ES2629743T3 - Procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato - Google Patents

Procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato, que comprende hacer reaccionar un compuesto activador de ácido fosfórico representado por la siguiente fórmula [II] o [III] con un compuesto de ácido fosfórico seleccionado entre el grupo que consiste en UMP, UDP, UTP y un ácido pirofosfórico o una sal del mismo, excluyendo UTP libre, en agua o un disolvente orgánico hidrofílico, en presencia de un ión metálico seleccionado entre el grupo que consiste en un ión de hierro (II), un ión de hierro (III), un ión de aluminio trivalente, un ión de lantano trivalente y un ión de cerio trivalente.**Fórmula** donde R1 representa un grupo uridilo que se une a la posición 5'; X representa un grupo heterocíclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo; y n representa un número entero de 1 o 2,**Fórmula** donde X representa un grupo heterocíclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un novedoso procedimiento eficaz para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato. Tecnica antecedente
Se usa P1, P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato (en lo sucesivo en este documento "UP4U") representado por la siguiente formula [I] o una sal del mismo como farmaco terapeutico para el trastorno del epitelio queratoconjuntivo que acompana al ojo seco y es tambien un compuesto que tiene un efecto inductor de la expectoracion y por tanto se preve que se desarrolle como un expectorante o un farmaco terapeutico para la neumonfa.
Convencionalmente, como procedimiento para sintetizar UP4U, se ha presentado un procedimiento para hacer reaccionar el acido uridina 5'-trifosforico cfclico preparado por condensacion de deshidratacion de acido uridina 5'- trifosforico (UTP) con acido uridina 5'-monofosforico (UMP) (Documento de no Patente 1) y un procedimiento mejorado del mismo (Documento de Patente 1).
imagen1
Listado de citas
Documentos de Patentes
Documento de Patente 1: WO 2008/012949 A Documento de Patente 2: WO 2008/024169 A
Documentos de no Patentes
Documento de no Patente 1: Bioorg. & Medicinal Chemistry Letters, vol. 11, 157 a 160 (2001),
Documento de no Patente 2: Org. Biomol. Chem., 2011, N.° 9, 730 to 738 (2011)
Shaver y col., Purinergic Signalling, 2005, 1, 183-191 divulga relaciones de la actividad estructural de los dinucleosidos.
Sumario de la invencion
Problema tecnico
Sin embargo, la tecnica anterior descrita en los documentos anteriores tenia margen de mejora en los puntos siguientes.
En primer lugar, el procedimiento del Documento de Patente 1 puede sintetizar UP4U con un alto rendimiento de 80 % o mas a nivel de laboratorio, pero plantea problemas en la produccion en masa a escala industrial por el procedimiento.
Especificamente, en el procedimiento del Documento de Patente 1, es necesario usar un material de partida UTP en una forma de sal de una amina terciaria tal como tri-n-butilamina, con el fin de llevar a cabo una reaccion para formar acido 5- trifosforico cfclico a parti r de 5'-UTP. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para preparar previamente una sal trisodica de UTP en una UTP libre (libre de UTP) mediante una cromatografia en columna de intercambio ionico y, entonces formar una sal con una amina terciaria. Sin embargo, como se verifica en los ejemplos de ensayo expuestos a continuacion, el material libre de UTP es muy inestable, por tanto, es muy dificil usar UTP libre como material de partida en la produccion en masa a escala industrial.
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En segundo lugar, con el fin de sintetizar eficientemente acido 5' trifosforico cfclico a partir de UTP, es necesario mantener la sal de tributilamina de UTP en un estado deshidratado inmediatamente antes de la reaccion. Sin embargo, como se verifica tambien en el ensayo comparative expuesto a continuacion, en la produccion en masa a escala industrial, cuando la sal de tri-n-butilamina de UTP se deshidrata azeotropicamente, se produce una reaccion de descomposicion termica de UTP y por tanto la pureza de UTP se reduce y, por consiguiente, se reduce la eficiencia sintetica.
Como se ha descrito anteriormente, no se puede decir que el procedimiento del Documento de Patente 1 que usa UTP como material de partida sea un procedimiento optimo para la produccion industrial en masa de UP4U. Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es desarrollar un nuevo procedimiento de produccion que pueda evitar la reduccion de la eficiencia sintetica debido a la descomposicion de un material de partida, al no usar UTP libre, o evitando la operacion de deshidratacion de la sal de UTP para sintetizar acido uridina 5'-trifosforico cfclico.
Solucion al problema
Como procedimiento para evitar los problemas en el procedimiento de sfntesis descrito en el Documento de Patente 1, se consideran, o ya se conocen, los dos procedimientos siguientes mostrados en los siguientes A y B.
(A) Un procedimiento para sintetizar UP4U, usando UMP no UTP como material de partida, preparando UTP a partir de UMP en el sistema de reaccion y aplicando entonces el procedimiento del Documento de Patente 1 sin purificacion (en lo sucesivo en este documento "procedimiento de sfntesis en un solo recipiente").
(B) Un procedimiento para sintetizar UP4U activando un acido pirofosforico por imidazol para sintetizar pirofosfato de diimidazolilo y condensarlo con UMP (en lo sucesivo en este documento "antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo", Documento de Patente 2, Documento de no Patente 2).
Sin embargo, el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente y el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo se realizaron ambos usando un disolvente organico tal como dimetilformamida (DMF) como disolvente de reaccion de sfntesis de UP4U en medio anhidro. Por otra parte, UMP, UTP, acido pirofosforico y similares usados como materiales de partida de la reaccion son todos compuestos altamente hidrofflicos, por tanto estos materiales de partida deben someterse a una etapa de deshidratacion en cada procedimiento, con el fin de someterse a la reaccion. En concreto, un pirofosfato tenia el problema de que la solubilidad en un disolvente organico es tambien pobre, el manejo requiere precaucion y similares.
Asimismo, los presentes inventores estudiaron adicionalmente para los dos procedimientos de sfntesis mejorados anteriores. En primer lugar, cuando se estudio en detalle el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente, el rendimiento del producto objetivo UP4U se redujo en gran medida hasta aproximadamente un 40 %, como se muestra en los ejemplos expuestos a continuacion. Ademas, cuando se llevo a cabo el procedimiento del Documento de Patente 1 como el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente, se generaron diversos subproductos, por tanto, se puso de manifiesto que es necesaria una purificacion compleja mediante cromatograffa en columna para la separacion.
A continuacion, tambien se estudio en detalle el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo. Como resultado, se descubrio recientemente que los subproductos se generaron mucho tambien en el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo y el rendimiento de UP4U, un producto final, relativo a UMP esta lejos de ser alto, como se muestra en los ejemplos expuestos a continuacion. Mas especfficamente, se hizo evidente que tanto el procedimiento en un solo recipiente como el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo no se pueden poner como un procedimiento de sfntesis adecuado para la produccion en masa de UP4U a escala industrial.
Por lo tanto, los presentes inventores han realizado estudios exhaustivos para establecer un procedimiento eficiente para sintetizar UP4U adecuado para la produccion industrial en masa y por consiguiente, han descubierto que, mediante un simple procedimiento de combinar (a) un compuesto activador de acido fosforico sintetizado por condensacion de acido uridina 5-difosforico (UDP), UMP o un acido pirofosforico con un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en imidazol, bencimidazol y 1,2,4-triazol que tiene opcionalmente un sustituyente y (b) un compuesto de acido fosforico seleccionado entre el grupo que consiste en UMP, UDP, UTP y un acido pirofosforico o una sal del mismo (excluyendo UTP libre) y hacer reaccionar los compuestos en agua o un disolvente organico hidrofflico, en presencia de un ion metalico seleccionado entre el grupo que consiste en un ion de hierro (II), un ion de hierro (III), un ion de aluminio trivalente, un ion de lantano trivalente y un ion de cerio trivalente, como catalizador, se podrfa evitar el uso de UTP libre y la operacion de deshidratacion de la sal de UTP y UP4U se podrfa sintetizar con un alto rendimiento con menos subproducto. La presente invencion se ha logrado sobre la base de este hallazgo.
Mas especfficamente, la presente invencion proporciona un procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'- )tetrafosfato, que comprende hacer reaccionar un compuesto activador de acido fosforico representado por la siguiente formula [II] o [III] con un compuesto de acido fosforico seleccionado entre el grupo que consiste en UMP, UDP, UTP y un acido pirofosforico o una sal del mismo (excluyendo UTP libre) en agua o un disolvente organico hidrofflico, en presencia de un ion metalico seleccionado entre el grupo que consiste en un ion de hierro (II), un ion
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de hierro (III), un ion de aluminio trivalente, un ion de lantano trivalente y un ion de cerio trivalente.
imagen2
donde R1 representa un grupo uridilo que se une a la posicion 5'; X representa un grupo heterodclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo; y n representa un numero entero de 1 o 2.

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II II
X—P—o—P—X

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donde X representa un grupo heterodclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo.
Efectos ventajosos de la invencion
El procedimiento de produccion de la presente invencion puede sintetizar UP4U con un alto rendimiento, evitando al mismo tiempo el uso de UTP libre y la operacion de deshidratacion de la sal de UTP. Asimismo, en el procedimiento de produccion de la presente invencion, casi no se produce ningun subproducto, por tanto es facil la purificacion de UP4U. Ademas, se lleva a cabo una reaccion en condiciones hidrofflicas, a traves de la cual se puede omitir una etapa de deshidratacion complicada. Mas espedficamente, el procedimiento de produccion de la presente invencion es muy adecuado para la smtesisindustrial en masa de UP4U.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 ilustra un grafico de HPLC que analiza un producto en una mezcla de reaccion cuando se sintetiza UP4U mediante el procedimiento de la presente invencion. En la figura, el 10° pico ilustra un producto objetivo UP4U y el 6° pico ilustra un material de partida UDP.
La Fig. 2 ilustra un grafico de HPLC que analiza un producto en una mezcla de reaccion cuando se sintetiza UP4U mediante el procedimiento de smtesis en un solo recipiente. En la figura, el 19° pico ilustra un producto objetivo UP4U y el 5° pico ilustra un material de partida UMP.
La Fig. 3 ilustra un grafico de HPLC que analiza un producto en una mezcla de reaccion cuando se sintetiza UP4U mediante el procedimiento de la presente invencion. En la figura, el 16° pico ilustra un producto objetivo UP4U y el 6° pico ilustra un material de partida UMP.
La Fig. 4 ilustra un grafico de HPLC que analiza un producto en una mezcla de reaccion cuando se sintetiza UP4U mediante el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo (sin catalizador). En la figura, el 17° pico ilustra un producto objetivo UP4U y el 5° pico ilustra un material de partida UMP.
La Fig. 5 ilustra un grafico de HPLC que analiza un producto en una mezcla de reaccion cuando se sintetiza UP4U mediante el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo (catalizador ZnCh). En la figura, el 16° pico ilustra un producto objetivo UP4U y el 5° pico ilustra un material de partida UMP.
La Fig. 6 ilustra un grafico de HPLC que analiza un producto en una mezcla de reaccion cuando se sintetiza UP4U mediante el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo (catalizador tetrazol). En la figura, el 20° pico ilustra un producto objetivo UP4U y el 5° pico ilustra un material de partida UMP. Descripcion de las realizaciones
Mas adelante en el presente documento, se describira en detalle la realizacion de la presente invencion.
<Compuesto activador de acido fosforico>
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El compuesto activador de acido fosforico usado en la presente invencion es un compuesto representado por la formula [II] o [III], y sintetizado por condensacion de UMP, UDP o un acido pirofosforico con imidazol, bencimidazol o 1,2,4 triazol que tiene opcionalmente un sustituyente.
imagen3
donde R1 representa un grupo uridilo que se une a la posicion 5'; X representa un grupo heterocfclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo; y n representa un numero entero de 1 o 2.

0 O

II II
X—P—o—P—X

1 I

HO HO
[ HI ]
donde X representa un sustituyente heterocfclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo.
El sustituyente heterocfclico representado por X incluye un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo, un grupo 1,2,4-triazolilo y similares. Asimismo, estos grupos heterocfclicos pueden tener un sustituyente en el grupo heterocfclico y ejemplos del sustituyente incluyen grupos alquilo C1-6, grupos nitro, grupos ciano y similares.
El compuesto activador de acido fosforico descrito anteriormente incluye especfficamente UDP-imidazolida, UDP- triazolida, UMP-imidazolida, pirofosfato de diimidazolilo y similares y estos compuestos se pueden preparar de acuerdo con un procedimiento conocido (Nucleic Acids Research, vol. 4, 2843 (1977), Journal of American Chemical Society, vol. 126, 9548 (2004)).
En la sfntesis de UP4U, se puede usar una mezcla del compuesto activador de acido fosforico tal como UDP- imidazolida, UDP-triazolida, UMP-imidazolida o pirofosfato de diimidazolilo o una solucion concentrada de la misma tal como esta o usarse despues de purificada segun sea necesario.
<Compuesto de acido fosforico>
El compuesto de acido fosforico de la presente invencion es un compuesto representado por la siguiente formula (IV) o una sal del mismo y especfficamente incluye UMP, UDP, UTP, un acido pirofosforico y sus sales, excepto UTP libre.
imagen4
donde R2 representa un grupo uridilo que se une al atomo de hidrogeno o a la posicion 5'; y m representa un numero entero de 1 a 3.
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El compuesto de acido fosforico se puede usar en forma de una sal de metal alcalino tal como sodio y potasio, una sal de amonio terciaria tal como trietilamonio y tributilamonio y una sal de amonio cuaternario tal como sal de tetraetilamonio y tetrabutilamoni o.
<Combinacion de compuestos de material de partida>
La combinacion de compuestos de material de partida del compuesto activador de acido fosforico y el compuesto de acido fosforico descritos anteriormente se puede determinar apropiadamente y es adecuada para usar preferentemente en las siguientes combinaciones.
Combinacion 1: combinacion de compuesto activador de UDP y UDP o sal de UDP
Combinacion 2: combinacion de compuesto activador de UMP y sal de UTP
Combinacion 3: combinacion de compuesto activador de UMP y acido pirofosforico o pirofosfato
Combinacion 4: combinacion de compuesto activador de acido pirofosforico y UMP o sal de UMP
En cualquier combinacion, se prefiere cuando la relacion molar del compuesto activador de acido fosforico y el compuesto de acido fosforico en la reaccion de condensacion se establece en el intervalo de 1:10 a 10:1, ya que se mejora el rendimiento de UP4U. La relacion molar es, por ejemplo,
(1) en la combinacion 1 anterior, la relacion molar es 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2 o 10:1,
(2) en la combinacion 2 anterior, la relacion molar es 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4 u 8:3,
(3) en la combinacion 3 anterior, la relacion molar es 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, o 10:1, y adicionalmente,
(4) en la combinacion 4 anterior, la relacion molar es 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, o 10:1, y
tambien puede estar dentro del intervalo de cualquiera de los dos valores numericos ejemplificados en este documento.
<Ion metalico>
El ion metalico usado en la presente invencion se anade a una solucion, en forma de una sal metalica que contiene un ion metalico objetivo, convirtiendose de este modo en un ion metalico en agua o en un disolvente organico hidrofflico y se puede proporcionar al sistema de reaccion. Como tipo de la sal metalica, se puede sugerir un haluro metalico, una sal inorganica metalica, una sal organica metalica y similares. Como ejemplos especfficos adicionales, se prefiere usar (i) cloruro ferroso, cloruro ferrico, bromuro ferrico, tricloruro de aluminio, tricloruro de cerio, tricloruro de lantano y similares como ejemplos del haluro metalico, (ii) sales inorganicas tales como sulfato, nitrato, acido perclorico y similares de un metal seleccionado entre el grupo que consiste en hierro (divalente), hierro (trivalente), aluminio, cerio y lantano como ejemplos de la sal inorganica metalica y (iii) trifluorometanosulfonato, acetato, trifluoroacetato, citrato y similares de un metal seleccionado entre el grupo que consiste en hierro (divalente), hierro (trivalente), aluminio, cerio y lantano como ejemplos de la sal organica metalica, ya que se mejora el rendimiento de UP4U. Entre ellas, es preferente una sal ferrica y cloruro ferrico es particularmente preferente, desde el punto de vista del rendimiento de sfntesis y facilidad de manipulacion. En este documento, la sal metalica a usar puede ser anhfdrido o hidruro. Sin embargo, entre las combinaciones del compuesto activador de acido fosforico y del compuesto de acido fosforico, particularmente en el caso de la Combinacion 4, es particularmente preferente usar ion de hierro (III), ion de aluminio trivalente o similares.
Con el fin de mejorar el rendimiento de UP4U, la sal metalica que es una fuente de iones metalicos, se usa preferentemente en una cantidad molar de 0,001 a 10 veces el numero molar total del compuesto de acido fosforico usado en la reaccion y particularmente preferente usado en una cantidad molar de 0,001 a 1 veces. Por ejemplo, la cantidad de esta sal metalica es una cualquiera de las cantidades molares de 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 y 1 veces el numero molar total del compuesto de acido fosforico usado en la reaccion y puede estar dentro de cualquiera de los dos valores numericos ejemplificados en este documento.
<Condiciones de la reaccion de condensacion y purificacion>
La reaccion de condensacion del compuesto activador de acido fosforico y del compuesto de acido fosforico en la presente invencion se realiza usando agua o un disolvente organico hidrofflico como disolvente. Desde el punto de vista del rendimiento de sfntesis y facilidad de manipulacion, se pueden usar alcoholes que tienen seis o menos atomos de carbono tales como metanol o etanol, cetonas tales como acetona, eteres tales como dioxano, nitrilos tales como acetonitrilo y amidas tales como dimetilformamida como disolvente organico hidrofflico.
En esta reaccion de condensacion, el pH de reaccion es preferentemente de 7 o menos y particularmente preferentemente de aproximadamente 1 a 4, con el fin de mejorar el rendimiento de UP4U. Asimismo, en esta reaccion de condensacion, la temperatura de reaccion es preferentemente de 0 °C a 60 °C, con el fin de mejorar el rendimiento de UP4U. En la combinacion de los compuestos de material de partida anteriores, es particularmente preferente una temperatura de reaccion de 20 a 30 °C en el caso de la Combinacion 1 a la Combinacion 3 y una temperatura de reaccion de 0 a 20 °C es particularmente preferente en el caso de la Combinacion 4. El perfodo de
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tiempo de esta reaccion de condensacion es preferentemente de alrededor de 1 a 36 horas y particularmente preferentemente de 2 a 20 horas, con el fin de realizar la necesaria y suficiente reaccion de condensacion.
Despues de la finalizacion de la reaccion de condensacion, se combinan apropiadamente los procedimientos usados para la purificacion de aislamiento general del nucleotido (p.ej., procedimiento de cristalizacion, cromatograffa en columna de intercambio ionico, cromatograffa en columna de adsorcion, cromatograffa en columna de carbono activado, etc.), a traves de los cuales se puede separar y purificar el UP4U producido y tambien se puede proporcionar en forma de sal segun sea necesario.
Como resina de intercambio ionico usada en la cromatograffa en columna de intercambio ionico, se puede usar una resina de intercambio anionico fuertemente basica (p. ej., Amberlite IRA 402 [fabricada por Rohm & Haas], Diaion PA-312 o Diaion SA-11A [fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation], una resina de intercambio anionico debilmente basica (p. ej., Amberlite IRA 67 [fabricada por Rohm & Haas] o Diaion WA-30 [fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation]), una resina de intercambio cationico fuertemente acida (p. ej., Diaion PK-216 [fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation]), una resina de intercambio cationico debilmente basica (p. ej., Diaion WK-30 [fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation]) o similares.
El carbon activado usado puede ser carbon activado molido o granulado para cromatograffa, por ejemplo, se puede usar carbon activado disponible en el mercado en Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Futamura Chemical Co., Ltd o similar.
Asimismo, se puede usar un procedimiento conocido para la cristalizacion y el cristal se obtiene anadiendo un disolvente organico hidrofflico a la UP4U obtenida o una sal de la misma para la precipitacion de cristales. Ejemplos del disolvente organico hidrofflico usado incluyen alcoholes que tienen seis o menos atomos de carbono tales como metanol y etanol, cetonas tales como acetona, eteres tales como dioxano, nitrilos tales como acetonitrilo, amidas tales como dimetilformamida y similares. Son preferentes los alcoholes y ademas, el etanol es particularmente preferente.
<Accion efecto de la presente invencion>
Como se ha descrito anteriormente, en la presente invencion, se usa un procedimiento de combinar (a) un compuesto activador de acido fosforico sintetizado por condensacion de acido uridina 5-difosforico (UDP), UMP o un acido pirofosforico con un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en imidazol, bencimidazol y 1,2,4- triazol que tiene opcionalmente un sustituyente y (b) un compuesto de acido fosforico seleccionado entre el grupo que consiste en UMP, UDP, UTP y un acido pirofosforico o una sal del mismo (excluyendo UTP libre) y hacer reaccionar los compuestos en agua o un disolvente organico hidrofflico, en presencia de un ion metalico seleccionado entre el grupo que consiste en un ion de hierro (II), un ion de hierro (III), un ion de aluminio trivalente, un ion de lantano trivalente y un ion de cerio trivalente, como un catalizador, a traves del cual la produccion industrial en masa de UP4U se puede llevar a cabo mediante un simple procedimiento como se muestra en los ejemplos expuestos a continuacion.
Por otra parte, como ya se ha explicado, el procedimiento convencionalmente conocido del Documento de Patente 1 puede sintetizar UP4U con un alto rendimiento de 80 % o mas a nivel de laboratorio, pero plantea problemas en la produccion en masa a escala industrial por el procedimiento. Especfficamente, en el procedimiento del Documento de Patente 1, es necesario usar un material de partida UTP en una forma de sal de una amina terciaria tal como tri- n-butilamina, con el fin de llevar a cabo una reaccion para formar 5'-trifosfato cfclico de uridina. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para preparar previamente una sal trisodica de UTP en una UTP libre (libre de UTP) mediante cromatograffa en columna de intercambio ionico y, entonces formar una sal con una amina terciaria. Sin embargo, como se verifica en los ejemplos de ensayo expuestos a continuacion, el material libre de UTP es muy inestable, por tanto, es muy diffcil usar UTP libre como material de partida en la produccion en masa a escala industrial. Asimismo, con el fin de sintetizar eficientemente una reaccion para formar 5'-trifosfato cfclico de uridina, es necesario mantener la sal de tri-n-butilamina de UTP en un estado deshidratado inmediatamente antes de la reaccion. Sin embargo, como se muestra en el ensayo comparative expuesto a continuacion, en la produccion en masa a escala industrial, cuando la sal de tri-n-butilamina de UTP se deshidrata azeotropicamente, se produce una reaccion de descomposicion termica de UTP y por tanto la pureza de UTP se reduce y, por consiguiente, se reduce la eficiencia sintetica.
Asimismo, en el procedimiento del Documento de Patente 2 y Documento de No Patente 2, fue posible sintetizar UP4U sin usar la etapa que usa UTP libre, pero el rendimiento relative a UMP se redujo notablemente, como tambien se muestra en los ejemplos comparativos expuestos a continuacion. Ademas, se generaron muchos subproductos y no se podrfa poner como procedimiento de produccion adecuado para la produccion industrial a gran escala.
Por otra parte, en el procedimiento de la presente invencion, ya que el material de partida es UDP o UMP, no es necesario usar UTP libre, y ademas, la operacion de deshidratacion de la sal de UTP para sintetizar uridina 5'- trifosfato cfclico tambien se puede evitar, por tanto, se puede evitar la reduccion de la eficiencia sintetica debido a la descomposicion de los materiales de partida, como se muestra en los ejemplos expuestos a continuacion. Asimismo,
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no es necesario deshidratar azeotropicamente una sal de tri-n-butilamina de UTP, no se produce una reaccion de descomposicion termica de UTP y asf mismo, la pureza de UTP no se reduce por la generacion de subproductos innecesarios, como se muestra en los ejemplos expuestos a continuacion. Por lo tanto, el procedimiento de producdon de la presente invencion es un procedimiento muy adecuado para la sfntesis industrial en masa de UP4U.
En la presente invencion, es preferente que el compuesto activador de acido fosforico sea UDP-imidazolida y el compuesto de acido fosforico sea UDP o una sal de UDP. Es porque, en este caso, se verifica en los ejemplos expuestos a continuacion que la sfntesis de UP4U se puede realizar con un alto rendimiento, evitando al mismo tiempo el uso de UTP libre y la operacion de deshidratacion de la sal de UTP que no son adecuadas para la producdon industrial en masa.
Ademas, en la presente invencion, es preferente que el compuesto activador de acido fosforico sea UMP-imidazolida y el compuesto de acido fosforico sea UTP o una sal de UTP. Es porque, tambien en este caso, se verifica en los ejemplos expuestos a continuacion que la sfntesis de UP4U se puede realizar con un alto rendimiento, evitando al mismo tiempo el uso de UTP libre y la operacion de deshidratacion de la sal de UTP que no son adecuadas para la producdon industrial en masa.
Ademas, en la presente invencion, es preferente que el compuesto activador de acido fosforico sea UMP-imidazolida y el compuesto de acido fosforico sea un acido pirofosforico o una sal de acido pirofosforico. Es porque, tambien en este caso, se verifica en los ejemplos expuestos a continuacion que la sfntesis de UP4U se puede realizar con un alto rendimiento, evitando al mismo tiempo el uso de UTP libre y la operacion de deshidratacion de la sal de UTP que no son adecuadas para la produccion industrial en masa.
Ademas, en la presente invencion, es preferente que el compuesto activador de acido fosforico sea pirofosfato de diimidazolilo y el compuesto de acido fosforico sea UMP o una sal de UMP. Es porque, tambien en este caso, se verifica en los ejemplos expuestos a continuacion que la sfntesis de UP4U se puede realizar eficientemente, evitando al mismo tiempo el uso de UTP libre y la operaaon de deshidratacion de la sal de UTP que no son adecuadas para la produccion industrial en masa.
Ademas, en la presente invencion, es preferente que el ion metalico se seleccione entre el grupo que consiste en un ion de hierro (II), un ion de hierro (III) y un ion de aluminio. En concreto, cuando el compuesto activador de acido fosforico es pirofosfato de diimidazolilo y el compuesto de acido fosforico es UMP libre o es una sal de UMP, es preferente que el ion metalico se seleccione entre el grupo que consiste en un ion de hierro (III) y un ion de aluminio. Es porque, tambien en este caso, se verifica en los ejemplos comparativos expuestos a continuaaon que la sfntesis de UP4U se puede realizar eficientemente, en comparacion con el caso de usar otro ion metalico.
Ademas, en la presente invencion, es preferente que el ion metalico se suministre en una forma de sal seleccionada entre el grupo que consiste en cloruro, bromuro, nitrato, sulfato y acetato del metal. Es porque, tambien en este caso, se verifica que la sfntesis de UP4U se puede realizar eficientemente.
Aunque las realizaciones de la presente invencion se describen como antes, estas son ilustraciones de la presente invencion y tambien se pueden adoptar diversas constituciones distintas de las anteriores.
Ejemplos
Mas adelante en el presente documento, la presente invencion se describira adicionalmente en detalle a modo de ejemplos, que no se deben interpretar como limitativos de la presente invencion a este caso.
(Ejemplo 1) Combinacionl (parte 1): Reaccion de UDP-imidazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = imidazolilo, n = 2) y sal de sodio UDP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 2)
Se anadio dimetilacetamida (6,0 ml) a una solucion acuosa de 0,32 M de sal de UDP-tributilamina (1,26 ml, 4,0 mmol) y la mezcla se deshidrato azeotropicamente cuatro veces. El residuo resultante se disolvio en dimetilacetamida (6,0 ml) y se anadio a esto carbonildiimidazol (1,95 g, 12,0 mmol), entonces la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la mezcla de reaccion bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio gota a gota una solucion acuosa de 0,5 M e acido clorhfdrico (12,0 ml) (pH 7,0). la mezcla de reaccion se concentro a presion reducida para preparar una solucion de UDP-imidazolida.
Se anadio una solucion acuosa de sodio UDP (2,0 mmol, 2,1 ml) a la solucion de UDP-imidazolida bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio a esto una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico para preparar una solucion mixta con pH 4,9. Se anadio a esto una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (1,5 mmol, 1,5 ml) bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio a esto una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico para preparar una solucion mixta con pH 1,6 y la solucion mixta se agito a 25 °C durante 3 horas. La mezcla de reaccion se ajusto a pH 12 mediante la adicion de una solucion acuosa 6 M de hidroxido de sodio y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reaccion se ajusto a pH 7,6 mediante la adicion de acido clorhfdrico 2 M. La mezcla de reaccion resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de
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sfntesis de UP4U se calculo como 87 %.
La mezcla se concentro hasta 10 ml y se disolvio anadiendo hidrogeno fosfato de sodio (4,2 mmol) para depositar fosfato de hierro. La suspension se dejo reposar a 4 °C durante una noche, entonces el precipitado se elimino por centrifugacion. El sobrenadante se ajusto a pH 2,5 y entonces se ajusto a una solucion de 30 ml para preparar una solucion adsorbente en columna.
La desalinizacion de la solucion adsorbente en columna se realizo mediante cromatograffa en columna de carbono activado (cantidad de resina de 20 ml), y la solucion de recuperacion resultante se ajusto a pH 7 y se concentro, entonces se sometio a filtracion por membrana. El residuo se concentro adicionalmente y se anadio etanol gota a gota al residuo, entonces se cristalizo a temperatura ambiente durante una noche. El cristal se filtro y se seco al vacfo a 50 °C durante 3 horas para obtener 2,12 g (rendimiento de 75 % como tetrahidrato) de UP4U.
(Ejemplo 2) Combinacion1 (parte 2): Reaccion de UDP-imidazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = imidazolilo, n = 2) y sal de sodio UDP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 2)
Se anadio una solucion 5,64 M de imidazol-dimetilacetamida (0,5 ml) a una solucion acuosa 0,94 M de sodio UDP (1,0 ml), y se anadio N,N-diisopropilcarbodiimida (0,73 ml, 4,7 mmol) a temperatura ambiente y se agito a temperatura ambiente durante 5 horas a 50 °C durante 2 horas para preparar una mezcla de UDP y un UDP- imidazolida.
Se anadio a esto una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico bajo enfriamiento con hielo para preparar una solucion mixta con pH 5,3. Posteriormente, se anadio a esto una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (0,24 mmol, 0,24 ml) y se anadio adicionalmente a esto una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico para preparar una solucion mixta con pH 1,9 y la solucion mixta se agito a 25 °C durante 16 horas. La mezcla de reaccion resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 63 %.
(Ejemplo 3) Combinacion1 (parte 3): Reaccion de UDP-imidazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = imidazolilo, n = 2) y sal de sodio UDP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 2)
Se anadio propionitrilo (3,0 ml) a una solucion acuosa de 0,17 M de sal de UDP-tributilamina (11,8 ml, 2,0 mmol) y la mezcla se deshidrato azeotropicamente cuatro veces. El residuo resultante se disolvio en propionitrilo (3,0 ml). Esta solucion se anadio gota a gota a una suspension de propionitrilo (2,0 ml) de 1,1'-carbonildiimidazol (0,97 g, 6,0 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos y entonces se concentro a presion reducida para preparar una solucion de UDP-imidazolida.
Se anadio sal UDP-disodica (0,53 g, 1,0 mmol) a la solucion de UDP-imidazolida bajo enfriamiento con hielo y la solucion mixta se ajusto a pH 3,9 mediante una solucion acuosa 6 M de acido clorhfdrico. Se anadio adicionalmente a esto una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (15pl, 0,02 mmol) y la solucion mixta se agito a 10 °C durante 27 horas. La mezcla de reaccion se ajusto a pH 10 mediante la adicion de una solucion acuosa 7,5 M de hidroxido de sodio y entonces se agito durante 1 hora bajo enfriamiento con hielo. Se anadio 10 ml de etanol a la mezcla de reaccion bajo enfriamiento con hielo y la mezcla se dejo reposar a 4 °C durante una noche. El precipitado se recogio y se preparo a una solucion acuosa de 20 ml con pH 7,5, entonces, la solucion acuosa se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 94 %. Mas especfficamente, se ha puesto de manifiesto que incluso cuando la cantidad de catalizador de cloruro ferrico usado se reduce enormemente, la reaccion avanza correctamente.
(Ejemplo 4) Combinacion1 (parte 4): Reaccion de UDP-bencimidazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = bencimidazolilo, n = 2) y sal de sodio UDP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 2)
Se disolvio sal UDP-disodica (0,5 g, 0,94 mmol) en 2,7 ml de agua y se anadio una solucion de dimetilacetamida (1,8 ml) de bencimidazol (0,33 g, 2,82 mmol) y N,N-diisopropilcarbodiimida (0,44 ml, 2,82 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se destilo a presion reducida para preparar una mezcla de UDP y UDP-bencimidazolida.
Se anadio a esto 1 ml de agua y entonces se anadio a esto una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico bajo enfriamiento con hielo para ajustar el pH a 4,6. Se anadio a esto una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (94 pi, 0,09 mmol) bajo enfriamiento con hielo y se anadio a esto adicionalmente una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico para preparar una solucion mixta con pH 3,0 y la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante10 horas. La mezcla de reaccion se ajusto a pH 12 mediante la adicion de una solucion acuosa 6 M de hidroxido de sodio y se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se ajusto a pH 7,3 mediante la adicion de acido clorhfdrico 2 M. La mezcla resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 83 %.
(Ejemplo 5) Combinacion1 (parte 5): Reaccion de UDP-triazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X= 1,2,4- triazolilo, n = 2) y sal de sodio UDP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m = 2)
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Se anadio dimetilacetamida (2,0 ml) a una solucion acuosa de 0,37 M de sal de UDP-tributilamina (1,6 ml, 0,6 mmol) y la mezcla se deshidrato azeotropicamente cuatro veces. El residuo resultante se disolvio en dimetilacetamida (2,0 ml) y se anadio a esto 1, 1'-carbonildi-(1,2,4-triazol (0,25 g, 1,5 mmol), entonces la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la solucion de reaccion bajo enfriamiento con hielo, y adicionalmente, se anadio una solucion acuosa 0,5 M de acido clorhfdrico para tener un pH 7,4. La mezcla se concentro a presion reducida para preparar una solucion de UDP-triazolida.
Se anadio una solucion acuosa de sal de sodio UDP (0,25 mmol, 0,9 ml) a la solucion de UDP-triazolida bajo enfriamiento con hielo y se anadio una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (0,19 mmol, 0,19 ml) (pH 6,3) y la mezcla se agito a 25 °C durante 5 horas. La mezcla se ajusto a pH 12 mediante la adicion de una solucion acuosa 6 M de hidroxido de sodio y se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla se ajusto a pH 7,0 mediante la adicion de acido clorhfdrico 2 M. La mezcla resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 48 %.
(Ejemplo 6) Combinacion 2: Reaccion de UMP-imidazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = imidazolilo, n = 1) y sal de sodio UTP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 3)
Se anadio tributilamina (0,25 ml, 1,1 mmol) a una solucion acuosa 2,05 M de UMP libre (0,49 ml, 1,0 mmol) y la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces, se anadio adicionalmente dimetilacetamida (1,5 ml) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente tres veces. La solucion de sal de UMP- tributilamina resultante se disolvio en dimetilacetamida (1,5 ml), y se anadio a esto carbonildiimidazol (486 mg, 3,0 mmol), entonces la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la mezcla bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio gota a gota una solucion acuosa 0,5 M de acido clorhfdrico (4,0 ml) (pH 7,2). La mezcla se concentro a presion reducida para preparar una solucion de UMP-imidazolida.
La solucion de UMP-imidazolida y una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico se anadieron a una solucion acuosa 165 Mm de sal de sodio UTP (8,0 ml, 1,3 mmol) bajo enfriamiento con hielo para preparar una solucion mixta con pH 5,1. Se anadio a esto una solucion acuosa de cloruro ferrico (0,5 mmol, 0,2 ml) bajo enfriamiento con hielo y la solucion mixta se agito a 25 °C durante 4 horas. La mezcla se sometio a filtracion por membrana, entonces se ajusto a pH 10,4 mediante la adicion de una solucion acuosa 1 M de hidroxido de sodio (11 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 40 minutos. Posteriormente, La mezcla se ajusto a pH 6,9 mediante la adicion de acido dorhidrico 2 M (3,5 ml). La mezcla resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 67 %.
Posteriormente, como resultado de la purificacion del mismo modo que en el Ejemplo1, se obtuvieron 471 mg (50 % como tetrahidrato) del UP4U objeto.
(Ejemplo 7) Combinaaon 3: Reaccion de UMP-imidazolida (donde en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = imidazolilo, n = 1) y sal trietilamina de acido fosforico (donde, en la formula IV, R2 = atomo de hidrogeno, m= 2)
Se anadio tributilamina (0,25 ml, 1,1 mmol) a una solucion acuosa 2,05 M de UMP libre (0,49 ml, 1,0 mmol) y la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante 20 minutos. Despues, se anadio adicionalmente dimetilacetamida (1,5 ml) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente tres veces. La sal de UMP-tributilamina resultante se disolvio en dimetilacetamida (1,5 ml), se anadio a esto carbonildiimidazol (486 mg, 3,0 mmol) y la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la mezcla bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio gota a gota una solucion acuosa 0,5 M de acido clorhfdrico (4,0 ml) (pH 7,2). La mezcla se concentro a presion reducida para preparar una solucion de UMP-imidazolida (esta operacon se realizo dos veces).
Se anadio una solucion acuosa 0,95 M de sal trietilamina de acido pirofosforico (1,1 ml, 1,0 mmol) a la solucion de UMP-imidazolida bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio a esto una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (0,5 mmol, 0,5 ml). La mezcla se ajusto a pH 5,1 mediante la adicion de una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico y entonces se agito a 25 °C durante 5 horas. Despues de agitar, la solucon de UMP-imidazolida (1,0 mmol) preparada por separado se anadio a esto bajo enfriamiento con hielo y la solucion mixta se ajusto ademas a pH 2,1 mediante una solucion acuosa 2 M de acido corhidrico y se agito a 25 °C durante 6 horas. Se anadio a esto una soluaon acuosa 6 M de hidroxido de sodio a esto para tener un pH 11 y la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ademas, la solucion mixta se ajusto a pH 7,6 mediante la adicion de acido dorhidrico 2 M y se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 45 %.
(Ejemplo 8) Combinacion 4: Reacaon de pirofosfato de diimidazolilo (donde en la Formula III, X = imidazolilo) y UMP (donde,en la Formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 1)
Se anadio tributilamina (0,95 ml, 4,0 mmol) y formamida (2,0 ml) a una solucion acuosa de 1,09 M de acido pirofosforico-sal de trietilamina (1,86 ml, 2,0 mmol) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente con dimetilformamida cuatro veces. El residuo resultante se disolvio en dimetilformamida (8 ml), se anadio a esto carbonildiimidazol (0,97 g, 6,0 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua
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Se anadio una solucion acuosa libre de UMP (2,03 M, 2,47 ml, 5,0 mmol) a la solucion de pirofosfato de diimidazolilo bajo enfriamiento con hielo. Ademas, se anadio a esto una solucion acuosa 1 M de cloruro ferrico (2 ml, 2,0 mmol) y la mezcla se ajusto a pH 2,4 mediante la adicion de una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico y se agito a 0 °C durante 5 horas. Se anadio a la mezcla una solucion acuosa 6 M de hidroxido de sodio para tener un pH 6,3. Se anadio a esto agua para preparar una solucion acuosa de 50 ml y la solucion de reaccion resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC y el rendimiento de UP4U se calculo como 51 %.
(Ejemplo de ensayo 1) Determinacion de la estabilidad de UTP y un compuesto relacionado
Con el fin de evaluar la estabilidad de UTP libre, se examinaron la estabilidad de soluciones acuosas de UTP libre y de sal de sodio UTP (UTP-Na) y de una solucion de dimetilacetamida de sal de UTP-tributilamina (UTP-TBA). Asimismo, tambien se determino la estabilidad de soluciones acuosas libres de UDP y UDP-Na como control de comparacion. La solucion de cada sustancia se dejo reposar durante un determinado perfodo a -20 °C, 25 °C o 50 °C y la concentracion de cada sustancia se determino por HPLC para calcular una velocidad de descomposicion. En este documento, la velocidad de descomposicion se definio como sigue [Ecuacion 1].
[Ecuacion 1]
Velocidad de descomposicion (%) de cada sustancia = {100-(% de HPLC de cada sustancia en la determinacion/% de HPLC de cada sustancia al comienzo del ensayo) x 100}
Como resultado, se puso de manifiesto que, como se muestra en la siguiente [Tabla 1] y [Tabla 2], UTP libre y UTP- TBA claramente tienen baja estabilidad durante el almacenamiento de la solucion, en comparacion con otros compuestos tales como sal de sodio UTP, UDP libre y sal de sodio UDP.
[Tabla 1]
-20 °C, 18 h 25 °C,8 h 25 °C,24 h
16 mM de UTP libre
4 % 4 % 12 %
10 mM de UDP libre
- 0 % 0 %
(Los valores numericos de la tabla indican una velocidad de descomposicion en cada condicion)
________________[Tabla 2]________________
50 °C,8 h 50 °C,24 h
35 mM de UTP-TBA
7 % 18 %
40 mM de UTP-Na
2 % 6 %
40 mM de UDP-Na
2 % 5 %
(Los valores numericos de la tabla indican una velocidad de descomposicion en cada condicion)
(Ensayo comparative 1) Efecto catalizador del metal en la reaccion de UDP-imidazolida (donde, en la Formula II, R1 = 5'-uridilo, X = imidazolilo, n = 2) y sal de sodio UDP (donde, en la formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 2)
Se anadieron diversos catalizadores de metal (0,06 M) a una solucion acuosa mixta de UDP-imidazolida y sal de sodio UDP en una relacion molar de 1:1 (cada uno 0,15 M) y la mezcla se ajusto a pH 2 ± 0,3 mediante una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico. La cantidad producida de UP4U despues de 6 horas se determino cuantitativamente a 25 °C por HPLC. El resultado se muestra en la Tabla 3.
[Tabla 3]
Catalizador
pH de reaccion Rendimiento de UP4U
FeCl3
2,0 79,4 %
Fe (NO3)3
2,0 81,8 %
AlCls
2,0 69,2 %
LaCla
2,0 52,1 %
CeCla
2,0 53,5 %
MnCl2
2,0 10,3 %
MgCl2
2,2 6,3 %
FeCl2
2,3 68,3 %
5
10
15
20
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30
35
40
45
Catalizador
pH de reaccion Rendimiento de UP4U
ZnCl2
2,2 7,0 %
Sin adicion
2,1 2,8 %
Como resultado, se puso de manifiesto que se puede obtener UP4U con un rendimiento particularmente alto cuando se usa cloruro ferroso, cloruro ferrico, nitrato ferrico, cloruro de aluminio, cloruro de lantano o cloruro de cerio como la sal metalica como catalizador.
(Ensayo comparative 2) Efecto catalizador del metal en la reaccion de pirofosfato de imidazolilo (donde, en la Formula III, X = imidazolilo) y UMP libre (donde,en la Formula IV, R2 = 5'-uridilo, m= 1)
Se anadieron diversos catalizadores de metal (0,4 mmol) a una solucion acuosa mixta de pirofosfato de diimidazolilo y UMP libre en una relacion molar de 2:5 ( 0,4 mmol como pirofosfato de diimidazolilo) preparado en el procedimiento del Ejemplo 8 y la mezcla se ajusto a pH 2,5 ± 0,5 mediante una solucion acuosa 2 M de acido clorhfdrico. La cantidad producida de UP4U despues de 5 horas se determino cuantitativamente a 0 °C por HPLC. El resultado se muestra en la [Tabla 4].
[Tabla 41
Catalizador
pH de reaccion Rendimiento de UP4U
FeCla
2,9 51,1 %
AlCla
2,7 49,2 %
MnCl2
2,7 17,7 %
MgCl2
2,8 5,2 %
FeCl2
2,9 10,6 %
ZnCl2
2,9 0,6 %
NiCl2
2,7 0,2 %
CoCl2
2,7 1,2 %
CaCl2
2,8 0,5 %
Sin adicion
2,3 0 %
Como resultado, se puso de manifiesto que se puede obtener UP4U con un rendimiento particularmente alto cuando se usa cloruro ferrico o cloruro de aluminio como la sal metalica como catalizador cuando se usa la combinacion de un compuesto activador de acido pirofosforico y UMP.
(Ensayo comparativo 3) Comparacion del rendimiento de UP4U y el nivel de produccion de impurezas cuando se usa el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente y el procedimiento de la presente invencion
El rendimiento del producto final de cada uno se comparo cuando se sintetizo UP4U de cada uno usando el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente que es un procedimiento de sfntesis que mejora el procedimiento habitual y evita una etapa usando UTP libre y el procedimiento del presente ejemplo. El procedimiento del presente ejemplo estaba de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1 anterior. La sfntesis mediante el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente que cambia el procedimiento habitual se realizo mediante la siguiente etapa.
(1) Preparacion de la solucion de sfntesis 1
Se anadio tri-n-butilamina (2,2 ml, 9,2 mmol) a una solucion acuosa 2,05 M de UMP libre (2,1 ml, 4,3 mmol) y la solucion mixta se agito durante 20 minutos, entonces se deshidrato azeotropicamente con N,N-dimetilacetamida (DMAC) cuatro veces. El residuo se disolvio en DMAC (5,5 ml) y se anadio a esto clorofosfato de difenilo (DPC) (1,1 ml, 5,2 mmol) a esto a 10 °C y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio a esto tri-n- butilamina (4,1 ml, 17,2 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 minutos para preparar la solucion de sfntesis 1.
(2) Preparacion de la solucion de sfntesis 2
Se anadio tri-n-butilamina (2,2 ml, 9,2 mmol) y DMAC (3,0 ml) a una solucion acuosa 0,95 M de acido pirofosforico- sal de tretilamina (9,0 ml, 8,5 mmol), entonces la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente con piridina tres veces. Se anadio tri-n-butilamina (0,4 ml, 2,8 mmol) y piridina (4 ml) al residuo para preparar la solucion de sfntesis 2.
(3) Preparacion de la solucion de UMP-TBA
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Se anadio tri-n-butilamina (1,7 ml, 6,9 mmol) a una solucion acuosa 2,05 M de UMP libre (3,1 ml, 6,4 mmol) y la solucion mixta se agito durante 20 minutos, entonces se deshidrato azeotropicamente con N,N-dimetilacetamida (DMAC) cuatro veces. El residuo se disolvio en DMAC (3,5 ml) para preparar la solucion de UMP-TBA
(4) Preparacion de la solucion de sfntesis de UP4U
La solucion de sfntesis 1 se anadio gota a gota a la solucion de sfntesis 2 a temperatura ambiente y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora (se confirmo mediante analisis por HPLC que se produjo UTP aproximadamente un 60 %). Se anadio a esto N,N-diisopropilcarbodiimida (2,3 ml, 17,0 mmol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Posteriormente, se anadio a esto la solucion de UMP-TBA y el cloruro de magnesio-hexahidratado (1,7 g, 8,4 mmol) y la mezcla se agito a 0 °C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 19 horas. Se anadio a esto agua (20 ml) a 0 °C, entonces la solucion mixta se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se concentro a presion reducida, entonces se anadio a esto agua (50 ml) y la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. El precipitado se elimino por filtracion para preparar una solucion de UP4U. UP4U se determino cuantitativamente por HPLC y el rendimiento de UMP se calculo como 42 %.
(Tratamiento de resultados- rendimiento)
Como resultado, mientras que el rendimiento de UDP fue de 87 % cuando se sintetizo UP4U mediante el procedimiento de los presentes ejemplos, como se muestra en el Ejemplo 1 descrito anteriormente, el rendimiento de UMP fue solo de 42 % en el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente. Por tanto, se puso de manifesto que el procedimiento de la presente invencion consigue un rendimiento notablemente alto, en comparacion con el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente.
(Tratamiento de resultados- subproductos)
Ademas, con el fin de comparar la diferencia de los niveles de produccion de impurezas en el procedimiento del presente ejemplo y en el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente, el producto de la solucion de reaccion, despues de sintetizar UP4U para cada procedimiento, se analizo por HPLC. Los graficos de HPLC se muestran en la [Fig. 1] y [Fig. 2]. Como se desprende de las Figs. 1 y 2, en el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente, subproductos distintos de UP4U que es un producto o UMP que es un material de partida se generaron aproximadamente 48 % en la relacion del area del grafico de HPLC y tambien el numero del tipo de subproductos es alto. Por otra parte, en el procedimiento de la presente invencion, la relacion de subproductos distintos de UP4U o UDP que es un material de partida se redujo claramente 4,8 % y tambien el numero del tipo de subproductos es muy bajo. Por tanto, en el procedimiento de la presente invencion, la generacion de subproductos se puede reducir notablemente, por tanto, el producto se puede sintetizar eficientemente y el aislamiento y la purificacion son faciles tambien.
Basandose en la comparacion como se ha descrito anteriormente, se mostro que el procedimiento de la presente invencion produce menos impurezas, en comparacion con el procedimiento de sfntesis en un solo recipiente y da un rendimiento notablemente mejorado, por tanto es muy adecuado como procedimiento de produccion industrial en masa de UP4U.
(Ensayo comparativo 4) Comparacion del rendimiento de UP4U y el nivel de produccion de impurezas cuando se usa el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo y el procedimiento de la presente invencion
El rendimiento del producto final de cada uno se comparo cuando se sintetizo UP4U de cada uno usando el antiguo procedimiento de imidazolida y el procedimiento del presente ejemplo. El procedimiento del presente ejemplo estaba de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 8 anterior. La sfntesis mediante el antiguo procedimiento de imidazolida se realizo mediante la siguiente etapa. Asimismo, respecto al catalizador usado en la reaccion, se ha estudiado (1) el caso de no anadir catalizador en la reaccion y (2) el caso de usar cloruro de cinc o (3) el caso de usar tetrazol como un catalizador, en referencia a procedimientos conocidos (se refiere al Documento de Patente 2 y Documento de No Patente 2).
(1) Caso sin catalizador
Se anadio tributilamina (0,95 ml, 4,0 mmol) y formamida (2,0 ml) a una solucion acuosa de 1,09 M de acido pirofosforico-sal de trietilamina (1,86 ml, 2,0 mmol) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente cuatro veces con dimetilformamida. El residuo resultante se disolvio en dimetilformamida (8,0 ml) y se anadio a esto carbonildiimidazol (0,97 g, 6,0 mmol), entonces la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la mezcla bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio gota a gota a esto una solucion acuosa 2,0 M de acido clorhfdrico (1,5 ml) (pH 7). La mezcla se concentro a presion reducida y adicionalmente se deshidrato azeotropicamente dos veces con dimetilformamida para preparar una solucion de pirofosfato de diimidazolilo anhidro.
Se anadio tributilamina (3,56 ml, 15,0 mmol) a una solucion acuosa libre de UMP (2,03 M, 2,47 ml, 5,0 mmol) y la
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solucion mixta se deshidrato azeotropicamente cuatro veces con dimetilformamida, entonces se anadio a esto dimetilformamida (2,0 ml) para preparar una solucion de UMP-tributilamina anhidro. Esta solucion se anadio a la solucion de pirofosfato de diimidazolilo anhidro y la solucion mixta se concentro a pres ion reducida yse agito a 25 °C durante 48 horas. Se anadio agua a la mezcla para preparar una solucion acuosa de 50 ml y la solucion acuosa resultante se determino cuantitativamente mediante analisis porHPLC yel rendimiento de UP^se calculo como 10 %.
(2) Caso de usar cloruro de cine como catalizador
Se anadio tributilamina (0,95 ml, 4,0 mmol) y formamida (2,0 ml) a una solucion acuosa de 1,09 M de acido pirofosforico-sal de trietilamina (1,86 ml, 2,0 mmol) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente cuatro veces con dimetilformamida. El residuo resultante se disolvio en dimetilformamida (8,0 ml) y se anadio a esto carbonildiimidazol (0,97 g, 6,0 mmol), entonces la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la mezcla bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio gota a gota a esto una solucion acuosa 2,0 M de acido clorhidrico (1,5 ml) (pH 7). La mezcla se concentro a presion reducida y adicionalmente se deshidrato azeotropicamente dos veces para preparar una solucion de pirofosfato de diimidazolilo anhidro.
Se anadio tributilamina (3,56 ml, 15,0 mmol) a una solucion acuosa libre de UMP (2,03 M, 2,47 ml, 5,0 mmol) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente cuatro veces con dimetilformamida, entonces se anadio a esto dimetilformamida (2,0 ml) para preparar una solucion de UMP-tributilamina anhidro. Esta solucion se anadio a la solucion de pirofosfato de diimidazolilo anhidro yse anadio adicionalmente cloruro de cine (1,34 g, 9,8 mmol), entonces la solucion mixta se concentro a presion reducida y se agito a 25 °C durante 5 horas. Se anadio agua a la mezcla para preparar una solucion acuosa de 50 ml y la solucion acuosa resultante se determino cuantitativamente mediante analisis porHPLC yel rendimiento de UP4Use calculo como 17 %.
(3) Caso de usartetrazol como catalizador
Se anadio tributilamina (0,95 ml, 4,0 mmol) y formamida (2,0 ml) a una solucion acuosa de 1,09 M de acido pirofosforico-sal de trietilamina (1,86 ml, 2,0 mmol) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente cuatro veces con dimetilformamida. El residuo resultante se disolvio en dimetilformamida (8,0 ml) y se anadio a esto carbonildiimidazol (0,97 g, 6,0 mmol), entonces la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua (0,2 ml) a la mezcla de reaccion bajo enfriamiento con hielo y adicionalmente, se anadio gota a gota a esto una solucion acuosa 2,0 M de acido clorhidrico (1,5 ml) (pH 7). La mezcla se concentro a presion reducida y adicionalmente se deshidrato azeotropicamente dos veces para preparar una solucion de acido pirofosforico- diimidazolida anhidro.
Se anadio tributilamina (3,56 ml, 15,0 mmol) a una solucion acuosa libre de UMP (2,03 M, 2,47 ml, 5,0 mmol) y la solucion mixta se deshidrato azeotropicamente cuatro veces con dimetilformamida, entonces se anadio a esto dimetilformamida (2,0 ml) para preparar una solucion de UMP-tributilamina anhidro. Esta solucion se anadio a la solucion de acido pirofosforico-diimidazolida anhidro y se anadio adicionalmente 1 H-tetrazol (0,5 g, 7,2 mmol), entonces la solucion mixta se concentro a presion reducida yse agito a 25 °C durante 19 horas. Se anadio agua al liquido de reaccion para preparar una solucion acuosa de 50 ml y la solucion acuosa resultante se determino cuantitativamente mediante analisis por HPLC yel rendimiento de sintesis de UP4U se calculo como 9%.
(4) Tratamiento de resultados-rendimiento
Para resumir el rendimiento de sintesis de UP4U en el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida y el procedimiento de la presente invencion, se da como se muestra en la [Tabla 5] como se describe a continuadon. Mas especificamente, se puso de manifiesto que el procedimiento de la presente invencion consigue un rendimiento notablemente alto, en comparadon con el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida que un procedimiento conocido.
[Tabla 5]
Procedimiento
Rendimiento de UP4U
Antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida (sin catalizador)
10 %
Antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida (catalizador: cloruro de cinc)
17 %
Antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida (catalizador: tetrazol)
9 %
Procedimiento de la presente invencion (Ejemplo 8)
51 %
(5) Tratamiento de resultados-subproductos
Ademas, con el fin de comparer la diferencia de los niveles de produccion de impurezas en el procedimiento de la presente invencion y en el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida, el producto del liquido de reaccion, despues de sintetizar UP4U para cada procedimiento, se analizo por HPLC. Los graficos de HPLC se muestran en la
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[Fig. 3] a [Fig. 6]. Asimismo, en el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolida y en el procedimiento del presente ejemplo, la reladon de los subproductos distintos de UP4U que es un producto o UMP que es un material de partida en el area del grafico de HPLC es como se muestra en la [Fig. 6] descrita anteriormente.
Como se desprende de las Figs. 3 a 6 y de la Tabla 6, en el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo, subproductos distintos de UP4U que es un producto o UMP que es un material de partida se generaron tanto como aproximadamente 40 % en la relacion del area del grafico de HPLC y tambien el numero del tipo de subproductos es alto. Por otra parte, en el procedimiento de la presente invencion, la relacion de subproductos distintos de UP4U o la UMP que es un material de partida se redujo claramente como 16 % y tambien el numero del tipo de subproductos es muy bajo. Por tanto, en el procedimiento de la presente invencion, la generacion de subproductos se puede reducir notablemente, por tanto, el producto se puede sintetizar eficientemente y el aislamiento y la purificacion son faciles tambien.
[Tabla 6]
Procedimiento
Relacion de area del subproducto
Antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo (sin catalizador)
40 %
Antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo (catalizador: cloruro de cinc)
39 %
Antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo (catalizador: tetrazol)
41 %
Procedimiento de la presente invencion (Ejemplo 8)
16 %
Basandose en la comparacion como se ha descrito anteriormente, se mostro que el procedimiento de la presente invencion produce menos impurezas, en comparacion con el antiguo procedimiento de pirofosfato de diimidazolilo y da un rendimiento notablemente mejorado, por tanto es muy adecuado como procedimiento de produccion industrial en masa de UP4U.
La presente invencion se ha descrito anteriormente, basandose en los ejemplos. Los ejemplos son simplemente ejemplos y se entiende por una persona experta en la tecnica que son posibles diversas modificaciones y las modificaciones estan tambien en el alcance de la presente invencion.
Por ejemplo, en los ejemplos anteriores, se uso una solucion acuosa de cloruro ferrico como la solucion acuosa que contiene el ion metalico que se uso, pero no es la intencion de limitar en concreto y se puede usar adecuadamente una solucion acuosa que disuelve (i) cloruro ferroso, cloruro ferrico, bromuro ferrico, tricloruro de aluminio, tricloruro de cerio, tricloruro de lantano y similares como ejemplos del haluro metalico, (ii) sales inorganicas de sulfato, nitrato, acido perclorico y similares de un metal seleccionado entre el grupo que consiste en hierro (divalente), hierro (trivalente), aluminio, cerio y lantano como ejemplos de la sal inorganica metalica o (iii) trifluorometanosulfonato, acetato, trifluoroacetato, citrato y similares de un metal seleccionado entre el grupo que consiste en hierro (divalente), hierro (trivalente), aluminio, cerio y lantano como ejemplos de la sal organica metalica. Una persona experta en la tecnica puede entender facilmente que el rendimiento de UP4U se mejora asf como los ejemplos anteriores tambien, cuando se usa la solucion acuosa que contiene estos iones metalicos.

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
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    35
    40
    1. Un procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato, que comprende hacer reaccionar un compuesto activador de acido fosforico representado por la siguiente formula [II] o [III] con un compuesto de acido fosforico seleccionado entre el grupo que consiste en UMP, UDP, UTP y un acido pirofosforico o una sal del mismo, excluyendo UTP libre, en agua o un disolvente organico hidrofflico, en presencia de un ion metalico seleccionado entre el grupo que consiste en un ion de hierro (II), un ion de hierro (III), un ion de aluminio trivalente, un ion de lantano trivalente y un ion de cerio trivalente.
    imagen1
    donde R1 representa un grupo uridilo que se une a la posicion 5'; X representa un grupo heterocfclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo; y n representa un numero entero de 1 o 2,

    O O
    imagen2

    X-------P------O-------P-------X

    HO HO
    [III]
    donde X representa un grupo heterocfclico seleccionado entre el grupo que consiste en un grupo imidazolilo, un grupo bencimidazolilo y un grupo 1,2,4-triazolilo.
  2. 2. El procedimiento de produccion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto activador de acido fosforico es UDP-imidazolida y el compuesto de acido fosforico es UDP o una sal de UDP.
  3. 3. El procedimiento de produccion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto activador de acido fosforico es UMP-imidazolida y el compuesto de acido fosforico es una sal de UTP.
  4. 4. El procedimiento de produccion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto activador de acido fosforico es UMP-imidazolida y el compuesto de acido fosforico es un acido pirofosforico o pirofosfato.
  5. 5. El procedimiento de produccion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto activador de acido fosforico es pirofosfato de diimidazolilo y el compuesto de acido fosforico es UMP o una sal de UMP.
  6. 6. El procedimiento de produccion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el ion metalico se seleccione entre el grupo que consiste en un ion de hierro (II), un ion de hierro (III) y un ion de aluminio.
  7. 7. El procedimiento de produccion de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el ion metalico es un ion de hierro (III) o un ion de aluminio.
  8. 8. El procedimiento de produccion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el ion metalico se proporciona en forma de cloruro, bromuro, nitrato, sulfato o acetato del metal.
    imagen3
    imagen4
    imagen5
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    imagen7
    imagen8
ES13869663.8T 2012-12-28 2013-12-10 Procedimiento para producir P1,P4-di(uridina 5'-)tetrafosfato Active ES2629743T3 (es)

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