ES2585357T3 - Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C - Google Patents

Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C Download PDF

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Abstract

Un compuesto que tiene la formula:**Fórmula** o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo, en la que: R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, X1- (carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C8- (carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; o R4 yR5 forman conjuntamente un anillo carbociclico y tienen la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina con una cadena lateral de aminoacido modificado en donde el resto de bioisostero de fenilalanina**Fórmula** es en la que R9 es H; R10 es bencilo; R11 es H; Z2 es CO2H; el subindice n es un numero entero de 0 a 2; y el subindice o es un numero entero de 0 a 2 a condicion de que n + o sea al menos 1.

Description

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El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena polipeptídica. Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los
5 dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más en detalle en, por ejemplo, el documento EP 0 404 097; el documento WO 93/11161; y Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de región marco conservada (RMC) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los
15 correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las RMC son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
25 Como se usa en el presente documento, "aislado" significa separado de otros componentes de (a) una fuente natural, tal como una célula vegetal o animal o cultivo celular o (b) una mezcla de reacción química de síntesis orgánica. En el presente documento, "purificado" significa que cuando se aísla, el aislado contiene al menos el 95 % y en otro aspecto, al menos el 98 %, de un compuesto (por ejemplo, un conjugado) en peso del aislado.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95 % en peso de anticuerpo como se determina por el método de Lowry y más preferentemente más del 99 % en peso, (2) hasta un grado
35 suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando Coomassie azul o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés es aquel capaz de unirse a ese antígeno con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo sea útil en la selección de una célula que exprese el antígeno.
45 Un anticuerpo que "induce apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada como se determina mediante la unión de anexina V, la fragmentación del ADN, la contracción celular, la dilatación del retículo endoplásmico, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos). La célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas o vejiga. Hay disponibles diversos métodos para evaluar los acontecimientos celulares asociados a la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse mediante la unión de anexina; la fragmentación de ADN puede evaluarse a través del encadenamiento de ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación del ADN pueden evaluarse mediante cualquier incremento en las células hipodiploides.
55 La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados al cáncer. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia puede, por ejemplo, medirse mediante la evaluación del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TPE) y/o la determinación de la tasa de respuesta (TR).
65 La expresión "cantidad sustancial" se refiere a una mayoría, es decir, > 50 % de una población, de una colección o una muestra.
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Una "enfermedad autoinmune" en el presente documento es una enfermedad o trastorno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un co-segregado o manifestación de la misma o afección resultante de ello. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a la artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante), la psoriasis, la 5 dermatitis incluyendo la dermatitis atópica; la urticaria idiopática crónica, incluyendo la urticaria crónica autoinmune, la polimiositis/dermatomiositis, la necrólisis epidérmica tóxica, la esclerodermia y la esclerosis sistémicas, las respuestas asociadas a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa) y la EII con co-segregado de pioderma gangrenoso, el eritema nodoso, la colangitis esclerosante primaria, y/o la episcleritis), el síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), la meningitis, las enfermedades mediadas por IgE tales como la anafilaxia y la rinitis alérgica, la encefalitis, tal como la encefalitis de Rasmussen, la uveítis, la colitis tal como la colitis microscópica y la colitis colagenosa, la glomerulonefritis (GN) tal como la GN membranosa, la GN membranosa idiopática, la GN membranosa proliferativa (GNMP), incluyendo la de Tipo I y la de Tipo II y la GN rápidamente progresiva, las afecciones alérgicas, el eczema, el asma, las afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y las respuestas inflamatorias crónicas, la 15 aterosclerosis, la miocarditis autoinmune, la deficiencia de adhesión de los leucocitos, el lupus eritematoso sistémico (LES) tal como el LES cutáneo, el lupus (incluyendo la nefritis, la cerebritis, el pediátrico, el no renal, el discoide, la alopecia), la diabetes de inicio juvenil, la esclerosis múltiple (EM), tal como la EM espino-óptica, la encefalomielitis alérgica, las respuestas inmunológicas asociadas a la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, la tuberculosis, la sarcoidosis, la granulomatosis, incluyendo la granulomatosis de Wegener, la agranulocitosis, la vasculitis (incluyendo la vasculitis de vasos grandes (incluyendo la polimialgia reumática y la arteritis de células gigantes (de Takayasu)), la vasculitis de vasos medianos (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa), la vasculitis del SNC y la vasculitis asociada a ANCA, tal como la vasculitis o el síndrome de Churg-Strauss (SCS)), la anemia aplásica, la anemia de Coombs positiva, la anemia de Diamond Blackfan, la anemia hemolítica inmunitaria incluyendo la anemia hemolítica autoinmune (AHAI), la anemia perniciosa, l aplasia 25 pura de células rojas (APCR), la deficiencia del factor VIII, la hemofilia A, la neutropenia autoinmune, la pancitopenia, la leucopenia, las enfermedades que implican diapédesis de leucocitos, los trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, el síndrome de lesión de múltiples órganos, la miastenia grave, las enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, la enfermedad de la membrana basal anti-glomerular, el síndrome de los anticuerpos antifosfolípidos, la neuritis alérgica, la enfermedad de Bechet, el síndrome de Castleman, el síndrome de Goodpasture, el síndrome miasténico de Lambert-Eaton, el síndrome de Raynaud, el síndrome de Sjorgen, el síndrome de Stevens-Johnson, el rechazo del trasplante de órganos sólidos (incluyendo el tratamiento previo para los títulos de anticuerpos reactivos de panel alto, el depósito de IgA en los tejidos y el rechazo que surge del trasplante renal, el trasplante de hígado, el trasplante intestinal, el trasplante cardíaco, etc.), la enfermedad del injerto contra hospedador (EICH), el penfigoide ampollar, el pénfigo (incluyendo el vulgar, el foliáceo y la mucosidad 35 penfigosa-pénfigo de membrana), las poliendocrinopatías autoinmunes, la enfermedad de Reiter, el síndrome del hombre rígido, la nefritis por complejos inmunes, las polineuropatías por IgM o la neuropatía mediada por IgM, la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), la trombocitopenia (desarrollada por los pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo la trombocitopenia autoinmune, la enfermedad autoinmune del testículo y el ovario incluyendo la orquitis y la ooforitis autoinmunes, el hipotiroidismo primario; las enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo la tiroiditis autoinmune, la tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), la tiroiditis subaguda, el hipotiroidismo idiopático, la enfermedad de Addison, la enfermedad de Grave, los síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), la diabetes de tipo I también conocida como diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), incluyendo la IDDM pediátrica y el síndrome de Sheehan; la hepatitis autoinmune, la neumonitis intersticial linfoide (VIH), la bronquiolitis obliterante (no
45 trasplantados) vs NSIP, el síndrome de Guillain-Barré, la enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), la cirrosis biliar primaria, el esprúe celíaco (enteropatía por gluten), el esprúe refractario con co-segregado de dermatitis herpetiforme, la crioglobulinemia, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig), la arteriopatía coronaria, la enfermedad autoinmune del oído interno (EAOI), la pérdida de la audición autoinmune, el síndrome de mioclonía opsoclonía (SMO), la policondritis tal como la policondritis refractaria, la proteinosis alveolar pulmonar, la amiloidosis, la hepatitis de células gigantes, la escleritis, la gammapatía monoclonal de significado incierto/desconocido (GMSI), la neuropatía periférica, el síndrome paraneoplásico, las canalopatías tales como la epilepsia, la migraña, las arritmias, los trastornos musculares, la sordera, la ceguera, la parálisis periódica y las canalopatías del sistema nervioso central; el autismo, la miopatía inflamatoria y la glomerulosclerosis segmentaria focal (GSF).
55 El término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado que tiene del número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, "alquilo C1-C8" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono). Cuando no se indica el número de átomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-C8" representativos de cadena lineal incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo; mientras que los alquilos C1-C8 ramificados incluyen, pero no se limitan a, -isopropilo, -secbutilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo y 2-metilbutilo; los alquilos C1-C8 insaturados incluyen, pero no se limitan a, -vinilo, -alilo, -1-butenilo,-2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, 2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo y -3-metil-1-butinilo. Un grupo alquilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno
65 o más grupos incluyendo, pero no limitados a, -O-(alquilo C1-C8), arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -OH -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -SR', -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN;
donde cada R' se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C8 sin sustituir y arilo.
"Alquenilo" se refiere a un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, 5 pero no se limitan a: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7), y 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2).
"Alquinilo" se refiere a un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: acetilénico (-C≡CH) y propargilo (-CH2C≡CH).
"Alquileno" se refiere a un radical hidrocarbonado saturado de cadena ramificada o lineal, o cíclico, de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alcano parental. Los radicales
15 alquileno típicos incluyen, pero no se limitan a: metileno (-CH2-), 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) y similares. Un "alquileno C1-C10" es un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal, de fórmula -(CH2)1-10-. Los ejemplos de un alquileno C1-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarbonado insaturado de cadena ramificada o lineal, o cíclico, de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alqueno parental. Los radicales alquenileno típicos incluyen, pero no se limitan a: 1,2-etileno (-CH=CH-).
25 "Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarbonado insaturado de cadena ramificada o lineal, o cíclico, de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alquino parental. Los radicales alquinileno típicos incluyen, pero no se limitan a: acetileno (-C≡C-), propargilo (-CH2C≡C-) y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C≡CH-)
"Arilo" significa un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático parental. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Los grupos arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y 35 similares. Un grupo aromático carbocíclico (arilo) o un grupo aromático heterocíclico (heteroarilo) puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos incluyendo, pero no limitados a alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2,NH(R'), -N(R')2 y -CN; en la que cada R' se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C8 y arilo sin sustituir.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está reemplazado por un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo
45 tiene de 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo tiene de 6 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está reemplazado por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y el resto heteroarilo tiene de 5 a 14 átomos en el anillo, por lo general de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S, siendo el resto átomos de carbono. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tenga de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S) o un
55 biciclo que tenga de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, o, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
"Alquilo sustituido", "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo y arilalquilo respectivamente, en los que uno o más átomos de hidrógeno están reemplazados cada uno independientemente por un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen, pero no se limitan a, -X, -R, -O, -OR, -SR, -S, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, -PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2 o -C(=NR)NR2, donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o I; y cada R es independientemente H, alquilo C1-C20, arilo C6-C20, heterociclo C3-C14, un
65 grupo protector o un resto de profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno como se han descrito anteriormente también pueden estar sustituidos de manera similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refieren a un sistema de anillo en el que uno o más átomos del anillo son un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende de 1 a 20 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tenga de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y
5 S) o un biciclo que tenga de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5 ], [5,5], [5,6] o [6,6].
Se describen heterociclos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente los capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, desde 1950 hasta el presente), en particular los volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566
Los ejemplos de heterociclos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo con azufre oxidado, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo,
15 pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bistetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoílo.
25 A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, la posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, la posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, la posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, la posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, la posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, la posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, la posición 2 o 3 de una aziridina, la posición 2, 3 o 4 de una azetidina, la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de un quinolina o la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aún más normalmente, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5tiazolilo.
35 A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, la posición 2 de un isoindol o isoindolina, la posición 4 de una morfolina y la posición 9 de un carbazol o β-carbolina. Aún más normalmente, los heterociclos unidos a nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo y 1-piperidinilo.
Un "heterociclo C3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el que de uno a cuatro de los átomos de carbono del anillo están reemplazados independientemente por un heteroátomo del grupo que consiste
45 en O, S y N. Los ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, pero no se limitan a, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con hasta siete grupos incluyendo, pero no limitados a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo. "Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en el que uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo está reemplazado por un enlace. Un heterociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con hasta seis grupos, incluyendo, pero no limitados a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2
55 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y-CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o de 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos en el anillo, aún más normalmente 5 o 6 átomos en el anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos en el anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos de anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocíclico no aromático saturado o
65 insaturado de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4
imagen8
imagen9
imagen10
imagen11
en las que
imagen12representa un enlace sencillo o doble;
R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H y un grupo protector de amino;
5R10 se selecciona entre el grupo que consiste en H y -(CR13R14)xR15; cada R11 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halógeno, arilo, arilalquilo C1-C20, haloalquilo C1-C10, OR16 y N(R16)2;
R12
se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halógeno, arilo, aril-alquilo C1-C20, arilalquenilo C2-C20, aril-alquinilo C2-C20, OR16, N(R16)2 y -C(O)R16;
10 cada R13 y R14 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halógeno, arilalquilo, haloalquilo C1-C10, OR16, SR16, N(R16)2, -OC(O)R16, -N(R16)C(O)R16, -COOR16, -CON(R16)2,X1-SO3H, X1-SO3-alquilo C1-C20,X1-OSO3H, X1-OSO3-alquilo C1-C20,X1-SO2-alquilo C1-C20,X1-SO-alquilo C1-C20,OP(O)(OR16)2, -OP(O)(NR16)2, -OP(O)N(R16)2O16 , -OP(O)(R16)OR16 , -OP(O)(R16)N(R16)2, -P(O)(OR16)2,P(O)(NR16)2, -P(O)N(R16)2OR16, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo
15 C3-C20 y X1-heterociclo C3-C8;
oR13 y R14 se combinan entre sí para formar un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en =O, =NNH-R17, =N-NH-C(O)-R17 y un carbociclo C3-C8; cada R15 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20,X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2,
20 C(O)R16 eY1(CR13R14)xR18; y las porciones de carbociclo, arilo y heterociclo están opcionalmente sustituidas con de uno a tres grupos R12 . cada R16 es independientemente H o alquilo C1-C20;
R17
se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y X1-heterociclo C3-C8;
25 cada R18 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20,X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2 y -C(O)R16; Y1 es O, S, NR16, SO, SO2 o Se; cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; el subíndice x es un número entero de 0 a 10;
30 los subíndices n, o, q, r, s, t y u son independientemente números enteros de 0 a 2; Z2 es COZ3R19; Z3 es O, S, NH o NR20,en el que R20 es alquilo C1-C8; R19 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(X1O)v-R22, OR-(X1O)v-CH(R23)2; v es un número entero que varía de 1 a 1000;
35 R22 es H o alquilo C1-C8; cada R23 es independientemente H, COOH, -(CH2)1-N(R24)2, -(CH2)1-SO3H o -(CH2)1-SO3-alquilo C1-C8;y cada R24 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)1-COOH; dónde; 1 es un número entero que varía de 0 a 6; a condición de que cuando n y o sean 0 y R11 es H, entonces R10 sea distinto de arilo-CH2 o CH2-heterociclo C3-C8.
40 En una realización, R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclilo C3-C8,X1-arilo, X1(carbociclilo C3-C8) y X1-heterociclilo C3-C8. En otra realización R9 es H.
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en la que R12 se selecciona entre el grupo: H, alquilo, halógeno, amino, carboxi, amido, carboetoxi, formilo, fenilo, E2-feniletenilo, Z-2-feniletenilo y 2-feniletinilo.
En un grupo de realizaciones, el resto de bioisóstero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
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10 En una realización, el resto de bioisóstero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
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en la que Z2 es CO2H; R12 es como se ha descrito anteriormente; y los subíndices q, r y s son independientemente números enteros de 1 a 3.
En una realización, el resto de bioisóstero de fenilalanina es
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En un aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona conjugados en los que los compuestos comprenden adicionalmente una unidad de enlazador (LU), teniendo los conjugados la fórmula: 10 L-(LU-(D)1-4)p
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que L es una unidad de ligando; -LU- es una unidad de enlazador; y D es una unidad de fármaco, como se expone en el presente documento.
15 En otro aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona conjugados que tienen la fórmula:
LU-(D)1-4
20 o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que, -LU- es una unidad de enlazador; y D es un resto de fármaco que tiene la Fórmula D:
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25 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, se proporcionan conjugados fármaco-enlazador-ligando que tienen la fórmula la:
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o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que L-es una unidad de ligando; -AA-Ww-Yy- es una unidad de enlazador (LU), en la que --A-es una unidad de extensor, el subíndice a es 0 o 1, cada -W-es independientemente una unidad de aminoácidos, w es un número entero que varía de 0 a 12, -Y- es una unidad de espaciador, e y es 0, 1 o 2; p es un número entero de 1 a aproximadamente 20; y D es una unidad de fármaco que
35 tiene la Fórmula D:
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en la que R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;R3 se selecciona entre el grupo que
40 consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8,X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; o R4 yR5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n-, enel que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se
45 selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo
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Otra unidad de extensor ilustrativa más es la de Fórmula IIIb en la que R17 es -(CH2)5-:
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En otra realización, la unidad de extensor se enlaza a la unidad de ligando mediante un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de ligando y un átomo de azufre de la unidad de extensor. Una unidad de extensor representativa de esta realización se representa dentro de los corchetes de la fórmula IV, en la que R17, L-, -W-, -Y-,
10 -D, w e y son como se han definido anteriormente.
L-[S-R17-C(O)-Ww-Yy-D]p IV
En otra realización más, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un
15 grupo amino primario o secundario de un ligando. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero no se limitan a, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Se representan unidades de extensor representativas de esta realización dentro de los corchetes de las Fórmulas VaVc, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente;
20 L-[C(O)NH-R17-C(O)-Ww-Yy-D]p Va
L-[C(S)NH-R17-C(O)-Ww-Yy-D]p Vb
25 L-[C(O)-R17-C(O)-Ww-Yy-D]p Vc
En otro aspecto más, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que es reactivo a un grupo de hidrato de carbono modificado (-CHO) que puede estar presente en un ligando. Por ejemplo, un hidrato de carbono puede oxidarse suavemente usando un reactivo tal como peryodato de sodio y la unidad de hidrato de carbono oxidado (
30 CHO) resultante puede condensarse con un extensor que contenga un grupo funcional tal como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina y una arilhidrazida tal como las descritas por Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem 2:133-41. Se representan unidades de extensor representativas de esta realización dentro de los corchetes de las Fórmulas VIa, VIb y VIc, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
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La unidad de aminoácido
La unidad de aminoácido (-W-), cuando está presente, enlaza la unidad de extensor a la unidad de espaciador si la
45 unidad de espaciador está presente, enlaza la unidad de extensor al resto de fármaco si la unidad de espaciador está ausente y enlaza la unidad de ligando a la unidad de fármaco si la unidad de extensor y la unidad de espaciador están ausentes.
Ww-es una unidad de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido,
50 nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad -W- tiene independientemente la fórmula indicada a continuación en los corchetes y w es un número entero que varía de 0 a 12:
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Otros ejemplos de espaciadores autodestructivos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similar al grupo PAB tales como los derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (véase, por ejemplo, Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse espaciadores que experimenten ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico 5 sustituidas y sin sustituir (véase, por ejemplo, Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (véase, por ejemplo, Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815). y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (véase, por ejemplo, Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Eliminación de los fármacos que contienen aminas que están sustituidas en la posición α de glicina (véase, por ejemplo, Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) son también ejemplos de espaciador
10 autodestructivo útil en compuestos a modo de ejemplo.
En una realización, la unidad de espaciador es una unidad de bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado como se representa en el Esquema 4, que puede usarse para incorporar y liberar múltiples fármacos.
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15 en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0 a 4; n es 0 o 1; y p varía de 1 a aproximadamente 20. 20 En una realización, los restos -D son iguales. En otra realización más, los restos -D son diferentes. En un aspecto, las unidades de espaciador (-Yy-) se representan por las fórmulas (X)(XII):
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en la que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4;
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y
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35 Las realizaciones de los compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco de Fórmula Ia' incluyen:
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proteolítica, enlace a una unidad de anticuerpo celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, la escisión química específica, la acetilación, la formilación, la síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. De forma adicional, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales.
5 Los anticuerpos pueden tener modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones) en restos de aminoácidos que interactúan con receptores Fc. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en los restos de aminoácidos identificados como que están implicados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 97/34631).
Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa puede obtenerse en el mercado o producirse mediante cualquier método conocido para un experto en la materia tal como, por ejemplo, la síntesis química o las técnicas de expresión recombinantes. La secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos
15 GenBank o de una base de datos como esta, las publicaciones de la bibliografía o por clonación y secuenciación sistemáticas.
En una realización específica, pueden usarse anticuerpos conocidos para el tratamiento o prevención del cáncer. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa pueden obtenerse en el mercado o producirse mediante cualquier método conocido para un experto en la materia tal como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinantes. La secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos como esta, las publicaciones de la bibliografía o por clonación y secuenciación sistemáticas. Los ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, RITUXAN® (rituximab; 25 Genentech) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin; OVAREX que es un anticuerpo murino para el tratamiento del cáncer de ovario; PANOREX (Glaxo Wellcome, NC), que es un anticuerpo de IgG2a murino para el tratamiento del cáncer colorrectal; Cetuximab ERBITUX (Imclone Systems Inc., NY) que es un anticuerpo quimérico de IgG anti-EGFR para el tratamiento de cánceres positivos para el factor de crecimiento epidérmico, tales como el cáncer de cabeza y cuello; Vitaxin (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo humanizado para el tratamiento del sarcoma; CAMPATH I/H (LeukoSite, MA) que es un anticuerpo de IgG1 humanizado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (LLC); SMART MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA) y SGN-33 (Seattle Genetics, Inc., WA) que es un anticuerpo de IgG anti-CD33 humanizado para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA); LYMPHOCIDE (Immunomedics, Inc., NJ), que es un anticuerpo de IgG anti-CD22 humanizado para el tratamiento del linfoma no
35 Hodgkin; SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; ONCOLYM (Techniclone, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR10 murino radiomarcado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; ALLOMUNE (Bio Transplant, CA) que es un mAb anti-CD2 humanizado para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin o del linfoma no Hodgkin; AVASTIN (Genentech, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-VEGF humanizado para el tratamiento del cáncer de pulmón y el colorrectal; EPRATUZAMAB (Immunomedics, Inc., NJ y Amgen, CA) que es un anticuerpo anti-CD22 para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; y CEACIDE (Immunomedics, NJ), que es un anticuerpo humanizado anti-CEA para el tratamiento del cáncer colorrectal.
Otros anticuerpos útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos contra los
45 siguientes antígenos (donde los cánceres a modo de ejemplo que pueden tratarse con el anticuerpo están entre paréntesis): CA125 (ovario), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), fetoproteína alfa (carcinomas), CA 242 (colorrectal), fosfatasa alcalina placentaria (carcinomas), antígeno específico de la próstata (próstata), antígeno de membrana específico de la próstata (próstata), fosfatasa ácida prostática (próstata), factor de crecimiento epidérmico (carcinomas), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), receptor de anti-transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1-KLH (cáncer de mama), CEA (colorrectal), gp100 (melanoma), MART1 (melanoma), receptor de IL-2 (leucemia y linfomas de linfocitos T), CD20 (linfoma no Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 (linfoma), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiple), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma) y producto del oncogén Neu (carcinomas).
55 Algunos anticuerpos específicos útiles incluyen, pero no se limitan a, mAb BR96 (Trail et al., 1993, Science 261: 212-215), BR64 (Trail et al., 1997, Cancer Research 57: 100-105), mAb contra el antígeno CD40, tales como mAb S2C6 (Francisco et al., 2000, Cancer Res 60: 3.225-3.231), mAb contra el antígeno CD70, tales como mAb 1F6, mAb 1F6 humanizado, mAb 2F2 y mAb 2F2 humanizado (véase, por ejemplo, la Solicitud Internacional Publicada n.º WO 04/073656 y la solicitud publicada de los EE.UU. n.º 2006-0083736) y mAb contra el antígeno CD30, tales como AC10 (Bowen et al., 1993, J. Immunol 151:5896-5906; Wahl et al., 2002 Cancer Res 62 (13): 3736-42) y MDX-060. Pueden usarse muchos otros anticuerpos de internalización que se unen a antígenos asociados a tumores y se han revisado (véase, por ejemplo, Franke et al., 2000, Cancer Biother Radiopharm 15, 459-76; Murray, 2000, Semin Oncol. 27:64-70; Breitling y Dubel, Recombinant Antibodies, John Wiley y Sons, Nueva York, 1998).
65 En otra realización específica, los anticuerpos para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune se usan de acuerdo con las composiciones y métodos de la divulgación. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un
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procesamiento post-traduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse estirpes celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto del gen. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO (por ejemplo, DG44), VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst .
Para el largo plazo, se utiliza normalmente la producción de alto rendimiento de proteínas recombinantes, la expresión estable. Por ejemplo, las estirpes celulares que expresan de manera estable un anticuerpo pueden modificarse por ingeniería genética. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células manipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y, después, se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en estirpes celulares. Este método puede usarse ventajosamente para obtener por ingeniería genética estirpes celulares que expresen el anticuerpo. Dichas estirpes celulares modificadas por ingeniería genética pueden ser particularmente útiles en la exploración y la evaluación de los antígenos tumorales que interactúan directamente o indirectamente con el anticuerpo.
Pueden usarse una serie de sistemas de selección, incluyendo pero no limitados a los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple de (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 48: 202) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) en células tk, hgprto aprt-, respectivamente. También, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como la base de selección para los siguientes genes: DHFR, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy
3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann Rev. Pharmacol Toxicology 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann Rev. Biochem 62: 191-217; Mayo de 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Se describen métodos habitualmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante que puede usarse en Ausubel et al. (citado anteriormente; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nueva York; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol Biol 150: 1).
Los niveles de expresión de un anticuerpo pueden incrementarse mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedador aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada a la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (véase, por ejemplo, Crouse et al., 1983, Mol Cell Biol 3: 257).
La célula hospedadora puede co-transfectarse con dos vectores de expresión, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten igual expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, un único vector puede usarse para codificar ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera se coloca normalmente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (véase, por ejemplo, Proudfoot, 1986, Nature
322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 2197). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que el anticuerpo se ha expresado de forma recombinante, puede purificarse usando cualquier método conocido en la técnica para la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.
En otra realización a modo de ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
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También se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos en la bibliografía. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando unión química. Brennan et al., 1985, Science, 229: 81 describe un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinde proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 217-225 describen la producción de un anticuerpo biespecífico completamente humanizado molécula F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.
También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148 (5): 1547-1553. Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede usarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios de VH y VL de un fragmento están obligados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros de cadena simple Fv (sFv). Véase Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152: 5368.
Se consideran anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos
Se consideran la modificación o modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritas en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se preparan variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo o mediante la síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo, tales como cambiar el número
o posición de los sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones favorecidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis de rastreo con alanina", como se describe por Cunningham y Wells, 1989, Science, 244: 1081-1085. En este caso, se identifican un resto o un grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones después se refinan introduciendo más u otras variantes en o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, el rastreo con ala
o la mutagénesis aleatoria se realizan en el codón o región diana y las variantes de anticuerpos expresadas se exploran para determinar la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a los extremos N-o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
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Los efectos anti-proliferativos de los conjugados anticuerpo fármaco pueden medirse mediante el ensayo de destrucción celular in vitro y de proliferación celular anterior contra diferentes estirpes celulares de tumor de mama.
Aclaramiento plasmático y estabilidad in vivo
El aclaramiento plasmático farmacocinético y la estabilidad de los conjugados fármaco-enlazador-ligando, tales como los CAF, pueden investigarse en ratas y macacos a lo largo del tiempo. La exploración de conjugados fármaco-enlazador-ligando como los CAF se ejemplifica en el presente documento.
Toxicidad en roedores
Los conjugados anticuerpo fármaco y un control CAF-menos, "vehículo", se evalúan en un modelo de toxicidad aguda en rata. La toxicidad del CAF se investiga mediante el tratamiento de ratas Sprague-Dawley macho y hembra con el CAF y la posterior inspección y análisis de los efectos en diversos órganos. Las observaciones globales incluyen los cambios en el peso corporal y los signos de lesiones y hemorragias. Los parámetros de patología clínica (hematología y química de suero), la histopatología y la necropsia se realizan en animales tratados. Se considera que la pérdida de peso o el cambio de peso con respecto a los animales tratados solamente con vehículo, en los animales después del tratamiento con CAF es un indicador global y general de toxicidad sistémica o localizada.
La hepatotoxicidad se mide por las enzimas hepáticas elevadas, los números aumentados de formas mitóticas y apoptóticas y la necrosis de los hepatocitos. La toxicidad hematolinfoide se observa por el agotamiento de leucocitos, principalmente granulocitos (neutrófilos) y/o plaquetas y la implicación de los órganos linfoides, es decir, la atrofia o la actividad apoptótica. La toxicidad también se observa por lesiones del tracto gastrointestinal, tales como el aumento del número de formas mitóticas y apoptóticas y la enterocolitis degenerativa.
Las enzimas indicativas de lesión hepática que se estudian incluyen:
AST (aspartato aminotransferasa)
Localización: citoplásmica, hígado, corazón, músculo esquelético, riñón Relación hígado:plasma de 7000:1 T1/2: 17 h
ALT (alanina aminotransferasa)
Localización: citoplásmica; hígado, riñón, corazón, músculo esquelético Relación hígado:plasma de 3000:1
T1/2: 42 horas; variación diurna GGT (g-glutamil transferasa) Localización: membrana plasmática de las células con alta capacidad de absorción o de secreción; hígado, riñón, intestino Factor predictivo pobre de lesión hepática; habitualmente elevada en los trastornos de las vías biliares
Toxicidad/Seguridad en macacos
Al igual que en el estudio de toxicidad/seguridad en rata, los macacos se tratan con CAF seguido de mediciones de enzimas hepáticas e inspección y análisis de los efectos en diversos órganos. Las observaciones globales incluyen los cambios en el peso corporal y los signos de lesiones y hemorragias. Los parámetros de patología clínica (hematología y química de suero), la histopatología y la necropsia se realizan en animales tratados.
Síntesis de los compuestos
Los compuestos a modo de ejemplo y conjugados a modo de ejemplo pueden fabricarse usando los procedimientos de síntesis que se esbozan a continuación en los Esquemas 5-16. Como se describe en más detalle a continuación, los compuestos a modo de ejemplo o conjugados a modo de ejemplo pueden prepararse convenientemente usando un enlazador que tenga un sitio reactivo para la unión al fármaco y al ligando. En un aspecto, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo a un grupo nucleófilo presente en un ligando, tal como, pero no limitado a un anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo
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Procedimiento General E: Eliminación de Fmoc usando dietilamina
Un fármaco L protegido con Fmoc se diluye con un disolvente orgánico aprótico tal como diclorometano y a la solución resultante se le añadió dietilamina (½ v/v). El progreso de la reacción se controla por TLC o HPLC y
5 normalmente se completa en 2 h. La mezcla de reacción se concentra al vacío y el residuo resultante se seca azeotrópicamente, preferentemente con tolueno, después se seca a alto vacío para proporcionar fármaco Ib que tiene un grupo amino desprotegido. Por tanto, el método anterior es útil para fármacos que pueden usarse.
Como alternativa, pueden prepararse compuestos de fármaco convenientemente mediante síntesis de péptidos en
10 fase sólida usando la química de Fmoc convencional bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, catálogo de Novabiochem® 2006/2007, Notas de síntesis) como se muestra en el Esquema 6 bis (a continuación). Pueden prepararse aminoácidos protegidos con Fmoc a partir de aminoácidos no protegidos usando, por ejemplo, Fmoc-OSu a través de procedimientos bien establecidos (véase, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Síntesis, segunda edición, 1991, John Wiley & Sons, p. 506).
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Los aminoácidos no están disponibles en el mercado pre-cargados en una resina lábil en medio ácido apropiado, preferentemente resina de 2-clorotritilo, pueden cargarse en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en 20 el Procedimiento general SP(a). La carga puede determinarse mediante el ensayo de cuantificación de Fmoc espectrofotométrico. Los niveles de carga (mmol/g) de aminoácidos disponibles en el mercado pre-cargados en resina de clorotritilo pueden determinarse como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Después, los péptidos entonces pueden ensamblarse en la resina cargada con el primer aminoácido mediante el acoplamiento de Fmoc-Dolaproína usando un agente de acoplamiento apropiado, preferentemente HATU/DIEA, seguido de 25 desprotección de Fmoc y posterior acoplamiento de tripéptido Fmoc-MeVal-Val-Dil. La rutina de acoplamiento en fase sólida está bien establecida en la técnica y se describe en el Procedimiento General SP(c). La desprotección final de los péptidos y la escisión de la resina puede realizarse fácilmente siguiendo el Procedimiento General SP(d).
Procedimiento General SP(a). Carga de la resina
30 Se suspende Fmoc-aminoácido (0,84°mmol) en CH2Cl2 anhidro (4 ml) y DIEA (585 µl, 3,36°mmol, 4 equiv). La mezcla resultante se añade a una jeringa de 10 ml que contiene resina de cloruro de 2-Clorotritilo (500 mg, 0,70°mmol, 1,4°mmol/g). La mezcla se agita durante 6 horas a temperatura ambiente. Después, la resina se filtra, se lava con DCM/MeOH/DIEA (17:2:1; 5 ml, 4 veces), MeOH (5 ml, 1 vez), DCM (5 ml, 2 veces), DMF (5 ml, 2 veces),
35 DCM (5 ml, 2 veces), éter etílico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacío durante 2 h. La resina se deja al vacío durante la noche para producir resina SP1.
La carga se determina mediante la cuantificación de Fmoc. Una cantidad conocida de resina SP1 (4,4 mg) se pesa en un matraz aforado de 10 ml. Al matraz se le transfiere piperidina al 20 %/DMF (2 ml). La mezcla se deja escindir
40 durante 1 h, con agitación ocasional a mano. Al matraz se le transfiere DMF (8 ml) para llevar el volumen total a 10 ml. Se prepara una solución de blanco con 10 ml, piperidina al 20 %/DMF en un matraz aforado de 10 ml. El espectrofotómetro se pone a cero con la solución de blanco. La absorbancia se midió a 301 nm y el nivel de carga viene dado por:
45 Carga (mmol/g) =A301 × 10 ml/7800 × peso
por la que A301 es la absorbancia a 301 nm, 7800 es el coeficiente de extinción del aducto de piperidina-fluorenona y
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Pueden obtenerse enlazadores útiles a través de fuentes comerciales, tales como Molecular BioSciences Inc. (Boulder, CO) o pueden prepararse como se resume en los Esquemas 8-10 a continuación.
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en el que X es -CH2- o -CH2OCH2-; y n es un número entero que varía ya sea de 0 a 10, cuando X es -CH2-; ode 1a 10, cuando X es -CH2OCH2-.
El método mostrado en el Esquema 9 combina maleimida con un glicol en condiciones de Mitsunobu para hacer un extensor de maleimida polietilenglicol (véase, por ejemplo, ejemplo, Walker, 1995, J. Org. Chem. 60, 5352-5), seguido de instalación de un grupo sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo.
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Pueden incorporarse extensores útiles en un enlazador usando los intermedios disponibles en el mercado de Molecular Biosciences (Boulder, CO) descritos a continuación mediante la utilización de técnicas conocidas de síntesis orgánica.
Los extensores de fórmula (IIIa) pueden introducirse en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes intermedios con el extremo N de una unidad de aminoácido como se representa en los Esquemas 11 y 12:
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10 enlaquenesunnúmeroenteroquevaríade1a10y Tes-Ho-SO3Na;
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donde n es un número entero que varía de 0 a 3;
y
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20 Las unidades de extensor de fórmula (IIIb) pueden introducirse en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes intermedios con el extremo N de una unidad de aminoácido:
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y
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Otros extensores útiles pueden sintetizarse de acuerdo con procedimientos conocidos. Pueden prepararse extensores de aminooxi de la fórmula que se muestra a continuación mediante el tratamiento de haluros de alquilo con N-Boc-hidroxilamina de acuerdo con los procedimientos descritos en Jones et al., 2000, Tetrahedron Letters 41 (10): 1531-1533; y Gilon et al., 1967, Tetrahedron 23(11): 4441-4447.
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en la que -R17- se selecciona entre –alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquilen C1C10-arileno-, -arilen-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C10-C10,heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2O)r-,(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1 a 10;
Los extensores de isotiocianato de la fórmula que se muestra a continuación pueden prepararse a partir de cloruros del ácido isotiocianatocarboxílico como se describe en Angew. Chem., 87(14): 517 (1975).
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en laque-R17- es como se describe en el presente documento.
El esquema 11 muestra un método para obtener de un enlazador de dipéptido val-cit que tiene un extensor de maleimida y, opcionalmente, un espaciador autodestructivo de p-aminobenzoílo.
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en la que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o –ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
5 El esquema 12 ilustra la síntesis de una unidad de enlazador de dipéptido phe-lys(Mtr) que tiene una unidad de extensor de maleimida y una unidad de espaciador autodestructiva de p-aminobencilo. El material de partida AD (Lys(MTR)) está disponible en el mercado (Bachem, Torrance, CA) o puede prepararse de acuerdo con Dubowchik, et al., 1997 Tetrahedron Letters 38: 5257-60.
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Se representan métodos ilustrativos útiles para enlazar un fármaco a un ligando para formar un compuesto de fármaco-enlazador, en el Esquema 13 y se esbozan en los procedimientos generales de G-H.
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5 Procedimiento general G: Formación de amida usando HATU
Un fármaco (Ib) (1,0 eq.) y un enlazador N-protegido que contiene un sitio reactivo de ácido carboxílico (1,0 eq.) se diluyen con un disolvente orgánico adecuado, tal como diclorometano y la solución resultante se trata con HATU
10 (1,5 eq.) y una base orgánica, preferentemente piridina (1,5 eq.). La mezcla de reacción se deja en agitación en una atmósfera inerte, preferentemente de argón, durante 6 horas, durante cuyo tiempo la mezcla de reacción se controla usando HPLC. La mezcla de reacción se concentra y el residuo resultante se purificó usando HPLC para producir la amida de fórmula AK.
15 Procedimiento H: Formación de carbamato usando HOBt
Una mezcla de un enlazador AL que tiene un sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo (1,1 eq.) y fármaco (Ib) (1,0 eq.) se diluyen con un disolvente orgánico aprótico, tal como DMF, para proporcionar una solución que tiene una concentración de 50-100°mM y la solución resultante se trata con HOBt (0,2 eq.) y se coloca en una atmósfera
20 inerte, preferentemente de argón. La mezcla de reacción se deja en agitación durante 15 min, después, una base orgánica, tal como piridina (1/4 v/v), se añade y el progreso de reacción se controla usando HPLC. El enlazador se consume normalmente en el plazo de 16 h. La mezcla de reacción se concentra al vacío y el residuo resultante se purifica usando, por ejemplo, HPLC para proporcionar el carbamato AM.
25 Procedimiento General S: Formación de enlace de amida entre el enlazador y el fármaco
Un enlazador que contiene ácido carboxílico (30 mg) y anhidro DMF (10 µl) se coloca en una atmósfera inerte, preferentemente de argón, y se enfría en hielo seco durante aproximadamente 5 min. A esta mezcla se le añade cloruro de oxalilo (1 ml) gota a gota mediante una jeringa. Normalmente, después de unos minutos, la mezcla se
30 deja calentar a temperatura ambiente y se deja durante 30 min con agitación manual ocasional. Los productos volátiles se retiran a presión reducida. El residuo se vuelve a suspender en CH2Cl2 anhidro (1 ml) y el disolvente se retira al vacío. El residuo se seca durante la noche en bomba de vacío para producir enlazador AN.
El cloruro de acilo AN se suspende en CH2Cl2 anhidro (3 ml). Un fármaco Ib (0,006°mmol) y N,N-diisopropil
35 etilamina (4 µl, ~4 eq.) se suspenden en CH2Cl2 anhidro (100 µl) y la mezcla se enfría en el baño de hielo normalmente durante aproximadamente 10 min. A esta mezcla, se le añaden 150 µl de cloruro de acilo en CH2Cl2 (~1,1 eq.) mediante una jeringa. Después de 15 min en hielo, la mezcla de reacción se deja calentar hasta temperatura ambiente y la agitación continuó durante aproximadamente 2 horas más. El progreso de la reacción puede monitorizarse mediante RP-HPLC. Después, el disolvente entonces se retira al vacío. El residuo se suspende
40 en DMSO (0,5 ml). Se añadió agua (100 µl) y después de 0,5 h la mezcla se purifica, por ejemplo, usando HPLC preparativa para producir fármaco-enlazador AO.
Procedimiento General T: preparación de enlazador-fármaco de éster de N-hidroxisuccinimida
45 El esquema 13a representa un ejemplo de preparación de compuestos de fármaco-enlazador AA2 que contienen
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en la que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
La aplicación de esta estrategia general para la preparación de enlazador-fármaco de éster de N-hidroxisuccinimida reactivo a lisinas se representa en el Esquema 14a.
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Procedimiento General U
5 Método alternativo de preparación de enlazador-fármaco de éster de N-hidroxisuccinimida
El intermedio AQ (1 eq.) se suspende en piridina y esta mezcla se añade gota a gota a la suspensión de suberato de disuccinimidilo (5 eq) en piridina. Después, la mezcla de reacción se deja en agitación en una atmósfera inerte, preferentemente de argón, durante aproximadamente 4 h, tiempo durante el cual el progreso de la reacción se
10 controla usando HPLC. Después, la piridina se retira al vacío, el residuo se suspende en un disolvente orgánico adecuado, tal como diclorometano y el fármaco-enlazador AQ1 se aísla usando cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice. Si es necesario, el grupo protector de carboxilo del fármaco puede retirarse ahora mediante el tratamiento adecuado, preferentemente con TFA al 1 % en diclorometano para proporcionar éster de dimetoxibencilo.
15 La metodología útil para la preparación de una unidad de enlazador que contiene un espaciador ramificado se muestra en el Esquema 15.
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cisteína tiol reactivo, una multitud de restos de fármaco pueden unirse a través de un enlazador dendrítico.
Las siguientes realizaciones a modo de ejemplo de reactivos enlazadores dendríticos permiten que hasta nueve reactivos de resto de fármaco nucleófilo se conjuguen por reacción con los grupos funcionales cloroetil mostaza nitrogenada:
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Conjugación de restos de fármaco a anticuerpos
15 El esquema 16 ilustra la metodología útil para hacer conjugados de fármaco-enlazador-ligando que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 fármacos por anticuerpo. Un anticuerpo se trata con un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) para reducir algunos o todos los residuos de disulfuro de cisteína para formar grupos tiol de cisteína altamente nucleófilos (-CH2SH). Por tanto, el anticuerpo parcialmente reducido reacciona con los compuestos de fármaco-enlazador, o reactivos enlazadores, con grupos funcionales electrófilos tales como
20 maleimida o α-halo carbonilo, de acuerdo con el método de conjugación de la página 766 de Klussman et al., 2004, Bioconjugate Chemistry 15 (4): 765-773.
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25 Por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, AC10, disuelto en borato de sodio 500°mM y cloruro de sodio 500°mM a pH 8,0 se trata con un exceso de ditiotreitol 100°mM (DTT). Después de la incubación a 37 ºC durante aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambia por elución sobre resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con DTPA 1°mM. El valor de tiol/Ab se comprueba determinando la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol mediante la reacción con DTNB (Aldrich,
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administración oral, una composición puede comprender uno o más de un agente edulcorante, conservantes, un tinte/colorante y un potenciador del sabor. En una composición para la administración por inyección, también pueden incluirse uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, también puede incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o parabeno de metilo; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composición parenteral puede incluirse en una ampolla, una jeringa desechable o un vial de múltiples dosis hechos de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante a modo de ejemplo. Una composición inyectable es preferentemente estéril.
La cantidad del compuesto de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o condición particular dependerá de la naturaleza del trastorno o condición y puede ser determinada por la norma técnicas clínicas. Además, se pueden emplear ensayos in vitro o in vivo opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en las composiciones también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo de manera que se obtendrá una dosificación adecuada. Normalmente, esta cantidad es al menos aproximadamente el 0,01 % de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo en peso de la composición. Cuando se destinan a la administración oral, esta cantidad puede variarse en el intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 80 % en peso de la composición. En un aspecto, las composiciones orales pueden comprender de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 50 % del compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo en peso de la composición. En otro aspecto más, las composiciones presentes se preparan de modo que una unidad de dosificación parenteral contiene de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2 % en peso del compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo.
Para la administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo por kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la composición puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo por kg de peso corporal del animal. En otro aspecto, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo.
Generalmente, la dosificación de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo administrada a un paciente es normalmente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 2000 mg/kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la dosificación administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del animal, en otro aspecto, la dosificación administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal del animal, en otro aspecto más, la dosificación administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del animal, en otro aspecto, la dosis administrada es de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del animal y en otro aspecto más, la dosis administrada es de entre aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del animal.
Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen diversos sistemas de liberación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc. y pueden usarse para administrar un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo o composición. En ciertas realizaciones, se administra a un paciente más de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo o composición.
En realizaciones específicas, puede ser deseable administrar uno o más compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones localmente a la zona que necesita tratamiento. Esto puede lograrse, por ejemplo y no a modo de limitación, por infusión local durante la cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con un apósito para heridas después de la cirugía; por inyección; por medio de un catéter; por medio de un supositorio; o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo las membranas, tales como las membranas sialásticas, o fibras. En una realización, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un cáncer, tumor o tejido neoplásico o preneoplásico. En otra realización, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de una manifestación de una enfermedad autoinmune.
En ciertas realizaciones, puede ser deseable introducir uno o más compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular e intratecal. La inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya.
La administración pulmonar también puede emplearse, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y una formulación con un agente de aerosolización o por medio de perfusión en un fluorocarbono o tensioactivo pulmonar sintético.
En otra realización más, los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones pueden suministrarse en un sistema de liberación controlada, tal como, pero no limitado a, una bomba, o pueden usarse diversos materiales poliméricos. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede colocarse en la proximidad de la diana de los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones, por ejemplo, el cerebro, necesitando de este modo solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Pueden usarse otros sistemas de liberación controlada analizados en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, con el que se administra un compuesto a modo de ejemplo y/o un conjugado a modo de ejemplo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los vehículos pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En una realización, cuando se administra a un paciente, el compuesto a modo de ejemplo y/o el conjugado a modo de ejemplo o composiciones y los vehículos farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un vehículo a modo de ejemplo, cuando los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo se administran por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden emplearse como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados también incluyen excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH.
Las presentes composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, pulverizaciones, suspensiones o cualquier otra forma adecuada para su uso. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington’s Pharmaceutical Sciences" de
E.W. Martin.
En una realización, los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo se formulan de acuerdo con procedimientos sistemáticos en forma de una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a animales, en particular seres humanos. Normalmente, los excipientes o vehículos para la administración intravenosa son soluciones tampón acuosas isotónicas estériles. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente solubilizante. Las composiciones para la administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado en seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo se administre por infusión, puede dosificarse, por ejemplo, con una botella de infusión que contenga agua de calidad farmacéutica o solución salina estériles. Cuando el compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo se administran por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua para inyección o de solución salina estériles para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
Las composiciones para la administración oral pueden estar en forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por vía oral pueden contener uno o más agentes opcionales, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéuticamente agradable al paladar. Además, cuando están en forma de comprimido o píldora, las composiciones pueden recubrirse para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal
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En otra realización, la unidad de ligando se une a un antígeno de célula tumoral o célula cancerosa que es una proteína de la matriz extracelular asociada a la célula tumoral o la célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de ligando para una célula tumoral o célula cancerosa particular puede ser importante para la determinación de los tumores o cánceres que se tratan con mayor eficacia. Por ejemplo, los conjugados a modo de ejemplo que tienen una unidad de ligando BR96 pueden ser útiles para el tratamiento de carcinomas positivos a antígenos incluyendo los de pulmón, mama, colon, ovarios y páncreas. Los conjugados a modo de ejemplo que tienen una unidad de ligando anti-CD30 o anti-CD40 pueden ser útiles para el tratamiento de neoplasias malignas hemáticas.
Otros tipos particulares de cánceres que pueden tratarse con conjugados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los que se describen en la Tabla 1:
TABLA 1
Los tumores sólidos, incluyendo pero no limitados a: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer óseo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer oral, cáncer nasal, cáncer de garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer cervical, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, cáncer de piel, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, cánceres transmitidas por la sangre, incluyendo, pero no limitados a: leucemia aguda linfoblástica "LAL", leucemia de células B linfoblástica aguda, leucemia de linfocitos T linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda "LMA", leucemia promielocítica aguda "LPA", leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroleucémica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mieloide crónica "LMC", leucemia linfocítica crónica "LLC", leucemia de células pilosas, mieloma múltiple leucemias agudas y crónicas: leucemias linfoblástica, mieloide, linfoide, mielocítica Linfomas: enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, Policitemia vera
Los conjugados a modo de ejemplo proporcionan conjugación orientada al tumor o cáncer específico, lo que reduce la toxicidad general de estos compuestos. Las unidades de enlazador estabilizan los conjugados a modo de ejemplo en la sangre, sin embargo, son escindibles por proteasas específicas del tumor dentro de la célula, liberando un fármaco.
Terapia multimodalidad para el cáncer
Los cánceres, incluyendo, pero no limitados a, un tumor, metástasis u otra enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado, puede tratarse o prevenirse mediante la administración de un conjugado a modo de ejemplo y/o un compuesto a modo de ejemplo.
En otras realizaciones, se proporcionan métodos para tratar o prevenir el cáncer, incluyendo la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de un ejemplo de conjugado y un agente quimioterápico. En una realización, el agente quimioterápico es aquel con el que se ha descubierto que el tratamiento del cáncer no es refractario. En otra realización, el agente quimioterápico es aquel con el que se ha descubierto que el tratamiento del cáncer es refractario. Los conjugados a modo de ejemplo pueden administrarse a un paciente que también ha sido sometido a cirugía como tratamiento para el cáncer.
En alguna realización, el paciente también recibe un tratamiento adicional, tal como la radioterapia. En una realización específica, el conjugado a modo de ejemplo se administra simultáneamente con el agente quimioterápico o con radioterapia. En otra realización específica, el agente quimioterápico o la radioterapia se administran antes o después de la administración de un conjugado a modo de ejemplo, en un aspecto al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes, en otros aspectos varios meses (por ejemplo, hasta tres meses) antes o después de la administración de un conjugado a modo de ejemplo.
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mepitiostano y testolactona; anti-suprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; rellenador de ácido fólico tales como ácido folínico (leucovorina); aceglatona; agentes antineoplásicos anti-folato tales como ALIMTA®, pemetrexed LY231514, inhibidores de la dihidrofolato reductasa como metotrexato y trimetrexato, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profármacos tales como UFT, S-1 y capecitabina y los inhibidores de la timidilato sintasa e inhibidores de glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXM , TDX); inhibidores de la deshidrogenasa de dihidropirimidina tal como eniluracilo; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; defereoxamina; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxanos, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncología, Princeton, NJ), ABRAXANE™ sin Cremophor, formulación de paclitaxel de nanopartículas de albúmina modificada por ingeniería genética (American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; análogos de platino o análogos a base de platino, como el cisplatino, oxaliplatino; platino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); vinblastina; vindesina; vinorelbina; alcaloides de la vinca, vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); Inhibidores de MDR tales como verapamilo; retinoides tales como ácido retinoico; inhibidores del ciclo celular, tales como estaurosporina; lovastatina; REVLIMID (lenalidomida); THALAMI (talidomida); VELADE (bortezomib); sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura de una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN ™) combinado con 5-FU y leucovorina.
También se incluyen en la presente definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como los anti-estrógenos y los moduladores selectivos de receptores estrogénicos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales citadas anteriormente, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, megestrol, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, anastrozol ARIMIDEX®; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida (por ejemplo, acetato de leuprolida) y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como las vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna VAXID®; PROLEUKIN® RIL-2; LURTOTECAN® inhibidor de la topoisomerasa 1; ABARELIX® rmRH; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
También se incluyen en la presente definición análogos de la vitamina D3, tales como EB 1089, CB 1093 y KH 1060; y terapias fotodinámicas, tales como vertoporfin (BPD-MA), ftalocianina, fotosensibilizador Pc4, desmetoxihipocrelina A y 2BA-2-DMHA.
Tratamiento de enfermedades autoinmunes
Los conjugados a modo de ejemplo son útiles para destruir o inhibir la replicación de una célula que produce una enfermedad autoinmune o para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. Los conjugados a modo de ejemplo pueden usarse, en consecuencia, en diversas configuraciones para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente. Los conjugados de fármaco-enlazador-ligando pueden usarse para suministrar un fármaco a una célula diana. Sin quedar ligado por teoría alguna, en una realización, los conjugados fármaco-enlazador-ligando asociados a un antígeno en la superficie de una célula diana, y el conjugado a modo de ejemplo se recoge después dentro de una célula diana a través de endocitosis mediada por receptor. Una vez dentro de la célula, una o más secuencias específicas de péptidos dentro de la unidad de enlazador se escinden enzimáticamente o hidrolíticamente, dando como resultado la liberación de un fármaco. Después, el fármaco liberado queda libre para migrar en el citosol e inducir actividades citotóxicas o citostáticas. El conjugado fármaco-enlazador-ligando también puede escindirse por una proteasa intracelular para liberar el resto de fármaco, el compuesto fármaco-enlazador y/o un fragmento activo del conjugado fármaco-enlazador-ligando (por ejemplo, cistilo-enlazador-fármaco). En una realización alternativa, el fármaco se escinde del conjugado a modo de ejemplo fuera de la célula diana y posteriormente el fármaco penetra en la célula.
En una realización, la unidad de ligando se une a un antígeno autoinmune. En un aspecto, el antígeno está sobre la superficie de una célula implicada en una afección autoinmune.
En otra realización, la unidad de ligando se une a un antígeno autoinmune que está sobre la superficie de una célula.
En una realización, el ligando se une a los linfocitos activados que se asocian a la patología autoinmune.
En una realización adicional, los conjugados a modo de ejemplo destruyen o inhiben la multiplicación de células que producen un anticuerpo autoinmune asociado a una enfermedad autoinmune en particular.
Los tipos particulares de enfermedades autoinmunes que pueden tratarse con los conjugados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, trastornos relacionados con linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atópica, asma atópica, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica y enfermedad injerto contra hospedador); trastornos relacionados con linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener y tuberculosis); trastornos relacionados con linfocitos B activados (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes de tipo I); y los desvelados en la Tabla 3.
TABLA 3 Hepatitis crónica activa, enfermedad de Addison, alveolitis alérgica, reacción alérgica, rinitis alérgica, síndrome de Alport, anafilaxia, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, artritis, ascariasis, aspergilosis, alergia atópico, dermatitis atópica, rinitis atópica, enfermedad de Behcet, pulmón de Bird-Fancier, asma bronquial, síndrome de Caplan, miocardiopatía, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, glomerulonefritis crónica, síndrome de Cogan, enfermedad por crioaglutininas, infección por rubéola congénita, síndrome de CREST, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia, Síndrome de Cushing, dermatomiositis, lupus discoide, síndrome de Dressler, síndrome de Lambert-Eaton, infección por Ecovirus, encefalomielitis, oftalmopatía endocrina, infección por virus de Epstein-Barr, náuseas equinas, eritematosis, síndrome de Evan, síndrome de Felty, fibromialgia, ciclitis de Fuch, atrofia gástrica, alergia gastrointestinal, arteritis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de injerto contra hospedador, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch Schonlein, atrofia suprarrenal idiopática, fibritis pulmonar idiopática, nefropatía por IgA, enfermedades inflamatorias del intestino, diabetes mellitus insulino-dependiente, artritis juvenil, diabetes mellitus juvenil (tipo I), síndrome de Lambert-Eaton, laminitis, liquen plano, hepatitis lupoide, lupus, linfopenia, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, anemia perniciosa, síndromes poliglandulares, demencia presenil, agamaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, aborto recurrente, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, síndrome de Sampter, esquistosomiasis, esclerodermia, síndrome de Sjorgen, síndrome de Shulman, síndrome de Schmidt, síndrome del hombre rígido, oftalmía simpática, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, artritis temporal, tiroiditis, trombocitopenia, tirotoxicosis, necrólisis epidérmica tóxica, resistencia a la insulina de tipo B, diabetes mellitus de tipo I, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo, macroglobulinemia de Waldenstrom, granulomatosis de Wegener.
Terapia de enfermedades autoinmunes con múltiples fármacos
También se desvelan métodos para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, incluyendo la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de un conjugado a modo de ejemplo y otro agente terapéutico conocido para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En una realización, el agente contra la enfermedad anti-autoinmune incluye, pero no se limita a, los agentes enumerados en la Tabla 4.
Tabla 4 ciclosporina, ciclosporina A, micofenolato de mofetilo, sirolimus, tacrolimus, enanercept, prednisona, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, prednisona, ácido aminocaproico, cloroquina, hidroxicloroquina, hidrocortisona, dexametasona, clorambucilo, DHEA, danazol, bromocriptina, meloxicam, infliximab
Tratamiento de enfermedades infecciosas
Los conjugados a modo de ejemplo son útiles para destruir o inhibir la multiplicación de una célula que produce una enfermedad infecciosa o para tratar una enfermedad infecciosa. Los conjugados a modo de ejemplo pueden usarse, en consecuencia, en diversas configuraciones para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un paciente. Los conjugados fármaco-enlazador-ligando pueden usarse para suministrar un fármaco a una célula diana. En una realización, la unidad de ligando se une a la célula de la enfermedad infecciosa.
En una realización, los conjugados destruyen o inhiben la multiplicación de células que producen una enfermedad infecciosa particular.
Los tipos particulares de enfermedades infecciosas que pueden tratarse con los conjugados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en la Tabla 5.
TABLA 5 Enfermedades bacterianas:
difteria, tosferina, bacteriemia oculta, infección del tracto urinario, gastroenteritis, celulitis, epiglotitis, traqueítis, hipertrofia de la adenoides, absceso retrofaríngeo, impétigo, ectima, neumonía, endocarditis, artritis séptica, neumococos, peritonitis, bacteriemia, meningitis, meningitis purulenta aguda, uretritis, cervicitis, proctitis, faringitis, salpingitis, epididimitis, gonorrea, sífilis, listeriosis, ántrax, nocardiosis, salmonella, fiebre tifoidea, disentería, conjuntivitis, sinusitis, brucelosis, tularemia, cólera, peste bubónica, tétanos, enteritis necrotizante, actinomicosis, infecciones anaerobias mixtas, sífilis, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme, fiebre por mordedura de rata, tuberculosis, linfadenitis, lepra, clamidia, neumonía por clamidia, tracoma, conjuntivitis por inclusión Enfermedades fúngicas sistémicas:
Histoplasmosis, coccidioidomicosis, blastomicosis, esporotricosis, criptococosis, candidiasis sistémica, aspergilosis, mucormicosis, micetoma, cromomicosis Enfermedades por Rickettsias:
Tifus, rickettsiosis exantemática, ehrlichiosis, rickettsiosis transmitida por garrapatas orientales, rickettsiosis pustulosa, fiebre Q, bartonelosis Enfermedades parasitarias:
Malaria, babesiosis, enfermedad del sueño africana, enfermedad de Chagas, leishmaniasis, fiebre Dum-Dum, toxoplasmosis, meningoencefalitis, queratitis, entamebiasis, giardiasis, criptosporidiasis, isosporiasis, ciclosporiasis, microsporidiosis, ascariasis, infección por tricuros, infección por anquilostoma, infección por nematodos, larva migratoria ocular, triquinosis, dracunculosis, filariasis linfática, loiasis, oncocercosis, infección canina por Dirofilaria immitis, esquistosomiasis, cercariosis cutánea, infección por Paragonimus westermanii, infección por Clonorchis sinensis, fascioliasis, fasciolopsiasis, opistorquiasis, infecciones por tenia, hidatidosis, hidatidosis alveolar Enfermedades virales:
Sarampión, panencefalitis esclerosante subaguda, resfriado común, paperas, rubeola, roseola, eritema infeccioso, varicela, infección por virus sincitial respiratorio, crup, bronquiolitis, mononucleosis infecciosa, poliomielitis, herpangina, fiebre aftosa, enfermedad de Bornholm, herpes genital, verrugas genitales, meningitis aséptica, miocarditis, pericarditis, gastroenteritis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), síndrome de Reye, síndrome de Kawasaki, gripe, bronquitis, neumonía errante viral, enfermedad respiratoria febril aguda, fiebre faringoconjuntival aguda, queratoconjuntivitis epidémica, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple tipo 2 (VHS-2), herpes zóster, citomegalovirosis, rabia, leucoencefalopatía multifocal progresiva, Kuru, insomnio letal familiar, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, paraparesia espástica tropical, encefalitis equina occidental, encefalitis de California, encefalitis de San Luis, fiebre amarilla, dengue, coriomeningitis linfocítica, fiebre de Lassa, fiebre hemorrágica, síndrome pulmonar por Hantavirus, infecciones por virus de Marburgo, infecciones por virus del Ébola, viruela
Terapia de enfermedades infecciosas con múltiples fármacos
Se desvelan métodos para el tratamiento de una enfermedad infecciosa incluyendo la administración a un paciente que lo necesita un conjugado a modo de ejemplo y otro agente terapéutico que es un agente anti-enfermedad infecciosa. En una realización, el agente anti-enfermedad infecciosa es, pero no se limita a, agentes enumerados en la Tabla 6.
TABLA 6 Antibióticos β-lactámicos:
Penicilina G, penicilina V, Cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina Aminoglucósidos:
Amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina Macrólidos: Azitromicina, claritromicina eritromicina, lincomicina, clindamicina Tetraciclinas: Demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina Quinolonas: Cinoxacina, ácido nalidíxico Fluoroquinolonas:
Ciprofloxacino, enoxacino, grepafloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, norfloxacino, ofloxacino, esparfloxacino, trovafloxicino Polipéptidos:
Bacitracina, colistina, polimixina B Sulfonamidas:
Sulfisoxazol, sulfametoxazol, sulfadiazina, sulfametizol, sulfacetamida Agentes antibacterianos diversos: Trimetoprim, sulfametazol, cloranfenicol, vancomicina, metronidazol, quinupristina, dalfopristina, rifampicina, espectinomicina, nitrofurantoína 5 Agentes antivirales: Agentes antivirales generales:
Idoxuradina, vidarabina, trifluridina, aciclovir, famciciclovir, penciciclovir, valaciclovir, ganciciclovir, foscarnet, ribavirina, amantadina, rimantadina, cidofovir, oligonucleótidos antisentido, inmunoglobulinas, interferones Fármacos para la infección por VIH:
10 Tenofovir, emtricitabina, zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina, nevirapina, delavirdina, saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir
Ejemplos
15 Ejemplo 1 - Preparación del compuesto AB
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Se diluyó Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3°mmol, 1,0 eq.; véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.º
20 6.214.345 a Firestone et al.) con DMF (120 ml, 0,2 M) y a esta solución se le añadió una dietilamina (60 ml). La reacción se controló mediante HPLC y se descubrió que se completó en 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se precipitó usando acetato de etilo (aproximadamente 100 ml) con ultrasonidos durante 10 min. Se añadió éter (200 ml) y el precipitado se sometió a ultrasonidos durante 5 minutos adicionales. La solución se dejó reposar durante 30 min sin agitación y después se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar Val-cit-PAB
25 OH, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Se diluyó Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21°mmol) con DMF (110 ml) y la solución resultante se trató con MC-OSu (Willner et al., 1993, Bioconjugate Chem. 4: 521; 6,5 g, 21°mmol, 1,0 eq.). La reacción se completó de acuerdo con el análisis por HPLC después de 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se precipitó usando acetato de etilo (50 ml). Después del tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos, se añadió éter (400 ml) y la mezcla se
30 sometió a ultrasonidos adicionalmente hasta que todas las partículas grandes se rompieron. Después, la solución se filtró y el sólido se secó para proporcionar un intermedio sólido de color blanquecino. Rendimiento: 11,63 g (96 %); EN-EM m/z 757,9 [M-H]
El intermedio sólido de color blanquecino (8,0 g, 14,0°mmol) se diluyó con DMF (120 ml, 0,12 M) y a la solución
35 resultante se le añadió bis(4-nitrofenil)carbonato (8,5 g, 28,0°mmol, 2,0 eq.) y DIEA (3,66 ml, 21,0°mmol, 1,5 eq.). La reacción se completó en 1 h de acuerdo con el análisis por HPLC. La mezcla de reacción se concentró para proporcionar un aceite que se precipitó con EtOAc y después se trituró con EtOAc (aproximadamente 25 ml). El soluto se precipitó adicionalmente con éter (aproximadamente 200 ml) y se trituró durante 15 minutos. El sólido se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar el Compuesto AB, que tenía una pureza del 93 % de acuerdo con el
40 análisis por HPLC y se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 9,7 g (94 %).
Ejemplo 2 - Preparación de compuestos MMAZ mediante síntesis en fase sólida
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clorotritilo era de 0,790°mmol/g.
Resina de Fmoc-3-(3-piridil)-L-Ala-2-clorotritilo (SP1-h)
Se cargó Fmoc-3-(3-piridil)-L-alanina (543 mg, 0,70°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determinó que el nivel de carga de la resina de Fmoc-3-(3-piridil)-L-Ala-2clorotritilo era de 0,790°mmol/g.
La cuantificación de Fmoc de resinas pre-cargados disponibles en el mercado se realizó de acuerdo con el Procedimiento General SP(b).
Resina de H-Leu-2-clorotritilo (SP1-i)
Se disolvió Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol) en CH2Cl2 anhidro (2 ml) para hacer una solución de trabajo 0,5 M. La solución se transfirió a una jeringa de plástico de 3 ml que contenía resina de H-Leu-2-clorotritilo (25 mg, 0,86°mmol/g, 0,0215°mmol). La mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con DMF (5 ml, 2 veces), CH2Cl2 (5 ml, 2 veces) y éter etílico (5 ml, 2 veces) y se secó al vacío durante 2 horas. La resina se ensayó mediante el ensayo de amina de Kaiser. Tras los resultados negativos (amina libre completamente protegida), se realizó la cuantificación de Fmoc para obtener el nivel de carga, como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determinó que nivel de carga de la resina de H-Leu-2-clorotritilo era de 0,85°mmol/g.
Resina de H-Met-2-clorotritilo (SP1-j)
Se aciló resina de H-Met-2-clorotritilo (25 mg, 0,64°mmol/g, 0,016°mmol) con un exceso de Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol), como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Se determinó que el nivel de carga de la resina de H-Met-2-clorotritilo era de 0,27°mmol/g.
Resina de H-Trp(Boc)-2-clorotritilo (SP1-k)
Se aciló resina de H-Trp(Boc)-2-clorotritilo (25 mg, 0,74°mmol/g, 0,033°mmol) con un exceso de Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol), como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Se determinó que el nivel de carga de la resina de H-Trp(Boc)-2-clorotritilo era de 0,70°mmol/g.
H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo resina (SP1-l)
Se aciló resina de H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo (25 mg, 0,90°mmol/g, 0,022°mmol) con un exceso de Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol), como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Se determinó que el nivel de carga de la resina de H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo era de 0,88°mmol/g.
Resina de MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo
Se preparó resina de MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo siguiendo el Procedimiento general SP(c). Brevemente, se añadió una piperidina al 20 % en solución de DMF (5 ml) a la jeringa que contenía resina de Fmoc2-cloro-Phe-2-clorotritilo y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró, se lavó con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y éter etílico (5 ml, 4 veces) y se secó al vacío durante 2 h.
Se disolvieron Fmoc-Dap (278 mg, 0,680°mmol) y HATU (259 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) en DMF anhidro (5 ml) y DIEA (237 µl, 1,36°mmol, 4 equiv.). La solución resultante se transfirió a la jeringa de plástico de 10 ml que contenía resina de H-2-cloro-Phe-2-clorotritilo (555,6 mg, 0,340°mmol). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La finalización de la reacción se determinó mediante el ensayo de amina de Kaiser y el análisis por CLEM de material retirado por escisión de una pequeña cantidad de resina (usando TFA al 2 %/CH2Cl2). La resina se filtró, se lavó con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y éter etílico (5 ml, 4 veces) y se secó al vacío durante 2 h.
Se añadió piperidina al 20 % en solución de DMF (5 ml) a la jeringa que contenía resina de Fmoc-Dap-2-cloro-Phe2-clorotritilo y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró, se lavó con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y éter etílico (5 ml, 4 veces) y se secó al vacío durante 2 h.
Se disolvieron Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (510 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) y HATU (259 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) en DMF anhidro (5 ml) y DIEA (237 µl, 1,70°mmol, 5 equiv.). La solución resultante se transfirió a la jeringa de plástico de 10 ml que contenía resina de H-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo. La mezcla se agitó durante 6 horas. La finalización de la reacción se determinó mediante análisis por CLEM del material retirado por escisión de una pequeña cantidad de resina (usando TFA al 2 %/CH2Cl2). La resina se filtró, se lavó con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y éter etílico (5 ml, 4 veces) y se secó al vacío durante 2 h.
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Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexil-L-Ala-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en una resina de H-3-ciclohexil-L-Ala-2clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexil-L-Ala-OH (SP2-f)
Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexil-L-Ala-OH por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 343,4 mg (99 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,87 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H71N5O85, 737,53; encontrado, 738,974 (M+H)+ .
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-L-4-Tiazolilalanina-2clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina (SP2-g)
Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 357 mg (87 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,23 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H62N6O8S, 738,43; encontrado, 739,889 (M+H)+ .
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-3-(3-piridil)-L-Ala-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val -Dil-OH, respectivamente, en resina de H-3-(3-piridil)-L-Ala-2-Clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-3 (3-piridil)-L-Ala-OH (SP2-h)
Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-3-(3-piridil)-L-Ala-OH por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 388,6 mg (94 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a 6,13 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C38H64N6O8, 732,48; encontrado, 733,842 (M+H)+ .
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Leu-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-OH (SP2-i)
Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-OH por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 217,4 mg (62 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,43 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C36H67N6O8, 697,5; encontrado 698,999 (M+H)+ .
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Met-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Met-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Met-OH (SP2-j)
Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-Met-OH por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 90,7 mg (82 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,39 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C35H65N5O8S, 715,46; encontrado 716,399 (M+H)+ .
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Trp(Boc)-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Trp-(Boc)-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
Trp MeVal-Val-Dil-DAP-OH (Boc) (P2-k)
Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-Trp(Boc)-OH por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa 5 proporcionó 151,7 mg (42 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 7,39 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C46H74N6O10, 870,55; encontrado 871,645 (M+H)+ .
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-2-clorotritilo
10 Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-OH (SP2-1)
15 Se retiró MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-OH por escisión de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporó para dejar un sólido de color blanco. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 219,4 mg (55 % de sal de TFA) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,67 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H71N5O10, 769,52; encontrado 770,989 (M+H)+ .
20 Ejemplo 3. Preparación de MC-Val-Cit-PAB-MMAZ
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Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-DAP-2-cloro-Phe-OH (SP3-a)
25 Se unió maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 13,50 mg (14 %) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 7,23 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C68H102ClN11O16, 1363,72; encontrado 1364,766 (M+H)+ .
30 Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-OH (SP3-b)
Se unió maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 17,1 mg (13 %) de un sólido de 35 color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 7,24 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C69H105N11O16, 1343,77; encontrado, m/z 1344,835 (M+H)+ .
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-OH (SP3-c)
40 Se unió maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 2,7 mg (2 %) de un sólido de color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,21 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C69H103N11O16,
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color blanco. Análisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,47 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C68H109N11O18, 1367,8; encontrado 1368,452 (M+H)+ .
Ejemplo 4. Preparación de MMAZ (1) en fase de solución
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La síntesis de MMAZ se describe en los Esquemas 5 y 6. Pueden prepararse aminoácidos protegidos con Fmoc a partir de aminoácidos no protegidos usando, por ejemplo, Fmoc-OSu a través de procedimientos bien establecidos 10 (véase, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª edición, 1991, John Wiley & Sons,
p. 506).
Preparación de Fmoc-Dolaproína (Fmoc-Dap)
15 Se suspendió Boc-Dolaproína (58,8 g, 0,205 mol) en HCl 4 N en 1,4-dioxano (256 ml, 1,02 mol, Aldrich). Después de agitar durante 1,5 horas, el análisis por TLC indicó que la reacción se había completado (MeOH al 10 %/CH2Cl2) y la mezcla se concentró hasta casi sequedad. Se cargó de 1,4-dioxano (50 ml) adicional y la mezcla se concentró a sequedad y se secó al vacío durante la noche. El sólido de color blanco resultante se disolvió en H2O (400 ml) y se transfirió a un matraz de de fondo redondo de 3 l, de tres bocas, con un agitador mecánico y sonda de temperatura.
20 Se añadió N,N-diisopropiletilamina (214,3 ml, 1,23 mol, Acros) a lo largo de un minuto, causando una exotermia de 20,5 a 28,2 ºC (interna). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió 1,4-dioxano (400 ml). Una solución de Fmoc-OSu (89,90 g, 0,267 mol, Advanced Chem Tech) en 1,4-dioxano (400 ml) se añadió desde un embudo de adición durante 15 minutos, manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 9 ºC. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 19 horas, después de lo cual la mezcla se concentró por evaporación
25 rotatoria a una suspensión acuosa (390 g). La suspensión se diluyó con H2O (750 ml) y Et2O (750 ml). Las capas se separaron, manteniendo cualquier sólido con la capa orgánica. La capa acuosa se acidificó usando HCl conc. (30 ml) y se extrajo con EtOAc (500 ml, 3 veces). Los extractos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El extracto de Et2O se extrajo una vez con una solución sat de NaHCO3 (200 ml), manteniendo cualquier sólido con la fase acuosa. La suspensión acuosa se acidificó usando HCl conc. (50 ml) y se extrajo con
30 Et2O (50 ml), manteniendo cualquier sólido con la capa orgánica. La capa orgánica se filtró y se concentró. Los dos productos se combinaron y se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con CH2Cl2 (3,5 l), después MeOH al 3 %/CH2Cl2 (9 l) para proporcionar 68,23 g de Fmoc-Dolaproína en forma de una espuma de color blanco (81 %, pureza del 97,5 % mediante HPLC (ABC)).
35 Preparación de Fmoc-Dap-Z
La sal y/o forma protegida del bioisóstero de fenilalanina (3°mmol), N-Boc-Dolaproína (668 mg, 1 eq.), DEPC (820 µl, 1,5 eq.) y DIEA (1,2 ml) se diluyeron con diclorometano (3 ml). Después de 2 horas (h) a temperatura ambiente (aproximadamente 28 grados Celsius), la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó
40 sucesivamente con una solución acuosa saturada (ac.) de NaHCO3 (10 ml, 2 veces) y solución ac. de NaCl (10 ml, 2 veces). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en acetato de etilo. Las fracciones pertinentes se combinaron y se concentraron para proporcionar el dipéptido. Los grupos protectores se escindieron por métodos conocidos para los expertos en la materia.
45 Preparación alternativa de Fmoc-Dap-Z
Se suspendió Aminoácido Z con el grupo carboxi protegido (48,3°mmol) en DMF anhidra (105 ml, Acros) durante 5 minutos y se agregó Fmoc-Dap (19,80 g, 48,3°mmol). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió TBTU 50 (17,08 g, 53,20°mmol, Innovaciones Matrix). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (25,3 ml, 145,0°mmol, Acros) mediante una jeringa durante 3 min. Después de 1 hora, el baño de hielo se retiró y la mezcla se dejó calentar durante 30 min. La mezcla se vertió en agua (1 l) y se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Después de la separación, la capa acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (150 ml, 2 veces). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (150 ml), se secaron (MgSO4) y se filtraron (papel de filtro) para retirar los
55 productos insolubles (inorgánicos y algunos de dibenzofulveno). Después de la concentración, el residuo se adsorbió sobre sílice (41 g) y se purificó mediante cromatografía (columna de 22°cm × 8°cm; heptano al 65 %/EtOAc (2,5 l);. heptano al 33 %/EtOAc (3,8 l), para proporcionar el producto.
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La 3-fenilserina está disponible en Aldrich.
Síntesis de dimetilvalinaValDilDapfenilserina
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A una suspensión de Fmoc-Dap (1,2 g, 2,93°mmoles) en CH2Cl2 anhidro (10 ml) se le añadió carbonato de N,N'
10 disuccinimidilo (901 mg, 1,2 eq) seguido de DIEA (1,28 ml, 2,5 eq). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. Se cargaron cantidades adicionales de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (901 mg, 1,2 eq), seguido de DIEA (1,28 ml, 2,5 eq) y se continuó agitando durante 18 h más. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc; la capa orgánica se lavó con HCl ac. 0,1 M dos veces, después se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío. La cromatografía en columna de gel de sílice en un gradiente escalonado de MeOH del 0 al
15 5%enCH2Cl2 proporcionó 1,12 g (rendimiento del 75 %) de Fmoc-Dap-OSu en forma de una espuma de color blanco.
Se suspendió Fmoc-Dap-OSu (0,615 g, 1,21°mmol) en DMSO seco (6 ml). Se añadió D,L-treo-3-fenil serina (0,2 g, 1,1°mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se cargó 20 directamente en RP-HPLC preparativa y el producto se aisló en un gradiente lineal de MeCN del 10 al 90 % en TFA acuoso al 0,1 %. La Fmoc-Dap-fenilserina obtenida, 280 mg (rendimiento del 44 %), se suspendió en CH2Cl2 seco (2 ml) y se trató con dimetilamina (2 ml) durante 4 horas a temperatura ambiente. Los productos volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se co-evaporó con Et3N/CH2Cl2 3 veces para retirar la mayor cantidad posible de dietilamina, después se secó al vacío durante la noche. El residuo se trituró con éter exhaustivamente para retirar el
25 DBF. La Dap-fenilserina se secó y se usó sin purificación adicional.
Se suspendieron dimetilVal-Val-Dil-COOH (130 mg, 0,3°mmol, 1 eq), N-hidroxisuccinimida (39 mg, 0,3°mmol, 1 eq) y DCC (93 mg, 1,5 eq) en CH2Cl2 seco (1,5 ml). A esto, se le añadió DMAP (1 mg, cat.) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se separó por filtración. El dimetilVal-Val-Dil-OSu 30 obtenido de este modo se suspendió en CH2Cl2 (2 ml) y la mezcla se añadió a Dap-fenilserina, seguido de DMSO (4 ml) y DIEA (100 uL). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se separó por filtración. Se reemplazó el CH2Cl2 por DMSO y el producto se aisló por RP-HPLC preparativa (gradiente lineal de MeCN, del 10 al 90 % en TFA ac. al 0,005 %) como dos diastereómeros. Isómero A: 84 mg, espuma de color blanco. CL-EM m/z (EN+) 762,67 (M+H)+ a 10,58 min. Isómero B: 62 mg de sólido de color blanco. CL-EM m/z
35 (EN+) 762,54 (M+H)+ a 10,67 min.
Síntesis de NmetilvalinaValDilDapfenilserina
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40
Puede prepararse MeVal-Val-Dil-Dap-fenilserina como se ha descrito anteriormente usando tripéptido de FmocMeVal-Val-Dil. El Fmoc puede retirarse por escisión más tarde del fármaco final de acuerdo con el Procedimiento General E.
45
La 3-fenilserina apropiadamente protegida puede someterse a condiciones de oxidación, por ejemplo, clorocromato de piridinio (PCC)/piridina (véase, por ejemplo, Syntheses, 1982, 245, 881, revisión), a fin de proporcionar la cetona correspondiente. La cetona puede convertirse además en diversos hidrazonas (hidrazonas, acil hidrazonas, semicarbazonas, tiosemicarbazonas, etc.) como se describe, por ejemplo, por Kaneko et al. Bioconjugate Chemistry,
5 1991, 2(3), 133-141. Como alternativa el grupo hidroxilo de la 3-fenilserina protegida en el amino y el carboxilato puede condensarse fácilmente con diversos ácidos usando la química DCC/DMAP para proporcionar ésteres (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH, 1999, pág.1937).
El éster de metilfosfonato de 3-fenilserina puede generarse haciendo reaccionar diimidazolida metilfosfónica (a partir
10 de dicloruro metilfosfónico disponible en el mercado, Aldrich) con 3-fenilserina protegida seguida de hidrólisis acuosa.
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15 Puede generarse éster de fosfato de 3-fenilserina mediante un procedimiento similar a partir de oxicloruro de fósforo (Aldrich). Pueden usarse químicas similares a las descritas anteriormente para la preparación de diversos derivados de serina y treonina.
Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-Ot-Bu siguiendo 20 el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 6 - Síntesis de compuestos de MMAZ
Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que 25
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Pueden prepararse convenientemente diaminoácidos enantioméricamente puros que se muestran a continuación en los que Hal es un halógeno como se describe en Zhou et al. 1999, Tetrahedron: Asymmetry 10 (5): 855-862.
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Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4. Ejemplo 7 - Síntesis de compuestos de MMAZ Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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Los beta-alcoxi-aminoácidos anteriores, donde R = alquilo, ciclohexilo, fenilo, bencilo, etc., pueden sintetizarse como se describe en Bulletin of the Chemicals Society of Japan, 1982, 55 (9): 3049-50.
5 Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 11 - Síntesis de compuestos de MMAZ 10 Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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15 Los análogos de fenilalanina se sintetizan como se describe a continuación. Se escindieron aziridinas (Azi) (a continuación), en las que Z = PhCH2O2C; R = H o Me y R1= PhCH2 o Me, mediante alcoholes, R2OH, en los que R2 = Me, Me2CH, EtCHMe, Me3C, ciclohexilo, PhCH2, Ph o similares, en presencia de BF3Et2O para proporcionar derivados de serina y treonina ópticamente puros R2OCHRCH(NHZ)CO2R1 . Estos últimos se desprotegieron mediante hidrogenólisis y saponificación para proporcionar el correspondiente R2OCHRCH(NH2)CO2H.
20
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Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4. Ejemplo 12 - Síntesis de compuestos de MMAZ Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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30
Se sintetizan deshidrofenilalanina y otros deshidroaminoácidos como se describe en Mathur et al., 2004, Biopolymers 76 (2): 150-161.
35 Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 11 - Síntesis de compuestos de MMAZ Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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5
Pueden sintetizarse β,β-dimetil-fenilalanina y β,β-dimetil-tirosina como se describe por Jonsson y Mikiver, 1976, Acta Pharmaceutica Suecica 13 (1): 75-8. El calentamiento a reflujo de PhCMe2CH(CN)CO2Et con N2H4 en MeOH proporciona un 93 % de la hidrazida con un producto secundario de pirazolidina con un rendimiento del 3,5 %. La
10 diazotación secuencial, la degradación de Curtius y la hidrólisis proporcionan un 74 % de PhCMe2CH(NH2)CO2H. Puede prepararse β,β-dimetiltirosina de manera similar.
Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4. 15 Ejemplo 14 - Síntesis de compuestos de MMAZ
Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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20 Puede prepararse ácido 4-(1-amino-2-feniletil)benzoico como se describe en Journal of Medicinal Chemistry 38 (10): 1600-7 (1995). 25 Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4. Ejemplo 15 - Síntesis de compuestos de MMAZ 30 Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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Los análogos de fenilalanina se sintetizan siguiendo los procedimientos descritos en Toth et al., 2004, Journal of the 35 American Chemical Society 126 (34): 10538-10539.
Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4. Ejemplo 16 - Síntesis de compuestos de MMAZ Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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10 Se sintetizan análogos β,β-difluoro del ácido α-oxo-β-fenilpropiónico y fenilalanina como se muestra a continuación siguiendo los procedimientos descritos en Schlosser et al., 2004, Tetrahedron 60 (35): 7731-7742 y Roff et al., 2004, Journal of the American Chemical Society 126 (13): 4098-4099. Un procedimiento simple de tres etapas convierte los (2-bromo-1,1-difluoroetil)arenos fácilmente accesibles en α-aril-α,α-difluoroacetaldehídos. Las posteriores hidrocianación, hidrólisis, oxidación e hidrólisis adicional proporcionaron ácidos β-aril-β,β-difluoro-α-oxopropiónicos.
15 La aminación reductora transforma los oxo ácidos en una mezcla separable de α-hidroxiácidos y derivados de β,βdifluoro-β-fenilalanina racémica. Se obtiene β,β-difluorofenilalanina enantioméricamente pura cuando se condensa α,α-difluoro-α-fenilacetaldehído con 1-feniletilamina homoquiral, se añade cianuro de hidrógeno a la imina resultante, la mezcla diastereomérica producida de este modo se hidroliza a las carboxamidas que se pueden separar mediante cristalización fraccionada o cromatografía.
20 Ejemplo 17 - Síntesis de compuestos de MMAZ
Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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25
Puede prepararse una serie de diastereoisómeros ((2R,3S)-, (2S,3R)-, (2S,3S)- y (2R,3R)) de análogos de β-metil-βarilalanina en forma enantioméricamente pura usando una combinación de quimiocatálisis y biocatálisis. A partir de MeL-treoninato, se obtiene una gama de dideshidroaminoácidos β,β-disustituidos en forma de sus isómeros (Z). La
30 hidrogenación asimétrica, usando ya sea [Rh(R,R)-Et-DuPhos(COD)]BF4 o [Rh(S,S)-Et-DuPhos(COD)]BF4 como catalizador, seguida de hidrólisis proporcionó los isómeros (2R,3S) y (2S,3R), respectivamente. La posterior estereoinversion enzimática del isómero (2R,3S) con D-aminoácido oxidasa y la estereoinversion del isómero (2S,3R) con L-aminoácido oxidasa en combinación con NH3•BH3 proporcionan los isómeros (2S,3S) y (2R,3R) restantes, respectivamente.
35 Ejemplo 18 - Síntesis de compuestos de MMAZ
Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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40
Síntesis de ácidos 2-amino-4-fosfonobutanoicos:
Los ácidos 2-amino-4-fosfonobutanoicos anteriores, donde Ar = fenilo, 3-piridilo y 2-tienilo, se sintetizan como se 45 describe en Ruiz et al., 2003, Journal of Organic Chemistry 68 (20): 7634-7645.
Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo
el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 19 - Síntesis del MMAZ de la fórmula anterior en la que:
Las adiciones de conjugado de éteres de bislactima litiados derivados de ciclo[Gly-Val] y ciclo[Ala-Val] a vinilfosfonatos α-, β- o α,β-sustituidos permiten el acceso directo y estereoselectivo a diversos ácidos 2-amino-4
5 fosfonobutanoicos 3- o 4-monosustituidos y 2,3-, 2,4- o 3,4-disustituidos (derivados AP4) en forma enantioméricamente pura. La estereoquímica relativa puede asignarse mediante análisis por difracción de rayos X o estudios por RMN de derivados de 1,2-oxafosforinano. Se recurre a estructuras del estado de transición "compacto" y "relajado" de 8 miembros, competitivas, parar racionalizar el resultado estereoquímico de las adiciones de conjugado.
10 Ejemplo 20 - Síntesis de compuestos de MMAZ
Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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15
La síntesis de histidinas beta-sustituidas se describe en Wang et al., 2000, Tetrahedron Letters 41 (9): 1307-1310.
Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo 20 el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 21 - Síntesis de compuestos de MMAZ
Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que: 25
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Se sintetizan beta-fluoroaminoácidos como se describe en Davis et al., 1999, Journal of Organic Chemistry 64 (18): 6931-6934.
30 Se prepara MMAZ usando el análogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dilOtBu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 22- Síntesis de compuestos de MMAZ 35 Esta síntesis describe la preparación de compuestos de MMAZ en los que:
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40 Pueden prepararse ácidos glutámicos beta-sustituidos, como el anterior, como se describe en Ezquerra et al., 1999, Journal of Organic Chemistry 64 (18): 6554-6565. La reacción de los enolatos de litio de ésteres de glicina protegidos en N aquirales con complejos de cromo de alcoxialquenilcarbeno quirales proporciona los aductos de Michael correspondientes, con alta selectividad anti o sin dependiendo de la naturaleza del grupo protector de nitrógeno y alta selectividad diastereofacial cuando se emplean complejos de carbeno que contienen el grupo (-)-8
45 fenilmetiloxi. La posterior oxidación del resto de metalcarbeno seguida de la desprotección del grupo amina y la hidrólisis de ambos ésteres carboxílicos proporciona ácidos glutámicos 3-sustituidos enantioméricamente enriquecidos de estereoquímica natural así como no natural. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar complejo de carbeno con enolato de litio de glicina para proporcionar el aducto de adición de Michael, que puede oxidarse para
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(disponible en el mercado de Advanced ChemTech);
(disponible en el mercado de Pharmacore Products);
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(disponible en el mercado de Fluka);
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15 (disponibles en el mercado de Peptech),
(disponible en el mercado de Bachem);
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(disponible en el mercado de ChemStep); (disponible en el mercado de Chem IMPX);
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(disponibles en el mercado de Advanced ChemTech);
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(disponibles en el mercado de Sigma);
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(disponibles en el mercado de Apolo Scientific Ltd.);
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10 (disponible en el mercado de DSL Chemicals (Shanghai) Co., Ltd.); (disponibles en el mercado de Salor);
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(disponibles en el mercado de Synchem OHG);
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15 (disponible en el mercado de Sequoia Research Products Ltd.);
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(disponibles en el mercado de JRD Fluorochemicals);
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(disponibles en el mercado de Fluka);
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(disponibles en el mercado de Advanced ChemTech);
imagen171
(disponibles en el mercado de Tyger Scientific);
imagen172
(disponible en el mercado de AMRI Fine Chemicals);
imagen173
(disponibles en el mercado de Synthetech) ;
imagen174
(disponibles en el mercado de Apin Chemicals);
imagen175
10 (disponibles en el mercado de Biocatalytics, Inc.);
imagen176
(disponibles en el mercado de AG Scientific);
imagen177
imagen178
(disponibles en el mercado de Qventas);
imagen179
(disponibles en el mercado de Encyclopedia of Amino Acid Analogs and Chiral Building Blocks);
imagen180
10 (disponibles en el mercado de Bachem);
imagen181
imagen182
imagen183
imagen184
imagen185
(disponibles en el mercado de Acros);
imagen186
(disponible en el mercado de Organics);
imagen187
(disponibles en el mercado de ChemPacific);
imagen188
imagen189
(disponible en el mercado de Rare Chemicals GmbH);
imagen190
(disponible en el mercado de AstaTech);
imagen191
(disponible en el mercado de Austin);
imagen192
15 (disponible en el mercado de Advanced Asymmetrics, Inc.);
imagen193
(disponible en el mercado de Tocris Cookson Inc.);
imagen194
(disponible en el mercado de Chem Service, Inc.); y
imagen195
(disponible en el mercado de Synchem OHG, Alemania).
Ejemplo 24 Síntesis de compuestos de MMAZ
También pueden prepararse compuestos de MMAZ usando los siguientes análogos de fenilalanina disponibles en el mercado, ya sea en forma de sus aminoácidos protegidos o no protegidos incorporados en la síntesis en fase sólida
o en solución como se ha descrito anteriormente: 4-cloro-fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina, 4-nitro-fenilalanina, N-αmetil-fenilalanina, α-metil-fenilalanina, ácido glutámico, ácido aspártico, triptófano, isoleucina, leucina, metionina, tirosina, glutamina, treonina, valina, asparagina, fenilglicina, O-bencil-serina, O-t-butil-serina, O-t-butil-treonina, homofenilalanina, metionina-DL-sulfóxido, metionina-sulfona, ácido α-aminobutírico, ácido α-aminoisobutírico, ácido 4-amino-1-piperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-tetrahidropiran-4-carboxílico, ácido aspártico, benzotiazol-2-ilalanina, α-t-butil-glicina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, S-acetamidometilo-penicilamina, β-3-piperidin-3-ilalanina, piperidinilo-glicina, pirrolidinilalanina, selenocisteína, tetrahidropiran-4-il-glicina, O-bencil-treonina, O-t-butiltirosina, 3-(p-acetilfenil)alanina, 3-fenilserina y ácido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico.
Ejemplo 25 Síntesis de MC-MMAZ
Puede prepararse maleimidocaproil-MeVal-Val-Dil-Dap-Z siguiendo el Procedimiento general S.
En resumen, se enfrían ácido maleimidocaproico (30 mg, Molecular BioSciences) y DMF anhidro (10 µl) en un matraz de vidrio de 10 ml en atmósfera de Ar (globo), en hielo seco durante 5 min. A esta mezcla se le añade cloruro de oxalilo (1 ml) con una jeringa. (Se produce un aumento vigoroso de la reacción y la presión). Después de 5 min, la mezcla se deja calentar a temperatura ambiente y se deja durante 30 min con agitación manual ocasional. Los productos volátiles se retiran en rotavapor, el residuo se co-evapora con CH2Cl2 anhidro (1 ml) y se seca en bomba de vacío durante la noche. El producto se genera inicialmente en forma de un sólido de color blanco, volviéndose progresivamente un sólido de color blanquecino a marrón. RMN-1H en CDCl3: 1,26-1,32 (2H, m), 1,51-1,59 (2H, m), 1,63-1,70 (2H, m), 2,82 (2H, t), 3,46 (2H, t), 6,70 (2H, s) ppm. El material hidrolizado puede detectarse mediante un triplete a 2,35 ppm. El producto se usa si la integral del triplete a 2,42 ppm no excede del 20 % del triplete a 3,46 ppm.
Puede prepararse cloruro de maleimidocaproílo como se ha descrito anteriormente y se disuelve en CH2Cl2 anhidro (3 ml).
Se disuelven MMAZ (1 eq.) y diisopropiletilamina (~ 4 eq.) en CH2Cl2 anhidro en un matraz de vidrio equipado con barra de agitación magnética y tapón de goma. La mezcla de reacción se enfría en el baño de hielo durante 10 min y se añade solución de cloruro de maleimidocaproílo (-1,1 eq.) mediante una jeringa. Después de 15 min en hielo, se deja que la mezcla de reacción se caliente hasta la temperatura ambiente y la agitación continúa durante 2 horas más. Después, el disolvente se retira al vacío. El residuo se suspende en DMSO (0,5 ml). Después, se añade agua (100 µl) y después de 0,5 h la mezcla se carga en una columna de HPLC preparativa para la separación: columna C12 Phenomenex Synergi MAX-RP, 4 µl, 250 × 10°mm, 80 Å. El control se realiza a 215 nm. Las fracciones que contienen producto se concentran en rotavapor, se co-evaporan con acetonitrilo (5 ml, 2 veces), después con la mezcla de CH2Cl2 y hexano para proporcionar el material final.
Ejemplo 26 - Síntesis de un análogo de MC-MMAZ
La síntesis de un análogo de MC-MMAZ se muestra a continuación.
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Se suspende MeVal-Val-Dil-Dap-Z-GP (compuesto 1, 0,044°mmol) en DMF (0,250 ml). Se añaden ácido 4-(2,5dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-benzoico (11 mg, 0,049°mmol) y HATU (17 mg, 0,044°mmol) seguidos de DIEA 5 (0,031 ml, 0,17°mmol). Esta mezcla de reacción se deja en agitación durante 2,0 h. El análisis por HPLC indica el consumo completo del compuesto de partida 1. El producto se aísla mediante RP-HPLC preparatoria usando una columna de 80 Å Phenomenex C12 Synergi Max-RP (250 × 21,20°mm). El eluyente es un gradiente lineal de MeCN del 10 % al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) durante 8 minutos, después, MeCN al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocrático durante 12 minutos adicionales. Se suspende MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Z-GP (0,0385°mmol) en CH2Cl2 (1ml) y TFA
10 (1 ml). La mezcla se agita durante 2 h y después los extractos orgánicos volátiles se evaporan a presión reducida. El producto (MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Z) se purifica mediante RP-HPLC preparatoria, usando una columna de 80 Å Phenomenex C12 Synergi Max-RP (250 × 21,20°mm). El eluyente es un gradiente lineal de MeCN del 10 % al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) durante 8 minutos, después, MeCN al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocrático durante 12 minutos adicionales..
15 Ejemplo 27 Preparación de MC-val-cit-PAB-MMAZ (9)
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20 Se recogen Compuesto 1 (0,11°mmol), Compuesto AB (85 mg, 0,12°mmol, 1,1 eq.) y HOBt (2,8 mg, 21°µmol, 0,2 eq.), en DMF seca (1,5 ml) y piridina (0,3 ml), mientras están en atmósfera de argón. Después de 30 h, se
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cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando MeOH al 10 %/CH2Cl2. Se recupera Fmoc-MeValCit-PAB-OH puro (por ejemplo, 0,55 g, 0,896°mmol, rendimiento del 18,5 %).
A una suspensión de Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0,55 g, 0,896°mmol) en CH2Cl2 (40 ml) se le añade
5 STRATOSPHERES™ (piperazina-resina ligadas) (> 5°mmol/g, 150 mg). Después de agitarse a temperatura ambiente durante 16 h, la mezcla se filtra a través de celite (prelavado con MeOH) y se concentra a presión reducida. El residuo se tritura con éter dietílico y hexanos. El material sólido resultante, MeVal-Cit-PAB-OH, se suspende en CH2Cl2 (20 ml) y se le añaden MC-OSu (0,28 g, 0,896°mmol), DIEA (0,17 ml, 0,99°mmol) y DMF (15 ml). Esta suspensión se agita durante 16 h. Si el análisis por HPLC de la mezcla de reacción indica una reacción
10 incompleta, la suspensión se concentra a presión reducida a un volumen de 6 ml, después se añade una solución al 10 % de NaHCO3 (ac.) y la suspensión se agita durante 16 h adicionales. El disolvente se retira a presión reducida y el residuo se purifica mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de MeOH al 0-10 %/CH2Cl2, dando como resultado MC-MeVal-Cit-PAB-OH (por ejemplo, 42 mg (0,072°mmol, rendimiento del 8 %)).
15 A una suspensión de MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2,37 g, 4,04°mmol) y bis(nitrofenil)carbonato (2,59 g, 8,52°mmol) en CH2Cl2 (10 ml) se le añade DIEA (1,06 ml, 6,06°mmol). Esta suspensión se agita durante 5,5 h, se concentra a presión reducida y se purifica mediante trituración con éter dietílico. Se suspende MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0,196°mmol) en una solución 1:5 de piridina/DMF (3 ml) y se les añaden HOBt (5 mg, 0,039°mmol), DIEA
20 (0,17 ml, 0,978°mmol) y MMAZ (0,205°mmol). Esta mezcla de reacción se agita durante 16 horas a temperatura ambiente y después se purifica mediante RP-HPLC preparativa (3 veces), usando una columna de 80 Å Phenomenex C12 Synergi Max-RP (250 x 21,20°mm). El eluyente es un gradiente lineal de MeCN del 10 % al 90 %/TFA al 0,05 % (ac) durante 30 minutos, después MeCN al 90 %/TFA al 0,05 % (ac) isocrático durante 20 minutos. Se obtiene MC-MeVal-Cit-PAB-MMAZ.
25 Ejemplo 31 - Preparación de éster de succinimida de suberil-Val-Cit-PAB-MMAZ
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30 Se suspenden Compuesto 1 (0,38°mmol), Fmoc-Val-Cit-PAB-pNP (436 mg, 0,57°mmol, 1,5 eq.) en piridina anhidra, se añaden 5 ml de HOBt (10 mg, 0,076°mmol, 0,2 eq.) seguido de DIEA (199 µl, 1,14°mmol, 3 eq.). La mezcla de reacción se somete a ultrasonidos durante 10 min y después se agita durante la noche a temperatura ambiente. La piridina se retira a presión reducida y el residuo se resuspende en CH2Cl2. La mezcla se separa mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice en un gradiente por etapas de MeOH, del 0 al 10 %, en CH2Cl2. Las
35 fracciones que contienen el producto se recogen, se concentran y se secan al vacío durante la noche para proporcionar Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAZ.
Se suspende Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAZ en CH2Cl2 (2 ml), dietilamina (2 ml) y DMF (2 ml). La mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retira a presión reducida. El residuo se co-evapora con
40 piridina (2 ml), después con tolueno (5 ml, 2 veces) y se seca al vacío. Se obtiene Val-Cit-PAB-MMAZ.
Todo el Val-Cit-PAB-MMAZ preparado a partir de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAZ se suspende en piridina (2 ml) y se añade a una solución de suberato de disuccinimidilo (74 mg, 0,2°mmol, 4 eq.), en piridina (1 ml). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente. Después de 3 horas se añade éter (20 ml). El precipitado se recoge y se
45 lavó con una cantidad adicional de éter. El sólido de color rojizo se suspende en MeOH al 30 %/CH2Cl2 y se filtra a través de un lecho de gel de sílice con MeOH al 30 %/CH2Cl2 como eluyente.
Ejemplo 32 Determinación de la citotoxicidad de compuestos seleccionados
50 La actividad citotóxica de MMAZ y conjugados anticuerpo-fármaco se evalúa en las estirpes celulares positivas para CD70+, por ejemplo, Caki-1, carcinoma de células renales; L428, enfermedad de Hodgkin; U251, glioblastoma. Para evaluar la citotoxicidad de los compuestos, las células pueden sembrarse a aproximadamente 5-10000 por pocillo en 150 µl de medio de cultivo, después, pueden tratarse con dosis graduadas de compuestos por cuadruplicado al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se realizan generalmente durante 96 horas después de la adición de los
55 compuestos de ensayo. Pueden añadirse 50 µl de colorante de resazurina a cada pocillo durante las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. La reducción del colorante puede determinarse mediante espectrometría de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitación y de emisión de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el análisis, el grado de reducción de la resazurina por las células tratadas puede compararse con el de las células de control sin tratar.
5 Ejemplo 33 - Determinación de la citotoxicidad in vitro general
Para evaluar la citotoxicidad de los conjugados, las células se siembran a aproximadamente 5-10000 por pocillo en 150 µl de medio de cultivo y después se tratan con dosis graduadas de conjugados por cuadruplicado al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se realizan durante 96 horas después de la adición de los compuestos de
10 ensayo. Se añaden 50 µl de colorante de resazurina a cada pocillo durante las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. La reducción del colorante se determina mediante espectrometría de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitación y de emisión de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el análisis, el grado de reducción de la resazurina por las células tratadas se compara con el de las células de control sin tratar.
15 Ejemplo 34 – Ensayo de proliferación celular in vitro
La eficacia del CAF puede medirse mediante un ensayo de proliferación celular que emplea el siguiente protocolo (Boletín técnico de Promega Corp. TB288; Mendoza et al., 2002, Cancer Res. 62: 5485-5488):
20
1.
Una alícuota de 100 µl de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (por ejemplo, SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468) en medio, se deposita en cada pocillo de una placa de paredes opacas de pocillos 96.
2.
Se preparan pocillos de control que contienen medio y sin células.
25 3. Se añade CAF a los pocillos experimentales y se incuban durante 3-5 días.
4.
Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
5.
Se añade un volumen de reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pocillo.
6.
Los contenidos se mezclan durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
30 7. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia.
8. La luminiscencia se registra y se presenta en los gráficos como ULR = unidades de luminiscencia relativa.
La Tabla 7 muestra la actividad in vitro de los conjugados hlF6-anticuerpo-MMAZ (h1F6-mc-vc-PAB-MMAZ) contra estirpes celulares CD70+ (U251, L428 y Caki-1). Los conjugados contienen aproximadamente 4 fármacos por
35 anticuerpo.
Tabla 7.
CI50 (ng/ml) de conjugados h1F6MCvalcitPABMMAZ sobre estirpes celulares CD70+
Z
U251 Caki1 L428
(L-2-Clorofenilalanina)
8 4,4 8
(L-Me-Fenilalanina)
8 6 6
(L-Tic)
20 28 Inhibición máxima = 12 % a 1000 ng/ml
(L-beta-homofenilalanina)
11 9 33
(L-Met)
23 18 43
(L-Leu)
14 16 105
(3-Piridil-L-alanina)
16 16 12
(L-4-tiazolilalanina)
6 7 4
(L-Trp)
7,5 6 11
(3-Ciclohexil-L-alanina)
8 10 105
(Glu(OtBu)
43 51 Inhibición máxima = 12 % a 141 ng/ml
(p-Aminofenilalanina)
Ningún efecto Ningún efecto Inhibición máxima = 10 % a 100 ng/ml
fenilalanina (MMAF)
10 7 8

Ejemplo 35 - Aclaramiento plasmático en ratas
La farmacocinética del aclaramiento plasmático de conjugados de fármaco anticuerpo y del anticuerpo total se
5 estudia en ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 250-275 gramos cada una). Los animales se tratan mediante inyección en la vena de la cola en embolada (inyección I.V. lenta). Se recogen aproximadamente 300 µl de sangre completa a través de una cánula yugular o por pinchazo de la cola, en recipientes anticoagulantes con litio/heparina en cada punto temporal: 0 (antes de la dosis), 10 y 30 minutos; 1, 2, 4, 8, 24 y 36 horas; y 2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la dosis. El anticuerpo total se mide mediante ELISA-ECD/GxhuFc-HRP. El conjugado
10 fármaco anticuerpo se mide mediante ELISA - M MAZ/ECD-Bio/SA-HRP.
Ejemplo 36 - Aclaramiento plasmático en monos
La farmacocinética del aclaramiento plasmático de conjugados de fármaco anticuerpo y del anticuerpo total puede 15 estudiarse en macacos, usando un procedimiento similar al descrito anteriormente.
Ejemplo 37 – Eficacia in vivo sobre el volumen tumoral en ratones explantados transgénicos
Pueden obtenerse animales adecuados para experimentos transgénicos de fuentes comerciales convencionales
20 tales como Taconic (Germantown, NY). Muchas cepas son adecuadas, pero se prefieren los ratones hembra FVB debido a su mayor susceptibilidad a la formación de tumores. Pueden usarse machos FVB para el apareamiento y pueden usarse sementales CD.1 vasectomizados para estimular la seudopreñez. Pueden obtenerse ratones
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Claims (1)

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