CN106028797A

CN106028797A - 用于玉米基因渗入的性状堆叠策略

Info

Publication number: CN106028797A
Application number: CN201480076355.7A
Authority: CN
Inventors: J·迈耶; J·W·宾
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2016-10-12
Also published as: EP3089578A1; CA2935326A1; AR099005A1; AU2014374053B2; UY35924A; AU2014374053A1; BR102014032614A2; US20150184193A1; MX2016008757A; EP3089578A4; WO2015103070A1

Abstract

提供了一种方法来减少将3个或更多个期望性状从供体植物系渗入优良植物背景中所需的时间。该方法包括杂交两个供体植物，其中每一个供体植物已经被回交从而具有高的轮回亲本百分比，并共有一个待渗入到优良植物背景内的期望基因座。

Description

用于玉米基因渗入的性状堆叠策略

相关专利申请相互参考

本申请要求根据35USC§119(e)获得2013年12月30日提交的美国临时专利申请系列号61/921,681的利益，其全部公开内容通过引用并入本文。

背景

植物育种是生产具有新组合期望特征的植物的技术和科学。植物育种可以通过许多不同的技术实现，从简单地选择具有期望特征的植物用于繁殖，到更复杂的分子技术。虽然分子生物学已经取得了长足进步，并具备了产生转基因植物的能力，但传统的植物育种方法在植物品种开发中仍然具有一席之地。传统植物育种方法的一个重要用途涉及利用回交程序将转基因从在转化中使用的良好组织培养栽培种转移到优良的实验品系或栽培种。对于许多作物，一旦转基因处于作物物种中，杂交转化优良品系便会比重组技术更加高效，因为大部分转化方案是专为特定的实验室品系优化的(往往适应性较差并且产量较低)。很多优良品系(高产的)并不适于转化。因此，遗传工程师通常转化实验室品系，而育种师将转基因从实验室品系回交到优良品系中。

然而，标准回交育种方法是费时的。为了将三个基因渗入到优良近交种质中，从开始到产生种子通常需要4年。因此，需要能够减少这个时间框的回交育种新方法。当有三个或更多个转基因事件要渗入轮回亲本时，本公开提供的方法可以省略一代或多代回交，并为更多、更快地增加亲本种子创造条件。

概要

根据一个实施方案，提供了改良的回交育种方法，其可以减少将三个或更多个堆叠性状或核酸区段渗入到优良近交植物系内所需的时间。在一个实施方案中，该方法包括回交两个供体植物，其中这两个供体植物各自包含三种共同的期望堆叠转基因事件中的一种，并且每个供体已经与相同的轮回亲本进行了回交，从而产生具有高的轮回亲本百分比并携带来自供体的感兴趣基因的回交供体系。然后，将两个回交供体系(每一个具有一组不同的来自供体的基因)进行杂交，以产生包含最初存在于两个供体亲本系中的三个转基因事件并且轮回亲本百分比为至少94％的后代。

在一个实施方案中，用于将三个或更多个转基因事件从两个供体系基因渗入到单个轮回植物种质内的方法包括：将第一供体/轮回植物与第二供体/轮回植物杂交，其中该第一供体/轮回植物包含第一转基因事件和第二转基因事件，该第二供体/轮回植物包括所述第二转基因事件和第三转基因事件，两个供体/轮回植物均具有轮回植物基因组的大于80％。在杂交两个供体/轮回植物之后，对产生的植物后代进行检查，以鉴定和选择包含所述第一、第二和第三转基因事件者。在一个实施方案中，所述第一供体/轮回植物和所述第二供体/轮回植物是作为平行的植物系生成的，其中该第一供体植物和第二供体植物分别与相同的轮回植物杂交，以分别产生第一后代和第二后代，其中所述第一供体植物包括所述第一转基因事件和所述第二转基因事件，而所述第二供体植物包括所述第二转基因事件和所述第三转基因事件。然后，通过将所述第一植物后代和所述第二植物后代与所述轮回亲本植物杂交，分别产生第一和第二回交植物，从而产生一个或多个回交世代。然后将第一和第二回交植物与所述轮回植物回交，分别产生第一供体/轮回植物(包括所述第一转基因事件、第二转基因事件，并具有轮回植物基因组的大于80％)和第二供体/轮回植物(包括所述第二转基因事件、第三转基因事件，并具有轮回植物基因组的大于80％)。在一个实施方案中，在每次供体转换内用轮回植物进行的至少一个杂交中，轮回亲本植物是雌性植物。

在一个实施方案中，提供了用于将三个或更多个转基因事件基因渗入到轮回植物种质内的方法，所述方法包括：

a)提供第一供体植物，其包括至少两个转基因事件的第一堆叠；

b)将该第一供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，以产生包含该第一堆叠的转基因事件的第一F1后代植物；

c)将第一F1后代植物与轮回亲本植物进行第一育种回交，并选择包含所述第一堆叠的转基因事件的第一育种回交后代植物；

d)将所选第一育种回交后代与轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含所述第一堆叠的转基因事件的BC2或更高代的第一回交后代植物；

e)选择包含至少2个转基因事件的第二堆叠的第二供体植物，其中所述第二堆叠的转基因事件中的至少一个也存在于所述第一堆叠的转基因事件中；

f)将所述第二供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，以产生包含所述第二堆叠的转基因事件的第二F1后代植物；

g)将第二F1后代植物与轮回亲本植物进行第二育种回交，并选择包含所述第二堆叠的转基因事件的第二育种回交后代植物；

h)将选定的第二育种回交后代与轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含第二堆叠的转基因事件的BC2或更高代的第二回交后代植物；

i)将所述BC2或更高代的第一回交后代与所述BC2或更高代的第二回交后代杂交以产生第三后代植物，该第三后代植物包含来自所述第一和第二堆叠的转基因事件的三个独特的转基因事件。

附图简述

图1.用于将Mon 88017和Mon89034与TC1507一起堆叠到优良种质中并回收98％轮回亲本基因组的性状转换策略的示意图。

图2.提供了用于Mon17(Mon88017::TC1507)和Mon89(Mon88017::Mon89034)的平行转换的BC2和BC3后代的标志物辅助选择方案的流程图。

图3.提供了用于BC2的标志物辅助选择方案的流程图。

图4.提供了用于BC3的标志物辅助选择方案的流程图。

图5.提供了用于堆叠世代的标志物辅助选择方案的流程图。

详细说明

定义

在本发明的描述和权利要求中，下列术语将根据下文提出的定义使用。

如本文所使用的，术语“约”意思是大于或小于所述数值或数值范围的10％，但并不意图将任何数值或数值范围仅指定于这个较广的定义内。前面有术语“约”的每个数值或数值范围还意图包括所述绝对数值或数值范围的实施方案。

如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、细胞、组织或植物部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括例如但不仅限于：种子(包括成熟的种子和不成熟的种子)；植物插枝；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织，或者任何其它可组织成结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有该细胞或组织所得植物的生理学和形态学特征的植物，以及再生具有与该植物基本上相同基因型的植物。与此相反，某些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚，原生质体，分生细胞，愈伤组织，花粉，叶，花药，根，根尖，须，花，果仁，穗，穗轴，壳，或茎。

如本文所使用的，术语“天然的”或“自然的”定义了在自然界中发现的条件。“天然DNA序列”是自然界中存在的DNA序列，其通过自然手段或传统育种技术产生，而不是通过遗传工程化(例如，使用分子生物学/转化技术)产生。

如本文所使用的，“内源序列”定义处于生物体的自然位置或者处于生物体基因组内的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。

如本文所使用的，术语“分离的”意思是已从其自然环境中移出。

如本文所使用的，术语“纯化的”定义分子或化合物的分离形式，该分子或化合物实质上游离于在天然或自然环境中通常与之相伴随的污染物，并意味着由于和原始组合物的其它组分分离而导致纯度增加。术语“纯化的核酸”在本文中用于描述与其它化合物分离的核酸序列，包括但不仅限于，多肽、脂和碳水化合物。

如本文所使用的，术语“外源DNA序列”是任何核酸序列，其已经从其自然位置移出并插入到新的位置内，从而改变了被移出核酸序列两侧的序列。例如，外源DNA序列可以包括来自另一物种的序列。

如本文所使用的，“(经过)修饰的内源序列”是内源核酸序列的改变，包括内源基因组序列的删除、插入、取代和重排，包括插入外源DNA序列。

如本文所使用的，术语“转基因事件”意图指示编码一个或多个期望性状的基因座。转基因事件可以包括代表单一改变的修饰内源序列，或者可以包括一系列共同分离的修饰内源序列，包括例如，一个或多个紧密连锁的外源序列，其可以含有一个或多个转基因。

如本文所使用的，术语“(基因)渗入”指一个物种、变体或栽培种的性状、基因或DNA序列通过与另一个物种、变体或栽培种杂交而被转移到该另一个物种、变体或栽培种的基因组中的自然和人工过程，以及所得到的事件。这个过程任选地可以通过与轮回亲本回交实现。基因渗入的实例包括基因、转基因、调节元件、标志物、性状、性状基因座或染色体区段从一个植物的基因组进入或被引入另一个植物的基因组中。

“基因座”是指基因或DNA序列在基因组中的特定位置。基因座可以指特定的性状，并可以存在于细胞核、叶绿体或线粒体DNA中。

如本文所使用的，术语“轮回亲本”或“轮回植物”描述在杂交中作为受体植物系的优良品系，其将被用作连续回交的亲本系以产生最终的期望品系。

如本文所使用的，术语“杂交”是指雌性植物(或配子)被雄性植物(或配子)授精。术语“配子”是指植物中通过减数分裂从配子体产生的单倍体生殖细胞(卵或花粉)，并参与有性繁殖，其中两个相反性别的配子融合形成二倍体合子。该术语一般包括花粉(包括精细胞)和胚珠(包括卵)。因此，“杂交”一般指一个个体的胚珠从另一个个体的花粉受精，而“自交”通常定义某一个体的胚珠从来自同一个体的花粉受精。当在实现基因组区域或区段的基因渗入的语境中提到杂交时，技术人员会理解，为了实现一个植物仅一部分染色体基因渗入到另一个植物的染色体中，两个亲本系的基因组的随机部分会在杂交过程中重组，这是由于在亲本系中产生配子时会出现交换事件。因此，双亲的基因组通过杂交一定会被组合在单个细胞内，在从该细胞产生配子之后，它们在受精中的融合将产生基因渗入事件。

如本文所使用的，术语“受体”(recipient)是指从供体接受性状、转基因事件或基因组区段的植物或植物系，受体自身可以具有或者不具有处于杂合或纯合状态的所述性状、转基因事件或基因组区段。

如本文所使用的，术语“育种系”或“优良系”是指具有商业上有价值的或者农学上期望特征的栽培植物系，与野生型品种或具有和实验操作相关的有益品质的品种相对。该术语也指称优良植物系，后者代表基本上纯合的，即近交或加倍单倍的植物系，用于产生F1植物。

如本文所使用的，术语“F1”意思是两个在遗传上不相似的个体之间杂交的任何后代。

如本文所使用的，术语“供体”是指性状、转基因事件或基因组区段所来源的植物或植物系，并且该供体的所述性状、基因渗入或基因组区段可以处于杂合或纯合状态。

如本文所使用的，术语“回交”定义了F1植物与其中一个原始亲本的杂交。回交用于保持一个亲本(物种)的身份(identity)，并纳入来自第二亲本(物种)的特定性状。如本文所使用的，术语“回交世代”是指回交的后代。

如本文所使用的，术语“自交的”(selfed)定义两个遗传上相同的植物的杂交。通常，术语“自交的”定义了自花授粉事件，并且包括胚珠和花粉来自相同的植物或植物系的受精过程。

如本文所使用的，术语“轮回亲本百分比”是指回交后代植物与回交中使用的轮回亲本植物相同的百分比。与轮回亲本的百分比同一性可以通过测量遗传标志物，例如RFLP，而实验地加以确定，或者可以根据数学公式理论计算。

如本文所使用的，术语“后代”是指从杂交或自交产生的任何后代。

如本文所使用的，术语“鉴定”是指证明植物的身份，或者区分植物的特征(例如显示某些性状)的过程。

如本文所使用的，术语“选择”是指从一群个体中拣选某些个体植物的过程，通常是根据该个体的特定身份。

如本文所使用的，术语“标志物辅助选择”是指一种诊断性的鉴定过程，任选地后续以分子标志物的存在作为诊断特征或选择标准，从一群植物中选择某个植物。该过程通常涉及在某个植物的基因组中检测某些核酸序列或多态性的存在。

如本文所使用的，术语“分子标志物”定义在方法中用于可视化核酸序列特征差异的指标。这些指标的实例有：限制性片段长度多态性(RFLP)标志物，扩增片段长度多态性(AFLP)标志物，单核苷酸多态性(SNP)，微卫星标志物(例如SSR)，序列表征的扩增区域(SCAR)标志物，分子标志物的下一代测序(NGS)，酶切扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工酶标志物，或本文所述标志物的组合，其可界定特定的遗传和染色体位置。

如本文所使用的，术语“基因”是指由DNA序列构成的遗传单位，其占据染色体上的特定位置并含有关于生物体的特定特征的遗传指令。因此，术语“基因”包括核酸(例如DNA或RNA)序列，其包括产生RNA、多肽或其前体所需的编码序列。功能性多肽可以由全长编码序列或者由编码序列的任何部分编码，只要保留该多肽的期望活性或功能性质(例如，酶活性，配体结合，信号转导等)即可。

实施方案

回交或家系选择是育种者向优良育种系添加期望的农学性状的一种方法。该方法涉及育种系与表达期望性状的品系杂交，随后将表达该性状的后代植物与轮回亲本回交。本公开涉及将三个或更多个期望转基因事件基因渗入到优良植物种质内的改良方法。在一个实施方案中，该方法包括平行制备两个供体系，其中这些供体系包括至少一个共享的待转移到优良种质内的期望转基因事件。这两个供体系最初根据具有某些期望的可遗传性状而被选择。随后将该第一和第二供体系与优良品系杂交以产生F1后代。分别对第一和第二F1后代进行分析，并从两个品系各自选择出具有期望的堆叠转基因事件的植物，将这些植物分别与轮回亲本回交，产生具有期望性状并具有原始优良品系的基本上全部生理学和形态学特征的第一和第二回交后代植物。在一个实施方案中，至少一个所述回交步骤将使用雌性轮回亲本植物进行。

在一个实施方案中，通过与轮回亲本回交产生的最终第一和第二供体植物将包括期望的堆叠转基因事件，并将会显示高的轮回亲本百分比(RPP)。理论RPP可以用简单的公式，根据所实施的回交的次数进行计算。如果用于回交的亲本是纯合的，那么N代回交后的轮回亲本百分比是1-(1/2)^N+1x 100。因此，需要6个回交世代才能获得大于99％的轮回亲本百分比。用限制性片段长度多态性(RFLP)标志物对回交后代进行分析，是一种分析结果、并将近交的理论量与观察到的近交实际水平相比较的方法。其它分子标志物也能够用于评估RPP，包括例如，扩增片段长度多态性(AFLP)标志物，单核苷酸多态性(SNP)，微卫星标志物(例如SSR)，序列特征性扩增区域(SCAR)标志物，酶切扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工酶标志物，或其组合。下一代测序(NGS)技术也可以用于覆盖整个基因组。

在一个实施方案中，将三个转基因事件基因渗入轮回亲本内的方法包括平行制备两个供体系，其中这两个供体系将被与相同的轮回亲本植物回交。所得的两个平行回交的供体系在它们所含的期望转基因事件上将会有差异，但是它们会各自包含一个共同的转基因事件，并且两个供体将会具有至少75,85,88,90,94,97或97.5％的轮回亲本百分比。在一个实施方案中，两个平行的供体植物系将会各自包含至少两个待基因渗入到优良品系内的转基因事件，并且至少一个所述待基因渗入的转基因事件将会在两个供体植物中均存在。

转基因事件

最初的供体植物系包括至少两个期望的转基因事件，其期望被基因渗入到优良品系中。在本公开的一个实施方案中，供体植物包含两个或更多个转基因事件，其中这些转基因事件并不紧密连锁，而且更典型地，位于不同的染色体上。在其它实施方案中，供体植物包括两个或多个转基因事件，其中这些转基因事件紧密连锁在相同染色体上。每个转基因事件代表一个或多个期望的序列，它们充分连锁以至于一起分离。在一个实施方案中，转基因事件是包含导致一个或多个性状表达的遗传组分的基因座。在一个实施方案中，转基因事件包括一系列调控序列或基因，包括例如，一个或多个插入的外源序列，它们可以含有一个或多个转基因。包括转基因事件的组分可以包括开放阅读框或经过修饰的内源序列。在一个实施方案中，转基因事件包括一个或多个基因表达盒，所述基因表达盒进一步包括活跃转录和/或翻译的基因序列。反过来，转基因事件可以包括这样的多核苷酸序列：其不包含功能性基因表达盒或完整基因(例如，可以简单地包括调控序列如启动子)，或者可以不包含任何可识别的基因表达元件或任何活跃转录的基因序列。

在一个实施方案中，转基因事件包括一个或多个编码除草剂耐受性、昆虫抗性、营养物、抗生素或治疗性分子的基因。根据一个实施方案，供体植物系包括“堆叠”在供体植物基因组内的多个转基因事件，其中该转基因事件包括两个或更多个编码可提供农学性状的序列的基因。可以堆叠在供体植物基因组内的农学性状的实例包括，对草甘膦或其它除草剂的抗性或耐受性，和/或提供对选定昆虫或疾病的抗性，和/或营养增强，和/或改良的农学特性，和/或在饲料、食品、工业、医药或其它用途中有用的蛋白质或其它产物。两个或多个感兴趣的核酸序列(例如，基因)在供体植物基因组内的“堆叠”可以通过，例如，使用两个或更多个事件进行常规植物育种、用含有感兴趣序列的构建体转化植物、转基因植物再转化、或者通过同源重组的靶向整合添加新的性状等来实现。

根据本公开的转基因事件可以包括的序列包括，但不仅限于，如下实例：

1.赋予害虫或疾病抗性的基因或编码序列(例如iRNA)

(A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。这些基因的实例包括：提供黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因(Jones et al.,1994Science 266:789)；，提供丁香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶(Martin et al.,1993Science 262:1432)，和提供丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinoset al.,1994Cell 78:1089)。

(B)苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或以其为模本的人造多肽，例如Btδ-内毒素基因的多核苷酸序列(Geiser et al.,1986Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因(见，例如，Estruch et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登录号为40098，67136，31995和31998。

(C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al.,1994Plant Molec.Biol.24:825)。

(D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的杀幼虫剂。见美国专利No.5,659,026。

(E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这些基因的实例包括水稻半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al.,1987J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I(Huub et al.,1993Plant Molec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani et al.,1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。

(F)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子(Hammock et al.,1990Nature 344:458)。

(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt,1989)，和昆虫特异性麻痹神经毒素(美国专利No.5,266,361)。

(H)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性肽(Pang,1992Gene 116:165)。

(I)负责超富集单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性的非蛋白质分子的酶。

(J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。这些基因的实例包括马蹄莲(callas)基因(PCT公开的申请WO 93/02197)，几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC以登录号3999637和67152获得)，烟草钩虫几丁质酶(Kramer et al.,1993Insect Molec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck et al.,1993Plant Molec.Biol.21:673)。

(K)刺激信号转导的分子。这些分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al.,1994Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess et al.,1994Plant Physiol.104:1467)。

(L)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和5,607,914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肽。

(M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes et al.,1993Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯病有抗性。

(N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒以及相关病毒所致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。

(O)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道关键代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第七届国际分子植物-微生物相互作用研讨会(Seventh Int'l.Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。

(P)病毒特异性抗体。见例如Tavladoraki et al.(1993)Nature 266:469，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。

(Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质。因此，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-α-1,4-D-半乳糖醛酸而促进真菌定殖和植物营养素释放(Lamb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。Toubart等(1992Plant J.2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的编码基因的克隆和表征。

(R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性(Longemann etal.,1992).Bio/Technology 10:3305。

(S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到靶向复合体中，靶向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559；Graham等人，美国专利6,573,099。

2.赋予除草剂抗性的基因

(A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮类(imidazalinone)、磺酰苯胺类(sulfonanilide)或磺酰脲类除草剂的抗性或耐受性的基因。这类基因的实例编码一种突变乙酰乳酸合酶(ALS)(Lee et al.,1988EMBOJ.7:1241)，其也称乙酰羟酸合酶(AHAL)(Miki et al.,1990Theor.Appl.Genet.80:449)。

(B)一种或多种额外的编码针对草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如DGT-28，2mEPSPS，GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat，bar，和dsm-2基因)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)所致的代谢失活而获得的。见例如美国专利No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得，突变体基因的核苷酸序列在美国专利No.4,769,061中公开。欧洲专利申请No.0 333 033和美国专利No.4,975,374公开了可赋予除草剂如L-草铵膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提供了草铵膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61中描述了表达编码草铵膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮如稀禾定和甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是Accl-S1,Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.(1992)Theor.Appl.Genet.83:435所述。

(C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。Przibilla et al.(1991)Plant Cell 3:169描述了使用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利No.4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes et al.(1992)Biochem.J.285:173中描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。

(D)编码针对可结合羟基苯基丙酮酸二加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性基因，HPPD是催化对-羟基苯基丙酮酸(HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。这包括例如异噁唑(EP418175,EP470856,EP487352,EP527036,EP560482,EP682659,美国专利No.5,424,276)，特别是异噁唑草酮，其是玉米的选择性除草剂，二酮腈(diketonitrile)(EP496630,EP496631)，特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮类(EP625505，EP625508，美国专利No.5,506,195)，特别是磺草酮、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因能够提供针对这些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利Nos.6,268,549和6,245,968和美国专利申请公开No.20030066102中描述的基因。

(E)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(AOPP)除草剂的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利No.7,838,733所述。

(F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对吡啶基氧基生长素除草剂，如氟草烟或绿草定的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如WO2007/053482-A2所述。

(G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(见例如美国专利公开No.20030135879)。

(H)编码针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(见美国专利No.5,767,373)。

(I)提供针对可结合光系统II反应中心(PS II)核心蛋白质的三嗪除草剂(例如莠去津)和尿素衍生物(如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因。见Brussian et al.,(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245。

3.可赋予或贡献数量叠加性状(Value Added Trait)的基因

(A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量(Knultzon et al.,1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:2624。

(B)降低的植酸含量

(1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因(Van Hartingsveldt et al.,1993Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离磷酸盐。

(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现：该单个等位基因导致以植酸水平低为特征的玉米突变体的原因(Raboy et al.,1990Maydica35:383)。

(C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcusmucus)果糖基转移酶基因(Shiroza et al.,1988)J.Bacteriol.170:810，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz et al.,1985Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Pen et al.,1992Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因(Elliot et al.,1993),大麦淀粉酶基因(Sogaard et al.,1993J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher et al.,1993Plant Physiol.102:10450)。

在一个实施方案中，转基因事件包括一个或多个选自下组的转基因：杀虫剂抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水分利用效率转基因，营养质量转基因，DNA结合转基因，和选择性标志物转基因。

供体植物

根据一个实施方案，选择包含至少两个转基因事件的堆叠组的供体植物。这些供体植物能够使用标准重组或育种技术或其任何组合来产生。在一个实施方案中，供体植物包含2,3,4,5,6或更多个堆叠的转基因事件。而且，每个转基因事件可以包括多个紧密连锁并且一起分离的组分。在一个实施方案中，每个转基因事件包括一系列基因，它们在功能上有关或者与特定的期望性状相关。供体系的遗传背景有助于创建具有转基因的植物。然而，为了完全把握与转基因事件相关的性状的利益，必须将转基因事件基因渗入到优良育种系内。

在根据一个实施方案，提供了一种方法来减少在传统回交选择方法学中所需的杂交次数。该方法包括平行制备两个供体植物系，其中期望用于基因渗入的转基因事件在这两个供体植物之间分配，这两个供体共享至少一个转基因。在一个实施方案中，第一供体植物包括第一和第二转基因事件，而第二供体植物包含相同的第二转基因事件和第三转基因事件。在一个实施方案中，第一供体植物包括第一、第二和第三转基因事件，而第二供体植物包括相同的第三转基因事件，以及第四转基因事件。在一个实施方案中，第一供体植物包括第一、第二和第三转基因事件，而第二供体植物包括相同的第三转基因事件，以及第四和第五转基因事件。在一个实施方案中，第一供体植物包括第一、第二、第三和第四转基因事件，而第二供体植物包括相同的第三和第四转基因事件，以及第五和第六转基因事件。

根据一个实施方案，第一和第二供体植物作为两个不同的系被维持，每个系被与相同的轮回亲本系回交以产生第一和第二供体系，其每一个具有高轮回亲本百分比。更具体地，在一个实施方案中，第一和第二供体植物的每一个与相同的优良植物系杂交，并且将保留期望转基因事件的第一和第二F1后代进一步与轮回亲本系回交，以产生第一和第二回交后代植物，其包括所述期望的性状和所述优良品系的基本上全部的生理学和形态学特征，除了来自期望转基因事件的特性之外。所得第一供体/轮回植物可以随后与所述第二供体/轮回植物杂交，以产生期望的转基因事件被固定在期望的优良植物种质内的后代。

根据一个实施方案，提供了用于将三个或更多个转基因事件从供体系基因渗入到单一优良植物种质内的方法。该方法包括：

a)提供第一供体/轮回植物，其包括第一转基因事件，第二转基因事件，并且具有大于80％,88％,90％,94％,97％或97.5％的轮回亲本百分比；

b)提供第二供体/轮回植物，其包括所述第二转基因事件，第三转基因事件，并且具有大于80％,88％,90％,94％,97％或97.5％的轮回亲本百分比；

c)将所述第一供体/轮回植物与所述第二供体/轮回植物杂交，以产生后代；

d)从步骤(c)中培育的植物、或任选地，步骤(c)的植物的自交后代中鉴定和选择包括所述第一、第二和第三转基因事件的产物植物。

根据一个实施方案，第一和第二供体/轮回植物是这样产生的：使最初的第一和第二供体植物与优良品系杂交，以产生第一和第二F1后代品系。然后，基于具有期望的性状从第一和第二F1后代选择出一个或多个后代植物，并将它们进一步与轮回亲本平行(即，第一F1后代和第二F1后代二者作为两个单独的系繁殖)杂交，以产生回交后代植物；随后选择具有所述期望性状的回交后代植物，并将回交步骤重复一次、两次或更多次，以产生选定的第二、第三或更高代的回交后代植物，其除了来自供体植物的特性之外，包含期望的性状和基本上全部的优良品系生理学和形态学特征。根据一个实施方案，在回交中使用的轮回亲本植物是至少一次所述回交的雌性植物。

根据一个实施方案，通过使用标志物辅助选择来筛选和选择包含期望性状的后代植物。在一个实施方案中，所用的标志物辅助选择技术选自下组：SNP标志物辅助选择，SSR标志物辅助选择，RFLP标志物辅助选择，RAPD标志物辅助选择，和AFLP标志物辅助选择。下一代测序(NGS)技术也可以用于在回交过程中覆盖整个基因组。

根据一个实施方案，回交供体植物包含与轮回亲本系享有超过80％,88％,90％,94％,97％,或97.5％的序列同一性的基因组序列。根据一个实施方案，第一和第二回交供体植物分别包含少于5cM,10cM,20cM,25cM,30cM,35cM,40cM,45cM,或50cM的来自第一或第二供体亲本植物的连锁累赘。根据一个实施方案，回交供体植物包含期望的转基因事件，同时与轮回亲本植物共有超过88％,90％,95％,97％,或97.5％的分子标志物。在一个实施方案中，回交供体植物包含期望的转基因事件，同时具有基本上全部的优良品系生理学和形态学特征。

根据一个实施方案，提供了包含至少2个转基因事件的第一堆叠的第一供体植物，并且将该第一供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，产生包含所述转基因事件的第一堆叠的第一F1后代植物。用第一F1后代植物与轮回亲本植物进行第一育种回交，并且选择包含所述转基因事件的第一堆叠的第一育种回交后代。然后将第一育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含所述转基因事件的第一堆叠的BC2、BC3或BC4或更高代的第一回交后代植物。根据一个实施方案，一次或多次所述回交是使用雌性轮回植物进行的。

按照相似的方式，选择包括至少2个转基因事件的第二堆叠的第二植物，其中该第二堆叠中的至少一个转基因事件也存在于所述第一供体植物的转基因事件的第一堆叠中。将第二供体植物与相同的选定轮回亲本植物杂交以产生第一F1后代植物。此杂交产生了包含所述转基因事件的第二堆叠的第二F1后代植物。用第二F1后代植物与轮回亲本植物进行第二育种回交，并且选择包含所述转基因事件的第二堆叠的第二育种回交后代。然后将第二育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含所述转基因事件的第二堆叠的BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物。根据一个实施方案，一次或多次所述回交是使用雌性轮回植物进行的。

BC2、BC3或BC4或更高代的第一和第二回交后代植物将具有高的轮回亲本百分比，与轮回亲本植物共有大于88％,90％,95％,97％或97.5％的分子标志物，并且/或者分别来自第一或第二供体亲本植物的连锁累赘少于20cM。然后将BC2、BC3或BC4或更高代的第一回交后代植物与BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物杂交，以产生第三后代植物，其包含来自所述转基因事件第一和第二堆叠的独特的三个(或更多个)转基因事件。任选地，将所述第三后代植物自交或者与轮回亲本回交，同时选择包含期望的基因渗入的转基因事件的后代植物。在一个实施方案中，第三后代植物具有至少97.5％的轮回亲本百分比。在一个实施方案中，一个或多个所述转基因事件以纯合状态被固定在最终的育种系中。在一个实施方案中，所述转基因事件全部以纯合状态被固定。在一个实施方案中，包含基因渗入的期望转基因事件的植物以及轮回亲本种质包含少于5cM,10cM,15cM,20cM,25cM,30cM,35cM,40cM,45cM,或50cM的来自第一和/或第二供体亲本植物的连锁累赘。

根据一个实施方案，包含期望转基因事件的植物和轮回亲本种质可以和紧密亲缘的物种而非相同的物种杂交。例如，在一个实施方案中，玉米植物可以和亲缘的植物，例如类蜀黍(teosinte)，杂交。并且/或者，在一个实施方案中，包含期望转基因事件的第一和第二供体植物可以来自紧密亲缘的但不相同的物种。

根据一个实施方案，所述的将三个或多个转基因事件基因渗入到优良品系中的方法可以对任何能够通过回交选择进行育种的植物物种使用。在一个实施方案中，植物是作物物种，并且可以选自单子叶植物或双子叶植物。例如，可根据本公开使用的单子叶植物包括选自下组的任何植物：玉米植物，小麦植物，或水稻植物。可以使用的单子叶植物的进一步的具体实例包括，但不仅限于，玉米(Zea mays)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)，小米(例如，珍珠粟(Pennisetumglaucum)，黍(Panicum miliaceum)，粟(Setaria italica)，龙爪稷(Eleusinecoracana))，小麦(Triticum aestivum)，甘蔗(甘蔗属)，燕麦(Avena)，大麦(Hordeum)，凤梨(Ananas comosus)，香蕉(香蕉属)，棕榈，观赏植物，和草。在一个实施方案中，单子叶植物是玉米。可以根据本公开使用的双子叶植物的实例包括任何选自下组的植物：大豆植物，番茄植物，苜蓿植物，芥花(canola)植物，油菜(rapeseed)植物，芸苔属植物，棉花植物，和向日葵植物。可以根据本公开使用的双子叶植物的其它实例包括，但不仅限于，芥花，棉花，马铃薯，昆诺阿藜，苋，荞麦，红花，大豆，甜菜，向日葵，芥花，油菜，烟草，拟南芥，芸苔属和棉花。在一个实施方案中，双子叶植物是大豆。实施例1

在玉米中RRH63近交系与Mon88017:Mon89034的标志物辅助性状转换

SmartStax 8

SmartStax 8(SSX 8)是一种通过标志物辅助回交育种将8个基因[TC1507(PAT,Cry 1F),DAS591227(PAT,Cry34Ab1,Cry35Ab1),Mon89034(Cry1A.105,Cry2Ab2),Mon88017(EPSPS,Cry3Bb1)]渗入到高产玉米系中而产生的玉米植物。SmartStax 8的最终目的是保护玉米免于主要害虫，例如玉米螟、根虫、夜盗虫、玉米穗蛾和粘虫的伤害。SmartStax 8还可以提供对草甘膦除草剂的抗性，并纳入草铵膦作为选择性标志物。

标志物辅助回交育种(MABB)

通过经典育种方法的作物改良在上个世纪取得了显著进展。然而，考虑到人口稳定增长和可供作物种植的土地不断减少，采用新的策略以满足需求是当务之急。在短时间内开发具有期望性状的高产品种是育种计划的一个重要关注点。标志物辅助选择(MAS)有助于在比传统方法更短的时间内开发出优越品种。为了有利地使用MAS，必须有可用的基因组资源，例如中性(基于DNA)分子标志物(特别是共显性标志物)。回交育种业已成为将一个或数个基因从供体纳入到适应品种内的常用方法，在植物育种中已经应用了将近一个世纪。虽然性状的基因渗入可以通过传统的回交育种方法实现，但是该方法需要长达6代才能获得99％的轮回亲本百分比(RPP)。然而，MAS预期可以在仅仅3个回交世代内回收超过99％的RPP，表明分子标志物可以极大地提高回交效率(Bassett et al.2000)。

目标

通过标志物辅助回交将Mon89034和Mon88017基因渗入到玉米优良近交系SMA07BM中，这些基因最终将在BC3代与Mon88017和TC1507基因堆叠，获得具有全部三个基因Mon88017::Mon89034::TC1507、并且回收超过98％轮回亲本基因组(RPP)的SMA07BM。

转换策略

在SSX8的雌性侧，关注点是将Mon88017和Mon89034与TC1507一起堆叠到某一优良种质内，并回收98％或更高的轮回亲本基因组。为此，分别进行Mon17(Mon88017::TC1507)和Mon89(Mon88017::Mon89034)的平行转换，并且从BC2和BC3开始标志物辅助选择策略并在BC3实现堆叠(图1)。在由于不可预知的原因导致不可能在BC3实现堆叠的情况下，各品系在BC4或BC5进行堆叠。或者，这个策略还可以使用标志物在BC1和BC2上实施，并在BC2进行堆叠。因为Mon88017在两侧均存在，所以我们能够选择对于Mon88017::TC1507::Mon89034而言分别是纯合::杂合::杂合的等位基因状态的堆叠品系。

材料和方法

BC2

DNA提取和制备

从BC2RRH63Mon88017::Mon89034群体采取422个样品。使用MagAttract^TM方案在Agilent Biocel Robot^TM(Bohl et al 2010)上从新鲜组织提取DNA。对样品进行高通量分子分析(HTMA)测试，考察Mon89034的存在(Hinchey 2002)。接着，将对Mon89034测试为杂合的188个DNA样品拾取(hit-picked)到2个96孔板内。

用蒸馏水以1:10的比例稀释DNA。接着，从MABL存储DNA(MABLstock DNA)获得6RC162Mon88017::Mon89034(群体供体)和RRH63(轮回亲本)，并添加到平板1的A1和A2孔和平板2的H10和H11孔。

SNP标志物和基因型分型平台

标志物分析使用KASPar^TMSNP平台进行。标志物选择在下面的表1中列出。所得数据用Kraken Kluster Caller^TM软件上传和分析。使用Marker StudyManager为每个样品组装染色体表，并计算轮回亲本百分比(RPP)。

连锁累赘分析

为了实施连锁累赘(LD)分析，使用标志物选择在整个基因组中可扩增基因座的多态性标志物。LD在染色体1和4上实施，因为事件Mon89034先前被定位到染色体1大约342cM处，事件Mon88017先前被定位到染色体4大约110cM处。所选标志物在染色体1和4上相隔大约10cM。

基因组分析

将具有最高RPP的45个样品从提取平板拾取(hitpick)到1块96孔板中，供HTMA实验室检查Mon88017的存在，并拾取到另一块用于jinxing基因组分析(GA)。GA在染色体2-3,5-10上使用KASPar^TM SNP分析来实施。选定的标志物相隔大约20cM，并且在下文表1中列出。所得的数据用KrakenKluster Caller^TM软件上传和分析。使用Marker Study Manager^TM为每个样品组装染色体表，该染色体表既包括先前的LD又包括新的GA分析，并计算轮回亲本百分比(RPP)。

选择10个具有最高RPP并且对Mon88017和Mon89034均测试为杂合的植物。

BC3

DNA提取和制备

接下来，从BC3RRH63Mon88017::Mon89034群体，以及轮回亲本RRH63，采取188个样品。使用MagAttract^TM方案在Agilent Biocel Robot^TM上从新鲜组织提取DNA。提取的DNA用蒸馏水以1:10的比例稀释。从存储DNA获得6RC172Mon88017::Mon89034(群体供体)，并添加到平板1的A2孔和平板2的H11孔。

SNP标志物和基因型分型平台

BC3标志物分析使用KASPar^TM SNP分析进行。标志物的选择在下面的表1中列出。所得数据用Kraken Kluster Caller^TM软件上传和分析。使用MarkerStudy Manager为每个样品组装染色体表并计算轮回亲本百分比(RPP)。

连锁累赘分析

使用MarkerDB^TM选择在整个基因组中扩增了多个基因座的多态性标志物。LD在染色体1和4上执行，因为事件Mon89034先前被定位到染色体1大约342cM处，而事件Mon88017先前被定位到染色体4大约110cM处。选定的标志物在染色体1和4上相隔大约10cM，并且在基因组的所有其余部分上每隔大约20cM分布。评估了来自BC2的用作BC3代的供体的植物的基因型。将在全部BC3群体供体中对A等位基因为纯合的标志物从分析中淘汰，并添加到最终的结果中作为历史的非分离标志物。

选择具有最高RPP的10个植物。将Mon88017::Mon89034群体和Mon88017::TC1507群体的最佳选择投入到堆叠程序中，以发现最佳的可能堆叠组合。

表1.在BC2连锁累赘分析、BC2基因组分析和BC3连锁累赘/基因组分析中用于KASPar^TM SNP平台的标志物以及基因座染色体和染色体位置

堆叠

如图1所示进行RRH63与Mon 17::TC1507的平行回交转换。目标是在RRH63的双侧均实现堆叠，并获得可产生RPP大于98％的品系的堆叠组合。使用Mon 17侧和Mon 89侧的10个最佳选择来进行堆叠组合程序，以统计学确定可产生>98％RPP的组合的获得概率。对所得的堆叠群体执行标志物分析。

表型分型

新起点育苗(new start nursery)

此育苗是将感兴趣的性状转移到目标轮回亲本(RPP)近交系的初始步骤。使用定量ELISA测试对所有可能的供体植物筛选基因表达。仅有高表达的供体植物被用于给轮回亲本授粉。应当从供体转移花粉到RPP，以捕获RPP胞质。进行最少10次授粉，对穗进行批量脱壳(bulk-shell)。

从F1到BC1育苗

对每一个F1群体进行测试，以确认感兴趣的基因的存在。这通过喷洒合适的选择性除草剂标志物(用于Mon 88017；或者Liberty用于TC1507)或者使用定量ELISA测试(Mon 89034)来实现。如果没有错误，则被测试的全部植物都应该具有感兴趣的基因。在开花时，通过从RPP花粉转移到F1材料中进行最少10次授粉。

从BC1到BC2育苗

这里再一次实施选择性除草剂标志物和定量ELSIA，并且在后续的全部育苗中也实施。植物将关于每种基因的存在以1:1的比例分离。在开花时，选择20个阳性植物并进行授粉。在收获时，根据穗的类型选择10个植物并进行批量脱壳。

从BC2到BC3育苗

这是群体接受基因型分型的第一代。种植的行数必须足以在测定了基因的存在(通过除草剂应用或定量ELISA)之后获得至少186株的阳性植物。在3-4周龄的植物上收集叶组织样品。实验室选择开花最好的植物，并且只用那些植物授粉。在这个阶段，最好的植物以两种方式使用：用RPP对其授粉以进行反向回交；用它们给RPP授粉以实施最高达5次回交授粉。使用每个群体的最好的10个植物进行授粉并收获，但是仅再次种植最佳的3个植物。在BC2中使用表型选择作为标志物选择的补充，仅抛弃那些具有严重表型问题的植物。

BC3堆叠育苗

随着堆叠基因数目的增加，堆叠设计变得越来越复杂。当有3个或更多个性状需要基因渗入到某个品系中时，最好应当在开始时将基因渗入分成两个不同的标志物基因渗入项目，并通过堆叠实现最终的基因组合。通常，堆叠在BC3(或者更晚，例如BC4)代进行，使用对其各自的基因而言为半合的植物。

当使用BC3(半合)植物实施堆叠时，重要的是在授粉之前对待在堆叠中使用的植物进行全基因组分析。具体的杂交组合当在基因组分析结果出来之后，与实验团队协商来确定。待堆叠的品系必须经过选择，使它们具有“互补”的供体提亲本背景渗入。这将为随后在S1植物的标志物的帮助下近乎完全地消除供体遗传背景创造条件。

结果

基因型分型数据以辅助在选择中进行定量遗传

LD BC2

在少数基因座中，RPP(来自田间)和供体等位基因是单态的，但群体是分离的。对于这些情况，在KLIM中将RPP的等位基因强制判读为杂合——以符合预期判读并符合群体分离。在大多数情况下，亲本是多态的，在群体中存在BB。这些田间的基因型最有可能来自在早前世代中使用的不净的RPP。Mon89在染色体1上标志物覆盖低并且没有右侧标志物。数据返回率是99.1％。选择最好的45个植物用于授粉和接合性测试。

GA BC2

数据返回率是98.2％。由于异常的群体分离——特别是染色体4和染色体9上的cM 110附近，去掉了数个标志物。

LDGA BC3

数据返回率是99.1％。下列植物：94305117,94308841,94308798是劣种(rogue)样品。Mon 89的右侧没有标志物。在这些劣种植物中观察到了出乎意料的分离；所有其它的家族群与历史分离模式相符。分离标志物7594,2479对于这个杂交似乎不是多态性标志物(在BC2和BC3之间提供了不同的RPP来源)。根据开花情况选择了最佳的10个植物用于堆叠。另外，如果有超过10个植物具有100％RPP，则选择它们，以便能够基于表型选择植物。

选择

在下面的表2中列出了最佳的植物选择，以及它们的RPP，用于BC2和BC3LDGA。表3列出了最佳的堆叠组合。

表2.最终从RRH63Mon88017::Mon89034群体挑选，并通知育种者获取BC2和BC2世代育种的10个植物，以及每个植物的轮回亲本百分比和选择排名

堆叠组合

通过堆叠组合程序，使用Mon 17侧和Mon 89侧的10个最佳选择，为以统计学方式确定了所有组合的获得可产生>98％RPP的组合的概率。使用概率最高的组合在田间进行实际杂交。表3指示了在田间使用的堆叠组合。

表3.最佳堆叠组合，显示为植物编号，来自每个转换(Mon88017:TC1507和Mon89034:Mon88017)的配对在一起

讨论

RRH63x SLB01转换是窄杂交，因此只有相对较少的多态性标志物可用于分析。假设基因组中没有多态性标志物覆盖的大部分区域在两个品系间没有差异，因此不必转换。BC2到BC3的RPP进展显著，并且在为堆叠设定的98％最小RPP内。

自交和测交育苗

这是要种植的最后一代。这个育苗用于将项目材料从自交的S1水平推进到S2水平，同时产生杂交种子用于在目标环境中进行产量性状测试。通常，种植从最好的5个S1植物获得的全部种子，并且这些植物构成用于产量试验的5个选择。

对此项育苗的全部植物测试接合性。在授粉时，对就Mon88107和Mon89034而言均为纯合、并且就TC1507而言为纯合或无效的植物进行自花授粉，并送去进行最终育苗。群体中的其它植物用作雌性，通过从雄性测试者传递花粉来产生杂交种子。

Claims

1.一种用于将三个或更多个转基因事件从供体系渗入到轮回植物基因组内的方法，所述方法包括：

a)提供第一供体/轮回植物，其包括第一转基因事件、第二转基因事件，并且具有大于80％的轮回亲本百分比；

b)提供第二供体/轮回植物，其包括所述第二转基因事件、第三转基因事件，并且具有大于80％的轮回亲本百分比；

c)将所述第一供体/轮回植物与所述第二供体/轮回植物杂交，以产生后代植物；

d)从步骤(c)中的那些后代植物、或者任选地步骤(c)的后代植物的自交后代中鉴定并选择包括所述第一、第二和第三转基因事件的后代植物。

2.权利要求1的方法，其中：

i)所述第一供体/轮回植物是如下产生的：

e)使第一供体植物与轮回植物杂交产生第一后代，其中所述第一供体植物包括所述第一转基因事件和所述第二转基因事件；

f)通过将步骤(e)的第一后代、或者任选地，步骤(e)的第一后代的自交后代与所述轮回植物杂交而提供一个或多个回交世代，从而提供第一回交植物，并将所述第一回交植物与所述轮回植物杂交，从而产生包含所述第一转基因事件、所述第二转基因事件，并且具有大于80％的轮回亲本百分比的所述第一供体/轮回植物；和

ii)第二供体/轮回植物是如下产生的：

g)使第二供体植物与所述轮回植物杂交以产生第二后代，其中所述第二供体植物包括所述第二转基因事件和所述第三转基因事件；

h)通过将步骤(g)的第二后代、或者任选地，步骤(g)的第二后代的自交后代与所述轮回植物杂交而提供一个或多个回交世代，从而提供第二回交植物，并将所述第二回交植物与所述轮回植物杂交，从而产生包含所述第二转基因事件、所述第三转基因事件，并且具有大于80％的轮回亲本百分比的所述第二供体/轮回植物。

3.权利要求2的方法，其中所述轮回亲本植物在步骤(e)到(h)的至少一个步骤中是雌性育种植物。

4.权利要求3的方法，其中所述第一和第二后代植物各自与所述轮回植物回交至少2次以产生平行的BC2系或更高代的第一回交后代植物，分别代表所述第一供体/轮回植物和第二供体/轮回植物。

5.权利要求2的方法，其中第一供体/轮回植物的第一或第二转基因事件中的至少一个作为纯合性状被固定。

6.权利要求2的方法，其中第二供体/轮回植物的第二或第三转基因事件中的至少一个作为纯合性状被固定。

7.权利要求1的方法，其中在包含所述第一、第二和第三转基因事件的后代植物中，该第一、第二和第三转基因事件作为纯合性状被固定。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含所述第一、第二和第三转基因事件的后代植物具有大于94％的轮回亲本百分比。

9.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含所述第一、第二和第三转基因事件的后代植物具有大于97.5％的轮回亲本百分比。

10.权利要求9的方法，其中该植物是单子叶植物。

11.权利要求10的方法，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物、小麦植物、草植物和水稻植物。

12.权利要求9的方法，其中该植物是双子叶植物。

13.权利要求12的方法，其中该双子叶植物选自下组：大豆植物，芥花植物，烟草植物，番茄植物，油菜植物，芸苔属植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。

14.权利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三转基因性状中的至少一个包括选自下组的转基因：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。

15.权利要求1的方法，其中所述第一和第二供体/轮回植物中的一个还包括第四转基因事件。

16.权利要求15的方法，其中所述第一和第二供体/轮回植物中的一个还包括第五转基因事件。

17.一种用于将三个或更多个转基因事件渗入到植物内的方法，所述方法包括：

b)将该第一供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，以产生包含所述转基因事件的第一堆叠的第一F1后代植物；

c)将第一F1后代植物与所述轮回亲本植物进行第一育种回交，并选择包含所述转基因事件的第一堆叠的第一育种回交后代植物；

d)将选定的第一育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含所述转基因事件的第一堆叠的BC2或更高代的第一回交后代植物；

e)选择包含至少两个转基因事件的第二堆叠的第二供体植物，其中该第二堆叠的转基因事件中的至少一个也存在于所述第一堆叠的转基因事件中；

f)将该第二供体植物与所述选定的轮回亲本植物杂交，以产生包含所述转基因事件的第二堆叠的第二F1后代植物；

g)将第二F1后代植物与所述轮回亲本植物进行第二育种回交，并选择包含所述转基因事件第二堆叠的第二育种回交后代植物；

h)将选定的第二育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含所述转基因事件的第二堆叠的BC2或更高代的第二回交后代植物；

i)将所述BC2或更高代的第一回交后代与所述BC2或更高代的第二回交后代杂交，以产生包含来自所述转基因事件的第一和第二堆叠的三个转基因事件的第三后代植物。

18.权利要求17的方法，其中该第三后代植物包含至少97.5％的重组亲本基因组。

19.权利要求17的方法，其中该轮回亲本植物在步骤(c)到(h)中的至少一个中是雌性育种植物。

20.权利要求17的方法，其中该植物是单子叶植物。

21.权利要求20的方法，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物、小麦植物、草植物和水稻植物。

22.权利要求17的方法，其中该植物是双子叶植物。

23.权利要求22的方法，其中该双子叶植物选自下组：大豆植物，芥花植物，烟草植物，番茄植物，油菜植物，芸苔属植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。

24.权利要求17的方法，其中所述第一、第二和第三转基因性状的至少一个包括选自下组的转基因：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。

25.权利要求17-24中任一项的方法，其中第一堆叠的转基因事件中的至少一个在第一回交后代植物中作为纯合性状被固定。

26.权利要求17-24中任一项的方法，其中第二堆叠的转基因事件中的至少一个在第一回交后代植物中作为纯合性状被固定。

27.权利要求17-24中任一项的方法，其中第三后代植物包含所有作为纯合性状被固定的转基因事件。

28.权利要求17的方法，其中该第三后代植物包括少于20cM的来自第一供体植物的连锁累赘。

29.权利要求17的方法，其中该第三后代植物包括少于20cM的来自第二供体植物的连锁累赘。

30.权利要求17的方法，其中步骤(e)的第一回交后代植物和步骤(i)的第二回交后代植物是通过标志物辅助选择而选择的。

31.权利要求30的方法，其中该标志物辅助选择选自下组：SNP标志物辅助选择，SSR标志物辅助选择，RFLP标志物辅助选择，下一代测序辅助选择，RAPD标志物辅助选择，和AFLP标志物辅助选择。

32.通过权利要求17的方法产生的植物，其中该植物包括所述转基因事件的第一和第二堆叠。