CN105026414B - P1,p4‑二（尿苷5’‑）四磷酸酯的制造方法 - Google Patents

P1,p4‑二（尿苷5’‑）四磷酸酯的制造方法 Download PDF

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Abstract

开发不使用UTP游离基、能够避免合成效率降低的P1,P4‑二（尿苷5'‑）四磷酸酯（UP4U）的制造方法。UP4U的制造方法，其特征在于，使式[II]或[III]所示的磷酸活性化合物与选自UMP、UDP、UTP和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐（不包括游离UTP）在选自铁(II)离子、铁(III)离子、3价铝离子、3价镧离子和3价铈离子中的金属离子的存在下在水或亲水性有机溶剂中发生反应。[II][III]（式[II]中的R1、X、n、式[III]中的X分别表示权利要求1中记载的意义）。

Description

P1,P4-二（尿苷5’-）四磷酸酯的制造方法
技术领域
本发明涉及P1,P4-二（尿苷5’-）四磷酸酯的有效的新型制造方法。
背景技术
下述式[I]所示的P1,P4-二（尿苷5’-）四磷酸酯（以下表述为“UP4U”）或其盐被用作与干眼症相伴的角膜上皮障碍的治疗药。另外，是作为具有诱导排痰作用的去痰剂或肺炎治疗药而期待开发的化合物。
以往，作为UP4U的合成方法，报告了使利用尿苷5’-三磷酸（UTP）的脱水缩合反应而制备的尿苷5’-环状三磷酸与尿苷5’-单磷酸（UMP）发生反应的方法（非专利文献1）及其改良方法（专利文献1）。
[化1]
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/012949号
专利文献2：国际公开第2008/024169号
非专利文献
非专利文献1：Bioorg.＆ Medicinal Chemistry Letters,vol.11,157-160（2001）
非专利文献2：Org.Biomol.Chem.,2011,No.9,730-738（2011）。
发明内容
发明要解决的课题
然而，上述文献记载的现有技术在以下方面还具有改善的余地。
第一，专利文献1的方法能够在实验室水平下以80%以上这一高收率合成UP4U，但利用该方法以工业规模进行大量制造还存在问题。
具体而言，专利文献1的方法中，为了进行5’-UTP的5’-环状三磷酸化反应，需要将原料UTP以三正丁胺之类的叔胺盐的形态使用。因此，需要将UTP的三钠盐事先利用离子交换色谱法制成游离型的UTP（游离UTP）后，与叔胺形成盐的工序。然而，如后述试验例中验证得那样，游离UTP是非常不稳定的物质，在工业规模的大量制造中，非常难以将游离UTP用作原料。
第二，为了有效地合成UTP的5’-环状三磷酸化反应，需要在即将进行反应之前预先使UTP的三正丁胺盐成为脱水状态。然而，如后述比较试验中验证得那样，在工业规模的大量制造中，通过共沸将UTP的三正丁胺盐进行脱水时，会发生UTP的热分解反应，因此UTP的纯度降低，结果导致合成效率降低。
像这样，以UTP作为起始原料的专利文献1的方法对于UP4U的工业大量制造而言无法说是最佳的方法。因而，本发明的目的在于，通过不使用游离UTP、规避用于合成尿苷5’-环状三磷酸的UTP盐的脱水操作，从而开发出能够降低由原料分解导致的合成效率降低的新型制造方法。
用于解决问题的手段
作为规避专利文献1记载的合成方法中的问题的方法，可以考虑或已知有下述A、B所示的2个方法。
方法（A）：作为起始原料，使用UMP而非UTP，在反应体系内由UMP制备UTP后，不对其进行精制地应用于专利文献1的方法，从而合成UP4U（以下称为“一步合成法”）。
方法（B）：将焦磷酸利用咪唑进行活化而合成焦磷酸二咪唑，使其与UMP进行缩合，从而合成UP4U（以下称为“焦磷酸二咪唑法旧法”、专利文献2、非专利文献2）。
然而，上述一步合成法、焦磷酸二咪唑法旧法均是使用二甲基甲酰胺（DMF）等有机溶剂作为UP4U的合成反应的溶剂并在无水环境下进行的方法。另一方面，反应原料中使用的UMP、UTP、焦磷酸等均是亲水性高的化合物，为了将这些原料供于反应而必须在各工序中经由脱水工序。尤其是，焦磷酸盐在有机溶剂中的溶解性也差，存在其处理需要多加注意等问题。
另外，本发明人针对上述2个改良合成方法进一步进行了研究。首先，针对一步合成法进行详细研究时，如后述实施例所示那样，作为目标产物的UP4U的合成收率大幅降低至约40%。另外发现：将专利文献1的方法作为一步合成法来实施时，会产生各种副产物，因此为了将其分离而需要利用复杂的柱色谱法进行精制。
接着，针对焦磷酸二咪唑法旧法进行了详细研究。结果发现：如后述实施例所示那样，在焦磷酸二咪唑法旧法中也大量产生副产物、无法说作为最终产物的UP4U相对于UMP的收率充分高。即可明确：一步合成法、焦磷酸二咪唑法旧法均无法说是适合于工业规模的UP4U大量生产的合成方法。
因而，本发明人为了确定适合于工业大量制造的UP4U的有效合成方法而重复进行了深入研究，结果发现：通过将（a）使尿苷5’-二磷酸（UDP）、UMP或焦磷酸与选自可以具有取代基的咪唑、苯并咪唑或1,2,4-三唑中的化合物进行缩合而合成的磷酸活性化合物与（b）选自UMP、UDP、UTP和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐（其中不包括游离UTP）进行组合，并在作为催化剂的选自铁（II）离子、铁（III）离子、3价铝离子、3价镧离子、3价铈离子中的金属离子的存在下在水或亲水性有机溶剂中使其反应这一简便的方法，能够规避游离UTP的利用和UTP盐的脱水操作而且副产物少，能够以高收率合成UP4U，从而完成了本发明。
即，本发明提供如下P1,P4-二（尿苷5’-）四磷酸酯的制造方法，其特征在于，包括使下述式[II]或[III]所示的磷酸活性化合物与选自UMP、UDP、UTP和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐（其中不包括游离UTP）在选自铁（II）离子、铁（III）离子、3价铝离子、3价镧离子和3价铈离子中的金属离子的存在下在水或亲水性有机溶剂中发生反应的工序。
[化2]
（式中，R1表示在5’位键合的尿苷基；X表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环式基团；n表示1或2的整数）。
[化3]
（式中，X表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环式基团）。
发明的效果
本发明的制造方法能够在规避不适合于工业大量制造的游离UTP的利用和UTP盐的脱水操作的同时高效地进行UP4U的合成。另外，本发明的制造方法基本上不会生成副产物，因此所合成的UP4U容易精制。进而，通过在亲水性条件下进行反应，能够省略繁杂的脱水工序。即，本发明的制造方法对于UP4U的工业大量合成是极其适合的方法。
附图说明
图1表示对利用本发明方法合成UP4U时的反应液中的产物进行分析的HPLC谱图。图中，第10个峰表示作为目标产物的UP4U、第6个峰表示作为原料的UDP。
图2表示对利用一步合成法合成UP4U时的反应液中的产物进行分析的HPLC谱图。图中，第19个峰表示作为目标产物的UP4U、第5个峰表示作为原料的UMP。
图3表示对利用本发明方法合成UP4U时的反应液中的产物进行分析的HPLC谱图。图中，第16个峰表示作为目标产物的UP4U、第6个峰表示作为原料的UMP。
图4表示对利用焦磷酸咪唑法旧法（无催化剂）合成UP4U时的反应液中的产物进行分析的HPLC谱图。图中，第17个峰表示作为目标产物的UP4U、第5个峰表示作为原料的UMP。
图5表示对利用焦磷酸二咪唑法旧法（催化剂为ZnCl2）合成UP4U时的反应液中的产物进行分析的HPLC谱图。图中，第16个峰表示作为目标产物的UP4U、第5个峰表示作为原料的UMP。
图6表示对利用焦磷酸二咪唑法旧法（催化剂为四唑）合成UP4U时的反应液中的产物进行分析的HPLC谱图。图中，第20个峰表示作为目标产物的UP4U、第5个峰表示作为原料的UMP。
具体实施方式
以下，针对本发明的实施方式进行详细说明。
<磷酸活性化合物>
本发明所使用的磷酸活性化合物是式[II]或[III]所示的化合物，是通过使UMP、UDP或焦磷酸与可以具有取代基的咪唑、苯并咪唑或1,2,4-三唑缩合而合成的。
[化4]
（式中，R1表示在5’位键合的尿苷基；X表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的一个杂环式基团；n表示1或2的整数）。
[化5]
（式中，X表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环取代基）。
作为X所示的杂环取代基，可列举出咪唑基、苯并咪唑基或1,2,4-三唑基等。另外，这些杂环式基团可以在该杂环式基团中具有取代基，作为该取代基，可列举出例如C1-6烷基、硝基、氰基等。
作为这种磷酸活性化合物，具体而言，可列举出UDP-磷酸咪唑、UDP-磷酸三唑、UMP-磷酸咪唑或焦磷酸二咪唑等，这些化合物可按照已知的方法（Nucleic AcidsResearch,vol.4,2843（1977）、Journal of American Chemical Society,vol.126,9548（2004））来制备。
在UP4U的合成时，可以将UDP-磷酸咪唑、UDP-磷酸三唑、UMP-磷酸咪唑或焦磷酸二咪唑等磷酸活性化合物的合成液或其浓缩液直接使用，或者根据需要进行精制后使用。
<磷酸化合物>
本发明中使用的磷酸化合物是下述式（IV）所示的化合物或其盐，具体而言，可列举出不包括游离UTP在内的UMP、UDP、UTP、焦磷酸、或它们的盐。
[化6]
（式中，R2表示氢原子或在5’位键合的尿苷基；m表示1~3的整数）。
该磷酸化合物能够以钠、钾等碱金属盐、三乙基铵、三丁基铵等叔铵盐、四乙基铵盐、四丁基铵之类的季铵盐的形态使用。
<原料化合物的组合>
作为这种磷酸活性化合物与磷酸化合物的原料化合物的组合，合乎目的地确定即可，优选以以下组合来使用。
组合1：UDP活性化合物与UDP或UDP盐的组合
组合2：UMP活性化合物与UTP盐的组合
组合3：UMP活性化合物与焦磷酸或焦磷酸盐的组合
组合4：焦磷酸活性化合物与UMP或UMP盐的组合。
在任意组合中，将缩合反应中的磷酸活性化合物与磷酸化合物的摩尔比设定为1:10~10:1的范围时，UP4U的收率会提高，故而优选。该摩尔比例如为：
（1）为上述组合1时，摩尔比为3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1中的任一者；
（2）为组合2时，摩尔比为1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3中的任一者；
（3）为组合3时，为4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1中的任一者；进而，
（4）为组合4时，为4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1中的任一者，
可以为此处例示的任意2个数值的范围内。
<金属离子>
本发明所使用的金属离子通过以包含目标金属离子的金属盐形态添加至溶液中，会在水或亲水性有机溶剂中成为金属离子，从而能够供给至反应体系中。作为金属盐的种类，可提示出金属卤化物、金属无机酸盐、金属有机酸盐等。进而作为具体例，由于UP4U的收率提高而优选使用（i）作为金属卤化物例子的氯化亚铁、氯化铁、溴化铁、三氯化铝、三氯化铈、三氯化镧等；（ii）作为金属无机酸盐例子的选自铁（2价）、铁（3价）、铝、铈、镧中的金属的硫酸、硝酸、高氯酸等的无机酸盐；（iii）作为金属有机酸盐例子的选自铁（2价）、铁（3价）、铝、铈、镧中的金属的三氟甲磺酸盐、醋酸盐、三氟醋酸盐、柠檬酸盐等。其中，从合成收率和处理容易性的观点出发，优选为三价铁盐、特别优选为氯化铁。需要说明的是，所使用的金属盐可以是无水物，也可以是水合物。其中，在上述磷酸活性化合物与磷酸化合物的组合之中，尤其是在组合4的情况下，特别优选使用铁（III）离子、3价铝离子等。
为了提高UP4U的收率，作为金属离子源的金属盐相对于反应中使用的磷酸化合物的总摩尔数优选设为0.001~10倍摩尔量、可特别优选地使用0.001~1倍摩尔量。该金属盐的量例如相对于反应中使用的磷酸化合物的总摩尔数为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1倍摩尔量中的任一者，可以是此处例示出的任意2个数值的范围内。
<缩合反应・精制的条件>
本发明中的磷酸活性化合物与磷酸化合物的缩合反应将水或亲水性有机溶剂作为溶剂来实施。从合成收率和处理容易度的观点出发，作为亲水性有机溶剂，可以使用甲醇、乙醇等碳原子数6以下的醇类、丙酮等酮类、二噁烷等醚类、乙腈等腈类、二甲基甲酰胺等酰胺类等。
在该缩合反应中，为了提高UP4U的收率，反应pH优选为7以下、特别优选为pH1~4附近。另外，在该缩合反应中，为了提高UP4U的收率，反应温度优选为0℃~60℃。在上述原料化合物的组合中，在组合1~组合3的情况下，反应温度特别优选为20~30℃，在组合4的情况下，反应温度特别优选为0~20℃。为了进行必要充分的缩合反应，该缩合反应的时间优选为1~36小时左右、特别优选为2~20小时。
缩合反应结束后，通过适当组合通常的核苷酸的分离精制中使用的方法（例如结晶法、离子交换色谱法、吸附柱色谱法、活性炭柱色谱法等），能够分离精制所生成的UP4U，根据需要也能够制成盐型。
作为离子交换色谱法中使用的离子交换树脂，可以使用强碱性阴离子交换树脂（例如アンバーライトIRA402〔ローム&ハース公司制〕、ダイアイオンPA-312、ダイアイオンSA-11A〔三菱化学株式会社制〕）、弱碱性阴离子交换树脂（例如アンバーライトIRA67〔ローム&ハース公司制〕、ダイアイオンWA-30〔三菱化学株式会社制〕）、强酸性阳离子交换树脂（例如ダイアイオンPK-216〔三菱化学株式会社制〕）或弱酸性阳离子交换树脂（ダイアイオンWK-30〔三菱化学株式会社制〕）等。
作为活性炭，使用形成为破碎状或粒状的色谱用活性炭即可，例如可以使用和光纯药工业株式会社、二村化学工业株式会社制等的市售品。
另外，结晶化使用已知的方法即可，例如向所得UP4U或其盐中添加亲水性有机溶剂，使晶体析出从而可以得到。作为使用的亲水性有机溶剂，可例示出甲醇、乙醇等碳原子数6以下的醇类、丙酮等酮类、二噁烷等醚类、乙腈等腈类、二甲基甲酰胺等酰胺类，优选为醇类、进而特别优选为乙醇。
<本发明的作用效果>
如上所述说明得那样，本发明通过使用将（a）使尿苷5’-二磷酸（UDP）、UMP或焦磷酸与选自可以具有取代基的咪唑、苯并咪唑或1,2,4-三唑中的化合物缩合而合成的磷酸活性化合物与（b）选自UMP、UDP、UTP和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐（其中不包括游离UTP）进行组合，在作为催化剂的选自铁（II）离子、铁（III）离子、3价铝离子、3价镧离子、3价铈离子中的金属离子的存在下在水或亲水性有机溶剂中使其发生反应这一方法，如后述实施例所示那样，能够以简便的工序进行UP4U的工业大量制造。
另一方面，如上所述那样，以往公知的专利文献1的方法能够在实验室水平下以80%以上这一高收率合成UP4U，但利用该方法以工业规模进行大量制造还存在问题。具体而言，专利文献1的方法中，为了进行5’-UTP的5’-环状三磷酸化反应，需要将原料UTP以三正丁胺之类的叔胺盐的形态使用。因此，需要将UTP的三钠盐事先利用离子交换色谱法制成游离型的UTP（游离UTP）后，与叔胺形成盐的工序。然而，如后述试验例中所示那样，游离UTP是非常不稳定的物质，在工业规模的大量制造中，有时非常难以将游离UTP用作原料。另外，为了有效地合成UTP的5’-环状三磷酸化反应，需要在即将进行反应之前预先使UTP的三正丁胺盐成为脱水状态。然而，如后述比较试验例所示那样，在工业规模的大量制造中，通过共沸将UTP的三正丁胺盐进行脱水时，会发生UTP的热分解反应，因此UTP的纯度降低，结果成为合成效率降低的原因。
另外，专利文献2和非专利文献2的方法能够合成UP4U而不应用使用了上述游离UTP的工序，如后述比较试验所示那样，相对于UMP的收率显著降低。另外，大量生成副产物，无法说是适合工业大规模制造的制法。
相对于此，本发明方法以UDP或UMP作为起始原料，因此无需使用游离UTP，进而也可以规避用于合成尿苷5’-环状三磷酸的UTP盐的脱水操作，如后述实施例所示那样，因此能够规避由原料分解导致的合成效率降低。另外，也无需利用共沸而对UTP的三正丁胺盐进行脱水，因此UTP不会发生热分解反应，如后述实施例所示那样，不会产生多于的副产物而导致UTP的纯度降低。因此，本发明的制造方法是极其适合UP4U的工业大量合成的方法。
本发明中优选的是，磷酸活性化合物为UDP-磷酸咪唑、磷酸化合物为UDP或UDP盐。该情况是因为后述实施例中验证了能够在规避不适合工业大量制造的游离UTP的利用和UTP盐的脱水操作的同时，高效地进行UP4U的合成。
另外，本发明中优选的是，磷酸活性化合物为UMP-磷酸咪唑、磷酸化合物为UTP或UTP盐。该情况也是因为后述实施例中验证了能够在规避不适合工业大量制造的游离UTP的利用和UTP盐的脱水操作的同时，高效地进行UP4U的合成。
另外，本发明中优选的是，磷酸活性化合物为UMP-磷酸咪唑、磷酸化合物为焦磷酸或焦磷酸盐。该情况也是因为后述实施例中验证了能够在规避不适合工业大量制造的游离UTP的利用和UTP盐的脱水操作的同时，高效地进行UP4U的合成。
另外，本发明中优选的是，磷酸活性化合物为焦磷酸二咪唑、磷酸化合物为UMP或UMP盐。该情况也是因为后述实施例中验证了能够在规避不适合工业大量制造的游离UTP的利用和UTP盐的脱水操作的同时，高效地进行UP4U的合成。
另外，本发明中，金属离子优选选自铁（II）离子、铁（III）离子或铝离子。尤其是磷酸活性化合物为焦磷酸二咪唑、磷酸化合物为游离UMP或UMP盐时，优选选自铁（III）离子或铝离子。这些情况是因为后述比较试验中验证了：与使用其它金属离子的情况相比，能够高效地进行UP4U的合成。
另外，本发明中，金属离子优选以选自金属的氯化物、溴化物、硝酸化物、硫酸化物、醋酸化物中的盐的形态供给。该情况也是因为能够高效地进行UP4U的合成。
以上，针对本发明的实施方式进行叙述，但它们是本发明的例示，也可以采用上述之外的各种技术方案。
实施例
以下，利用实施例来进一步说明本发明，但本发明不限定于它们。
（实施例1）组合1（其1）：UDP-磷酸咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=咪唑、n=2）与UDP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=2）的反应
向0.32M UDP-三丁胺盐的水溶液（1.26ml、4.0mmol）中添加二甲基乙酰胺（6.0ml），进行4次共沸脱水。将所得残渣用二甲基乙酰胺（6.0ml）溶解，添加碳酰二咪唑（1.95g、12.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加0.5M盐酸水溶液（12.0ml）（pH7.0）。将反应液在减压下浓缩，从而制备UDP-磷酸咪唑溶液。
在冰冷下向UDP-磷酸咪唑溶液中添加UDP钠水溶液（2.0mmol、2.1ml），进而添加2M盐酸水溶液而制成pH4.9的混合溶液。在冰冷下添加1M氯化铁水溶液（1.5mmol、1.5ml），进而添加2M盐酸水溶液而制成pH1.6的混合溶液，以25℃搅拌3小时。向反应液中添加6M氢氧化钠水溶液而使pH为12，在室温下搅拌30分钟。添加2M盐酸而使pH为7.6。利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为87%。
将合成液浓缩至10ml，添加磷酸一氢钠（4.2mmol）并溶解，使磷酸铁析出。将悬浊液以4℃静置一晩后，利用离心分离来去除沉淀物。将上清液的pH调整至2.5后，作为30ml溶液而制成柱吸附液。
针对上述柱吸附液，利用活性炭柱色谱法（树脂量20ml）进行脱盐，将所得回收液的pH调整至7并浓缩后，进行薄膜过滤。进而进行浓缩，向残渣中滴加乙醇，在室温下进行一晩结晶化。滤取晶体，以50℃真空干燥3小时，得到目标物UP4U 2.12g（以4水合物计，收率为75%）。
（实施例2）组合1（其2）：UDP-磷酸咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=咪唑、n=2）与UDP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=2）的反应
向0.94M UDP钠水溶液（1.0ml）中添加5.64M 咪唑-二甲基乙酰胺溶液（0.5ml），添加N,N-二异丙基碳二亚胺（0.73ml、4.7mmol）并在室温下搅拌5小时，以50℃搅拌2小时，从而制备UDP与UDP-磷酸咪唑溶液的混合液。
在冰冷下添加2M盐酸水溶液而制成pH5.3的混合溶液后，添加1M氯化铁水溶液（0.24mmol、0.24ml），进而添加2M盐酸水溶液而制成pH1.9的混合溶液，以25℃搅拌16小时。利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为63%。
（实施例3）组合1（其3）：UDP-磷酸咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=咪唑、n=2）与UDP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=2）的反应
向0.17M UDP-三丁胺盐的水溶液（11.8ml、2.0mmol）中添加丙腈（3.0ml）并进行4次共沸脱水。将所得残渣用丙腈（3.0ml）溶解。将其滴加至1,1’-碳酰二咪唑（0.97g、6.0mmol）的丙腈（2.0ml）悬浊液中。在室温下搅拌30分钟后，将反应液在减压下浓缩，从而制备UDP-磷酸咪唑溶液。
在冰冷下向UDP-磷酸咪唑溶液中添加UDP-2钠（0.53g,1.0mmol），用6M盐酸水溶液将pH调整至3.9。进而添加1M氯化铁水溶液（15μl、0.02mmol），以10℃搅拌27小时。向反应液中添加7.5M氢氧化钠水溶液而使pH为10，在冰冷下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加10ml乙醇，在4℃下静置一晩。回收沉淀物而制备pH7.5的20ml水溶液，利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为94%。即明确了：即使大幅减少氯化亚铁催化剂的用量时，反应也会良好地推进。
（实施例4）组合1（其4）：UDP-磷酸苯并咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=苯并咪唑、n=2）与UDP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=2）的反应
将UDP-2钠盐（0.5g、0.94mmol）溶于水2.7ml中，添加苯并咪唑（0.33g、2.82mmol）的二甲基乙酰胺溶液（1.8ml）和N,N-二异丙基碳二亚胺（0.44ml、2.82mmol），在室温下搅拌一晩。在减压下蒸馏去除溶剂，从而制备UDP-2钠与UDP-磷酸苯并咪唑的混合物。
向其中添加水1ml后，在冰冷下添加2M盐酸水溶液而将pH制备成4.6。在冰冷下添加1M氯化铁水溶液（94μl、0.09mmol），进而添加2M盐酸水溶液而制成pH3.0的混合溶液，在室温下搅拌10小时。向反应液中添加6M氢氧化钠水溶液而使pH为12，在室温下搅拌1小时。添加2M盐酸而使pH为7.3。利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为83%。
（实施例5）组合1（其5）：UDP-磷酸三唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=1,2,4-三唑、n=2）与UDP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=2）的反应
向0.37M UDP-三丁胺盐的水溶液（1.6ml、0.6mmol）中添加二甲基乙酰胺（2.0ml）并进行4次共沸脱水。将所得残渣用二甲基乙酰胺（2.0ml）溶解，添加1,1’-碳酰二（1,2,4-三唑）（0.25g、1.5mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而添加0.5M盐酸水溶液而使pH为7.4。将反应液在减压下浓缩，从而制备UDP-磷酸三唑溶液。
在冰冷下向UDP-磷酸三唑溶液中添加UDP钠水溶液（0.25mmol、0.9ml），进而添加1M氯化铁水溶液（0.19mmol、0.19ml）（pH6.3），以25℃搅拌5小时。向反应液中添加6M氢氧化钠水溶液而使pH为12，在室温下搅拌30分钟。添加2M盐酸而使pH为7.0。利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为48%。
（实施例6）组合2：UMP-磷酸咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=咪唑、n=1）与UTP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=3）的反应
向2.05M 游离UMP水溶液（0.49ml、1.0mmol）中添加三丁胺（0.25ml、1.1mmol），在室温下搅拌20分钟后，进一步添加二甲基乙酰胺（1.5ml）并进行3次共沸脱水。将所得UMP-三丁胺盐溶液用二甲基乙酰胺（1.5ml）溶解，添加碳酰二咪唑（486mg、3.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加0.5M盐酸水溶液（4.0ml）（pH7.2）。将反应液在减压下浓缩，从而制备UMP-磷酸咪唑溶液。
在冰冷下向165mM UTP钠水溶液（8.0ml、1.3mmol）中添加上述UMP-磷酸咪唑溶液和2M盐酸水溶液，制成pH5.1的混合溶液。在冰冷下添加氯化铁水溶液（0.5mmol、0.2ml），以25℃搅拌4小时。将反应液进行薄膜过滤后，添加1M氢氧化钠水溶液（11ml）而使pH为10.4，在室温下搅拌40分钟。其后，添加2M盐酸（3.5ml）而使pH为6.9。利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为67%。
以下，与实施例1同样地进行精制，结果得到目标物UP4U 471mg（以四水合物计为50%）。
（实施例7）组合3：UMP-磷酸咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=咪唑、n=1）与焦磷酸三乙胺盐（式IV中，R2为氢原子、m=2）的反应
向2.05M 游离UMP水溶液（0.49ml、1.0mmol）中添加三丁胺（0.25ml、1.1mmol），在室温下搅拌20分钟后，添加二甲基乙酰胺（1.5ml）并进行3次共沸脱水。将所得UMP-三丁胺盐溶液用二甲基乙酰胺（1.5ml）溶解，添加碳酰二咪唑（486mg、3.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加0.5M盐酸水溶液（4.0ml）（pH7.2）。将反应液在减压下浓缩，从而制备UMP-磷酸咪唑溶液（该操作进行2次）。
在冰冷下向UMP-磷酸咪唑溶液中添加0.95M 焦磷酸三乙胺水溶液（1.1ml、1.0mmol），进而添加1M氯化铁水溶液（0.5mmol、0.5ml）。将反应液用2M盐酸水溶液将pH调整至5.1后，以25℃搅拌5小时。搅拌后，在冰冷下添加另行制备的UMP-磷酸咪唑溶液（1.0mmol），进而用2M盐酸水溶液将pH调整至2.1，以25℃搅拌6小时。添加6M氢氧化钠水溶液而使pH为11，在室温下搅拌30分钟。进而添加2M盐酸而使pH为7.6，用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为45%。
（实施例8）组合4：焦磷酸二咪唑（式III中，X=咪唑）与UMP（式IV中，R2为5’-尿苷、m=1）的反应
向1.09M焦磷酸-三乙胺盐的水溶液（1.86ml、2.0mmol）中添加三丁胺（0.95ml、4.0mmol）、甲酰胺（2.0ml），利用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水。将所得残渣用二甲基甲酰胺（8.0ml）溶解，添加碳酰二咪唑（0.97g、6.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加2.0M盐酸水溶液（1.5ml）（pH7）。将反应液在减压下浓缩，从而制备焦磷酸-二咪唑溶液。
在冰冷下向焦磷酸-二咪唑溶液中添加游离UMP水溶液（2.03M、2.47ml、5.0mmol）。进而添加1M氯化铁水溶液（2ml、2.0mmol），添加2M盐酸水溶液而将pH调整至2.4，以0℃搅拌5小时。向反应液中添加6.0M氢氧化钠水溶液，使pH为6.3。向其中添加水而制备成50ml水溶液，利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为51%。
（试验例1）UTP和相关化合物的稳定性的测定
为了评价游离UTP的稳定性而调查了游离UTP、UTP钠盐（UTP-Na）的水溶液和UTP-三丁胺盐（UTP-TBA）的二甲基乙酰胺溶液的稳定性。另外，作为比较对照，还测定了游离UDP和UDP-Na的水溶液的稳定性。将各物质的溶液以-20℃、25℃或50℃静置一定时间，利用HPLC来测定各物质的浓度，算出分解率。需要说明的是，分解率如以下[数学式1]那样地定义。
[数学式1]
各物质的分解率(%)={100-(测定时的各物质的HPLC%/试验开始时的各物质的HPLC%)×100}
结果如下述[表1][表2]所示那样，可明确：与UTP钠盐、游离UDP、UDP钠盐之类的其它化合物相比，游离UTP和UTP-TBA的溶液保存时的稳定性明显低。
[表1]
（表中的数值表示各条件下的分解率）。
[表2]
（表中的数值表示各条件下的分解率）。
（比较试验1）UDP-磷酸咪唑（式II中，R1=5’-尿苷、X=咪唑、n=2）与UDP钠盐（式IV中，R2=5’-尿苷、m=2）的反应中的金属催化剂效果
向利用实施例1的方法制备的UDP-磷酸咪唑与UDP钠盐的摩尔比为1:1的混合水溶液（各0.15M）中添加各种金属催化剂（0.06M），用2M盐酸水溶液制成pH2±0.3，利用HPLC定量25℃、6小时后的UP4U的产量。将结果示于表3。
[表3]
结果可明确：将作为金属盐的氯化亚铁、氯化铁、硝酸铁、氯化铝、氯化镧、氯化铈用作催化剂时，能够以特别高的收率得到UP4U。
（比较试验2）焦磷酸二咪唑（式III中，X=咪唑）与游离UMP（式IV中，R2=5’-尿苷、m=1）的反应中的金属催化剂效果
向利用实施例8的方法制备的焦磷酸-二咪唑与游离UMP的摩尔比为2:5的混合水溶液（以焦磷酸-二咪唑计为0.4mmol）中添加各种金属催化剂（0.4mmol），用2M盐酸水溶液制成pH2.5±0.5，利用HPLC定量0℃、5小时后的UP4U的产量。将结果示于[表4]。
[表4]
结果可明确：作为原料而使用焦磷酸活性化合物与UMP的组合时，将作为金属盐的氯化铁、氯化铝用作催化剂时，能够以特别高的收率得到UP4U。
（比较试验3）使用一步合成法和本发明方法时的UP4U收率和杂质生成程度的比较
针对使用对以往方法进行改善而规避应用游离UTP的工序的合成法即一步合成法和本实施例的方法，分别合成UP4U时的最终产物的收率分别进行比较。作为本实施例的方法，基于上述实施例1的方法。改变以往方法的一步合成法的合成利用以下工序来进行。
（1）合成液1的制备
向2.05M的游离UMP水溶液（2.1ml、4.3mmol）中添加三正丁胺（2.2ml、9.2mmol）并搅拌20分钟后，用N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）进行4次共沸脱水。将残渣溶于DMAC（5.5ml），以10℃添加氯代磷酸二苯酯（DPC）（1.1ml、5.2mmol），在室温下搅拌1小时。添加三正丁胺（4.1ml、17.2mmol）并在室温下搅拌10分钟，将其作为合成液1。
（2）合成液2的制备
向0.95M焦磷酸-三乙胺盐水溶液（9.0ml、8.5mmol）中添加三正丁胺（2.2ml、9.2mmol）、DMAC（3.0ml）后，用吡啶进行3次共沸脱水。向残渣中添加三正丁胺（0.4ml、2.8mmol）、吡啶（4.0ml），将其作为合成液2。
（3）UMP-TBA溶液的制备
向2.05M的游离UMP水溶液（3.1ml、6.4mmol）中添加三正丁胺（1.7ml、6.9mmol）并搅拌20分钟后，用N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）进行4次共沸脱水。将残渣溶于DMAC（3.5ml），从而制备UMP-TBA溶液。
（4）UP4U合成液的制备
在室温下向合成液2中滴加合成液1，在室温下搅拌1小时（利用HPLC分析确认了UTP约生成60%）。添加N,N-二异丙基碳二亚胺（2.3ml、17.0mmol）并在室温下搅拌3小时后，以0℃添加UMP-TBA溶液和氯化镁六水合物（1.7g、8.4mmol），以0℃搅拌1小时、在室温下搅拌19小时。以0℃添加水（20ml）后，在室温下搅拌1小时。将反应液减压浓缩后，添加水（50ml）并在室温下静置2小时。过滤去除沉淀物而制备UP4U合成液。利用HPLC来定量UP4U，由UMP算出合成收率为42%。
（结果的考察/收率）
其结果可明确：利用本实施例的方法合成UP4U时，如上述实施例1所示那样，基于UDP的合成收率为87%，利用一步合成法基于UMP的合成收率不过是42%，本发明的方法与一步合成法相比会实现明显高的收率。
（结果的考察/副产物）
进而，为了比较本实施例的方法与一步合成法中的杂质生成程度的差异，利用HPLC来分析分别用各方法合成UP4U后的反应液中的产物。将HPLC谱图示于[图1][图2]。由图1和图2可明确：利用一步合成法时，作为产物的UP4U和原料UMP之外的副产物以HPLC谱图的面积比率计约产生48%，并且副产物的种类也多，利用本发明的方法时，UP4U和原料UDP之外的副产物的比率明显降低至4.8%，副产物的种类也极少，因此本发明的方法能够明显降低副产物的发生，因此能够高收率地合成，且容易分离精制。
由以上那样的比较示出：本发明的方法与一步合成法相比生成的杂质少且收率显著提高，极其适合作为UP4U的工业大量制造方法。
（比较试验4）使用焦磷酸二咪唑法旧法和本发明方法时的UP4U收率和杂质生成程度的比较
针对使用咪唑法旧法和本实施例的方法分别合成UP4U时的最终产物的收率和副产物的生成分别进行对比。作为本实施例的方法，基于上述实施例8的方法。利用咪唑法旧法的合成按照以下工序来进行。另外，关于反应时使用的催化剂，参考公知的方法（参照专利文献2和非专利文献2），针对（1）反应时未添加催化剂的情况、作为催化剂而使用（2）氯化锌或（3）四唑的情况进行了研究。
（1）无催化剂的情况
向1.09M焦磷酸-三乙胺盐的水溶液（1.86ml、2.0mmol）中添加三丁胺（0.95ml、4.0mmol）、甲酰胺（2.0ml），用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水。将所得残渣用二甲基甲酰胺（8.0ml）溶解，添加碳酰二咪唑（0.97g、6.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加2.0M盐酸水溶液（1.5ml）（pH7）。将反应液在减压下浓缩，进而用二甲基甲酰胺进行2次共沸脱水，从而制备无水焦磷酸-二咪唑溶液。
向游离UMP水溶液（2.03M、2.47ml,5.0mmol）中添加三丁胺（3.56ml、15.0mmol），用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水，添加二甲基甲酰胺（2.0ml），从而制备无水UMP-三丁胺溶液。将其添加至无水焦磷酸-二咪唑溶液，在减压下进行浓缩，以25℃搅拌48小时。向反应液中添加水而制备50ml水溶液，用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为10%。
（2）将氯化锌用于催化剂的情况
向1.09M焦磷酸-三乙胺盐的水溶液（1.86ml、2.0mmol）中添加三丁胺（0.95ml、4.0mmol）、甲酰胺（2.0ml），用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水。将所得残渣用二甲基甲酰胺（8.0ml）溶解，添加碳酰二咪唑（0.97g、6.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加2.0M盐酸水溶液（1.5ml）（pH7）。将反应液在减压下浓缩，进而用二甲基甲酰胺进行2次共沸脱水，从而制备无水焦磷酸-二咪唑溶液。
向游离UMP水溶液（2.03M、2.47ml、5.0mmol）中添加三丁胺（3.56ml、15.0mmol），用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水，添加二甲基甲酰胺（2.0ml），从而制备无水UMP-三丁胺溶液。将其添加至无水焦磷酸-二咪唑溶液，进而添加氯化锌（1.34g、9.8mmol）后，在减压下进行浓缩，以25℃搅拌5小时。向反应液中添加水而制备成50ml水溶液，利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为17%。
（3）将四唑用于催化剂的情况
向1.09M焦磷酸-三乙胺盐的水溶液（1.86ml、2.0mmol）中添加三丁胺（0.95ml、4.0mmol）、甲酰胺（2.0ml），用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水。将所得残渣用二甲基甲酰胺（8.0ml）溶解，添加碳酰二咪唑（0.97g、6.0mmol）并在室温下搅拌1小时。在冰冷下向反应液中添加水（0.2ml），进而滴加2.0M盐酸水溶液（1.5ml）（pH7）。将反应液在减压下浓缩，进而用二甲基甲酰胺进行2次共沸脱水，从而制备无水焦磷酸-二咪唑溶液。
向游离UMP水溶液（2.03M、2.47ml、5.0mmol）中添加三丁胺（3.56ml、15.0mmol），用二甲基甲酰胺进行4次共沸脱水，添加二甲基甲酰胺（2.0ml），从而制备无水UMP-三丁胺溶液。将其添加至无水焦磷酸-二咪唑溶液，进而添加1H-四唑（0.5g、7.2mmol）后，在减压下进行浓缩，以25℃搅拌19小时。向反应液中添加水而制备成50ml水溶液，利用HPLC分析进行定量，算出UP4U的合成收率为9%。
（4）结果的考察/收率
针对焦磷酸二咪唑法旧法和本发明方法中的UP4U合成收率进行总结时，如下述[表5]所示那样。即可明确：与作为公知方法的磷酸咪唑法旧法相比，本发明方法会实现明显高的收率。
[表5]
（5）结果的考察/副产物
进而，为了比较本发明方法与焦磷酸二咪唑法旧法中的杂质生成程度的差异，利用HPLC对各方法中的合成UP4U后的反应液中的产物进行分析。将所得HPLC谱图示于[图3]~[图6]。另外，在焦磷酸二咪唑法旧法和本实施例的方法中，对HPLC谱图的面积中的产物即UP4U和原料UMP之外的副产物的比率进行总结时，如下述[表6]所示那样。
如图3~6和表6可明确的是，利用焦磷酸二咪唑法旧法时，作为产物的UP4U和原料UMP之外的副产物以HPLC谱图的面积比率计约产生40%，并且副产物的种类也多，与此相对，利用本发明的方法时，UP4U和原料UMP之外的副产物的比率明显降低至16%，副产物的种数也极少，因此本发明的方法能够显著降低副产物的发生，且能够高收率地合成，同时也容易分离精制。
[表6]
由以上那样的对比而示出：与焦磷酸二咪唑法旧法相比，本发明方法生成的杂质少、且收率明显提高，极其适合作为UP4U的工业大量制造方法。
以上基于实施例而说明了本发明。该实施例只不过是例示，本领域技术人员理解可呈现各种变形例，另外这种变形例也在本发明范围内。
例如在上述实施例中使用氯化铁水溶液作为包含金属离子的水溶液，但不意于特别限定，可适合地使用溶解有（i）作为金属卤化物例子的氯化亚铁、氯化铁、溴化铁、三氯化铝、三氯化铈、三氯化镧等、（ii）作为金属无机酸盐例子的选自铁（2价）、铁（3价）、铝、铈、镧中的金属的硫酸、硝酸、高氯酸等的无机酸盐、（iii）作为金属有机酸盐例子的选自铁（2价）、铁（3价）、铝、铈、镧中的金属的三氟甲磺酸盐、醋酸盐、三氟醋酸盐、柠檬酸盐等而成的水溶液。使用包含这些金属离子的水溶液时与上述实施例同样地也能提高UP4U的收率对于本领域技术人员是能够理解的。

Claims (8)

1.P1,P4-二（尿苷5’-）四磷酸酯的制造方法，其特征在于，包括使下述式[II]所示的磷酸活性化合物与选自UDP和焦磷酸中的磷酸化合物或其盐、或者UTP的盐在选自2价铁离子、3价铁离子、3价铝离子、3价镧离子和3价铈离子中的金属离子的存在下在水或亲水性有机溶剂中发生反应的工序，或者使下述式[III]所示的磷酸活性化合物与UMP或其盐在选自2价铁离子、3价铁离子、3价铝离子、3价镧离子和3价铈离子中的金属离子的存在下在水或亲水性有机溶剂中发生反应的工序，
[化1]
式[II]中，R1表示在5’位键合的尿苷基；X表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环式基团；n表示1或2的整数，
[化2]
式[III]中，X表示选自咪唑基、苯并咪唑基和1,2,4-三唑基中的1个杂环式基团。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，磷酸活性化合物为UDP-磷酸咪唑，磷酸化合物为UDP或UDP盐。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，磷酸活性化合物为UMP-磷酸咪唑，磷酸化合物为UTP盐。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其中，磷酸活性化合物为UMP-磷酸咪唑，磷酸化合物为焦磷酸或焦磷酸盐。
5.根据权利要求1所述的制造方法，其中，磷酸活性化合物为焦磷酸二咪唑，磷酸化合物为UMP或UMP盐。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的制造方法，其中，金属离子选自2价铁离子、3价铁离子和铝离子。
7.根据权利要求5所述的制造方法，其中，金属离子为3价铁离子或铝离子。
8.根据权利要求1所述的制造方法，其中，金属离子以金属的氯化物、溴化物、硝酸化物、硫酸化物或醋酸化物的形态来供给。
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