ES2582552T3 - Acontecimiento de soja DP-305423-1 y composiciones y métodos para su identificación y/o detección - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende la SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 82, 84, 85, 86, 87 o 88, o su complemento.

Description

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imagen4

de plantas individuales de DP-305423-1 (generación T5 y T4) y de un control no modificado (Jack), digerido con Nco I y sondado con la sonda génica gm-fad2-1.

La figura 7 muestra un experimento de hibridación Southern de ADN genómico aislado a partir de tejido foliar de soja de plantas individuales de DP-305423-1 (generación T5 y T4) y de un control no modificado (Jack), digerido con 5 Hind III y sondado con la sonda génica gm-hra.

La figura 8 muestra un experimento de hibridación Southern de ADN genómico aislado a partir de tejido foliar de soja de plantas individuales de DP-305423-1 (generación T5 y T4) y de un control no modificado (Jack), digerido con Nco I y sondado con la sonda génica gm-hra.

La figura 9 proporciona un mapa esquemático del cóntigo-1 que indica diversos elementos genéticos dentro de la 10 inserción-1.

La figura 10 proporciona un mapa esquemático del cóntigo-2 que indica diversos elementos genéticos dentro de la inserción-2.

La figura 11 proporciona un mapa esquemático del cóntigo-3 que indica diversos elementos genéticos dentro de la inserción-3.

15 La figura 12 proporciona un mapa esquemático del cóntigo-4 que indica diversos elementos genéticos dentro de la inserción-4.

La tabla 1 presenta una descripción de las siguientes secuencias que están presentes en la lista de secuencias: (1) las secuencias de inserción empleadas para crear el acontecimiento DP-305423-1 y los vectores de los que se derivan; (2) las secuencia de ADN genómico presentes en el cóntigo-1, cóntigo-2, cóntigo-3 y cóntigo-4; (3) las

20 secuencias de la zona de unión 5’ y 3’, en la que se unen la inserción transgénica y la secuencia genómica de soja endógena, para cada uno de los cuatro cóntigos; y (4) secuencias de cebador que pueden emplearse para amplificar las secuencias de la zona de unión 5’ y 3’ de cada uno de los cuatro cóntigos.

Tabla 1

Tabla resumen de SEQ ID NO:

SEQ ID NO:

Descripción

1

PHP19340A

2

PHP17752A

3

PHP19340

4

PHP17752

5

Cóntigo-1 de DP-305423-1

6

Cóntigo-2 de DP-305423-1

7

Cóntigo-3 de DP-305423-1

8

Zona de unión 5’ de 20-nt del cóntigo-1 (5’ genómico/5’ transgén; 10-nt/10-nt)

9

Zona de unión 3’ de 20-nt del cóntigo-1 (3’ transgén/3’ genómico; 10-nt/10-nt)

10

Zona de unión 5’ de 40-nt del cóntigo-1 (5’ genómico/5’ transgén; 20-nt/20-nt)

11

Zona de unión 3’ de 40-nt del cóntigo-1 (3’ transgén/3’ genómico; 20-nt/20-nt)

12

Zona de unión 5’ de 60-nt del cóntigo-1 (5’ genómico/5’ transgén; 30-nt/30-nt)

13

Zona de unión 3’ de 60-nt del cóntigo-1 (3’ transgén/3’genomic; 30-nt/30-nt)

14

Zona de unión 5’ de 20-nt del cóntigo-2 (5’ genómico/5’ transgén; 10-nt/10-nt)

15

Zona de unión 3’ de 20-nt del cóntigo-2 (3’ transgén/3’ genómico; 10-nt/10-nt)

16

Zona de unión 5’ de 40-nt del cóntigo-2 (5’ genómico/5’ transgén; 20-nt/20-nt)

17

Zona de unión 3’ de 40-nt del cóntigo-2 (3’ transgén/3’ genómico; 20-nt/20-nt)

18

Zona de unión 5’ de 60-nt del cóntigo-2 (5’ genómico/5’ transgén; 30-nt/30-nt)

19

Zona de unión 3’ de 60-nt del cóntigo-2 (3’ transgén/3’ genómico; 30-nt/30-nt)

20

Zona de unión 5’ de 20-nt del cóntigo-3 (5’ genómico/5’ transgén; 10-nt/10-nt)

Tabla resumen de SEQ ID NO:

SEQ ID NO:

Descripción

21

Zona de unión 3’ de 20-nt del cóntigo-3 (3’ transgén/3’ genómico; 10-nt/10-nt)

22

Zona de unión 5’ de 40-nt del cóntigo-3 (5’ genómico/5’ transgén; 20-nt/20-nt)

23

Zona de unión 3’ de 40-nt del cóntigo-3 (3’ transgén/3’ genómico; 20-nt/20-nt)

24

Zona de unión 5’ de 60-nt del cóntigo-3 (5’ genómico/5’ transgén; 30-nt/30-nt)

25

Zona de unión 3’ de 60-nt del cóntigo-3 (3’ transgén/3’ genómico; 30-nt/30-nt)

26

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 05-O-975

27

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 05-O-977

28

Cebador de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 05-QP22

29

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 06-O-1573

30

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 06-O-1487

31

Cebador directo de la zona de unión 3’ del cóntigo-1 06-O-1414

32

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-1 06-O-1579

33

Cebador directo de la zona de unión 3’ del cóntigo-1 06-O-1577

34

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-1 06-O-1579

35

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-2 06-O-1586

36

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-2 06-O-1585

37

Cebador directo de la zona de unión 3’ del cóntigo-2 06-O-1404

38

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-2 06-O-1590

39

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-3 06-O-1626

40

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-3 06-O-1366

41

Cebador directo de la zona de unión 3’ del cóntigo-3 06-O-1569

42

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-3 06-O-1551

43

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 06-O-1571

44

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 06-O-1572

45

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 06-O-1351

46

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-1 06-O-1367

47

Cebador directo de la inserción del cóntigo-1 06-O-1357

48

Cebador inverso de la inserción del cóntigo-1 06-O-1368

49

Cebador inverso de la inserción del cóntigo-1 06-O-1369

50

Cebador directo de la inserción del cóntigo-1 06-O-1356

51

Cebador inverso de la inserción del cóntigo-1 06-O-1371

52

Cebador directo de la inserción del cóntigo-1 06-O-1360

53

Cebador inverso de la inserción del cóntigo-1 06-O-1423

54

Cebador directo de la inserción del cóntigo-1 06-O-1363

55

Cebador directo de la inserción del cóntigo-1 06-O-1421

56

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-1 06-O-1578

57

Cebador directo de la región 5’ del contigo-1 07-O-1889

58

Cebador inverso de la región 5’ del contigo-1 07-O-1940

Tabla resumen de SEQ ID NO:

SEQ ID NO:

Descripción

59

Cebador inverso de la región 3’ del contigo-1 07-O-1892

60

Cebador directo de la región 3’ del contigo-1 07-O-1894

61

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-2 06-O-1588

62

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-2 06-O-1403

63

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-2 06-O-1592

64

Cebador directo de la región 5’ del contigo-2 07-O-1895

65

Cebador inverso de la región 5’ del contigo-2 07-O-1898

66

Cebador directo de la región 3’ del contigo-2 07-O-1905

67

Cebador inverso de la región 3’ del contigo-2 07-O-1903

68

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-3 06-O-1669

69

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-3 06-O-1426

70

Cebador directo de la inserción del cóntigo-3 06-O-1355

71

Cebador inverso de la inserción del cóntigo-3 06-O-1459

72

Cebador directo de la zona de unión 3’ del cóntigo-3 05-O-1182

73

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-3 06-O-1672

74

Cebador directo de la región 5’ del contigo-3 07-O-1881

75

Cebador inverso de la región 5’ del contigo-3 07-O-1882

76

Cebador directo de la región 3’ del contigo-3 07-O-1886

77

Cebador inverso de la región 3’ del contigo-3 07-O-1884

78

Cebador directo de la zona de unión 5’ del cóntigo-4 HOS-A

79

Cebador inverso de la zona de unión 5’ del cóntigo-4 HOS-B

80

Cebador inverso de la zona de unión 3’ del cóntigo-4 HOS-C

81

Cebador directo de la zona de unión 3’ del cóntigo-4 HOS-D

82

Cóntigo-4 de DP-305423-1

83

Zona de unión 5’ de 20-nt del cóntigo-4 (5’ genómico/5’ transgén; 10-nt/10-nt)

84

Zona de unión 3’ de 20-nt del cóntigo-4 (3’ transgén/3’ genómico; 10-nt/10-nt)

85

Zona de unión 5’ de 40-nt del cóntigo-4 (5’ genómico/5’ transgén; 20-nt/20-nt)

86

Zona de unión 3’ de 40-nt del cóntigo-4 (3’ transgén/3’ genómico; 20-nt/20-nt)

87

Zona de unión 5’ de 60-nt del cóntigo-4 (5’ genómico/5’ transgén; 30-nt/30-nt)

88

Zona de unión 3’ de 60-nt del cóntigo-4 (3’ transgén/3’ genómico; 30-nt/30-nt)

89

Cebador directo QPCR de la zona de unión 5’ del cóntigo-1

90

Cebador inverso QPCR de la zona de unión 5’ del cóntigo-1

91

Sonda QPCR de la zona de unión 5’ del cóntigo-1

92

Cebador directo QPCR de SAMS-HRA

93

Cebador inverso QPCR de SAMS-HRA

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Sonda QPCR de SAMS-HRA

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá con más detalle a continuación remitiéndose los dibujos adjuntos, en los que se 8

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muestran algunas, pero no todas, de las realizaciones de la invención.

A los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención se les ocurrirán muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención indicada en la presente, aprovechando las indicaciones presentadas en las anteriores descripciones y los dibujos asociados. Aunque en la presente se emplean términos y expresiones específicos, estos se emplean solo en un sentido genérico y descriptivo, y no pretenden ser limitantes.

En la descripción de la presente invención se emplean las siguientes abreviaturas:

ALS: proteína de acetolactato sintasa

pb: par de bases

FAD2: proteína de omega-6 desaturasa microsómica

gm-fad2-1: gen 1 de omega-6 desaturasa microsómica de soja

gm-als: gen de acetolactato sintasa de tipo salvaje de soja

gm-hra: versión modificada del gen de acetolactato sintasa de soja

kb: kilobase

PCR: reacción en cadena de polimerasa

UTR: región no traducida

Se proporcionan composiciones y métodos relacionados con plantas de sojas tolerantes al inhibidor de ALS/con alto contenido en ácido oleico transgénicas. De modo específico, la presente invención proporciona plantas de soja que contienen un acontecimiento DP-305423-1. Una planta de soja que contiene el "acontecimiento DP-305423-1" se ha modificado mediante la inserción de un módulo de supresión que contiene un fragmento de 597 pb del gen 1 de omega-6 desaturasa microsómica de soja (gm-fad2-1) y un módulo de expresión que contiene una versión modificada del gen de acetolactato sintasa de soja (gm-hra). La inserción del módulo de supresión de gm-fad2-1 en la planta confiere un fenotipo de alto contenido en ácido oleico. La inserción del gen gm-hra produce una forma modificada de la enzima acetolactato sintasa (ALS). La ALS es fundamental para la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada y es inhibida por ciertos herbicidas. La modificación en el gen gm-hra supera esta inhibición y, por tanto, proporciona tolerancia a una amplia gama de herbicidas inhibidores de ALS. Así, una planta de soja que contenga un acontecimiento DP-305423-1 tiene un fenotipo de alto contenido en ácido oleico y es tolerante al menos a un herbicida inhibidor de ALS.

Los polinucleótidos que confieren el fenotipo de alto contenido en ácido oleico y tolerancia al inhibidor de ALS están enlazados genéticamente en el genoma de soja en el acontecimiento DP-305423-1 de soja. La planta de soja que porta el acontecimiento DP-305423-1 comprende zonas de unión genómicas/del transgén que tienen al menos la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:8, 9, 14, 15, 20, 21, 83, y 84. La caracterización del sitio de inserción genómico del acontecimiento DP-305423-1 proporciona una mayor eficacia de reproducción y permite el uso de marcadores moleculares para seguir la pista de la inserción del transgén en las poblaciones reproductoras y su progenie. En la presente se proporcionan diversos métodos y composiciones para la identificación, la detección y el uso de acontecimientos DP-305423-1 de soja. Tal como se emplea en la presente, la expresión "específico del acontecimiento DP-305423-1" se refiere a una secuencia polinucleotídica que es adecuada para identificar, de modo discriminante, el acontecimiento DP-305423-1 en plantas, material vegetal, o en productos tales como, pero sin limitase a productos alimentarios o de piensos (frescos o procesados) que comprenden o se derivan de material vegetal.

Tal como se emplea en la presente, el término "soja" significa Glycine max e incluye todas las variedades de plantas que pueden cruzarse con la soja. Tal como se emplea en la presente, el término planta incluye células vegetales, órganos vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido de células vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse plantas, callos vegetales, matas vegetales, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, tallos, raíces, zonas apicales de las raíces, anteras y similares. Grano significa la semilla madura producida por cultivadores comerciales para objetivos distintos del crecimiento o la reproducción de la especie. En la presente se describen la progenie, los variantes y los mutantes de las plantas regeneradas que comprenden el acontecimiento DP-305423-1.

Un "acontecimiento" transgénico se produce mediante la transformación de células vegetales con una o más construcciones de ADN heterólogas, que incluyen un módulo de expresión de ácido nucleico que comprende un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas que resultan de la inserción del transgén en el genoma de la planta, y la selección de una planta concreta que se caracteriza por la inserción en una localización genómica concreta. Un acontecimiento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgén o transgenes. A nivel genético, un acontecimiento es parte de la constitución genética de una planta. El término "acontecimiento" también se refiere a la progenie producida mediante reproducción sexual entre el transformante y otra variedad que

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incluye el ADN heterólogo. Incluso después de repetidos retrocruzamientos hasta lograr un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante del progenitor transformado están presentes en la progenie del cruzamiento en la misma localización cromosómica. El término "acontecimiento" también se refiere a ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y la secuencia flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se espera que sea transferido a la progenie que recibe el ADN insertado que incluye el transgén de interés, como resultado de una reproducción sexual de una línea progenitora que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie que resulta de la autofecundación) y una línea progenitora que no contiene el ADN insertado.

Tal como se emplea en la presente, una "inserción de ADN" se refiere al ADN heterólogo dentro de los módulos de expresión empleados para transformar el material vegetal, mientras que el "ADN flanqueante" puede comprender ADN genómico presente en la naturaleza en un organismo, tal como una planta, o ADN extraño (heterólogo) introducido a través del proceso de transformación, que es extraño a la molécula de la inserción de ADN original, por ejemplo, fragmentos asociados con el acontecimiento de transformación. Una "región flanqueante" o "secuencia flanqueante", tal como se emplea en la presente, se refiere a una secuencia de al menos 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500, o 5000 pares de bases o mayor, que se localiza inmediatamente cadena arriba y contigua,

o inmediatamente cadena abajo y contigua, a la molécula de la inserción de ADN extraño original. Se indican ejemplos de las regiones flanqueantes del acontecimiento DP-305423-1 en SEQ ID NO:5, 6, 7 y 82 y sus fragmentos.

Los procedimientos de transformación que conducen a la integración aleatoria del ADN extraño producirán transformantes que contienen diferentes regiones flanqueantes características y exclusivas para cada transformante. Una "zona de unión" es un punto en el que se unen dos fragmentos de ADN específicos. Por ejemplo, existe una zona de unión en donde la inserción de ADN se une al ADN genómico flanqueante. También existe un punto de zona de unión en un organismo transformado en donde dos fragmentos de ADN se unen de una manera que es distinta de la que se encuentra en el organismo nativo. Tal como se emplea en la presente, un "ADN de zona de unión" se refiere al ADN que comprende un punto de zona de unión. Se indican ejemplos de ADN de zona de unión del acontecimiento DP-305423-1 en SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 82, 83, 84, 85, 86, 87 o 88, o sus fragmentos.

Puede obtenerse una planta DP-305423-1 realizando en primer lugar una reproducción sexual entre una primera planta de soja progenitora cultivada a partir de la planta de soja DP-305423-1 transgénica (o su progenie derivada de la transformación con los módulos de expresión descritos en la presente que confieren tolerancia a herbicidas) y una segunda planta de soja progenitora que carece del fenotipo de tolerancia al herbicida, produciendo con ello una pluralidad de plantas de la primera progenie; y después seleccionando una planta de la primera progenie que muestre la tolerancia al herbicida deseada; y realizando una autofecundación con la planta de la primera progenie, produciendo con ello una pluralidad de plantas de la segunda progenie; y después seleccionando, a partir de las plantas de la segunda progenie, las plantas que muestran la tolerancia al herbicida deseada. Estas etapas pueden incluir además el retrocruzamiento de la planta de la primera progenie tolerante al herbicida o la planta de la segunda progenie tolerante al herbicida, con la segunda planta de soja progenitora o una tercera planta de soja progenitora, produciendo con ello una planta de soja que muestra la tolerancia al herbicida deseada. También se reconoce que no es necesario ensayar la progenie para el fenotipo. Pueden emplearse diversos métodos y composiciones, tal como se describe en otros puntos en la presente, para detectar y/o identificar el acontecimiento DP-305423-1.

Además se entiende que dos plantas transgénicas diferentes también pueden cruzarse para producir descendencia que contenga dos genes exógenos añadidos que se segregan independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos. También se contempla el retrocruzamiento hasta la planta progenitora y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica, así como la propagación vegetativa. Pueden encontrarse descripciones de otros métodos de reproducción que se emplean habitualmente para diferentes rasgos y cultivos en una de varias referencias bibliográficas, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

Una aplicación particularmente útil de la invención reivindicada es combinar el rasgo de alto contenido en ácido oleico del acontecimiento DP-305423-1 con otras líneas de soja que tengan composiciones alteradas de ácidos grasos para obtener líneas de progenie con nuevas composiciones de ácidos grasos y/o mejores rasgos agronómicos. Las otras líneas de soja pueden ser líneas mutantes, líneas transgénicas, o líneas transgénicas que también comprenden un gen mutado. Los transgenes de DP-305423-1 pueden combinarse con genes mutantes u otros transgenes realizando un cruzamiento genético o transformando la otra línea de soja con las construcciones de ADN recombinante descritas en la presente.

Como ejemplos, el rasgo de alto contenido en ácido oleico de la invención puede combinarse con una línea mutante que tenga un fenotipo de alto contenido en ácido esteárico, tal como la línea de soja A6 [Hammond, E. G. y Fehr, W.

R. (1983)] o con una línea mutante que tenga un fenotipo de bajo contenido en ácido linolénico, tal como las líneas de soja mutantes A5, A23, A16 y C1640 [Fehr, W. R. et al. (1992), en Crop Science, 32:903-906]. Los aceites producidos a partir de dichas combinaciones proporcionarán mejores materias primas para la producción de

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margarinas, mantecas, aceites de revestimiento por pulverización y para freír, que eliminen o reduzcan la necesidad de una hidrogenación. Además, estos aceites proporcionan un beneficio para la salud de los consumidores, por ejemplo, reduciendo o eliminando los ácidos grasos trans, que se ha descubierto que están asociados con un alto riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares.

El rasgo de alto contenido en ácido oleico de la invención también puede combinarse con líneas mutantes que tengan un fenotipo de alto contenido en ácido oleico. Los ejemplos de líneas mutantes de alto contenido en ácido oleico incluyen las líneas de soja A5 y N782245 [Martin, B. A. y Rinne, R. W. (1985), Crop Science, 25:1055-1058].

Tal como se emplea en la presente, el uso del término "polinucleótido" no pretende limitar la presente invención a los polinucleótidos que comprenden ADN. Los expertos en la técnica reconocerán que los polinucleótidos pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Estos ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos incluyen moléculas naturales y análogos sintéticos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen todas las formas de secuencias que incluyen, pero no se limitan a las formas monocatenarias, las formas bicatenarias, las horquillas, las estructuras de tallo y bucle, y similares.

Una planta DP-305423-1 comprende un módulo de supresión que contiene un fragmento de 597 pb del gen 1 de omega-6 desaturasa microsómica de soja (gm-fad2-1) y un módulo de expresión que contiene una versión modificada del gen de acetolactato sintasa de soja (gm-hra). El módulo puede incluir secuencias reguladoras 5’ y 3’ unidas operablemente a los polinucleótidos gm-fad2-1 y gm-hra. "Unido operablemente" significa un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos unidos operablemente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se emplea para indicar la unión de dos regiones codificadoras de proteínas, unido operablemente significa que las regiones codificadoras están en el mismo marco de lectura. El módulo puede contener también al menos un gen adicional que va a ser cotransformado hacia el interior del organismo. Como alternativa, el gen o genes adicionales pueden proporcionarse sobre múltiples módulos de expresión. Este módulo de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para la inserción del polinucleótido que está bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El módulo de expresión puede contener también genes de marcadores seleccionables.

El módulo de expresión incluirá, en la dirección 5’-3’ de la transcripción, una región de inicio transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una región codificadora, y una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. Un "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o un ARN funcional. En general, una secuencia codificadora se localiza 3’ con respecto a una secuencia de promotor. La secuencia de promotor puede comprender elementos proximales y más distales cadena arriba, y estos últimos elementos a menudo se denominan potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o especificidad de tejido de un promotor. Los promotores pueden derivarse, en su totalidad, de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que provocan que un fragmento de ácido nucleico pueda expresarse en la mayoría de los tipos de células la mayoría de las veces se denominan habitualmente "promotores constitutivos". Constantemente se están descubriendo nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales; pueden encontrarse numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg (1989), Biochemistry of Plants, 15: 1-82. También se reconoce que, puesto que en la mayoría de los casos, los límites exactos de las secuencias reguladoras aún no se han definido por completo, fragmentos de ácidos nucleicos de diferente longitud pueden tener una actividad de promotor idéntica.

Los módulos de expresión también pueden contener secuencias conductoras 5’. Estas secuencias conductoras pueden actuar para potenciar la traducción. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras transcripcionales, regiones de estabilidad o procesamiento de ARN, intrones, señales de poliadenilación, y regiones de terminación de la traducción) y/o la región codificadora pueden ser nativas/análogas o heterólogas para la célula hospedante o entre sí.

La "secuencia conductora de la traducción" se refiere a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia de promotor de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia conductora de la traducción está presente en el ARNm totalmente procesado cadena arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia conductora de la traducción puede afectar a numerosos parámetros, que incluyen el procesamiento de la transcripción primaria a ARNm, la estabilidad del ARNm y/o la eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias conductoras de la traducción (Turner y Foster (1995), Mol. Biotechnol., 3:225-236). Las "secuencias no codificadoras 3’" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas cadena abajo de una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de la poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del ARNm o a la expresión génica. La señal de poliadenilación habitualmente se caracteriza porque afecta a la adición de tramos de poli(ácido adenílico) al extremo 3’ del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificadoras 3’ se ejemplifica en Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell, 1:671-680.

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fusión térmico (Tm); unas condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm); una condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la técnica entenderán que se describen inherentemente las variaciones en la rigurosidad de la hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de resultados de desapareamiento produce una Tm menor que 45 °C (disolución acuosa) o 32 °C (disolución de formamida), resulta óptimo aumentar la concentración de SSC de modo que pueda utilizarse una temperatura mayor. Puede encontrarse una guía completa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York); y Haymes et al. (1985), en: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.

Se dice que un polinucleótido es el "complemento" de otro polinucleótido si muestran complementariedad. Tal como se emplea en la presente, se dice que las moléculas muestran una "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas polinucleotídicas es complementario con un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad para que puedan seguir asociadas entre sí bajo al menos unas condiciones de "baja rigurosidad" convencionales. De modo similar, se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad para que puedan seguir asociadas entre sí bajo al menos unas condiciones de "alta rigurosidad" convencionales.

También se proporcionan métodos para detectar la presencia de un ADN que se corresponde con el acontecimiento DP-305423-1 en una muestra. En una realización, el método comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con una sonda polinucleotídica que se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con un ADN de un acontecimiento DP-305423-1 de soja y detecta específicamente el acontecimiento DP-305423-1; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN, en el que la detección de la hibridación indica la presencia del acontecimiento DP-305423-1.

Pueden emplearse diversos métodos para detectar la región específica de DP-305423-1 o su amplicón que incluyen, pero no se limitan a Genetic Bit Analysis (Nikiforov et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22:4167-4175), en el que se diseña un oligonucleótido de ADN que se solapa con la secuencia de ADN flanqueante adyacente y con la secuencia de ADN insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de microtitulación. Después de una PCR de la región de interés (empleando un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante adyacente), un producto de la PCR monocatenario puede hibridarse con el oligonucleótido inmovilizado y actuar como molde para una reacción de extensión de una sola base, empleando una ADN polimerasa y ddNTP marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basarse en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia de la inserción/flanqueante debido a que se ha realizado una amplificación, una hibridación y una extensión de una sola base con éxito.

Otro método de detección es la técnica de pirosecuenciación, según se describe en Winge ((2000), Innov. Pharma. Tech., 00:18-24). En este método, se diseña un oligonucleótido que se solapa con el ADN adyacente y con la zona de unión del ADN de la inserción. El oligonucleótido se hibrida con un producto de la PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5 fosfosulfato y luciferina. Se añaden individualmente dNTP y la incorporación produce una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la inserción del transgén/secuencia flanqueante debido a que se ha realizado una amplificación, una hibridación y una extensión de una sola base o de múltiples bases con éxito.

La polarización de fluorescencia, tal como describen Chen et al. ((1999), Genome Res., 9:492-498, 1999) también es un método que puede utilizarse para detectar un amplicón producido por los métodos de la invención. Empleando este método, se diseña un oligonucleótido que se solapa con la zona de unión del ADN insertado y flanqueante. El oligonucleótido se hibrida con un producto de la PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y ddNTP marcado fluorescente. Una extensión de una sola base provoca la incorporación del ddNTP. La incorporación puede medirse como un cambio en la polarización empleando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la inserción del transgén/secuencia flanqueante debido a que se ha realizado una amplificación, una hibridación y una extensión de una sola base con éxito.

Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) se describe como un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN y se entiende sin problemas en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que se solapa con la zona de unión del ADN insertado y flanqueante. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET provoca la escisión y la liberación del resto fluorescente del resto extintor sobre la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de la inserción del transgén/flanqueante debido a que se ha

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realizado una amplificación y una hibridación con éxito.

Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencias, tal como se describe en Tyangi et al. ((1996), Nature Biotech., 14:303-308). Brevemente, se diseña un oligonucleótido FRET que se solapa con la zona de unión del ADN insertado y flanqueante. La estructura exclusiva de la sonda FRET hace que contenga una estructura secundaria que mantiene muy cercanos a los restos fluorescente y extintor. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Después de haber realizado con éxito una amplificación con PCR, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia diana provoca la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescente y extintor. Se produce una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de la inserción del transgén/flanqueante debido a que se ha realizado una amplificación y una hibridación con éxito.

Una reacción de hibridación que emplea una sonda específica para una secuencia que se encuentra dentro del amplicón es otro método utilizado para detectar el amplicón producido mediante una reacción de PCR.

Tal como se emplea en la presente, un "kit" se refiere a un conjunto de reactivos para poner en práctica las realizaciones del método de la invención, más en concreto, la identificación y/o la detección del acontecimiento DP305423-1 en muestras biológicas. El kit descrito en la presente puede utilizarse, y sus componentes pueden ajustarse específicamente, para el control de calidad (por ejemplo, la pureza de lotes de semillas), la detección del acontecimiento DP-305423-1 en material vegetal, o material que comprende o se deriva de material vegetal, tal como, pero sin limitarse a productos alimentarios o de piensos.

En la presente se describe un kit para identificar el acontecimiento DP-305423-1 en una muestra biológica. El kit comprende un primer y un segundo cebador, en el que el primer y el segundo cebador amplifican un polinucleótido que comprende una región específica de DP-305423-1. El kit también puede comprender un polinucleótido para la detección de la región específica de DP-305423-1. El kit puede comprender, por ejemplo, un primer cebador que comprende un fragmento de un polinucleótido de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, en el que el primer o el segundo cebador comparte una complementariedad u homología de secuencia suficiente con el polinucleótido para amplificar dicha región específica de DP-305423-1. Por ejemplo, el primer cebador comprende un fragmento de un polinucleótido de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, en el que el primer o el segundo cebador comparte una complementariedad u homología de secuencia suficiente con los polinucleótidos para amplificar dicha región específica de DP-305423-1. La pareja de cebadores puede comprender un primer cebador que comprende un fragmento de una región genómica 5’ de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, y un segundo cebador que comprende un fragmento de una región genómica 3’ de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, o una región de inserción de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, o, como alternativa, la pareja de cebadores puede comprender un primer cebador que comprende un fragmento de una región genómica 3’ de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, y un segundo cebador que comprende un fragmento de una región genómica 5’ de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, o una región de inserción de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82. El primer y el segundo cebador pueden comprender cualquiera o cualquier combinación de las secuencias indicadas en SEQ ID NO:26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 89, 90, 91, 92, 93 o 94. Los cebadores pueden tener cualquier longitud suficiente para amplificar una región de DP-305423-1, e incluyen, por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15, o 30, o aproximadamente 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 nucleótidos o más.

En la presente también se describen kits de detección de ADN que comprenden al menos un polinucleótido que puede detectar específicamente una región específica de DP-305423-1, en los que dicho polinucleótido comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homóloga o complementaria con SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82. El kit de detección de ADN puede comprender un polinucleótido que tiene la SEQ ID NO:8, 9, 14, 15, 20, 21, 83 o 84, o puede comprender una secuencia que se hibrida con al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: a) las secuencias de una región genómica 5’ de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, y las secuencias de una región de inserción de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82; y, b) la secuencias de una región genómica 3’ de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82, y las secuencias de una región de inserción de SEQ ID NO:5, 6, 7 o 82.

Cualquiera de los polinucleótidos y sus fragmentos y variantes empleados en los métodos y las composiciones de la invención puede compartir una identidad de secuencia con una región de la inserción del transgén del acontecimiento DP-305423-1, una secuencia de zona de unión del acontecimiento DP-305423-1, o una secuencia flanqueante del acontecimiento DP-305423-1. Los métodos para determinar la relación de diversas secuencias son conocidos. Tal como se emplea en la presente, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se emplea como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o ADNc de longitud completa, o la secuencia génica o ADNc completo. Tal como se emplea en la presente, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotídica, en la que la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos), comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100, o más. Los expertos en la técnica entienden que, para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debida a la inclusión de huecos en la

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secuencia polinucleotídica, generalmente se introduce una penalización de hueco y se resta del número de apareamientos.

Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación son muy conocidos en la técnica. Así, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualesquiera puede lograrse empleando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de dichos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988), CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981), Adv. Appl. Math., 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48:443-453; el método de búsqueda de alineamiento de local de Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877.

Pueden utilizarse aplicaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Estas aplicaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el paquete GCG Wisconsin Genetics Software Package, versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EEUU). Empleando estos programas, los alineamientos pueden realizarse utilizando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL se describe a fondo en Higgins et al. (1988), Gene, 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989), CABIOS, 5:151-153; Corpet et al. (1988), Nucleic Acids Res., 16:10881-10890; Huang et al. (1992), CABlOS 8:155-165; y Pearson et al. (1994), Meth. Mol. Biol., 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988), supra. Puede utilizarse una tabla de peso de restos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403, se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas con una secuencia de nucleótidos descrita en la presente. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas con una proteína o un polipéptido descrito en la presente. Para obtener alineamientos con huecos para comparaciones, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0), tal como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389. Como alternativa, puede utilizarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones lejanas entre moléculas. Véase, Altschul et al. (1997) ,supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, o PSI-BLAST, pueden emplearse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase, www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también puede realizarse de forma manual mediante inspección.

Los cálculos de alineamiento de secuencias y de porcentaje de identidad pueden determinarse empleando un diversidad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homólogas que incluyen, pero no se limitan al programa Megalign® del paquete bioinformático LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI). Por ejemplo, pueden realizarse múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente empleando el método de alineamiento Clustal V (Higgins y Sharp (1989), CABIOS, 5:151-153) con los parámetros por defecto (PENALIZACIÓN DE HUECO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 10). Los parámetros por defecto para los alineamientos apareados y el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas empleando el método Clustal V son KTUPLO = 1, PENALIZACIÓN DE HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLO = 2, PENALIZACIÓN DE HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después del alineamiento de las secuencias empleando el programa Clustal V, es posible obtener los valores del "porcentaje de identidad" y de "divergencia" observando la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa.

A menos que se indique lo contrario, los valores de similitud/identidad de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido empleando GAP, versión 10, utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos empleando un peso GAP de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos empleando un peso GAP de 8 y un peso de longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente a estos. Un "programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquier par de secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene idénticos desapareamientos de nucleótidos o restos aminoácidos, y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por GAP, versión 10.

GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48:443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximice el número de apareamientos y minimice el número de huecos. GAP considera todos los alineamientos posibles y posiciones de huecos, y crea el alineamiento con el mayor número de bases apareadas y el mínimo de huecos. Permite proporcionar la penalización de creación de huecos y la penalización de extensión de huecos en unidades de bases apareadas. GAP debe aprovechar la penalización de creación de huecos del número de apareamientos para cada hueco que inserta. Si se elige la penalización de extensión de hueco mayor que cero, GAP debe aprovechar, además, cada hueco insertado de la longitud del hueco por la penalización de la extensión de hueco. Los valores de penalización de creación de huecos y los valores de

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penalización de extensión de hueco por defecto en la versión 10 del paquete GCG Wisconsin Genetics Software Package para secuencias de proteínas son de 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, la penalización de creación de huecos por defecto es de 50, mientras que la penalización de extensión de huecos por defecto es de 3. Las penalizaciones de creación de huecos y de extensión de huecos pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Así, por ejemplo, las penalizaciones de creación de huecos y de extensión de huecos pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor.

GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Existen muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro factores de calidad para los alineamientos: calidad, proporción, identidad, y similitud. La calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La proporción es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El porcentaje de identidad es el porcentaje de símbolos que realmente se aparean. El porcentaje de similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Los símbolos que están frente a los huecos no se toman en cuenta. Se puntúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para una pareja de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación empleada en la versión 10 del paquete GCG Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915).

Tal como se emplea en la presente, la "identidad de secuencia" o "identidad", en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, se refiere a los restos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se emplea en referencia a las proteínas, se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras, en las que los restos aminoácidos son sustituidos por otros restos aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias se diferencian en sustituciones conservadores, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que se diferencian por dichas sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son muy conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente, esto implica puntuar una sustitución conservadora como desapareamiento parcial, en lugar de total, aumentando con ello el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una puntuación de cero, una sustitución conservadora recibe una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, según se aplica en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

Tal como se emplea en la presente, un "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, en el que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos), comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el resto aminoácido idéntico en ambas secuencias, para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

En la presente se describen métodos para controlar las hierbas adventicias en un área de cultivo, para evitar el desarrollo o la aparición de hierbas adventicias resistentes a herbicidas en un área de cultivo, para producir una cosecha y para aumentar la seguridad de la cosecha. La expresión "controlar" y sus derivados, por ejemplo, "controlar las hierbas adventicias", se refiere a uno o más de inhibir el crecimiento, la germinación, la reproducción y/o la proliferación y/o matar, eliminar, destruir o disminuir de otro modo la aparición y/o la actividad de una hierba adventicia.

Tal como se emplea en la presente, un "área de cultivo" comprende cualquier región en la que se desee cultivar una planta. Estas áreas de cultivo incluyen, pero no se limitan a un campo en el que se cultiva una planta (tal como un campo de cultivo, un campo de césped, un campo de árboles, un bosque gestionado, un campo para cultivar frutas y verduras, etc.), un invernadero, una cámara de crecimiento, etc.

Los métodos descritos en la presente comprenden plantar el área de cultivo con plantas o semillas DP-305423-1 de soja y, en realizaciones específicas, aplicar al cultivo, semilla, hierba adventicia o a su área de cultivo una cantidad eficaz de un herbicida de interés. Se reconoce que el herbicida puede aplicarse antes o después de que el cultivo se plante en el área de cultivo. Estas aplicaciones de herbicidas pueden incluir una aplicación de un inhibidor de ALS. Un inhibidor de ALS puede aplicarse al acontecimiento DP-305423-1 de soja, en el que la concentración eficaz del inhibidor de ALS dañará significativamente una planta control apropiada. El herbicida puede comprender al menos uno de una sulfonilaminocarboniltriazolinona; una triazolopirimidina; un pirimidinil(tio)benzoato; una imidazolinona; una triazina; y/o un ácido fosfínico.

El herbicida puede comprender imazapiro, clorimurona-etilo, quizalofop, o fomesafeno, en el que una cantidad eficaz es tolerada por el cultivo y las hierbas adventicias control. Tal como se describe en otro punto en la presente, puede

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Estas entidades también publican consejos y directrices para evitar el desarrollo y/o la aparición y el control de la proliferación de hierbas adventicias tolerantes a herbicida (véase, por ejemplo, Owen y Hartzler (2004), 2005 Herbicide Manual for Agricultural Professionals, Pub. WC 92 revisado (Iowa State University Extension, Iowa State University of Science and Technology, Ames, Iowa); Weed Control for Com, Soybeans, and Sorghum, capítulo 2 de "2004 Illinois Agricultural Pest Management Handbook" (University of Illinois Extension, University of Illinois at Urbana-Champaign, Illinois); Weed Control Guide for Field Crops, MSU Extension Bulletin E434 (Michigan State University, East Lansing, Michigan)).

Tabla 2 -Versión abreviada de la clasificación de herbicidas HRAC

I. Inhibidores de ALS (WSSA Grupo 2)

A. Sulfonilureas

1.

Azimsulfurona 17. Flupirsulfurona-metilo

2.

Clorimurona-etilo 18. Foramsulfurona

3.

Metsulfurona-metilo 19. Imazosulfurona

4.

Nicosulfurona 20. Yodosulfurona-metilo

5.

Rimsulfurona 21. Mesosulfurona-metilo

6.

Sulfometurona-metilo 22. Oxasulfurona

7.

Tifensulfurona-metilo 23. Primisulfurona-metilo

8.

Tribenurona-metilo 24. Prosulfurona

9.

Amidosulfurona 25. Pirazosulfurona-etilo

10.

Bensulfurona-metilo 26. Sulfosulfurona

11.

Clorsulfurona 27. Triasulfurona

12.

Cinosulfurona 28. Trifloxisulfurona

13.

Ciclosulfamurona 29. Triflusulfurona-metilo

14.

Etametsulfurona-metilo 30. Tritosulfurona

15.

Etoxisulfurona 31. Halosulfurona-metilo

16.

Flazasulfurona 32. Flucetosulfurona

B. Sulfonilaminocarboniltriazolinonas

1. Flucarbazona 2. Procarbazona

C. Triazolopirimidinas

1.

Cloransulamo-metilo 5. Metosulamo

2.

Flumetsulamo 6. Penoxsulamo

3.

Diclosulamo 7. Piroxsulamo

4.

Florasulamo

D. Pirimidiniloxi(tio)benzoatos

1.

Bispiribaco 4. Piritiobaco

2.

Piriftalida 5. Piriminobaco-metilo

3.

Piribenzoxima

E. Imidazolinonas

1.

Imazapiro 4. Imazapico

2.

Imazetapiro 5. Imazametabenz-metilo

3.

Imazaquino 6. Imazamox

II. Otros ingredientes activos herbicidas/otros modos de acción

imagen11

imagen12

1. Piridazinonas

a. Norflurazona

2. Piridincarboxamidas

a. Diflufenicano

b. Picolinafeno

3. Otros

a. Beflubutamida

c. Flurocloridona

b. Fluridona

d. Flurtamona

H. Blanqueamiento: Inhibición de la 4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (4-HPPD) (WSSA Grupo 28)

1. Tricetonas

a. Mesotriona b. Sulcotriona

2. Isoxazoles

a. Isoxaclortol b. Isoxaflutol

3. Pirazoles

a.

Benzofenapo c. Pirazolinato

b.

Pirazoxifeno

4. Otros

a. Benzobuciclona

I. Blanqueamiento: Inhibición de la biosíntesis de carotenoide (diana desconocida) (WSSA Grupo 11 y 13)

1. Triazoles (WSSA Grupo 11)

a. Amitrol

2. Isoxazolidinonas (WSSA Grupo 13)

a. Clomazona

3. Ureas

a. Fluometurona

4. Difenil éter

a. Aclonifeno

J. Inhibición de la EPSP sintasa

1. Glicinas (WSSA Grupo 9)

a. Glifosato b. Sulfosato

K. Inhibición de la glutamina sintetasa

1. Ácidos fosfínicos

a. Glufosinato-amonio b. Bialafós

L. Inhibición de la DHP (dihidropteroato) sintasa (WSSA Grupo 18)

1. Carbamatos

a. Asulamo

M. Inhibición del ensamblaje de microtúbulos (WSSA Grupo 3)

1. Dinitroanilinas

a.

Benfluralina e. Orizalina

b.

Butralina f. Pendimetalina

c.

Dinitramina g. Trifluralina

d. Etalfluralina

2. Fosforamidatos

a. Amiprofós-metilo

b. Butamifós

3. Piridinas

a. Ditiopiro

b. Tiazopior

4. Benzamidas

a. Pronamida

b. Tebutamo

5. Ácidos bencendicarboxílicos

a. Clortal-dimetilo

N. Inhibición de la mitosis/organización de los microtúbulos (WSSA Grupo 23)

1. Carbamatos

a.

Clorprofamo c. Carbetamida

b.

Profamo

O. Inhibición de la división celular (inhibición de ácidos de cadena muy larga como mecanismo propuesto; WSSA Grupo 15)

1. Cloroacetamidas

a.

Acetoclor g. Metolaclor

b.

Alaclor h. Petoxamida

c.

Butaclor i. Pretilaclor

d.

Dimetaclor j. Propaclor

e.

Dimetanamida k. Propisoclor

f.

Metazaclor l. Tenilclor

2. Acetamidas

a.

Difenamida c. Naproanilida

b.

Napropamida

3. Oxyacetamidas

a. Flufenaceto b. Mefenaceto

4. Tetrazolinonas

a. Fentrazamida

5. Otros

a.

Anilofós c. Indanofano

b.

Cafenstrol d. Piperofós

P. Inhibición de la síntesis de la pared celular (celulosa)

1. Nitrilos (WSSA Grupo 20)

a. Diclobenilo b. Clortiamida

2. Benzamidas (isoxabeno (WSSA Grupo 21))

a. Isoxabeno

3. Triazolocarboxamidas (flupoxamo)

a. Flupoxamo

Q. Desacoplamiento (alteración de la membrana): (WSSA Grupo 24)

1. Dinitrofenoles

a.

DNOC c. Dinoterbo

b.

Dinosebo

R. Inhibición de la síntesis de lípidos de un modo distinto a la inhibición de ACC

1. Tiocarbamatos (WSSA Grupo 8)

a. Butilato

h. Pebulato

b. Cicloato

i. Prosulfocarbo

c. Dimepiperato

j. Bentiocarbo

d. EPTC

k. Tiocarbazilo

e. Esprocarbo

l. Trialato

f. Molinato

m. Vernolato

g. Orbencarbo

2. Fosforoditioatos

a. Bensulida

3. Benzofuranos

a. Benfuresato

b. Etofumesato

4. Ácidos alcanoicos halogenados (WSSA Grupo 26)

a. TCA

c. Flupropanato

b. Dalapón

S. Auxinas sintéticas (similares a IAA) (WSSA Grupo 4)

1. Ácidos fenoxicarboxílicos

a. Clomeprop

c. Mecoprop

b. 2,4-D

2. Ácidos benzoicos

a. Dicamba

c. TBA

b. Clorambeno

3. Ácidos piridincarboxílicos

a. Clopiralid

c. Picloramo

b. Fluroxipiro

d. Triciclopiro

4. Ácidos quinolincarboxílicos

a. Quincloraco

b. Quinmeraco

5. Otros (benazolina-etilo)

a. Benazolina-etilo

T. Inhibición del transporte de auxinas

1. Ftalamatos; semicarbazonas (WSSA Grupo 19)

a. Naptalamo

b. Diflufenzopiro-Na

U. Otros mecanismos de acción

1. Ácidos arilaminopropiónicos

a. Flamprop-M-metilo/-isopropilo

2. Pirazolio

a. Difenzoquat

imagen13

imagen14

J se selecciona del grupo que consiste en:

imagen15

J es R13SO2N(CH3)-; R es H o CH3; R1 es F, Cl, Br, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C4, haloalquenilo C2-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi

C1-C4, (alcoxi C2-C4)alcoxi, CO2R14, C(O)NR15R16, SO2NR17R18, S(O)nR19, C(O)R20, CH2CN o L; R2 es H, F, Cl, Br, I, CN, CH3, OCH3, SCH3, CF3 o OCF2H; R3 es Cl, NO2, CO2CH3, CO2CH2CH3, C(O)CH3, C(O)CH2CH3, C(O)-ciclopropilo, SO2N(CH3)2, SO2CH3, SO2CH2CH3,

OCH3 u OCH2CH3;

imagen16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

son los que presentan la fórmula:

imagen17

en la que:

R22 y R23 son cada uno independientemente halógeno, nitro, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4 o (alcoxi C2-C3)carbonilo;

R24 es H, halógeno, alquilo C1-C2 o alcoxi C1-C2;

W es -NHS(O)2-o -S(O)2NH-;

Y1 es H, alquilo C1-C2 o alcoxi C1-C2;

Y2 es H, F, Cl, Br, alquilo C1-C2 o alcoxi C1-C2;

Y3 es H, F o metoxi;

Z1 es CH o N; y

Z2 es CH o N;

con la condición de que al menos uno de Y1 e Y2 es distinto de H.

En la anterior descripción de Markush de los herbicidas de triazolopirimidina representativos, cuando W es -NHS(O)2-, el extremo sulfonilo del resto sulfonamida está conectado con el sistema de anillo de [1,2,4]triazolopirimidina, y cuando W es -S(O)2NH, el extremo amino del resto sulfonamida está conectado con el sistema de anillo de [1,2,4]triazolopirimidina.

En las anteriores relaciones, el término "alquilo", utilizado por sí solo o en palabras compuestas, tales como "alquiltio" o "haloalquilo", incluye alquilo de cadena lineal o ramificada, tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, o los diferentes isómeros de butilo. "Cicloalquilo" incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y ciclopentilo. "Alquenilo" incluye alquenos de cadena lineal o ramificada, tales como etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, y los diferentes isómeros de butenilo. "Alquenilo" tambiénincluye polienos, tales como 1,2-propadienilo y 2,4-butadienilo. "Alquinilo" incluye alquinos de cadena lineal o ramificada, tales como etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo y los diferentes isómeros de butinilo. "Alquinilo" también puede incluir restos formados por múlples enlaces triples, tales como 2,5-hexadiinilo. "Alcoxi" incluye, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propiloxi, isopropiloxi y los diferentes isómeros de butoxi. "Alcoxialquilo" indica una sustitución alcoxi sobre un alquilo. Los ejemplos de "alcoxialquilo" incluyen CH3OCH2, CH3OCH2CH2, CH3CH2OCH2, CH3CH2CH2CH2OCH2 y CH3CH2OCH2CH2. "Alcoxialcoxi" indica una sustitución alcoxi sobre un alcoxi. "Alqueniloxi" incluye restos alqueniloxi de cadena lineal o ramificada. Los ejemplos de "alqueniloxi" incluyen H2C=CHCH2O, (CH3)CH=CHCH2O y CH2=CHCH2CH2O. "Alquiniloxi" incluyen restos alquiniloxi de cadena lineal o ramificada. Los ejemplos de "alquiniloxi" incluyen HC≡CCH2O y CH3C≡CCH2O. "Alquiltio" incluye restos alquiltio de cadena lineal o ramificada, tales como metiltio, etiltio y los diferentes isómeros de propiltio. "Alquiltioalquilo" indica una sustitución alquiltio sobre un alquilo. Los ejemplos de "alquiltioalquilo" incluyen CH3SCH2, CH3SCH2CH2, CH3CH2SCH2, CH3CH2CH2CH2SCH2 y CH3CH2SCH2CH2; "alquilsulfinilalquilo" y "alquilsulfonilalquilo" incluyen los correspondientes sulfóxidos y sulfonas, respectivamente. Otros sustituyentes, tales como "alquilamino", "dialquilamino", se definen de modo análogo.

El número total de átomos de carbono en un grupo sustituyente se indica mediante el prefijo "Ci-Cj", en el que i y j son números de 1 a 5. Por ejemplo, alquilo C1-C4 indica de metilo a butilo, incluyendo los diversos isómeros. Como otros ejemplos, (alcoxi C2)alquilo indica CH3OCH2; (alcoxi C3)alquilo indica, por ejemplo, CH3CH(OCH3), CH3OCH2CH2 o CH3CH2OCH2; y (alcoxi C4)alquilo indica los diversos isómeros de un grupo alquilo sustituido con un grupo alcoxi que contiene un total de cuatro átomos de carbono, cuyos ejemplos incluyen CH3CH2CH2OCH2 y CH3CH2OCH2CH2.

El término "halógeno", utilizado por sí solo o en palabras compuestas, tales como "haloalquilo", incluye flúor, cloro, bromo o yodo. Además, cuando se emplea en palabras compuestas, tales como "haloalquilo", dicho alquilo puede estar parcial o totalmente sustituido con átomos de halógeno que pueden ser iguales o diferentes. Los ejemplos de "haloalquilo" incluyen F3C, ClCH2, CF3CH2 y CF3CCl2. Los términos "haloalcoxi", "haloalquiltio", y similares, se

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imagen25

El acontecimiento DP-305423-1 de soja (Glycine max) se produjo mediante cobombardeo de partículas con fragmentos PHP19340A (figura 1; SEQ ID NO:1) y PHP17752A (figura 2; SEQ ID NO:2). Un resumen de los elementos y su posición sobre el fragmento PHP19340A se presenta en la tabla 3, y para el fragmento PHP17752A en la tabla 4. Estos fragmentos se obtuvieron mediante la digestión con Asc I de un plásmido fuente. El fragmento

5 PHP19340A se obtuvo del plásmido PHP19340 (figura 3; SEQ ID NO:3) y el fragmento PHP17752A se obtuvo del plásmido PHP17752 (figura 4; SEQ ID NO:4). Un resumen de los elementos y su posición sobre cada uno de los plásmidos, PHP19340 y PHP17752, se describe en las tablas 5 y 6, respectivamente.

El fragmento PHP19340A contiene un módulo con un fragmento de 597 pb del gen 1 de omega-6 desaturasa microsómica de soja (gm-fad2-1) (Heppard et al., 1996). La presencia del fragmento de gm-fad2-1 en el módulo de 10 expresión actúa para suprimir la expresión de omega-6 desaturasas endógenas, lo cual produce un aumento en el nivel de ácido oleico y una disminución en los niveles de ácido palmítico, linoleico, y linolénico. Cadena arriba del fragmento de gm-fad2-1 se encuentra la región de promotor del gen 3 del inhibidor de tripsina de Kunitz (KTi3) (Jofuku y Goldberg, 1989; Jofuku et al., 1989), que regula la expresión de la transcripción. El promotor KTi3 es muy activo en embriones de soja y es 1000 veces menos activos en tejido foliar (Jofuku y Goldberg, 1989). La región no

15 traducida 3’ del gen KTi3 (terminador KTi3) (Jofuku y Goldberg, 1989) termina la expresión de este módulo.

El fragmento PHP17752A contiene un módulo con una versión modificada del gen de la acetolactato sintasa de soja (gm-hra) que codifica la proteína GM-HRA con dos restos aminoácidos modificados con respecto a la enzima endógena y cinco aminoácidos adicionales en la región N-terminal de la proteína derivados de la traducción de la región no traducida 5' del gen de la acetolactato sintasa de soja (Falco y Li, 2003). El gen gm-hra codifica una forma

20 de acetolactato sintasa, que es tolerante a los herbicidas de la clase de la sulfonilurea. La proteína GM-HRA está formada por 656 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 71 kDa.

La expresión del gen gm-hra está controlada por la región de promotor 5’ del gen de S-adenosil-L-metionina sintetasa (SAMS) de la soja (Falco y Li, 2003). Esta región 5’ consiste en un promotor constitutivo y un intrón que interrumpe la región no traducida SAMS 5’ (Falco y Li, 2003). El terminador para el gen gm-hra es el terminador de

25 acetolactato sintasa de soja endógeno (terminador gm-als) (Falco y Li, 2003).

Tabla 3

Descripción de los elementos genéticos en el fragmento PHP19340A

Localización sobre el fragmento de ADN (posición de pares de bases)

Elemento genético Tamaño (pares debases) Descripción

1 a 18

región de policonector 15 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

19 a 2102

promotor KTi3 2084 Región de promotor del gen 3 del inhibidor de tripsina de Kunitz de soja (Jofuku y Goldberg, 1989; Jofuku et al., 1989).

2103 a 2113

región de policonector 11 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

2114 a 2710

fragmento de gm-fad2-1 597 Fragmento del gen de omega-6 desaturasa microsómica (Heppard et al., 1996)

2711 a 2720

región de policonector 10 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

2721 a 2916

terminador KTi3 196 Región del terminador del gen 3 del inhibidor de tripsina de Kunitz de soja (Jofuku y Goldberg, 1989; Jofuku et al., 1989)

2917 a 2924

región de policonector 8 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

Tabla 4

Descripción de los elementos genéticos en el fragmento PHP17752A

Localización sobre el fragmento de ADN (posiciónde pares de bases)

Elemento genético Tamaño (pares debases) Descripción

1 a 25

región de policonector 25 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

26 a 76

FRT1 51 Sitio de recombinación de Flp recombinasa (GenBank ID: AY737006.1)

77 a 222

región de policonector 145 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

223 a 867

promotor de SAMS 645 Porción de promotor de la región reguladora del gen SAMS (Falco y Li, 2003)

868 a 926

UTR-5’ de SAMS 59 Región no traducida 5’ del en SAMS (Falco y Li, 2003)

927 a 1517

intrón de SAMS 591 Intrón dentro de la 5’-UTR del gen SAMS (Falco y Li, 2003).

1518 a 1533

UTR-5’ de SAMS 16 Región no traducida 5’ del en SAMS (Falco y Li, 2003)

1534 a 3504

gen gm-hra 1971 Versión modificada del gen de la acetolactato sintasa de soja con 15 nucleótidos adicionales en el extremo 5’ (1534 a 1548) derivados del 5’ UTR de als y dos cambios de nucleótidos dentro de la secuencia codificadora (Falco y Li, 2003).

3505 a 4156

terminador als 652 Terminador nativo del gen de la acetolactato sintasa de soja (Falco y Li, 2003).

4157 a 4231

región de policonector 75 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

4232 a 4282

FRT1 51 Sitio de recombinación de Flp recombinasa (GenBank ID: AY737006.1)

4283 a 4396

región de policonector 114 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

4397 a 4447

FRT6 51 Sitio de recombinación de la Flp recombinasa (94% de homología con GenBank ID: AY737006.1)

4448 a 4512

región de policonector 65 Región requerida para la clonación de elementos genéticos

Tabla 5

Descripción de los elementos genéticos del plásmido PHP19340

Región

Localización sobre el plásmido (posición depares de bases) Elemento genéticoconocido Tamaño (pares debases) Descripción

Fragmento

2725 a 5438 1 a 210 2924 Véase la tabla 3 para los

PHP19340A

elementos y la descripción delfragmento (hebra complementaria)

Construcción de plásmido

211 a 2724 incluye los siguienteelementos 2514 Vector de ADN de diversas fuentes para la construcción y replicación del plásmido

228 a 351

Terminador T7 124 Terminador derivado del genoma del fago de la enterobacteria T7 (GenBank V01146; Dunn y Studier, 1983) (hebra complementaria)

376 a 1326

Hyg 951 Gen de resistencia a la higromicina de Trypanosoma brucei (GenBank AL671259; Gritz y Davies, 1983) (hebra complementaria)

1404 a 1487

Promotor T7 84 Promotor derivado del genoma del fago de la enterobacteria T7 (GenBank V01146; Dunn y Studier, 1983) (hebra complementaria)

1561 a 1930

Ori 370 Fragmento Hae II que contiene el origen de la replicación bacteriano (derivado de colE1) (Tomizawa et al., 1977)

Tabla 6 5

Descripción de los elementos genéticos del plásmido PHP17752

Región

Localización sobre el plásmido (posición depares de bases) Elemento genéticoconocido Tamaño (pares debases) Descripción

FragmentoPHP17752A

2528 a 7026 1 a 13 4512 Véase la tabla 4 para los elementos y la descripción delfragmento (hebra complementaria)

Construcción de plásmido

14 a 2527 incluye los siguienteelementos 2514 Vector de ADN de diversas fuentes para la construcción y replicación del plásmido

31 a 154

Terminador T7 124 Terminador derivado del genoma del fago de la enterobacteria T7 (GenBank V01146; Dunn y Studier, 1983) (hebra complementaria)

10

15

20

25

30

Descripción de los elementos genéticos del plásmido PHP17752

Región

Localización sobre el plásmido (posición depares de bases) Elemento genéticoconocido Tamaño (pares debases) Descripción

179 a 1129

Hyg 951 Gen de resistencia a la higromicina de Trypanosoma brucei (GenBank AL671259; Gritz y Davies, 1983) (hebra complementaria)

1207 a 1290

Promotor T7 84 Promotor derivado del genoma del fago de la enterobacteria T7 (GenBank V01146; Dunn y Studier, 1983) (hebra complementaria)

1364 a 1733

Ori 370 Fragmento Hae II que contiene el origen de la replicación bacteriano (derivado de colE1) (Tomizawa et al., 1977)

Referencias bibliográficas

Dunn, J. J. y Studier, F. W., 1983, Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the locations of T7 genetic elements, J. Mol. Biol., 166(4): 477-535.

Falco, C.S. y Li, Z., 2003, S-adenosyl-L-methionine Synthetase Promoter and Its Use in Expression of Transgenic Genes in Plants, solicitud de patente de EEUU: 2003/0226166.

Gritz, L. y Davies, J., 1983, Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in E. coli and Saccharomyces cerevisiae, Gene, 25:179-188.

Heppard, E.P., Kinney, A.J., Stecca, K.L., y Miao, G.-H., 1996, Developmental and Growth Temperature Regulation of Two Different Microsomal omega-6 Desaturase Genes in Soybeans, Plant Physiol., 110:311-319.

Jofuku, K.D. y Goldberg, R.B., 1989, Kunitz Trypsin Inhibitor Genes Are Differentially Expressed during the Soybean Life Cycle and in Transformed Tobacco Plants, Plant Cell, 1:1079-1093.

Jofuku, K.D. y Schipper, R.D., y Goldberg, R.B., 1989, A Frameshift Mutation Prevents Kunitz Trypsin Inhibitor mRNA Accumulation in Soybean Embryos, Plant Cell, 1:427-435.

Tomizawa, J-I., Ohmori, H., y Bird, R. E., 1977, Origin of replication of colicin E1 plasmid DNA, Proc. Natl. Acad. Sci., 74(5):1865-1869.

Ejemplo 2:

Método de transformación y selección del acontecimiento DP-305423-1 de soja

Para la transformación de tejido de soja, una porción lineal de ADN, que contiene la secuencia de gen gm-fad2-1 y los componentes reguladores necesarios para la expresión, se corta del plásmido PHP19340 empleando la enzima de restricción Asc I y se purifica utilizando una electroforesis en gel de agarosa. Una porción lineal de ADN, que contiene las secuencias del gen gm-hra y los componentes reguladores necesarios para la expresión, se corta del plásmido PHP17752 empleando la enzima de restricción Asc I y se purifica utilizando una electroforesis en gel de agarosa. La porción lineal de ADN que contiene el gen gm-fad2-1 se denomina inserción PHP19340A y tiene un tamaño de 2924 pb. La porción lineal de ADN que contiene el gen gm-hra se denomina inserción PHP17752A y tiene un tamaño de 4511 pb. El único ADN introducido en el acontecimiento de transformación DP-305423-1 es el ADN de las inserciones descritas anteriormente.

Las plantas transgénicas del acontecimiento DP-305423-1 se obtuvieron mediante bombardeo de microproyectiles empleando la pistola de partículas Biolistics ™ PDS-1000He fabricada por Bio-Rad, fundamentalmente como se describe en Klein et al. ("High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells", Nature, 327:70-73 (1987)). Las dianas para la transformación fueron agrupaciones de embriones somáticos secundarios derivados de explantes de semillas de soja inmaduras pequeñas. Los embriones somáticos secundarios se cortaron de los explantes inmaduros después de varias semanas en medio de inicio del cultivo de soja. Las agrupaciones embriogénicas, que se habían cortado de los explantes, se trasladaron a un medio de mantenimiento de cultivo de soja líquido y se subcultivaron a intervalos regulares hasta que estuvieron preparadas para el bombardeo.

imagen26

Tabla 7

Análisis de la transferencia Southern del acontecimiento DP-305423-1; digestión con Hind III, sonda gm-fad2-1

Carril

Muestra Carril Muestra

1

2 copias PHP19340 + control 11 DP-305423-1/T38 (generación T4)

2

DIGVII 12 DP-305423-1/T39 (generación T4)

3

control 13 DP-305423-1/T40 (generación T4)

4

DP-305423-1/T8 (generación T5) 14 DP-305423-1/T41 (generación T4)

5

DP-305423-1/T9 (generación T5) 15 DP-305423-1/T42 (generación T4)

6

DP-305423-1/T10 (generación T5) 16 DP-305423-1/T43 (generación T4)

7

DP-305423-1/T11 (generación T5) 17 DP-305423-1/T44 (generación T4)

8

DP-305423-1/T12 (generación T5) 18 Control

9

DP-305423-1/T13 (generación T5) 19 DIGVII

10

DP-305423-1/T14 (generación T5) 20 2 copias PHP17752 + control

El ADN genómico aislado a partir de tejido foliar de soja de plantas individuales de DP-305423-1 (generación T5 y T4) y del control no modificado (Jack) se digirió con Nco I y se sondó con la sonda del gen gm-fad2-1 (figura 6; tabla 8). Se digirieron y se cargaron en cada carril aproximadamente 2 g de ADN genómico. Los controles de número de copias de los genes incluyeron al plásmido PHP19340 y PHP17752 con el número de copias de genes aproximado indicado y 2 g de ADN control no modificado. Los tamaños de los marcadores de peso molecular DIG VII se indican adyacentes a la imagen de la transferencia en kilopares de bases (kb). En la tabla 8 se presenta una descripción de cada carril.

Tabla 8

Análisis de la transferencia Southern del acontecimiento DP-305423-1; digestión con Nco I, sonda gm-fad2-1

Carril

Muestra Carril Muestra

1

2 copias PHP19340 + control 11 DP-305423-1/T38 (generación T4)

2

DIGVII 12 DP-305423-1/T39 (generación T4)

3

control 13 DP-305423-1/T40 (generación T4)

4

DP-305423-1/T8 (generación T5) 14 DP-305423-1/T41 (generación T4)

5

DP-305423-1/T9 (generación T5) 15 DP-305423-1/T42 (generación T4)

6

DP-305423-1/T10 (generación T5) 16 DP-305423-1/T43 (generación T4)

7

DP-305423-1/T11 (generación T5) 17 DP-305423-1/T44 (generación T4)

8

DP-305423-1/T12 (generación T5) 18 Control

9

DP-305423-1/T13 (generación T5) 19 DIGVII

10

DP-305423-1/T14 (generación T5) 20 2 copias PHP17752 + control

10 El ADN genómico aislado a partir de tejido foliar de soja de plantas individuales de DP-305423-1 (generación T5 y T4) y del control no modificado (Jack) se digirió con Hind III y se sondó con la sonda del gen gm-hra (figura 7; tabla 9). Se digirieron y se cargaron en cada carril aproximadamente 2 g de ADN genómico.. Los controles de número de copias de los genes incluyeron al plásmido PHP19340 y PHP17752 con el número de copias de genes aproximado indicado y 2 g de ADN control no modificado. Los tamaños de los marcadores de peso molecular DIG VII se indican

15 adyacentes a la imagen de la transferencia en kilopares de bases (kb). En la tabla 9 se presenta una descripción de cada carril.

Tabla 9

Análisis de la transferencia Southern del acontecimiento DP-305423-1; digestión con Hind III, sonda gm-hra

Carril

Muestra Carril Muestra

1

2 copias PHP19340 + control 11 DP-305423-1/T38 (generación T4)

2

DIGVII 12 DP-305423-1/T39 (generación T4)

3

control 13 DP-305423-1/T40 (generación T4)

4

DP-305423-1/T8 (generación T5) 14 DP-305423-1/T41 (generación T4)

5

DP-305423-1/T9 (generación T5) 15 DP-305423-1/T42 (generación T4)

6

DP-305423-1/T10 (generación T5) 16 DP-305423-1/T43 (generación T4)

7

DP-305423-1/T11 (generación T5) 17 DP-305423-1/T44 (generación T4)

8

DP-305423-1/T12 (generación T5) 18 Control

9

DP-305423-1/T13 (generación T5) 19 DIGVII

10

DP-305423-1/T14 (generación T5) 20 2 copias PHP17752 + control

El ADN genómico aislado a partir de tejido foliar de soja de plantas individuales de DP-305423-1 (generación T5 y T4) y del control no modificado (Jack) se digirió con Nco I y se sondó con la sonda del gen gm-hra . Se digirieron y se cargaron en cada carril aproximadamente 2 g de ADN genómico. Los controles de número de copias de los genes incluyeron al plásmido PHP19340 y PHP17752 con el número de copias de genes aproximado indicado y 2 mg de ADN control no modificado. Los tamaños de los marcadores de peso molecular DIG VII se indican adyacentes a la imagen de la transferencia en kilopares de bases (kb). En la tabla 10 se presenta una descripción de cada carril.

Tabla 10

Análisis de la transferencia Southern del acontecimiento DP-305423-1; digestión con Nco I, sonda gm-hra

Carril

Muestra Carril Muestra

1

2 copias PHP19340 + control 11 DP-305423-1/T38 (generación T4)

2

DIGVII 12 DP-305423-1/T39 (generación T4)

3

control 13 DP-305423-1/T40 (generación T4)

4

DP-305423-1/T8 (generación T5) 14 DP-305423-1/T41 (generación T4)

5

DP-305423-1/T9 (generación T5) 15 DP-305423-1/T42 (generación T4)

6

DP-305423-1/T10 (generación T5) 16 DP-305423-1/T43 (generación T4)

7

DP-305423-1/T11 (generación T5) 17 DP-305423-1/T44 (generación T4)

8

DP-305423-1/T12 (generación T5) 18 Control

9

DP-305423-1/T13 (generación T5) 19 DIGVII

10

DP-305423-1/T14 (generación T5) 20 2 copias PHP17752 + control

Las tablas 11 y 12 resumen los resultados de los análisis de la transferencia Southern presentados en las figuras 5 a

10 8.

Tabla 11

Resumen de los fragmentos de hibridación esperados y observados en las transferencias Southern con la sonda gm-fad2-1 para DP-305423-1

Generación

Digestiónenzimática Tamaño esperado delfragmento1 (pb) Tamaño esperado delplásmido (pb)2 Tamaño observado del fragmento en DP305423-1 (pb)

T4 y T5 (figura 5)

Hind III 1687 1687 aprox. 8600* aprox. 8000* aprox.2400 16873

T4 y T5 (figura 6)

Nco I >2300 (límite) 3510 >8600* 3 bandas >8600 aprox. 7400 aprox.6100 (débil) aprox. 2900 aprox. 900*

Notas: *: La banda de hibridación también estaba presente en las muestras control. Se determina que esta banda procede de secuencias endógenas al entorno de la variedad Jack y no está relacionada con la inserción en DP305423-1. 1: El tamaño se basa en el mapa del fragmento PHP19340A en la figura 2. 2: El tamaño se basa en el mapa del plásmido PHP19340 en la figura 1. 3: El tamaño es el mismo que el esperado debido a una migración equivalente con el plásmido de control positivo.

Tabla 12 5

Resumen de los fragmentos de hibridación esperados y observados en las transferencias Southern con la sonda gm-hra para DP-305423-1

Generación

Digestiónenzimática Tamaño esperado delfragmento1 (pb) Tamaño esperado delplásmido (pb)2 Tamaño observado del fragmento en DP305423-1 (pb)

T4 y T5 (figura 7)

Hind III 2418 1529 2418 1529 >8600* aprox. 8600* aprox. 7400* aprox. 5700* aprox. 4600* 24183 aprox. 2300* aprox. 2100* 15293 aprox. 900*

10

15

20

25

30

Resumen de los fragmentos de hibridación esperados y observados en las transferencias Southern con la sonda gm-hra para DP-305423-1

Generación

Digestiónenzimática Tamaño esperado delfragmento1 (pb) Tamaño esperado delplásmido (pb)2 Tamaño observado del fragmento en DP305423-1 (pb)

T4 y T5 (figura 8)

Nco I >3000 (límite) >1500 (límite) 4214 2812 >8600* aprox. 8000* aprox. 6900* aprox.6100* aprox. 5200* aprox. 4900* aprox. 4500* aprox. 3600 aprox. 2300 aprox. 1600*

Notas: *: La banda de hibridación también estaba presente en las muestras control. Se determina que esta banda procede de secuencias endógenas al entorno de la variedad Jack y no está relacionada con la inserción en DP305423-1. 1: El tamaño se basa en el mapa del fragmento PHP17752A en la figura 4. 2: El tamaño se basa en el mapa del plásmido PHP17752 en la figura 3. 3: El tamaño es el mismo que el esperado debido a una migración equivalente con el plásmido de control positivo.

Se realizaron digestiones con Hind III en las muestras de ADN genómico para evaluar los fragmentos internos y la integridad de PHP19340A (figura 1; SEQ ID NO:1) y PHP17752A (figura 2; SEQ ID NO:2) a través de las generaciones T4 y T5 de DP-305423-1. Se seleccionó Nco I para evaluar el número de copias de los elementos gmfad2-1 y gm-hra en DP-305423-1 debido a la presencia de un único sitio de enzima de restricción en cada uno de los fragmentos de transformación. El único sitio de enzima de restricción produciría un único fragmento de límite de hibridación para cada copia insertada del elemento gm-fad2-1 y dos fragmentos de límite de hibridación para cada copia del gen gm-hra (tablas 11 y 12, respectivamente). Un fragmento de límite se deriva de un sitio de restricción en la inserción y el sitio de restricción correspondiente más cercado dentro del ADN genómico vegetal adyacente. El número de fragmentos de límite observados con las sondas de gm-fad2-1 y gm-hra proporciona un cálculo del número de copias del elemento dentro de la inserción de ADN de DP-305423-1.

Las sondas de gm-fad2-1 y gm-hra utilizadas para los análisis Southern eran altamente homólogas con secuencias en el genoma de soja endógeno y, por tanto, se esperaban otros fragmentos de hibridación. Estas bandas de hibridación se determinaron a través de su presencia en las muestras de control negativo y se indican en las tablas 11 y 12 mediante un asterisco (*).

Para verificar la integridad de la región 3’ de la inserción PHP19340A, el gm-fad2-1 se hibridó con la transferencia de Hind III. Se espera un único fragmento interno de 1687 pb basándose en la presencia de sitios Hind III en PHP19340A (tabla 11, figura 1). Se observó la banda esperada de 1687 pb y también se observó una segunda banda de aproximadamente 2400 pb (figura 5). Además, la sonda de gm-fad2-1 se hibridó con dos bandas más en DP-305423-1 que también estaban presentes en los controles y que no son debidas a la inserción de DP-305423-1 (figura 5). Es muy probable que la banda de 2400 pb sea debida a una copia parcial de PHP19340A que contiene la región gm-fad2-1. Estos resultados indican la presencia de copias intactas de PHP19340A, así como una copia parcial que contiene gm-fad2-1 en DP-305423-1. Este patrón de hibridación es constante a través de las generaciones T4 y T5 de DP-305423-1 analizadas (tabla 11).

Para determinar el número de copias del elemento gm-fad2-1 en DP-305423-1, la sonda de gm-fad2-1 se hibridó con la transferencia de Nco I. Se espera un fragmento de límite mayor que 2300 pb para cada copia de gm-fad2-1 (tabla 11, figura 1). La transferencia de Nco I hibridada con la sonda de gm-fad2-1 mostró seis fragmentos de hibridación (figura 6). El tamaño de estos seis fragmentos de hibridación se muestra en la tabla 11. Se observaron dos bandas adicionales y se determinó que eran debidas al genoma de soja endógeno, basándose en su presencia en las muestras de control negativo (tabla 11, figura 6). La presencia de seis fragmentos de hibridación indica que existen aproximadamente seis copias insertadas de los elementos gm-fad2-1 completos o parciales en el genoma de DP-305423-1. Este patrón de hibridación es constante a través de las generaciones T4 y T5 de DP-305423-1 analizadas (tabla 11), lo cual indica la estabilidad del ADN insertado.

La hibridación de la sonda gm-hra a la transferencia de Hind III verificaría la integridad del fragmento PHP17752A

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intacto y un terminador KTi3 de 35 pb en la orientación inversa, y que SpeI5.1 contenía un terminador KTi3 intacto y un terminador KTi3 de 34 pb en la orientación inversa, lo cual indica que los dos terminadores KTi3 de SpeI2.8 y SpeI5.1 están dispuestos como repeticiones invertidas. Los datos de la secuencia generados a partir de los productos de la iPCR con una digestión con PacI confirmaron que SpeI2.8 y Spe5.1 están dispuestos como

5 repeticiones invertidas.

Se empleó un análisis de la transferencia Southern para una posterior confirmación. Se digirió el ADN genómico total de plantas de soja DP-305423-1 y control con Bcl I, ClaI y XmnI, se ensayó en un gel de agarosa, se trasladó a una membrana de nailon, y se hibridó con la sonda de gm-fad2-1. Las bandas con el tamaño esperado se hibridaron con la sonda de gm-fad2-1: una banda de aproximadamente 3,1 kb para la digestión con Bcl I, una banda de

10 aproximadamente 3,9 kb para la digestión con ClaI, y una banda de 1,7 kb para la digestión con XmnI (figura 12). Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que los dos terminadores KTi3 de SpeI2.8 y SpeI5.1 están dispuestos de modo invertido.

Para el cóntigo-4, se identificaron 10058 pb de la secuencia genómica de DP-305423-1 (SEQ ID NO:82), que comprenden 2899 pb de la secuencia de límite genómica flanqueante 5’, 2149 pb de la secuencia de límite 15 genómica flanqueante 3’, y 5010 pb del ADN insertado. Se cree que la inserción contiene dos fragmentos PHP19340A truncados de un modo invertido. El primer fragmento PHP1930A truncado se localiza desde 2900 a 5163 pb, contiene un promotor KTi3 parcial (1442 pb) con una deleción 5’, un fragmento de gm-fad2-1 intacto (597 pb) y un terminador KTi3 intacto (196 pb). El segundo fragmento PHP1930A truncado se localiza desde 5164 a 7919 pb, contiene un promotor KTi3 parcial (1934 pb) con una deleción 5’, un fragmento de gmfad2-1 intacto (597 pb) y un

20 terminador KTi3 intacto (196 pb) (figura 12).

Para verificar las zonas de unión genómica/inserción 5’ y 3’ obtenidas de los bancos de plásmidos, se realizó una PCR con el ADN genómico de plantas de soja DP-305423-1 empleando la pareja de cebadores Q (HOS-A/HOS-B) para confirmar la zona de unión genómica/inserción 5’, y con la pareja de cebadores R (HOS-C/HOS-D) para confirmar la zona de unión genómica/inserción 3’. Los productos esperados de la PCR se amplificaron de plantas

25 DP-305423-1 (tabla 13), y no de plantas control; estos productos de la PCR se clonaron y secuenciaron. Se confirmó que la secuencia era la misma que la secuencia obtenida de los clones de plásmidos. Ejemplo 6: Estabilidad de la inserción del cóntigo-1

Tabla 13

PCR genómica para confirmar el ADN insertado y las regiones de límite genómicas flanqueantes en la soja DP305423-1

Producto de la PCR (tamaño en pb)

Pareja de cebadores Sistema de PCR1 Inserción Región amplificada

A (7103)

06-O-1571/06-O-1572 Expansión de molde largo 1 Inserción y región flanqueante 5’

B (731)

06-O-1351/06-O-1367 Alta fidelidad 1 Inserción y región flanqueante 5’

C (3226)

06-O-1357/06-O-1368 Advantage-GC-2 1 Inserción

D (2737)

06-O-1357/06-O1369 Advantage-GC-2 1 Inserción

E (1800)

06-O-1356/06-O-1371 Alta fidelidad 1 Inserción

F (1321)

06-O-1360/06-O-1423 Advantage-GC-2 1 Inserción

G (1830)

06-O-1363/06-O-1369 Advantage-GC-2 1 Inserción

H (2410)

06-O-1421 /06-O-1367 Advantage-GC-2 1 Inserción

I (2991)

06-O-1577/06-O-1578 Extensor de alta fidelidad 1 Inserción y región flanqueante 3’

J (7642)

06-O-1588/06-O-1585 Expansión de molde largo 2 Inserción y región flanqueante 5’

K (2817)

06-O-1586/06-O-1403 Advantage-GC-2 2 Inserción y región flanqueante 5’

L (2845)

06-O-1404/06-O-1592 Advantage-GC-2 2 Inserción y región flanqueante 3’

M (2804)

06-O-1669/06-O-1426 Expansión de molde largo 3 Inserción y región flanqueante 5’

PCR genómica para confirmar el ADN insertado y las regiones de límite genómicas flanqueantes en la soja DP305423-1

Producto de la PCR (tamaño en pb)

Pareja de cebadores Sistema de PCR1 Inserción Región amplificada

N (1335)

06-O-1355/06-O-1459 Alta fidelidad 3 Inserción

O(1085)

06-O-1569/06-O-1551 Expansión de molde largo 3 Inserción y región flanqueante 3’

P (2614)

05-O-1182/06-O-1672 Alta fidelidad 3 Inserción y región flanqueante 3’

Q (209)

HOS-A/HOS-B Taq polimerasa 4 Inserción y región flanqueante 5’

R (222)

HOS-C/HOS-D Taq polimerasa 4 Inserción y región flanqueante 3’

1. Los sistemas de PCR de alta fidelidad y de expansión de molde largo se adquirieron en Roche (Mannheim, Alemania), el sistema de PCR Advantage-GC-2 se adquirió en Clontech (Palo Alto, CA), el sistema de PCR de extensor de alta fidelidad se adquirió en ABgene (Surrey, Reino Unido), y la Taq polimerasa se adquirió en Fermentas (Hanover, MD).

Ejemplo 6:

Estabilidad de la inserción del cóntigo-1

Se descubrió que la inserción en el cóntigo-1 contenía un fragmento PHP19340A intacto (módulo de supresión de gm-fad2-1), un único fragmento PHP17752A intacto (módulo de expresión de gm-hra), y tres fragmentos 5 PHP19340A truncados. Un análisis de la transferencia Southern realizado en 100 plantas de la generación F2 de DP-305423-1 identificó una única planta que parece haber sufrido un acontecimiento de recombinación que provoca la eliminación del módulo de gm-hra completo, junto con porciones de dos de los múltiples fragmentos del promotor KTi3 que se encuentran en la inserción. Se analizó un gran número de plantas de generaciones segregantes mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para determinar con qué frecuencia aparece esta

10 recombinación.

Las semillas se obtuvieron de las generaciones segregantes de soja DP-305423-1 BC1F2, BC2F2, y BC3F2. Cada generación consiste en DP-305423-1 en el entorno Elite 1 o Elite 2. Se plantaron un total de 1060 semillas (tabla 14).

Tabla 14

Semilla de soja DP-305423-1

Generación

Entorno Semillas plantadas Plantas muestreadas

BC1F2

Elite 1 175 166

BC1F2

Elite 2 150 142

BC2F2

Elite 1 65 62

BC2F2

Elite 2 40 36

BC3F2

Elite 1 420 402

BC3F2

Elite 2 210 201

Se recogieron troquelados de hoja individuales y se extrajo el ADN genómico de los troquelados empleando el

15 método de extracción de hidróxido de sodio caliente y Tris (Truett, G.E., Heeger, P., Mynatt, R.L., Truett, A.A., Walker, J.A. y Warman, M.L. (2000), Preparation of PCR-Quality Mouse Genomic DNA with Hot Sodium Hydroxide and Tris (HotSHOT), BioTechniques 29: 52-53.).

Se realizó una PCR a tiempo real en cada muestra de ADN empleando un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7900HT y el software SDS adjunto (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Se diseñaron conjuntos de 20 sondas y cebadores TaqMan® para detectar dos secuencias de inserción diana: (1) la región de la zona de unión 5’ entre el ADN genómico y el ADN de la inserción en el cóntigo-1, que se empleó como marcador para el módulo de supresión de gm-fad2-1 (SEQ ID NO:89, 90 y 91), y (2) la región en la inserción del cóntigo-1 que abarca el promotor de SAMS y gm-hra (SEQ ID NO:92, 93 y 94). Además, se empleó un conjunto de sonda y cebador TaqMan® para el gen endógeno de soja de referencia para confirmar la presencia de un ADN amplificable en cada reacción. El

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

el contenido en ácido linoleico afecte al contenido en ácido linolénico en la soja DP-305423-1. La disminución en el contenido en ácido palmítico y en ácido linolénico se ha indicado previamente para una soja con alto contenido en ácido oleico transgénica (OECD identificador DD-∅26∅∅5-3, base de datos AGBIOS) generada por la introducción del gen FAD2-1 (Kinney y Knowlton, 1997; Glancey et al., 1998; Knowlton, 1999).

Se detectó el isómero (9,15) del ácido linoleico (ácido cis-9, cis-15-octadecadienoico) en la soja DP-305423-1 a la concentración promedio de 0,341% de los ácidos grasos totales, mientras que las variedades de referencia convencionales no contienen concentraciones mensurables de este analito. Esto fue un descubrimiento esperado, puesto que el isómero del ácido 9,15-linoleico ya se ha observado previamente en aceite de soja con alto contenido en ácido oleico en menos del 1% del contenido en ácidos grasos totales (Kinney y Knowlton, 1997). Este isómero también se ha encontrado, en concentraciones que varían del 0,02% al 5,4% de ácidos grasos totales, en muchas fuentes comestibles de grasas, que incluyen grasa de mantequilla, queso, sebo de vaca y cordero, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, leche humana y pulpa de mango (Kinney y Knowlton, 1997, y las referencias en este documento). Es probable que el isómero del ácido 9,15-linoleico sea el resultado de la actividad de la ácido graso desaturasa codificada por el gen FAD3 que normalmente inserta un doble enlace d-15 en el ácido 9,12-linoleico para producir ácido 9,12,15-linolénico. En la soja DP-305423-1, el contenido en ácido 9,12-linoleico está significativamente reducido (tabla 16), de modo que la desaturasa codificada por FAD3 probablemente crea una pequeña cantidad del isómero del ácido 9,15-linoleico mediante la desaturación del abundante sustrato de ácido 9oleico en la posición d-15. Esta opinión resulta apoyada por los resultados del cruzamiento de soja con alto contenido en ácido oleico (OECD identificador DD-∅26∅∅5-3, base de datos AGBIOS) con soja que contiene el gen FAD3 silenciado. En la progenie resultante, el isómero de ácido 9,15-linoleico se encuentra reducido o se ha eliminado (Kinney y Knowlton, 1997).

Los valores promedio de dos ácidos grasos secundarios, el ácido heptadecanoico (C17:0) y el ácido heptadecenoico (C17:1), en la soja DP-305423-1 estaban por encima del límite superior de los intervalos de tolerancia estadística y de los intervalos de la bibliografía de las variedades de soja convencionales. Los valores promedio de C17:0 y C17:1 fueron estadística y significativamente diferentes de los de la soja control cercana a la isolínea. Sin embargo, los niveles de ácido heptadecanoico y heptadecenoico en general aún son muy bajos; cada uno representa menos del 1,2% del contenido en ácidos grasos totales en la soja DP-305423-1.

El aumento detectado en el ácido heptadecanoico (C17:0) y el ácido heptadecenoico (C17:1) en la soja DP-3054231 no es inesperado, puesto que es probable que la expresión de la proteína GM-HRA produzca un ligero desplazamiento en la disponibilidad de los sustratos enzimáticos de GM-HRA, piruvato y 2-cetobutirato. Estos dos compuestos también son sustratos para el complejo enzimático que inicia la biosíntesis de aceite.

Los valores promedio para el ácido mirístico (C14:0), ácido palmitoleico (C16:1), ácido esteárico (C18:0), ácido araquídico (C20:0), ácido eicosenoico (C20:1), ácido behénico (C22:0) y ácido lignocérico (C24:0) para la soja DP305423-1 estaban dentro de los intervalos de tolerancia estadística y/o los intervalos de la bibliografía combinados para estos ácidos grasos en diferentes variedades de soja. Con la excepción del ácido behénico, los valores promedio para estos ácidos grasos fueron fue estadística y significativamente diferentes, tanto por encima (ácidos palmitoleico, araquídico, eicosenoico, y lignocérico) como por debajo (ácidos mirístico y esteárico), de los del control cerca de la isolínea. Los ácidos mirístico, palmitoleico, araquídico, eicosenoico, behénico, y lignocérico son ácidos grasos secundarios, y cada uno comprende del 0,05-0,5% de ácidos grasos totales en la soja DP-305423-1; el ácido esteárico comprende menos del 4,5% en la soja DP-305423-1. Estos ácidos grasos son constituyentes habituales de los aceites vegetales y productos alimentarios habituales, y están presentes a unos niveles similares a los observados en la soja DP-305423-1 (USDA Nutrition Database, edición 19).

El ácido eicosadienoico (C20:2) resultó indetectable en la soja DP-305423-1. De modo similar, las variedades de soja de referencia también carecen de concentraciones mensurables de este ácido graso. Un nivel muy bajo de ácido eicosadienoico resultó detectable en la soja control cercana a la isolínea; sin embargo, esta diferencia con la soja DP-305423-1 no resultó estadísticamente significativa (valor P ajustado <0,05).

Tabla 16

Principales ácidos grasos en granos de soja

Ácidos grasos (% del total)

Control (segregante nulo) Soja 305423 Intervalo de tolerancia1 Intervalos de la bibliografíacombinados2

Ácido mirístico (C14:0)

Promedio3 0,0742 0,0451 0-0,174 0,0710-0,238

Intervalo4

0,0676-0,0807 0,0419-0,0522

Valor P ajustado5

0,00077

Valor P6

0,0001

Principales ácidos grasos en granos de soja

Ácidos grasos (% del total)

Control (segregante nulo) Soja 305423 Intervalo de tolerancia1 Intervalos de la bibliografíacombinados2

Ácido palmítico (C16:0)

Promedio 10,3 6,28 2,93-19,6 7,00-15,8

Intervalo

9,77-10,7 5,71-7,27

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido palmitoleico (C16:1)

Promedio 0,0860 0,0946 0,0110-0,177 0,0860 -0,194

Intervalo

0,0751-0,0948 0,0835-0,105

Valor P ajustado

0,02487

Valor P

0,0053

Ácido heptadecanoico (C17:0)

Promedio 0,113 0,798 0,0722-0,131 0,0850-0,146

Intervalo

0,0993-0,127 0,703-0,890

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido heptadecenoico (C17:1)

Promedio 0,0614 1,19 0,0351-0,0732 0,0730-0,0870

Intervalo

0,0513-0,0762 1,01-1,51

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido esteárico (C18:0)

Promedio 4,98 4,36 0,852-8,34 2,00-5,88

Intervalo

4,36-5,89 3,90-5,01

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido oleico (C18:1)

Promedio 21,1 76,5 11,3-32,6 14,3-34,0

Intervalo

18,0-24,1 68,7-79,4

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido linoleico (C18:2)

Promedio 52,5 3,62 41,7-64,3 42,3 -60,0

Intervalo

50,2-54,3 1,53-8,98

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido linoleico (C18:2), isómero (9,15)

Promedio 0,247 0,341 NA8 NR9

Intervalo

0-0,532 0,143-0,456

Valor P ajustado

0,1787

Valor P

0,0699

Principales ácidos grasos en granos de soja

Ácidos grasos (% del total)

Control (segregante nulo) Soja 305423 Intervalo de tolerancia1 Intervalos de la bibliografíacombinados2

Ácido linolénico (C18:3)

Promedio 9,35 5,39 1,15-14,7 2,00-12,5

Intervalo

7,83-11,2 4,03-7,32

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido araquídico (C20:0)

Promedio 0,396 0,450 0,103-0,619 0-1,00

Intervalo

0,348-0,479 0,393-0,528

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido eicosenoico (C20:1)

Promedio 0,170 0,347 0,0549-0,319 0,140-0,350

Intervalo

0,135-0,201 0,290-0,394

Valor P ajustado

0,00077

Valor P

0,0001

Ácido eicosadienoico (C20:2)

Promedio 0,0225 NA8 0,0770-0,245

Intervalo

0-0,0502 0-0

Valor P ajustado

0,0928

Valor P

0,0298

Ácido behénico (C22:0)

Promedio 0,414 0,427 0,188-0,458 0,277-0,595

Intervalo

0,349-0,566 0,382-0,546

Valor P ajustado

0,5468

Valor P

0,3779

Ácido lignocérico (C24:0)

Promedio 0,114 0,143 0-0,310 NR9

Intervalo

0,0845-0,139 0,115-0,173

Valor P ajustado

0,00177

Valor P

0,0003

1 Los límites de tolerancia negativos se ajustaron a cero. 2 Los intervalos de la bibliografía se han tomado de la bibliografía publicada para la soja (OECD, 2001; ILSI 2004). 3 Promedio de mínimos cuadrados. 4 El intervalo indica el valor individual menor y mayor a través de las localizaciones. 5 Valor P ajustado a la tasa de descubrimientos falsos (FDR). 6 Valor P no ajustado. 7 Diferencia estadísticamente significativa; valor P ajustado <0,05. 8 El análisis estadístico no está disponible (NA), debido a la falta de concentraciones mensurables detectadas para este analito. 9 Los intervalos del analito no se han indicado (NR) en las referencias de la bibliografía publicadas.

El artículo "el/la" se emplea en la presente para indicar uno o más de un (es decir, al menos un) objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos.

Claims (1)

1. imagen1

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