BR112012005816B1 - método para a fabricação de ácido hialurônico de baixo peso molecular - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO DE BAIXO PESO MOLECULAR. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular a partir do ácido hialurônico de peso molecular elevado que é produzido por Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP). Mais especificamente, a invenção está relacionada a um método de reduzir o peso molecular do ácido hialurônico uniformemente mediante a reação do ácido hialurônico de peso molecular elevado com um carvão ativado em certa condição de decomposição enquanto mantém a sua propriedade original. O método da invenção para diminuir o peso molecular de ácido hialurônico de peso molecular elevado possui um processo conveniente sem o inconveniente de reprocessamento para a remoção de materiais de entrada, ou que requeira tratamento de pH, vários catalisadores de reação, e complicadas condições de tratamento adicionais (tais como o tratamento térmico) como em um método convencional. Além disso, o método possui um efeito para a remoção de impurezas. Assim, através do método, é possível conveniente e economicamente produzir ácido hialurônico de baixo peso molecular com elevada pureza. O método da invenção para diminuir o peso molecular possui uma vantagem em que de acordo com uma mudança de uma (...).
Description
[001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido de Patente Coreano No. 10-2009-0087185, depositado em 15 de Setembro de 2010, o qual é aqui incorporado por referência para todos os propósitos como se completamente aqui apresentado.
[002] A presente invenção refere-se a um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico de peso molecular elevado enquanto que as próprias características do ácido hialurônico de peso molecular elevado, tais como viscosidade, elasticidade e absorção de umidade são mantidas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método de produzir industrialmente o ácido hialurônico de baixo peso molecular aplicável de alta qualidade através do meio de decomposição a ser reagido com o ácido hialurônico, e condição de produção de baixo peso molecular eficiente.
[003] O ácido hialurônico ((HA), Hyaluronan, (C14H20NNaO11) n (n > 1000)) é um polímero que existe em todos os organismos vivos, e é um polissacarídeo, chamado glicosaminoglicano. Ele possui uma estrutura mostrada na figura 1, que é composta de ácido D-glucurônico e N- acetilglucosamina alternantes, ligados entre si através ligações glicosídi- cas β-1,3 e β-1,4 alternadas. É um material solúvel em água e o seu peso molecular utilizável tem uma ampla faixa de 1.000 a 13.000.000 Da (daltons). Também, possui uma estrutura de uma cadeia reta.
[004] O ácido hialurônico foi encontrado pela primeira vez em 1934 por Meyer e Palmer do humor vítreo de um olho de vaca, e é distribuído em abundância na pele, corpos vítreos óticos, líquido articular, músculos, cordões umbilicais, crista de galinha, etc. Assim, é obtido a partir desses órgãos através da separação e extração. Especialmente, é conhecido por estar presente dentro de uma placenta ou uma articulação em abundância, e é geralmente extraído da crista de galinha. No entanto, sabe-se que na produção de ácido hialurônico a partir de tecidos biológicos, é difícil separar um polímero tal como condroitina, e há uma preocupação sobre os materiais patogênicos de origem animal.
[005] O ácido hialurônico com estrutura de sal mostra uma eleva da eficácia e um elevado efeito, e mostra um forte efeito lubrificante em um estado de atrito físico, devido ao seu elevado efeito umectante. Da mesma forma, possui as vantagens preferíveis em vários efeitos e propriedades tais como a proteção contra a invasão bacteriana, etc. Assim, o desenvolvimento de vários produtos usando o ácido hialurô- nico foi recentemente conduzido. Estas vantagens podem ser aplicadas aos suplementos médicos, materiais biológicos, e alimentos, assim como desempenhar um papel em suprimentos médicos ou cosméticos. Além disso, os novos campos à base de ácido hialurônico têm sido continuamente desenvolvidos.
[006] O ácido hialurônico de peso molecular elevado possui van tagens funcionais tais como viscosidade aumentada, lubrificação das articulações ativas, e absorção de umidade e elasticidade. Assim, seu uso tem sido ampliado para diversas áreas de suprimentos médicos, tais como oftálmica/injeção intra-articular do joelho ou colírios. Em consideração de um tremendo aumento recente de um mercado de ácido hialurônico em todo o mundo, espera-se que o derivado de ácido hialurônico seja desenvolvido.
[007] Ao contrário do ácido hialurônico de peso molecular eleva do, a potência do ácido hialurônico de baixo peso molecular tem sido subestimada. No entanto, a absorção do corpo de ácido hialurônico de baixo peso molecular foi recentemente estudada. Consequentemente, a utilização de ácido hialurônico de baixo peso molecular em cosméti- cos ou alimentos que requer a absorvência tecidual foi projetada. Assim, o desenvolvimento de ácido hialurônico de baixo peso molecular é requerido, e uma tecnologia para diminuir o peso molecular enquanto mantém a função característica do ácido hialurônico é requerida.
[008] Um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurô- nico de peso molecular elevado tem sido relatado em muitas teses e patentes. Por exemplo, existe um método de hidrólise pelo ácido e base (Publicação de Patente Japonesa sho 63-57602, Publicação de Patente Pyung 1-266102, Y. Tokita et al., Polymer Degradation and Stability, 48, 269-273, 1995). Este método possui uma desvantagem em que um novo processo é adicionado, e após o tratamento, o pH tem que ser aumentado ou diminuído para um valor dentro de uma faixa padrão. No método, a taxa de variação do pH pode variar de acordo com a concentração de ácido hialurônico. Assim, fica difícil empregar o método em um processo de fabricação real. Também, observou-se que o ajuste do pH aumenta as impurezas, e especialmente aumenta o valor da endotoxina. Assim, um processo de purificação para remover as impurezas deve ser adicionado, aumentando assim o custo. Enquanto isso, em um método de decomposição por meio de ultrassom ou tratamento de aquecimento com alta temperatura em um pH apropriado, uma nova máquina é requerida de ser introduzida, e também em um processo de purificação, um custo desnecessário é originado adicionalmente. Da mesma forma, em um método que utiliza um agente oxidante tal como o ácido hipocloroso (Publi-cação de Patente Japonesa Pyung 2-245193), um método que utiliza pe- róxido de hidrogênio (Publicação de Patente Japonesa Pyung 2-22301), e um método para uso de uma capacidade de decomposição de perssul- fato de amônio (Patente Registrada Coreana 10-0369517), a hidrólise pode ser conseguido, mas um material de decomposição introduzido deve ser removido. Além disso, a produção de endotoxina ou outras impurezas pode causar baixa qualidade.
[009] Nos métodos acima mencionados para diminuir o peso mole cular do ácido hialurônico de peso molecular elevado, durante um processo de purificação, devido a um promotor de decomposição recentemente introduzido para o ajuste de um peso molecular, apenas uma ação de decomposição existe. Em outras palavras, em um processo de purificação, um processo de melhora da qualidade de uma matéria-prima tem que ser interrompido, e depois uma máquina adicional para o ajuste do peso molecular deve ser introduzida, e um custo adicional se origina. Assim, os métodos são ineficientes. Em outras palavras, o processo de tratamento torna-se mais complicada, e a adição de processos prolonga o tempo necessário, aumentando assim o custo. Na visão industrial de produção em massa, estes são fatores muito economicamente ineficientes.
[010] Portanto, os inventores da presente invenção pesquisaram um método para reduzir um peso molecular de ácido hialurônico de peso molecular elevado, em que a remoção de impurezas e o ajuste de um peso molecular podem ser obtidos de uma só vez. Depois, eles descobriram que quando o ácido hialurônico for colocado em contato com carvão ativado sob uma condição apropriada, o peso molecular médio de ácido hialurônico é diminuído. Com base nesta descoberta, eles completaram esta invenção.
[011] A presente invenção fornece um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico de peso molecular elevado. Mais particularmente a presente invenção fornece um método para economicamente produzir ácido hialurônico de baixo peso molecular de alta qualidade, em que os problemas de ineficiência de um método convencional, tais como a degradação da qualidade causada pela produção de impurezas, e aumento de custo causado pela adição de um processo complicado são resolvidos.
[012] Consequentemente, um objetivo da presente invenção é fornecer um método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular que compreende a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.
[013] Também, outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para diminuir o peso molecular do ácido hialurônico com-preendendo a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.
[014] Para atingir o objetivo acima mencionado, a presente in venção fornece um método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular que compreende a etapa de levar o ácido hialu- rônico em contato com carvão ativado.
[015] Para alcançar outro objetivo, a presente invenção fornece um método para reduzir o peso molecular do ácido hialurônico compreendendo a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.
[016] A presente invenção fornece um método de uso de carvão ativado como um meio de reação a fim de converter o ácido hialurôni- co de peso molecular elevado em ácido hialurônico de baixo peso molecular tendo um peso molecular predeterminado, em que o ácido hia- lurônico de peso molecular elevado é obtido através da cultura de micro-organismos, extração de crista de galinha, ou similar.
[017] O ácido hialurônico de peso molecular elevado utilizado na presente invenção pode ser obtido através da cultura de microorganismos, a extração de crista de galinha, ou similar. Um exemplo da obtenção de ácido hialurônico de peso molecular elevado através da cultura de micro-organismos é como se segue.
[018] Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) é selecionado como um micro-organismo produtor de ácido hialurônico, e é cultivado em um fermentador de 75 L com glicose (40 a 100 g/L), extrato de levedura (2 a 5 g/L), peptona de caseína (10 a 20 g/L), sulfato de magnésio (0,5 a 1 g/L), di-hidrogênio fosfato de potássio (1 a 5 g/L), cloreto de sódio (2 a 10 g/L), ácido glutâmico (0,1 a 1 g/L), em pH 6,0 a 7,0, a 32 - 37 °C, sob uma condição aeróbica de 0,1 a 1 vvm. Depois, o ácido hialurônico tendo pesos moleculares médios de 2.000.000 a 4.000.000 Da é produzido com a produtividade em uma faixa de 4 a 6 g/L.
[019] A partir de uma cultura contendo ácido hialurônico, um mi cro-organismo é removido através de um método conhecido tal como centrifugação, prensa de filtro, filtro de profundidade, e filtração por membrana. Em seguida, o filtrado é usado como o ácido hialurônico de peso molecular elevado na presente invenção.
[020] Na presente invenção, o ácido hialurônico de peso molecu lar elevado é decomposto em ácido hialurônico de baixo peso molecular tendo uma faixa específica de peso molecular médio, por carvão ativado, e outras condições de conversão de peso molecular baixo.
[021] A presente invenção fornece um método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular que compreende a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.
[022] O método da invenção é caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.
[023] Na presente invenção, o ácido hialurônico ((HA), Hyaluro nan, (C14H20NNaO11) n (n > 1000)) é um polímero existente em todos os organismos vivos, e é um polissacarídeo, chamado glicosaminogli- cano. Ele possui uma estrutura mostrada na figura 1.
[024] Na presente invenção, o ácido hialurônico pode ser obtido a partir de um tecido biológico tal como crista de galinha através da purificação, e pode ser produzido a partir de um micro-organismo transformado através de um método de engenharia genética. O ácido hialu- rônico utilizado como uma matéria-prima na presente invenção pode ser preparado pelo método acima descrito, ou adquirido de fontes comerciais. O peso molecular médio do ácido hialurônico utilizado no método da presente invenção não é particularmente limitado. Por exemplo, o peso molecular médio do ácido hialurônico utilizado na presente invenção pode variar de 100.000 Da a 13.000.000 Da, de 1.000.000 Da a 13.000.000 Da, de 3.500.000 Da a 13.000.000 Da, de 3.500.000 Da a 10.000.000 Da, de 3.500.000 Da a 8.000.000 Da, de preferência variar de 3.500.000 Da a 13.000.000 Da, e mais preferi-velmente variar de 3.500.000 Da a 8.000.000 Da.
[025] Em uma forma de realização da presente invenção, o Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) capaz de produzir ácido hialurônico foi selecionado como um micro-organismo produtor de ácido hialurônico, e foi cultivado em um fermentador de 75 L com glicose (40 a 100 g/L), extrato de levedura (2 a 5 g/L), peptona de caseína (10 a 20 g/L) sulfato de magnésio (0,5 a 1 g/L), di-hidrogênio fosfato de potássio (1 a 5 g/L), cloreto de sódio (2 a 10 g/L), ácido glutâmico (0,1 a 1 g/L), em pH 6,0 a 7,0, a 32 - 37 °C, sob uma condição aeróbica de 0,1 a 1 vvm de modo a obter o ácido hialurônico.
[026] O carvão ativado indica um material carbonáceo tendo ad- sortividade elevada. É obtido pelo tratamento de madeira, linhita, ou turfa com um ativador tal como cloreto de zinco ou ácido fosfórico, seguido por secagem, ou é obtido através da ativação de carvão vegetal com vapor de água. Em geral, o carvão ativado é produzido em um estado de pó ou em um estado de partícula. O carvão ativado tipo pó pode ser produzido em carvão ativado tipo partícula para utilização. É usado principalmente como um adsorvente para a absorção de gases ou umidade, e pode ser usado para vários propósitos tais como a recuperação de solvente, purificação de gás, descoloração, ou similar.
[027] Na presente invenção, o carvão ativado pode ser preparado diretamente, ou adquirido de fontes comerciais. Não há qualquer limitação específica do tipo de carvão ativado usado na presente invenção. Por exemplo, pode ser carvão ativado granular, carvão ativado em pó, ou carvão ativado granulado, e de preferência pode ser carvão ativado em pó. O carvão ativado em pó pode ser obtido por um método de ativação de vapor ou um método de ativação química. Não existe nenhuma limitação específica no método de ativação.
[028] Na etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado, não existe nenhuma limitação específica no método de contato. De preferência, um meio de cultura purificado contendo ácido hialurônico preparado por um método de cultura de micro-organismo, ou uma solução diluente de ácido hialurônico contendo ácido hialurônico diluído em um solvente pode ser dispersa em carvão ativado. O solvente para diluir o ácido hialurônico não é particularmente limitado. Por exemplo, pode ser água ou um solvente misturado de álcool inferior tendo de 1 a 6 átomos de carbono e água. De preferência, pode ser água.
[029] No meio de cultura purificado contendo ácido hialurônico ou na solução diluente de ácido hialurônico, a concentração de ácido hia- lurônico não é particularmente limitada, e pode variar de 0,01 a 90 %, de 0,1 a 50 %, de 0,1 a 30 %, ou de 0,1 a 10 %. De preferência, pode variar de 0,1 a 10 %.
[030] Através do contato, uma reação do ácido hialurônico é mo tivada. Como um resultado, o peso molecular é reduzido. A reação indica um fenômeno em uma resposta ao estímulo, ou uma mudança química que ocorre entre os materiais.
[031] O método da presente invenção pode ter outras etapas pa ra a colheita de ácido hialurônico da solução de reação após a reação ter sido concluída. Qualquer método está disponível para a colheita de ácido hialurônico a partir da solução de reação, contanto que ele seja bem conhecido com relação ao método de isolamento e purificação. Geralmente, a centrifugação, filtração e outras mais podem ser executadas para a remoção de carvão ativado e eletroforese e várias croma- tografias de coluna também podem ser executadas. Para as cromato- grafias, a cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel, HPLC, cromatografia de fase reversa, cromatografia de coluna por afinidade isoladamente ou em suas combinações, podem ser utilizadas para a colheita de ácido hialurônico.
[032] O método da presente invenção possui um efeito sobre a redução do peso molecular do ácido hialurônico.
[033] Na presente invenção, não há nenhuma limitação específi ca na relação de ácido hialurônico e carvão ativado. Preferivelmente, a relação pode variar desde 1:2 a 1:6.
[034] Na presente invenção, não há nenhuma limitação específi ca na temperatura e tempo requerido para levar o ácido hialurônico em contato com o carvão ativado. Eles podem variar de acordo com o peso molecular do ácido hialurônico antes do contato com o carvão ativado, e o peso molecular requerido do ácido hialurônico. Preferivelmente, a temperatura pode variar entre 25 °C a 45 °C, e mais preferivelmente a temperatura pode variar entre 35 °C a 45 °C. O tempo pode preferivelmente variar de 3 a 18 horas, e mais preferivelmente variar de 6 a 18 horas.
[035] Quando a relação de carvão ativado ou a temperatura de contato aumenta, uma relação de redução do peso molecular de ácido hialurônico por unidade de tempo aumenta. Quando o tempo de contato aumenta, o peso molecular médio de ácido hialurônico obtido após o contato diminui. O peso molecular médio de ácido hialurônico preparado pelo método da invenção pode variar de acordo com o peso molecular do ácido hialurônico antes do contato com carvão ativado, a relação de carvão ativado, a temperatura de contato, e o tempo de contato. Assim, não é particularmente limitado. Por exemplo, o peso molecular médio de ácido hialurônico produzido na presente invenção pode variar de 10.000 Da a 3.000.000 Da, de 10.000 Da a 100.000 Da, de 100.000 Da a 500.000 Da, de 500.000 Da a 1.000.000 Da, de 1.000.000 Da a 2.000.000 Da, de 2.000.000 Da a 3.000.000 Da, de 3.000.000 Da a 4.000.000 Da, de 4.000.000 Da a 5.000.000 Da, de 5.000.000 Da a 6.000.000 Da, de 6.000.000 Da a 7.000.000 Da, de 7.000.000 Da a 8.000.000 Da, de 8.000.000 Da a 9.000.000 Da. De preferência, pode variar de 10.000 Da a 3.000.000 Da, e mais preferivelmente pode variar de 10.000 Da a 2.000.000 Da.
[036] O método da presente invenção possui um processo sim ples, e tem fatores facilmente controláveis (tais como a quantidade de carvão ativado, temperatura e tempo) para controlar uma relação de redução de um peso molecular de ácido hialurônico. De acordo com uma mudança de fatores de controle, a relação de redução de um peso molecular de ácido hialurônico é relativamente alterada de forma regular. Isto é muito útil na preparação de ácido hialurônico tendo um peso molecular predeterminado. Também, tal característica pode remover uma grande quantidade de endotoxina contida em um meio de cultura num caso onde o ácido hialurônico é preparado por uma cultura de micro-organismos.
[037] De acordo com o método de preparação da presente inven ção, é possível produzir eficientemente o ácido hialurônico tendo um peso molecular específico por um processo simples. Da mesma forma, é possível ajustar facilmente e de forma estável o peso molecular do ácido hialurônico produzido através do ajuste da quantidade de carvão ativado, da temperatura e do tempo.
[038] Enquanto isso, a presente invenção fornece um método para a diminuição do peso molecular do ácido hialurônico compreendendo a etapa de levar o ácido hialurônico em contato com carvão ativado.
[039] É descrito pela primeira vez na presente invenção à redu ção do peso molecular do ácido hialurônico mediante a condução do ácido hialurônico em contato com o carvão ativado.
[040] No método da presente invenção, o ácido hialurônico a ser lavado em contanto com o carvão ativado, o peso molecular do ácido hialurônico, o carvão ativado, e o tipo de carvão ativado, uma relação de ácido hialurônico para o carvão ativado, um método de contato, uma condição de contato (solvente, concentração do ácido hialurônico, e similares), uma temperatura de contato, um tempo de contato, um efeito de contato, um peso molecular reduzido do ácido hialurônico obtido após ser levado em contato com carvão ativado, e outros efeitos são os mesmos como aqueles descritos no método de preparação acima.
[041] Estas características da presente invenção podem ser fa cilmente compreendidas com referência aos exemplos da presente invenção.
[042] De acordo com um exemplo da presente invenção, um mi cro-organismo Streptococcus sp. que produz ácido hialurônico foi cultivado de modo a produzir o ácido hialurônico. Em seguida, o ácido hia- lurônico foi purificado. O carvão ativado com várias relações foi disperso no meio de cultura, purificado e foi colocado em contato com o ácido hialurônico sob várias condições de temperatura com vários tempos. Depois, o ácido hialurônico foi coletado, e o seu peso molecular foi medido.
[043] Sob uma condição de 25 °C a 45 °C, quando o ácido hialu- rônico foi colocado em contato com carvão ativado durante 3 a 18 horas, ácido hialurônico de 3.500.000 Da foi preparado em ácido hialurô- nico tendo vários pesos moleculares de 10.000 Da a 3.000.000 Da.
[044] De acordo com outro exemplo da presente invenção, o ácido hialurônico extraído e purificado da crista de galinha foi utili- zado na mesma experiência através de diluição. Depois, o resultado foi medido.
[045] Como um resultado, quando o ácido hialurônico extraí- do/purificado da crista de galinha foi utilizado, foi possível preparar o ácido hialurônico tendo um peso molecular reduzido da mesma maneira como aquele na cultura de um micro-organismo produtor de ácido hialurônico.
[046] Assim, através do método da presente invenção, é possível reduzir eficazmente o peso molecular do ácido hialurônico, independente de um método de preparação de ácido hialurônico ou uma condição de contato entre o ácido hialurônico e o carvão ativado.
[047] Em um exemplo da presente invenção, 1 t de ácido hialurô- nico tendo um peso molecular médio de 3.500.000 Da foi cultivado, e foi reagido com carvão ativado em uma quantidade de 4 vezes o peso de ácido hialurônico durante 4 horas em uma temperatura de reação de 45 °C. Em seguida, o ácido hialurônico com um peso molecular médio de 2.000.000 Da foi preparado.
[048] Em outros exemplos da presente invenção, sob a mesma condição como aquela do exemplo acima, para vários tempos de reação de 6, 7 ou 8 horas, o ácido hialurônico foi preparado, e o peso molecular médio foi medido. Como um resultado, de acordo com o tempo de reação, o ácido hialurônico com pesos moleculares médios de 1.000.000 Da, 500.000 Da e 100.000 Da foi preparado.
[049] Consequentemente, no método da invenção, é possível fa cilmente ajustar o peso molecular do ácido hialurônico mediante o ajuste de vários fatores tais como a relação de carvão ativado, a temperatura, o tempo de reação. Além disso, o método da invenção é um método de preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular de alta qualidade industrialmente aplicável.
[050] O método da presente invenção para diminuir um peso mole cular do ácido hialurônico de peso molecular elevado possui um processo conveniente sem o inconveniente de reprocessamento para a remoção dos materiais de entrada, ou que requeria tratamento de pH, vários catalisadores de reação, e complicadas condições de tratamento adicionais (tais como o tratamento térmico) como em um método convencional. Além disso, o método possui um efeito para a remoção de impurezas. Assim, através do método, é possível conveniente e economicamente produzir o ácido hialurônico de baixo peso molecular com elevada pureza. O método da invenção para diminuir o peso molecular tem uma vantagem em que de acordo com uma mudança de uma condição de reação usando o carvão ativado, o peso molecular do ácido hialurônico de baixo peso molecular pode ser variavelmente ajustado. O ácido hialurônico de baixo peso molecular produzido pelo método da presente invenção pode ser produzido em conformidade com os padrões dos suprimentos médicos enquanto que as próprias características do ácido hialurônico podem ser mantidas. Da mesma forma, pode ser produzido em conformidade com os padrões de cosméticos ou alimentos.
[051] A figura 1 mostra uma unidade de repetição de ácido hialu- rônico, que é composta de ácido D-glucurônico e N-acetilglucosamina alternantes, ligados entre si através da alternância de β-1,3 e β-1,4; a figura 2 é um gráfico que mostra a mudança de peso molecular do ácido hialurônico de acordo com vários tipos de carvão ativado e respectivas concentrações em 25 °C (2X, 4X, 6X: quantidade de carvão ativado administrado em relação ao ácido hialurônico, CA1, CGSP, CASP, CN1, SX-PLUS, SX-ULTRA, DARCO KBB, DARCO A- 51: o tipo de carvão ativado usado, Norit® CA1, Norit® CGSP, Norit® CASP, Norit® CN1, Norit® SX-PLUS, Norit® SX-ULTRA, Norit® DAR- CO KBB, Norit® DARCO A-51); a figura 3 é um gráfico que mostra a mudança de peso molecular do ácido hialurônico de acordo com vários tipos de carvão ativado, e as respectivas concentrações a 35 °C (2X, 4X, 6X: quantidade de carvão ativado administrado em relação ao ácido hialurô- nico, CA1, CGSP, CASP, CN1, S-51HF, SA-SUPER, SX-PLUS, SX- 1G, SX-ULTRA, PAC-200C, DARCO KBB, DARCO A-51: o tipo de carvão ativado usado, Norit® CA1, Norit® CGSP, Norit® CASP, No- rit® CN1, Norit® S-51HF, Norit® SA-SUPER, Norit® SX-PLUS, No- rit® SX-1G, Norit® SX-ULTRA, Norit® PAC-200C, Norit® DARCO KBB, Norit® DARCO A-51) e a figura 4 é um gráfico que mostra a mudança de peso molecular do ácido hialurônico de acordo com vários tipos de carvão ativado, e as respectivas concentrações em 45 °C (2X, 4X, 6X: quantidade de carvão ativado administrado em relação ao ácido hia- lurônico, CA1, CGSP, CASP, CN1, S-51HF, SA-SUPER, SX-PLUS, SX-1G, SX-ULTRA, PAC-200C, DARCO KBB, DARCO A-51: o tipo de carvão ativado usado, Norit® CA1, Norit® CGSP, Norit® CASP, Norit® CN1, Norit® S-51HF, Norit® SA-SUPER, Norit® SX-PLUS, Norit® SX-1G, Norit® SX-ULTRA, Norit® PAC-200C, Norit® DARCO KBB, Norit® DARCO A-51).
[052] Daqui em diante, as formas de realização exemplares da pre sente invenção serão descritas com referência aos desenhos anexos.
[053] Na presente invenção, uma concentração de ácido hialurôni- co existente em uma solução foi observada por um método de carbazol (T. Bitter, Anal. Biochem., 1962, 4, 330-334). O peso molecular médio de ácido hialurônico foi obtido pela cromatografia em gel de (Narlin B. Beaty et al., Anal. Biochem., 1985, 147, 387-395). As condições de análise incluem uma coluna de gel Toyo Soda TSK G6000PWXL, e uma fase móvel de 150 mM de NaCl, 3 mM de Na2HPO4 (pH 7,0), 0,02 % de NaN3. Para a detecção, um detector de índice de refração (Shodex) foi usado. Como um material de referência, óxido de polietileno foi preparado na concentração de 2mg/Ml. Como uma endotoxina, um reagente de LAL comercialmente disponível da Charles River Laboratories Koreia foi quantificado. Dentro de um faixa menor do que uma diluição múltipla efetiva máxima, a diluição múltipla foi definido como o ponto 3. Foi determinado que a partir de um grupo de controle negativo, a endotoxina não foi detectada, e através de um controle de produto positivo, não houve nenhum fator de interferência da reação.
[054] Nos exemplos abaixo, uma concentração de cada um de ácido hialurônico de peso molecular elevado extraído de um microorganismo, e ácido hialurônico de peso molecular elevado extraído da crista de galinha é ajustada para um valor predeterminado, e depois o ácido hialurônico de baixo peso molecular é produzido de acordo com uma mudança de uma condição de reação mediante o uso de carvão ativado como um meio para a produção de ácido hialurônico de baixo peso molecular. A mudança do peso molecular médio de ácido hialu- rônico de baixo peso molecular produzido será descrita mais tarde.
[055] Os seguintes exemplos ilustram a invenção e não se desti nam a limitá-la.
[056] Neste exemplo, como uma matéria-prima para a produção de ácido hialurônico de baixo peso molecular, uma composição purificada de uma cultura obtida através da cultura de Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) como um micro-organismo de produção foi usada. O peso molecular médio de ácido hialurônico incluído na matéria-prima é de 3.500.000 Da, e a concentração da endotoxina é muito maior do que 0,5 EU/mg.
[057] As condições de cultura são como se segue:
[058] Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) foi selecionado como um micro-organismo que produz ácido hialurônico, e é cultivado em um fermentador de 75 L contendo glicose (40 a 100 g/L), extrato de levedura (2 a 5 g/L), caseína de peptona (10 a 20 g/L), sulfato de magnésio (0,5 a 1 g/L), di-hidrogênio fosfato de potássio (1 a 5 g / L), cloreto de sódio (2 a 10 g/L), e ácido glutâmico (0,1 a 1 g/L), em pH 6,0 a 7,0, a 32 - 37 °C, sob uma condição aeróbica de 0,1 a 1 vvm.
[059] As condições de reação básicas são como se segue:
[060] A fim de obter uma força de agitação apropriada e reativi- dade de ácido hialurônico purificado a partir da ultrafiltração e carvão ativado Norit® CA1 (a seguir referido como CA1, Norit, Netherlands, Norit® - carvões ativados utilizados nos exemplos foram produzidos a partir de Norit), a concentração de ácido hialurônico foi ajustada para 2,5 g de HA/L. Depois, o ácido hialurônico foi introduzido em uma quantidade de 300 Ml em um béquer de vidro de 1 L, e carvão ativado CA1 foi introduzido em um béquer de vidro em uma concentração de duas vezes, 4 vezes e 6 vezes maiores do que a concentração de ácido hialurônico. Depois, o impulsor (diâmetro 5 cm) produzido de teflon foi girado em uma taxa de 300 rpm enquanto que a condição de reação predeterminada foi mantida. De modo a impedir a mistura de impurezas ou evaporação de um líquido de reação no valor máximo até a conclusão da reação, as partes do impulsor diferentes daquela da parte de rotação do impulsor foram lacradas com uma tampa. As temperaturas de reação foram 25 °C, 35 °C e 45 °C.
[061] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 1. De acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ati- vado CA1 aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 25 °C, sob uma condição de CA1 2X, durante 6 horas, 2.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos, e durante 18 horas, 1.500.000 Da de peso molecular foram obtidos. A 25 °C, e CA1 4X, durante 18 horas, cerca de 1.000.000 Da de peso molecular foram obtidos, e em CA1 6X, durante 6 horas, cerca de 1.000.000 Da de peso molecular foram obtidos, e durante 18 horas, 500.000 Da de peso molecular foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 °C, embora a concentração tenha uma reatividade 2X menor do que aquela a 25 °C, a capacidade de decomposição de peso molecular foi semelhante àquela a 25 °C. A 35 °C, com 6X, durante 18 horas, 130.000 Da de peso molecular foram obtidos. Em um caso onde a rea-ção foi realizada a 45 °C, embora a concentração tenha uma reatividade 2X menor do que a 35 °C, a capacidade de decomposição de peso molecular foi semelhante àquela a 35 °C. Com 6X, 15.000 Da de peso molecular foram obtidos. Sob todas as condições de reação, a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg. Da mesma forma, verificou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina. Também, a concentração de ácido hialurônico foi mantida a 92 % ou mais, sob todas as condições de reação. Assim, verificou-se que não há nenhuma preocupação sobre a perda de ácido hialurônico. Tabela 1
[062] O ácido hialurônico e a condição de reação do exemplo 1 foram utilizados exceto Norit® CGSP (daqui em diante CGSP) em vez de carvão ativado CA1 como um meio para a produção de ácido hialu- rônico de baixo peso molecular para executar a análise comparativa de produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[063] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 2. Como o carvão ativado CA1, de acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição do carvão ativado CGSP aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 25 °C, sob uma condição de CGSP 4X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos, e 6x durante 18 horas, 500.000 Da de peso molecular foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 °C, embora a concentração tenha uma reatividade 2X menor do que aquela a 25 °C, a capacidade de decomposição de peso molecular foi semelhante àquela a 25 °C. Especialmente, no caso de 6x a 45 °C, o resultado obtido a 10.000 Da de peso molecular. Nestas condições de reação, os inventores confirmaram que a endotoxina foi menos do que 0,5 EU/mg. Tal como o resultado de CA1, observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina. Também, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições de reação. Assim, os inventores confirmaram esta estabilidade do ácido hialurônico e o efeito do carvão ativado CGSP. Tabela 2 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado CGSP
[064] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® CASP (daqui em diante CASP) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa de produtividade do ácido hialurôni- co de baixo peso molecular.
[065] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 3. Tal como o carvão ativado CA1 e CGSP, de acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ativado CASP também aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 25 °C, sob uma condição de CASP 4X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 °C, embora a concentração tivesse uma reatividade 2X menor do que a 25 °C a capacidade de decomposição do peso molecular foi semelhante àquela a 25 °C. No caso de 45 °C, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 2x durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 5.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e no caso de 2S, durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 500.000 Da, 18 h, 100.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. No caso de 6x, a capacidade de decompo-sição foi aumentada mais altamente, portanto, os presentes inventores confirmaram que durante 6 h, 15.000 Da e durante 18 horas, 12.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da en- dotoxina tal como o resultado de CA1 e CGSP. Da mesma forma, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições de reação de CASP. Tabela 3 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado CASP Temp. Rxn Conc. de carvão ativado MW, kDa Endotoxina, EU/mg g HA/L
[066] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® CN1 (daqui em diante CN1) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[067] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 4. De acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ativado CASP também aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 25 °C, sob uma condição de CN1 4X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 °C, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 4x durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 5.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. No caso de 45 °C, 2x durante 6 h, 1.000.000 Da, 4x durante 6 h 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a en- dotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de CN1. Tabela 4
[068] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® S-51HF (daqui em diante S-51HF) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialu- rônico de baixo peso molecular.
[069] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 5. De acordo com um aumento de uma temperatura de reação, a capacidade de decomposição de carvão ativado S-51HF também aumentou, aumentando assim a taxa de redução do peso molecular do ácido hialurônico. A 35 °C, sob uma condição de S-51HF 6X, durante 6 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 45 °C, 2x durante 6 h, 1.000.000 Da, 4x durante 6 h, 5.000,000 Da de ácido hia- lurônico foram obtidos e em caso de 6x durante 18h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a en- dotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Da mesma forma, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições de reação de S-51HF. Tabela 5 Resultado após a reação de ácido hialurônico com carvão ativado 51HF
[070] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada, exceto No- rit® SA-SUPER (aqui em diante SA-SUPER) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[071] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 6. A 35 °C, sob uma condição de SA-SUPER 2X e 4X, durante 18 horas, 500.000 Da, em condição de 6X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Também, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SA-SUPER. Tabela 6
[072] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® SX-PLUS (daqui em diante SX-PLUS) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[073] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 7. A 25 °C, sob uma condição de SX- SUPER 6X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 35 °C 2X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurô- nico foram obtidos e 4x durante 18 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 °C 2X durante 6 h, 1.000.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SX-PLUS. Tabela 7
[074] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® SX-1G (daqui em diante SX-1G) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialu- rônico de baixo peso molecular.
[075] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na [Tabela 8]. A 35 °C, 6X durante 6 h, 1.000.000 Da, e durante 18 h 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 °C 2X durante 18 h, 500.000 Da, 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a en- dotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SX-1G. Tabela 8
[076] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® SX-ULTRA (daqui em diante SX-ULTRA) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[077] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na [tabela 9]. A 25 °C, sob uma condição de SX- ULTRA 4X, durante 18 horas, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 35 °C 2X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 4x durante 18 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 °C 2X durante 6 h, 1.000.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirma- ram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de SX-ULTRA. Tabela 9
[078] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® PAC-200C (daqui em diante PAC-200C) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[079] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 10. A 35 °C 6X durante 6 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 °C 2X durante 18 h, 500.000 Da, 4x durante 6 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos e 6x durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da endotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Da mesma forma, a concentração de ácido hia- lurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de PAC-200C. Tabela 10
[080] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® DARCO RBB (daqui em diante PAC-200C) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[081] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 11. A 25 °C4X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso onde a reação foi realizada a 35 °C, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 2x durante 18 h, 1.000.000 Da, 4x durante 18 h, 500.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 °C, 2x durante 18 h, 500.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da, 6X durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da en- dotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 92 % ou mais sob todas as condições da reação de DARCO KBB. Tabela 11
[082] A condição de reação do exemplo 1 foi utilizada exceto No- rit® DARCO A-51 (daqui em diante PAC-A-51) em vez de carvão ativado CA1 para executar a análise comparativa da produtividade de ácido hialurônico de baixo peso molecular.
[083] Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e uma en- dotoxina, uma concentração de ácido hialurônico, e um peso molecular médio foram analisados de acordo com o método de análise. O resultado é mencionado na tabela 12. A 25 °C, 4X durante 18 h, 1.000.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Em um caso em que a reação foi realizada a 35 °C, a capacidade de decomposição foi altamente aumentada e no caso de 6x durante 6 h, 1.000.000 Da, durante 18 h, 100.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. A 45 °C, 2x durante 18 h, 500.000 Da, 4x durante 6 h, 500.000 Da, 6X durante 18 h, 10.000 Da de ácido hialurônico foram obtidos. Os inventores confirmaram que a endotoxina foi menor do que 0,5 EU/mg e observou-se que um aumento da temperatura de reação é eficaz na redução adicional da en- dotoxina mesmo como o resultado dos resultados acima. Além disso, a concentração de ácido hialurônico foi mantida pelo menos 93 % ou mais sob todas as condições da reação de DARCO A-51. Tabela 12
[084] No presente exemplo, a matéria-prima de ácido hialurônico de peso molecular elevado foi extraída e purificada a partir da crista de galinha, e seu peso molecular médio foi 3.500.000 Da.
[085] Nesta experiência, o carvão ativado CA1 foi selecionado como um ajustador do peso molecular, e depois o resultado experimental de ácido hialurônico derivado da crista de galinha foi comparado com aquele do ácido hialurônico derivado de micro-organismo. Depois disto, a experiência será descrita com detalhes.
[086] A concentração de matéria-prima de ácido hialurônico deri vado da crista de galinha foi ajustada para 2,5 g de HA/L. Depois, o ácido hialurônico foi introduzido em uma quantidade de 300 Ml em um béquer de vidro de 1 L, e carvão ativado CA1 foi introduzido em um béquer de vidro a uma concentração duas vezes, 4 vezes e 6 vezes maior do que a concentração de ácido hialurônico. Em seguida, o impulsor (diâmetro 5 cm) produzido de teflon foi girado em uma taxa de 300 rpm. A fim de impedir a mistura de impurezas ou evaporação de um líquido de reação no valor máximo até a conclusão da reação, as partes do impulsor diferentes da parte de rotação do impulsor foram lacradas com uma cobertura. As temperaturas de reação foram 25 °C.
[087] O resultado de ácido hialurônico derivado da crista de gali nha como um grupo de controle foi comparado com aquele do exemplo 1. Após 3, 6 e 18 horas, cada amostra foi coletada, e a mudança foi analisada. A mudança do peso molecular médio de ácido hialurôni- co derivado da crista de galinha é mencionada na tabela 13.
[088] Observou-se que o ácido hialurônico derivado da crista de galinha foi decomposto por carvão ativado CA1 da mesma maneira como aquele no ácido hialurônico derivado de micro-organismo do exemplo 1. Isto indica que não há diferença no processo de redução de peso molecular entre a matéria-prima derivada de micro-organismo e a matéria-prima derivada da crista de galinha. Tabela 13
[089] Em um fermentador de 1 ton, Streptococcus sp. ID9102 (KCTC11395BP) foi cultivado sob a mesma condição de meio de cultura conforme descrito no exemplo 1 de modo a obter 500 L de cultura. Esta cultura foi purificada de modo a produzir uma composição de 500 L. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi de 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg.
[090] O carvão ativado foi selecionado como um ajustador do pe so molecular, e foi introduzido em uma quantidade 4 vezes maior que a do ácido hialurônico. A reação de redução do peso molecular foi realizada em um reator de 500 L revestido com Teflon, e a temperatura de reação foi 45 °C. Após 4 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma concentração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endoto- xina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos.
[091] Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialu- rônico foi 2.000.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi de 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos.
[092] O ácido hialurônico filtrado cujo peso molecular foi reduzido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 2.000.000 Da. Exemplo 15 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 1.000.000 Da em um processo industrial
[093] 500 L de composição de ácido hialurônico foram prepara dos sob a mesma condição como descrita no exemplo 14. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg.
[094] A condição de reação do carvão ativado foi a mesma no exemplo 14, e o tempo de reação foi 6 horas. Após 6 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma concentração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos.
[095] Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialu- rônico foi 1.000.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos.
[096] O filtrado de ácido hialurônico cujo peso molecular foi redu zido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialu- rônico tendo um peso molecular médio de 1.000.000 Da. Exemplo 16 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 500.000 Da em um processo industrial
[097] 500 L de composição de ácido hialurônico foram prepara dos sob a mesma condição como descrita no exemplo 14. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg.
[098] A condição de reação do carvão ativado foi a mesma no exemplo 14, e o tempo de reação foi 7 horas. Após 7 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma concentração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos.
[099] Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialu- rônico foi 500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos.
[0100] O filtrado de ácido hialurônico cujo peso molecular foi redu zido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialu- rônico tendo um peso molecular médio de 500.000 Da. Exemplo 17 Método para a produção de ácido hialurônico tendo um peso molecular médio de 100.000 Da em um processo industrial
[0101] 500 L de composição de ácido hialurônico foram prepara dos sob a mesma condição como descrita no exemplo 14. O peso molecular médio de ácido hialurônico foi 3.500.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi muito maior do que 5,0 EU/mg.
[0102] A condição de reação do carvão ativado foi a mesma no exemplo 14, e o tempo de reação foi 8 horas. Após 8 horas a partir da reação, o adsorvente foi removido e a reação foi concluída. Após a reação, uma concentração de ácido hialurônico do produto resultante, uma concentração de endotoxina, e um peso molecular médio de ácido hialurônico foram medidos.
[0103] Como um resultado, o peso molecular médio de ácido hialu- rônico foi 100.000 Da, a concentração de ácido hialurônico foi 5 g/L, e a concentração de endotoxina foi 0,005 EU/mg ou menos.
[0104] O filtrado de ácido hialurônico cujo peso molecular foi redu zido foi precipitado e secado de modo a fornecer 2 kg de ácido hialu- rônico tendo um peso molecular médio de 100.000 Da.
[0105] Através do exemplo 14 até o exemplo 17, os presentes in ventores desenvolveram um método para a produção de ácido hialu- rônico de baixo peso molecular de alta qualidade, que é fácil de aplicar na indústria.
[0106] O método da presente invenção para diminuir um peso molecular do ácido hialurônico de peso molecular elevado possui um processo conveniente sem o inconveniente de reprocessamento para a remoção de materiais de entrada, ou que requeira tratamento de pH, vários catalisadores de reação, e complicadas condições de tratamento adicional (tais como o tratamento térmico) como em um método convencional. Além disso, o método possui um efeito para a remoção de impurezas. Assim, através do método, é possível conveniente e economicamente produzir o ácido hialurônico de baixo peso molecular com elevada pureza. O método da invenção para diminuir o peso molecular possui uma vantagem em que de acordo com uma mudança de uma condição de reação usando carvão ativado, o peso molecular do ácido hialurônico de baixo peso molecular pode ser ajustado de forma variada. O ácido hialurônico de baixo peso molecular produzido pelo método da presente invenção pode ser produzido em conformidade com os padrões de suprimentos médicos enquanto que a própria característica do ácido hialurônico pode ser mantida. Também, pode ser produzido em conformidade com os padrões de cosméticos ou alimentos.
Claims (2)
1. Método para a preparação de ácido hialurônico de baixo peso molecular caracterizado por compreender a etapa de levar o ácido hialurônico ao contato com o carvão ativado, em que o carvão ativado é usado como meio reacional para converter ácido hialurônico de alto peso molecular em ácido hialurôni- co de baixo peso molecular possuindo um peso molecular predeterminado e, em que o ácido hialurônico de alto peso molecular é obtido através de uma cultura de microorganismos ou extração de crista de frango e em que a razão de ácido hialurônico para o carvão ativado é de 1:2 a 1:6.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura para levar o ácido hialurônico ao contato com carvão ativado é de 25 °C a 45 °C, e o tempo para levar o ácido hialurônico ao contato com o carvão ativado é de 3h a 18h.
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