclopropabencindol (CBI) (Boger et al., J. Org. Chem., 55: 5823-5833 (1990), y Boger et ál., Bíoorg. Med. Chem. Lett . , 1: 115-120 (1991)). Estos análogos de CC-1065 conservan la alta potencia in vi tro del fármaco madre, sin causar toxicidad retardada en ratones. Como la CC-1065, estos compuestos son agentes alquilantes que se unen de manera covalente a la ranura menor del ADN para causar la muerte celular.
La eficacia terapéutica de los análogos de CC-1065 puede mejorarse ampliamente mediante el cambio de la distribución in vivo a través de la administración dirigida a un sitio de un tumor, lo cual da como resultado una toxicidad más baja hacia los tejidos que no son objetivo, y, por lo tanto, una menor toxicidad sistémica. Para este fin, se generaron conjugados de análogos y derivados de CC-1065 con agentes de unión celular que se dirigen específicamente a células tumorales (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5,475,092, 5,585,499 y 5,846,545). Estos conjugados típicamente muestran una alta citotoxicidad específica del objetivo in vitro, y una actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de tumor humano en ratones (véase, por ejemplo, Chari et ál., Cáncer Res., 55: 4079-4084 (1995)).
Los métodos para sintetizar los análogos de CC-1065 se describen en detalle en las patentes estadounidenses 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545, 6,534,660, 6,586,618, 6,756,397 y 7,329,760.
También pueden usarse los fármacos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina , vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, caliqueamicina, tubulisina y análogos de tubulisina, duocarmicina y análogos de duocarmicina, dolastatina y análogos de dolastatina como el agente citotóxico de la invención. También pueden usarse compuestos de doxarrubicina y daunorrubicina (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 6,630,579) como el agente citotóxico.
Los conjugados de agente de unión celular y agente citotóxico pueden prepararse mediante métodos in vi tro. Para poder unir un agente citotóxico al anticuerpo se usa un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados son conocidos en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos de ácidos lábiles, grupos fotolábiles, grupos de peptidasa lábiles, y grupos de estearasa lábiles, asi como grupos de enlace no escindibles. Por ejemplo, el agente de unión celular puede estar acoplado químicamente al agente citotóxico por medio de enlaces químicos seleccionados del grupo que consiste en enlaces disulfuro, enlaces ácidos lábiles, enlaces fotolábiles, enlaces peptidasa lábiles, enlaces tioéter y enlaces estearasa lábiles.
De acuerdo con la invención, el agente de unión celular se enlaza a un agente citotóxico por medio de un reactivo de reticulación bifuncional. Tal como se usa en la presente, un "reactivo de reticulación bifuncional" se refiere a un reactivo que posee dos grupos reactivos, uno de los cuales es capaz de reaccionar con un agente de unión celular mientras que el otro es capaz de reaccionar con el agente citotóxico para unir el agente de unión celular con el agente citotóxico, formando asi' un conjugado.
Puede usarse cualquier reactivo de reticulación bifuncional adecuado en conexión con la invención, mientras el reactivo enlazador proporcione la retención del agente terapéutico, por ejemplo, citotoxicidad, y las características objetivo del agente citotóxico y del agente de unión celular, respectivamente, sin toxicidad indebida. Preferentemente, la molécula enlazadora une al agente citotóxico con el agente de unión celular a través de enlaces químicos (tal como se describió anteriormente), de manera que el agente citotóxico y el agente de unión celular se acoplen químicamente, (por ejemplo, unidos covalentemente ) entre ellos.
En una modalidad, el reactivo de reticulación bifuncional comprende enlazadores no escindibles. Un enlazador no escindible es cualquier resto químico que sea capaz de unir un agente citotóxico, tal como un maitansinoide, un taxano o un análogo de CC-1065, con un agente de unión celular de forma estable y covalente. Por lo tanto, los enlazadores no escindibles son esencialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, escisión inducida por luz, escisión inducida por peptidasa, escisión inducida por esterasa y escisión de enlace de disulfuro, en condiciones en las que el agente citotóxico o el agente de unión a la célula permanece activo.
Los reactivos de reticulación adecuados que forman enlazadores no escindibles entre un agente citotóxico y el agente de unión celular son conocidos en la técnica. En una modalidad, el agente citotóxico está unido a un agente de unión celular a través de un enlace tioéter. Los ejemplos de enlazadores no escindibles incluyen enlazadores que tienen un resto basado en haloacetilo o maleimido para la reacción con el agente citotóxico. Dichos agentes de reticulación bi funcionales son conocidos ¦ en la técnica (véanse las publicaciones de patente estadounidenses N° 2010/0129314, 2009/0274713, 2008/0050310, 20050169933, 2009/0274713, 2010/0129314 y aquellas disponibles de Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA) e incluyen, de modo no taxativo, 4- (maleimidometil ) ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC), N-succinimidil-4- (N-maleimidometil ) -ciclohexano-1-carboxi- ( 6-amidocaproato ) , que es un análogo de "cadena larga" de SMCC (LC-SMCC) , éster de N-succinimidilo del ácido ?-maleimidoundecanoico (KMUA), éster de N ' succinimidilo del ácido ?-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido e-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N- ( oi-maleimidoacetoxi ) -succinimida (AMAS), succinimidil-6-( ß-maleimidopropionamido ) hexanoato (SMPH), 4-(p-maleimidofenil ) -butirato de N-succinimidilo (SMPB) y N-(p-maleimidofenil ) isocianato ( PMPI ) . ' Los reactivos de reticulación que comprenden un resto basado en halocetilo incluyen N-succinimidil-4- ( yodoacetil ) -aminobenzoato (SIAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA), y 3- ( bromoacetamido ) propionato de N-succinimidilo (SBAP), bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, éster de ?-(ß-maleimidopropiloxi ) succinimida (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4- ( 4 -N-maleimidofenil ) -butírico hidrazida »HC1 (MPBH), Succinimidil- ( 4 -vinilsulfonil ) enzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1, 4-bis-maleimidobutano ( BMB ) , 1 , -bismaleimidi 1-2 , 3-dihodroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), 4 -( N-maleimido-metil ) ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo ( sulfo-SMCC) , sul fosuccinimidil ( 4 -yodo-acetil ) aminobenzoato (sulfo-SIAB) , éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo- MBS ) , éster de N- (?-maleimidobutriloxi ) sul fosuccinimida (sulfo-GMBS) , éster de ?-(e- maleimidocaproiloxi ) sulfosuccimido ( sul fo-EMCS ) , éster de N- (?-maleimidoundecanoiloxi ) sulfosuccinimida ( sul fo-KMUS ) , 4- (p-maleimidofenil ) butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo- SMPB) , CX1-1, sulfo-Mal y PEGn-Mal. Preferentemente, el reactivo de reticulación bifuncional es SMCC.
En una modalidad, el reactivo enlazador es un enlazador escindible. Los ejemplos de enlazadores escindibles adecuados incluyen enlazadores de disulfuro, enlazadores lábiles de ácido, enlazadores fotolábiles, enlazadores lábiles de peptidasa y enlazadores lábiles de esterasa. Los enlazadores que contienen disulfuro son enlazadores escindibles a través del intercambio de disulfuro, que puede ocurrir en condiciones fisiológicas. Los enlazadores lábiles de ácido son enlazadores escindibles a pH ácido. Por ejemplo, determinados compartimentos intracelulares , tales como endosomas y lisosomas, tienen un pH ácido (pH 4-5), y proporcionan condiciones adecuadas para escindir enlazadores lábiles de ácido. Los enlazadores fotolábiles son útiles en la superficie corporal y en muchas cavidades corporales que son accesibles a la luz. Asimismo, la luz infrarroja puede penetrar el tejido. Los enlazadores lábiles de peptidasa pueden usarse para escindir determinados péptidos dentro o fuera de las células (véase p. ej . , Trouet et ál., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 79: 626-629 (1982), y Umemoto et ál., Int. J. Cáncer, 43: 677-684 (1989)). En una modalidad, el enlazador escindible se escinde bajo condiciones moderadas, es decir, condiciones dentro de una célula en la que la actividad del agente citotoxico no se ve afectada.
En otra modalidad, el agente citotoxico está- enlazado a un agente de unión celular a través de un enlace de disulfuro. La molécula enlazadora comprende un grupo químico reactivo que puede reaccionar con el agente de unión celular.
Los grupos químicos reactivos preferidos para su reacción con el agente de unión celular son ésteres de N-succinimidilo y ésteres de N-sulfosuccinimidilo . Adicionalmente la molécula enlazadora comprende un grupo químico reactivo, preferentemente un grupo ditiopiridilo, que puede reaccionar con el agente citotóxico para formar un enlace disulfuro. Los reactivos de reticulación bifuncionales que permiten el enlace del agente de unión celular con el agente citotóxico a través de los enlaces disulfuro son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, 3- ( 2-piridilditio ) propionato de N-succinimidilo (SPDP) (véase, p. ej . , Carlsson et ál., Bioche . J. , 173: 723-737 (1978)), 4-(2-piridilditio) butanoato de N-succinimidilo (SPDB) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 4,563,304), 4-(2-piridilditio ) pentanoato de N-succinimidilo (SPP) (véase, por ejemplo, número de Registro CAS 341498-08-6), y N-succinimidil-4- ( 2-piridilditio ) 2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud estadounidense N.° 2009/0274713). En la técnica se conocen otros reactivos de reticulación bifuncionales que pueden usarse para introducir grupos disulfuro y se describen en las patentes estadounidenses 6,913,748, 6,716,821 y en las publicaciones de solicitud de patente .estadounidense 2009/0274713 y 2010/0129314, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Otros reactivos de reticulación que carecen de un átomo de azufre que forman enlazadores no escindibles pueden usarse también en el método de la invención. Dichos enlazadores pueden derivar de restos a base de ácido dicarboxílico . Los restos a base de ácido dicarboxílico adecuados incluyen, de modo no taxativo, ácidos a, ?-dicarboxílieos de la fórmula general ( I ) : HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH (IX) , donde X es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo lineal o ramificado que tiene de 2 a -20 átomos de carbono, Y es un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo con 3 a 10 átomos de carbono, Z es un grupo aromático sustituido o no sustituido con 6 a 10 átomos de carbono, o un grupo heterocíclico sustituido o no sustituido donde el heteroátomo se selecciona de N, O o S, y donde 1, m y n son cada uno 0 o 1, siempre que 1, m y n no sean todos cero al mismo tiempo.
Varios de los enlazadores no escindibles divulgados en la presente se describen en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2005/0169933 Al.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deberían entenderse como que limitan de manera alguna su alcance.
Ejemplo 1 Se hizo reaccionar el anticuerpo CD37-3 humanizado con el reactivo de reticulación heterobi funcional SMCC y el maitansinoide DM1 usando un proceso descrito previamente (p. ej . La patente estadounidense 5,208,020), asi como el proceso de una etapa que es el objeto de la presente solicitud.
Para el proceso descrito previamente, huCD37-3 (15 mg/mL) se hizo reaccionar primero con SMCC (exceso molar de 6.5 veces en relación a la cantidad de anticuerpo) para formar el anticuerpo modificado. La reacción de modificación se llevó a cabo a 16 °C en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 6.9) que contenía EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante 90 minutos. La reacción se inactivo con acetato 1 M para ajustar el pH a 4.5 y el anticuerpo modificado se purificó usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida con acetato de sodio 20 mM (pH 4.5) que contenía EDTA 2 mM. Después de la purificación, el anticuerpo modificado (5 mg/mL) se hizo reaccionar con el maitansinoide DM1 (exceso molar de 6.8 veces en relación con la cantidad de anticuerpo; exceso de 1.3 veces en relación con la cantidad medida de enlazador en el anticuerpo) para formar el anticuerpo conjugado. La reacción de conjugación se llevó a cabo a 20 °C en amortiguador de acetato de sodio 20 mM (pH 5.0) que contenía EDTA 2 mM y DMA al 5% durante aproximadamente 20 horas. La mezcla de reacción se purificó usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5.0) .
Para el proceso de la invención, huCD37-3 (2.5 mg/mL) se mezcló con DM1 (exceso molar de 6.2 veces en relación con la cantidad de anticuerpo) y después con SMCC (exceso de 5.2 veces en relación a la cantidad de anticuerpo) . La reacción se llevó a cabo a 20 °C en amortiguador EPPS [ácido 4- (2-Hidroxietil ) -1-piperazinpropanosul fónico ] 50 mM (pH 8.1) que contenía EDTA 2 mM y DMA al 10 % durante aproximadamente 2 horas. La reacción se inactivo mediante la adición de acetato 1 M para ajustar el pH a 5.0. Luego la mezcla de reacción se retuvo a 2 - 8 °C durante aproximadamente 20 horas. Después de la retención, la mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de PVDF de 0.2 µp\ y se purificó y sometió a diafiltración en succinato de sodio 10 mM (pH 5.0) usando filtración de flujo tangencial (TFF) .
El conjugado derivado de los dos procesos se analizó mediante: espectroscopia UV para verificar la concentración y la carga de agente citotóxico (relación de maitansinoide respecto al anticuerpo, MAR); espectrometría de masas para determinar el nivel de enlazador no conjugado; electroforesis SDS PAGE reducida para determinar el nivel de la especie no reducible; y SEC-HPLC para determinar el monómero conjugado; y estabilidad durante el almacenamiento respecto a la liberación de maintansinoide libre y monómero del conjugado.
La concentración y la relación de maitansinoide respecto al anticuerpo (MAR) se determinaron mediante la medición de la absorbancia del conjugado a 252 y 280 nm en un espectrofotómetro UV-VIS y usando los coeficientes de extinción molar de DM1 y del anticuerpo a las dos longitudes de onda, para calcular las concentraciones molares del anticuerpo y de DM1.
El nivel de enlazador no conjugado de los conjugados se analizó mediante espectrometría de masas: se midieron las áreas de pico de la especie conjugada individual (incluyendo conjugados con o sin enlazadores no conjugados); se calculó el nivel de enlazador no conjugado mediante la proporción de la suma de áreas que contenían enlazadores no conjugados (pesada mediante el número de enlazadores) respecto a la suma de áreas de todas las especies conjugadas (también pesada mediante el número de enlazadores).
El nivel de especies no reducibles de los conjugados se analizó mediante electroforesis en gel SDS reducida: se midieron las áreas pico de las especies de conjugados individuales reducidas (incluyendo cadena ligera reducida, cadena pesada reducida, cadena ligera-ligera reticulada, cadena ligera-pesada reticulada, etc.); en nivel de especies no reducibles se calculó mediante la proporción de la suma de áreas de especies no reducibles respecto a la suma de las áreas de todas las especies.
El nivel de monómeros de los conjugados se analizó mediante HPLC de exclusión por tamaño: las áreas pico de especies de bajo peso molecular, monómeros, dímeros y agregados se midieron usando un detector de absorbancia a una longitud de onda de 252 nm o 280 nm; el nivel de monómero se calculó mediante la proporción de área de monómero respecto al área total.
La cantidad de maitansinoide libre presente en el conjugado se analizó mediante HPLC en doble columna (columnas HiSep y C18): las áreas pico del total de especies de maitansinoide libre (eluido en el gradiente e identificado en comparación con el tiempo de elusión con estándares conocidos) se midieron usando un detector de absorbancia a una longitud de onda de 252 nm; la cantidad de maitansinoide libre se calculó usando una curva estándar generada por las áreas pico de la cantidad conocida de estándares.
Como se muestra en la Tabla 1 a continuación, el conjugado elaborado usando el proceso de la invención fue superior al elaborado usando el proceso previamente descrito, con respecto al enlazador no conjugado, especie no reducible y monómero del conjugado. A su vez, la estabilidad del conjugado elaborado mediante el proceso de la invención resultó considerablemente superior con respecto a la liberación de maitansinoide libre luego de su almacenamiento durante cinco meses a 4 °C. Los niveles de monómeros de los conjugados elaborados mediante ambos procesos resultaron estables .
Tabla 1. Comparación de propiedades clave del conjugado CD37-3 elaborado mediante el proceso de la invención en comparación con el proceso anterior Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran un proceso mejorado para preparar conjugados de agente de unión celular y agente citotóxico que tienen una pureza considerablemente alta. Además de las mejoras a la pureza y estabilidad del conjugado utilizando el proceso de la invención, también se presentan mejoras en los tiempos de procesamiento y conveniencia, como resultado de la eliminación de dos etapas del proceso (la reacción de modificación y la purificación del anticuerpo modificado).
Ej emplo 2 El anticuerpo huMovl9 receptor de folato humanizado (véase la publicación de solicitud estadounidense 2012/0009181) se hizo reaccionar con el reactivo de reticulación bifuncional sulfo-SPDB y el maitansinoide DM4 usando dos proceso descritos previamente, asi como el proceso mejorado que es el sujeto de la presente solicitud.
Para el Proceso A descrito anteriormente (proceso de dos etapas, p. ej . chari et ál., US 5, 208,020), se hizo reaccionar el anticuerpo huMovl9 (20 mg/mL) en primer lugar con sulfo-SPDB (exceso molar de 5.7 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA, dimeti lacetámida ) para formar el anticuerpo modificado. La reacción de modificación se llevó a cabo a 20 °C en un amortiguador de EPPS (4- (ácido 2-hydroxyethyl ) piperazin-l-propanesulfónico ) 50 mM (pH 8.1) con 5% DMA durante 180 minutos. El anticuerpo modificado se purificó usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en. EPPS 50 mM (pH 8.1) con EDTA (ácido ethylenediaminetetraacético ) 2 mM. Después de la purificación, el anticuerpo modificado (5.0 mg/mL) se hizo reaccionar con el maitansinoide DM4 (Disuelto en DMA; exceso molar de 9.7 veces en relación a la cantidad del anticuerpo; exceso de 1.7 veces en relación con la cantidad medida de enlazador en el anticuerpo) para formar el anticuerpo conjugado. La reacción de conjugación se llevó a cabo a temperatura ambiente en EPPS 50 mM (pH 8.1) que contenía EDTA 2mM y DMA al 5% durante aproximadamente 18 horas. Luego, la mezcla de reacción se purificó usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de. sodio 10 mM (pH 5.0).
Para el Proceso B descrito anteriormente (proceso de un recipiente, Dai et ál., patente estadounidense 7,811,572), se hizo reaccionar el anticuerpo huMovl9 (10 mg/mL) en primer lugar con sulfo-SPDB (exceso molar de 4.9 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) para formar el anticuerpo modificado. La reacción de modificación se llevó a cabo a 20 °C en amortiguador de EPPS 50 mM (pH 7.5) que contenia EDTA 2 mM y DMA al 10% durante 60 minutos. El anticuerpo modificado no se purificó previo a la reacción de conjugación. En su lugar, el anticuerpo modificado sin purificar se hizo reaccionar a 10 mg/mL con el maitansinoide DM4 (exceso molar de 8.3 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) para formar el anticuerpo con ugado. La reacción de conjugación se llevó a cabo a temperatura ambiente en amortiguador EPPS 50 mM (pH 7.5) que contenia EDTA 2mM y DMA al 10% durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se purificó usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5.0).
Para el proceso de la invención en que se utilizó G-25 Sephadex (Proceso C, proceso de una etapa) para purificar el conjugado, se mezcló anticuerpo huMovl9 (6.0 mg/mL) con DM4 (exceso molar de 9.7 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) y después se agregó sulfo-SPDB (exceso molar de 5.7 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) . La reacción se llevó a cabo a 20 °C en amortiguador de EPPS 50 mM (pH 8.1) que contenía EDTA 2 mM y DMA al 10% durante aproximadamente 20 horas. La mezcla de reacción se purificó usando una columna de resina G-25F Sephadex equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5.0).
Para el proceso de la invención en que se utilizó filtración de flujo tangencial (TFF) (Proceso D, proceso de una etapa) para purificar el conjugado, se mezcló anticuerpo huMovl9 (5.0 mg/mL) con DM4 (exceso molar de 10.2 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) y después con sulfo-SPDB (exceso molar de 6.0 veces en relación a la cantidad de anticuerpo, disuelto en DMA) . La reacción se llevó a cabo a 20 °C en amortiguador de EPPS 50 mM (pH 8.5) que contenia EDTA 2 mM y DMA al 10% durante aproximadamente 20 horas. Luego, la mezcla de reacción se purificó y se lo sometió a diafiltración utilizando una TFF en succinato de sodio 10 mM (pH 5.0).
El conjugado derivado de los diferentes procesos se analizó mediante: Espectroscopia UV (para concentración y la relación de maitasinoide respecto a anticuerpo, MAR) ; HPLC de fase inversa para determinar los maitansínoides libres; Espectrometría de masas para la determinación de niveles de enlazadores sin conjugar perfil de distribución de masa; electroforesis SDS PAGE reducida para determinar el nivel de especies no reducibles; electroforesis SDS PAGE no reducida para la determinación del nivel de fragmentación; SEC-HPLC para determinar los monómeros del conjugado. La estabilidad durante el almacenamiento se evaluó en lo que refiere al monómero del conjugado y la liberación de maitansinoide libre. Se suministra información adicional sobre las metodologías analíticas en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 2, a continuación, el conjugado elaborado usando el proceso de la invención fue superior al elaborado usando los procesos previamente descritos con respecto al monómero. El conjugado elaborado utilizando los procesos de un recipiente y una etapa en que la purificación final del conjugado se realizó utilizando G-25 Sephadex, Procesos B y C, respectivamente, presentó un nivel más alto de maitansinoide libre que el conjugado elaborado utilizando el proceso de dos etapas, Proceso A. Sin embargo, cuando se utilizó un proceso de purificación final diferente, TFF (Proceso D), el nivel de maitansinoide libre fue muy bajo y comparable con el encontrado en los procesos de dos etapas, ambos después de la purificación inicial y después del almacenamiento a 4 °C durante seis semanas. En lo que respecta a los otros atributos importantes del conjugado (p. ej '. fragmentación, especies no reducibles, perfil de distribución de masa y enlazador sin conjugar), el conjugado elaborado utilizando el proceso inventivo fue equivalente al elaborado mediante los procesos descritos anteriormente.
Tabla 2. Comparación de propiedades clave del conjugado huMovl9 elaborado mediante el proceso de la invención en comparación con procesos anteriores.
* Purificado con G-25 Sephadex ** Purificado utilizando TFF Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran un proceso mejorado para preparar conjugados de agente de unión celular y agente citotóxico que tienen una pureza considerablemente alta. Además de las mejoras a la pureza y estabilidad del conjugado utilizando el proceso de la invención, también se presentan mejoras en los tiempos de procesamiento y conveniencia, como resultado de la eliminación de dos etapas del proceso (la reacción de modificación y la purificación del anticuerpo modificado).
Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra que el proceso de una etapa que se describe en la presente se puede utilizar para elaborar conjugados a partir de varios enlazadores y agentes citotóxicos de maitansinoide .
El anticuerpo humanizado huN901 se mezcló con maitansinoide (DM1 o DM4) y después con un enlazador (Sulfo-SMCC, SMCC, SPDB, o SPP) . La reacción se realizó a 20 °C en amortiguador de fosfato 50 mM (pH 7.5) que contenía EDTA 2 mM y 10% DMA durante aproximadamente 20-24 horas. La mezcla de reacción luego se purificó usando una columna de resina G25F Sephadex, equilibrada y eluida en succinato de sodio 10 mM (pH 5.0).
Como se muestra en la Tabla 3 a continuación, la reacción de una etapa se puede realizar con diferentes combinaciones de enlazador y maitansinoide y producir un conjugado con buenos niveles de MAR y de monómeros .
Tabla 3. Elaboración de conjugados utilizando diferentes combinaciones de enlazador y maitansinoide Todas las referencias, incluyendo publicaciones, solicitudes de patente y patentes, citadas en la presente se incorporan a la presente mediante referencia en la misma medida como si cada referencia se indicara individual o específicamente como incorporada mediante referencia y se establecieran en su totalidad en la presente.
El uso de los términos "un", "una" y "el" y referentes similares utilizados en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se deben interpretar como abarcativos tanto del singular como del plural, salvo que se indique lo contrario en la presente o que el contexto lo contradiga claramente. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (esto es, como que significan "que incluye, de modo no taxativo"), a menos que se indique lo contrario. La mención de intervalos de valores en la presente meramente pretende servir como un método taquigráfico para referirse individualmente a cada valor separado que está dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en la presente. Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado, salvo que se indique lo contrario en la presente o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cualquiera de los ejemplos o las expresiones de ejemplo (por ejemplo, "tal como") que se proporcionan en la presente, pretende meramente esclarecer la invención y no representa una limitación al alcance de la invención, a menos que se reivindique lo contrario. No se debe interpretar ninguna expresión en la memoria descriptiva como una indicación de que algún elemento no reivindicado es esencial para la puesta en práctica de la invención .
Las modalidades preferidas de esta invención se describen en la presente, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para desarrollar la invención. Las variaciones de esas modalidades preferidas serán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la descripción que antecede. Los inventores esperan que los expertos utilicen tales variaciones según sea apropiado y pretenden que la invención se practique de una forma diferente a la que se describe específicamente en la presente. Por lo tanto, la presente invención incluye todas las modificaciones y los equivalentes de la materia mencionada en las reivindicaciones adjuntas a la presente según permita la legislación pertinente. Adicionalmente, toda combinación de los elementos antedichos en todas las variaciones posibles de los mismos se encuentra incluida en la invención, salvo que se indique lo contrario en la presente o que lo contradiga claramente el contexto.

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES :
1. Un proceso para preparar un con ugado de agente de unión celular y agente citotóxico que comprende la etapa de : (a) poner en contacto un agente de unión celular con un agente citotóxico para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotóxico, luego poner en contacto la primera mezcla con un reactivo de reticulación bifuncional que comprende un enlazador, en una solución que tiene un pH de alrededor de 4 a alrededor de 9 para proporcionar una segunda mezcla que comprende (i) el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico, donde el agente de unión celular está acoplado químicamente a través del enlazador al agente citotóxico, (ii) agente citotóxico libre, y (iii) subproductos de reacción.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde el proceso comprende adicionalmente el paso de: (b) purificar la segunda mezcla que comprende el conjugado de agente de unión celular y agente citotóxico para proporcionar un conjugado de agente de unión celular y agente citotoxico purificado.
3. El proceso de la reivindicación 2 done la segunda mezcla se purifica al someter la mezcla a filtración de flujo tangencial, precipitación selectiva, filtración de adsorción, cromatografía de adsorción, cromatografía de no adsorción o una combinación de estas, para purificar el conjugado de agente de unión celular y agente citotoxico del agente citotoxico libre y de subproductos de reacción.
4. El proceso de la reivindicación 3, donde la segunda mezcla se purifica al someter la mezcla a filtración de flujo tangencial.
5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la puesta en contacto en la etapa (a) se efectúa al colocar el agente de unión celular en un recipiente de reacción, agregar el agente citotoxico al recipiente de reacción para formar una primera mezcla que comprende el agente de unión celular y el agente citotoxico, y luego agregar el reactivo de reticulación bifuncional a la primera mezcla .
6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2-5 que comprende adicionalmente retener la segunda mezcla entre las etapas (a) - (b) para liberar los enlazadores unidos de manera inestable del agente de unión celular.
7. El proceso de la reivindicación 6, donde la segunda mezcla se retiene durante alrededor de 20 horas a una temperatura de alrededor de 2 ° C a alrededor de 8o C.
8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7 que comprende adicionalmenté inactivar la segunda mezcla entre las etapas (a) - (b) para inactivar cualquier agente citotóxico sin reaccionar y/o reactivo de reticulación bifuncional sin reaccionar.
9. El proceso de la reivindicación 8, donde la mezcla se inactiva mediante la puesta en contacto de la segunda mezcla con un reactivo de inactivación que reacciona con el. agente citotóxico libre.
10. El proceso de la reivindicación 9, donde el reactivo de inactivación se selecciona, del grupo que consiste en ácido 4-maleimidobutírico, ácido 3-maleimidopropiónico, N-etilmaleimida , yodoacetamida y ácido yodoacetamidopropiónico.
11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la puesta en contacto en la etapa (a) ocurre en una solución que tiene un pH de alrededor de 7 a alrededor de 9.
12. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la puesta en contacto en la etapa (a) ocurre a una temperatura de alrededor de 16 °C a alrededor de 24 °C.
13. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la puesta en contacto en la etapa (a) ocurre a una temperatura de alrededor de 0 °C a alrededor de 15 °C.
1 . El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el agente de unión celular es un anticuerpo.
15. El proceso de la reivindicación 14, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
16. El proceso de la reivindicación 15, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.
17. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huN901, huMy9-6, huB4, huC242, t rastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, CNT095, huDS6, rituximab, anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD27L, anti-EGFRvIII, Cripto, anti-CD138, anti-CD38, anti-EphA2, anticuerpo dirigido a integrina, anti-CD37, anti-folato, anti-Her3 y anti-IGFIR.
18. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1- 17, donde el agente citotóxico es un maitansinoide .
19. El proceso de la reivindicación 18, donde el maitansinoide comprende un grupo tiol.
20. El proceso de la reivindicación 19, donde el maitansinoide es N2 ' -deacetil-N2' - ( 3-mercapto-l-oxopropil ) -maitansina (DM1).
21. El proceso de la reivindicación 19, donde el maitansinoide es N2' -deacetil-N2 ' - ( 4-metil-4-mercapto-l-oxopentil ) -maitansina (DM4).
22. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, donde el agente de unión celular está acoplado químicamente al agente citotóxico por medio de enlaces químicos seleccionados del grupo que consiste en enlaces disulfuro, enlaces ácidos lábiles, enlaces fotolábiles, enlaces peptidasa lábiles, enlaces tioéter y enlaces estearasa lábiles.
23. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, donde el reactivo de reticulación bifuncional comprende un resto de éster de N-succinimidilo, un resto de éster de N-sulfosuccinimidilo, un resto a base de maleimido o un resto a base de haloacetilo.
24. El proceso de la reivindicación 23, donde el reactivo de reticulación bifuncional se selecciona del grupo que consiste en SPDP, SPP, SPDB, sulfo-SPDB, SMCC, PEG-mal, sulfo-Mal y CX1-1. ·
25. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde la solución en la etapa (a) comprende sacarosa.
26. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, donde la solución en la etapa (a) comprende un agente amortiguador seleccionado del grupo que consiste en un amortiguador citrato, un amortiguador acetato, un amortiguador succinato y un amortiguador fosfato.
27. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, donde la solución en la etapa (a) comprende un agente amortiguado que se selecciona del grupo que consiste en HEPPSO (ácido N- ( 2-hidroxietil ) piperazina-N '-( 2-hidroxipropanosul fónico ) ) , POPSO (dehidrato de piperazina-1, 4-bis- (ácido 2-hidroxi-propano-sulfónico)), HEPES (ácido 4-( 2-hidroxietil ) piperazina-l-etanosul fónico ) , HEPPS (EPPS) (ácido 4- ( 2-hidroxietil ) piperazina-l-propanosul fónico ) , TES (ácido N- [ tris ( hidroximetil ) metil ] -2-aminoetanosul fónico ) , y combinaciones de estos.
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