BR112012005816A2

BR112012005816A2 - método para a fabricação de ácido hialurônico de baixo peso molecular

Info

Publication number: BR112012005816A2
Application number: BR112012005816-9A
Authority: BR
Inventors: Dae-Jung Kang; Jong-Hyuk Im; Jae-Hoon Kang
Original assignee: Ildong Pharm Co., Ltd.
Priority date: 2009-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2020-08-25
Also published as: EP2479194A2; ES2535625T5; EP2479194B2; JP5750442B2; WO2011034341A2; EP2479194A4; WO2011034341A3; EP2479194B1; CN102630231A; US20120232261A1; JP2013504679A; ES2535625T3; KR20110029492A; KR101132114B1; CN102630231B; BR112012005816B1

Abstract

MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO DE BAIXO PESO MOLECULAR. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular a partir do ácido hialurônico de peso molecular elevado que é produzido por Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP). Mais especificamente, a invenção está relacionada a um método de reduzir o peso molecular do ácido hialurônico uniformemente mediante a reação do ácido hialurônico de peso molecular elevado com um carvão ativado em certa condição de decomposição enquanto mantém a sua propriedade original. O método da invenção para diminuir o peso molecular de ácido hialurônico de peso molecular elevado possui um processo conveniente sem o inconveniente de reprocessamento para a remoção de materiais de entrada, ou que requeira tratamento de pH, vários catalisadores de reação, e complicadas condições de tratamento adicionais (tais como o tratamento térmico) como em um método convencional. Além disso, o método possui um efeito para a remoção de impurezas. Assim, através do método, é possível conveniente e economicamente produzir ácido hialurônico de baixo peso molecular com elevada pureza. O método da invenção para diminuir o peso molecular possui uma vantagem em que de acordo com uma mudança de uma condição de reação usando carvão ativado, o peso molecular de ácido hialurônico de baixo peso molecular pode ser ajustado de forma variada. O ácido hialurônico de baixo peso molecular produzido pelo método da invenção pode ser produzido em conformidade com os padrões de suprimentos médicos enquanto que as próprias características do ácido hialurônico podem ser mantidas. Também, ele pode ser produzido em conformidade com os padrões de cosméticos ou alimentos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO DE BAIXO PESO MO- LECULAR".

Campo Técnico Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido de Patente Coreano No. 10-2009-0087185, depositado em 15 de Setembro de 2010, o qual é aqui incorporado por referência para todos os propósitos co- mo se completamente aqui apresentado.

A presente invenção refere-se a um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico de peso molecular elevado enquanto que as próprias características do ácido hialurônico de peso molecular elevado, tais como viscosidade, elasticidade e absorção de umidade são mantidas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método de produzir in- dustrialmente o ácido hialurônico de baixo peso molecular aplicável de alta : 15 qualidade através do meio de decomposição a ser reagido com o ácido hia- lurônico, e condição de produção de baixo peso molecular eficiente. Antecedentes da Técnica O ácido hialurônico ((HA), Hyaluronan, (CiaH2oNNaOr1) n (n > 1000)) é um polímero que existe em todos os organismos vivos, e é um po- lissacarídeo, chamado glicosaminoglicano. Ele possuí uma estrutura mostra- da na figura 1, que é composta de ácido D-glucurônico e N- acetilglucosamina alternantes, ligados entre si através ligações glicosídicas B-1,3 e 8-1,4 alternadas. É um material solúvel em água e o seu peso mole- cular utilizável tem uma ampla faixa de 1.000 a 13.000.000 Da (daltons).

Também, possui uma estrutura de uma cadeia reta.

O ácido hialurônico foi encontrado pela primeira vez em 1934 por Meyer e Palmer do humor vítreo de um olho de vaca, e é distribuído em abundância na pele, corpos vítreos óticos, líquido articular, músculos, cor- dões umbilicais, crista de galinha, etc. Assim, é obtido a partir desses órgãos através da separação e extração. Especialmente, é conhecido por estar pre- sente dentro de uma placenta ou uma articulação em abundância, e é ge- ralmente extraído da crista de galinha. No entanto, sabe-se que na | i produção de ácido hialurônico a partir dé tecidos biológicos, é dificil separar ç um polimero tal como condroiítina, e há uma preocupação sobre os materiais patogênicos de origem animal.

O ácido hialurônico com estrutura de sal mostra uma elevada e- ficáciaeum elevado efeito, e mostra um forte efeito lubrificante em um esta- do de atrito físico, devido ão seu elevado efeito umectante. Da mesma for- Ma, possui às vantagens preferíveis em vários efeitos e propriedades tais como a proteção contra a invasão bacteriana, etc. Assim, o desenvolvimento de vários produtos usando 60 ácido hialurônico foi recentemente conduzido, Estas vantagens podem ser aplicadas aos suplementos médicos, materiais biológicos, e alimentos, assim como desempenhar um papel em suprimentos médicos ou cosméticos, Além disso, os novos campos à base de ácido hialu- rônico têmvsido continuamente desenvolvidos.

O ácido hialurônico de peso molecular elevado possui vantagens funcionais tais como viscosidade aumentada, lubrificação das articulações ativas, e absorção de umidade e elasticidade. Assim, seu uso tem sido am- z pliado para diversas áreas de suprimentos médicos, tais como oftálmi- calinjeção intra-articular do joelho ou colifios; Em consideração de um tre- mendo aumento recente de um mercado de ácido hialurônico em todo o mundo, espera-se que o derivado de ácido hialurônico seja desenvolvido.

Ao contrário do ácido hialurônico de peso molecular elevado, a potência do ácido hialurônico de baixo peso molecular tem sido subestima- da. No entanto, a absorção do corpo de ácido hialurônico de baixo peso mo- lecular foi recentemente estudada. Consequentemente, a utilização de ácido hialurônicode baixo peso molecular em cosméticos ou alimentos que requer a absorvência tecidual foi projetada. Assim, o desenvolvimento de ácido hia- lurônico de baixo peso molecular é requerido, e uma tecnologia para diminuir 0 peso molecular enquanto mantém a função característica do ácido hialurô- nico é requerida, Um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico de peso molecular elevado tem sido relatado em muitas teses e patentes. Por exémplo, existe um método de hidrólise pelo ácido e base (Publicação

| de Patente Japonesa sho 63-57602, Publicação de Patente Pyung 1- T 266102, Y.

Tokita et al., Polymer Degradation and Stabílity, 48, 269-273, 1995). Este método possuí uma desvantagem em que um novo processo é adicionado, e após o tratamento, o pH tem que ser aumentado ou diminuído paraumvalor dentrode uma faixa padrão, No método, a taxa de variação do pH pode variar de acordo com a concentração de ácido hialurônico.

Assim, fica dificil empregar o método em um processo de fabricação real.

Também, observou-se que o ajuste do pH aumenta as impurezas, e especialmente aumenta o valor da endotoxina.

Assim, um processo de purificação para re- moveras impurezas deve ser adicionado, aumentando assim o custo.

En- quanto isso, em um método de decomposição por meio de ultrassom ou tra- tamento de aquecimento com alta temperatura em um pH apropriado, uma nova máquina é requerida de ser introduzida, e também em um processo de purificação, um custo desnecessário é originado adicionalmente.

Da mesma " 15 forma, em um método que utiliza um agente oxidante tal como 6 ácido hipo- cloroso (Publicação de Patente Japonesa Pyung 2-245193), um método que : utiliza peróxido de hidrogênio (Publicação de Patente Japonesa Pyung 2- 22301), e um método para uso de uma capacidade de decomposição de perssulfato de ámônio (Patente Registrada Coreana 10-0369517), a hidrólise pode ser conseguido, mas um material de decomposição introduzido deve ser removido.

Além disso, a produção de endotoxina ou outras impurezas pode causar baixa qualidade.

Nos métodos acima mencionados para diminuir o peso molecu- lar do ácido hialurônico de peso molecular elevado, durante um processo de purificação, devido a um promotor de decomposição recentemente introduzi- do para o ajuste de um peso molecular, apenas uma ação de decomposição existe, Em outras palavras, em um processo de purificação, um processo de melhora da qualidade de uma matéria-prima tem que ser interrompido, e de- pois uma máquina adicional para o ajuste do peso molecular deve ser intro- duzida, eum custo adicional se origina.

Assim, os métodos são ineficientes.

Em outras palavras, o processo de tratamento torna-se mais complicada, e à adição de processos prolonga o tempo necessário, aumentando assim o custo. Na visão industrial de produção em massa, estes são fatores muito ç economicamente ineficientes. Descrição Problema Técnico Portanto, os inventores da presente invenção pesquisaram um método para reduzir um peso molecular de ácido hialurônico de peso mole- cular elevado, em que a remoção de impurezas e 0 ajuste de um peso mole- cular podem ser obtidos de uma só vez. Depois, eles descobriram» que quando o ácido hialurônico for colocado em contato com carvão ativado sob uma condição ápropriada, o peso molecular médio de ácido hialurônico é diminuído, Com base nesta descoberta, eles completaram esta invenção.

A presente invenção fornece um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico de peso molecular elevado. Mais particular mente a presente invenção fomece um método para economicamente pro- ' 15 duzirácido hialurônico de baixo peso molecular de/alta qualidade, em que os problemas de ineficiência de um método convencional, tais como a degrada- : ção da qualidade causada pela produção de impurezas, e aumento de custo causado pela adição de um processo complicado são resolvidos.

Consequentemente, um objetivo da presente invenção é forne- cerum método para à preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular que compreende a etapa de levar 0 ácido hialurônico em contato com carvão ativado, Também, outro objetivo da presente invenção é fornecer um mê- todo para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico compreendendo a 25 . etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado. Solução Técnica Para atingir o: objetivo acima mencionado, a presente invenção fornece um método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular que compreende a etapa de levar o ácido hialurônico em contato comcarvão ativado.

Para alcançar outro objetivo, apresente invenção fornece um método pára reduzir o peso molecular do ácido hialurônico compreendendo i a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.

7 A presente invenção fornece um método de uso de carvão ativa- do como um méio de reação a fim de converter o ácido hialurônico de peso molecular elevado em ácido hialurônico de baixo peso molecular tendo um pesomolecularpredeterminado, em que 0 ácido hialurônico de peso molecu- lar elevado é obtido através da cultura de micro-organismos, extração de crista de galinha, ou similar.

O ácido hialurônico de peso molecular elevado utilizado na pre- sente invenção pode ser obtido através da cultura de micro-organismos, a extraçãode crista de galinha, ou similar: Um exemplo da obtenção de ácido hialúrônico de peso molecular elevado através da cultura de micro- organismos é como se segue.

Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) é selecionado como um micro-organismo produtor de ácido hialurônico, e é cultivado em um fer- mentadorde?75Lcom glicose (40 a 100 g/L), extrato. de levedura (2 a 59/L), peptona de caseina (10 a 20 g/L), sulfato de magnésio (0,5 a 1 9/L), di- 1 hidrogênio fosfato de potássio (1 a 5 g/L), cloreto de sódio (2 a 10 g/L), ácido glutâmico (0,1 à 1 g/L) em pH 6,0 a 7,0, a 32 - 37 *C, sob uma condição ae- róbica de 0,1 a 1 vm. Depois, o ácido hialurônico tendo pesos moleculares médios de 2.000.000 a 4.000.000 Da é produzido com a produtividade em uma faixa de 4 a 6 g/L.

A partir de uma cultura contendo ácido hialurônico, um micro- organismo é removido através de um método conhecido tal como centrifuga- ção, prensa de filtro, filtro de profundidade, e filtração por membrana. Em seguida, o filtrado é usado como o ácido hialurônico de peso molecular ele- vado na presente invenção.

Na presente invenção, o ácido hialurônico de peso molecular e- levado é decomposto em ácido hialurônico de baixo peso molecular tendo uma faixa específica de peso molecular médio, por carvão ativado, e outras condições de conversão de peso molecular baixo.

A presente invenção fornece um método para à preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular que compreende a etapa de levar

| o ácido hialurônico em contato com carvão ativado. x O método da invenção é caracterizado pelo fato de que compre- ende à etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado, Na presente invenção, o ácido hialurônico ((HA), Hyaluronan, (CrHoNNAO 4) n(n>1000)) é um polimero existente em todos os organis- mos vivos, e é um polissacarideo, chamado glicosaminoglicano. Ele possui uma estrutura mostrada na figura 1. Na presente invenção, o ácido hialurônico pode ser obtido à par- tirde um tecido biológico tal como crista de galinha através da purificação, e pode ser produzido a partir de um micro-organismo transformado através de um método de engenharia genética. O ácido hialurônico utilizado como uma matéria-prima na presente invenção pode ser preparado pelo método acima descrito, ou adquirido de fontes comerciais. O peso molecular médio do áci- do hialurônico utilizado no método da presente invenção não é particular- 1 15 mente limitado, Por exemplo, o. peso molecular médio do ácido hialurônico utilizado na presente invenção pode variar de 100.000 Da a 13.000.000 Da, T de. 1.000.000 Da a 13.000.000 Da, de 3.500.000 Da a 13.000.000 Da, de

3.500.000 Da a 10:000.000 Da, de 3 500.000 Da a 8.000,000 Da, de prefe- rência variar de 3,500.000 Da à 13.000.000 Da, é mais preferivelmente vari- arde3500.000 Da a 8.000.000 Da. Em uma forma de realização da presente invenção, o Strepto- Coccus sp. ID9102 (KCTC11395BP) capaz de produzir ácido hialurônico foi selecionado como um micro-organismo, produtor de ácido hialurônico, e foi cultivado em um fermentador de 75 L"com glicose (40 a 100 g/L), extrato de

25. » levedura (2 a 5 g/L), peptona de caseina (10 a 20 g/L) sulfato de magnésio (0,5 a 1 g/L), di-hidrogênio fosfato de potássio (1 a 5 g/L), cloreto de sódio (2 à 10 9/L), ácido glutâmico (0,1. 1 g/L), em/pH 6,0 a 7,0, a 32 - 37 “C, sob uma condição aeróbica de 0,1 à 1 vm de modo a obter o ácido hialurônico, O carvão ativado indica um material carbonáceo tendo adsortivi- dade elevada. É obtido pelo tratamento de madeira, línhita, ou turfa com um ativador tal como cloreto de zinco ou ácido fosfórico, seguido por secagem, ou é obtido através da ativação de carvão vegetal com vapor de água. Em geral, o carvão ativado é produzido em um estado de pó ou em um estado » de partícula. O carvão ativado tipo pó pode ser produzido em carvão ativado tipo partícula para utilização. É usado principalmente como um adsorvente para a absorção de gases ou umidade, e pode ser usado para vários propó- sitostais como à recuperação de solvente, purificação de gás, descoloração, ou similar.

Na presente invenção, o carvão ativado pode ser preparado dire- tamente, ou adquirido de fontes comerciais. Não há qualquer limitação espe- cífica do tipo de carvão ativado usado na presente invenção. Por exemplo, pode ser carvão ativado granular, carvão ativado em pó, ou carvão ativado granulado, e de preferência pode ser carvão ativado em pó. O carvão ativa- do em pó pode ser obtido por um método de ativação de vapor ou um méto- do de ativação química. Não existe nenhuma limitação específica no método de ativação.

. 15 Na etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão a- tivado, não existe nenhuma limitação específica no método de contato. De " preferência, um meio de cultura purificado contendo ácido hialurônico prepa- rado por um método de cultura de micro-organismo, ou uma solução diluente de ácido hialurônico contendo ácido hialurônico diluído em um solvente pode ser dispersa em carvão ativado. O solvente para diluir o ácido hialurônico não é particularmente limitado. Por exemplo, pode ser água ou um solvente misturado de álcool inferior tendo de 1 a 6 átomos de carbono e água. De preferência, pode ser água.

No meio de cultura purificado contendo ácido hialurônico ou na solução diluente de ácido hialurônico, a concentração de ácido hialurônico não é particularmente limitada, e pode variar de 0,01 a 90 %, de 0,1 a 50 %, de 0,1 a 30 %, ou de 0,1 a 10 %. De preferência, pode variar de 0,1 a 10%.

Através do contato, uma reação do ácido hialurônico é motivada. Como um resultado, o peso molecular é reduzido. A reação indica um fenô- menoem uma resposta ao estímulo, ou uma mudança química que ocorre entre os materiais.

O método da presente invenção pode ter outras etapas para a colheita de ácido hialurônico da solução de reação após a reação ter sido * concluída.

Qualquer método está disponível para a colheita de ácido hialurô- nico a partir da solução de reação, contanto que ele seja bem conhecido com relação ao método de isolamento e purificação.

Geralmente, a centrifu- gação, filtração e outras mais podem ser executadas para a remoção de carvão ativado e eletroforese e várias cromatografias de coluna também po- dem ser executadas.

Para as cromatografias, a cromatografia de troca iôni- ca, cromatografia de filtração em gel, HPLC, cromatografia de fase reversa, cromatografia de coluna por afinidade isoladamente ou em suas combina- ções, podem ser utilizadas para a colheita de ácido hialurônico.

O método da presente invenção possui um efeito sobre a redu- ção do peso molecular do ácido hialurônico.

Na presente invenção, não há nenhuma limitação específica na relação de ácido hialurônico e carvão ativado.

Preferivelmente, a relação . 15 podevariardesde1:2a1:6, Na presente invenção, não há nenhuma limitação específica na ' temperatura e tempo requerido para levar o ácido hialurônico em contato com o carvão ativado.

Eles podem variar de acordo com o peso molecular do ácido hialurônico antes do contato com o carvão ativado, e o peso mole- cular requerido do ácido hialurônico.

Preferivelmente, a temperatura pode variar entre 25 ºC a 45 ºC, e mais preferivelmente a temperatura pode variar entre 35 ºC a 45 ºC.

O tempo pode preferivelmente variar de 3 a 18 horas, e mais preferivelmente variar de 6 a 18 horas.

Quando a relação de carvão ativado ou a temperatura de conta- to aumenta, uma relação de redução do peso molecular de ácido hialurônico por unidade de tempo aumenta.

Quando o tempo de contato aumenta, o pe- so molecular médio de ácido hialurônico obtido após o contato diminui.

O peso molecular médio de ácido hialurônico preparado pelo método da inven- ção pode variar de acordo com o peso molecular do ácido hialurônico antes do contato com carvão ativado, a relação de carvão ativado, a temperatura de contato, e o tempo de contato.

Assim, não é particularmente limitado.

Por exemplo, o peso molecular médio de ácido hialurônico produzido na presen- | te invenção pode variar de 10.000 Da a 3.000.000 Da, de 10.000 Da a * 100.000 Da, de 100.000 Da a 500.000 Da, de 500.000 Da a 1.000.000 Da, de 1.000.000 Da a 2.000.000 Da, de 2.000.000 Da a 3.000.000 Da, de

3.000.000 Da a 4.000.000 Da, de 4.000.000 Da a 5.000.000 Da, de

5.000.000 Da a 6.000.000 Da, de 6.000.000 Da a 7.000.000 Da, de

7.000.000 Da a 8.000.000 Da, de 8.000.000 Da a 9.000.000 Da. De prefe- rência, pode variar de 10.000 Da a 3.000.000 Da, e mais preferivelmente pode variar de 10.000 Da a 2.000.000 Da. O método da presente invenção possui um processo simples, e tem fatores facilmente controláveis (tais como a quantidade de carvão ativa- do, temperatura e tempo) para controlar uma relação de redução de um pe- so molecular de ácido hialurônico. De acordo com uma mudança de fatores de controle, a relação de redução de um peso molecular de ácido hialurônico é relativamente alterada de forma regular. Isto é muito útil na preparação de . 15 ácido hialurônico tendo um peso molecular predeterminado. Também, tal característica pode remover uma grande quantidade de endotoxina contida ' em um meio de cultura num caso onde o ácido hialurônico é preparado por uma cultura de micro-organismos.

De acordo com o método de preparação da presente invenção, é possível produzir eficientemente o ácido hialurônico tendo um peso molecu- lar específico por um processo simples. Da mesma forma, é possível ajustar facilmente e de forma estável o peso molecular do ácido hialurônico produzi- do através do ajuste da quantidade de carvão ativado, da temperatura e do tempo.

Enquanto isso, a presente invenção fornece um método para a diminuição do peso molecular do ácido hialurônico compreendendo a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.

É descrito pela primeira vez na presente invenção à redução do peso molecular do ácido hialurônico mediante a condução do ácido hialurô- —nicoem contato com o carvão ativado.

No método da presente invenção, o ácido hialurônico a ser lava- do em contanto com o carvão ativado, o peso molecular do ácido hialurôni-

co, o carvão ativado, e o tipo de carvão ativado, uma relação de ácido hialu- . rônico para o carvão ativado, um método de contato, uma condição de con- tato (solvente, concentração do ácido hialurônico, e similares), uma tempera- tura de contato, um tempo de contato, um efeito de contato, um peso mole- cularreduzido do ácido hialurônico obtido após ser levado em contato com carvão ativado, e outros efeitos são os mesmos como aqueles descritos no método de preparação acima.

Estas características da presente invenção podem ser facilmente compreendidas com referência aos exemplos da presente invenção.

De acordo com um exemplo da presente invenção, um micro- organismo Streptococcus sp. que produz ácido hialurônico foi cultivado de modo a produzir o ácido hialurônico. Em seguida, o ácido hialurônico foi puri- ficado. O carvão ativado com várias relações foi disperso no meio de cultura, purificado e foi colocado em contato com o ácido hialurônico sob várias con- « 15 diçõesde temperatura com vários tempos. Depois, o ácido hialurônico foi coletado, e o seu peso molecular foi medido.

' Sob uma condição de 25 ºC a 45 ºC, quando o ácido hialurônico foi colocado em contato com carvão ativado durante 3 a 18 horas, ácido hia- lurônico de 3.500.000 Da foi preparado em ácido hialurônico tendo vários pesos moleculares de 10.000 Da a 3.000.000 Da.

De acordo com outro exemplo da presente invenção, o ácido hialurônico extraído e purificado da crista de galinha foi utilizado na mesma experiência através de diluição. Depois, o resultado foi medido.

Como um resultado, quando o ácido hialurônico extraí- — do/purificado da crista de galinha foi utilizado, foi possível preparar o ácido hialurônico tendo um peso molecular reduzido da mesma maneira como a- quele na cultura de um micro-organismo produtor de ácido hialurônico.

Assim, através do método da presente invenção, é possível re- duzir eficazmente o peso molecular do ácido hialurônico, independente de um método de preparação de ácido hialurônico ou uma condição de contato entre o ácido hialurônico e o carvão ativado.

Em um exemplo da presente invenção, 1 t de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 3.500.000 Da foi cultivado, e foi reagido , com carvão ativado em uma quantidade de 4 vezes o peso de ácido hialurô- nico durante 4 horas em uma temperatura de reação de 45 ºC. Em seguida, o ácido hialurônico com um peso molecular médio de 2.000.000 Da foi pre- parado.

Em outros exemplos da presente invenção, sob a mesma condi- ção como aquela do exemplo acima, para vários tempos de reação de 6, 7 ou 8 horas, o ácido hialurônico foi preparado, e o peso molecular médio foi medido. Como um resultado, de acordo com o tempo de reação, o ácido hia- lurônico com pesos moleculares médios de 1.000.000 Da, 500.000 Da e

100.000 Da foi preparado.

Consequentemente, no método da invenção, é possível facil- mente ajustar o peso molecular do ácido hialurônico mediante o ajuste de vários fatores tais como a relação de carvão ativado, a temperatura, o tempo « 15 dereação. Além disso, o método da invenção é um método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular de alta qualidade industrial- ' mente aplicável. Efeitos Vantajosos O método da presente invenção para diminuir um peso molecu- lardo ácido hialurônico de peso molecular elevado possui um processo con- veniente sem o inconveniente de reprocessamento para a remoção dos ma- teriais de entrada, ou que requeria tratamento de pH, vários catalisadores de reação, e complicadas condições de tratamento adicionais (tais como o tra- tamento térmico) como em um método convencional. Além disso, o método possuium «efeito para a remoção de impurezas. Assim, através do método, é possível conveniente e economicamente produzir o ácido hialurônico de bai- xo peso molecular com elevada pureza. O método da invenção para diminuir o peso molecular tem uma vantagem em que de acordo com uma mudança de uma condição de reação usando o carvão ativado, o peso molecular do ácido hialurônico de baixo peso molecular pode ser variavelmente ajustado. O ácido hialurônico de baixo peso molecular produzido pelo método da pre- sente invenção pode ser produzido em conformidade com os padrões dos suprimentos médicos enquanto que as próprias características do ácido hia- “* lurônico podem ser mantidas.

Da mesma forma, pode ser produzido em con- formidade com os padrões de cosméticos ou alimentos.

Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra uma unidade de repetição de ácido hialurônico, que é composta de ácido D-glucurônico e N-acetilglucosamina alternantes, ligados entre si através da alternância de B-1,3 e B-1,4; a figura 2 é um gráfico que mostra a mudança de peso molecular do ácido hialurônico de acordo com vários tipos de carvão ativado e respec- tivas concentrações em 25 ºC (2X, 4X, 6X: quantidade de carvão ativado administrado em relação ao ácido hialurônico, CAI, CGSP, CASP, CN1, SX- PLUS, SX-ULTRA, DARCO KBB, DARCO A-51: o tipo de carvão ativado usado, Noritê CA1, Noritê CGSP, Noritê CASP, Norit&ê CN1, Noritê& SX- PLUS, Norit& SX-ULTRA, Noritê DARCO KBB, Noritê DARCO A-51); «15 a figura 3 é um gráfico que mostra a mudança de peso molecular do ácido hialurônico de acordo com vários tipos de carvão ativado, e as res- ' pectivas concentrações a 35 ºC (2X, 4X, 6X: quantidade de carvão ativado administrado em relação ao ácido hialurônico, CA1, CGSP, CASP, CN1, S- 51HF, SA-SUPER, SX-PLUS, SX-1G, SX-ULTRA, PAC-200C, DARCO KBB, DARCO A-51: o tipo de carvão ativado usado, Norit& CA1, Noritê CGSP, Noritê CASP, Norit& CN1, Noritê S-51HF, Noritê SA-SUPER, Noritê SX- PLUS, Norit& SX-1G, Noritê SX-ULTRA, Norit& PAC-200C, Noritê DARCO KBB, Noritê DARCO A-51) e a figura 4 é um gráfico que mostra a mudança de peso molecular doácido hialurônico de acordo com vários tipos de carvão ativado, e as res- pectivas concentrações em 45 ºC (2X, 4X, 6X: quantidade de carvão ativado administrado em relação ao ácido hialurônico, CA1, CGSP, CASP, CN1, S- 51HF, SA-SUPER, SX-PLUS, SX-1G, SX-ULTRA, PAC-200C, DARCO KBB, DARCO A-51: o tipo de carvão ativado usado, Norit& CA1, Noritê CGSP, —Noritê CASP, Noritê CN1, Noritê S-51HF, Noritê SA-SUPER, Noritê SX- PLUS, Norit& SX-1G, Noritê SX-ULTRA, Norit& PAC-200C, Noritê DARCO KBB, Noritê DARCO A-51).

Modo para a Invenção 7 Daqui em diante, as formas de realização exemplares da pre- sente invenção serão descritas com referência aos desenhos anexos.

Na presente invenção, uma concentração de ácido hialurônico existente em uma solução foi observada por um método de carbazol (T.

Bit- ter, Anal.

Biochem., 1962, 4, 330-334). O peso molecular médio de ácido hialurônico foi obtido pela cromatografia em gel de (Narlin B.

Beaty et al.

Anal.

Biochem., 1985, 147, 387-395). As condições de análise incluem uma coluna de gel Toyo Soda TSK G6000PWXL, e uma fase móvel de 150 mM de NaCl, 3 mM de Na2HPO4 (pH 7,0), 0,02 % de NaN;. Para a detecção, um detector de índice de refração (Shodex) foi usado.

Como um material de referência, óxido de polietileno foi preparado na concentração de 2mg/Mt.

Como uma endotoxina, um reagente de LAL comercialmente disponível da Charles River Laboratories Koreia foi quantificado.

Dentro de um faixa menor . 15 doque uma diluiçãomúltipla efetiva máxima, a diluição múltipla foi definido como o ponto 3. Foi determinado que a partir de um grupo de controle nega- ' tivo, a endotoxina não foi detectada, e através de um controle de produto positivo, não houve nenhum fator de interferência da reação.

Nos exemplos abaixo, uma concentração de cada um de ácido hialurônico de peso molecular elevado extraído de um micro-organismo, e ácido hialurônico de peso molecular elevado extraído da crista de galinha é ajustada para um valor predeterminado, e depois o ácido hialurônico de bai- xo peso molecular é produzido de acordo com uma mudança de uma condi- ção de reação mediante o uso de carvão ativado como um meio para a pro- dução de ácido hialurônico de baixo peso molecular.

A mudança do peso molecular médio de ácido hialurônico de baixo peso molecular produzido será descrita mais tarde.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção e não se destinam a limitá-la.

Exemplo1 Método para a produção de ácido hialurônico de baixo peso mo- lecular mediante a utilização de carvão ativado CA1

Neste exemplo, como uma matéria-prima para a produção de á- 7 cido hialurônico de baixo peso molecular, uma composição purificada de uma cultura obtida através da cultura de Streptococcus sp. 1D9102 (KCTC11395BP) como um micro-organismo de produção foi usada. O peso molecular médio de ácido hialurônico incluido na matéria-prima é de

3.500.000 Da, e a concentração da endotoxina é muito maior do que 0,5 EU/mg. As condições de cultura são como se segue: Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) foi selecionado como um micro-organismo que produz ácido hialurônico, e é cultivado em um fer- mentador de 75 L contendo glicose (40 a 100 g/L), extrato de levedura (2 a 5 g/L), caseína de peptona (10 a 20 g/L), sulfato de magnésio (0,5 a 1 g/L), di- hidrogênio fosfato de potássio (1 a 5 g / L), cloreto de sódio (2 a 10 g/L), e ácido glutâmico (0,1 a 1 g/L), em pH 6,0 a 7,0, a 32 - 37 ºC, sob uma condi- . 15 ção aeróbica de 0,1 a 1 vm. As condições de reação básicas são como se segue: ' A fim de obter uma força de agitação apropriada e reatividade de ácido hialurônico purificado a partir da ultrafiltração e carvão ativado Norit& CA1 (a seguir referido como CA1, Norit, Netherlands, Norit& - carvões ativa- dos utilizados nos exemplos foram produzidos a partir de Norit), a concen- tração de ácido hialurônico foi ajustada para 2,5 g de HA/L. Depois, o ácido hialurônico foi introduzido em uma quantidade de 300 Mt em um béquer de vidro de 1 L, e carvão ativado CA1 foi introduzido em um béquer de vidro em uma concentração de duas vezes, 4 vezes e 6 vezes maiores do que a con- centração de ácido hialurônico. Depois, o impulsor (diâmetro 5 cm) produzi- do de teflon foi girado em uma taxa de 300 rpm enquanto que a condição de reação predeterminada foi mantida. De modo a impedir a mistura de impure- zas ou evaporação de um líquido de reação no valor máximo até a conclu- são da reação, as partes do impulsor diferentes daquela da parte de rotação — do impulsor foram lacradas com uma tampa. As temperaturas de reação fo- ram 25 ºC, 35 ºCe 45"C. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto-

xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio ' foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 1. De acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ativado CA1 aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurôni- co. A 25 ºC, sob uma condição de CA1 2X, durante 6 horas, 2.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos, e durante 18 horas, 1.500.000 Da de pe- so molecular foram obtidos. A 25 ºC, e CA1 4X, durante 18 horas, cerca de

1.000.000 Da de peso molecular foram obtidos, e em CA1 6X, durante 6 ho- ras, cerca de 1.000.000 Da de peso molecular foram obtidos, e durante 18 horas, 500.000 Da de peso molecular foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 ºC, embora a concentração tenha uma reatividade 2X menor do que aquela a 25 ºC, a capacidade de decomposição de peso molecular foi semelhante àquela a 25 ºC. A 35 ºC, com 6X, durante 18 ho- -« 15 ras,130.000 Da de peso molecular foram obtidos. Em um caso onde a rea- ção foi realizada a 45 ºC, embora a concentração tenha uma reatividade 2X ' menor do que a 35 ºC, a capacidade de decomposição de peso molecular foi semelhante àquela a 35 ºC. Com 6X, 15.000 Da de peso molecular foram obtidos. Sob todas as condições de reação, à endotoxina foi menor do que 0,5EU/mg. Da mesma forma, verificou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina. Também, a concen- tração de ácido hialurônico foi mantida a 92 % ou mais, sob todas as condi- ções de reação. Assim, verificou-se que não há nenhuma preocupação so- bre a perda de ácido hialurônico. Tabela 1 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado CA1 Temp. | Sene-de | MW. kDa —| EndotorinaEUmg | gHAL | TESE a efe a [ato vado 2060 [1485] =05 | sos | <os 26 2C) ax [3519 1485/9094 sos] <os | <o5 252246204

' Temp. cone: de MW, kDa Endotoxina, EU/mg g HAL Rxn |9AMVão ati; | sn jaen) 36 | 6h ENS 6hh1sh vado e e ame es [rsricoos | =om [caos parenãa 45ºC 4x 3519 | 473 | 129 | <0,005 | <0,005 45" Exemplo 2 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado CGSP O ácido hialurônico e a condição de reação do exemplo 1 foram utilizados exceto Noritê CGSP (daqui em diante CGSP) em vez de carvão ativado CA1 como um meio para a produção de ácido hialurônico de baixo peso molecular para executar a análise comparativa de produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular. . Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio . foram analisados de acordo com o método de análise.

O resultado é men- cionado na tabela 2. Como o carvão ativado CA1, de acordo com um au- mento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição do carvão ativado CGSP aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico.

A 25 ºC, sob uma condição de CGSP 4X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos, e 6x durante 18 horas, 500.000 Da de peso molecular foram obtidos.

Em um caso onde a reação foi realizada a 35 ºC, embora a concentração tenha uma rea- tividade 2X menor do que aquela a 25 ºC, a capacidade de decomposição de peso molecular foi semelhante àquela a 25 ºC.

Especialmente, no caso de 6x a 45 ºC, o resultado obtido a 10.000 Da de peso molecular.

Nestas condições de reação, os inventores confirmaram que a endotoxina foi menos do que 0,5 EU/mg.

Tal como o resultado de CA1, observou-se que um au- mento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxi- na Também, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições de reação.

Assim, os inventores confir- maram esta estabilidade do ácido hialurônico e o efeito do carvão ativado |

CGSP. ' Tabela 2 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado CGSP Temp. Conc. del MWkDa | Endotoxina | EU/mg T gHA/L IPANDNmENTITnNDO ativado 25 de te ao os 25ºC ax [3449 [2263 l1015/)<05 |<05 |<o5 52 25ºC ex 3449 [1456 513 <o5 |<o5 cos pas cisto 35ºc jax — Ja449 [1515 503 [<0,05 [<0,05 [<0,05 1251 [2,50 [2,41 asse x — ja449 814 534 /<0,005 /<0,005 |<0,005 (248 /12,42 2,39 45º ax — ja449 |asz 139 |<0,005 |<0,005 |<0,005 2,47 [2,45 [2,34 Exemplo 3 . 5 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado CASP " A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& CASP (daqui em diante CASP) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa de produtividade do ácido hialurônico de baixo peso molecular.

Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 3. Tal como o carvão ativado CA1 e CGSP, de acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decom- posição de carvão ativado CASP também aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 25 ºC, sob uma condição de CASP 4X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 ºC, embora a concentração tivesse uma reatividade 2X menor do que a 25 ºC a capacida- de de decomposição do peso molecular foi semelhante àquela a 25 ºC. No caso de 45 ºC, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 2x durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 5.000.000 Da de " ácido hialurônico foram obtidos e no caso de 28, durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 500.000 Da, 18 h, 100.000 Da de ácido hialurônico foram obti- dos.

No caso de 6x, a capacidade de decomposição foi aumentada mais al- tamente, portanto, os presentes inventores confirmaram que durante 6 h, 15,000 Da e durante 18 horas, 12.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos.

Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina tal como o resultado de CA1 e CGSP.

Da mesma forma, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições de reação de CASP.

Tabela 3 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado CASP Temp. cone. de/ — mw, kDa carvão EEE fe : 2x [340 <os 2218 25C| 6x [3409 s55 x 1515 | 483 246 1015 [129 |45º0 | 2x [3409 918 [513 [<0.005/<0,005/<0,005] 2.50 | 247 | 2,32 | a5c| 4x |3519| 263 126 [re] oe Tane| so [so [asmbaaminos[220] 2 238 Exemplo 4 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado CN1., A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& CN1 (daqui em diante CN1) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.

Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto-

xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio " foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 4. De acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ativado CASP também aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 25 ºC, sob uma condição de CN1 4X, durante 18 horas,

1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a rea- ção foi realizada a 35 ºC, a capacidade de decomposição foi altamente au- mentada e no caso de 4x durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h,

5.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. No caso de 45 ºC, 2x du- rante 6 h, 1.000.000 Da, 4x durante 6 h 500.000 Da de ácido hialurônico fo- ram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é efi- caz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resul- - 15 tados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de CN1. ] Tabela 4 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado CN1 remo. [Eone: dem, kDa EM EE Dr er en oo ee fe pn ár fas ativado 25º€ s5ºc s5ºc bc fax sore [1oss ja6a [c0,005 [en,005 [0,005 2.5 [2,47 2.35 | sc lex — fast os 111 J<ooos Exemplo 5 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado S-51HF A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit6& S-

51HF (daqui em diante S-51HF) em vez de carvão ativado CA1 para execu- " tar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo pe- so molecular. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 5. De acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ativado S-51HF também aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 35 ºC, sob uma condição de S-51HF 6X, durante 6 horas,

1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a rea- ção foi realizada a 45 ºC, 2x durante 6 h, 1.000.000 Da, 4x durante 6 h,

5.000,000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e em caso de 6x durante 18h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confir- - 15 maramquea endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endoto- xina mesmo como o resultado dos resultados acima. Da mesma forma, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições de reação de S-51HF. Tabela 5 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado 51HF Conc.de [MWKDa — EndotoxinaEUMmg — gHAL — | Em ea cn enfer sn en Den snleio <0,05 | < 0,05 [2,51 [2,46/2,44 x <0,05 HST | x 2600/242|13| <0,005 |=0,005/<0,005]2,47 [2,462,38 Exemplo 6 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- | cular utilizando carvão ativado SA-SUPER A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada, exceto Norit& SA-SUPER (aqui em diante SA-SUPER) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de bai- ' xo peso molecular. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 6. A 35 ºC, sob uma condição de SA-SUPER 2X e 4X, durante 18 horas, 500.000 Da, em condição de 6X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a en- dotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Também, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SA-SUPER. Tabela 6 - 15 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado SA-

SUPER : Iremp. Conc. de MW, kDa Endotoxina, EU/mg g HA/L Bra Dr be je bs pe ar cn in fas ativado B5º€ DX [35ºC ex 12944 |1318 |555 [cedo Caran aa Tear nas io 45º€ [ox 3650 1578 jas2 |<0,005 [<0,005 |<0,005 [2,47 [2,45

EA 45ºC sx 2642 1206 13 —J<o,005 |<0,005 [<0,005 [2,5 [2,43 [2,35 | Exemplo 7 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado SX-PLUS A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& SX-PLUS (daqui em diante SX-PLUS) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de bai- xo peso molecular. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- ' cionado na tabela 7. A 25 ºC, sob uma condição de SX-SUPER 6X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 35 ºC 2X du- rante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 4x durante 18 h,500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 ºC 2X durante 6 h,

1.000.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os invento- res confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou- se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxinamesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SX-PLUS. Tabela 7 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado SX-PLUS cConc. delMW,kDa — = Endotoxina, EU/mg ' Temp. carvão IRxn s 18h 6h 18h ativado . “o BOX [sb TE] 05 05 [24 25º ax 3171 1795] 899 | <0,5 | <0,5 | <o5 |2,50 3092 [1426] 599 | <05 3176 [1966] 545 <005 | <0,05 B5ºC AX 2779 1271] 559 | <0,05 | <0,05| <0,05 2,39 B5ºC fox [2704 | 897 | 322 | <0,05 | <0,05| <0,05 [2,41 2,33 45C x 2897 [1074] 348 | <0,005 |<0,005 2,53 145ºC x 2673 | 519 | 144 | <0,005 | <0,005 5º 6x 2426 10 Exemplo8 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado SX-1G A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& SX-1G (daqui em diante SX-1G) em vez de carvão ativado CA1 para execu- tara análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo pe- so molecular. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- ' cionado na [Tabela 8]. A 35 ºC, 6X durante 6 h, 1.000.000 Da, e durante 18 h 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 ºC 2X durante 18 h,

500.000 Da, 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. A- lém disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SX-1G. Tabela 8 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado SX-1G Temp. jde car- TERA a ab e eo . vado 35ºC bx — |3529 aos 1241 [< 0.05 |< 0,05 [< 0.05 [2,54 "> bre dec 6rro hisso ez B50c ox — Ésoos f1osa 427 5ºc x — 971 loss 45ºc Exemplo 9 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado SK-ULTRA A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& SX-ULTRA (daqui em diante SX-ULTRA) em vez de carvão ativado CA1 pa- ra executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.

' 20 Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na [tabela 9]. A 25 ºC, sob uma condição de SX-ULTRA 4X, durante

18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 35 ºC 2X du- ' rante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 4x durante 18 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 ºC 2X durante 6 h,

1.000.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e6xdurante18h,10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os invento- res confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou- se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todasas condições da reação de SX-ULTRA. Tabela 9 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado SX-

ULTRA Conc. | MWkDa | Endotoxina, EU/mg g HA/L Temp. jde car. PERSA oo : vado <os p5ºc ax 1795 2,47 psºc lx — 3092/1426) 509 | <0,5 | <0,5 | <0,5 2,40/2,46/2,41 Bro di aimed. 966 2,46 2779 | 1271 | 559 s5ºc 145º <0,005 241 Exemplo 10 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular com carvão ativado PAC-200C A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& PAC-200C (daqui em diante PAC-200C) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de bai- xopesomolecular.

Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- ' xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 10. A 35 ºC 6X durante 6 h, 1.000.000 Da de ácido hialu- rônico foram obtidos. A 45 ºC 2X durante 18 h, 500.000 Da, 4x durante 6 h,

1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a en- dotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Da mesma forma, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as con- dições da reação de PAC-200C. Tabela 10 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado PAC- * 15 200C temp, Conc. de Endotoxina, EU/mg ss lee cr a e sele vado 1478 2,80 L2ro —m genitenzes soa <008 <008, 2,60 acl x 1893 915 365 2,50 Exemplo 11 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado DARCO KBB A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Norit& —"DARCO RBB (daqui em diante PAC-200C) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é men- cionado na tabela 11. A 25 *ºC4X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialu- rônico foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 ºC, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 2x du- rante 18h, 1.000.000 Da, 4x durante 18 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 ºC, 2x durante 18 h, 500.000 Da, 4x durante 6 h,

500.000 Da, 6X durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. A- lém disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 92 % ou mais sob todas as condições da reação de DARCO KBB. Tabela 11 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado DARCO - 15 KBB Temp. so de MW, kDa Endotoxina, EU/mg Rim anão fa pa er) nd ET 25º fax |3380 [2500 [1454 [<o5 %<os 1<os 50 247 /232] 25º ex 83380 11426 ja410 |<o5 <os eos 1252 [2,39 2,39 [s5ºc lex — bBsso fosa [123 |<0,05 [<0,05 [<0,05 251 [2,45 12,38 | E o eat |a5ºC 6x s346 15 jo — j<o,005 [<0,005 [<0,005 12,51 [2,44 [2.40 Exemplo 12 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular utilizando carvão ativado DARCO A-51 A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto Noritê DARCO A-51 (daqui em diante PAC-A-51) em vez de carvão ativado CAI para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.

Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma endoto- " xina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise.

O resultado é men- cionado na tabela 12. A 25 ºC, 4X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hia- lurônico foram obtidos.

Em um caso em que a reação foi realizada a 35 “C, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 6x du- rante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 100.000 Da de ácido hialurônico fo- ram obtidos.

A 45 ºC, 2x durante 18 h, 500.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da, 6X durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos.

Os in- ventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e ob- servou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima.

A- lém disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de DARCO A-51. * 15 Tabela 12 . Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado DARCO A-51 RE ana Do mao ativado | 25º fox Bs54 2527 asoj<o5 |<os 25º ax Basa faro [os os eos 25º ox 35º 2X 3311 1965 898 |- 0,05 /)<0,05 leo,05 b.54 2,46 85º c ox sc bx => zo mst aos [<0.005 <o.005 [<0.005 12.49 2.43 12.34 | asc x —Bizs fao2 hz [0.005 [<o.00s leocos as lat aa focar au fo e Tacos one fone Dam bas 2,34 Exemplo 13 Método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso mole- cular derivado de crista de galinha No presente exemplo, a matéria-prima de ácido hialurônico de peso molecular elevado foi extraída e purificada a partir da crista de galinha,

e seu peso molecular médio foi 3.500.000 Da.

7 Nesta experiência, o carvão ativado CA1 foi selecionado como um ajustador do peso molecular, e depois o resultado experimental de ácido hialurônico derivado da crista de galinha foi comparado com aquele do ácido hialurônico derivado de micro-organismo. Depois disto, a experiência será descrita com detalhes.

A concentração de matéria-prima de ácido hialurônico derivado da crista de galinha foi ajustada para 2,5 g de HA/L. Depois, o ácido hialurô- nico foi introduzido em uma quantidade de 300 Mt em um béquer de vidro de 1L,ecarvão ativado CA1 foi introduzido em um béquer de vidro a uma con- centração duas vezes, 4 vezes e 6 vezes maior do que a concentração de ácido hialurônico. Em seguida, o impulsor (diâmetro 5 cm) produzido de te- flon foi girado em uma taxa de 300 rpm. A fim de impedir a mistura de impu- rezas ou evaporação de um líquido de reação no valor máximo até a conclu- * 15 sãoda reação, as partes do impulsor diferentes da parte de rotação do im- : pulsor foram lacradas com uma cobertura. As temperaturas de reação foram 25ºC.

O resultado de ácido hialurônico derivado da crista de galinha como um grupo de controle foi comparado com aquele do exemplo 1. Após 3,6e18 horas, cada amostra foi coletada, e a mudança foi analisada. À mudança do peso molecular médio de ácido hialurônico derivado da crista de galinha é mencionada na tabela 13.

Observou-se que o ácido hialurônico derivado da crista de gali- nha foi decomposto por carvão ativado CA1 da mesma maneira como aque- lenoácido hialurônico derivado de micro-organismo do exemplo 1. Isto indi- ca que não há diferença no processo de redução de peso molecular entre à matéria-prima derivada de micro-organismo e a matéria-prima derivada da crista de galinha.

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Tabela 13 ' Mudanças de peso molecular do ácido hialurônico derivado de crista de galinha = Origem do ácido hialurô. Cone. de NI, kDa ico carvão ati- ENE 18h vado micro-organismo | cataX | 3519

SST CORE CCI ERES micro-organismo 3519 Crista de galinha ea sm mo os | Crista de galinha 3519 | 994 751 Crista de galinha 3314 Exemplo 14 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 2.000.000 Da em um processo industrial Em um fermentador de 1 ton, Streptococcus sp. ID9102 - (KCTC11395BP) foi cultivado sob a mesma condição de meio de cultura conforme descrito no exemplo 1 de modo a obter 500 L de cultura. Esta cul- ] tura foi purificada de modo a produzir uma composição de 500 L. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi de 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito mai- or do que 5,0 EU/mg. O carvão ativado foi selecionado como um ajustador do peso molecular, e foi introduzido em uma quantidade 4 vezes maior que a do áci- do hialurônico. A reação de redução do peso molecular foi realizada em um reator de 500 L revestido com Teflon, e a temperatura de reação foi 45 ºC. Após 4 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma concentração de ácido hialurônico do produ- to resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio deácidohialurônico foram medidos. Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialurôni- co foi 2.000.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi de 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos. O ácido hialurônico filtrado cujo peso molecular foi reduzido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialurônico tendo um : peso molecular médio de 2.000.000 Da. Exemplo 15 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso — molecularmédiode 1.000,000 Da em um processo industrial 500 L de composição de ácido hialurônico foram preparados sob a mesma condição como descrita no exemplo 14. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg. A condição de reação do carvão ativado foi a mesma no exem- plo 14, e o tempo de reação foi 6 horas. Após 6 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma con- centração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos, * 15 Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialurôni- . co foi 1.000.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a con- centração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos. O filtrado de ácido hialurônico cujo peso molecular foi reduzido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialurônico tendo umpeso molecular médio de 1.000.000 Da. Exemplo 16 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 500.000 Da em um processo industrial 500 L de composição de ácido hialurônico foram preparados sob a mesma condição como descrita no exemplo 14. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg. A condição de reação do carvão ativado foi a mesma no exem- plo 14, e o tempo de reação foi 7 horas. Após 7 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma con- centração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos.

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Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialurôni- : co foi 500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concen- tração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos.

O filtrado de ácido hialurônico cujo peso molecular foi reduzido foiprecipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 500.000 Da. Exemplo 17 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 100.000 Da em um processo industrial 500 L de composição de ácido hialurônico foram preparados sob a mesma condição como descrita no exemplo 14. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg.

A condição de reação do carvão ativado foi a mesma no exem- * 15 plo1i4,e0tempo de reação foi 8 horas. Após 8 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma con- centração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos.

Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialurôni- cofoi100.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concen- tração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos.

O filtrado de ácido hialurônico cujo peso molecular foi reduzido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 100.000 Da.

Através do exemplo 14 até o exemplo 17, os presentes invento- res desenvolveram um método para a produção de ácido hialurônico de bai- xo peso molecular de alta qualidade, que é fácil de aplicar na indústria. Aplicabilidade Industrial O método da presente invenção para diminuir um peso molecu- lardo ácido hialurônico de peso molecular elevado possui um processo con- veniente sem o inconveniente de reprocessamento para a remoção de mate- riais de entrada, ou que requeira tratamento de pH, vários catalisadores de

FE | reação, e complicadas condições de tratamento adicional (tais como o tra- 7 tamento térmico) como em um método convencional. Além disso, o método possui um efeito para a remoção de impurezas. Assim, através do método, é possível conveniente e economicamente produzir o ácido hialurônico de bai- xopesomolecular com elevada pureza. O método da invenção para diminuir o peso molecular possui uma vantagem em que de acordo com uma mudan- ça de uma condição de reação usando carvão ativado, o peso molecular do ácido hialurônico de baixo peso molecular pode ser ajustado de forma varia- da. O ácido hialurônico de baixo peso molecular produzido pelo método da presente invenção pode ser produzido em conformidade com os padrões de suprimentos médicos enquanto que a própria característica do ácido hialurô- nico pode ser mantida. Também, pode ser produzido em conformidade com os padrões de cosméticos ou alimentos.

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Claims

REIVINDICAÇÕES : 1. Método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular compreendendo a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com o carvão ativado.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a relação de ácido hialurônico para o carvão ativado é de 1:2 a 1:6.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a tempera- tura para levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado é de 25 ºC a 45 ºC, e o tempo para levar o ácido hialurônico em contato com o carvão ativadoéde3ha18h.
4. Método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico compreendendo a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.

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