ES2629349T3 - Procedimiento para obtener composiciones hemostáticas secas y estables - Google Patents

Abstract

Procedimiento para obtener una composición hemostática seca y estable, comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una preparación granular seca de gelatina, b) revestir los gránulos de dicha preparación granular seca con una solución de trombina, obteniendo así gránulos de gelatina revestidos con trombina, c) cargar dichos gránulos de gelatina revestidos con trombina en un contenedor final, d) acondicionar el contenedor final a un dispositivo farmacéutico almacenable que contiene dichos gránulos de gelatina revestidos como una composición hemostática seca y estable.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para obtener composiciones hemostaticas secas y estables

Campo de la Invencion

La presente invencion se refiere a procesos para obtener composiciones hemostaticas en una forma de almacenamiento estable.

Antecedentes de la Invencion

Son conocidas composiciones hemostaticas secas en formas de almacenamiento estable que comprenden un material biocompatible, biodegradable, granular seco estable, por ejemplo de las WO 98/008550A o WO 2003/007845A. Estos productos han sido aplicados con exito en la tecnica para la hemostasis. Floseal® es un ejemplo de agente hemostatico poderoso y versatil que consiste en una matriz de gelatina granular hinchada en una solucion que contiene trombina para formar una pasta capaz de fluir.

Debido a que dichos productos deben aplicarse en humanos, es necesario proporcionar los estandares de seguridad mas altos de calidad, estabilidad de almacenamiento y esterilidad de los productos finales y de sus componentes. Por otra parte, la fabricacion y el manejo deben realizarse de la manera mas conveniente y eficiente posibles. Si las composiciones hemostaticas requieren un componente de trombina para su uso, dotar de este componente de trombina al producto final es un desaffo. Dado que la trombina y el material de matriz normalmente tienen propiedades diferentes en cuanto a los requerimientos de fabricacion, deben fabricarse y provisionarse por separado. Por ejemplo, los requisitos de esterilizacion pueden diferir significativamente entre el material de matriz granular relativamente estable (con frecuencia tambien reticulado) y los componentes proteicos, como trombina. Mientras que dichos materiales de matriz normalmente pueden esterilizarse por fuertes metodos de esterilizacion (como autoclave, irradiacion gama, etc.), la trombina (como enzima) debe ser tratada con mas cuidado. Esos metodos de esterilizacion fuertes normalmente no son posibles para la trombina debido a la perdida de actividad enzimatica producida por dichos duros tratamientos. Por razones de estabilidad, dichos productos (asf como tambien los productos segun la presente invencion) normalmente son provistos en una forma seca y se lleva a la forma "lista para su uso" (la cual normalmente es en forma de (hidro)gel, suspension o solucion) inmediatamente antes del uso, necesitando la adicion de agentes de humectacion o solucion (suspension) y la mezcla del componente del material de matriz con el componente de trombina. La reconstitucion de la trombina o el paso de mezclado de una solucion de trombina con el material de matriz granular son pasos que normalmente requieren cierto tiempo y manejo y pueden generar problemas, especialmente en el cuidado intensivo de la salud.

Un objeto de la presente invencion es superar dichos problemas y proporcionar metodos adecuados para obtener una composicion hemostatica seca y de almacenamiento estable que se puede suministrar y utilizar de forma conveniente. Estos metodos deben proporcionar formatos de producto que permiten una administracion conveniente de las composiciones hemostaticas "listas para el uso", especialmente en la medicina de cuidados intensivos, donde el numero de pasos de manejo debe mantenerse al mmimo posible.

Sumario de la Invencion

Asf, la presente invencion proporciona un procedimiento para obtener una composicion hemostatica seca y estable, comprendiendo dicho procedimiento:

a) proporcionar una preparacion granular seca de gelatina,

b) revestir los granulos de dicha preparacion granular seca con una solucion de trombina, obteniendo asf granulos de gelatina recubiertos de trombina,

c) cargar dichos granulos de gelatina revestidos con trombina en un contenedor final,

d) acondicionar el contenedor final a un dispositivo farmaceutico almacenable que contiene dichos granulos de gelatina recubiertos con trombina en forma de una composicion hemostatica seca y estable.

El procedimiento proporciona la composicion seca y estable de acuerdo con la presente invencion en una forma conveniente que permite que la composicion sea reconstituida facilmente para su uso medico. Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para suministrar una composicion hemostatica en un punto diana en el cuerpo de un paciente, comprendiendo dicho metodo suministrar una composicion hemostatica producida mediante el procedimiento de la presente invencion al sitio diana. De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a un contenedor final terminado obtenido mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invencion. La invencion tambien se refiere a un metodo para proporcionar una composicion hemostatica lista para el uso que comprende poner en contacto una composicion hemostatica producida mediante el procedimiento de la presente invencion con un diluyente farmaceuticamente aceptable, asf como tambien a un kit que comprende el contenedor final terminado y otros medios para aplicar la composicion (por

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ejemplo, un contenedor de diluyente). Las composiciones segun la presente invencion son particularmente utiles para proporcionar hemostasis en puntos de sangrado, incluyendo puntos de sangrado quirurgico, de sangrado traumatico y similares. Un uso ilustrativo de las composiciones puede ser en el sellado de tracto de tejido alrededor de una penetracion de vaso sangumeo originada por la cateterizacion vascular.

Descripcion de Realizaciones Espedficas de la Invencion

La presente invencion proporciona una mejora de la administracion y manejo de composiciones hemostaticas, principalmente proporcionando un producto de dos componentes en un formato conveniente de una unica composicion. Las composiciones hemostaticas segun la presente invencion contienen granulos recubiertos de gelatina revestidos con trombina, adecuados para su uso en la hemostasis (el "componente polimerico biocompatible hemostatico"). Pueden estar presentes otros componentes adicionales. Estos granulos recubiertos pueden ser reconstituidos en preparaciones hemostaticas "listas para el uso" utilizando diluyentes adecuados (por ejemplo soluciones ionicas acuosas). Preferentemente, las preparaciones "listas para el uso” se proporcionan como hidrogeles. En principio, productos de este tipo son conocidos en la tecnica, aunque en un formato diferente. Normalmente, los componentes se proporcionan como entidades separadas en forma seca. Antes de mezclar los componentes para la administracion en un paciente, los componentes secos normalmente se ponen en contacto por separado con los diluyentes adecuados. Entonces se mezclan los componentes mezclando los componentes reconstituidos por separado. Por ejemplo, puede preverse un componente de trombina seco que es reconstituido con un diluyente farmaceuticamente aceptable (acuoso). La solucion de trombina obtenida tras la reconstitucion se emplea entonces para mojar o solubilizar el polfmero, normalmente por formacion de un hidrogel, que se aplica entonces al paciente. Debido a que este es al menos un procedimiento en dos pasos para el producto "listo el uso utilizarse", sena mas conveniente si un producto pudiera necesitar unicamente un paso antes de estar listo el uso. Sin embargo, como se establecio anteriormente, la naturaleza de los dos componentes impide una mezcla simple de los componentes durante el metodo de produccion, principalmente debido a las perdidas de estabilidad y actividad.

Con la presente invencion, se proporcionan procedimientos de produccion que permiten que los dos componentes (trombina y gelatina) sean provistos ya en una forma seca combinada listos para ser reconstituidos juntos. Los procedimientos segun la presente invencion no son unicamente factibles para los experimentos cientfficos de laboratorio, sino que son adecuados para la produccion farmaceutica industrial masiva. Con la presente invencion es posible proporcionar esta composicion hemostatica ya mezclada sin el riesgo de una degradacion no deseada o de perdida de actividad enzimatica. Las composiciones resultantes tienen una estabilidad de almacenamiento comparable con la de productos previamente conocidos, pero son mas convenientes para el manejo debido a que la reconstitucion y mezcla separada antes de la administracion medica no es necesaria con los productos que se pueden obtener con la presente invencion. Es posible proporcionar un hidrogel, suspension o solucion lista para el uso de la composicion hemostatica en un procedimiento de un solo paso, agregando simplemente un diluyente farmaceuticamente aceptable adecuado a la composicion en el contenedor final. El contenedor final preferentemente es una jeringa disenada para administrar directamente la composicion hemostatica despues del contacto con el diluyente. Los granulos polimericos recubiertos con trombina de acuerdo con la presente invencion pueden cargarse en una jeringa y la jeringa puede entonces cerrarse con un tapon.

La "solucion de trombina" puede elaborarse a partir de cualquier preparacion de trombina que sea adecuada para su uso en humanos (es decir, farmaceuticamente aceptable). Fuentes adecuadas de trombina incluyen sangre, plasma o suero humanos o bovinos (pueden emplearse otras fuentes animales de trombina si no se esperan reacciones inmunes adversas) y trombina de origen recombinante (por ejemplo, trombina recombinante humana); la trombina humana autologa puede ser preferente para algunas aplicaciones. Preferentemente, la composicion hemostatica contiene de 10 al 100.000 Unidades internacionales (I.U.) de trombina, mas preferentemente de 100 a 10.000 I.U., en especial de 500 a 5.000 I.U. La concentracion de trombina en la composicion "lista para el uso" preferentemente esta en el rango de 10 a 10.000 I.U., mas preferentemente de 50 a 5.000 I.U., especialmente de 100 a 1.000 I.U./ml. El diluyente se utiliza en tal cantidad que permita la concentracion final deseada en la composicion "lista para el uso". La solucion de trombina puede contener otros componentes utiles, como iones, tampones, excipientes, estabilizadores, etc. Preferentemente, la solucion de trombina contiene albumina humana, manitol o mezclas de los mismos. Las sales preferentes son NaCl y/o CaCh, ambas utilizadas en las cantidades normales y a las concentraciones aplicadas para la trombina (por ejemplo del 0,5 al 1,5% de NaCI (por ejemplo, 0,9%) y/o de 20 a 80 mM de CaCl2 (por ejemplo 40 mM)).

La "preparacion granular seca de gelatina" (“polfmero biocompatible”) de acuerdo con la presente invencion es conocida, por ejemplo del documento WO 98/08550 A; sin embargo, sin revestimiento de trombina. Preferentemente, el polfmero es un material granular estable seco, biocompatible, biodegradable. El polfmero de gelatina "seco" de acuerdo con la presente invencion normalmente se proporciona con tamano de partfcula de 0,1 a 5.000 pm. Normalmente, las partfculas polimericas tienen un diametro de partfcula medio (el "diametro de partfcula medio" es el tamano mediano medido por difractometna laser; "tamano mediano (o diametro de partfcula mediano en masa, el diametro de partfcula que divide la distribucion de frecuencia por la mitad; el

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cincuenta por ciento de las partmulas de una preparacion determinada tienen un diametro mas grande y el cincuenta por ciento de las partmulas tienen un diametro mas pequeno) de 10 a 1.000 pm, especialmente de 50 a 500 pm (tamano mediano). La aplicacion de partmulas mas grandes depende principalmente de las necesidades medicas; partmulas con diametros de partmula medios mas pequenos a menudo son mas diffciles de manejar durante los procedimientos de produccion. Asf, el poUmero seco es provisto en forma granular. Aunque los terminos polvo y granular (o granulados) en algunas ocasiones se utilizan para distinguir tipos diferentes de material, los polvos como se definen aqu son una sub-clase especial de material granular. En particular, los polvos se refieren a aquellos materiales granulares que tienen los tamanos de grano mas finos y que, por ello, tienen una mayor tendencia a formar aglomeraciones cuando fluyen. Los granulos incluyen materiales granulares mas toscos que no tienden a formar aglomeraciones excepto cuando estan humedos. Para la presente aplicacion, las partmulas utilizadas son aquellas que pueden ser revestidas mediante tecnicas de revestimiento adecuadas. Por tanto, el tamano de partmula de los granulos polimericos segun la presente invencion puede adaptarse y optimizarse facilmente para ciertas tecnicas de revestimiento segun las necesidades de esta tecnica.

Una composicion hemostatica "seca" de acuerdo con la presente invencion solotiene un contenido residual de humedad que puede corresponder aproximadamente al contenido de humedad de productos disponibles comparables, como Floseal® (Floseal, por ejemplo, tiene aproximadamente un 12% de humedad en forma de producto seco). Normalmente, la composicion seca segun la presente invencion tiene un contenido de humedad residual por debajo de estos productos, preferentemente por debajo del 10% de humedad, mas preferentemente por debajo del 5% de humedad, especialmente por debajo del 1% de humedad. La composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion tambien puede tener un contenido menor de humedad, por ejemplo del 0,1% o incluso inferior. Los contenidos de humedad preferentes de la composicion hemostatica seca segun la presente invencion son del 0,1 al 10%, especialmente del 0,5 al 5%.

De acuerdo con la presente invencion, la composicion hemostatica se proporciona en forma seca en el contenedor final. En la forma seca, los procesos de degradacion o desactivacion de los componentes se reducen de manera significativa y adecuada para permitir la estabilidad de almacenamiento. La estabilidad de almacenamiento adecuada puede determinarse en base a la actividad de trombina. Asf, una composicion hemostatica seca del tipo presente es estable en almacenamiento si esta presente no menos de 400 I.U./ml (para un producto de 500 I.U./ml) despues de la reconstitucion pasados 24 meses de almacenamiento en forma seca a temperatura ambiente (25°C) (es decir, se mantiene el 80% de la actividad de trombina o mas en comparacion con la actividad inicial antes de la liofilizacion). Preferentemente, la composicion segun la presente invencion tiene una estabilidad de almacenamiento superior, es decir, permanece al menos el 90% de la actividad de trombina, especialmente al menos el 95% de actividad de trombina, despues de estos 24 meses de almacenamiento.

Sin embargo, proporcionar una mezcla seca de trombina y gelatina como polfmero biocompatible no es trivial, dado que la mezcla tiene que elaborarse en forma seca. Mezclar los componentes en la forma soluble (suspendida) y entonces empezar con el proceso de secado tiene como resultado una degradacion intolerable del material. Por ejemplo, incluso si la trombina y la gelatina se mantienen a una temperatura de 4°C, es visible una degradacion clara despues de 24 horas.

Por consiguiente, la presente invencion utiliza los principios de los procedimientos de revestimiento para superar dichos procesos de degradacion de la mezcla. Este procedimiento de revestimiento debe evitar una humectacion completa durante el contacto de la trombina con el polfmero, lo cual conduce a los procesos de degradacion. Durante el procedimiento de revestimiento, debe tenerse cuidado de que unicamente la capa exterior de los granulos polimericos se hinche hasta un grado determinado para empaparse con la cantidad deseada de trombina. Por consiguiente, el procedimiento de revestimiento preferentemente se lleva a cabo aplicando la trombina en forma de espray, dado que la superficie mojada de los granulos polimericos puede manejarse asf facilmente. Una tecnica preferente para realizar el procedimiento de revestimiento de acuerdo con la presente invencion es un procedimiento de lecho de fluido. En un procedimiento de lecho fluido o revestimiento de lecho de fluido, los granulos polimericos son recubiertos con una capa de las protemas contenidas en la solucion de trombina (es decir, preferentemente, suero, albumina y manitol humano). En este procedimiento, los granulos polimericos se llevan a un lecho de fluido soplando aire caliente desde la parte inferior a traves del lecho de granulos polimericos, suspendiendo asf estos en esta corriente de aire para crear un lecho fluido. En este lecho fluido se introduce un espray de la solucion de trombina, mezclandose mtimamente con el lecho fluido. Las gotitas de espray cubren las partmulas con trombina de forma homogenea. Este procedimiento se lleva a cabo en condiciones de procedimiento que mantienen la actividad de la trombina: la capa exterior de los granulos polimericos probablemente se hinchara hasta cierto grado y empaparan parte de la solucion de trombina, mientras que la mayona de las protemas de la solucion de trombina formara una capa sobre la superficie de los granulos. De acuerdo con una realizacion especialmente preferente, la preparacion de trombina introducida en el procedimiento de revestimiento se obtiene por esprayado, preferentemente esprayado aseptico. El esprayado se puede llevar a cabo con cualquier aparato de esprayado, especialmente para material proteico, preferentemente, los aparatos son esterilizados de inmediato antes de llevarlos a la solucion de trombina para el esprayado.

Preferentemente, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion se lleva a cabo en ambiente aseptico,

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especialmente el paso de revestimiento y el paso de llenado dentro del contenedor final deben realizarse asepticamente. Tambien es preferente empezar el procedimiento por los componentes que ya han sido apropiadamente esterilizados y entonces realizar todos los pasos adicionales de forma aseptica.

Una realizacion preferente de la presente invencion aplica la tecnica de revestimiento Wurster. El procedimiento Wurster es una tecnica de revestimiento muy adecuada para recubrir o encapsular uniformemente materiales en partfculas individuales y es especialmente popular en la tecnologfa de la formulacion farmaceutica. Esta tecnologfa se caracteriza por situar una boquilla de pulverizacion en el fondo de un lecho fluidizado de partfculas solidas. Las partfculas se suspenden en la corriente de aire fluidizante disenada para inducir un flujo dclico de las partfculas tras la boquilla de pulverizacion. La boquilla rocfa un flujo atomizado de una solucion de revestimiento, suspension u otro vehnculo de revestimiento (en el presente caso la preparacion de trombina).

El material de revestimiento atomizado choca con las partfculas a medida que se alejan de la boquilla. Se establece la temperatura del aire fluidizante para evaporar de forma adecuada la solucion o suspension de disolvente o solidificar el material de revestimiento poco tiempo despues de chocar con las partfculas.

Todos los solidos de revestimiento se mantienen sobre las partfculas como parte de la pelfcula o revestimiento en desarrollo. Este procedimiento se continua hasta que cada partfcula queda revestida de forma uniforme hasta el espesor de partfcula deseado.

El proceso Wurster es una tecnica de revestimiento reconocida en la industria por su aplicacion precisa de la pelfcula de revestimiento a materiales particulados tales como polvo, cristales o granulos. La tecnologfa puede emplearse para encapsular materiales solidos de diametros que vanan desde cerca de 50 pm hasta varios centimetros. El procedimiento tiene una mayor capacidad de secado que otros sistemas de revestimiento debido a la velocidad relativamente alta del aire fluidizante. Dado que las partfculas en realidad se separan a medida que se alejan de la boquilla, es posible revestir partfculas pequenas sin aglomeracion. Las posibilidades de revestimiento son relativamente ilimitadas, incluyendo la capacidad de disponer una cubierta hidrofila sobre un nucleo hidrofobo o una cubierta acuosa sobre un nucleo soluble en agua. Las propiedades de revestimiento pueden optimizarse mediante los parametros de formulacion de cubierta, las condiciones de procesamiento y la formacion de capas. Una gran ventaja del revestimiento de lecho fluido es que puede llevarse a cabo como una tecnologfa en lotes (revestimiento Wurster). Una tecnologfa en lotes es mucho mas preferida para la fabricacion. Con un revestimiento de lecho fluido, las partfculas son fluidizadas y el fluido de revestimiento se pulveriza sobre ellas y se seca. Gotitas pequenas y una viscosidad baja del medio de pulverizacion aseguran un revestimiento uniforme de los productos. Preferentemente, este revestimiento se realiza como un revestimiento de lecho fluido por lotes, especialmente aplicando de un espray desde abajo.

El paso final del metodo es el paso de terminado. Durante este paso, el contenedor final se sella de manera adecuada y se deja listo para el almacenamiento y/o la venta. El paso de terminado puede comprender etiquetar el contenedor final, envasar y (adicionalmente) llevar a cabo procedimientos de esterilizacion (por ejemplo sobre el contenedor final o sobre el producto envasado o el kit que comprende el contenedor final).

Preferentemente, el paso d) comprende un paso de esterilizacion EO (oxido de etileno). La esterilizacion EO es habitual en este campo de la tecnologfa. El gas oxido de etileno aniquila las bacterias (y sus endosporas), mohos y hongos. La esterilizacion EO se emplea para esterilizar sustancias que podnan resultar danadas por tecnicas que utilizan temperaturas altas, como la pasteurizacion y el autoclave.

Otras realizaciones preferidas de esterilizacion son la aplicacion de irradiacion ionizante, como irradiacion p o Y o el uso de peroxido de hidrogeno vaporizado.

El contenedor final puede ser cualquier contenedor adecuado para el alojamiento (y almacenamiento) de compuestos que se pueden administrar farmaceuticamente. Pueden emplearse jeringas, frascos, tubos, etc.; sin embargo, es especialmente preferente proporcionar las composiciones hemostaticas de acuerdo con la presente invencion en una jeringa. Las jeringas han sido un medio de administracion preferido para las composiciones hemostaticas, como se describio en la tecnica anterior, debido a las ventajas de su manejo en la practica medica. Asf, preferentemente las composiciones pueden ser administradas (despues de la reconstitucion) mediante agujas espedficas de la jeringa o via los cateteres adecuados. Las composiciones hemostaticas reconstituidas (que son reconstituidas preferentemente para formar un hidrogel) tambien se pueden administrar mediante otros medios diversos, por ejemplo con una espatula, un cepillo, un espray, manualmente por presion o por cualquier otra tecnica convencional. Normalmente, las composiciones hemostaticas reconstituidas segun la presente invencion se aplicaran utilizando una jeringa o aplicador similar que tiene la capacidad de extrudir la composicion reconstituida a traves de un orificio, abertura, aguja, tubo u otro paso para formar un lecho, capa o porcion similar de material. La alteracion mecanica de las composiciones puede realizarse por extrusion a traves de un orificio en la jeringa u otro aplicador, que normalmente tiene un tamano en el intervalo de 0,01 mm a 5,0 mm, preferentemente de 0,5 mm a 2,5 mm. Preferentemente, sin embargo, la composicion hemostatica se preparada inicialmente a partir de una forma seca que tiene un tamano de partfcula deseado (el cual, a partir de la reconstitucion, especialmente por hidratacion, produce sub-unidades del tamano requerido (por ejemplo, sub-unidades de hidrogel)) o se altera mecanicamente ya sea de manera parcial o total al tamano requerido antes de un paso de extrusion final u otra aplicacion. Esto es, desde luego evidente, porque estos componentes mecanicos tienen que ser provistos en forma esteril (dentro y fuera) con

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el objeto de cumplir los requerimientos de seguridad para uso en humanos.

Las composiciones hemostaticas secas de acuerdo con la presente invencion normalmente son reconstituidas (re-hidratadas) antes del uso poniendo en contacto la composicion seca con un diluyente adecuado. El diluyente de acuerdo con la presente invencion puede ser cualquier medio de reconstitucion adecuado para la composicion hemostatica seca que permita la humectacion adecuada de la composicion seca. Preferentemente, la composicion hemostatica seca es reconstituida en un hidrogel como un formato "listo para el uso".

Los diluyentes adecuados son fluidos acuosos farmaceuticamente aceptables, por ejemplo agua desionizada de grado farmaceutico (si todos los componentes ionicos o tampones ya son provistos en la composicion seca; "agua para inyeccion") o soluciones acuosas de grado farmaceutico que contienen iones y/o tampones espedficos. Estas soluciones acuosas pueden contener ademas otros ingredientes, tales como excipientes. Un "excipiente" es una sustancia inerte que se agrega a la solucion, por ejemplo para asegurar que la trombina mantiene su estabilidad qrnmica y su actividad biologica al ser almacenada (o esterilizada (por ejemplo, por irradiacion)), o por razones esteticas, por ejemplo por el color. Los excipientes preferentes incluyen albumina humana, manitol o acetato de sodio. Las concentraciones preferentes para la albumina en el producto reconstituido son de 0,1 a 100 mg/ml, preferentemente de 1 a 10 mg/ml. Las concentraciones de manitol preferentes pueden estar en el intervalo de concentracion de 0,5 a 500 mg/ml, especialmente de 10 a 50 mg/ml. Las concentraciones de acetato de sodio preferentes estan en el intervalo de 1 a 10 mg/ml, especialmente de 2 a 5 mg/ml.

Por ejemplo, un diluyente adecuado comprende agua para inyeccion e -independientemente unos de los otros - NaCl (preferentemente de 50 a 150 mM, especialmente 110 nM), CaCl2 (preferentemente de 10 a 80 mM, especialmente 40 mM), albumina humana (preferentemente de hasta el 2% p/p, especialmente el 0,5% p/p), acetato de sodio (preferentemente de 0 a 50 mM, especialmente 20 mM) y manitol (preferentemente hasta el 10% p/p, especialmente el 2% p/p). Preferentemente, el diluyente tambien puede incluir un tampon o un sistema tampon de manera que regule el pH de la composicion seca reconstituida, preferentemente a un pH de 6,4 a 7,5, especialmente a un pH de 6,9 a 7,1.

En una realizacion preferente, el diluyente se proporciona en un contenedor separado. Este, preferentemente puede ser una jeringa. El diluyente en la jeringa puede entonces aplicarse facilmente al contenedor final para la reconstitucion de las composiciones hemostaticas secas de acuerdo con la presente invencion. Si el contenedor final tambien es una jeringa, ambas jeringas pueden presentarse juntas en un paquete. Por consiguiente, es preferente proporcionar las composiciones hemostaticas secas de acuerdo con la presente invencion en una jeringa que se complementa con una jeringa de diluyente con un diluyente farmaceuticamente aceptable para reconstituir dicha composicion hemostatica seca y estable.

Puede reticularse una gelatina no reticulada junto con un auxiliar de re-hidratacion adecuado en cualquier forma adecuada para la reconstitucion, por ejemplo para formar una base de hidrogel adecuada. Por ejemplo, las moleculas polimericas pueden reticularse utilizando agentes de reticulacion bifuncionales o polifuncionales que se unen de manera covalente a dos o mas cadenas de las moleculas polimericas. Agentes de reticulacion bifuncionales ilustrativos incluyen aldehfdos, epoxidos, succinimidas, carbodiimidas, maleimidas, azidas, carbonatos, isocianatos, divinilsulfona, alcoholes, aminas, imidatos, anhfdridos, haluros, silanos, diazoacetato, aziridinas y similares. Alternativamente, la reticulacion puede lograrse utilizando oxidantes y otros agentes, tales como periodatos, que activan cadenas laterales o restos del polfmero de manera que estos pueden reaccionar con otras cadenas laterales o restos para formar los enlaces de reticulacion. Un metodo adicional de reticulacion comprende exponer los polfmeros a radiacion, tal como radiacion gama, para activar las cadenas polimericas con el fin de permitir las reacciones de reticulacion. Tambien son adecuados los metodos de reticulacion dehidrotermicos. Los metodos de reticulacion preferentes para las moleculas de gelatina se describen a continuacion.

Como se ha mencionado anteriormente, el polfmero de gelatina biocompatible adecuado para su uso en la hemostasis es un material granular. Este material granular puede humedecerse rapidamente cuando se expone a un fluido (es decir, el diluyente) y en su forma hinchada tiene la capacidad de contribuir a formar una pasta capaz de fluir que puede aplicarse a un sitio de sangrado. El polfmero de gelatina biocompatible puede proporcionarse en forma de pelfcula, la cual puede entonces molerse para obtener un material granular. La mayona de las partfculas contenidas en este material granular preferentemente tienen tamano de partfcula de 100 a 1.000 pm, especialmente de 300 a 500 pm.

De acuerdo con una realizacion preferente, la gelatina es una gelatina reticulada. El polvo de gelatina reticulado seco puede prepararse para volverse a hidratar rapidamente si se pone en contacto con un diluyente adecuado. Los granulos de gelatina, especialmente en forma de un polvo de gelatina, preferentemente comprenden partfculas relativamente grandes, tambien denominadas fragmentos o sub-unidades, como aquellas descritas en los documentos WO 98/08550 A y WO 2003/007845 A. Un tamano de partfcula preferente (mediano) estara dentro del rango de 20 a 1.000 pm, preferentemente de 100 a 750 pm, especialmente de 150 a 500 pm, aunque tamanos de partfcula fuera de este rango preferente pueden ser utiles en muchas circunstancias. Las composiciones secas tambien mostraran un "equilibrio de hinchamiento" significativo cuando se exponen a un medio de rehidratacion acuoso (= diluyentes). Preferentemente, el hinchamiento estara en el rango del 400%

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al 1.000%. "El equilibrio de hinchamiento" puede determinarse restando el peso seco del polvo de hidrogel de gelatina de su peso cuando esta hidratado por completo y, por consiguiente, hinchado por completo. La diferencia entonces se divide entre el peso y se multiplica por l00 para calcular la medida de hinchamiento. El peso seco debena medirse despues de la exposicion del material a una temperature elevada durante un tiempo suficiente para eliminar esencialmente toda humedad residual, por ejemplo dos horas a una temperatura de 120°C. El equilibrio de hidratacion del material puede lograrse sumergiendo el material seco en un diluyente adecuado, tal como una solucion salina acuosa, durante un penodo de tiempo suficiente para que el contenido de agua sea constante, normalmente de 18 a 24 horas a temperatura ambiente.

Una gelatina no reticulada junto con el auxiliar de rehidratacion puede reticularse de cualquier forma adecuada para formar una base de hidrogel adecuada. Los polvos de gelatina reticulados secos segun esta realizacion preferente preferentemente se obtienen preparando los polvos en presencia de determinados auxiliares de rehidratacion. Dichos auxiliares de rehidratacion estaran presentes durante la preparacion de los polvos, pero normalmente son eliminados de los productos finales. Por ejemplo, los auxiliares de rehidratacion que estan presente aproximadamente al 20% del contenido de solidos total normalmente se reduciran por debajo del 1% en el producto final, con frecuencia por debajo del 0,5% en peso. Auxiliares de rehidratacion ilustrativos incluyen polietilenglicol (PEG), preferentemente con un peso molecular de aproximadamente 1.000; polivinilpirrolidona (PVP), preferentemente con un peso molecular promedio de aproximadamente 50.000; y dextrano, que normalmente tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40.000. Es preferente emplear al menos dos de estos auxiliares de rehidratacion cuando se preparan las composiciones de la presente invencion, y mas particularmente es preferente emplear los tres.

Metodos ilustrativos para producir gelatinas reticuladas son los siguientes. Se obtiene la gelatina y se suspende en una solucion acuosa para formar un hidrogel no reticulado, tipicamente con un contenido en solidos del 1% al 70% en peso, normalmente del 3% al 10% en peso. La gelatina es reticulada, normalmente por la exposicion ya sea a giutaraldehfdo (por ejemplo del 0,01% al 0,05% p/p, durante una noche a una temperatura de 0°C a 15°C en un tampon acuoso), periodato de sodio (por ejemplo 0,05 M, mantenido a una temperatura de 0°C a 15°C durante 48 horas) o 1-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida ("EDC") (por ejemplo del 0,5% al 1,5% p/p durante una noche a temperatura ambiente), o mediante la exposicion a desde aproximadamente 0,3 hasta 3 megaradios de radiacion de rayos gama o haz electronico. Alternativamente, las partfculas de gelatina pueden ser suspendidas en un alcohol, preferentemente alcohol metflico o etflico, con un contenido en solidos del 1% al 70% en peso, normalmente del 3% al 10% en peso, y reticularse por exposicion a un agente de reticulacion, normalmente glutaraldehfdo (por ejemplo del 0,01% al 0,1% p/p, durante una noche a temperatura ambiente). En el caso de los aldehfdos, el pH debe mantenerse aproximadamente de 6 a 11, preferentemente de 7 a 10. Cuando se reticula con glutaraldehfdo, las reticulaciones se forman mediante bases de Schiff, que pueden estabilizarse por reduccion subsiguiente, por ejemplo portratamiento con borohidruro de sodio. Despues de la reticulacion, los granulos resultantes pueden lavarse con agua y opcionalmente enjuagarse en alcohol y secarse. Los polvos secos resultantes pueden entonces ser provistos en el contenedor final tal como se describe aqrn.

Despues de la reticulacion, al menos el 50% (p/p) del auxiliar de rehidratacion se elimina del hidrogel resultante. Normalmente, el auxiliar de rehidratacion se elimina por filtracion del hidrogel, seguido por lavado de la torta filtrada resultante. Dichos pasos de filtracion/lavado pueden repetirse una o mas veces con el objeto de limpiar el producto al nivel deseado y para eliminar al menos el 50% del auxiliar de rehidratacion, eliminandose preferentemente al menos el 90% (p/p) del auxiliar de rehidratacion presente originalmente. Despues de la filtracion, la gelatina se seca, normalmente secando la torta de filtrado final producida. La torta de filtrado seca puede entonces romperse o molerse para producir el polvo reticulado con un tamano de partfcula en los rangos deseados antes citados.

De acuerdo con una realizacion preferente, el contenedor final contiene ademas una cantidad efectiva de un estabilizador para inhibir la modificacion del polfmero cuando es expuesto a la radiacion de esterilizacion, preferentemente acido ascorbico, ascorbato de sodio, otras sales de acido ascorbico o un antioxidante.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion tambien proporciona un metodo para administrar una composicion hemostatica que contiene los granulos revestidos de acuerdo con la presente invencion a un sitio objetivo en el cuerpo de un paciente, comprendiendo dicho metodo administrar una composicion hemostatica producida mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invencion al sitio objetivo. Aunque en ciertas realizaciones tambien la composicion seca puede aplicarse directamente al sitio objetivo (y opcionalmente ponerse en contacto con el diluyente en el sitio objetivo, si es necesario), es preferente poner en contacto la composicion hemostatica seca con un diluyente farmaceuticamente aceptable antes de la administracion al sitio objetivo, de manera que se obtiene una composicion hemostatica en una forma humeda, especialmente una forma de hidrogel.

La presente invencion, tambien se refiere a un contenedor final terminado obtenido mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invencion. Este contenedor terminado contiene los componentes combinados en una forma esteril, estable para almacenamiento y comercializable.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para proporcionar una composicion hemostatica lista para el uso que comprende poner en contacto una composicion hemostatica producida mediante el

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procedimiento de acuerdo con la presente invencion con un diluyente farmaceuticamente aceptable.

La presente invencion tambien se refiere a un kit que comprende la composicion hemostatica seca y estable de acuerdo con la presente invencion en forma terminada y un contenedor con un diluyente adecuado. Otros componentes adicionales del kit pueden ser instrucciones de uso, medios de administracion, como jeringas, cateteres, cepillos, etc. (si las composiciones no son provistas ya en el medio de administracion) u otros componentes necesarios para utilizar en la practica medica (quirurgica), como agujas de repuesto o cateteres, viales extra u otros medios para cubrir heridas. Preferentemente, el kit segun la presente invencion comprende un alojamiento de jeringa, la composicion hemostatica seca y estable y una jeringa que contiene el diluyente (o es provista para tomar el diluyente de otro contenedor de diluyente). Preferentemente, estas dos jeringas se proporcionan en una forma adaptada una con la otra, de manera que el diluyente puede suministrarse a la composicion hemostatica seca mediante otra entrada diferente a la salida para administrar la composicion reconstituida.

La presente invencion tambien se refiere a granulos de gelatina revestidos con trombina como polfmero biocompatible adecuado para su uso en la hemostasis. Estos granulos revestidos se pueden obtener por los metodos aqrn descritos. Preferentemente, los granulos revestidos con trombina se pueden obtener mediante revestimiento en lecho fluido, especialmente mediante revestimiento Wurster. De acuerdo con una realizacion preferente, los granulos son polfmeros de gelatina revestidos con trombina.

La presente invencion se describe adicionalmente en los ejemplos siguientes y en referencia a las figuras, sin limitarse a estos.

Fig. 1: muestra los principios del revestimiento en lecho fluido por lotes, espray inferior (revestimiento de

Wurster).

Fig. 2: muestra una distribucion de tamano de partfcula ilustrativa de granulos de gelatina (A) y granulos

de gelatina revestidos con trombina de acuerdo con la presente invencion (B).

Ejemplos

1. Preparacion de los granulos polimericos revestidos con trombina como composicion hemostatica seca segun la presente invencion

Materiales y Metodos

Equipo

MiniGlatt, Wurster, Nitrogeno (N2) como gas de proceso, pre-filtrado por un filtro de 0,2 pm

Micro-kit mini Glatt de 0,2 pm, boquilla de 0,5 o 0,8 mm, apertura de particion Wurster 10 a 20 mm, placa de

distribucion de aire estandar, filtro metalico de 2 o 5 pm

GPCG 3, 6" Wurster, aire pre-filtrado (0,2 pm), filtro PA-CF, placa de distribucion de aire P2100, abertura de particion Wurster de 20 mm.

Camara de secado

Revestimiento

Los granulos de gelatina y los granulos de gelatina revestidos con trombina fueron almacenados en el refrigerador a una temperatura de 4 a 8°C. Las soluciones de trombina (500 lU/ml, 0,9% de NaCl; 500 lU/ml, 42,9 manitol/l) fueron almacenados en el congelador a una temperatura de -20°C. El procedimiento se realizo en el Mini Glatt proporcionando 81 g de granulos de gelatina; pre-calentamiento de la maquina a una temperatura de 37°C, pre-calentamiento del material de partida solido a 37±7°C y manteniendo esta temperatura durante el tiempo completo de proceso. La solucion de trombina se pulverizo hasta que se aplicaron 400 g de solucion. Entonces, el material revestido se seco durante 15 minutos al final del proceso.

Metodos analttcos.

Perdida por secado (LOD)

La LOD (perdida por secado) se determino con un analizador de humedad de halogeno Mettler Toledo, tipo HB 43. La temperatura de secado fue de 140°C utilizando un criterio de tope espedfico (< 1mg/60s).

Analisis de criba

El analisis de criba se realizo con una maquina de criba Retsc, tipo AS 200, control g (amplitud: ,.5, tiempo 5 minutos).

Distribucion del tamano de partfcula

La distribucion del tamano de partfcula se determino en un modo angular utilizando un difractometro Laser (LD) Malvern Mastersizer 2000 Ver. 5.40. Una masa de granulos de 10 a 15 g se utilizo en estado seco para la medida (desviacion media y estandar, n = 3).

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La medida de la densidad de volumen se realizo en un cilindro graduado a un volumen de 100 ml.

Jeringa de diluyente

La jeringa de diluyente contiene un medio de reconstitucion adecuado para hidratar el producto. Este puede ser acoplado con la jeringa Floseal, ya sea directamente o por medio de un conector. El diluyente es transferido dentro de la jeringa Floseal y el producto hidratado es transferido de atras hacia adelante entre las jeringas acopladas repetidamente para generar una pasta que puede fluir. La jeringa de diluyente puede prepararse, por ejemplo, mediante un procedimiento tal como el siguiente: el medio es filtrado esteril y cargado en jeringas adecuadas (jeringas Toppac comunes, Clearshot, ...); y si es necesario, se esterilizan por irradiacion.

Granulado de gelatina.

La fabricacion en masa de los granulos de gelatina se realiza de acuerdo con metodos establecidos (WO 98/08550 A; WO 2003/00785 A; etc.). Los granulos (granulos de "Floseal"; matriz de "Floseal") son esterilizados inmediatamente por irradiacion gama. Para la esterilizacion pre-clmica, la matriz de Floseal se carga en botellas de vidrio Schott de tamano adecuado.

La dosis de irradiacion requerida en el nivel de bio-carga maxima actual (1.000 cfu/muestra) es de 25 a 40 kGy para el producto en el contenedor final. El material en masa es entonces almacenado a una temperatura de - 20°C para su posterior manejo.

Resultados

Se muestra la distribucion del tamano de partfcula del granulo de gelatina revestido con trombina para un granulo de gelatina revestido con trombina de ejemplo en la figura 2 (la figura 2A muestra el granulo de gelatina antes del revestimiento (d(0,1) = 143,2; d(0,5) = 304,3; d(0,9) = 517,2); la figura 2B se obtuvo con la solucion de trombina de 500 IU + manitol (d(0,1) = 155,3; d(0,5) = 327,1; d(0,9) = 543,0)).

El proceso era muy estable en todos los experimentos realizados. La temperatura de producto se ajusto a 36,0±1, 33,0±1 y 39,0±1°C, respectivamente. El granulo final tema una buena capacidad de flujo en todos los lotes. Se observaron altos rendimiento de alrededor del 95%, indicando la deposicion de los solidos desde la solucion de trombina sobre el material de partida solido. Los recipientes del procedimiento paredan muy limpios despues de los pasos de revestimiento. No se adhirio material sobre la pared, unicamente una pocas partfculas mas grandes podfan observarse en el producto final. Se aplicaron indices de pulverizacion medios de 1,64 g/min y 1,24 g/min; equivalentes a los tiempos de pulverizacion de 244 min y 323 min, respectivamente. indices de pulverizacion inferiores normalmente reducen la perdida de material (incrementando asf los rendimientos).

El procedimiento podfa ser escalado de forma exitosa a 6" Wurster. Se utilizo aire pre-filtrado como gas de proceso en el GPCG 3 en contraste con el nitrogeno del Mini Glatt. Apenas se observaron partfculas mas grandes en el producto final. El flujo de material fue mas homogeneo en el GPCG 3 en comparacion con el Mini Glatt.

La humedad del procedimiento se mantuvo baja en todos los procesos con el objeto de evitar un hinchamiento y la aglomeracion de la gelatina. Los valores lOd, entre 5,4 y 8,3%, se determinaron en los granulos revestidos utilizando una temperatura de secado alta, de 140°C, en un analizador de humedad de halogeno. Los diametros medios d(0,5) de 290 - 327 pm podfan determinarse en el material crudo de gelatina y para todos los lotes recubiertos. Se pudo concluir que apenas se produjeron cambios en la distribucion del tamano de partfcula durante el revestimiento del granulo de gelatina. En total, no se produjo una aglomeracion del material de partida de gelatina durante el procedimiento debido a las condiciones de procesamiento seleccionadas.

En resumen, el procedimiento demostro ser estable en todos los ensayos. Se podnan seleccionar libremente temperaturas de producto entre 33 y 40°C. El procedimiento se escalo de un Mini Glatt a un Wurster de 6". La calidad del producto podna mejorarse todavfa a gran escala. La distribucion del tamano de partfcula del material de gelatina de partida y la gelatina procesada apenas experimento cambios, la aglomeracion del material de partida en calidad considerable no se observo.

2. Estabilidad de los granulos de gelatina revestidos con trombina segun la presente invencion

El proposito de este estudio era investigar la estabilidad de los granulos revestidos en lecho fluido obtenidos en 1, abarcando 24 meses. De manera espedfica, los granulos de gelatina revestidos con trombina se ensayaron 0, 3, 6, 12, 18 y 24 meses despues de la preparacion; las muestras fueron analizadas en cuanto al equilibrio de hinchamiento, tromboelastograffa (TEG: prueba de coagulacion in vitro) y alfa-trombina.

Para este ensayo, los granulos de gelatina revestidos con trombina, que se obtuvieron con la solucion de trombina + manitol, fueron cargados en jeringas como contenedores finales bajo condiciones asepticas. Finalmente, todas las jeringas se envasaron y sellaron en bolsas revestidas de aluminio para evitar la absorcion de humedad. Estas fueron almacenadas a temperatura ambiente (temperatura de 22 a 28°C). Las muestras se recogieron 0, 3, 6, 12, 18 y 24 meses despues de la preparacion y se analizaron con respecto al equilibrio de hinchamiento de la gelatina y la actividad de alfa-trombina. El ensayo TEG se realizo unicamente despues de completarse la preparacion (0 meses).

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No se dispueso dentro de las bolsas recubiertas de aluminio ningun agente de prevencion ante la humedad secundaria, tal como una bolsa de desecante de silica-gel. Para simplificar la recogida de muestras, se envasaron tres jeringas de y se sellaron en una bolsa recubierta de aluminio, ya que la determinacion del equilibrio de hinchamiento, etc. requiere tres jeringas en cada caso.

Tampones y soluciones

0,9% NaCI

9 g de NaCI se disolvieron en 1.000 ml de agua purificada.

40 mM de CaCl2

5,88 g de CaCl2 • 2H2O se disolvieron en 1.000 ml de agua purificada.

Tampon imidazol

0,7 g de imidazol, 8,8 g de NaCI y 4,4 g de CaCl2 • 2H2O se disolvieron en 800 ml de agua purificada, se ajusto el pH a 7,3 con HCl 1N y finalmente el volumen total del tampon se llevo a 1.000 ml con agua purificada.

Reconstitucion de las jeringas de estabilidad

Las jeringas fueron reconstituidas con 4,0 ml, de solucion de CaCl2 40mM en cada caso como diluyente, extrafdo en una jeringa. La jeringa de estabilidad y la jeringa llena de la solucion de CaCl2 se acoplaron y los contenidos se mezclaron mediante "zumbido" (transferencia repetida entre las dos jeringas en un total de 21 pases). El procedimiento posterior era dependiente de la determinacion respectiva.

Equilibrio de hinchamiento

El equilibrio de hinchamiento de la gelatina es un parametro que expresa cuanto fluido pueden absorber los granulos de gelatina cuando se incuban en un exceso grande de fluido en un penodo de tiempo de 24 horas, en relacion con su peso seco. Se calculo como "peso hinchado/peso seco x 100". El calculo estadfstico para el equilibrio de hinchamiento (regresion, nivel de confianza = 95%) se realizo con el programa software "minitab 15".

TEG

La prueba fue realizada segun el manual prescrito estandar; los calculos TEG estadfsticos (ANOVA de una via, CI 95%) se realizaron con el programa de software "Minitab 15".

Recuperacion de alfa-trombina/trombina

Esta prueba se realizo de acuerdo con los metodos establecidos utilizando un coagulometro.

Para la determinacion coagulometrica de la actividad de trombina (KC4), la trombina tiene que ser extrafda de la pasta obtenida. Esto se realizo pesando aproximadamente 1 g de la pasta en un tubo Falcon de 15 ml, agregando 10 ml de NaCl 1M y agitando los tubos en un agitador de onda a 4°C durante una noche. La manana siguiente los tubos se centrifugaron a una temperatura de 4°C durante 10 minutos a 3.500 rpm. Entonces se extrajo una alfcuota de 5 ml del sobrenadante y se ensayo en busca de la actividad de trombina.

La recuperacion de trombina (en porcentaje) se normalizo para la cantidad total de trombina utilizada inicialmente por g de material durante la preparacion de las jeringas. La trombina se extrajo en un exceso de 10 veces de NaCl 1M (1 ml de pasta Floseal + 10 ml de medio de extraccion).

Para mantener la concentracion de sal constante entre la referencia y las muestras de ensayo (el sistema de prueba utilizado depende de la sal), la primera disolucion de la solucion de referencia de trombina (con la cual se prepararon las muestras) se hizo en NaCl 1M (1:10, despues 1 + 10) y el segundo paso de disolucion de todas las muestras fue a 1:20 en un tampon imidazol. El factor de disolucion completo represento 1:200 (o 1:220, respectivamente).

En los dos primeros puntos de estabilidad, las soluciones de partida de trombina fueron diluidas a 1:400 en el tampon de imidazol unicamente. Despues se considero el impacto de la sal sobre el tiempo de coagulacion y las soluciones de partida se diluyeron como se describio anteriormente. Para corregir los resultados de los primeros puntos de estabilidad, se utilizo el valor medio de las soluciones de partida, se diluyo en NaCl 1M y tampon imidazol, generando en los puntos de estabilidad subsiguientes.

La actividad de trombina calculada a partir de las soluciones de ensayo diluidas de esta forma fue el valor de referencia para el calculo de recuperacion de trombina. Con propositos comparativos, las soluciones de partida de trombina fueron diluidas por completo tambien en tampon imidazol. El factor de disolucion completo en este punto era de 1:400.

Calculo de recuperacion de trombina:

1. Calculo de trombina por g de pasta [IU/g] en las muestras de ensayo: (resultado de la muestra de prueba x

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disolucion x volumen de extraccion)/masa de pasta por extraccion.

2. Calculo de la cantidad total del contenido de solidos del material en granulos y la trombina al inicio de los experimenter: masa de granulos + contenido de solido de la solucion de trombina. La cantidad total del contenido de solidos es la suma del material de granulos utilizados para un experimento + el contenido de sal del volumen de la solucion de trombina utilizada para el experimento.

3. Correccion del volumen de gelatina: solucion de partida media x volumen total de trombina utilizado para el revestimiento en lecho fluidos/cantidad total del contenido de solidos.

4. Datos de muestra normalizados a los datos de solucion de partida (sal ajustada): El calculo estadfstico (regresion = CI 95%) se realizo con el programa de software "minitab 15".

Resultados

Los resultados ilustrativos para la recuperacion de trombina son (en %): 72±3 (3 mo); 75±6 (6 mo) y 74±6 (12 mo); de acuerdo con el analisis estadfstico de recuperacion de trombina, los granulos revestidos ensayados se consideraron estables.

Los granulos de gelatina revestidos con trombina eran faciles de reconstituir durante el periodo de estabilidad completo. El presente ejemplo mostrado via la recuperacion de la trombina demostro que los granulos obtenidos segun la presente invencion eran estables.

3. Efectividad en un modelo de abrasion hepatica porcino

El proposito de este estudio es comparar la efectividad de la composicion hemostatica seca de acuerdo con la presente invencion con un producto estandar establecido (Floseal VH S/D; Baxter Healthcare) en el modelo de abrasion de hngado porcino. Floseal VH S/D es una matriz de gelatina que suministra trombina para detener el sangrado activo en un pertedo de 2 minutos desde la aplicacion. Este producto requiere de una preparacion en 2 pasos, (1) reconstitucion de la trombina y (2) hidratacion de las partteulas de gelatina con la trombina reconstituida. El producto de acuerdo con la presente invencion esta disenado para reconstituir las partteulas de gelatina recubiertas con trombina en 1 paso y es una mejora principal de la preparacion en 2 pasos, que desfavorable cuando se necesita el producto rapidamente o en gran cantidad.

Modelo de abrasion de h^gado porcino

Seis cerdos hembra domesticos, peso medio 55,0 kg (rango de 52,4 a 58,4 kg) se obtuvieron de Oak Hill Genetics (Ewing, Illinois) y se pesaron en el momento de la cirugfa. A la llegada, los animales fueron aislados en cuarentena durante 6 dfas. En el momento de la cirugfa, los seis cerdos no mostraron senales de enfermedad clmica. Se utilizaron etiquetas de oreja para identificar a los animales y se hicieron referencias cruzadas a los numeros de identificacion asignados. Los animales fueron agrupados en corrales. Los cerdos recibieron agua ad libitum y una dieta estandar para cerdos una vez al dfa.

Los cerdos son un modelo cardiovascular bien aceptado y son adecuados para este tipo de estudio. Los lobulos grandes, multiples, del tngado permitieron lesiones multiples para comparaciones directas de los diferentes ensayos.

Anestesia y terapia de fluidos

Los cerdos son medicados con Midazolam (0,3 mg/kg, 1M) e inducidos con mascara con isoflurano en un vehteulo a 2:1 nitrogeno:oxfgeno. Los cerdos fueron intubados y ventilados a un mdice de 10 a 15 respiraciones por minuto. La anestesia se mantuvo con Isoflurano en un vehteulo de oxfgeno. Los cerdos recibieron una tasa de infusion continua de Solucion de Ringer Lactada calentada.

Procedimiento de abrasion de h^gado

Se utilizo un modelo de abrasion de hngado porcino para este estudio. Seis cerdos son preparados con el objeto de que se evaluen 120 lesiones (40 por grupo de tratamiento), suficientes para detectar una diferencia en los indices del 80 por ciento contra el 40 por ciento con a = 0,05 y potencia = 90%. Cada serie se confina ya sea al lobulo medial, lateral izquierdo o lateral derecho. Cada serie de lesiones contiene tres abrasiones de hfgado de 1 cm de diametro, 3-4 de profundidad, creadas con un taladro de mano fijo con lija. Se evalua el sangrado y la lesion se trata de forma aleatoria y ciega con la referencia o el ensayo. El ensayo de referencia y de prueba es aleatorizado utilizando un generador de numeros aleatorios. Cada artteulo es colocado sobre la lesion, mantenido en su lugar con una gasa humeda durante 2 minutos y se evaluo de forma ciega para la hemostasis a los 2, 5 y 10 minutos despues del tratamiento. El exceso de referencia o artteulo de prueba es irrigado despues de una evaluacion de 5 minutos.

Protocolo de heparinizacion

Se tomo el tiempo de coagulacion activado de lmea de base (ACT) y cada cerdo recibio una dosis de carga de heparina, 200 lU/kg. El ACT se evaluo cada 10 minutos hasta que el ACT era al menos 2 veces la lmea base. Si el ACT mide menos que o casi igual a 2 veces la lmea base, el cerdo se trato con un bolo de dosis de heparina, 75 I.U./kg.

Una vez que supera 2 veces la lmea base, el ACT se midio cada 20 minutos. Si el ACT mide menos que o casi

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igual al objetivo de 2 veces la lmea base, el cerdo recibe un bolo de dosis de heparina, 40 I.U./kg. Si el ACT mide mas que el objetivo de 2 veces la lmea base, el cerdo no es tratado o recibe un bolo de dosis de mantenimiento de heparina, limitado a no mas de 2.000 lU/hora.

Toda la heparina se suministra via un cateter venoso periferico. Todas las muestras de sangre se toman de un cateter yugular. Los valores de referencia de la presion sangumea y el ritmo cardfaco son registrados en el momento de las mediciones ACT.

Evaluacion de hemostasis

La hemostasis se evaluo 0, 2, 5 y 10 minutos despues de generarse y tratarse la serie de lesiones, siendo 0 minutos antes del tratamiento. Las calificaciones de 0, 1, 2, 3, 4, y 5 son asignadas a no sangrado, exudado, muy suave, suave, moderado y severo, respectivamente. Las tres lesiones son tratadas aproximadamente al mismo tiempo para evitar la diferencia en ubicacion y coagulacion que puede ser resultado del tratamiento de cada una en forma independiente. La sangre de la lesion se limpia despues de cada evaluacion segun sea necesario.

Mediciones y registros

Se evaluaron ACT, hemostasis, presion sangumea y ritmo de acuerdo con metodos estandar.

Analisis estad^stico

La unidad de muestra para este estudio es el sitio de lesion del fngado con 40 lesiones por grupo de tratamiento para un total de 120 lesiones.

Se utilizo la regresion logfstica multiple para evaluar el efecto del tratamiento en la clasificacion de sangrado (0=no, 1= exudado, 2=muy ligero, 3=ligero, 4=moderado y 5=severo) 2, 5 y 10 minutos tras el tratamiento. Las variables independientes incluyen grupo de tratamiento, cerdo, lobulo del fngado (medio, derecho o izquierdo) y clasificacion de sangrado inicial. Las proporciones de exudado para los efectos de FB/FS, Lyo/FS, FB/Lyo, y sus intervalos de confianza son calculadas en cada punto de tiempo despues del tratamiento.

La ubicacion de las lesiones no se distribuye de manera uniforme por los tres lobulos y los cerdos. El efecto del lobulo no era significativo y, por consiguiente, los analisis se realizaron nuevamente sin este efecto. Las conclusiones se basan en los analisis sin el efecto del lobulo en el modelo.

Otros experimentos animales

Se puede realizar una evaluacion pre-clmica para comparar la eficacia in vivo de las composiciones hemostaticas secas de acuerdo con la presente invencion con Floseal VH en un modelo muy riguroso (altamente anti-coagulado). Este modelo consiste en una perforacion hepatica de espesor completo de 5 mm con 4 incisiones adicionales que radian desde el punto de perforacion de forma transversal. Se utilizaron 6 animales por grupo de estudio, estos animales fueron heparinizados a 4.000 I.U./kg. Despues de realizar la lesion, se aplico Floseal reconstituido y una ligera presion con una gasa humeda durante 2 minutos. Despues de este tiempo, se evalua la hemostasis primaria. Si no se logra la hemostasis primaria, se vuelve a aplicar el producto hasta que se consigue o se acaba el producto (5 ml)/tiempo (15 minutos). Los puntos finales primarios son el logro de la hemostasis primaria (si/no) y el tiempo de la hemostasis (minutos). Si se logra la hemostasis primaria, los animales son cerrados quirurgicamente y despues de 24 horas son evaluados en busqueda de nuevos sangrados.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

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   Procedimiento para obtener una composicion hemostatica seca y estable, comprendiendo dicho procedimiento:

   a) proporcionar una preparacion granular seca de gelatina,

   b) revestir los granulos de dicha preparacion granular seca con una solucion de trombina, obteniendo as^ granulos de gelatina revestidos con trombina,

   c) cargar dichos granulos de gelatina revestidos con trombina en un contenedor final,

   d) acondicionar el contenedor final a un dispositivo farmaceutico almacenable que contiene dichos granulos de gelatina revestidos como una composicion hemostatica seca y estable.
2. 2.
3. 3.

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5. 5.

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    40 12.
11. 13.
12. 14.

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    Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el paso b) se realiza segun un proceso en lecho fluido.

    Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque dicha solucion de trombina es una solucion de trombina que contiene ademas excipientes, especialmente albumina, manitol o mezclas de los mismos.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el paso d) comprende un paso de esterilizacion con oxido de etileno.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha solucion de trombina contiene trombina en el rango de 10 a 10.000 I.U., preferentemente de 50 a 5.000 I.U., especialmente de 100 a 1.000 I.U./ml.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el paso b) se realiza como un procedimiento de revestimiento Wurster, preferentemente donde el procedimiento de revestimiento Wurster se lleva a cabo utilizando nitrogeno como gas de proceso, y preferentemente aplicando boquillas de 0,1 a 1,2 mm, especialmente de 0,4 a 1,0 mm.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se utiliza una jeringa como dicho contenedor final, preferentemente donde dicha jeringa es una jeringa terminada junto con una jeringa de diluyente con un diluyente farmaceuticamente aceptable para reconstituir dicha composicion hemostatica seca y estable.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicha solucion de trombina comprende trombina humana, especialmente trombina humana recombinante.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el paso b) se lleva a cabo de forma que solo la capa externa de los

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha gelatina es una gelatina reticulada.

    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho contenedor final contiene ademas una cantidad de un estabilizador efectiva para inhibir la modificacion del polfmero cuando es expuesto a radiacion de esterilizacion, preferentemente acido ascorbico, ascorbato de sodio, otras sales de acido ascorbico o un antioxidante.

    Contenedor final terminado obtenido mediante el procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

    Kit para la administracion de una composicion hemostatica que comprende el contenedor terminado segun la reivindicacion 12 y un contenedor con un diluyente farmaceuticamente aceptable.

    Granulos revestidos de trombina de un polfmero biocompatible adecuado para su uso en hemostasis, siendo el polfmero gelatina.