CN102093986B - 油桐油酸脱氢酶基因突变体snp232及其获得方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232及其获得方法，涉及生物工程技术领域中的基因突变体。油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第232位碱基发生C→A突变，导致SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第78位氨基酸由脯氨酸(P)转变为苏氨酸(T)。其获得方法是：(1)来源于油桐种质材料PT45或PT60；(2)检测步骤：①提取突变体材料叶片DNA；②fad2基因编码区的PCR扩增；③DNA测序分析。该基因突变体及相应的种质材料，对于提高桐酸的含量、调整桐油脂肪酸组分、改良桐油的品质等具有重要作用。

Description

油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232及其获得方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域中的基因突变体，尤其涉及一种油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232及其获得方法。
背景技术
脂肪酸脱氢酶基因(fad2)是控制油酸向亚油酸转化的关键基因，且关系到多不饱和脂肪酸的合成；而亚油酸是桐酸合成的底物。因而fad2基因的功能突变不仅会改变桐油中脂肪酸组分含量，而且会影响桐油的品质。目前通过人工诱发fad2基因的突变，抑制fad2基因的表达，获得了高油酸含量的葵花籽油、大豆油等，而且在油菜中，不仅获得了高油酸突变体品种，且利用转基因获得了特高油酸转基因油菜株系。但是对于油桐中fad2基因的突变，目前国内外尚未见报道。
油桐是我国原产的多年生木本油料树种，其种子榨出的桐油不仅是重要的工业原料也是重要的生物柴油原料。因而利用遗传资源多样性结合生物技术途径，对于油桐进行脂肪酸组成的全方位改良和培育含特种脂肪酸的油桐品种，提升桐油品质及经济价值具有重要科学与现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232及其获得方法。
本发明的目的是这样实现的：
1、油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232
油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第232位碱基发生C→A突变，导致SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第78位氨基酸由脯氨酸(P)转变为苏氨酸(T)。
2、油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232的获得方法
(1)来源于油桐种质材料PT45或PT60，见表1。
表1突变体材料具体地理位置
(2)检测步骤
①提取突变体材料叶片DNA；
②fad2基因编码区的PCR扩增；
③DNA测序分析。
本发明具有下列优点和积极效果：
①本发明所涉及的fad2基因突变体SNP232导致了SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第78位氨基酸由脯氨酸(P)转变为苏氨酸(T)；
②本发明所涉及的fad2基因突变体SNP232种质材料中，SEQ ID NO：2所示的氨基酸的变化导致了桐油中桐酸含量的增加；
③本发明所涉及的fad2基因突变体SNP232种质材料中，SEQ ID NO：2所示的氨基酸的变化导致了桐油中不饱和脂肪酸含量的增加；
④本发明所涉及的fad2基因突变体SNP232种质材料中脂肪酸组分的变化对于利用生物技术途径，进一步对桐油进行脂肪酸组成的全方位改良和培育含特种脂肪酸的油桐品种具有重要科学与现实意义。
由此可见，该基因突变体及相应的种质材料，对于提高桐酸的含量、调整桐油脂肪酸组分、改良桐油的品质等具有重要作用。
附图说明
图1是含SNP232突变体的种质材料PT45脂肪酸组分色谱图；
图2是含SNP232突变体的种质材料PT60脂肪酸组分色谱图；
图3是不含SNP232突变体的野生型种质材料PT292脂肪酸组分色谱图；
图4是利用Sequencher软件对多个序列比对发现的SNP232反向测序序列峰图(箭头表示突变位点)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明：
1、检测步骤
fad2基因其mRNA序列来自GenBank(AF525534.1)。
①提取突变体材料叶片DNA
采用改良的CTAB法。
②fad2基因编码区的PCR扩增
模板DNA(20ng/μL)5μL；引物(10μM)各1μL；10×buffer(Mg2+Plus)2.5μL；Taq酶(5U/μL)0.2μL；dNTP(10mM)0.5μL；ddH2O 15.3μL；总体积25μL。PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s；67℃退火45s；72℃延伸1min；30个循环；最后72℃延伸5min；扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中检测。
③DNA测序分析
是指PCR产物送交测序，利用软件Bioedit和clustalx对测序结果进行校正与比对，通过软件Sequencher识别SNP。
2、DNA测序分析结果
发明人对来自湖北、重庆、贵州、陕西、广东、广西、四川和江西8省28个地区的38个种质材料(基因型)进行PCR扩增并测序，分析测序结果鉴定出SNP232。
结果如下：有8个基因型在fad2基因编码区序列(SEQ ID NO：1)的232位点发生了C→A突变(其中有6个基因型为杂合突变)，即SNP232单核苷酸突变体，导致其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)第78位氨基酸由脯氨酸(P)转变为苏氨酸(T)，其纯和突变种质材料编号为PT45和PT60，如图4。
3、油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232的应用实验
试验方法：
从突变体种质材料上采摘果实，利用超声波辅助法提取桐油，根据国标GB/T17377-2008和GB/T17376-200，使用气相色谱-质谱连用技术(GC-MS)对提取的桐油进行脂肪酸组分测定如图1，2，3。
试验结果：
突变体种质材料相应桐油组分测定结果如下：
表2 SNP232突变体与野生型种质材料脂肪酸组分分析(％)
Figure BDA0000036888770000041
注：PT45和PT60为含有SNP232突变体的种质材料；PT292作为对照，为不含SNP232突变体的野生型种质材料。
4、油酸脱氢酶基因突变体SNP232的应用前景
①利用生物技术途径对桐油进行脂肪酸组成的全方位改良
对桐油脂肪酸组分分析可知，相比较未发生变异的种质材料，发生变异的种质材料的油酸和亚油酸含量降低，而不饱和脂肪酸含量要明显升高如图1、2、3和表2。这对于利用生物技术，对桐油进行脂肪酸组分的改良有重要的意义。
②培育含特种脂肪酸的油桐品种
对桐油脂肪酸组分分析可知，发生变异的种质材料的桐酸含量高达80％左右，要明显高于未发生变异的种质材料，如图1、2、3和表2。这对于利用生物技术，对桐油进行脂肪酸组分的改良，培育高含量桐酸的特种油桐品种具有重要的现实意义。
Figure IDA0000036888850000011
Figure IDA0000036888850000021
Figure IDA0000036888850000031

Claims (5)

1.一种油桐油酸脱氢酶基因fad2突变体SNP232，其特征在于：
油桐油酸脱氢酶基因突变体SNP232是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第232位碱基发生C→A突变，导致SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第78位氨基酸由脯氨酸P转变为苏氨酸T。
2.按权利要求1所述突变体SNP232的获得方法，其特征在于：
(1)来源于油桐种质材料PT45或PT60；
PT45，来源地是中国四川渠县渠南乡和平村，
纬度、经度、海拔分别为30°48.9’N、106°55.8’E、266m；
PT60，来源地是中国四川宝兴县五龙乡旁山上，
纬度、经度、海拔分别为30°24.5’N、102°45.8’E、1092m；
(2)检测步骤：
①提取突变体材料叶片DNA；
②fad2基因编码区的PCR扩增；
③DNA测序分析。
3.按权利要求2所述的获得方法，其特征在于检测步骤①：
采用改良的CTAB法。
4.按权利要求2所述的获得方法，其特征在于检测步骤②：
模板DNA，20ng/μL，5μL；引物，10μM，各1μL；10×buffer，Mg2+Plus，2.5μL；Taq酶，5U/μL，0.2μL；dNTP，10mM，0.5μL；ddH2O 15.3μL；总体积25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s；67℃退火45s；72℃延伸1min；30个循环；最后72℃延伸5min；扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中检测。
5.按权利要求2所述的检测方法，其特征在于检测步骤③：
利用软件Bioedit和clustalx对测序结果进行校正与比对，通过软件Sequencher识别SNP。
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WO2006034059A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Cargill, Incorporated Canola oil from hybrid brassica varieties
WO2008054747A2 (en) * 2006-10-31 2008-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean event dp-305423-1 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof

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