ES2535625T5 - Método para fabricar ácido hialurónico de bajo peso molecular - Google Patents
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Description
D E S C R I P C I O N
METODO PARA FABRICAR ACIDO HIALURONICO DE BAJO PESO MOLECULAR
Campo tecnico
Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud de Patente Coreana N° 10-2009-0087185, presentado el 15 de septiembre de 2010.
La presente invencion se refiere a un metodo para disminuir el peso molecular del acido hialuronico de alto peso molecular mientras se mantienen las caracterlsticas propias del acido hialuronico de alto peso molecular tales como viscosidad, elasticidad, y absorcion de humedad. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo de produccion de acido hialuronico de bajo peso molecular de alta calidad aplicable industrialmente a traves de la descomposicion del medio que va a reaccionar con el acido hialuronico, y a condiciones eficaces de produccion de bajo peso molecular.
Antecedentes en la tecnica
El acido hialuronico ((HA), Hialuronano, (C14H20NNa0n) n (n > 1000)) es un pollmero que existe en los organismos vivos, y es un polisacarido, denominado glicosaminoglicano. Tiene la estructura que se muestra en la [Figura 1], que esta compuesta por unidades alternantes de acido D-glucuronico y N-acetilglucosamina, unidas a traves de enlaces glicosldicos p-1,3 y p-1,4 alternantes. Es un material soluble en agua y su peso molecular de uso presenta un amplio intervalo de 1000 a 13.000.000 Da (daltons). Ademas, tiene una estructura de cadena lineal.
En 1934, Meyer y Palmer descubrieron el acido hialuronico en humor vltreo de ojo de vaca, y que se distribuye en abundancia en la piel, cuerpos vltreos opticos, fluidos articulares, musculos, cordon umbilical, cresta del gallo, etc. De ese modo, el acido hialuronico es obtenido de estos organos por separacion y extraccion. Especialmente, es sabido que esta presente en abundancia en la placenta o en las articulaciones, y que se extrae generalmente de la cresta de gallo. Sin embargo, es sabido que en la produccion de acido hialuronico a parti r de tejidos biologicos, es diflcil separar un pollmero, tal como la condritina, y que existe el riesgo de presencia de materiales patogenos derivados de animales.
El acido hialuronico con estructura salina muestra una elevada eficacia y un alto efecto, y muestra un potente efecto lubricante en un estado de friccion flsica debido a su alto efecto humectante. Ademas, tiene ventajas preferentes en diversos efectos y propiedades tales como proteccion frente a una invasion bacteriana, etc. De ese modo, se ha producido recientemente el desarrollo de diversos productos que usan el acido hialuronico. Estas ventajas se pueden aplicar a suplementos medicos, biomateriales, y alimentos as! como desempena un papel en suministros medicos o cosmeticos. Ademas, los nuevos campos basados en el acido hialuronico se estan desarrollando continuamente.
El acido hialuronico de alto peso molecular tiene ventajas funcionales tales como viscosidad aumentada, lubricacion de articulaciones activa, y absorcion de humedad y elasticidad. De ese modo, su uso se ha extendido a diversos campos de suministros medicos, tales como inyecciones para la articulacion de la rodilla/oftalmicas o gotas oculares. Considerando el extraordinario aumento reciente del mercado del acido hialuronico a nivel mundial, se espera que se desarrollen derivados del acido hialuronico.
A diferencia del acido hialuronico de alto peso molecular, se ha subestimado la potencia del acido hialuronico de bajo peso molecular. Sin embargo, se ha estudiado recientemente la capacidad de absorcion corporal del acido hialuronico de bajo peso molecular. En consecuencia, el uso de acido hialuronico de bajo peso molecular ha adquirido protagonismo en cosmeticos o alimentos que requieren capacidad de absorcion tisular. De ese modo, se requiere el desarrollo de acido hialuronico de bajo peso molecular, y de una tecnologla para disminuir el peso molecular mientras se mantiene la funcion caracterlstica del acido hialuronico.
Se han informado metodos para disminuir el peso molecular del acido hialuronico de alto peso molecular en numerosas tesis y patentes. Por ejemplo, existe un metodo de hidrolisis mediante acidos y bases (Publicacion de Patente Japonesa sho 63-57602, Publicacion de Patente Pyung 1-266102, Y. Tokita et al., Polymer Degradation and Stability, 48, 269-273, 1995). Este metodo tiene la desventaja de que se anade un nuevo proceso y, despues de tratamiento, se ha de aumentar o disminuir el pH hasta un valor en un intervalo convencional. En el metodo, la velocidad de cambio de pH puede variar de acuerdo con la concentracion de acido hialuronico. De ese modo, es diflcil emplear el metodo en un proceso de fabricacion real. Ademas, se ha descubierto que el ajuste de pH aumenta las impurezas, y especialmente aumenta los valores de endotoxinas. Por lo tanto, se ha de anadir un proceso de purification para retirar las impurezas, aumentando de ese modo el coste. En la Patente CN 101020724A el acido hialuronico obtenido por fermentation experimenta en primer lugar un proceso de purificacion y a continuation se usa la enzima hialuronidasa para la degradation del acido hialuronico de alto peso molecular puro en acido hialuronico de bajo peso molecular. En la Patente US 2009/162905 A1 se usa hidroxido sodico para reducir el peso molecular promedio del acido hialuronico hasta un valor deseado y a continuacion se lleva a cabo un procedimiento de purificacion.
En cambio, en un metodo de descomposicion mediante ultrasonicacion o tratamiento termico a alta temperatura a un pH apropiado, se requiere que se introduzca una nueva maquina y, ademas, en el proceso de purificacion, se produce ademas un coste innecesario. Tambien, en un metodo que usa un agente oxidante tal como acido hipocloroso (Publicacion de Patente Japonesa Pyung 2-245193), un metodo que usa peroxido de hidrogeno (Publicacion de Patente Japonesa Pyung 2-22301), y un metodo que usa la capacidad de descomposicion del persulfato de amonio (Patente Registrada Coreana 10-0369517), se puede lograr la hidrolisis pero se ha de retirar el material de descomposicion introducido. Ademas, la produccion de endotoxinas u otras impurezas puede causar una baja calidad.
En los metodos mencionados anteriormente para disminuir el peso molecular del acido hialuronico de elevado peso molecular, durante el proceso de purificacion, debido al promotor de descomposicion introducido recientemente para el ajuste del peso molecular, solo existe accion de descomposicion. En otras palabras, en el proceso de purificacion, se ha de detener el proceso de mejora de los materiales de partida, y a continuacion se ha de introducir una maquina adicional para ajustar el peso molecular, y se produce un coste adicional. De ese modo, los metodos son ineficaces. En otras palabras, el proceso de tratamiento se hace mas complicado, y la adicion de procesos prolonga el tiempo requerido, aumentando de ese modo el coste. Desde el punto de vista industrial de production en masa, estos son factores economicos muy ineficaces.
Divulgacion
Problema tecnico
Por lo tanto, los inventores de la presente invention investigaron un metodo para disminuir el peso molecular de acido hialuronico de elevado peso molecular, en el que se consigue al mismo tiempo la retirada de impurezas y el ajuste del peso molecular. Descubrieron entonces que cuando se pone en contacto acido hialuronico con carbon activado en las condiciones apropiadas, disminuye el peso molecular promedio del acido hialuronico. Basandose en este descubrimiento, ellos concluyeron la presente invencion.
La presente invencion proporciona un metodo para disminuir el peso molecular de acido hialuronico de elevado peso molecular. Mas particularmente, la presente invencion proporciona un metodo para producir economicamente acido hialuronico de bajo peso molecular de alta calidad, en el que se solucionan los problemas de ineficacia de los metodos convencionales, tales como la degradation de la calidad causada por la produccion de impurezas, y el aumento del coste causado por la adicion de procesos complicados.
En consecuencia, un objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar acido hialuronico de bajo peso molecular que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado.
Ademas, otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para disminuir el peso molecular del acido hialuronico que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado.
Solucion tecnica
Para conseguir el objetivo mencionado anteriormente, la presente invencion proporciona un metodo para preparar acido hialuronico de bajo peso molecular que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado. Para conseguir otro objetivo, la presente invencion proporciona un metodo para disminuir el peso molecular del acido hialuronico que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado.
La presente invencion proporciona un metodo de uso de carbon activado como medio de reaction con el fin de convertir acido hialuronico de elevado peso molecular en acido hialuronico de bajo peso molecular que tiene un peso molecular predeterminado, en el que el acido hialuronico de alto peso molecular se obtiene mediante cultivo de microorganismos, extraction de cresta del gallo, o similar.
El acido hialuronico de elevado peso molecular usado en la presente invencion se puede obtener mediante cultivo de microorganismos, extraccion de cresta de gallo, o similar. Un ejemplo de la obtencion de acido hialuronico de elevado peso molecular mediante cultivo de microorganismos es el que sigue a continuacion.
Se selecciona Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) como microorganismo productor de acido hialuronico, y se cultiva en un fermentador de 75 l con glucosa (40-100g/l), extracto de levadura (2-5 g/l), peptona de caselna (10-20 g/l), sulfato de magnesio (0,5-1 g/l), dihidrogenofosfato potasico (1-5 g/l), cloruro sodico (2-10 g/l), y acido glutamico (0,1-1 g/l), a pH 6,0-7,0, a 32-37 °C, en condiciones aerobicas de 0,1-1 vvm. A continuacion se produce acido hialuronico que tiene un peso molecular promedio de 2.000.000-4.000.000 Da con una productividad en un intervalo de 4-6 g/l.
Del cultivo que contiene acido hialuronico, se retira el microorganismo mediante un metodo conocido tal como centrifugation, prensado en filtro, filtrado en profundidad, y filtration de membrana. A continuacion, el filtrado se usa como el acido hialuronico de elevado peso molecular en la presente invencion.
En la presente invencion, el acido hialuronico de elevado peso molecular se descompone en acido hialuronico de bajo peso molecular que tiene un intervalo especlfico de peso molecular promedio, mediante carbon activado, y otras condiciones de conversion de bajo peso molecular.
La presente invencion proporciona un metodo para preparar acido hialuronico de bajo peso molecular que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado,
en el que el carbon activado es usado como medio de reaccion con el fin de convertir acido hialuronico de elevado peso molecular en acido hialuronico de bajo peso molecular que tiene un peso molecular predeterminado y
en el que el acido hialuronico de elevado peso molecular es obtenido mediante cultivo de microorganismos o extraccion de cresta de gallo.
El metodo de la invencion se caracteriza en que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado.
En la presente invencion, el acido hialuronico ((HA), Hialuronano, (C14H20NNa0n) n (n > 1000)) es un pollmero que existe en los organismos vivos, y es un polisacarido, denominado glicosaminoglicano. Tiene la estructura que se muestra en la [Figura 1].
En la presente invencion, el acido hialuronico se puede obtener a partir de un tejido biologico tal como cresta de gallo mediante purificacion, y se puede producir a partir de microorganismos transformados mediante metodos de ingenierla genetica. El acido hialuronico usado como material de partida de la presente invencion se puede preparar mediante el metodo descrito anteriormente o adquirirse en fuentes comerciales. El peso molecular promedio del acido hialuronico
usado en el metodo de la presente invencion no se limita de forma particular. Por ejemplo, el peso molecular promedio del acido hialuronico usado en la presente invencion puede variar de 100.000 Da a 13.000.000 Da, de 1.000.000 Da a 13.000. 000 Da, de 3.500.000 Da a 13.000.000 Da, de 3.500.000 Da a 10.000.000 Da, de 3.500.000 Da a 8.000.000 Da, preferentemente en el intervalo de 3.500.000 Da a 13.000.000 Da, y mas preferiblemente en el intervalo de 3.500.000 Da a 8.000.000 Da.
En una realizacion de la presente invencion, se selecciono Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) capaz de producir acido hialuronico como microorganismo productor de acido hialuronico, y se cultivo en un fermentador de 75 l con glucosa (40-100 g/l), extracto de levadura (2-5 g/l), peptona de caselna (10-20 g/l), sulfato de magnesio (0,5-1 g/l), dihidrogenofosfato potasico (1-5 g/l), cloruro sodico (2-10 g/l), y acido glutamico (0,1-1 g/l), a pH 6,0-7,0, a 32-37 °C, en unas condiciones aerobicas de 0,1-1 vvm de modo que se obtuvo acido hialuronico.
El carbon activado indica un material carbonaceo que presenta una alta capacidad de absorcion. Se obtiene por tratamiento de madera, lignito, o turba con un activador tal como cloruro de cinc o acido fosforico, seguido de secado, o es obtenido por activacion de carbon vegetal con vapor de agua. En general, el carbon activado se prepara en un estado de polvo o en un estado de partlculas. El carbon activado de tipo polvo se puede convertir en carbon activado de tipo partlcula para su uso. Se usa principalmente como adsorbente para adsorber gases o la humedad, y se puede usar para diversos fines tales como recuperacion de disolventes, purificacion de gases, decoloracion, o similares.
En la presente invencion, el carbon activado se puede preparar directamente, o adquirirlo en fuentes comerciales. No existe ninguna limitacion especlfica en la clase de carbon activado usado en la presente invencion. Por ejemplo, puede ser carbon activado granular, carbon activado en polvo, o carbon activado paletizado, y preferiblemente puede ser carbon activado en polvo. El carbon activado en polvo se puede obtener mediante un metodo de activacion de vapor o un metodo de activacion qulmica. No existe ninguna limitacion especlfica en el metodo de activacion.
En la etapa de poner en contacto el acido hialuronico con el carbon activado, no existe ninguna limitacion especlfica en el metodo de contacto. Preferentemente, el medio de cultivo purificado que contiene acido hialuronico preparado mediante el metodo de cultivo de microorganismos, o la solucion en diluyente de acido hialuronico que contiene acido hialuronico diluido en un disolvente se puede dispersar en carbon activado. El disolvente para diluir el acido hialuronico no esta particularmente limitado. Por ejemplo, puede ser agua o un disolvente mixto de un alcohol inferior que presenta de 1 a 6 atomos de carbono y agua. Preferiblemente, puede ser agua.
En el medio de cultivo purificado que contiene acido hialuronico o en la solucion en diluyente de acido hialuronico, la concentracion de acido hialuronico no se limita de manera particular, y puede variar de un 0,01 a un 90 %, de un 0,1 a un 50 %, de un 0,1 a un 30 %, o de un 0,1 a un 10 %. Preferiblemente, puede variar desde 0,1 a un 10 %.
Mediante la puesta en contacto, se produce una reaccion del acido hialuronico. Como resultado, se reduce el peso molecular. La reaccion indica un fenomeno en respuesta a una estimulacion, o cambio qulmico que se produce entre materiales.
El metodo de la presente invencion puede comprender etapas adicionales para recoger el acido hialuronico de la solucion de reaccion despues de que haya terminado la reaccion. Cualquier metodo es adecuado para recoger el acido hialuronico de la solucion de reaccion siempre que sea un metodo de aislamiento y purificacion bien conocido. Generalmente, se puede llevar a cabo mediante centrifugacion, filtracion, y similares para retirar el carbon activado y tambien se pueden llevar a cabo por electroforesis y diversas cromatograflas en columna. Para las cromatograflas, se pueden usar cromatografla de intercambio ionico, cromatografla de filtracion en gel, HPLC, cromatografla en fase inversa, cromatografla en columna por afinidad, solas o en una combinacion de las mismas, para recoger el acido hialuronico. El metodo de la presente invencion tiene el efecto de disminuir el peso molecular del acido hialuronico.
En la presente invencion, la proporcion entre acido hialuronico y carbon activado es una proporcion que puede variar de 1:2 a 1:6.
En la presente invencion, no existe ninguna limitacion especlfica en la temperatura y tiempo requeridos para poner en contacto el acido hialuronico con el carbon activado. Pueden variar de acuerdo con el peso molecular del acido hialuronico antes de ponerse en contacto con el carbon activado, y el peso molecular requerido del acido hialuronico. Preferiblemente, la temperatura puede variar de 25 °C a 45 °C, y mas preferiblemente la temperatura puede variar de 35 °C a 45 °C. El tiempo puede variar preferentemente de 3 a 18 horas, y mas preferentemente varla de 6 a 18 horas.
A medida que aumenta la proporcion de carbon activado o la temperatura de contacto, la proporcion de reduccion del peso molecular del acido hialuronico por unidad de tiempo aumenta. A medida que aumenta el tiempo de contacto, disminuye el peso molecular promedio del acido hialuronico obtenido despues de la puesta en contacto. El peso molecular promedio del acido hialuronico preparado mediante el metodo de la invencion puede variar de acuerdo con el peso molecular del acido hialuronico antes de ponerse en contacto con el carbon activado, la proporcion de carbon activado, la temperatura de contacto, y el tiempo de contacto. De ese modo, no se limita de forma particular. Por ejemplo, el peso molecular promedio del acido hialuronico producido en la presente invencion puede variar de 10.000 Da a 3.000.000 Da, de 10.000 Da a 100.000 Da, de 100.000 Da a 500.000 Da, de 500.000 Da a 1.000.000 Da, de 1.000.000 Da a 2.000. 000 Da, de 2.000.000 Da a 3.000.000 Da, de 3.000.000 Da a 4.000.000 Da, de 4.000.000 Da a 5.000.000 Da, de 5.000. 000 Da a 6.000.000 Da, de 6.000.000 Da a 7.000.000 Da, de 7.000.000 Da a 8.000.000 Da, de 8.000.000 Da a 9.000. 000 Da. Preferiblemente, puede variar de 10.000 Da a 3.000.000 Da, y mas preferentemente puede variar de 10.000 Da a 2.000.000 Da.
El metodo de la presente invencion tiene un proceso sencillo, y presenta factores facilmente controlables (tales como la cantidad de carbon activado, temperatura y tiempo) para controlar la proporcion de reduccion del peso molecular de acido hialuronico. Segun se cambian los factores de control, la proporcion de reduccion del peso molecular de acido hialuronico cambia regularmente de forma relativa. Esto es muy util en la preparacion de acido hialuronico que presenta un peso molecular predeterminado. Ademas, tal caracterlstica puede retirar una gran cantidad de endotoxinas contenidas en el
medio de cultivo en el caso en que el acido hialuronico se prepare mediante un cultivo de microorganismos.
De acuerdo con el metodo de preparacion de la presente invencion, es posible producir eficazmente acido hialuronico que presente un peso molecular especlfico mediante un proceso sencillo. Ademas, es posible ajustar facilmente y de forma estable el peso molecular del acido hialuronico producido mediante el ajuste de la cantidad de carbon activado, la temperatura y el tiempo.
Entretanto, la presente invencion proporciona un metodo para disminuir el peso molecular de acido hialuronico que comprende la etapa de poner en contacto acido hialuronico con carbon activado, en el que el carbon activado es usado como medio de reaccion con el fin de convertir acido hialuronico de elevado peso molecular en acido hialuronico de bajo peso molecular que presenta un peso molecular predeterminado, y en el que el acido hialuronico de elevado peso molecular se obtiene mediante cultivo de microorganismos o extraccion de la cresta de gallo.
Se desvela por primera vez en la presente invencion la disminucion del peso molecular de acido hialuronico al poner en contacto el acido hialuronico con carbon activado.
En el metodo de la presente invencion, el acido hialuronico que se va ponen en contacto con carbon activado, el peso molecular del acido hialuronico, el carbon activado, y la clase de carbon activado, la proporcion de acido hialuronico con respecto al carbon activado, el metodo de contacto, las condiciones de contacto (disolvente, concentracion de acido hialuronico, y similares), la temperatura de contacto, el tiempo de contacto, el efecto del contacto, el peso molecular disminuido del acido hialuronico obtenido despues de ponerse en contacto con el carbon activado, y otros efectos, son los mismos que los que se han descrito en el metodo de preparacion arriba indicado.
Estas caracterlsticas de la presente invencion se pueden entender facilmente con referencia a los Ejemplos de la presente invencion.
De acuerdo con un Ejemplo de la presente invencion, se cultivo un microorganismo, Streptococcus sp., que producla acido hialuronico de modo que produjera acido hialuronico. A continuacion, se purifico el acido hialuronico. Se disperso carbon activado a diversas proporciones en el medio de cultivo purificado y se puso en contacto con el acido hialuronico en diversas condiciones de temperatura con varios tiempos. A continuacion, se recogio el acido hialuronico, y se midio su peso molecular.
En condiciones de 25 °C a 45 °C, cuando el acido hialuronico se puso en contacto con carbon activado durante 3 a 18 horas, el acido hialuronico de 3.500.000 Da se convirtio en acido hialuronico que tenia diversos pesos moleculares de 10.000 Da a 3.000.000 Da.
De acuerdo con otro Ejemplo de la presente invencion, se uso acido hialuronico extraldo y purificado de cresta de gallo en el mismo experimento mediante dilucion. A continuacion, se midio el resultado.
Como resultado, cuando se uso el acido hialuronico extraldo/purificado a partir de cresta de gallo, fue posible preparar acido hialuronico que tenia un peso molecular disminuido de la misma manera que con el cultivo de un microorganismo que produce acido hialuronico.
De ese modo, mediante el metodo de la presente invencion, es posible reducir eficazmente el peso molecular del acido hialuronico independientemente del metodo de preparacion del acido hialuronico o de las condiciones de contacto entre el acido hialuronico y el carbon activado.
En un Ejemplo de la presente invencion, se cultivo 1 t de acido hialuronico que tenia un peso molecular promedio de 3.500.000 Da, y se hizo reaccionar con carbon activado en una cantidad de cuatro veces el peso de acido hialuronico durante 4 horas a una temperatura de reaccion de 45 °C. A continuacion, se preparo acido hialuronico con un peso molecular promedio de 2.000.000 Da.
En otros Ejemplos de la presente invencion, en las mismas condiciones que las del Ejemplo anterior, durante diversos tiempos de reaccion de 6, 7 u 8 horas, se preparo acido hialuronico, y se midio el peso molecular promedio. Como resultado, de acuerdo con el tiempo de reaccion, se preparo acido hialuronico con pesos moleculares promedio de 1.000.000 Da, 500.000 Da y 100.000 Da.
En consecuencia, en el metodo de la invencion, es posible ajustar facilmente el peso molecular del acido hialuronico ajustando diversos factores tales como la proporcion de carbon activado, la temperatura, y el tiempo de reaccion. Ademas, el metodo de la invencion es un metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular de alta calidad aplicable industrialmente.
Efectos ventajosos
El metodo de la presente invencion para disminuir el peso molecular de acido hialuronico de elevado peso molecular es un proceso conveniente sin los inconvenientes de reprocesar la retirada de materiales de alimentacion, o requerir tratamiento de pH, diversos catalizadores de reaccion, y condiciones de tratamiento adicionales complicadas (tales como tratamiento termico) como en los metodos convencionales. Ademas, el metodo tiene el efecto de retirar impurezas. De ese modo, mediante el metodo, es posible producir de forma conveniente y economica acido hialuronico de bajo peso molecular con una pureza elevada. El metodo de la invencion para disminuir el peso molecular tiene la ventaja de que de acuerdo con el cambio de las condiciones de reaccion usando carbon activado, el peso molecular del acido hialuronico de bajo peso molecular se puede ajustar de forma diversa. El acido hialuronico de bajo peso molecular producido mediante el metodo de la presente invencion se puede producir de acuerdo con los estandares de los suministros medicos mientras que se pueden mantener las caracterlsticas propias del acido hialuronico. Ademas, se puede producir de acuerdo con los estandares de los cosmeticos o los alimentos.
Descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una unidad de repetition de acido hialuronico, la cual esta compuesta por unidades alternantes de acido D-glucuronico y N-acetilglucosamina, unidas a traves de enlaces p-1,3 y p-1,4 alternantes;
la Figura 2 es un grafico que muestra el cambio de peso molecular del acido hialuronico de acuerdo con diversas clases de carbon activado y las concentraciones respectivas a 25 °C (2X, 4X, 6X : cantidad de carbon activado administrada con respecto al acido hialuronico, CA1, CGSP, CASP, CN1, SX-PLUS, SX-ULTRA, DARCO KBB, DARCO A-51: clase de carbon activado usado, Norit®CA1, Norit® CGSP, Norit® CASP, Norit® CN1, Norit® SX-PLUS, Norit® SX-ULTRA, Norit® DARCO KBB, Norit® DARCO A-51);
la Figura 3 es un grafico que muestra el cambio de peso molecular del acido hialuronico de acuerdo con diversas clases de carbon activado y las concentraciones respectivas a 35 °C (2X, 4X, 6X : cantidad de carbon activado administrada con respecto al acido hialuronico, CA1, CGSP, CASP, CN1, S-51HF, SA-SUPER, SX-PLUS, SX-1G, SX-ULTRA, PAC-200C, DARCO KBB, DARCO A-51: la clase de carbon activado usado, Norit® CA1, Norit® CGSP, Norit® CASP, Norit® CN1, Norit® S-51HF, Norit® SA-SUPER, Norit® SX-PLUS, Norit® SX-1G, Norit® SX-ULTRA, Norit® PAC-200C, Norit® DARCO KBB, Norit® DARCO A-51) y
la Figura 4 es un grafico que muestra el cambio de peso molecular del acido hialuronico de acuerdo con diversas clases de carbon activado y las concentraciones respectivas a 45 °C (2X, 4X, 6X : cantidad de carbon activado administrada con respecto al acido hialuronico, CA1, CGSP, CASP, CN1, S-51HF, SA-SUPER, SX-PLUS, SX-1G, SX-ULTRA, PAC-200C, DARCO KBB, DARCO A-51: la clase de carbon activado usado, Norit® CA1, Norit® CGSP, Norit® CASP, Norit® CN1, Norit® S-51HF, Norit® SA-SUPER, Norit® SX-PLUS, Norit® SX-1G, Norit® SX-ULTRA, Norit® PAC-200C, Norit® DARCO KBB, Norit® DARCO A-51).
Modo para la invencion
En adelante, se describiran realizaciones a tltulo de ejemplo de la presente invencion con referencia a los dibujos que se acompanan.
En la presente invencion, se midio la concentracion de acido hialuronico existente en una solucion mediante el metodo de carbazol (T. Bitter, Anal. Biochem., 1962, 4, 330-334). El peso molecular promedio del acido hialuronico se obtuvo mediante cromatografla en gel (Narlin B. Beaty et al., Anal. Biochem., 1985, 147, 387-395). Las condiciones de analisis incluyen una columna de gel Toyo Soda TSK G6000PWXL, y una fase movil de NaCI 150 mM, Na2HPO43 mM (pH 7,0), y NaN3 al 0,02 %. Para la deteccion, se uso un detector de Indice de refraccion (Shodex). Como material de referencia, se preparo oxido de polietileno a una concentracion de 2 mg/ml. Como endotoxina, se cuantifico un reactivo de LAL disponible en el mercado de Charles River Laboratories Korea. Dentro del intervalo de menos de una dilucion multiple eficaz maxima, la dilucion multiple se ajusto a 3 puntos. Se determino que, a partir de un grupo de control negativo, no se detecto ninguna endotoxina y, a traves de un control de producto positivo, no hubo ningun factor de interferencia de reaccion.
En los Ejemplos que siguen, una concentracion de cada uno del acido hialuronico de elevado peso molecular extraldo a partir de un microorganismo, y el acido hialuronico de elevado peso molecular extraldo de cresta de gallo, se ajusto a un valor predeterminado, y a continuacion se produjo acido hialuronico de bajo peso molecular de acuerdo con el cambio de las condiciones de reaccion usando carbon activado como medio para producir acido hialuronico de bajo peso molecular. El cambio del peso molecular promedio del acido hialuronico de bajo peso molecular producido se describira mas adelante. Los siguientes ejemplos ilustran la invencion y no se pretende que limiten la misma.
<Ejemplo 1>
Metodo para producir acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado CA1
En este Ejemplo, como material de partida para producir acido hialuronico de bajo peso molecular, se uso una composition purificada a partir de un cultivo obtenido mediante cultivo de Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) como microorganismo productor. El peso molecular promedio del acido hialuronico incluido en el material de partida es 3.500.000 Da, y la concentracion de endotoxina es mucho mayor de 0,5 EU/mg.
Las condiciones de cultivo son las que se indican a continuacion:
Se selecciono Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) como microorganismo productor de acido hialuronico, y se cultivo en un fermentador de 75 l que contenla glucosa (40-100 g/l), extracto de levadura (2-5 g/l), peptona de caselna (10-20 g/l), sulfato de magnesio (0,5-1 g/l), dihidrogenofosfato potasico (1-5 g/l), cloruro sodico (2-10 g/l), y acido glutamico (0,1-1 g/l), a pH 6,0-7,0, a 32-37 °C, bajo una condition aerobica de 0,1-1 vvm.
Las condiciones de reaccion basicas son las que se indican a continuacion:
Para obtener una fuerza de agitation apropiada y una reactividad del acido hialuronico purificado a partir de ultrafiltracion y el carbon activado Norit® CA1 (denominado en lo sucesivo en el presente documento CA1, Norit, Palses Bajos, Norit® - los carbones activados usados en los Ejemplos se produjeron a partir de Norit), la concentracion del acido hialuronico se ajusto a 2,5 g HA/l. A continuacion, se introdujo el acido hialuronico en una cantidad de 300 ml en un vaso de precipitados de vidrio de 1 l, y se introdujo el carbon activado CA1 en el vaso de precipitados con una concentracion dos veces, 4 veces y 6 veces mayor que la concentracion del acido hialuronico. A continuacion, se hizo girar un impulsor (diametro de 5 cm) hecho de teflon a una velocidad de 300 rpm mientras se mantenlan las condiciones de reaccion predeterminadas. Con el fin de evitar al maximo la mezcla de impurezas o la evaporation del llquido de reaccion hasta la finalization de la reaccion, las partes de impulsor distintas de la parte de rotation del impulsor se cerraron hermeticamente con una cubierta. Las temperaturas de reaccion fueron 25 °C, 35 °C, y 45 °C.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 1]. De acuerdo con el aumento de la temperatura de reaccion, la capacidad de descomposicion del carbon activado CA1 aumento, aumentando de ese modo la velocidad de disminucion del peso molecular del acido hialuronico. A 25 °C, en las condiciones de CA1 2X, durante 6 horas, se obtuvo acido hialuronico de 2.000.000 Da, y durante 18 horas, se obtuvo un peso molecular de 1.500.000 Da. A 25 °C, y CA1 4X, durante 18 horas, se obtuvo un peso molecular de aproximadamente 1.000.000 Da, y a CA1 6X, durante 6 horas, se obtuvo un peso molecular de aproximadamente 1.000.000 Da, y durante 18 horas, se obtuvo un peso molecular de 500.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 35 °C, aunque la concentracion tuvo una reactividad 2X menor que a 25 °C, la capacidad de descomposicion del peso molecular fue similar que la de 25 °C. A 35 °C, con 6X, durante 18 horas, se obtuvo un peso molecular de 130.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 45 °C, aunque la concentracion tuvo una reactividad 2X menor que a 35 °C, la capacidad de descomposicion del peso molecular fue similar que la de 35 °C. Con 6X, se obtuvo un peso molecular de 15.000 Da. En todas las condiciones de reaccion, la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg. Ademas, se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina. Ademas, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en un 92 % o superior, en todas las condiciones de reaccion. De ese modo, se descubrio que no existe ninguna preocupacion por la falta de acido hialuronico.
Tabla 1
<Ejemplo 2>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado CGSP
Se usaron el acido hialuronico y las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® CGSP (en lo sucesivo en el presente documento CGSP) en lugar de CA1 como medio para producir acido hialuronico de bajo peso molecular para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular. Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 2]. Como el carbon activado CA1, de acuerdo con el aumento de la temperatura de reaccion, la capacidad de descomposicion del carbon activado CGSP aumento, aumentando de ese modo la velocidad de disminucion del peso molecular del acido hialuronico. A 25 °C, en las condiciones de CGSP 4X, durante 18 horas, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y a 6x durante 18 horas, se obtuvo un peso molecular de 500.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 35 °C, aunque la concentracion tuvo una reactividad 2X menor que a 25 °C, la capacidad de descomposicion del peso molecular fue similar que la de 25 °C. Especialmente, en el caso de 6x a 45 °C, el resultado alcanzo 10.000 Da de peso molecular. En estas condiciones de reaccion, los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg. Como en los resultados de CA1, se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina. Ademas, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion. De ese modo, los inventores confirmaron la estabilidad del acido hialuronico y el efecto del carbon activado CGSP.
Tabla 2
Resultados despues de la reaccion de acido hialuronico con carbon activado CGSP
<Ejemplo 3>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado CASP
Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® CASP (en lo sucesivo en el presente documento CASP) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 3]. Como los carbones activados CA1 y CGSP, de acuerdo con un aumento de la temperatura de reaccion, la capacidad de descomposicion del carbon activado CASP tambien aumento, aumentando de ese modo la velocidad de disminucion del peso molecular del acido hialuronico. A 25 °C, en las condiciones de CASP 4X, durante 18 horas, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 35 °C, aunque la concentracion tuvo una reactividad 2X menor que a 25 °C, la capacidad de descomposicion del peso molecular fue similar que la de 25 °C. En el caso de 45 °C, la capacidad de descomposicion aumento de forma elevada y en el caso de 2x durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y durante 18 h, 5000.000 Da y en el caso de 2X, durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, durante 18 h, 500.000 Da, 18 h, 100.000 Da. En el caso de 6x, la capacidad de descomposicion aumento de la forma mas elevada, y por lo tanto los presentes inventores confirmaron que durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 15.000 Da y durante 18 h, de 12.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina como los resultados de CA1 y CGSP. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de CASP.
Tabla 3
<Ejemplo 4>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado CN1
Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® CN1 (en lo sucesivo CN1) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular. Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 4]. De acuerdo con el aumento de la temperatura de reaccion, la capacidad de descomposicion del carbon activado CASP tambien aumento, aumentando de ese modo la velocidad de disminucion del peso molecular del acido hialuronico. A 25 °C, en las condiciones de CN1 4X, durante 18 horas, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 35 °C, la capacidad de descomposicion aumento de forma elevada y en el caso de 4x durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y durante 18 h, de 5000.000 Da. En el caso de 45 °C, a 2x durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y a 4x durante 6 h de 500.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduction adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de CN1.
Tabla 4
<Ejemplo 5>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado S-51HF
Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® S-51HF (en lo sucesivo S-51HF) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular. Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 5]. De acuerdo con el aumento de la temperatura de reaccion, la capacidad de descomposicion del carbon activado S-51HF tambien aumento, aumentando de ese modo la velocidad de disminucion del peso molecular del acido hialuronico. A 35 °C, en las condiciones de S-51 HF 6X, durante 6 horas, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 45 °C, a 2x durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y a 4x durante 6 h, de 5000.000 Da y en el caso de 6x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de S-51 HF.
Tabla 5
<Ejemplo 6>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado SA-SUPER Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® SA-SUPER (en lo sucesivo SA-SUPER) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 6]. A 35 °C, en las condiciones de SA-SUPER 2X y 4X, durante 18 horas, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da, y en las condiciones de 6X durante 18 h, de 1000.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de SA-SUPER.
Tabla 6
<Ejemplo 7>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado SX-PLUS
Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® SX-PLUS (en lo sucesivo SX-PLUS) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 7]. A 25 °C, en las condiciones de Sx -SUPER 6X, durante 18 horas, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. A 35 °C 2X durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da y a 4x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da. A 45 °C 2X durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, a 4x durante 6 h, de 500.000 Da y a 6x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 10.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de SX-PLUS.
Tabla 7
<Ejemplo 8>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado SX-1G
Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® SX-1G (en lo sucesivo SX-1G) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular. Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 8]. A 35 °C, 6X durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y durante 18 h de 500.000 Da. A 45 °C 2X durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da, y a 6x durante 18 h, de 10.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduction adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de SX-1G.
Tabla 8
<Ejemplo 9>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado SX-ULTRA Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® SX-ULTRA (en lo sucesivo SX-ULTRA) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 9]. A 25 °C, en las condiciones de SX-ULTRA 4X, durante 18 horas, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. A 35 °C 2X durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da y a 4x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da. A 45 °C 2X durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, a 4x durante 6 h, de 500.000 Da y a 6x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 10.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 %
o superior en todas las condiciones de reaccion de SX-ULTRA.
Tabla 9
<Ejemplo 10>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado PAC-200C
Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® PAC-200C (en lo sucesivo PAC-200C) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 10]. A 35 °C 6X durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. A 45 °C 2X durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da, a 4x durante 6 h, de 1.000.000 Da y a 6x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 10.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de PAC-200C.
Tabla 10
<Ejemplo 11>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado DARCO KBB Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® DARCO RBB (en lo sucesivo PAC-200C) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 11]. A 25 °C,
4X durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 35 °C, la capacidad de descomposicion aumento de forma elevada y en el caso de 2x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y a 4x durante 18 h, de 500.000 Da. A 45 °C, 2x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da, a 4x durante 6 h, de 500.000 Da, y a 6X durante 18 h, de 10.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 92 % o superior en todas las condiciones de reaccion de DARCO KBB.
Tabla 11
<Ejemplo 12>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular usando carbon activado DARCO A-51 Se usaron las condiciones de reaccion del <Ejemplo 1> excepto carbon activado Norit® DARCO A-51 (en lo sucesivo PAC- A-51) en lugar de CA1 para llevar a cabo el analisis comparativo de productividad de acido hialuronico de bajo peso molecular.
Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron la endotoxina, la concentracion de acido hialuronico, y el peso molecular promedio de acuerdo con el metodo de analisis. Los resultados se indican en la [tabla 12]. A 25 °C, 4X durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da. En el caso en que la reaccion se llevo a cabo a 35 °C, la capacidad de descomposicion aumento de forma elevada y en el caso de 6x durante 6 h, se obtuvo acido hialuronico de 1.000.000 Da, y durante 18 h, de 100.000 Da. A 45 °C, 2x durante 18 h, se obtuvo acido hialuronico de 500.000 Da, a 4x durante 6 h, de 500.000 Da, y a 6X durante 18 h, de 10.000 Da. Los inventores confirmaron que la endotoxina fue menor de 0,5 EU/mg y se descubrio que el aumento de la temperatura de reaccion es eficaz en la reduccion adicional de la endotoxina al igual que los resultados obtenidos anteriormente. Tambien, la concentracion de acido hialuronico se mantuvo en al menos un 93 % o superior en todas las condiciones de reaccion de DARCO A-51.
Tabla 12
<Ejemplo 13>
Metodo de preparacion de acido hialuronico de bajo peso molecular derivado de la cresta de gallo
En el presente Ejemplo, el material de partida de acido hialuronico de alto peso molecular se extrajo y purifico de la cresta de gallo, y su peso molecular promedio fue 3.500.000 Da.
En este experimento, se selecciono carbon activado CA1 como ajustador de peso molecular, y a continuation los resultados experimentales del acido hialuronico derivado de la cresta de gallo se compararon con los del acido hialuronico derivado de microorganismo. A continuacion, se describira con detalle el experimento.
La concentration del material de partida de acido hialuronico derivado de cresta de gallo se ajusto a 2,5g HA/l. A continuacion, el acido hialuronico se introdujo en una cantidad de 300 ml en un vaso de precipitados de 1 l, y se introdujo carbon activado CA1 en el vaso de precipitados en una concentracion dos veces, 4 veces y 6 veces mayor que la concentracion de acido hialuronico. A continuacion, se hizo girar un impulsor (diametro de 5 cm) hecho de teflon a una velocidad de 300 rpm. Con el fin de evitar al maximo la mezcla de impurezas o la evaporation del llquido de reaction hasta la finalization de la reaccion, las partes del impulsor distintas de la parte de rotation del impulsor se cerraron hermeticamente con una cubierta. La temperatura de reaccion fue 25 °C.
Los resultados del acido hialuronico derivado de la cresta de gallo como grupo de control se compararon con los del <Ejemplo 1>. Despues de 3, 6, y 18 horas, se recogio cada muestra, y se analizaron los cambios. El cambio del peso molecular promedio del acido hialuronico derivado de la cresta de gallo se indica en la [tabla 13].
Se descubrio que el acido hialuronico derivado de la cresta de gallo se descompuso por el carbon activado CA1 de la misma manera que el acido hialuronico derivado de microorganismo del <Ejemplo 1>. Esto indica que no existe ninguna diferencia en el proceso de disminucion del peso molecular entre el material de partida derivado de microorganismo y el material de partida derivado de la cresta de gallo.
Tabla 13
<Ejemplo 14>
Metodo de produccion de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 2.000.000 Da en un proceso industrial
En un fermentador de 1 t, se cultivo Streptococcus sp. ID9102(KCTC11395BP) en las mismas condiciones del medio de cultivo que se han descrito en el <Ejemplo 1> de modo que se obtuvieran 500 l de cultivo. Este cultivo se purifico de modo que se produjera una composition de 500 l. El peso molecular promedio del acido hialuronico fue 3.500.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue mucho mayor de 5,0 EU/mg.
Se selecciono carbon activado como ajustador de peso molecular, y se introdujo en una cantidad 4 veces mayor que la de acido hialuronico. La reaccion de disminucion del peso molecular se llevo a cabo en un reactor de 500 l revestido con Teflon, y la temperatura de reaccion fue 45 °C. Despues de 4 horas de reaccion, se retiro el adsorbente y se finalizo la reaccion. Despues de la reaccion, se midieron la concentracion de acido hialuronico del producto resultante, la concentracion de endotoxina, y el peso molecular promedio del acido hialuronico.
Como resultado, el peso molecular promedio del acido hialuronico fue 2.000.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue 0,005 EU/mg o inferior.
El filtrado de acido hialuronico cuyo peso molecular se habla disminuido se hizo precipitar y se seco de modo que proporciono 2 kg de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 2.000.000 Da.
<Ejemplo 15>
Metodo de produccion de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 1.000.000 Da en un proceso industrial
Se prepararon 500 l de composicion de acido hialuronico en las mismas condiciones que se han descrito en el <Ejemplo 14>. El peso molecular promedio del acido hialuronico fue 3.500.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue mucho mayor de 5,0 EU/mg.
Las condiciones de reaccion del carbon activado fueron las mismas que en el <Ejemplo 14>, y el tiempo de reaccion fue 6 horas. Despues de 6 horas de reaccion, se retiro el adsorbente y se finalizo la reaccion. Despues de la reaccion, se midieron la concentracion de acido hialuronico del producto resultante, la concentracion de endotoxina, y el peso molecular promedio del acido hialuronico.
Como resultado, el peso molecular promedio del acido hialuronico fue 1.000.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue 0,005 EU/mg o inferior.
El filtrado de acido hialuronico cuyo peso molecular se habla disminuido se hizo precipitar y se seco de modo que proporciono 2 kg de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 1.000.000 Da.
<Ejemplo 16>
Metodo de produccion de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 500.000 Da en un proceso industrial
Se prepararon 500 l de composicion de acido hialuronico en las mismas condiciones que se han descrito en el <Ejemplo 14>. El peso molecular promedio del acido hialuronico fue 3.500.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue mucho mayor de 5,0 EU/mg.
Las condiciones de reaccion del carbon activado fueron las mismas que en el <Ejemplo 14>, y el tiempo de reaccion fue 7 horas. Despues de 7 horas de reaccion, se retiro el adsorbente y se finalizo la reaccion. Despues de la reaccion, se midieron la concentracion de acido hialuronico del producto resultante, la concentracion de endotoxina, y el peso molecular promedio del acido hialuronico.
Como resultado, el peso molecular promedio del acido hialuronico fue 500.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue 0,005 EU/mg o inferior.
El filtrado de acido hialuronico cuyo peso molecular se habla disminuido se hizo precipitar y se seco de modo que proporciono 2 kg de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 500.000 Da.
<Ejemplo 17>
Metodo de produccion de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 100.000 Da en un proceso industrial
Se prepararon 500 l de composicion de acido hialuronico en las mismas condiciones que se han descrito en el <Ejemplo 14>. El peso molecular promedio del acido hialuronico fue 3.500.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue mucho mayor de 5,0 EU/mg.
Las condiciones de reaccion del carbon activado fueron las mismas que en el <Ejemplo 14>, y el tiempo de reaccion fue 8 horas. Despues de 8 horas de reaccion, se retiro el adsorbente y se finalizo la reaccion. Despues de la reaccion, se midieron la concentracion de acido hialuronico del producto resultante, la concentracion de endotoxina, y el peso molecular promedio del acido hialuronico.
Como resultado, el peso molecular promedio del acido hialuronico fue 100.000 Da, la concentracion de acido hialuronico fue 5 g/l, y la concentracion de endotoxina fue 0,005 EU/mg o inferior.
El filtrado de acido hialuronico cuyo peso molecular se habla disminuido se hizo precipitar y se seco de modo que proporciono 2 kg de acido hialuronico teniendo un peso molecular promedio de 100.000 Da.
A traves del <Ejemplo 14> al <Ejemplo 17>, los presentes inventores desarrollaron un metodo para producir acido hialuronico de bajo peso molecular de alta calidad, que es facil de aplicar a escala industrial.
Aplicabilidad industrial
El metodo de la presente invencion para disminuir el peso molecular de acido hialuronico de alto peso molecular es un proceso conveniente sin los inconvenientes de reprocesar la retirada de materiales de alimentacion, o requerir tratamiento de pH, diversos catalizadores de reaccion, y condiciones de tratamiento adicionales complicadas (tales como tratamiento termico) como en los metodos convencionales. Ademas, el metodo tiene el efecto de retirar impurezas. De ese modo, mediante el metodo, es posible producir de forma conveniente y economica acido hialuronico de bajo peso molecular con una elevada pureza. El metodo de la invencion para disminuir el peso molecular tiene la ventaja de que de acuerdo con el cambio de las condiciones de reaccion usando carbon activado, el peso molecular del acido hialuronico de bajo peso molecular se puede ajustar de forma diversa. El acido hialuronico de bajo peso molecular producido mediante el metodo de la presente invencion se puede producir de acuerdo con los estandares de los suministros medicos mientras se pueden mantener las caracterlsticas propias del acido hialuronico. Tambien, se puede producir de acuerdo con los estandares de los cosmeticos y los alimentos.
Claims (2)
1. Un metodo para preparar acido hialuronico de bajo peso molecular que comprende la etapa de poner en contacto el acido hialuronico con carbon activado, en el que el carbon activado se usa como medio de reaccion con el fin de convertir el acido hialuronico de elevado peso molecular en acido hialuronico de bajo peso molecular teniendo un peso molecular predeterminado y
en el que el acido hialuronico de elevado peso molecular es obtenido mediante cultivo de microorganismos o por extraccion de la cresta de gallo, y
en el que la proporcion de acido hialuronico con respecto al carbon activado es de 1:2 a 1:6.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la temperatura para poner en contacto el acido hialuronico con el carbon activado es de 25 °C a 45 °C, y el tiempo para poner en contacto el acido hialuronico con el carbon activado es de 3 h a 18 h.
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