ES2611139T3 - (2S,3R)-N-(2-((3-Piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida, nuevas formas de sales, y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Un compuesto (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en un exceso enantiomérico o diastereoisomérico del 90 % o mayor con respecto a (2S,3S)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, (2R,3S)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, o (2R,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3- il)benzofuran-2-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde el compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable, es una sal de ácido de (2S,3R)-N-(2-((3- piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida, cuyo ácido se selecciona del grupo que consiste en ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido maleico, ácido toluenosulfónico, ácido galactárico (múcico), ácido Dmandélico, ácido D-tartárico, ácido metanosulfónico, ácidos R-10-canforsulfónico y S-10-canforsulfónico, ácido cetoglutárico, y ácido hipúrico.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

% o mayor. En una realización, el exceso enantiomérico y diastereoisomérico es del 99 % o mayor. En una realización, el exceso enantiomérico y diastereoisomérico es del 99,5 % o mayor.

La estequiometría, mezcla de disolventes, concentración de soluto, y temperatura empleada pueden variar. Los disolventes representativos que se pueden utilizar para preparar o recristalizar las formas de sal incluyen, sin limitación, etanol, metanol, alcohol isopropílico, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo.

Ejemplos de sales adecuadas farmacéuticamente aceptables descritos en la presente memoria, incluyen sales de adición de ácido inorgánico tales como cloruro, bromuro, sulfato, fosfato, y nitrato; sales de adición de ácido orgánico tales como acetato, galactarato, propionato, succinato, lactato, glicolato, malato, tartrato, citrato, maleato, fumarato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato, y ascorbato; y sales con aminoácidos tales como aspartato y glutamato. Las sales pueden ser en algunos casos hidratos o solvatos de etanol. Se proporcionan sales representativas como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5.597.919 de Dull et al., 5.616.716 de Dull et al. y 5.663.356 de Ruecroft et al.

La selección de sales para la base libre de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2carboxamida reveló que, aunque se podían formar muchas sales de ácidos farmacéuticamente aceptables, sólo unas pocas de estas sales tenían propiedades aceptables para la fabricación comercial. La capacidad de predecir las características típicas de una sal comercialmente viable, por lo tanto, no existe. Los ácidos que proporcionaron sales que eran cristalinas, es decir, sales que demuestran cierto grado de cristalinidad, dependiente del método por el que se preparan, incluyen el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido p-toluenosulfónico, ácido galactárico (múcico), ácido D-mandélico, ácido D-tartárico, ácido metanosulfónico, ácidos R-y S-10canforsulfónicos, ácido maleico, ácido cetoglutárico y ácido hipúrico. De estas sales, las sales de ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido maleico y ácido p-toluenosulfónico presentaron cada una, propiedades deseables adicionales, incluyendo puntos de fusión altos, buena solubilidad en agua y baja higroscopicidad. Estas características de estas sales fueron inesperadas.

IV. Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen las sales descritas aquí, en estado puro o en la forma de una composición en la que los compuestos se combinan con cualquier otro producto farmacéuticamente compatible, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. Las composiciones farmacéuticas resultantes se pueden utilizar para prevenir una afección o trastorno en un sujeto propenso a tal afección o trastorno, y/o para tratar a un sujeto que padece la afección o trastorno. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen el compuesto de la presente invención y/o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

La manera en que se administran los compuestos puede variar. Las composiciones se administran preferiblemente por vía oral (por ejemplo, en forma líquida dentro de un disolvente tal como un líquido acuoso o no acuoso, o dentro de un vehículo sólido). Las composiciones preferidas para administración oral incluyen pastillas, comprimidos, cápsulas, comprimidos oblongos, jarabes y soluciones, incluyendo cápsulas de gelatina dura y cápsulas de liberación prolongada. Los excipientes estándar incluyen aglutinantes, cargas, colorantes, solubilizantes, y similares. Las composiciones se pueden formular en forma de dosis única, o en dosis múltiples o subunitarias. Las composiciones preferidas están en forma líquida o semisólida. Se pueden usar composiciones que incluyen un vehículo líquido farmacéuticamente inerte, tal como agua u otros líquidos o semisólidos farmacéuticamente compatibles. El uso de tales líquidos y semisólidos es bien conocido por los expertos en la técnica.

Las composiciones se pueden administrar también mediante inyección, es decir, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraarterial, intratecal; e intracerebroventricular. La administración intravenosa es el método preferido de inyección. Los vehículos adecuados para inyección son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen soluciones de dextrosa al 5 %, solución salina y solución salina tamponada con fosfato. El fármaco se puede administrar también como una perfusión o inyección (por ejemplo, como una suspensión o como una emulsión en un líquido o mezcla de líquidos farmacéuticamente aceptable).

Las formulaciones se pueden administrar también utilizando otros medios, por ejemplo, la administración rectal. Las formulaciones útiles para administración rectal, tales como supositorios, son bien conocidas por los expertos en la técnica. El fármaco se puede administrar también por inhalación (por ejemplo, en forma de un aerosol bien por vía nasal o utilizando dispositivos de administración del tipo indicado en la patente de Estados Unidos nº 4.922.901 de Brooks et al.); tópicamente (por ejemplo, en forma de loción); transdérmicamente (por ejemplo, utilizando un parche transdérmico) o iontoforéticamente; o por administración sublingual o bucal. Aunque es posible administrar un compuesto en la forma de un producto químico activo a granel, es preferible presentar un fármaco en la forma de una composición o formulación farmacéutica para administración eficiente y eficaz.

Los ejemplos de métodos para la administración de compuestos serán evidentes para los expertos en la técnica. La utilidad de estas formulaciones puede depender de la composición particular utilizada y del sujeto particular que recibe el tratamiento. Estas formulaciones pueden contener un vehículo líquido que puede ser oleoso, acuoso, emulsionado o pueden contener ciertos disolventes adecuados para el modo de administración.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las composiciones se pueden administrar intermitentemente o a una velocidad gradual, continua, constante o controlada, a un animal de sangre caliente (por ejemplo, un mamífero tal como un ratón, rata, gato, conejo, perro, cerdo, vaca, o mono), pero ventajosamente se administran a un ser humano. Además, puede variar la hora del día y el número de veces al día en que se administra la formulación farmacéutica.

Otros métodos adecuados para la administración de los compuestos de la presente invención se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.604.231 de Smith et al.

Como se describe aquí, el compuesto de la presente invención se puede administrar en combinación con otros compuestos terapéuticos. Por ejemplo, un compuesto de esta invención se puede utilizar en combinación con otros ligandos de NNR (tal como vareniclina), antioxidantes (tales como agentes captadores de radicales libres), agentes antibacterianos (tales como antibióticos penicilínicos), agentes antivirales (tales como análogos de nucleósidos, como zidovudina y aciclovir), anticoagulantes (tal como warfarina), agentes antiinflamatorios (tales como los AINE), anti-piréticos, analgésicos, anestésicos (tales como los utilizados en cirugía), inhibidores de la acetilcolinesterasa (tales como donepezilo y galantamina), antipsicóticos (tales como haloperidol, clozapina, olanzapina y quetiapina), inmunodepresores (tales como ciclosporina y metotrexato), agentes neuroprotectores, esteroides (tales como hormonas esteroideas), corticosteroides (tales como dexametasona, prednisona, e hidrocortisona), vitaminas, minerales, nutracéuticos, antidepresivos (tales como imipramina, fluoxetina, paroxetina, escitalopram, sertralina, venlafaxina, y duloxetina), ansiolíticos (tales como alprazolam y buspirona), anticonvulsivos (tales como fenitoína y gabapentina), vasodilatadores (tales como prazosina y sildenafilo), estabilizadores del estado de ánimo (tales como valproato y aripiprazol), fármacos anti-cáncer (tales como los anti-antiproliferativos), agentes antihipertensivos (tales como atenolol, clonidina, amlopidino, verapamilo, y olmesartán), laxantes, ablandadores de las heces, diuréticos (tales como furosemida), anti-espasmódicos (tales como diciclomina), agentes antidiscinéticos y medicamentos antiulcerosos (tales como esomeprazol).

Los compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Tal combinación de agentes farmacéuticamente activos se puede administrar conjuntamente o por separado y, cuando se administra por separado, la administración puede realizarse simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden. Las cantidades de los compuestos o agentes y los tiempos relativos de administración se seleccionarán con el fin de alcanzar el efecto terapéutico deseado. La administración en combinación puede ser por administración concomitante en: (1) una composición farmacéutica unitaria que incluye múltiples compuestos, o (2) composiciones farmacéuticas separadas que incluye cada una, uno de los compuestos. Alternativamente, la combinación se puede administrar separadamente de una manera secuencial en donde un agente de tratamiento se administra en primer lugar y el otro en segundo lugar o viceversa. Tal administración secuencial puede ser próxima en el tiempo o remota en el tiempo. Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento de una variedad de trastornos y afecciones y, para ello, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en combinación con una variedad de otros agentes terapéuticos adecuados útiles en el tratamiento o profilaxis de esos trastornos o afecciones.

La dosis apropiada del compuesto es la cantidad eficaz para prevenir la aparición de los síntomas del trastorno o para tratar algunos síntomas del trastorno que sufre el paciente. Como se ha indicado, por "cantidad eficaz", "cantidad terapéutica" o "dosis eficaz" se entiende aquella cantidad suficiente para producir los efectos farmacológicos o terapéuticos deseados, dando así como resultado la prevención o tratamiento eficaz del trastorno.

Cuando se trata un trastorno del SNC, una cantidad eficaz de compuesto es una cantidad suficiente para pasar a través de la barrera hematoencefálica del sujeto, para unirse a sitios de receptores relevantes en el cerebro del sujeto y para modular la actividad de subtipos relevantes de NNR (por ejemplo, para proporcionar la secreción de neurotransmisores, dando así como resultado la prevención o tratamiento eficaz del trastorno). Un ejemplo de prevención de un trastorno se manifiesta por el retraso de la aparición de los síntomas del trastorno. Un ejemplo de tratamiento de un trastorno se manifiesta por una disminución de los síntomas asociados con el trastorno o una mejoría de la recurrencia de los síntomas del trastorno. Preferiblemente, la cantidad eficaz es suficiente para obtener el resultado deseado, pero insuficiente para causar efectos secundarios apreciables

La dosis eficaz puede variar, dependiendo de factores tales como la afección del paciente, la gravedad de los síntomas del trastorno, y la manera en la que se administra la composición farmacéutica. Para pacientes humanos, la dosis eficaz de compuestos típicos generalmente requiere la administración del compuesto en una cantidad suficiente para modular la actividad de los NNR pertinentes, pero la cantidad debería ser insuficiente para inducir efectos sobre los músculos esqueléticos y los ganglios en un grado significativo. La dosis eficaz de los compuestos, por supuesto, difiere de paciente a paciente, pero en general incluye cantidades iniciales con las que aparecen efectos sobre el sistema nervioso central u otros efectos terapéuticos deseados, pero por debajo de la cantidad en la que se observan efectos musculares.

Los compuestos descritos en esta memoria, cuando se emplean en cantidades eficaces de acuerdo con los métodos descritos aquí, pueden proporcionar algún grado de prevención de la progresión del trastorno, de mejora de los síntomas, o de mejora, en algún grado, de la recurrencia de trastornos del SNC u otros trastornos. Las cantidades eficaces de estos compuestos están normalmente por debajo de la concentración umbral requerida para provocar

imagen7

imagen8

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Tourette, autismo, adicción a drogas y a alcohol, tabaquismo, obesidad, caquexia, psoriasis, lupus, colangitis aguda, estomatitis aftosa, úlceras, asma, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, íleo postoperatorio, distonia espástica, diarrea, estreñimiento, pouchitis, pancreatitis, neumonitis viral, artritis, incluyendo artritis reumatoide y osteoartritis, endotoxemia, septicemia, ateroesclerosis, fibrosis pulmonar idiopática, dolor agudo, dolor crónico, neuropatías, incontinencia urinaria, diabetes y neoplasias.

Los deterioros o disfunciones cognitivas pueden estar asociados con trastornos o afecciones psiquiátricas, tales como esquizofrenia y otros trastornos psicóticos, incluyendo pero sin limitarse a trastorno psicótico, trastorno esquizofreniforme, trastorno esquizoafectivo, trastorno delirante, trastorno psicótico breve, trastorno psicótico compartido, y trastornos psicóticos debidos a una o más afecciones médicas generales, demencias y otros trastornos cognitivos, incluyendo pero sin limitarse a deterioro cognitivo leve, demencia pre-senil, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, demencia tipo Alzheimer, deterioro de la memoria asociado a la edad, demencia con cuerpos de Lewy, demencia vascular, complejo de demencia por SIDA, dislexia, parkinsonismo incluyendo la enfermedad de Parkinson, deterioro cognitivo y demencia de la enfermedad de Parkinson, deterioro cognitivo de la esclerosis múltiple, deterioro cognitivo causado por lesión traumática cerebral, demencias debidas a otras afecciones médicas generales, trastornos de ansiedad, incluyendo pero sin limitarse a trastorno de pánico sin agorafobia, trastorno de pánico con agorafobia, agorafobia sin historia de trastorno de pánico, fobia específica, fobia social, trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno de estrés post-traumático, trastorno de estrés agudo, trastorno de ansiedad generalizada y trastorno de ansiedad generalizada debido a una afección médica general, trastornos del estado de ánimo, incluyendo pero sin limitarse a trastorno depresivo mayor, trastorno distímico, depresión bipolar, manía bipolar, trastorno bipolar I, depresión asociada con episodios maniacos, depresivos o mixtos, trastorno bipolar II, trastorno ciclotímico, y trastornos del estado de ánimo debido a afecciones médicas generales, trastornos del sueño, incluyendo pero sin limitarse a trastornos de disomnia, insomnio primario, hipersomnia primaria, narcolepsia, trastornos de parasomnia, trastorno de pesadillas, trastorno de terror al sueño y trastorno de sonambulismo, retraso mental, trastornos del aprendizaje, trastorno de habilidades motoras, trastornos de comunicación, trastornos generalizados del desarrollo, trastornos de déficit de atención y comportamiento disruptivo, trastorno de déficit de atención, hiperactividad con déficit de atención, trastornos de alimentación y comida de la infancia, niñez, o adultos, trastornos de tics, trastornos de eliminación, trastornos relacionados con sustancias, incluyendo pero sin limitarse a dependencia de sustancias, abuso de sustancias, intoxicación por sustancias, abstinencia de sustancias, trastornos relacionados con alcohol, trastornos relacionados con anfetaminas o similares de anfetaminas, trastornos relacionados con cafeína, trastornos relacionados con cannabis, trastornos relacionados con cocaína, trastornos relacionados con alucinógenos, trastornos relacionados con inhalantes, trastornos relacionados con nicotina, trastornos relacionados con opioides, trastornos relacionados con fenciclidina o similares de fenciclidina, y trastornos relacionados con sedantes, hipnóticos, o ansiolíticos, trastornos de personalidad incluyendo, pero sin limitarse a trastorno de personalidad obsesivo-compulsivo y trastornos de control de impulsos.

Los síntomas de la esquizofrenia se dividen generalmente en tres categorías: positivos, negativos y cognitivos. Los síntomas positivos, se pueden denominar también "síntomas psicóticos", e incluyen delirios y alucinaciones. "Positivo" se refiere a tener síntomas patentes. Los síntomas negativos incluyen aplanamiento emocional o falta de expresión, incapacidad de empezar y seguir adelante con actividades, discurso que es breve y carente de contenido, y una falta de placer o interés en las actividades. "Negativo" se refiere a una falta de ciertas características que de otro modo estarían presentes en un individuo sano. Los síntomas cognitivos se refieren a los procesos de pensamiento. Los síntomas cognitivos incluyen deficiencias cognitivas tales como la memoria, incluyendo la memoria de trabajo, función ejecutiva, atención, vigilancia, procesamiento de información y aprendizaje, con referencia a Sharma et al., Cognitive Function in Schizophrenia: Deficits, Functional Consequences and Future Treatment, Psychiatr. Clin. N. Am. 26 (2003) 25-40. La esquizofrenia afecta también al estado de ánimo. Aunque muchas personas afectadas de esquizofrenia se deprimen, algunas también tienen aparentes cambios de humor e incluso estados tipo bipolar.

Las afecciones y trastornos anteriores se analizan con más detalle, por ejemplo, en la American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, Text Revision, Washington, DC, American Psychiatric Association, 2000. También se puede hacer referencia a este manual para un mayor detalle sobre los síntomas y características de diagnóstico asociados con el consumo, el abuso y la dependencia de sustancias.

Preferiblemente, el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones se produce sin efectos secundarios adversos apreciables, incluyendo, por ejemplo, aumentos significativos en la presión arterial y en la frecuencia cardíaca, efectos negativos significativos sobre el tracto gastrointestinal, y efectos significativos sobre el músculo esquelético.

Los compuestos de la presente invención, cuando se emplean en cantidades eficaces, se cree que modulan la actividad del NNR α7 sin interacción apreciable con los subtipos nicotínicos que caracterizan a los ganglios humanos, como se demuestra por la falta de capacidad para provocar la función nicotínica en tejidos cromafines suprarrenales, o músculo esquelético, demostrado además por una falta de capacidad de provocar la función nicotínica en preparaciones celulares que expresan receptores nicotínicos de tipo muscular. Por lo tanto, se cree que estos compuestos son capaces de tratar o prevenir enfermedades, trastornos y afecciones sin provocar efectos

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El efecto analgésico es adecuado para tratar el dolor de diversa génesis o etiología, en particular en el tratamiento del dolor inflamatorio e hiperalgesia asociada, dolor neuropático e hiperalgesia asociada, dolor crónico (por ejemplo, dolor crónico grave, dolor post-operatorio, y dolor asociado con diversas enfermedades, incluyendo cáncer, angina, cólico renal o biliar, menstruación, migraña, y gota). El dolor inflamatorio puede ser de diversa génesis, incluyendo artritis y enfermedad reumatoide, teno-sinovitis y vasculitis. El dolor neuropático incluye neuralgia del trigémino o neuralgia herpética, dolor neuropático diabético, causalgia, lumbalgia, y síndromes de desaferenciación tales como avulsión del plexo braquial.

Neovascularización

El NNR α7 se asocia con la neovascularización. La inhibición de la neovascularización, por ejemplo, administrando antagonistas (o en ciertas dosis, agonistas parciales) del NNR α7 puede tratar o prevenir afecciones caracterizadas por neovascularización o angiogénesis indeseable. Tales afecciones pueden incluir las caracterizadas por angiogénesis inflamatoria y/o angiogénesis inducida por isquemia. La neovascularización asociada con el crecimiento tumoral también se puede inhibir administrando los compuestos descritos en la presente memoria que funcionan como antagonistas o agonistas parciales de NNR α7.

El antagonismo específico de la actividad específica de NNR α7 reduce la respuesta angiogénica a la inflamación, isquemia y neoplasia. Pueden encontrarse directrices sobre sistemas de modelos animales apropiados para evaluar los compuestos descritos en esta memoria, por ejemplo, en Heeschen, C. et al., "A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors," J. Clin. Invest. 110(4): 527-36 (2002), con respecto a la divulgación de la inhibición de la angiogénesis específica de α7 y el modelo celular (in vitro) y animal de actividad angiogénica relevante para enfermedades humanas, especialmente el modelo de tumor de pulmón de Lewis (in vivo, en ratones – véase, en particular, las páginas 529 y 532-533).

Los tipos representativos de tumores que se pueden tratar utilizando los compuestos descritos en la presente memoria incluyen NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de ovario, cáncer de páncreas, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de recto, carcinoma de pulmón, carcinoma de orofaringe, carcinoma de hipofaringe, carcinoma de esófago, carcinoma de estómago, carcinoma de páncreas, carcinoma de hígado, carcinoma de la vesícula biliar, carcinoma del conducto biliar, carcinoma del intestino delgado, carcinoma del tracto urinario, carcinoma de riñón, carcinoma de vejiga, carcinoma de urotelio, carcinoma de tracto genital femenino, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de útero, carcinoma de ovario, coriocarcinoma, enfermedad trofoblástica gestacional, carcinoma del tracto genital masculino, carcinoma de próstata, carcinoma de vesículas seminales, carcinoma de testículos, tumores de células germinales, carcinoma de glándulas endocrinas, carcinoma de tiroides, carcinoma suprarrenal, carcinoma de la hipófisis, carcinoma de piel, hemangiomas, melanomas, sarcomas, sarcoma del hueso y de tejido blando, sarcoma de Kaposi, tumores del cerebro, tumores de los nervios, tumores de los ojos, tumores de las meninges, astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, schwannomas, meningiomas, tumores sólidos derivados de tumores malignos hematopoyéticos (tales como leucemias, cloromas, plasmocitomas, y las placas y tumores de micosis fungoides y linfoma/leucemia cutánea de células T), y tumores sólidos que surgen de linfomas.

Los compuestos se pueden administrar también en combinación con otras formas de tratamiento anticáncer, incluyendo la coadministración con agentes antitumorales antineoplásicos, tales como cis-platino, adriamicina, daunomicina, y similares, y/o agentes anti-VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), como se conocen en la técnica.

Los compuestos se pueden administrar de tal manera que se dirijan al sitio del tumor. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar en microesferas, micropartículas o liposomas conjugados con varios anticuerpos que dirigen las micropartículas al tumor. Además, los compuestos pueden estar presentes en microesferas, micropartículas o liposomas que son de tamaño apropiado para pasar, a través de las arterias y las venas, pero que se alojan en los lechos capilares que rodean a los tumores y que administran los compuestos localmente al tumor. Esos dispositivos de administración de fármacos son conocidos en la técnica.

Otros trastornos

Además de tratar trastornos del sistema nervioso central, inflamación, neovascularización, y dolor, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar también para prevenir o tratar ciertas otras afecciones, enfermedades y trastornos en los que los NNR desempeñan un papel. Los ejemplos incluyen trastornos autoinmunitarios tales como lupus, trastornos asociados con liberación de citocinas, caquexia secundaria a infección (por ejemplo, como ocurre en el SIDA, complejo relacionado con el SIDA y neoplasia), trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo I, diabetes tipo II, síndrome metabólico, obesidad, o hiperglucemia, penfitis, incontinencia urinaria, enfermedades retinales, enfermedades infecciosas, miastenia, síndrome de Eaton-Lambert, hipertensión, osteoporosis, vasoconstricción, vasodilatación, arritmias cardíacas, bulimia, anorexia, así como las indicaciones expuestas en la solicitud PCT publicada WO 98/25619. Los compuestos de esta invención se pueden administrar también para tratar convulsiones tales como las que son sintomáticas de la epilepsia, y para tratar afecciones tales como la sífilis y la enfermedad de Creutzfeld-Jakob.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Usos de diagnóstico

Se describen también en la presente memoria, compuestos que se pueden utilizar en composiciones de diagnóstico, tales como sondas, particularmente cuando se modifican para incluir marcadores apropiados. Las sondas se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar el número relativo y/o la función de los receptores específicos, en particular del subtipo de receptor α7. Para este fin, los compuestos de la presente invención se marcan más preferiblemente con un resto isotópico radiactivo tal como 11C, 18F, 76Br, 123I o 125I.

Los compuestos administrados se pueden detectar utilizando métodos de detección conocidos apropiados para la marca utilizada. Ejemplos de métodos de detección incluyen tomografía de emisión de positrones (PET) y tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Los radiomarcadores descritos anteriormente son útiles en captura de imágenes por PET (por ejemplo, 11C, 18F o 76Br) y SPECT (por ejemplo, 123I), con semividas de aproximadamente 20,4 minutos para 11C, aproximadamente 109 minutos para 18F, aproximadamente 13 horas para 123I, y aproximadamente 16 horas para 76Br. Se desea una actividad específica alta para visualizar los subtipos de receptores seleccionados a concentraciones de no saturación. Las dosis administradas normalmente están por debajo del intervalo tóxico y proporcionan imágenes de alto contraste. Se espera que los compuestos puedan administrarse a niveles no tóxicos. La determinación de la dosis se lleva a cabo de una manera conocida por los expertos en la técnica de captura de imágenes radiomarcadas. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº

5.969.144 de London et al.

Los compuestos se pueden administrar usando técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.969.144 de London et al., como se ha indicado. Los compuestos se pueden administrar en composiciones de formulación que incorporan otros ingredientes, tales como los tipos de ingredientes que son útiles en la formulación de una composición de diagnóstico. Compuestos útiles de acuerdo con la realización de la presente invención se emplean más preferiblemente en forma de alta pureza. Véase la patente de Estados Unidos Nº

5.853.696 de Elmalch et al.

Una vez que se han administrado los compuestos a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), puede capturarse una imagen de la presencia de dicho compuesto dentro del sujeto y puede cuantificarse por técnicas apropiadas para indicar la presencia, cantidad y funcionalidad de los subtipos seleccionados de NNR. Además de los seres humanos, los compuestos también se pueden administrar a animales, tales como ratones, ratas, perros y monos. La captura de imágenes por SPECT y PET se puede llevar a cabo utilizando cualquier técnica y aparato apropiado. Véase Villemagne et al., en: Americ et al. (Eds.) Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Therapeutic Opportunities, 235-250 (1998) y la patente de Estados Unidos Nº 5.853.696 de Elmalch et al

Los compuestos radiomarcados se unen con alta afinidad a subtipos selectivos de NNR (por ejemplo, α7) y presentan preferiblemente uniones no específicas insignificantes con otros subtipos de receptores nicotínicos colinérgicos (por ejemplo, aquellos subtipos de receptores asociados con músculos y ganglios). Por ello, los compuestos se pueden usar como agentes para captura de imágenes no invasiva, de subtipos de receptores nicotínicos colinérgicos dentro del cuerpo de un sujeto, particularmente dentro del cerebro para el diagnóstico asociado con una variedad de enfermedades y trastornos del SNC.

Las composiciones de diagnóstico se pueden utilizar en un método para diagnosticar una enfermedad en un sujeto, tal como un paciente humano. El método implica administrar a dicho paciente un compuesto marcado de manera detectable como se describe aquí, y detectar la unión de dicho compuesto con los subtipos seleccionados de NNR (por ejemplo, subtipo de receptor α7). Los expertos en la técnica de utilización de herramientas de diagnóstico, tales como PET y SPECT, pueden usar los compuestos radiomarcados descritos aquí para diagnosticar una amplia variedad de afecciones y trastornos, incluyendo las afecciones y trastornos asociados con disfunción del sistema nervioso central y del sistema nervioso autónomo. Tales trastornos incluyen una amplia variedad de enfermedades y trastornos del SNC, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esquizofrenia. Estas y otras enfermedades y trastornos representativos que pueden ser evaluados incluyen los que se indican en la patente de Estados Unidos Nº 5.952.339 de Bencherif et al.

Las composiciones de diagnóstico se pueden utilizar en un método para monitorizar los subtipos selectivos de receptores nicotínicos de un sujeto, tal como un paciente humano. El método implica administrar un compuesto marcado de forma detectable como se describe aquí a ese paciente y detectar la unión de dicho compuesto con los subtipos seleccionados de receptores nicotínicos, concretamente el subtipo de receptor α7.

Unión al receptor

Los compuestos de esta invención se pueden utilizar como ligandos de referencia en ensayos de unión para compuestos que se unen con subtipos de NNR, en particular el subtipo de receptor α7. Para este fin, los compuestos de esta invención se marcan preferiblemente con un resto radioactivo isotópico tal como 3H, o 14C.

V. Ejemplos sintéticos

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los siguientes ejemplos sintéticos se proporcionan para ilustrar la presente invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la misma. En estos ejemplos, todas las partes y porcentajes están en peso, a menos que se indique otra cosa. Todas las soluciones son acuosas a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 1: Síntesis a pequeña escala de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3il)benzofuran-2-carboxamida (Compuesto A) y su enantiómero, (2R,3S)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]octan-3-il)benzofuran-2-carboxamida

2-((3-Piridinil)metilen)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona

Se disolvió hidróxido de potasio (56 g, 0,54 mol) en metanol (420 mL). Se añadió hidrocloruro de 3-quinuclidinona (75 g, 0,49 mol) y se agitó la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadió 3-piridincarboxaldehído (58 g, 0,54 mol) y la mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se volvió amarilla durante este período, con depósito de sólidos endurecidos sobre las paredes del matraz. Se rasparon los sólidos de las paredes y se rompieron los pedazos. Con una agitación rápida, se añadió agua (390 mL). Cuando se disolvieron los sólidos, se enfrió la mezcla a 4 ºC durante la noche. Se recogieron los cristales por filtración, se lavaron con agua y se secaron al aire para obtener 80 g de un sólido amarillo. Se obtuvo una segunda cosecha (8 g) por concentración del filtrado hasta ~10 % de su volumen anterior y enfriamiento a 4 ºC durante la noche. Ambas cosechas fueron suficientemente puras para su posterior transformación (88 g, 82 % de rendimiento).

2-((3-Piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona

Se suspendió 2-((3-piridinil)metilen)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (20 g, 93 mmol) en metanol (200 mL) y se trató con 46 mL de ácido clorhídrico 6 M. Se añadió paladio al 10 % sobre carbón (1,6 g) y se agitó la mezcla bajo hidrógeno a 172 kPa (25 psi) durante 16 h. Se filtró la mezcla a través de tierra de diatomeas, y se separó el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria. Esto proporcionó hidrocloruro de 2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona crudo, como una goma blanca (20 g), que se trató posteriormente con hidróxido de sodio 2 M (50 mL) y cloroformo (50 mL) y se agitó durante una hora. Se separó la capa de cloroformo, y la fase acuosa se trató con hidróxido de sodio 2 M (~ 5 mL, suficiente para subir el pH a 10) y cloruro de sodio acuoso saturado (25 mL). Esta mezcla acuosa se extrajo con cloroformo (3 x 10 mL), y los extractos de cloroformo reunidos se secaron (sulfato de magnesio anhidro) y se concentraron por evaporación rotatoria. Se disolvió el residuo (18 g) en éter caliente (320 mL) y se enfrió a 4 ºC. El sólido blanco se separó por filtración, se lavó con una pequeña porción de éter frío y se secó al aire. La concentración del filtrado hasta ~10 % de su volumen anterior y el enfriamiento a 4 ºC produjeron una segunda cosecha. Se obtuvo un rendimiento conjunto de 16 g (79 %)

3-Amino-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano

A una solución en agitación de 2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (3,00 g, 13,9 mmol) en metanol seco (20 mL), bajo nitrógeno, se añadió una solución 1 M de cloruro de cinc en éter (2,78 mL, 2,78 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 min, se trató esta mezcla con formiato de amonio sólido (10,4 g, 167 mmol). Después de agitar durante otra hora a temperatura ambiente, se añadió cianoborohidruro de sodio sólido (1,75 g, 27,8 mmol) en porciones. Se agitó entonces la reacción a temperatura ambiente durante la noche y se terminó por adición de agua (~ 5 mL). La reacción sofocada se sometió a reparto entre hidróxido de sodio 5 M (10 mL) y cloroformo (20 mL). La capa acuosa se extrajo con cloroformo (20 mL), y las capas orgánicas reunidas se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron. Esto dejó 2,97 g de una goma amarilla. El análisis por GCMS indicó que el producto era una mezcla 1:9 de las aminas cis y trans, junto con trazas del alcohol correspondiente (98 % de recuperación total, en masa).

(2R,3S) y (2S,3R)-3-amino-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano

Se añadió ácido Di-p-toluoil-D-tartárico (5,33 g, 13,8 mmol) a una solución en agitación de 3-amino-2-((3piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano crudo (6,00 g, 27,6 mmol de cis/trans 1:9) en metanol (20 mL). Después de disolución completa, la solución límpida se concentró entonces hasta una masa sólida mediante evaporación rotatoria. Se disolvió el sólido en una cantidad mínima de metanol hirviente (~5 mL). Se enfrió la solución lentamente, primero a temperatura ambiente (1 h), después, durante ~4 h a 5 ºC y, finalmente, a -5 ºC durante la noche. Se recogió la sal precipitada mediante filtración por succión y se recristalizó en 5 mL de metanol. El secado al aire dejó 1,4 g de sólido blanco, que se sometió a reparto entre cloroformo (5 mL) e hidróxido de sodio 2 M (5 mL). La capa de cloroformo y un extracto clorofórmico de 5 mL de la capa acuosa se reunieron, se secaron (sulfato de sodio anhidro) y se concentraron para dar un aceite incoloro (0,434 g). La pureza enantiomérica de esta base libre se determinó por conversión de una porción en su N-(terc-butoxicarbonil)-L-prolinamida, que fue analizada entonces para determinar la pureza diastereoisomérica (98 %) utilizando LCMS.

Las aguas madre de la cristalización inicial se basificaron (pH ~ 11) con hidróxido de sodio 2 M y se extrajeron dos veces con cloroformo (10 mL). Los extractos clorofórmicos se secaron (sulfato de sodio anhidro) y se concentraron para dar un aceite. Esta amina (3,00 g, 13,8 mmol) se disolvió en metanol (10 mL) y se trató con ácido di-p-toluoil-Ltartárico (2,76 g, 6,90 mmol). Se calentó la mezcla para ayudar a la disolución y después se enfrió lentamente a -5

imagen10

15

25

35

45

55

evacuación y presurización con hidrógeno se repitieron 2 veces más, dejando el reactor bajo 4,98 kPa (20 pulgadas de agua) de presión de gas hidrógeno después de la tercera presurización. Se agitó la mezcla de reacción a 20 ºC ± 5 ºC durante un mínimo de 12 h, y se monitorizó la reacción por TLC. Una vez completada la reacción, se filtró la suspensión a través de un lecho de Celite®545 (1,9 kg) en un embudo de vidrio sinterizado, y la torta del filtro se lavó con metanol (10,1 L). Se concentró el filtrado para obtener un semi-sólido que se transfirió, bajo atmósfera de nitrógeno, a un matraz de reacción de 200 L equipado con un agitador mecánico, condensador y sonda de temperatura. Se disolvió el residuo semi-sólido en etanol (57,2 L), y se añadió ácido di-p-toluoil-D-tartárico (DTTA) (9,74 kg, 25,2 mol). Se calentó la mezcla de reacción en agitación a reflujo, durante un mínimo de 1 h, y durante un mínimo adicional de 12 h, mientras se enfriaba la reacción entre 15 ºC y 30 ºC. Se filtró la suspensión utilizando un filtro de mesa, y la torta del filtro se lavó con etanol (11,4 L). El producto se secó a vacío a temperatura ambiente para obtener 11,6 kg (76,2 % de rendimiento, 59,5 % corregido en cuanto a pureza) de sal di-p-toluoil-D-tartrato de (2S)-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona.

Sal di-p-toluoil-D-tartrato de (2S,3R)-3-amino-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano

Se añadieron agua (46,25 L) y bicarbonato de sodio (4,35 kg, 51,8 mol) a un matraz de 200 L. Cuando la disolución fue completa, se añadió diclorometano (69,4 L). Se añadió sal di-p-toluoil-D-tartrato de (2S)-2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (11,56 kg, 19,19 mol), y la mezcla de reacción se agitó entre 2 min y 10 min. Se dejaron separar las capas durante un mínimo de 2 min (se añadió agua adicional (20 L) cuando fue necesario para el reparto de las capas). Se separó la fase orgánica y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Se añadió diclorometano (34,7 L) a la fase acuosa restante, y se agitó la suspensión entre 2 min y 10 min. Se dejaron separar las capas entre 2 min y 10 min. Una vez más, se separó la fase orgánica y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La extracción de la fase acuosa con diclorometano (34,7 L) se repitió una vez más, como antes. Las muestras de cada extracción se sometieron a análisis por HPLC quiral. Se separó el sulfato de sodio por filtración, y los filtrados se concentraron para obtener (2S)-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (4,0 kg) como un sólido

La (2S)-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (3,8 kg) se transfirió a un matraz de reacción, de vidrio, limpio, de 100 L, bajo atmósfera de nitrógeno, equipado con un agitador mecánico y una sonda de temperatura. Se añadieron tetrahidrofurano anhidro (7,24 L) y (+)-(R)-α-metilbencilamina (2,55 L, 20,1 mol). Se añadió isopropóxido de titanio(IV) (6,47 L 21,8 mol) a la mezcla de reacción en agitación durante un período de 1 h. Se agitó la reacción bajo atmósfera de nitrógeno durante un mínimo de 12 h. Se añadió etanol (36,17 L) a la mezcla de reacción. Se enfrió la mezcla de reacción por debajo -5 ºC, y se añadió borohidruro de sodio (1,53 kg, 40,5 mol) en porciones, manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 15 ºC (esta adición tardó varias horas). La mezcla de reacción se agitó entonces a 15 ºC ± 10 ºC durante un mínimo de 1 h. Se monitorizó la reacción por HPLC, y cuando la reacción fue completa (como se indica por menos de 0,5 % de (2S)-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3ona restante), se añadió hidróxido de sodio 2 M (15,99 L) y se agitó la mezcla durante un mínimo de 10 min. Se filtró la mezcla de reacción por un lecho de Celite®545 en un embudo de mesa. La torta del filtro se lavó con etanol (15,23 L), y se concentró el filtrado para obtener un aceite.

Se transfirió el concentrado a un matraz de reacción, de vidrio, limpio, de 100 L, equipado con un agitador mecánico y una sonda de temperatura, en atmósfera inerte. Se añadió agua (1 L), y se enfrió la mezcla a 0 ºC ± 5 ºC. Se añadió a la mezcla ácido clorhídrico 2 M (24 L) para ajustar el pH de la mezcla a pH 1. Se agitó entonces la mezcla durante un mínimo de 10 min, y se añadió lentamente hidróxido de sodio 2 M (24 L) para ajustar el pH de la mezcla a pH 14. Se agitó la mezcla durante un mínimo de 10 min, y se extrajo la fase acuosa con diclorometano (3 x 15,23 L). Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro (2,0 kg), se filtraron, y se concentraron para dar (2S,3R)-N-((1R)-feniletil)-3-amino-2-((3-piridinil)metil))-1-azabiciclo[2.2.2]octano (4,80 kg, 84,7 % de rendimiento).

El (2S,3R)-N-((1R)-feniletil)-3-amino-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano se transfirió a un matraz de vidrio de 22 L equipado con un agitador mecánico y una sonda de temperatura, en atmósfera inerte. Se añadió agua (4,8 L), y la mezcla en agitación se enfrió a 5 ºC ± 5 ºC. Se añadió lentamente al matraz de reacción ácido clorhídrico concentrado (2,97 L), manteniendo la temperatura de la mezcla por debajo de 25 ºC. La solución resultante se transfirió a un matraz de reacción de 72 L que contenía etanol (18 L), equipado con un agitador mecánico, una sonda de temperatura, y un condensador, en atmósfera inerte. Se añadieron al matraz, paladio al 10 % sobre carbón (50 % de humedad) (311,1 g) y ciclohexeno (14,36 L). La mezcla de reacción se calentó a casi reflujo durante un mínimo de 12 h, y se monitorizó la reacción por TLC. Una vez completada la reacción, se enfrió la mezcla de reacción por debajo de 45 ºC, y se filtró por un lecho de Celite®545 (1,2 kg) sobre un embudo de vidrio sinterizado. Se lavó la torta del filtro con etanol (3 L) y se concentró el filtrado para obtener una fase acuosa. Se añadió agua (500 mL) al filtrado concentrado, y esta capa acuosa reunida se lavó con metil terc-butil éter (MTBE) (2 x 4,79 L). Se añadió hidróxido de sodio 2 M (19,5 L) a la fase acuosa para ajustar el pH de la mezcla a pH 14. Se agitó entonces la mezcla durante un mínimo de 10 min. Se extrajo la fase acuosa con cloroformo (4 x 11,96 L), y las fases orgánicas reunidas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro (2,34 kg). Se filtró y se concentró el filtrado para obtener (2S,3R)-3-amino-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano (3,49 kg, rendimiento > cuantitativo) como un aceite.

El (2S,3R)-3-amino-2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]octano se transfirió a un matraz de reacción, limpio, de 100 L, equipado con un agitador mecánico, un condensador y una sonda de temperatura, en atmósfera inerte. Se

imagen11

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

4,7, 7,7 Hz, 1H), 3,71 (m, J = 7,6 Hz, 1H), 3,11 (m, 1H), 3,02 (m, 1H), 2,80 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 2,55 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,62 (m, 1H), 1,56 (m, 1H), 1,26 ( m, 1H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 158,1, 154,1, 150,1, 149,1, 146,8, 136,4, 135,4, 127,1, 126,7, 123,6, 122,9, 122,6, 111.8, 109.3, 61,9, 53,4, 49,9, 40,3, 35,0, 28,1, 26,1, 19,6.

La sal monohidrocloruro del Compuesto A (véase el Ejemplo 5) se sometió a análisis cristalográfico por rayos X. La estructura cristalina resultante (mostrada en las figuras 10A y 10B, respectivamente) estableció la configuración absoluta 2S,3R del Compuesto A.

Ejemplo 3: Síntesis de la sal fosfato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran2-carboxamida

Se añadieron a un matraz de fondo redondo (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2carboxamida (8,18 g, 22,6 mmol) y 2-propanol (180 mL). Se agitó la mezcla y se calentó a 65-70 ºC hasta que se disolvieron todos los sólidos. La solución se agitó vigorosamente a 65-70 ºC, y se añadió ácido fosfórico (1,65 mL, 24,3 mmol) gota a gota con una pipeta. Inmediatamente se formó un sólido blanco granular. Se agitó la mezcla a 6570 ºC durante 30 minutos, se enfrió a temperatura ambiente (23 ºC) y se agitó durante otras 24 h. Los sólidos blancos se recogieron por filtración con succión, la torta del filtro se lavó con 2-propanol (20 mL) y el sólido se secó al aire durante al menos 1 h. Se secó el sólido adicionalmente en una estufa de vacío a 75 ºC durante la noche (16 h) para dar 10,7 g del producto (rendimiento > cuantitativo), p.f. 265-273 ºC con descomposición, con cambios de cristalinidad observados a ~180 ºC. La 1H-NMR (DMSO-d6) indicó la presencia de 2-propanol (solvato fuerte), lo que puede explicar que el rendimiento sea mayor que cuantitativo. El análisis por LC quiral dio una pureza de 97,1 % (270 nm).

Ejemplo 4: Síntesis de la sal maleato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran2-carboxamida

Se añadió ácido maleico (0,067 g, 0,630 mmol) a una suspensión caliente de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida (0,203 g, 0,560 mmol) en acetato de isopropilo (2 mL), depositando sólidos finos de color blanco, junto con un residuo gomoso. Se añadieron adicionalmente acetato de isopropilo (3 mL) y ácido maleico (0,006 g) y se calentó la mezcla a reflujo. Se añadió isopropanol (5 mL) a reflujo. La mezcla resultante de sólidos blancos se enfrió a temperatura ambiente, se filtró, y los sólidos se lavaron con acetato de isopropilo (2 mL). Se secó el producto a vacío a 60 ºC durante 18 h para dar 0,228 g de un sólido blanquecino escamoso (84,7 % de rendimiento), p.f. 180-182 ºC. La 1H NMR (DMSO-d6) indicó una estequiometría de mono-sal. Calculado para C22H23N3O2 · C4H4O4: C, 65,40, H, 5,70, N, 8,80; Encontrado: C, 65,35, 65,29, H, 5,86, 5,68, N, 8,69, 8,78.

Ejemplo de referencia 5: Síntesis de sales hidrocloruro de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida

Monohidrocloruro: Se preparó una solución de ácido clorhídrico/THF añadiendo ácido clorhídrico concentrado (1,93 mL de solución 12 M, 23,2 mmol) gota a gota a 8,5 mL de THF enfriado. Se calentó la solución a temperatura ambiente. Se añadieron a un matraz de fondo redondo (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3il)benzofuran-2-carboxamida (8,49 g, 23,5 mmol) y acetona (85 mL). Se agitó la mezcla y se calentó a 45-50 ºC hasta que se obtuvo una solución completa. Se añadió gota a gota la mezcla de ácido clorhídrico/THF preparada anteriormente, durante un período de 5 min, utilizando THF adicional (1,5 mL) en la transferencia. Se empezaron a formar sólidos granulares blancos durante la adición de la solución de ácido. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, y se agitó durante la noche (16 h). Se recogieron los sólidos por filtración con succión, se lavó la torta del filtro con acetona (10 mL), y se secó el sólido al aire con succión durante 30 minutos. Se secó el sólido adicionalmente en una estufa de vacío a 75 ºC durante 2 h para dar 8,79 g de cristales blancos finos (94 % de rendimiento), p.f. 255-262 ºC. El análisis por LC quiral dio una pureza de 98,8 % (270 nm). La 1H-NMR (DMSO-d6) no muestra disolventes residuales y confirma la estequiometría mono. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10,7 (s ancho, 1H-amonio cuaternario), 8,80 (s ancho, 1H-amida H), 8,54 (s, 1H), 8,23 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,47 (m, 2H), 7,33 (m, 1H), 7,19 (m, 1H), 4,19 (m,1H), 4,08 (m, 1H), 3,05-3,55 (m, 6H), 2,00 a 2,10 (m, 3H), 1,90 (m, 1H), 1,70 (m, 1H). Un análisis cristalográfico por rayos x de esta sal estableció la distribución estereoquímica y la estequiometría (véase las figuras 10A y 10B).

Dihidrocloruro: se burbujeó lentamente cloruro de hidrógeno gaseoso en una solución enfriada con hielo de (2S,3R)N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida (1,9 g, 5,3 mmol) en éter anhidro (25 mL). Se eliminaron los compuestos volátiles, primero en una corriente de nitrógeno y después con alto vacío (lavador de hidróxido de sodio en línea de alto vacío). Se trituró el residuo varias veces con pequeños volúmenes de éter anhidro (que se desecha), y el sólido restante se secó a alto vacío. Esto dio 2,17 g (94 % de rendimiento) de un polvo blanquecino, p.f. 210-212 ºC (higroscópico). El análisis por LC quiral dio una pureza de 93,7 % (270 nm). MS con electropulverización de iones positivos [M + H]+ m/z de iones = 362. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 9,15 (s, 1H), 8,84 (d, 1H), 8,63 (d, 1H), 7,97 (t, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (m, 2H), 7,35 (t, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 3,40-3,85 (m, 6H), 1,95-2,40 (m, 5H).

imagen12

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mg (93,8 % de rendimiento) de un sólido blanco, p.f. 149,5-156 ºC. 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8,30 (s, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,64 (d, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,36 (m, 2H), 7,18 (m, 1H), 7,11 (s, 1H), 6,99 (m, 1H), 4,07 (d, 1H), 3,73 (m, 1H), 3,45 (m, 2H), 3,95-3,35 (m, 5H, incluye ácido canforsulfónico), 2,64 (d, 1H, ácido canforsulfónico), 2,22 (m, 2H), 1,70-2,10 (m, 8H, incluye ácido canforsulfónico), 1,45 (m, 1H, ácido canforsulfónico), 1,25 (m, 1H, ácido canforsulfónico), 0,85 (s, 3H, ácido canforsulfónico), 0,68 (s, 3H, ácido canforsulfónico).

Ejemplo 11: Síntesis de sal S-canforsulfonato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3il)benzofuran-2-carboxamida

Se añadió ácido S-10-canforsulfónico (80,3 mg, 0,346 mmol) a una solución de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida (125 mg, 0,346 mmol) en etanol caliente (1 mL). La dilución con acetato de etilo (4 mL) y el enfriamiento no produjeron ningún precipitado. Los compuestos volátiles se eliminaron por evaporación rotatoria, y el residuo (espuma blanca) se disolvió en isopropanol caliente (1,5 mL). El enfriamiento a 5 ºC produjo cristales blancos. Se concentró la mezcla hasta ~ 0,5 mL y se enfrió de nuevo a 5 ºC. Se recogió entonces el sólido por filtración con succión y se secó a vacío, inicialmente 18 h a 45 ºC, pero después a temperaturas sucesivamente más altas (finalmente a 110 ºC) para eliminar el isopropanol residual. Esto proporcionó 143 mg (69,7 % de rendimiento) de un sólido blanco, p.f. 153,5-157 ºC. 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8,29 (s, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,54 (d, 1H), 7,34 (m, 2H), 7,18 (m, 1H). 7,10 (s, 1H), 6,99 (m, 1H), 4,05 (d, 1H), 3,73 (m, 1H), 3,44 (m, 2H), 3,95-3,35 (m, 5H, incluye ácido canforsulfónico), 2,67 (d, 1H, ácido canforsulfónico), 2,23 (m, 2H), 1.70-2.10 (m, 8H, incluye ácido canforsulfónico), 1,46 (m, 1H, ácido canforsulfónico), 1,25 (m, 1H, ácido canforsulfónico), 0,84 (s, 3H, ácido canforsulfónico), 0,64 (s, 3H, ácido canforsulfónico).

Utilizando procedimientos similares a los descritos antes (ejemplos 3-11), se caracterizaron otras diversas formas de sales. Los resultados de estas preparaciones se detallan en los ejemplos 12-14.

Ejemplo 12: Síntesis de sal sulfato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2carboxamida

Se precipitó una sal sulfato en una mezcla de acetato de isopropilo y agua. P.f. 278 ºC. 1H NMR (400 MHz,DMSOd6) δ 9,28 (s ancho, 1H, amida), 8,56 (dd, 1H), 8,24 (t, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,40 (m, 2H), 7,35 (s, 1H), 7,21 (m, 1H), 4,21 (m, 1H), 3,93 (m, 2H), 3,10-3,60 (m, 5H), 2,05 (m, 3H), 1,92 (m, 1H) , 1,73 (m, 1H).

Ejemplo 13: Síntesis de sal cetoglutarato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3il)benzofuran-2-carboxamida

Una sal α-cetoglutarato se precipitó en acetato de isopropilo. P.f. 177 ºC. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,64 (s, 1H, amida), 8,50 (d, 1H), 8,20 (d, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,70 (d, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,45 (m, 1H) , 7,32 (m, 2H), 7,18 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,78 (m, 2H), 3.00-3.45 (m, 5H), 2,81 (m, 2H, ácido cetoglutárico), 2,41 (m, 2H, ácido cetoglutárico), 1,96 (m, 3H), 1,83 (m, 1H), 1,60 (m, 1H).

Ejemplo 14: Síntesis de sal hipurato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran2-carboxamida

Se precipitó una sal hipurato en acetona (demasiado higroscópica para obtener el punto de fusión). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,79 (s, 1H, amida), 8,56 (d, 1H), 8,44 (s, 1H, ácido hipúrico), 8,29 (m, 1H), 7,87 (m, 2H, ácido hipúrico), 7,76 (d, 1H), 7,65 (m, 1H), 7,54 (m, 1H), 7,49 (m, 4H, incluye ácido hipúrico), 7,34 (m, 2H), 7,21 (m, 1H), 3,91 (m, 1H ), 3,74 (m, 2H), 3,00 a 3,50 (m, 5H), 2,80 (m, 2H, ácido hipúrico), 1,79 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 1,30 (m, 1H).

Ejemplo 15: Aislamiento de (2R,3R)-y (2S,3S)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2carboxamida y conversión en sales de ácido galactárico

Una muestra del sobrenadante procedente del aislamiento de p-toluenosulfato de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]benzofuran-2-carboxamida (Ejemplo 2) se concentró por evaporación rotatoria, se ajustó a pH 10 con hidróxido de sodio acuoso al 10 % y se extrajo con diclorometano. El extracto de diclorometano se evaporó, y el residuo (1,8 g) se disolvió en etanol absoluto (55 mL) que contenía 0,5 % de di-n-butilamina. Se inyectó esta solución, en porciones de 0,25 mL, en una columna de HPLC quiral Chiralpak® AD de 25 cm x 2,1 cm, eluyendo con hexano/etanol/di-n-butilamina 60:40:0,2 (caudal = 30 mL/min), monitorizado a 270 nm. El aislamiento del efluente que eluye a ~7,5 min y el que eluye a ~13,5 min dio, después de la evaporación del disolvente, 0,48 g (98 % de pureza quiral) y 0,47 g (99 % de pureza quiral) respectivamente de un aceite incoloro. Los dos espectros de NMR fueron idénticos. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,49 (s, 1H), 8,45 (d, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,52 (m, 4H), 7,35 (t, 1H), 7,20 (dd, 1H). 7,05 (d, 1H). 4,55 (dt, 1H). 3,43 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 2,90 (m, 5H), 2,09 (m, 1H), 1,88 (m, 4H).

Una solución caliente de cada una de las muestras de base libre en etanol absoluto (10 mL) se trató con un equivalente de ácido galactárico. Las mezclas resultantes se calentaron a 75 ºC durante 5 min y se enfriaron, con agitación, a temperatura ambiente. Los sólidos resultantes se recogieron mediante filtración por succión y se secaron a vacío, dando 0,65 g (87 % de rendimiento) y 0,62 g (85 % rendimiento), respectivamente, de un sólido

10

15

20

25

30

35

40

45

50

granular blanco (p.f. 200-205 ºC en cada caso). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8,38 (s, 1H). 8,28 (d, 1H). 7,94 (d, 1H), 7,70 (d, 1H). 7,59 (d, 1H). 7,48 (t, 1H). 7,40 (m, 1H). 7,32 (m, 2H), 4,42 (m, 1H), 4,21 (s, 2H), 3,87 (d, 2H), 3,68 (m, 1H), 3,35 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 2,02 (m, 3H).

Ejemplo 16: Síntesis de sal p-clorobenzoato de (2R,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2] octubre-3il)benzofuran-2-carboxamida

Se añadió ácido p-cloro-benzoico sólido (46,8 mg, 0,299 mmol) en una porción a una solución del isómero que eluye antes, de N-(2-((3-piridinil)metil)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il] benzofuran-2-carboxamida del Ejemplo 15 (108 mg, 0,299 mmol) en acetona (10 mL). Se calentó esta mezcla casi a reflujo durante 30 min y se enfrió a temperatura ambiente. No se formó ningún precipitado, por lo que la solución se concentró hasta aproximadamente un 20 % de su volumen anterior (placa caliente), en cuyo punto se empezaron a formar cristales. Se enfrió la mezcla y se diluyó con isopropanol (2 mL). Se concentró esta mezcla por evaporación lenta del disolvente a temperatura ambiente, y los sólidos resultantes se recogieron y secaron. Esto produjo 145 mg (94 % de rendimiento) de cristales de color amarillo claro, p.f. 150-152 ºC. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,49 (s, 1H), 8,38 (d, 1H), 7,93 (d, 2H, ácido p-clorobenzoico), 7,67 (m, 2H), 7,57 (d, 1H), 7,45 (m, 1H), 7,36 (d, 2H, ácido p-cloro-benzoico), 7,30 (m, 1H), 7,27 (s, 1H). 7,16 (m, 1H), 7,00 (d, 1H, amida), 6,90 (s ancho, amonio cuaternario), 4,62 (m, 1H), 3,85 (dd, 1H), 3,36 (m, 1H), 2,95-3,25 (m, 5H), 2,16 (s, 1H), 1,70-2,10 (m, 4H).

El análisis cristalográfico por rayos X de esta muestra reveló que su estereoquímica absoluta era 2R,3R (véase las figuras 11A y 11B). El isómero que eluye más tarde del Ejemplo 15, tiene así por eliminación, la configuración absoluta 2S,3S.

Ejemplo 17: Método cromatográfico quiral para análisis de los estereoisómeros

La generación de un método cromatográfico quiral para la separación de los cuatro estereoisómeros, uno de otro, resultó ser muy difícil. Los intentos iniciales (utilizando fase móvil de hexano/isopropanol/trietilamina) dio lugar a solapamiento de picos y formas de picos que no eran óptimas. El cambio de isopropanol a etanol y de trietilamina a di-n-butilamina mejoró la resolución y la forma de los picos y acortó el tiempo de ejecución. Los detalles del método son como sigue:

Columna analítica: Chiralpak ® AD (250 x 4,6 mm, 5 µm)

Fase móvil: hexano/etanol/di-n-butilamina 60:40:0,2

Volumen de inyección: 10 µL

Caudal: 1,0 mL por minuto

Temperatura: 20 ºC

Detección: UV a 270 nm

Tiempo de ejecución total: ~ 25 minutos

Orden de elución (tiempo de retención RT): 2S,3R (5,3 min); 2R,3S (7,3 min); 2R,3R (8,3 min); 2S,3S (12,1 min)

Un cromatograma representativo de los análogos de estereoisómeros se muestra en la figura 12.

Ejemplo 18: XRPD

El análisis de XRPD se realizó para varias muestras de sales descritas en la presente memoria. Se proporcionan patrones de difracción para las sales hidrocloruro (Figura 13) y tosilato (Figura 14).

Difracción de Rayos-X de Polvo (XRPD)

Se recogieron patrones de difracción de Rayos X de polvo en uno o ambos de dos instrumentos. Algunos se recogieron en un Difractómetro Siemens D5000 utilizando radiación CuKα (40 kV, 40 mA), goniómetro θ-θ, divergencia V20 y rendijas receptoras, un monocromador secundario de grafito y un contador de centelleo. Se comprueba el funcionamiento del instrumento utilizando un estándar Corundum certificado (NIST, 1976). Las muestras analizadas en condiciones ambientales se prepararon como muestras en placa plana utilizando polvo tal como se recibieron. Aproximadamente 35 mg de la muestra se empaquetaron cuidadosamente en un hueco de una oblea de silicio, pulida, de fondo cero (510). Se hizo girar la muestra en su propio plano durante el análisis, barriendo de 2° a 42° en etapas de 0,05° a 4 segundos por etapa, utilizando CuKα1 (λ = 1.5406Å).

Algunos de los patrones de difracción de rayos X de polvo se recogieron en un difractómetro Bruker AXS C2 GADDS utilizando radiación CuKα (40 kV, 40 mA), etapa XYZ automatizada, microscopio de vídeo láser para posicionamiento de automuestra y un detector de área bidimensional HiStar. La óptica de rayos X consiste en un único espejo multicapa Göbel acoplado con un colimador de poro de 0,3 mm. La divergencia del haz (es decir, el

imagen13

Parámetros del método genérico de GVS

Parámetros

Valores

Adsorción – Barrido 1

40-90

Desorción/Adsorción-Barrido 2

85-seco, seco-40

Intervalos (% de HR)

10

Número de barridos

2

Caudal (mL/min)

250

Temperatura (ºC)

25

Estabilidad (ºC/min)

0,05

Tiempo mínimo de sorción (horas)

1

Tiempo máximo de sorción (horas)

4

Modo

AF2

Precisión (%)

98

El software utiliza un procedimiento de minimización de mínimos cuadrados junto con un modelo de relajación de masa, para predecir un valor asintótico. El valor medido de relajación de masa debe estar dentro del 5 % del valor previsto por el software, antes de que sea seleccionado el siguiente valor de % de HR. El tiempo mínimo de

5 equilibración se fijó en 1 h y el máximo en 4 h. Típicamente, las muestras se recogieron después de completar la isoterma y se re-analizaron por XRPD.

Determinación de agua por Karl Fischer (KF)

El contenido de agua de cada muestra se midió en un culombímetro Mettler Toledo DL39 utilizando un reactivo Hydranal Coulomat AG y una purga de argón. Se introdujeron las muestras sólidas pesadas en el recipiente de una 10 cápsula de platino TGA que estaba conectada a un septum suba-seal para evitar la entrada de agua. Se utilizaron aproximadamente 10 mg de muestra por valoración y se hicieron determinaciones por duplicado.

Solubilidad termodinámica acuosa por HPLC

Se determinó la solubilidad acuosa suspendiendo suficiente compuesto en 0,25 mL de agua para dar una concentración máxima final ≥ 10 mg/mL del compuesto parental en forma libre. La suspensión se equilibró a 25 ºC 15 durante 24 h, y después se midió el pH. Se filtró entonces la suspensión a través de un filtro de fibra de vidrio C a una placa de 96 pocillos. Se diluyó entonces el filtrado por un factor de 101. La cuantificación se realizó por HPLC con referencia a una solución estándar de aproximadamente 0,1 mg/mL en DMSO. Se inyectaron diferentes volúmenes de las soluciones de muestras estándar, diluidas y sin diluir. Se calculó la solubilidad usando las áreas de los picos determinadas por integración del pico encontrado en el mismo tiempo de retención que el pico principal de

20 la inyección estándar. Cuando hubo suficiente sólido en la placa filtrante, se recogió el XRPD.

Detalles del método genérico para el método termodinámico de solubilidad acuosa

Tipo de método

Fase inversa con elución en gradiente

Columna:

Phenomenex Luna C18 (2) 5 µm 50x 4.6 mm

Temperatura de la columna (ºC):

25

Inyección (µL)

5, 8 y 50

Detección: Longitud de onda, amplitud de banda (nm)

260,80

Caudal (mL/min)

2

Fase A

TFA al 0,1 % en agua

Fase B

TFA al 0,085 % en acetonitrilo

Horario

Tiempo(min) % de Fase A % de Fase B

0,0

95 5

1,0

80 20

2,3

5 95

3,3

5 95

3,5

95 5

4,4

95 5

Pureza química por HPLC

El análisis de pureza se realizó sobre un sistema Agilent HP1100 series equipado con un detector de matriz de diodos y utilizando software ChemStation v9. Se usó uno de los dos métodos detallados a continuación. Método 1

Tipo de método:

Fase inversa con elución en gradiente

Columna:

Kromasil 5 µm C18, 150 x 4,6 mm

Temperatura de columna (ºC)

26

Inyección (µL)

10

Detección: Longitud de onda, amplitud de banda (nm)

302, 8

Caudal (mL/min)

1,0

Fase A:

KH2PO4 0,0256 M + sal sódica de ácido 1-hexanosulfonico 0,02 M

Fase B:

Acetonitrilo

Horario:

Tiempo (min) % de Fase A % de Fase B

0

90 10

8

90 10

40

10 90

41

90 10

49

90 10

50

90 10

Método 2

Tipo de método

Fase inversa con elución en gradiente

Columna:

Phenomenex Luna C18 (2) 150 x 4,6 mm, 5 µm

Temperatura de la columna (ºC):

25

Inyección (µL)

5

Detección: Longitud de onda, amplitud de banda (nm)

255, 90

Caudal (mL/min)

1

Fase A

TFA al 0,1 % en agua

Fase B

TFA al 0,085 % en acetonitrilo

Horario

Tiempo(min) % de Fase A % de Fase B

0

95 5

25

5 95

25,2

95 5

30

95 5

Cromatografía iónica

10 Los datos se recogieron en un Metrohm 861 Advanced Compact IC utilizando el software IC Net v2.3. Las muestras se prepararon como soluciones madre de 1000 ppm en agua. Cuando la solubilidad de la muestra era baja, se utilizó un codisolvente adecuado tal como DMSO. Las muestras se diluyeron a 50 ppm o 100 ppm con un disolvente apropiado antes del ensayo. La cuantificación se logró por comparación con soluciones estándar de concentración conocida del ion a analizar.

15 Método de cromatografía iónica para aniones

imagen14

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

α7. Los valores EC50 de los agonistas de las publicaciones científicas fueron comparables a los obtenidos utilizando este método (véase Dunlop et al. Biochem Pharmacol en prensa (2007) y materiales Dynaflow online (www.cellectricon.com).

Las corrientes de las células completas registradas con un amplificador Axopatch 700A se filtraron a 1 kHz y se muestrearon a 5 kHz mediante una tarjeta PCI (National Instrument). Comparadas con estudios previos, las soluciones salinas se modificaron como se indica para aumentar la estabilidad de la corriente. Las células se registraron a temperatura ambiente en el siguiente medio extracelular: NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM. MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM. ajustado a pH 7,4 con NaOH acuoso. Se llenaron electrodos de borosilicato (3 -5 MΩ) con el siguiente medio: TRIS fosfato 130 mM, NaCl 5 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM, EGTA 10 mM, ajustado a pH 7,4 con KOH acuoso (véase Wu et al., J. Physiol. 576:103-118 (2006)). En estas condiciones, la actividad de macrocorriente obtenida con el registro de células completas y NNR dura hasta 60 min cuando es provocada con una concentración 1000 µM de acetilcolina (ACh).

Los procedimientos de manipulación celular se adoptaron de las notas de aplicación de Cellectricon para Dynaflow. En resumen, después de retirar del incubador, se lavaron las células cuidadosamente tres veces con medio de registro y se colocaron sobre la platina de un microscopio invertido Zeiss. Fue necesaria una media de 5 min antes de que se estableciera la configuración de registro de las células enteras. Para evitar la modificación de las condiciones celulares, se registró una única célula por carga única de células en un chip de silicio Dynaflow. No se pudieron detectar diferencias en la fracción de células sensibles, entre las condiciones experimentales. Más del 95 % de las células respondieron a ACh, y cada célula que presenta una corriente medible fue tenida en cuenta. Las células se mantuvieron a -60 mV durante todo el experimento. Todas las soluciones de los artículos de ensayo se prepararon diariamente a partir de soluciones madre. Se realizaron a diario nuevas soluciones madre de acetilcolina (ACh) en solución de Ringer y se diluyeron. Las curvas dosis-respuesta se describieron por ecuaciones simples de Hill utilizando el software Prism 5.0.

Los oocitos de Xenopus que expresan NNR α7 humano se prepararon como se describe por Papke and Papke, Brit.

J. Pharmacol. 137: 49-61 (2002). Se usaron hembras maduras (> 9 cm) de sapo africano Xenopus leavis (Nasco, Ft. Atkinson, WI) como fuente de oocitos. Antes de la cirugía, los sapos fueron anestesiados colocando el animal en una solución de 1,5 g/L de éster etílico de ácido 3-aminobenzoico durante 30 min. Los oocitos fueron retirados mediante una incisión hecha en el abdomen.

Con el fin de retirar la capa de células foliculares, los oocitos recogidos se trataron con 1,25 mg/mL de colagenasa de Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ) durante 2 horas a temperatura ambiente en solución de Barth libre de calcio (NaCl 88 mM, KCl 1 mM, HEPES 15 mM, pH 7,6, MgSO4 0,81 mM, NaHCO3 2,38 mM, 0,1 mg/mL de sulfato de gentamicina). Posteriormente, se aislaron capas de 5 oocitos y se inyectaron con 50 nL (5-20 ng) de cada uno de los ARNc α7 humanos. Se hicieron registros 2 a 7 días después de la inyección. Se prepararon cada día nuevas soluciones madre de acetilcolina (ACh) en solución de Ringer.

Se realizaron experimentos utilizando OpusXpress 6000A (Axon Instruments, Union City CA). OpusXpress es un sistema integrado que proporciona empalamiento y fijación de voltaje automatizado de hasta ocho oocitos en paralelo. Ambos electrodos de tensión y corriente se rellenaron con KCl 3 M. Las células se sometieron a fijación de voltaje a un potencial de mantenimiento de -60mV. Se recogieron datos a 50 Hz y se filtraron a 20 Hz. Las células se sometieron a perfusión en baño con solución Ringer, y se administraron las soluciones agonistas desde una placa de 96 pocillos a través de puntas de pipeta desechables, lo que eliminó cualquier posibilidad de contaminación cruzada. Los caudales se fijaron en 2 mL/min. Las aplicaciones de fármacos se alternaron entre los controles de ACh y los agonistas experimentales. Las aplicaciones fueron de 12 segundos de duración seguidas por periodos de lavado de 181 segundos.

Las respuestas se calcularon como carga neta (véase Papke and Papke, Brit. J. Pharmacol 137: 49-61 (2002), citado antes) para los receptores α7. Cada oocito recibió una aplicación inicial de control, de ACh, después una aplicación de un fármaco experimental y, después una aplicación de control de seguimiento de ACh (300 µM). Las respuestas a las aplicaciones de fármacos experimentales se calcularon con respecto a las respuestas precedentes de control de ACh con el fin de normalizar los datos, compensando los diferentes niveles de canal de expresión entre los oocitos. Nótese que ACh 300 µM produjo respuestas máximas de carga neta de los receptores α7 por lo que la normalización con respecto a los controles de ACh efectivamente normalizó los datos con respecto a las respuestas máximas de ACh. Las medias y los errores estándar (SEM) se calcularon a partir de las respuestas normalizadas de al menos cuatro oocitos para cada concentración experimental. Para las relaciones concentraciónrespuesta, se representaron gráficamente los datos derivados de análisis de carga neta utilizando Kaleidagraph 3,0.2 (Abelbeck Software, Reading, PA), y se generaron las curvas a partir de la ecuación de Hill.

La caracterización del comportamiento del Compuesto A se llevó a cabo según los siguientes protocolos. La tarea de reconocimiento de objetos (OR) se realizó de acuerdo con la descripción de Ennaceur and Delacour Behav. Brain Res. 100: 85-92 (1988). El paradigma de laberinto de brazos radiales (RAM) se realizó de acuerdo con la descripción de Levin et al., Behav. Pharm. 10: 675-680 (1999). El ensayo de inhibición pre-pulso (PPI) se realizó según la descripción de Suemaru et al., Brit. J. Pharmacol. 142 (5): 843-850 (2004). La inversión del ensayo de

imagen15

cognición. El Compuesto A demostró una potente actividad en el paradigma de reconocimiento de objetos en ratas, tanto después de administración i.p. (intraperitoneal, Figura 3) como p.o (oral, Figura 4), y también demostró actividad en un amplio intervalo de dosis tras administración oral (Figura 4). Administrado por vía intraperitoneal a las mismas dosis bajas (0,3 y 1 mg/kg) el Compuesto A tiende a invertir las deficiencias, inducidas por MK-801, en la 5 tarea de reconocimiento de objetos (OR) (Figura 5), y administrado oralmente a 0,3 mg/kg, los efectos cognitivos del Compuesto A duran por lo menos 18 horas (Figura 6). En el paradigma del laberinto de brazos radiales (RAM) (Figura 7) que examina la memoria de trabajo, el Compuesto A aumentó significativamente el número de elecciones correctas antes de dar error. Estos resultados muestran el potencial de (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)-1azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida para tratar deficiencias y disfunciones cognitivas asociadas con

10 esquizofrenia, incluidas las de la memoria de trabajo.

Para que un compuesto sea útil para tratar la disfunción cognitiva en esquizofrenia, no debe disminuir los efectos de los antipsicóticos clásicos o atípicos contra los síntomas positivos de esquizofrenia. Por lo tanto, es apremiante que, además de sus propiedades de mejora cognitiva, el Compuesto A muestre también eficacia en la inversión de la actividad locomotora inducida por la apomorfinita (APO LOCO) (Figura 8) y en la inhibición pre-pulso (PPI) (Figura

15 9), modelos de síntomas positivos de esquizofrenia. Por ello, se debe esperar que la (2S,3R)-N-(2-((3-piridinil)metil)1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)benzofuran-2-carboxamida proporcione un beneficio adicional contra los síntomas positivos, así como también contra los síntomas cognitivos, asociados con esquizofrenia.

Las respuestas farmacológicas específicas observadas pueden variar de acuerdo con y dependiendo del compuesto activo particular seleccionado o de si hay o no presentes vehículos farmacéuticos, así como del tipo de formulación y

20 modo de administración empleados, y tales variaciones o diferencias esperadas en los resultados se contemplan de acuerdo con la práctica de la presente invención.

Claims (1)

1. imagen1