BR102014032614A2 - estratégia de empilhamento de traços para introgressão no milho - Google Patents

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Abstract

estratégia de empilhamento de traços para introgressão no milho. é fornecido um método para diminuir o tempo requerido para introgredir três ou mais traços desejados a partir de linhagens de planta doadora em um antecedente de planta de elite. o método compreende cruzar duas plantas doadoras, em que as plantas doadoras tenham sido cada uma retrocruzada para ter um alto percentual de parental recorrente e compartilhem um lócus desejado para ser introgredido no antecedente de planta de elite.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ESTRATÉGIA DE EMPILHAMENTO DE TRAÇOS PARA INTROGRESSÃO NO MILHO".
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS [001] Esse pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) do Pedido Provisório U.S. No. de Série 61/921.681, depositado em 30 de dezembro de 2013, cuja descrição completa está incorporada aqui por referência.
ANTECEDENTES [002] O melhoramento da planta é a arte e a ciência de produzir plantas que possuem novas combinações das características desejada. O melhoramento da planta pode ser obtido através de várias técnicas diferentes que variam entre simplesmente selecionar plantas com as características desejadas para propagação a técnicas moleculares mais complexas. Os métodos tradicionais de melhoramento de planta ainda possuem um lugar no desenvolvimento de variedades de plantas, mesmo com todos os avanços na biologia molecular e a habilidade de produzir plantas transgênicas. Um uso importante dos métodos de melhoramento de planta tradicionais envolve o uso de procedimentos de retrocruzamento para transferir um transgene de uma variedade boa de cultura de tecido que foi usada na transformação para uma linhagem ou variedade experimental de elite. Para várias culturas, uma vez que o transgene está na espécie de cultura, o cruzamento é mais eficiente do que a transformação da linhagem de elite através da tecnologia recombinante, por que a maioria dos protocolos de transformação são otimizados para uma linhagem de laboratório específica (geralmente insuficientemente adaptada e de menor rendimento). Várias linhagens de elite (que têm alto rendimento) não são passíveis de transformação. Portanto, os engenheiros genéticos transformam tipicamente as linhagens de laboratório e os reprodutores retrocruzam o transgene da linhagem de laboratório na linhagem de elite. [003] Entretanto, as metodologias padronizadas de melhoramento por retrocruzamento são demoradas. A introgressão de três genes no germeplasma da elite pura requer tipicamente quatro anos do início à produção de semente. Consequentemente, há uma necessidade de novos métodos de melhoramento por retrocruzamento que possam reduzir esse período de tempo. A presente descrição fornece uma metodologia para eliminar uma ou mais gerações de retrocruzamento e permite o aumento maiores e mais rápidos na semente parental quando três ou mais eventos transgênicos estão para ser introgredidos em um parental recorrente.
SUMÁRIO [004] De acordo com uma modalidade, uma metodologia aperfeiçoada de melhoramento por retrocruzamento é fornecida para reduzir o tempo requerido para introgredir três ou mais traços empilhados ou segmentos de ácidos nucleicos em uma linhagem pura de planta de elite. Em uma modalidade, o método compreende cruzar duas plantas doadoras, em que as duas plantas doadoras compreendem cada uma, um dos três eventos transgênicos empilhados desejados em comum e cada doadora tenha sido retrocruzada com a mesma planta recorrente para gerar linhagens de retrocruzamento doadoras que possuem um alto percentual do parental recorrente e carregam genes de interesse do doador. As duas linhagens de retrocruzamento doadoras (cada uma com um conjunto diferente de genes dos doadores) são então cruzadas para produzir uma progênie que compreenda os três eventos transgênicos originalmente presentes nas duas linhagens parentais doadoras e que tenha um percentual do parental recorrente de pelo menos 94%. [005] Em uma modalidade, o método para introgredir três ou mais eventos transgênicos a partir de duas linhagens doadoras em um úni- co germeplasma da planta recorrente compreende cruzar uma primeira planta doadora/recorrente com uma segunda planta doado-ra/recorrente, em que a primeira planta doadora/recorrente compreende um primeiro evento transgênico e um segundo evento transgênico e a segunda planta doadora/recorrente compreende o segundo evento transgênico e um terceiro evento transgênico, com ambas as plantas doadoras/recorrentes possuindo mais do que 80% do genoma da planta recorrente. Depois do cruzamento das duas plantas doadoras/recorrentes, o produto da progênie da planta é examinado para identificar e selecionar aquelas que compreendem os ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos. Em uma modalidade, a primeira planta doadora/recorrente e a segunda planta doadora/recorrente são geradas como linhagens de planta paralelas, em que cada uma das primeira planta doadora e segunda planta doadora é cruzada com a mesma planta recorrente para gerar uma primeira e segunda progênies, respectivamente, em que a dita primeira planta doadora compreende o primeiro evento transgênico e o segundo evento transgênico e a segunda planta doadora compreende o segundo evento transgênico e o terceiro evento transgênico. Uma ou mais gerações de retrocruzamento são então geradas pelo cruzamento da progênie da primeira planta e da progênie da segunda planta com as plantas parentais recorrentes para fornecer a primeira e segunda plantas de retrocruzamento, respectivamente. A primeira e segunda plantas de retrocruzamento são então retrocruzadas com as ditas plantas recorrentes para produzir a primeira planta doadora/recorrente (que compreende o dito primeiro evento transgênico, o segundo evento transgênico e que possui mais do que 80% do genoma da planta recorrente) e uma segunda planta doadora/recorrente (que compreende o dito segundo evento transgênico, o dito terceiro evento transgênico e que possui mais do que 80% do genoma da planta recorrente), respec- tivamente. Em uma modalidade, em pelo menos um dos cruzamentos conduzidos com a planta recorrente dentro de cada conversão de doador, a planta recorrente parental é uma planta feminina. [006] Em uma modalidade, um método para introgredir três ou mais eventos transgênicos no germeplasma de uma planta recorrente é fornecido, em que o método compreende a) fornecer uma primeira planta doadora, que compreenda um primeiro empilhamento de pelo menos dois eventos transgênicos; b) cruzar a primeira planta doadora com a planta recorrente parental selecionada para produzir uma primeira progênie de planta F1 que compreende o primeiro empilhamento de eventos transgênicos; c) realizar um primeiro retrocruzamento de melhoramento da primeira progênie de planta F1 com a planta recorrente parental e selecionar uma primeira progênie de planta de retrocruzamento de melhoramento que compreenda os primeiros eventos transgênicos de empilhamento d) retrocruzar a primeira progênie de retrocruzamento de melhoramento selecionada com a planta parental recorrente uma ou mais vezes em sucessão para produzir uma primeira progênie superior da planta de retrocruzamento ou BC2 que compreende o primeiro empilhamento de eventos transgênicos; e) selecionar uma segunda planta doadora que compreenda um segundo empilhamento de pelo menos dois eventos transgênicos, em que pelo menos um dos eventos transgênicos do segundo empilhamento também está presente no primeiro empilhamento de eventos transgênicos; f) cruzar a segunda planta doadora e a planta parental recorrente selecionada para produzir uma segunda progênie de planta F1 que compreende o segundo empilhamento de eventos transgênicos; g) realizar um segundo retrocruzamento de melhoramento da segunda progênie de planta F1 com a planta parental recorrente e selecionar uma segunda planta da progênie de retrocruzamento de melhoramento que compreenda o segundo empilhamento de eventos transgênicos; h) retrocruzar a segunda progênie de retrocruzamento de melhoramento selecionada com a planta parental recorrente uma ou mais vezes em sucessão para produzir uma primeira progênie superior da planta de retrocruzamento ou BC2 que compreende o segundo empilhamento de eventos transgênicos; i) cruzar a primeira progênie superior de retrocruzamento ou BC2 com a segunda progênie superior de retrocruzamento ou BC2 para produzir uma terceira progênie que compreenda os três eventos transgênicos únicos a partir do primeiro e segundo empilhamentos de eventos transgênicos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [007] A Fig. 1 é um desenho esquemático da estratégia de conversão de traço para o empilhamento de Mon88017 e Mon89034 junto com TC1507 em um germeplasma de elite e recuperação de 98% do genoma parental recorrente. [008] A Fig. 2 fornece um fluxograma do esquema de seleção assistida por marcador a ser usado para a progênie BC2 e BC3 das conversões paralelas para Mon17 (Mon88017::TC1507) e Mon89 (Mon88017::Mon89034), [009] A Fig. 3 fornece um fluxograma do esquema de seleção assistida por marcador para BC2. [0010] A Fig. 4 fornece um fluxograma do esquema de seleção assistida por marcador para BC3. [0011] A Fig.5 fornece um fluxograma do esquema de seleção assistida por marcador para a Geração de Empilhamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES [0012] Na descrição e reivindicação da invenção, a terminologia a seguir será usada de acordo com as definições dadas abaixo. [0013] A expressão "cerca de" como usada aqui significa maior ou menor do que o valor ou intervalo de valores estabelecidos em 10 porcento, mas não é pretendido designar qualquer valor ou intervalo de valores apenas a esta definição mais ampla. Cada valor ou intervalo de valores precedido pela expressão "cerca de" também é pretendido abranger a modalidade do valor ou intervalo de valores absolutos estabelecidos. [0014] Como usada aqui, a expressão "planta" inclui uma planta completa e qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta. A expressão "partes de planta" inclui quaisquer partes de uma planta incluindo, por exemplo e sem limitação: semente (incluindo a semente madura e a semente imatura); um corte de planta; uma célula de planta; uma cultura de célula de planta; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutos, brotos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido de planta ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células de planta que esteja organizado em uma unidade estrutural ou funcional. Uma célula ou cultura de tecido de planta pode ser capaz de regenerar uma planta que possua as características fisiológicas e morfológicas da planta a partir da qual a célula ou tecido foram obtidos e de regenerar uma planta que possua substancialmente o mesmo genótipo como a planta. Em contraste, algumas células de planta não são capazes de ser regeneradas para produzir plantas. Células regeneráveis em uma cultura de célula ou tecido de planta podem ser embriões, protoplas-tos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flores, amêndoas, grãos, espigas, cascas ou caules. [0015] Como usadas aqui, as expressões "nativa" ou "natural" definem uma condição encontrada na natureza. Uma "sequência de DNA nativa" é uma sequência de DNA presente na natureza que foi produzida por meios naturais ou técnicas de melhoramento tradicionais, mas não geradas pela manipulação genética (por exemplo, usando técnicas de biologia molecular/transformação). [0016] Como usada aqui, "sequência endógena" define a forma nativa de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo em sua localização natural no organismo ou no genoma de um organismo. [0017] A expressão "isolada" como usada aqui significa ter sido removido de seu ambiente natural. [0018] A expressão "purificada", como usada aqui, define o isolamento de uma molécula ou composto em uma forma que está substancialmente livre de contaminantes normalmente associados com a molécula ou composto em um ambiente nativo ou natural e significa ter tido a pureza aumentada como resultado de ter sido separado de outros componentes d composição original. A expressão "ácido nucleico purificado" é usada aqui para descrever uma sequência de ácido nucleico que tenha sido separada de outros compostos incluindo, mas não limitados a polipeptídeos, lipídeos e carboidratos. [0019] A expressão "sequência exógena de DNA" como usada aqui é qualquer sequência de ácido nucleico que tenha sido removida de sua localização nativa e inserida em uma nova localização que altera as sequências que flanqueiam a sequência de ácido nucleico que tenha sido movida. Por exemplo, uma sequência exógena de DNA pode compreender uma sequência de outra espécie. [0020] Como usada aqui, uma "sequência endógena modificada" é uma alteração em uma sequência de ácido nucleico endógeno e inclui deleções, inserções, substituições e rearranjos de sequências genômi-cas endógenas, incluindo a inserção de sequências exógenas de DNA. [0021] Como usada aqui, a expressão "evento transgênico" é pretendida designar um lócus que codifica um ou mais traços desejados. O evento transgênico pode compreender uma sequência endógena modificada que representa uma alteração única ou pode incluir uma série de sequências endógenas modificadas que segregam juntas, incluindo, por exemplo, uma ou mais sequências exógenas intimamente ligadas que podem conter um ou mais transgenes. [0022] Como usadas aqui, as expressões "introgressão", "introgre-dido" e "introgredir" se referem a ambos processos naturais e artificiais e os eventos resultantes, através dos quais traços, genes ou sequências de DNA de uma espécie, variedade ou cultivar são movidos para o genoma de outra espécie, variedade ou cultivar pelo cruzamento dessas espécies. O processo pode ser opcionalmente completado pelo retrocruzamento do parental recorrente. Exemplos de introgressão incluem a entrada ou a introdução de um gene, um transgene, um elemento regulatório, um marcador, um traço, um lócus de um traço ou um segmento cromossômico do genoma de uma planta no genoma de outra planta. [0023] "Lócus" (plural loci) se refere à localização específica de um gene ou sequência de DNA em um genoma. Um lócus pode conferir um traço específico e pode estar presente no DNA nuclear, do cloro-plasto ou mitocondrial. [0024] Como usada aqui, a expressão "parental recorrente" ou "planta recorrente" descreve uma linhagem de elite que é a linhagem da planta receptora e que será usada como a linhagem parental para retrocruzamentos sucessivos para produzir a linhagem final desejada. [0025] A expressão "cruzamento" como usada aqui, se refere à fertilização de plantas femininas (ou gametas) por plantas masculinas (ou gametas). A expressão "gameta" se refere à célula reprodutora haploide (ovo ou pólen) produzida nas plantas pela meiose de um ga- metócito e envolvida na reprodução sexual, durante a qual dois game-tas do sexo oposto se fundem para formar um zigoto diploide. A expressão geralmente inclui a referência a um pólen (incluindo a célula espermática) e um óvulo (incluindo o ovo). "Cruzamento", portanto, se refere de modo geral à fertilização de óvulos de um indivíduo com o pólen de outro indivíduo, enquanto que "autofecundação" define tipicamente a fertilização de óvulos de um indivíduo com pólen do mesmo indivíduo. Quando se referir a cruzamento no contexto de obtenção da introgressão de uma região ou segmento genômico, a pessoa experiente entenderá que a fim de obter a introgressão de apenas uma parte de um cromossomo de uma planta no cromossomo de outra planta, porções aleatórias dos genomas de ambas linhagens parentais se re-combinam durante o cruzamento devido a ocorrência de eventos de crossing-over na produção de gametas nas linhagens parentais. Portanto, os genomas de ambos parentais devem ser combinados em uma única célula por um cruzamento, onde depois da produção de gametas de uma célula e sua fusão na fertilização resultará em um evento de introgressão. [0026] A expressão "receptor", como usada aqui, se refere à planta ou linhagem de planta que recebe o traço, evento transgênico ou segmento genômico de um doador e cujo receptor pode ou não ter o próprio traço, evento transgênico ou segmento genômico em um estado heterozigoto ou homozigoto. [0027] A expressão "linhagem de melhoramento" ou "linhagem de elite" como usada aqui, se refere a uma linhagem de uma planta cultivada que características comercialmente valiosas ou agronomicamen-te desejáveis, em oposição a variedades selvagens ou variedades que possuam qualidades benéficas em relação à manipulação experimental. A expressão inclui a referência a linhagens de plantas de elite que representam uma linhagem de plantas essencialmente homozigota, por exemplo, natural ou haploide dupla, usada para produzir as plantas F1. [0028] Como usada aqui, a expressão "F1" se refere a qualquer descendência de um cruzamento entre dois indivíduos geneticamente diferentes. [0029] A expressão "doador", como usada aqui, se refere à planta ou linhagem de planta a partir da qual o traço, evento transgênico ou segmento genômico se origina e cujo doador pode ter um traço, intro-gressão ou segmento genômico em um estado heterozigoto ou homo-zigoto. [0030] A expressão "retrocruzamento", como usada aqui define o cruzamento de uma planta ou plantas F1 com um dos parentais originais. Um retrocruzamento é usado para manter a identidade de um parental (espécie) e para incorporar um traço particular de um segundo parental (espécie). A expressão "geração de retrocruzamento" como usada aqui, se refere à progênie de um retrocruzamento. [0031] A expressão "autofecundada" como usada aqui, define o cruzamento de duas plantas geneticamente idênticas. Tipicamente, a expressão autofecundada define os eventos de autopolinização e inclui o processo de fertilização em que o óvulo e o pólen são da mesma planta ou linhagem de planta. [0032] Como usada aqui, a expressão "percentual de parental recorrente" se refere ao percentual no qual uma progênie de retrocruzamento é idêntica à planta parental recorrente usada no retrocruzamento. O percentual de identidade com o parental recorrente pode ser determinado experimentalmente pela medida de mercadores genéticos tais como RFLPs ou pode ser calculado teoricamente com base em uma fórmula matemática. [0033] A expressão "descendência", como usada aqui, se refere a qualquer geração de progênie que resulte de um cruzamento ou auto- fecundação. [0034] A expressão "identificação", como usada aqui, se refere a um processo de estabelecimento da identidade ou caráter diferenciado de uma planta, tal como exibição de um certo traço. [0035] A expressão "selecionar", como usada aqui, se refere a um processo de escolha de um certo indivíduo a partir de um grupo de indivíduos, geralmente com base em uma certa identidade daquele indivíduo. [0036] A expressão "seleção assistida por marcador", como usada aqui, se refere ao processo diagnóstico de identificação, geralmente acompanhado pela seleção de uma planta a partir de um grupo de plantas usando a presença de um marcador molecular como a característica de diagnóstico ou critério de seleção. O processo geralmente envolve detectar a presença de uma certa sequência de ácido nucleico ou polimorfismo no genoma de uma planta. [0037] A expressão "marcador molecular", como usada aqui, define um indicador que é usado nos métodos para visualizar as diferenças nas características de sequências de ácido nucleico. Exemplos de tais indicadores são marcadores de polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo no comprimento do fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotí-deo único (SNPs), marcadores de microssatélite (por exemplo, SSRs), marcadores de região amplificada de sequência caracterizada (se-quence-characterized amplified region) (SCAR), Sequenciamento de DNA de Nova Geração (NGS) de um marcador molecular, marcadores de sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS) ou marcadores de isozima ou combinações dos marcadores descritos aqui que definem uma localização genética e cromossômica específica. [0038] A expressão "gene", como usada aqui, se refere a uma unidade hereditária que consiste em uma sequência de DNA que ocupa uma localização específica sobre um cromossomo e que contém a instrução genética para características ou traços particulares em um organismo. A expressão "gene" inclui assim uma sequência de ácido nu-cleico (por exemplo, DNA ou RNA) que compreende as sequências codificadoras necessárias para a produção de um RNA ou um polipep-tídeo ou seu precursor. Um polipeptídeo funcional pode ser codificado por uma sequência codificadora de extensão completa ou por qualquer porção da sequência codificadora desde que a atividade desejada ou as propriedades funcionais (por exemplo, atividade enzimática, ligação ao ligante, transdução do sinal, etc.) do polipeptídeo sejam retidas. MODALIDADES [0039] O retrocruzamento ou seleção de pedigree é um método pelo qual os reprodutores adicionam traços agronômicos às linhagens de reprodução de elite. O método envolve cruzar a linhagem de reprodução com uma linhagem que expresse o traço desejado seguido pelo retrocruzamento das plantas da progênie que expressam o traço com o parental recorrente. A presente descrição está direcionada para métodos aperfeiçoados de introgressão de três ou mais eventos transgê-nicos desejáveis em um germeplasma de planta de elite. Em uma modalidade, o método compreende preparar duas linhagens doadoras em paralelo, em que as linhagens doadoras compreendem pelo menos um evento transgênico desejável compartilhado para ser transferido para o germeplasma de elite. As duas linhagens doadoras são selecionadas inicialmente com base na existência de certos traços herdáveis desejáveis. A primeira e segunda linhagens doadoras são então cruzadas com uma linhagem de elite para produzir a progênie F1. A primeira e segunda progênies F1 são analisadas separadamente e as plantas de cada uma das duas linhagens que possuem os eventos transgênicos empilhados desejados são selecionadas e retrocruzadas separadamente com o parental recorrente para produzir plantas de uma primei- ra e segunda progênie de retrocruzamento que possuem o traço desejado e essencialmente todas as características fisiológicas e morfoló-gicas da linhagem de elite original. Em uma modalidade, pelo menos uma das etapas de retrocruzamento será conduzida usando uma planta parental recorrente feminina. [0040] Em uma modalidade, as primeira e segunda plantas doado-ras finais produzidas pelo retrocruzamento com o parental recorrente compreenderão os eventos transgênicos empilhados desejados e exibirão um alto Percentual do Parental Recorrente (RPP). O RPP teórico pode ser calculado usando uma fórmula simples e baseada no número de retrocruzamentos conduzidos. Se o parental usado para o retrocruzamento é homozigoto, o percentual de parental recorrente depois de N gerações de retrocruzamento é 1-(1/2)N + 1 x 100. Seis gerações de retrocruzamento são então necessárias para obter mais do que 99% de percentual de parental recorrente. A análise da progênie de retrocruzamento com marcadores de Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP) é um método de análise dos resultados e de comparação da quantidade teórica de endocruzamento com níveis reais de endocruzamento observados. Marcadores moleculares adicionais também podem ser usados para avaliar RPP, incluindo, por exemplo, marcadores de polimorfismo no comprimento do fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), marcadores de microssatélite (por exemplo, SSRs), marcadores de região amplificada de sequência caracterizada (sequence-characterized am-plified region) (SCAR), marcadores de sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS) ou marcadores de isozima ou combinações desses. A tecnologia do Sequenciamento de DNA de Nova Geração (NGS) também pode ser usada para cobrir o genoma completo. [0041] Em uma modalidade, um método para introgredir três eventos transgênicos em uma planta recorrente compreende a preparação de duas linhagens doadoras em paralelo, em que as duas linhagens doadoras serão retrocruzadas com a mesma planta parental recorrente. As duas linhagens doadoras retrocruzadas em paralelo resultantes diferirão nos eventos transgênicos desejados que elas contêm, mas cada uma compreenderá um evento transgênico em comum e ambas doadoras terão um Percentual de Parental Recorrente de pelo menos 75, 85, 88, 90, 94, 97 ou 97,5 %. Em uma modalidade, as duas linhagens paralelas de plantas doadoras compreenderão, cada uma, pelo menos dois eventos transgênicos a serem introgredidos na linhagem de elite e pelo menos um dos eventos transgênicos a ser introgredido estará presente em cada uma das duas plantas doadoras.
Evento Transgênico [0042] As linhagens de plantas doadoras iniciais compreenderão pelo menos dois eventos transgênicos desejados que são desejados serem introgredidos em uma linhagem de elite. Em uma modalidade da presente descrição, as plantas doadoras compreendem dois ou mais eventos transgênicos em que os eventos transgênicos não estão intimamente ligados e mais tipicamente estão localizados sobre cromossomos diferentes. Em outras modalidades, as plantas doadoras compreendem dois ou mais eventos transgênicos em que os eventos transgênicos estão intimamente ligados sobre o mesmo cromossomo. Cada evento transgênico representa uma ou mais sequências desejáveis que estão suficientemente ligadas tal que elas segregam juntas. Em uma modalidade, o evento transgênico está em um lócus que compreende os componentes genéticos que resultam na expressão de um ou mais traços. Em uma modalidade, o evento transgênico inclui uma série de sequências regulatórias ou genes, incluindo, por exemplo, uma ou mais sequências exógenas inseridas que podem conter um ou mais transgenes. Os componentes que compreendem um evento transgênico podem compreender uma fase de leitura aberta ou uma sequência endógena modificada. Em uma modalidade, o evento trans-gênico compreende um ou mais cassetes de expressão de gene que compreendem adicionalmente sequências de gene ativamente transcritas e/ou traduzidas. Inversamente, o evento transgênico pode compreender uma sequência de polinucleotídeos que não compreende um cassete de expressão de gene funcional ou um gene completo (por exemplo, pode compreender simplesmente sequências regulatórias tais como um promotor) ou pode não conter quaisquer elementos de expressão de gene identificáveis ou qualquer sequência de gene ativamente transcrito. [0043] Em uma modalidade, o evento transgênico compreende um ou mais genes que codificam a tolerância ao herbicida, resistência a insetos, nutrientes, antibióticos ou moléculas terapêuticas. De acordo com uma modalidade, as linhagens de planta doadora compreendem múltiplos eventos transgênicos "empilhados" no genoma da planta doadora, em que os eventos transgênicos compreendem duas ou mais sequências que codificam genes que fornecem um traço agronômico. Exemplos de traços agronômicos que podem ser empilhados no genoma da planta doadora incluem a resistência ou tolerância ao glifosa-to ou outro herbicida e/ou fornece resistência a insetos selecionados ou doenças e/ou melhorias nutricionais e/ou características agronômicas aperfeiçoadas e/ou proteínas ou outros produtos úteis na alimentação, em ração, usos industrial, farmacêuticos ou outros. O "empi-Ihamento" de duas ou mais sequências de ácido nucleico (por exemplo, genes) de interesse dentro de um genoma de planta doadora pode ser obtido, por exemplo, através da reprodução convencional usando dois ou mais eventos de transformação de uma planta com um cons-truto que contém as sequências de interesse, re-transformação de uma planta transgênica ou adição de novos traços através da integração direcionada via recombinação homóloga. [0044] Eventos transgênicos de acordo com a presente descrição podem incluir sequências que incluem, mas não estão limitadas aos seguintes exemplos: 1. Genes ou Sequência Codificadora (por exemplo, iRNA) Que Conferem Resistência a Pragas ou Doença (A) Genes de Resistência a Doença de Planta. As defesas da planta são geralmente ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com um gene de resistência clonado para manipular plantas que são resistentes a cepas específicas de patógenos. Exemplos de tais genes incluem o gene Cf-9 do tomate para a resistência ao Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), gene Pto do tomate, que codifica uma proteína qui-nase, para a resistência contra Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432) e o gene de Arabidopsis, RSSP2, para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089). (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado dessa ou um polipeptídeo sintético modelado a partir dela, tal como uma sequência de nucleotídeos de um gene de Bt δ-endotoxina (Gei-ser et al., 1986 Gene 48:109), e um gene de inseticida vegetativo (VIP) (veja, por exemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5389-94). Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de δ-endotoxina podem ser adquiridas da American Type Culture Collec-tion (Rockville, Md.), sob os números de acesso da ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. (C) Uma lectina, tal como as sequências de nucleotídeo de vários genes de lectina de que se ligam a manose de Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825). (D) Uma proteína que se liga a vitamina, tal como a avidina e homólogos da avidina que são úteis como larvicidas contra pragas de insetos. Veja, Pat. US No. 5.659.026. (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de proteína ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de cisteína protease de arroz (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor I de proteinase do tabaco (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), e um inibidor de α-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243). (F) Um hormônio específico de inseto ou ferormônio tal como ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante desse, um mimético baseado nele ou um antagonista ou agonista desse, tal como a expressão em baculovírus da esterase do hormônio juvenil clonado, uma inativadora do hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344:458). (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico para inseto que, depois da expressão, rompa a fisiologia da praga afetada (J Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor do hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989) e neurotoxinas paralisantes, específicas para inseto (Pat. U.S. No. 5.266.361). (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por cobra, uma vespa, etc., tal como um peptídeo tóxico para inseto de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165). (I) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de mono-terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanóide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida. (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma estera-se, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glicanase, naturais ou sintéticas. Exemplos de tais genes incluem um gene callas (pedido PCT publicado WO93/02197), sequências que codificam a quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, a partir da ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), quitinase da tênia do tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691) e o gene de poliubiquitina ubi4-2 da salsa (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673). (K) Uma molécula que estimule a transdução do sinal. Exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeos para clones de cDNA de calmodulina de feijão mung (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de milho (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467). (L) Um peptídeo com momento hidrofóbico. Veja as Pat. U.S. Nos. 5.659.026 e 5.607.914; a última ensina sobre peptídeos an-timicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença. (M) Uma permeasse de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo do peptídeo lítico cecropina-β (Jaynes et al., 1993 Plant Sei. 89:43) que torna plantas de tabaco transgênicas resistentes à Pseudomonas solanacearum. (N) Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa derivada dela. Por exemplo, o acumulo de proteínas de revestimento viral nas células de planta transformada transmite resistência contra a infecção viral e/ou o desenvolvimento de doença causada pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como pelos vírus relacionados. A resistência mediada pela proteína de revestimento foi conferida às plantas transformadas contra o vírus do mosaico da aifafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da estria do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus da ferrugem do tabaco, vírus do anel do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Veja, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathoí. 28:451. (O) Um anticorpo específico para inseto ou uma imunotoxi-na derivada dele. Portanto, um anticorpo direcionado para uma função metabólica crítica no intestino do inseto poderá inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh lnt'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interac-tions mostram a inativação enzimática no Tabaco transgênico através da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia simples. (P) Um anticorpo específico para o vírus. Veja, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469 que mostram que as plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinante são protegidas contra o ataque de vírus. (Q) Uma proteína que impeça o desenvolvimento produzida in natura por um patógeno ou parasita. Assim, as endo a-1,4-D-poli-galacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes para a planta pela solubilização da homo a-1,4-D-galactu-ronase da parede da célula de planta (Lamb et al., 1992) Bio/Techno-logy 10:1436). A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína que inibe uma endopoligalacturonase de feijão está descrita por Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367). (R) Uma proteína que impeça o desenvolvimento produzida in natura por uma planta, tal como o gene que inativa o ribossomo da cevada que fornece uma resistência aumentada à doença fúngica (Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305. (S) RNA de interferência, no qual uma molécula de RNA é usada para inibir a expressão de um gene alvo. Em um exemplo, uma molécula de RNA tem a fita parcialmente ou completamente dupla, o que desencadeia uma resposta de silenciamento, resultando na divagem de dsRNA em pequenos RNAs de interferência, que são então incorporados em um complexo de direcionamento que destrói mRNAs homólogos. Veja, por exemplo, Fire et al., Patente US 6.506.559; Graham et al. 6.573.099. 2. Genes que Conferem Resistência a um Herbicida (A) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida de imidazolinona, sulfoanilida ou sulfonilureia. Genes exem-plificadores nessa categoria codificam uma acetolactato sintase mutante (ALS) (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241) também conhecida como enzima aceto-hidroxiacido sintase (AHAS) (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449). (B) Um ou mais genes adicionais que codificam a resistência ou a tolerância ao glifosato, transmitida pelos genes de EPSP sintase mutante e aroA ou através de inativação metabólica pelos genes tais como DGT-28, 2mEPSPS, GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos fosfono tais como glifosi-nato (genes pat, bar e desm-2) e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ci-clohexanodionas (genes que codificam um inibidor de ACCase). Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.940.835, que descreve a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSP que confere resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifique um gene mutante de aroA pode ser obtido pelo número de acesso ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante está descrita na Pat. U.S. No. 4.769.061. O pedido de patente europeia No. 0 333 033 e a Pat U.S. No. 4.975.374 descrevem sequências de nucleotídeos de genes de glutamina sintase que conferem resistência a herbicidas tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene de fosfinotrici-na acetil transferase é fornecido no pedido europeu No. 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam a atividade de fosfinotricina acetil transferase. Exemplos de genes que conferem resistência aos ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo-hexanodionas, tais como sethoxydim e haloxyfop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. (C) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs +) e uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169 descrevem o uso de plasmídeos que codificam genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. As sequências de nucleotídeos para os genes de nitrilase estão descritas na Pat. U.S. No. 4.810.648 e as moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis sob os Números de Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase está descrita em Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173. (D) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga às hidroxifenilpiruvato dioxogenases (HPPD), enzimas que catalisam a reação na qual para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isso inclui herbicidas tais como iso-xazois (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Pat U.S. No. 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para o milho, dicetonitrilas (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-2,3CI2 fenil)propano-1,3-diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Pat. U.S. No. 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produza uma superabundância de HPPD em plantas pode fornecer tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 20030066102. (E) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de fenoxi auxina, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância aos herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetog luta rato (aad-1), descrito na Patente U.S. No. 7.838.733. (F) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de fenoxi auxina, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância aos herbicidas de piridiloxi auxina, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (aad-12), descrito no WO 2007/053482 A2. (G) Genes que codificam resistência ou tolerância a dicam-ba (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030135879). (H) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas que inibem a protoporfirinogênio oxidase (PPO) (veja a Pat. U.S. No. 5.767.373). (I) Genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (tais como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tais como diuron) que se ligam a proteínas do núcleo dos centros de reação de fotosistema II (OS II) (Veja, Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245. 3. Genes que Conferem ou Contribuem para um Traço com Valor Agregado (A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, pela transformação do milho ou Brassica com um gene antissenso ou estearoil-ACP dessaturase para aumentar o conteúdo de ácido esteá-rico da planta (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89:2624. (B) Conteúdo de fitato diminuído (1) Introdução de um gene que codifica a fitase, tal como o gene da fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87), intensifica a quebra do fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. (2) Um gene pode ser introduzido para reduzir o conteúdo de fitato. No milho, por exemplo, isso pode ser obtido pela clonagem e depois reintroduzindo o DNA associado com o alelo único que é responsável pelos mutantes do milho caracterizados pelos baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383). (C) Composição de carboidrato modificada causada, por exemplo, pela transformação das plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Exemplos de tais enzimas incluem, o gene de frutosiltransferase de Streptococ-cus mucus (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810, o gene de le-vansucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Ge-nel. 200:220), α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), genes de invertase do tomate (Elliot et al., 1993), gene de amilase da cevada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), e a enzima II de ramificação do amido do endosperma do milho (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450). [0045] Em uma modalidade, o evento transgênico compreende um ou mais transgenes selecionados do grupo que consiste em um trans-gene de resistência à inseticida, transgene de tolerância a herbicida, transgene de eficiência no uso de nitrogênio, transgene de eficiência no uso da água, transgene de qualidade nutricional, transgene de ligação ao DNA e um transgene para um marcador selecionável.
Plantas Doadoras [0046] De acordo com uma modalidade, as plantas doadoras que são selecionadas compreendem um conjunto empilhado de pelo menos dois eventos transgênicos. Essas plantas doadoras podem ser geradas usando técnicas recombinantes ou de reprodução padronizadas ou qualquer combinação dessas. Em uma modalidade, a planta doa-dora compreende 2, 3, 4, 5, 6 ou mais eventos transgênicos empilhados. Além disso, cada evento transgênico pode compreender múltiplos componentes que estão intimamente ligados e segregam juntos. Em uma modalidade, cada evento transgênico compreende uma série de genes que estão relacionados em função ou estão associados com um traço desejado particular. As linhagens doadoras possuem antecedentes genéticos que auxiliam na criação de plantas que possuem trans-genes. Entretanto, para capturar completamente o benefício dos traços associados com os eventos transgênicos, os eventos transgênicos devem ser introgredidos nas linhagens de melhoramento de elite. [0047] De acordo com uma modalidade, é fornecido um método para reduzir o número de cruzamentos necessários em uma metodologia de seleção por retrocruzamento tradicional. O método compreende preparar duas linhagens de planta doadora em que os eventos transgênicos desejados para a introgressão são distribuídos entre as duas plantas doadoras. Em uma modalidade, uma primeira planta doadora compreende um primeiro e segundo evento transgênico e a segunda planta doadora compreende o mesmo segundo evento transgênico e um terceiro evento transgênico. Em uma modalidade, uma primeira planta doadora compreende um primeiro, segundo e terceiro evento transgênico e a segunda planta doadora compreende o mesmo terceiro evento transgênico e um quarto evento transgênico. Em uma modalidade, uma primeira planta doadora compreende um primeiro, segundo e terceiro evento transgênico e a segunda planta doadora compreende o mesmo terceiro evento transgênico e um quarto e quinto eventos transgênicos. Em uma modalidade, uma primeira planta doadora compreende um primeiro, segundo, terceiro e quarto eventos transgênicos e a segunda planta doadora compreende o mesmo terceiro e quarto eventos transgênicos e um quinto e sexto eventos transgênicos. [0048] De acordo com uma modalidade, a primeira e segunda plantas doadoras são mantidas como duas linhagens separadas, com cada linhagem sendo retrocruzada com a mesma linhagem parental recorrente para gerar uma primeira e segunda linhagens doadoras cada uma tendo um alto percentual do parental recorrente para a mesma linhagem recorrente. Mais particularmente, em uma modalidade, a primeira e segunda plantas doaras são cruzadas, cada uma, com a mesma linhagem de planta de elite e a primeira e segunda progênie F1 dos dois cruzamentos que retêm os eventos transgênicos desejados são retrocruzadas com a linhagem parental recorrente para gerar uma primeira e segunda progênie de plantas de retrocruzamento que compreendem os traços desejados e essencialmente todas as características fisiológicas e morfológicas da linhagem de elite, exceto quanto as características derivadas dos eventos transgênicos desejados. A primeira planta doadora/recorrente resultante pode então ser cruzada com a dita segunda planta doadora/recorrente para produzir uma progênie que possui os eventos transgênicos desejados fixados no ger-meplasma da planta de elite desejada. [0049] De acordo com uma modalidade, um método para introgre-dir três ou mais eventos transgênicos a partir de linhagens doadoras em um germeplasma de uma única planta de elite é fornecido. O método compreende a) fornecer uma primeira planta doadora/recorrente que compreenda um primeiro evento transgênico, um segundo evento transgênico e que possua um percentual do parental recorrente maior do que 80%, 88%, 90%, 94%, 97% ou 97,5%; b) fornecer uma segunda planta doadora/recorrente que compreenda o dito segundo evento transgênico, um terceiro evento transgênico e que possua um percentual do parental recorrente maior do que 80%, 88%, 90%, 94%, 97% ou 97,5%; c) cruzar a dita primeira planta doadora/recorrente com a dita segunda planta doadora/recorrente para produzir uma progênie; d) identificar e selecionar o produto de plantas das plantas cultivadas na etapa (c) ou opcionalmente autofecundar a progênie das plantas da etapa (c), que compreendem o primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos. [0050] De acordo com uma modalidade, a primeira e segunda plantas doadoras/recorrentes são geradas pelo cruzamento de uma primeira e segunda plantas doadoras iniciais com uma linhagem de elite para gerar uma primeira e segunda linhagens da progênie F1. Uma ou mais progênies de planta da primeira e segunda progênies F1 são então selecionadas com base na existência do traço desejado e cruzadas posteriormente em paralelo (isto é, as duas primeira e segunda progênies F1 são propagadas como duas linhagens separadas) com as plantas parentais recorrentes para produzir uma progênie de plantas de retrocruzamento; as plantas da progênie de retrocruzamen-to são então selecionadas como aquelas que têm o traço desejado e as etapas de retrocruzamento são repetidas, uma, duas ou mais vezes para produzir uma segunda, terceira ou mais progênies de plantas de retrocruzamento que compreendam os traços desejados e, essencialmente, todas as características fisiológicas e morfológicas da linhagem de elite, exceto as características derivadas da planta doadora. De acordo com uma modalidade, a planta parental recorrente usada nos retrocruzamentos é uma planta feminina em pelo menos um dos retro-cruzamentos. [0051] De acordo com uma modalidade, as plantas da progênie são rastreadas e selecionadas com relação aquelas que compreendem os traços desejados através da seleção assistida por marcador. Em uma modalidade, as técnicas de seleção assistida por marcador usadas são selecionadas do grupo que consiste de seleção assistida por marcador de SNP, seleção assistida por marcador de SSR, seleção assistida por marcador de RFLP, seleção assistida por marcador de RAPD e seleção assistida por marcador de AFLP. A tecnologia de Sequenciamento de DNA de Nova Geração (NGS) também pode ser usada para cobrir o genoma completo durante o retrocruzamento. [0052] De acordo com uma modalidade, as plantas doadoras do retrocruzamento compreendem sequências genômicas que compartilham mais do que 80%, 88%. 90%, 94%, 97% ou 97,5% de identidade de sequência com a linhagem parental recorrente. De acordo com uma modalidade, a primeira e segunda plantas doadores de retrocruzamento compreendem menos do que 5 cM, 10 cM, 20 cM, 25 cM, 30 cM, 35 cM, 40 cM, 45 cM, ou 50 cM de arraste de genes da primeira ou segunda planta parental doadora de retrocruzamento. De acordo com uma modalidade, as plantas doadoras de retrocruzamento compreendem os eventos transgênicos desejados com mais do que 88%, 90%, 95%, 97%, ou 97,5% de marcadores moleculares em comum com a planta parental recorrente. Em uma modalidade, as plantas doadoras do retrocruzamento compreendem os eventos transgênicos com essencialmente todas as características fisiológicas e morfológicas da linhagem de elite. [0053] De acordo com uma modalidade, uma primeira planta doadora que compreende uma primeira pilha de pelo menos dois eventos transgênicos é fornecida e a primeira planta doadora é cruzada com uma planta parental recorrente para produzira primeira progênie F1 da planta que compreende a dita primeira pilha de eventos transgênicos. Um primeiro retrocruzamento de melhoramento é feito com as plantas da primeira progênie F1 com a planta parental recorrente e uma primeira planta da progênie de retrocruzamento de melhoramento é selecionada compreendendo a dita primeira pilha de eventos transgênicos. A primeira progênie de retrocruzamento de melhoramento é então re-trocruzada com a planta parental recorrente uma ou mais vezes em sucessão para produzir uma primeira progênie de planta de retrocruzamento BC2, BC3 ou BC4 ou maior que compreende a primeira pilha de eventos transgênicos. De acordo com uma modalidade, um ou mais retrocruzamentos são conduzidos usando uma planta feminina recorrente. [0054] Da mesma maneira, uma segunda planta doadora é selecionada compreendendo uma segunda pilha de pelo menos dois eventos transgênicos, em que pelo menos um dos eventos transgênicos da dita segunda pilha também está presente na primeira pilha de eventos transgênicos na primeira planta doadora. A segunda planta doadora é cruzada com a mesma planta parental recorrente selecionada usada para produzir a primeira progênie de plantas F1. Esse cruzamento produz uma segunda progênie de plantas F1 que compreende a dita segunda pilha de eventos transgênicos. Um segundo retrocruzamento de melhoramento é feito entre as plantas da segunda progênie F1 com a planta parental recorrente e uma segunda progênie de planta e retrocruzamento de melhoramento é selecionada compreendendo a dita segunda pilha de eventos transgênicos. A segunda progênie de retrocruzamento de melhoramento é então retrocruzada com a planta parental recorrente uma ou mais vezes em sucessão para produzir uma segunda progênie de planta de retrocruzamento BC2, BC3 ou BC4 ou maior que compreende a segunda pilha de eventos transgênicos. De acordo com uma modalidade, um ou mais retrocruzamentos são conduzidos usando uma planta feminina recorrente. [0055] As plantas da progênie BC2, BC3, BC4 ou maior do primei- ro e segundo retrocruzamentos terão um percentual de parental recorrente com mais do que 88%, 90%, 95%, 97% ou 97,5% de marcadores comuns em comum com a planta parental recorrente e/ou menos do que 20 cm de arraste de gene do primeiro ou segunda planta parental doadora, respectivamente. A primeira progênie de retrocruzamento BC2, BC3, BC4 ou maior é então cruzada com a segunda progênie de retrocruzamento BC2, BC3, BC4 ou maior para produzir uma terceira progênie de planta que compreende os três (ou mais) eventos trans-gênicos únicos da primeira e segunda pilhas de eventos transgênicos. Opcionalmente, a terceira planta da progênie é autofecundada ou re-trocruzada com o parental recorrente enquanto são selecionadas as plantas da progênie que compreendem os eventos transgênicos intro-gredidos desejados. Em uma modalidade, a terceira progênie de planta tem um percentual do parental recorrente de pelo menos 97,5%. Em uma modalidade, um ou mais eventos transgênicos são fixados na linhagem melhorada final em um estado homozigoto. Em uma modalidade, todos os eventos transgênicos são fixados em um estado homozigoto. Em uma modalidade, as plantas que compreendem os eventos transgênicos introgredidos desejados e o germeplasma parental recorrente compreendem menos do que 5 cM, 10 cM, 15 cM, 20 cM, 25 cM, 30 cM, 35 cM, 40 cM, 45 cM, ou 50 cM de arraste de gene da primeira e/ou segunda planta parental doadora. [0056] De acordo com uma modalidade, as plantas que compreendem os eventos transgênicos desejados e o germeplasma parental recorrente podem ser cruzadas com espécies intimamente relacionadas ao invés da mesma espécie. Por exemplo, em uma modalidade, plantas de milho podem ser cruzadas com plantas relacionadas tais como o teosinto. Alternativamente ou adicionalmente, em uma modalidade, a primeira e segunda plantas doadoras que compreendem os eventos transgênicos desejados podem ser de espécies intimamente relacionadas, mas não idênticas. [0057] De acordo com uma modalidade, o presente método de in-trogredir três ou mais eventos transgênicos em uma linhagem de elite pode ser usado em qualquer espécie de planta que possa ser reproduzida pela seleção por retrocruzamento. Em uma modalidade, a planta é uma espécie de cultura e pode ser selecionada entre monocotile-dôneas ou dicotiledôneas. Por exemplo, plantas monocotiledôneas para uso de acordo com a presente descrição compreende qualquer planta selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo ou uma planta de arroz. Exemplos mais específicos adicionais de plantas monocotiledôneas que podem ser usadas incluem, mas não são limitados a milho (Zea mays), arroz (Oryza sati-va), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulga-re), milheto (por exemplo, milheto grão (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto foxtail (Setaria italica), milheto fin-ger (Eleusine coracana)), trigo (Triticum aestivum), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia (Avena), cevada (Hordeum), abacaxi (Ananas comosus), banana (Musa spp.), palmeira, ornamentais, e gramas. Em uma modalidade, a monocotiledônea é o milho. Exemplos de plantas dicotiledôneas para uso de acordo com a presente descrição compreende qualquer planta selecionada do grupo que consiste em uma planta de soja, uma planta de tomate, uma planta de alfaífa, uma planta de canola, uma planta de colza, uma planta de Brassica, uma planta de algodão, e uma planta de girassol. Exemplos adicionais de plantas dicotiledôneas para uso de acordo com a presente descrição incluem, mas não são limitadas a canola, algodão, batata, quinoa, amaranto, trigo sarraceno, açafrão, soja, beterraba açucareira, girassol, canola, colza, tabaco, Arabidopsis, Brassica, e algodão. Em uma modalidade, a dicotiledônea é a soja. EXEMPLO 1 Conversão de traco assistida por marcador de RRH63 natural com Mon88017:Mon89034 no milho SmartStax 8 [0058] SmartStax 8 (SSX 8) é uma planta de milho gerada pela introgressão de 8 genes [TC1507 (PAT, Cry 1F), DAS591227 (PAT, Cry34Ab1, Cry35Ab1), Mon89034 (Cry 1A.105, Cry2Ab2), Mon88017 (EPSPS, Cry3Bb1)] em linhagens de milho de alto rendimento através da reprodução por retrocruzamento assistida por marcador. A meta final de SmartStax 8 é proteger o milho contra as principais pragas tais como a broca do milho, vermes da raiz, lagartas, lagartas da espiga e lagartas de cartucho. SmartStax 8 fornecerá resistência ao herbicida glifosato e incorporar o glifosinato como marcador selecionável. Reprodução por retrocruzamento Assistida por Marcador (MABB) [0059] A melhora de uma cultura através de métodos de reprodução clássicos tem feito progressos notáveis durante o último século. Entretanto, considerando o aumento constante da população humana e a terra disponível para cultura cada vez mais reduzida, é imperativo adotar novas estratégias para atingir as demandas. O desenvolvimento de variedades de alto rendimento com traços desejáveis em um curto período de tempo é um foco importante de programas de reprodução. A seleção assistida por marcador (MAS) facilitará o desenvolvimento de cultivares superiores em um tempo mais curto do que as abordagens clássicas. A disponibilidade de recursos genômicos tais como marcadores moleculares neutros (baseados em DNA) (especialmente marcadores codominantes) é necessária a fim de tirar vantagem de MAS. A reprodução por retrocruzamento tem sido um método comum para incorporar um ou alguns genes de um doador em uma variedade adaptada que tenha sido usada na reprodução da planta por aproximadamente um século. Embora a introgressão de um traço pos- sa ser obtida através dos métodos de reprodução por retrocruzamento tradicionais, ele leva até 6 gerações para obter 99% de percentual de parental recorrente (RPP). Entretanto, MAS promove a recuperação de mais do que 99% de RPP em apenas três gerações de retrocruzamento, o que indica que os marcadores moleculares aumentam tremendamente a eficiência do retrocruzamento (Basset et al. 2000).
Meta [0060] A introgressão dos genes Mon89034 e Mon88017 na elite de milho natural SMA07BM através da reprodução assistida por marcador que eventualmente serão empilhados com os genes Mon88017 e TC1507 na geração BC3 para obter SMA07BM com todos os três genes Mon88017::Mon89034::TC1507 e recuperar mais do que 98% do genoma do parental recorrente (RPP).
Estratégia de Conversão [0061] No lado feminino de SSX8, o foco foi empilhar Mon88017 e Mon89034 junto com TC1507 em um germeplasma de elite e recuperar 98% ou mais do genoma parental recorrente. A fim de fazer isso, conversões paralelas para Mon17 (Mon880117::TC1507) e Mon89 (Mon88017::Mon89034) foram corridas separadamente e uma estratégia de seleção assistida por marcador a partir de BC2 e BC3 e empi-Ihamento em BC3 (Fig. 1). Nos casos quando o empilhamento em BC3 não é obtenível devido a reações inesperadas, as linhagens serão empilhadas em BC4 ou BC5. Alternativamente, essa estratégia também poderá ser corrida com o uso de marcadores em BC1 e BC2 e empilhamento em BC2. Como Mon88017 está presente em ambos os lados, nós fomos capazes de selecionar linhagens empilhadas que tinham um estado alélico de Homo::Hemi::Hemi para Mon88017:: TC1507::Mon89034, respectivamente.
Materiais e Métodos BC2 Extração e preparação de DNA [0062] 422 amostras da população RRH63 Mon88017::Mon89034 de BC2 foram amostradas. O DNA foi extraído do tecido fresco usando o protocolo MagAttract™ no Agilent Biocel Robot™ (Bohl et al 2010). As amostras foram testadas pela High Through-Put Molecular Analysis (HTMA) quanto a presença de Mon89034 (Hinchey 2002). Depois, 188 amostras de DNA que testam Hemi para Mon89034 foram cuidadosamente escolhidas em 2 placas de 96 poços. [0063] O DNA foi diluído em uma proporção de 1:10 com água destilada. Depois 6RC162 Mon88017::Mon89034, a população doado-ra e RRH63, o Parental Recorrente, foram removidos do concentrado de DNA de MABL e adicionados aos poços A1 e A2 na Placa 1 e poços H10 e H11 na Placa 2.
Marcadores de SNP e plataforma de qenotipaqem [0064] A análise do marcador foi realizada usando a plataforma KASPar™ SNP. As seleções de marcadores estão listadas abaixo na Tabela 1. Os dados resultantes foram carregados e analisados usando um programa Kraken Kluster Caller™. Marker Study Manager foi usado para reunir uma tabela de cromossomos e calcular o Percentual de Parental Recorrente (RPP) para cada amostra.
Análise de Arraste de Ligação [0065] Para realizar a análise de Arraste de Ligação (Linkage draft - LD), marcadores polimórficos que amplificaram loci por todo genoma foram selecionados utilizando marcadores. AL foi realizada no cromossomo 1 e 4, pois o evento Mon89034 foi previamente mapeado ao cromossomo 1 próximo a 342 cM, e o evento Mon88017 foi previamente mapeado ao cromossomo 4 próximo a 110 cM. Os marcadores selecionados foram espaçados em aproximadamente 10 cM um do outro no cromossomo 1 e 4.
Análise de Genoma [0066] As 45 amostras com a maior RPP foram cuidadosamente selecionadas do prato de extração para um prato de 96 poços para o laboratório HTMA para checar a presença de Mon88017, e para outro para executar a Análise de Genoma (Genome Analysis - GA). O GA foi executado nos cromossomos 2-3, 5-10 utilizando a análise KAS-Par™ SNP. Os marcadores selecionados foram espaçados em aproximadamente 20 cM um do outro, e são listados abaixo na Tabela 1. Os dados resultantes foram carregados e analizados utilizando o sftware Kraken Kluster Caller™. O Marker Study Manager™ foi utilizado para construir uma tabela de cromossomo que inclui ambas as análises anterior LD e nova GA e para calcular o Percentual do Parental Recorrente (RPP) para cada amostra. [0067] As 10 plantas com as RPP mais elevadas e testadas como hemizigoto para ambos Mon88017 e Mon89034 foram selecionadas. BC3 Extração e preparação de DNA [0068] Em seguida, 188 amostras da população BC3 RRH63 Mon88017::Mon89034 foram amostradas juntamente com RRH63, o parente recorrente. Então o DNA foi extraído de um tecido novo utilizando o protocolo MagAttract™ no Agilent Biocel Robot™. O DNA extraído foi diluído a uma razão de 1:10 com água destilada. A 6RC172 Mon88017::Mon89034, a população doadora, foi retirada de estoque de DNA e adicionada ao poço A2 na Placa 1 e ao H11 na Placa 2. Marcadores SNP e plataforma de qenotipaqem [0069] A análise de marcador BC3 foi realizada utilizando análise SNP KASPar™. As seleções de marcador estão listadas na Tabela 1 abaixo. Os dados resultantes foram carregados e analisados utilizando o software Kraken Kluster Caller™. Marker Study Manager™ foi usado para construir a tabela de cromossomo e para calcular o o Percentual do Parental Recorrente (RPP) para cada análise. [0070] Análise de Arrasto de Ligação e do Genoma [0071] Marcadores polimórficos que amplificaram loci através do genoma completo foram selecionados usando MarkerDB™. O LD foi realizado sobre os cromossomos 1 e 4 por que o evento Mon89034 foi mapeado previamente para o cromossomo 1 em torno de 342 cM e o evento Mon88017 foi mapeado previamente para o cromossomo 4 em torno de 110 cM. Os marcadores selecionados estavam espaçados aproximadamente 10 cM sobre o cromossomo 1 e 4 e aproximadamente a cada 20 cM através do resto do genoma. O genótipo das plantas de BC2 usadas como doadoras para a geração BC3 foi avaliado. Marcadores de homozigose para o alelo A em todas as doadoras da população BC3 foram eliminados da análise e adicionados aos resultados finais como marcadores históricos, não segregantes. [0072] As 10 plantas com o melhor RPP foram selecionadas. As melhores seleções para ambas as populações Mon88017::Mon89034 e Mon88017::TC1507 foram introduzidas em um programa de empi-Ihamento para encontrar as melhoras combinações possíveis de empi-Ihamento.
Tabela 1. Marcadores, junto com o lócus do cromossomo e Posição do Cromossomo usado para a plataforma KASPar™ SNP na análise de arrasto de gene em BC2, análise do genoma de BC2 e análise de arrasto de gene/genoma de BC3.
Empilhamento [0073] Uma conversão de retrocruzamento paralelo de RRH63 com Mon17::TC1507 foi realizada como mostrado na Fig. 1. A meta foi empilhar ambos os lados de RRH63 e obter uma combinação empilhada que resultará em uma linhagem que terá mais do que 98% de RPP. Um programa de combinação de empilhamento foi corrido usando as 10 melhores seleções dos lados de Mon 17 e Mon 89 para determinar estatisticamente a probabilidade de obtenção de uma combinação que resultará na obtenção de > 98% de RPP para todas as combinações. A análise de marcador da população empilhada resultante foi completada.
Fenotipaqem Novos viveiros iniciais [0074] Esse viveiro é a etapa inicial na transferência do traço de interesse para a linhagem natural da planta parental recorrente (RPP) alvo. Todas as plantas doadoras em potencial foram rastreadas quanto a expressão de gene usando um teste ELISA quantitativo. Apenas plantas doadoras com alta expressão foram usadas para polinizar a planta recorrente. O pólen deve ser transportado da doadora para a RPP a fim de capturar o citoplasma da RPP. Um mínimo de 10 polini- zações foram feitas e essas espigas foram descascadas.
Viveiro de F1 a BC1 [0075] Cada população F1 foi testada para confirmar que os genes de interesse estivessem presentes. Isso foi feita pela pulverização do marcador herbicida selecionável (Round-Up® para Mon 88017 ou Liberty Link® para TC1507) ou usando um teste ELISA qualitativo (Mon89034). Se nenhum erro fosse feito, todas as plantas testadas deviam ter o(s) gene(s) de interesse. Na florescência, um mínimo de 10 polinizações foram feitas pelo transporte do pólen da RPP para o material F1.
Viveiro de BC1 e BC2 [0076] Aqui e em todos os viveiros subsequentes, marcadores selecionáveis de herbicida e ELISA qualitativo foram realizados. As plantas segregarão quanto a presença de cada gene em uma proporção de 1:1. Na florescência, 20 plantas positivas foram selecionadas e po-linizadas. Na colheita, 10 dessas plantas foram selecionadas com base no tipo da espiga e foram descascadas.
Viveiro de BC2 a BC3 [0077] Essa foi a primeira geração onde a população foi genotipa-da. Foi necessário plantas fileiras suficientes para ser capaz de obter pelo menos 186 plantas positivas depois que a presença do gene (através da aplicação do herbicida ou ELISA qualitativo) foi ensaiada. Amostras de tecido de folha foram coletadas em plantas com 3 a 4 semanas de idade. O laboratório escolheu as plantas superiores pela floração e apenas essas plantas foram usadas nas polinizações. Nesse estágio, as plantas superiores foram usadas de duas maneiras: elas foram polinizadas pela RPP para fazer um retrocruzamento reverso e elas foram usadas para polinizar a RPP para fazer até 5 retrocruza-mentos por polinização. As polinizações feitas usando as 10 plantas superiores de cada população foram coletadas, mas apenas as 3 me- ihores plantas foram replantadas. A seleção fenotípica foi usada para complementar as seleções com marcador em BC2, descartando apenas aquelas plantas com problemas fenotípicos importantes.
Viveiros de empilhamento de BC3 [0078] Com o número crescente de genes a serem empilhados, projetos de empilhamento estão se tornando progressivamente complexos. Quando 3 ou mais traços são para serem introgredidos em uma linhagem, a introgressão deve ser otimamente separada em dois projetos de introgressão de marcador diferentes e a combinação final de gene é obtida através do empilhamento. Tipicamente, o empilhamento é realizado na geração BC3 (ou mais tarde, por exemplo, BC4), usando plantas que são hemizigotas para seus respectivos genes. [0079] Quando o empilhamento é realizado usando plantas BC3(hemizigotas), é importante receber uma análise completa do ge-noma das plantas a ser usado no empilhamento antes da polinização. As combinações de cruzamento específicas devem ser determinadas através de uma reunião com o grupo do laboratório depois que os resultados da análise do genoma estão disponíveis. As linhagens a serem empilhadas devem ser selecionadas tal que elas tenham uma introgressão do doador parental antecedente "complementar". Isso permitirá uma eliminação quase completa do antecedente genético do doador com o auxílio de marcadores nas plantas S1 mais tarde. Resultados Dados da Genotipaqem para Auxiliar a Genética Quantitativa na Realização de Seleções LD BC2 [0080] Em alguns loci, a RPP (enviada do campo) e os alelos doadores eram monomórficos, embora a população fosse segregante. A designação de alelo para RPP foi forçada em heterozigotos em KLIMs para esses exemplos - para combinar a designação esperada e com- binar a segregação da população. Na maioria dos casos nos quais os parentais são polimórficos, houve BBs presentes na população. Os genótipos no campo muito provavelmente resultam de uma RPP impura usada em uma geração anterior. A baixa cobertura de marcador e nenhum marcador no flanco direito para Mon89 sobre Chr 1. A taxa de retorno de dados foi de 99,1%. As 45 plantas principais foram selecionadas para polinização e teste de zigosidade. GA BC2 [0081] A taxa de retorno de dados foi de 98,2%. Vários marcadores foram descartados devido a segregação de população estranha -particularmente em torno de cm 110 sobre o Chr4 e sobre o Chr9. LDGA BC3 [0082] A taxa de dados foi de 99,1%. As seguintes plantas 94305117, 94308841 e 94308798 eram amostras inferiores. Nenhum marcador para a direita de Mon89. Foi observada segregação inesperada nas plantas inferiores; todos os outros grupos de famílias adapta-ram-se aos padrões de segregação históricos. Marcadores de Segregação 7594, 2479 não apareceram como marcadores polimórficos para esse cruzamento (uma fonte diferente de RPP foi fornecida entre BC2 e BC3). As 10 plantas superiores foram selecionadas pela floração para o empilhamento. Se mais do que 10 plantas tivessem 100% de RPP, elas também seriam selecionadas tal que as plantas pudessem ser escolhidas fenotipicamente.
Seleções [0083] As seleções das plantas superiores junto com suas RPP estão listadas abaixo na Tabela 2 para BC2 e BC3 LDGA. As melhores combinações de empilhamento estão listadas na Tabela 3.
Tabela 2. Escolha das 10 plantas finais das populações RRH63 Mon88017::Mon89034 comunicada aos criadores para as gerações BC2 e BC3, junto com o Percentual de Parental Recorrente e Gradua- ção da Seleção para cada planta.
Combinação de empilhamento [0084] Um programa de combinação para empilhamento usando as 10 seleções superiores dos lados de Mon 17 e Mon 89 determinou, estatisticamente, a probabilidade de obtenção de uma combinação que forneça > 98% de RPP para todas as combinações. As combinações mais altamente prováveis foram usadas no campo para fazer uma cultura real. A tabela 3 indica as combinações para empilhamento que foram usadas no campo.
Tabela 3. Melhores combinações para empilhamento, mostradas como Número_Planta, pareadas a partir de cada uma das conversões (Mon88017:TC1507 e Mon89034:Mon88017) Discussão [0085] A conversão de RRH63 x SLB01 foi um cruzamento restrito e como resultado, relativamente poucos marcadores estavam disponíveis para uso na análise. Foi presumido que a maioria das áreas do genoma sem a cobertura do marcador polimórfico não difere entre as duas linhagens e não necessita de conversão. O progresso da RPP de BC2 para BC3 foi significativo e dentro de 98% do conjunto mínimo de RPP para o empilhamento.
Viveiro de Autofecundacão e Cruzamento de Teste [0086] Essa foi a última geração a ser plantada. Esse viveiro foi usado para fazer avançar o material do projeto do nível S1 para S2 de autofecundação, enquanto que concomitantemente se produzia uma semente híbrida para um teste de ensaio de produção no ambiente alvo. Tipicamente, todas as sementes obtidas das 5 plantas superiores de S1 foram plantadas e essas plantas formaram 5 seleções para serem usadas em testes de produção. [0087] Todas as plantas nesse viveiro foram testadas quanto a zi-gosidade. Na polinização, as plantas que eram homozigotas para ambos Mon88017 e Mon89034 e homozigotas ou nulas para TC1507 foram autopolinizadas para produzir um viveiro final. Outras plantas na população foram usadas como femininas para produzir uma semente híbrida pelo transporte do pólen a partir de um testador masculino.

Claims (32)

1. Método para introgredir três ou mais eventos transgêni-cos a partir de linhagens doadoras em um genoma de planta recorrente, caracterizado pelo fato de compreender: a) fornecer uma primeira planta doadora/recorrente que compreenda um primeiro evento transgênico, um segundo evento transgênico e que possua um percentual de parental recorrente maior do que 80%; b) fornecer uma segunda planta doadora/recorrente que compreenda um segundo evento transgênico, um terceiro evento transgênico e que possua um percentual de parental recorrente maior do que 80%; c) cruzara dita primeira planta doadora/recorrente com a dita segunda planta doadora/recorrente para produzir uma progênie de plantas; d) identificar e selecionar a progênie de plantas daquelas da etapa (c) ou opcionalmente autofecundar a descendência das plantas da etapa (c), que compreendem os ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: i) a primeira planta doadora/recorrente é gerada pelo e) cruzamento da primeira planta doadora com uma planta recorrente para gerar uma primeira progênie, em que a dita primeira planta doadora compreende o dito primeiro evento transgênico e o dito segundo evento transgênico; f) fornecer uma ou mais gerações de retrocruzamento pelo cruzamento da primeira progênie da etapa (e) ou opcionalmente a au-tofecundação da descendência da primeira progênie da etapa (e) com as ditas plantas recorrentes para fornecer as primeiras plantas de re- trocruzamento e cruzar as ditas primeiras plantas de retrocruzamento com as ditas plantas recorrentes para produzir a dita primeira planta doadora/recorrente que compreende o dito primeiro evento transgêni-co, o dito segundo evento transgênico e que possui um percentual de parental recorrente maior do que 80%; e ii) a segunda planta doadora/recorrente é gerada pelo g) cruzamento de uma segunda planta doadora com a dita planta recorrente para gerar a segunda progênie, em que a dita segunda planta doadora compreende o dito segundo evento transgênico e o dito terceiro evento transgênico; h) fornecer uma ou mais gerações de retrocruzamento pelo cruzamento da segunda progênie da etapa (g) ou opcionalmente pela autofecundação da descendência da segunda progênie da etapa (g) com as ditas plantas recorrentes para fornecer plantas do segundo retrocruzamento e cruzar as ditas plantas do segundo retrocruzamento com as ditas plantas recorrentes para produzir a dita segunda planta doadora/recorrente que compreenda o dito segundo evento transgênico, o dito terceiro evento transgênico e que possua um percentual de parental recorrente maior do que 80%.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta parental recorrente é uma planta para reprodução feminina em pelo menos uma das etapas de (e) até (h).
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a primeira e segunda progênie de plantas são retro-cruzadas cada uma com a dita planta recorrente pelo menos duas vezes para gerar linhagens paralelas de BC2 ou plantas superiores da primeira progênie de retrocruzamento, que representam a primeira planta doadora/recorrente e a segunda planta doadora/recorrente, respectivamente.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primeiro ou segundo eventos transgênicos da primeira planta doadora/recorrente é fixado como um traço homozigoto.
6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos segundo ou terceiro eventos transgênicos da segunda planta doadora/recorrente é fixado como um traço homozigoto.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos são fixados como traços homozigotos nas plantas da progênie que compreendem os ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as plantas da progênie que compreendem os ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos possuem um percentual de parental recorrente maior do que 94%.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as plantas da progênie que compreendem os ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos possuem um percentual de parental recorrente de pelo menos 97,5%.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta monocotiledônea.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo, uma planta de grama e uma planta de arroz.
12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta dicotiledônea.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a planta dicotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de soja, uma planta de canola, uma planta de tabaco, uma planta de tomate, uma planta de colza, uma planta de Brassica, uma planta de alfafa, uma planta de beterraba açucareira e uma planta de algodão.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos compreende um ou mais transgenes selecionados do grupo que consiste em um transgene de resistência à inseticida, transgene de tolerância a herbicida, transgene de eficiência no uso de nitrogênio, transgene de eficiência no uso da água, transgene de qualidade nutricional, transgene de ligação ao DNA e um transgene para um marcador selecionável.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma das ditas primeira e segunda planta doado-ra/recorrente compreende um quarto evento transgênico.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que uma das ditas primeira e segunda planta doado-ra/recorrente compreende um quinto evento transgênico.
17. Método para introgredir três ou mais eventos transgênicos em uma planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a) fornecer uma primeira planta doadora, que compreenda um primeiro empilhamento de pelo menos dois eventos transgênicos; b) cruzar a primeira planta doadora com a planta recorrente parental selecionada para produzir uma primeira progênie de planta F1 que compreende o dito primeiro empilhamento de eventos transgênicos; c) realizar um primeiro retrocruzamento de melhoramento da primeira progênie de planta F1 com a planta recorrente parental e selecionar uma primeira progênie de planta de retrocruzamento de melhoramento que compreenda o dito empilhamento de eventos transgê- nicos d) retrocruzar a primeira progênie de retrocruzamento de melhoramento selecionada com a planta parental recorrente uma ou mais vezes em sucessão para produzir uma primeira progênie superior da planta de retrocruzamento ou BC2 que compreende o primeiro em-pilhamento de eventos transgênicos; e) selecionar uma segunda planta doadora que compreenda um segundo empilhamento de pelo menos dois eventos transgênicos, em que pelo menos um dos eventos transgênicos do segundo empilhamento também está presente no primeiro empilhamento de eventos transgênicos; f) cruzar a segunda planta doadora e a dita planta parental recorrente selecionada para produzir uma segunda progênie de planta F1 que compreende o segundo empilhamento de eventos transgênicos; g) realizar um segundo retrocruzamento de melhoramento da segunda progênie de planta F1 com a planta parental recorrente e selecionar uma segunda planta da progênie de retrocruzamento de melhoramento que compreenda o segundo empilhamento de eventos transgênicos; h) retrocruzar a segunda progênie de retrocruzamento de melhoramento selecionada com a planta parental recorrente uma ou mais vezes em sucessão para produzir uma primeira progênie superior da planta de retrocruzamento ou BC2 que compreende o segundo empilhamento de eventos transgênicos; i) cruzar a primeira progênie superior de retrocruzamento ou BC2 com a segunda progênie superior de retrocruzamento ou BC2 para produzir uma terceira progênie que compreenda os três eventos transgênicos únicos a partir do primeiro e segundo empilhamentos de eventos transgênicos.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a terceira progênie de planta compreende pelo menos 97,5% do genoma parental recombinante.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta parental recombinante é uma planta natural feminina em pelo menos uma das etapas de (c) até (h).
20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta monocotiledônea.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo, uma planta de grama e uma planta de arroz.
22. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta dicotiledônea.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a planta dicotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de soja, uma planta de canola, uma planta de tabaco, uma planta de tomate, uma planta de colza, uma planta de Brassica, uma planta de alfafa, uma planta de beterraba açucareira e uma planta de algodão.
24. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos primeiro, segundo e terceiro eventos transgênicos compreende um ou mais transgenes selecionados do grupo que consiste em um transgene de resistência à inseticida, transgene de tolerância a herbicida, transgene de eficiência no uso de nitrogênio, transgene de eficiência no uso da água, transgene de qualidade nutricional, transgene de ligação ao DNA e um transgene para um marcador selecionável.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos eventos transgênicos do primeiro empilhamento é fixado como um traço homozigoto na primeira progênie de planta de retrocruzamento.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos eventos transgênicos do segundo empilhamento é fixado como um traço homozigoto na segunda progênie de planta de retrocruzamento.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de que a terceira progênie de planta compreende todos os eventos transgênicos fixados como traços homozigotos.
28. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a terceira progênie de planta compreende menos do que 20 cm de arrasto de gene da primeira planta doadora.
29. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a terceira progênie de planta compreende menos do que 20 cm de arrasto de gene da segunda planta doadora.
30. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a primeira progênie de planta de retrocruzamento da etapa (e) e a segunda progênie de planta de retrocruzamento da etapa (i) são selecionadas através de seleção assistida por marcador.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a seleção assistida por marcador é selecionada do grupo que consiste de seleção assistida por marcador de SNP, seleção assistida por marcador de SSR, seleção assistida por marcador de RFLP, seleção assistida por Sequenciamento de DNA de Nova Geração, seleção assistida por marcador de RAPD e seleção assistida por marcador de AFLP.
32. Planta produzida pelo método como definido na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um primeiro e um segundo empilhamento de eventos transgênicos.
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