SK10452002A3

SK10452002A3 - Kmeň Leuconostoc mesenteroides

Info

Publication number: SK10452002A3
Application number: SK1045-2002A
Authority: SK
Inventors: Blanka Gondová; Jana Kluková; Beata Dirbáková; Miroslava Čikošová; Marta Somorová; Dana Jeziorská
Original assignee: Biotika, A. S.
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2004-02-03
Also published as: SK286070B6

Description

Vynález sa týka kmeňa Leuconostoc mesenteroides L127P uloženého v Českej zbierke mikroorganizmov v Brne pod číslom CCM 4948, ktorý produkuje dextrán v množstve 5,3 g/100ml fermentačnej pôdy za 20 hodín kultivácie v produkčnom stupni pri 20 až 24°C a miešania v médiu s 15 až 20%(m/m) sacharózou.

Kyslou hydrolýzou natívneho dextránu je možné získať dextrány o molekulovej hmotnosti 1000 až 500 000. Najváčší význam majú tzv. klinické dextrány o molekulovej hmotnosti 40 000 až 70 000 používané v zdravotníctve ako náhrada krvnej plazmy.

Doterajší stav techniky

Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 je za určitých kultivačných podmienok producentom dextránu. Dextran je vysokomolekulárny polysacharid tvorený z glukózových jednotiek vzniknutých z molekúl sacharózy katalytickým účinkom extracelulárneho enzýmu dextransacharázy, ktorú do prostredia syntetizuje samotný producent dextráíiu Leuconostoc mesenteroides CCM 4948. Zrážaním natívneho dextránu etylalkoholom, kyslou hydrolýzou s kyselinou chlorovodíkovou, úprave pH a frakcionáciou hydrolyzátu s etylalkoholom sa získajú frakcie s molekulovou hmotnosťou 1000 až 500 000.

Výhodou kultivácie s kmeňom Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 je, že nie je potrebné extracelulárny enzým dextransacharázu z tohto kmeňa najskôr izolovať a potom do procesu kontinuálne pridávať ako je to uvedené v európskom patente EP 0 087 404 a japonskom patente 06090604. Výhodou kultivácie je, že fermentačný proces prebieha bez kontinuálneho prídavku roztoku sacharózy.

Taxonómiu bakteriálnych kmeňov druhu Leuconostoc popisuje Garvie so spoluautormi (International Journal of Systematic Bacteriology, 118 - 119, 1983). Je založená na kritériu homológie v zmysle deoxyribonukleovej kyseliny ( DNK ). Baktérie, klasifikované ako Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum a Leuconostoc cremoris, majú vysoký stupeň homológie vzhľadom na ich DNK, i keď majú rozdielne fenotypy. Podľa tejto taxonómie sú teda tieto baktérie poddruhy Leuconostoc mesenteroides a sú nazývané Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum a Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris.

Kmeň Leuconostoc mesenteroides ATCC 10803 ( NRRL B-512 ) je producentom dextransacharázy, ktorá má schopnosť syntetizovať dextran pre priemyselné a medicínske účely ( D.Kim a John F.Robyt, Enzýme Mcrobíol.Technol., Vol.16, 659- 664,august 1994). Leuconostoc mesenteroides B-1355 produkuje dva extracelulárne glukánsacharázy, ktoré so sacharózy syntetizujú / ^z Zfrakcie L- dextránu a frakcie S-dextranu. Frakcia L-dextranu má štruktúru veľmi podobnú dextránu vyprodukovaného kmeňom B-512(F). S-frakcia zvaná alternan” má glukózové jednotky spájané a-1,6 a a-1,3 väzbami. Absencia a-1,6 väzieb v hlavnom reťazci a vyššie zastúpenie a-1,3 väzieb robí alternan rezistentným k endodextranázovej hydrolýze a dodáva mu iné typické vlastnosti (je vysoko rozpustný, nízkokalorický, môže sa využiť v potravinárstve, v chemickom priemysle pri výrobe gúm, gélov, vo farmaceutickom priemysle pri výrobe liekov).

A.Lópes-Munguía so spoluautormi uvádzajú ( Enzýme Microb.Technol., Vol.15, 77- 85, january 1993), že kmene Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742, B-1299, B-1498, B-1501, B-1149, B-1355 produkújú dva rôzne typy polymérov.

V súčasnosti je biosyntéza dextránu ako náhrady krvnej plazmy objasnená v patente ( U.S.Patent 5,229,277) s použitím zmesnej kultúry baktérie Leuconostoc mesenteroides ATCC 10830 a kvasinky Lipomyces starkeyi ATCC 74054 v sacharózovom médiu. Kultivačné podmienky a vedenie fermentácie sú podmienené nárokmi oboch kmeňov, Leuconostoc mesenteroides ATCC 10830 ako producenta dextránu a Lipomyces starkeyi ATCC 74054 ako producenta dextranázy. Dĺžka fermentácie pri 28 až 30°C je viac ako 48 hodín. Molekulová hmotnosť vyprodukovaného dextranového polyméru dosahuje hodnoty od 40 000 do 100 000.

Výhodou kmeňa Leuconostoc mesenteroides CCM 4948, na ktorý sa vzťahuje patentový nárok je, že je súčasne vlastným producentom enzýmu a nie je potrebné do procesu zahrnúť ďalší kmeň ako producenta enzýmu, čím je vedenie fermentačného procesu a udržiavanie kultivačných podmienok jednoduchšie než je uvedené v patente 5,229,277. Ďalej predpokladáme, že energetické nároky spojené s udržiavaním teploty 28 až 30°C môžu byť vyššie než pri fermentácii pri 20 až 24°C. Naopak nevýhodou pri fermentácii kmeňa Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 je, že sa v inokulačnom stupni využíva médium s 10 až 15% sacharózou, čo navyšuje výrobné náklady.

Výhodou kmeňa Leuconostoc mesenteroides CCM 4948, na ktorý sa vzťahuje patentový nárok je, že dľžka fermentácie inokulačného a produkčného stupňa, počas ktorej bakteriálna kultúra dosiahne maximum svojej produkcie je 40 hodín.

Proces výroby klinického dextránu o molekulovej hmotnosti od 3000 do 60 000 a jeho izolácie objasňuje aj európsky patent EP 0 087 404 A2 z roku 1983. Producentom je kmeň Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512, ktorý produkuje dextrán v 10 až 50% sacharózovom médiu, s obsahom kvasničného extraktu, rastových faktorov, anorganických solí a stopových prvkov v rôznych koncentráciách. Kultivačná teplota pre tvorbu enzýmu sa udržuje v rozsahu od 23 do 30°C, bez alebo za slabého miešania, pH sa udržuje okolo 5,8. Pre producenta sa upravuje počiatočné pH od 6,2 do 7,0. Samotná syntéza dextránu prebieha pri 23°C v rozsahu pH od 4,8 do 6,0, v sacharózovom médiu, pričom 80 až 95% sacharózy skonvertuje na dextrán. Počas fermentácie sa do produkčnej pôdy kontinuálne pridáva roztok vyprodukovaného enzýmu rýchlosťou 125ml/hod a sterilná 22% sacharóza rýchlosťou 250ml/hod. Teoretický predpoklad tvorby dextránu je, že z 1g sacharózy sa vyprodukuje 0,47g dextránu. Výhodou kultivácie s kmeňom Leuconostoc mesenteroides CCM 4947 je, že nie je potrebné extracelulárny enzým dextránsacharázu z tohto kmeňa najskôr izolovať a potom do procesu kontinuálne pridávať ako je to uvedené v európskom patente EP 0 087 404 a japonskom patente 06090604. Výhodou kultivácie je, že fermentačný proces prebieha bez kontinuálneho prídavku roztoku sacharózy. Teoretický predpoklad tvorby dextránu v médiu so 15 až 20% sacharózou pri maximálnej produkcii 5,3 g/100ml je, že z 1g sacharózy sa vyprodukuje 0,33 g dextránu.

Japonský patent 06090604 objasňuje prípravu klinického dextránu o molekulovej hmotnosti od 4000 do 100 000 v sacharózovom roztoku s dextranovým prekurzorom a v prítomnosti enzýmu dextránsyntázy.

Výhodou kmeňa Leuconostoc mesenteroides CCM 4948, na ktorý sa vzťahuje patentový nárok je, že produkcia dextranu prebieha aj bez prítomností prekurzora vo fermentačnej pôde.

/ y

Z ďalších kmeňov, ktoré využívajú produkciu dextránsacharázy a dextranu pre potravinársky priemysel ( U.S.Patent 6,004,800) sú Leuconostoc mesenteroides ssp.cremoris CNCM 1-1692 a CNCM 1-1693, ako aditívum v práškovej forme pri výrobe jogurtov, mliečnych nápojov a zmrzlín. Podobné využitie má aj kmeň Leuconostoc dextranicum NRRL B - 18132 (U.S.Patent 4,855,149) a Leuconostoc dextranicum NRRL B- 18242 ( U.S.Patent 4,933,191).

Podstata vynálezu

Vynález sa týka kmeňa Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 ( interné označenie L127P, pôvodné označenie NRRL B-512), ktorý bol získaný z Instytut Przemyslu Fermentacyjnego, Varšava (IPF) v roku 1957. Následne bol kmeň oživený na výrobnom závode VZ 133 Biotika a.s. Technikami propagácie vypracovanými na VZ 133, viacnásobnou selekciou cez sacharózovú pôdu, rozsevom na sacharózový agar a vypichnutím kolónii do živného média sa získal kmeň Leuconostoc mesenteroides CCM 4948.

Kmeň Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 sa vyznačuje tým, že v 15 až 20% sacharózovej pôde produkuje dextran v koncentrácii 5,3 g/100ml fermentačnej pôdy za 40 hodín kultivácie pri 20 až 24°C za miešania 100 až 200 otáčok/min.

Kmeň Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 sa ďalej vyznačuje tým, že pri krátkodobom uchovávaní v komplexnej pečienkovej pôde pri 2 až 5°C dosahuje stabilné prežívanie počas 4 mesiacov z hodnoty 3,5.10⁸ na 1,5.10⁸ mikroorganizmov/ml bez straty produkčnej schopnosti. Rovnako stabilné je prežívanie kmeňa v komplexnej pečienkovej pôde s chloridom vápenatým z hodnoty 3,9.10⁸ na 1,4.10⁸mikroorganizmov/ml a produkciou 5,4 g/100ml fermentačnej pôdy.

Kmeň Leuconostoc mesenteroides L127P (CCM 4948) sa dalej vyznačuje tým, že pri dlhodobom uchovávaní v mrazničke pri - 80°C dosahuje počet prežívajúcich mikroorganizmov 3,0.10⁸mikroorganizmov/ml s ochranným médiom glycerínom a 1,2.10⁸ mikroorganizmov/ml bez ochranného média.

Postup oživenia uskladnenej kultúry je opísaný v nasledovnej schéme:

L127P (LK, kryokonzerva) i

1. pasáž na 10% sacharózovej pôde (ŠA) kultivácia 24 až 48 hod, t=20 až 24°C i

2. pasáž na 10% sacharózovej pôde(ŠA), kultivácia 24 až 48 hod, t=20 až 24°C

I

3. pasáž v KPP, kultivácia 24 až 48 hod, t=20 až 24°C

I uskladnenie v chladničke pri t= 2 až 5°C

Vysvetlivky: LK- lyofilizovaná konzerva PM - Petriho misky ŠA - šikmý agar

KPP - komplexná pečienková pôda

Popis kmeňa: Kmeň Leuconostoc mesenteroides L127P

Morfológia: -guľaté až oválne grampozitivne koky veľkosti 0,1 -1,2 pm, vyskytujúce sa tiež v retiazkach -nepohyblivé - fakultatívny anaerób

-na sacharózovom agare tvorí žltobiele, guľaté a vypuklé, lesklé, hladké kolónie

-pri nátere vytvára bohatý polotekutý sliz s hladkým povrchom

-v tekutej sacharózovej pôde dochádza k zoslizovateniu pôdy a k tvorbe plynu.

-skvasuje sacharózu, pričom počas fermentácie dochádza okrem tvorby hlavného produktu dextrán u i k tvorbe vedľajších metabolitov fruktózy, mannózy, kys.octovej, kys.mliečnej, etanolu a CO₂.

-vyfermentovaná pôda obsahujúca dextrán je tekutejšia, ľahšie rozpustná vo vode než pôda vyfermentovaná kmeňom Leuconostoc mesenteroides CCM 4947

Kultivačné médiá:

Inokulačná pôda: sacharóza 100g; kvasničný autolyzát 1g; CaCO3 0,5g; NaNH₄HPO₄ . 4H₂O 3g; KH₂PO₄1g; MgSO₄.7H₂O 0,1g; MnSO₄. H₂O 0,01g; FeCI₃.6H₂O 0,01g; KCI 0,1g do 1000mi pitnej vody , upraviť pH 7až 7,2.

Produkčná pôda; sacharóza 160g; kvasničný autolyzát 1g; CaCO3 0,5g; NaNH₄HPO₄ . 4H₂O 3g; KH₂PO₄1g; MgSO₄.7H₂O 0,1g; MnSO₄ . H₂O 0,01g; FeCI₃.6H₂O 0,01g; KCI 0,1g do 1000mi pitnej vody , upraviť pH 7 až 7,2.

Sacharózový agar: sacharóza 100g; kvasničný extrakt 0,5g; NaNH₄HPO₄ . 4H₂O 3g; KH₂PO₄ 1g;

MgSO₄ . 7H₂O 0,1g; MnSO₄ . H₂O 0,01g; KCI 0,1g ; NaCI 0,1g; (NH₄)₆Mo₇O₂₄ . 4H₂O 0,05g; agar 25g do 1000mi destilovanej vody , upraviť pH 7,2 až 7,5.

Komlexná pečienková pôda: sušená pečienková pôda 35,0g; sacharóza 5,0g do 1000 ml destilovanej vody, upraviť pH 6,7 až 7,1.

Príklady uskutočnenia vynálezu:

Príklad.č. 1

Z kultúry uskladnenej v chladničke v komplexnej pečienkovej pôde (ďalej KPP) sa preočkuje 0,1 až 0,5ml za sterilných podmienok do novej KPP a kultivuje sa 24 až 48 hodín pri 20 až 24°C. Kultúra v tekutej pôde vytvára zákal až usadeninu. Z tejto pôdy sa preočkuje 0,3 až 0,5ml na 10% sacharózový šikmý agar v Endovej skúmavke a kultivuje sa 24 až 48 hodín pri 20 až 24°C. Narastená kultúra vytvára na šikmom agare polotekutý, hladký sliz, ktorý sa zmyje 5 ml fyziologického roztoku. Suspenzia sa preleje do 10 až 15% sacharózovej inokulačnej pôdy s plnením 50 až 70% v Erlenmayerových bankách a kultivuje sa 20 hodín pri 20 až 24°C za miešania 100 až 200 otáčok/min. Narastené inokulum 2 až 10%(m/m) sa preočkuje do 15 až 20% sacharózovej produkčnej pôdy s plnením 50 až 75% v Erlenmayerových bankách a kultivuje sa ďalších 20 hodín pri 20 až 24°C za miešania 100 až 200 ot/mín.

Maximálna produkcia za miešania je 5,3g/100ml fermentačnej pôdy.

Priemyselná využiteľnosť:

Kmeň mikroorganizmu Leuconostoc mesenteroides CCM 4948, ktorý je predmetom vynálezu je možné využívať na prípravu natívneho dextranu, z ktorého je možné pripraviť dextrany o molekulovej hmotnosti 1000 až 500 000.

Kmeň mikroorganizmu Leuconostoc mesenteroides CCM 4948, ktorý je predmetom vynálezu je možné využívať pri priemyselnej výrobe klinických dextranov o molekulovej hmotnosti 40 000 až 70 000, pričom jeho produkčná schopnosť pri 40 hodinovej kultivácii pri 20 až 24°C v 15 až 20% sacharózovej fermentačnej pôde je 5,3 g/100ml fermentačnej pôdy.

z

Klinický dextran sa využíva v lekárstve na prípravu infúzneho roztoku s fyzikálno - chemickými vlastnosťami krvnej plazmy, vhodného na prevenciu liečenia šoku, prudkého krvácania, popálenín a má špecifický účinok na cirkuláciu krvi vo vlásočniciach.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kmeň mikroorganizmu Leuconostoc mesenteroides CCM 4948, vyznačujúci sa tým, že v médiu obsahujúcom 15 až 20% (m/m) sacharózy syntetizuje dextrán s výťažkom 5,3 g/100ml fermentačnej pôdy za 20 hodín kultivácie v produkčnom stupni pri 20 až 24°C a miešaní 100 až 200 otáčok/min.
2. Kmeň Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 podľa nároku 1, sa . vyznačuje tým, že je vysokostabilný pri krátkodobom uchovávaní v komplexnej pečienkovej pôde a v komplexnej pečienkovej pôde s chloridom vápenatým pri 2 až 5°C počas 4 mesiacov bez straty produkčnej schopnosti.
3. Kmeň Leuconostoc mesenteroides L127P (CCM 4948) podľa nároku 1,2 sa vyznačuje tým, že je vysokostabilný pri dlhodobom uchovávaní, v mrazničke pri - 80°C dosahuje počet prežívajúcich mikroorganizmov 3,0.10⁸ mikroorganizmov/ml s ochranným médiom glycerínom a 1,2.10® mikroorganizmov/ml bez ochranného média.
4. Kmeň mikroorganizmu Leuconostoc mesenteroides CCM 4948 podľa nároku 1,2,3 vyznačujúci sa tým, že je vlastným producentom enzýmu dextránsacharázy, ktorá zabezpečuje konverziu uhlikatého substrátu na dextŕan.