ES2535541T3 - Integración de almacenamiento de muestras y gestión de muestras para las ciencias biológicas - Google Patents

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Abstract

Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica, que comprende: (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente, que permite la recuperación completa o sustancial de una muestra biológica secada o un material biológico, después de hidratación, rehidratación u otra reconstitución con disolvente de la muestra, en la que el material matriz comprende un material seleccionado de poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, 2-hidroxietilcelulosa y poli(2-etil-2-oxazolina), o en donde el material matriz comprende al menos un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, agarosa, poli-N-vinilacetamida, poli(4-vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada, polimetacrilato, nanotubos de carbono, polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetatosuccinato de hidroxipropilmetilcelulosa, proteoglicano sulfato de heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico, dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina, fibronectina, un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua y colágeno, o comprende al menos un material matriz que comprende un polímero, en el que el polímero no se autoensambla de forma covalente y tiene la fórmula -[-X-]nen la que X es -CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CH(OH)- sustituido, -CH2CH(COOH)-, -CH2CH(COOH)- sustituido, -CH>=CH2, -CH>=CH-, alquilo C1-C24 o alquilo sustituido, alquenilo C2-24 o alquenilo sustituido, polioxietileno, polioxipropileno, o un copolímero aleatorio o de bloques de los mismos; y en el que n es un número entero que tiene un valor de aproximadamente 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, o 1501-3000; y (b) al menos un estabilizante que comprende un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, en el que el inhibidor biológico o inhibidor bioquímico es validamicina A; en la que la matriz se prepara por secado de una solución que comprende de 0,1% a 10% en peso-volumen del material matriz; en la que la matriz se obtiene por secado al aire a temperatura ambiente o a una temperatura elevada adecuada, y/o por secado bajo una corriente de gas adecuado, tal como una corriente de aire filtrado, CO2, o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, de una solución.

Description

E06848927
24-04-2015
DESCRIPCIÓN
Integración de almacenamiento de muestras y gestión de muestras para las ciencias biológicas
5 CAMPO TÉCNICO
[0001] La presente invención se refiere en general a composiciones y procedimientos mejorados para el almacenamiento de muestras biológicas y para procedimientos mediante los cuales se reciben materiales y muestras biológicas y se ponen en sistemas de inventario. La invención también se refiere al uso, organización,
10 almacenamiento, seguimiento, recuperación y análisis de dichos materiales y muestras biológicas y a la automatización de estos procedimientos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
15 [0002] La investigación en el campo de las ciencias biológicas se basa en el análisis de materiales y muestras biológicas, tales como ADN, ARN, sangre, orina, frotis bucales, bacterias, virus, productos de PCR, ADN clonado, proteínas, células y tejidos, y de minerales o productos químicos. Dichas muestras típicamente se recogen o se obtienen a partir de fuentes adecuadas y se ponen en almacenamiento e inventario para el posterior procesamiento y análisis.
20 [0003] Los recipientes de almacenamiento para dichas muestras incluyen botellas, tubos, viales, bolsas, cajas, rejillas, platos de múltiples pocillos y placas de múltiples pocillos, que típicamente están cerrados mediante tapas de rosca o tapas a presión individuales, cierres a presión o herméticos, cubiertas, tiras o cintas adhesivas o tiras de múltiples tapones. El formato de recipiente estándar para almacenamiento de muestras, procesamiento y
25 automatización de procesos biológicos de capacidad media a alta, es una placa o matriz de 96, 384 o 1536 pocillos. Los recipientes y las muestras contenidas en los mismos se almacenan a diferentes temperaturas, por ejemplo a temperatura ambiente o a 4 ºC o a temperaturas inferiores a 0 ºC, típicamente de aproximadamente -20 ºC o de -70 ºC a -80 ºC. Las muestras que se ponen y almacenan en los dispositivos, lo más frecuente es que estén contenidas en medio líquido o una solución tampón, y requieren almacenamiento a temperaturas bajo cero (p. ej., de -20 ºC o
30 -70 a -80 ºC). En algunos casos, las muestras primero se secan y después se almacenan a temperatura ambiente, o a 4 ºC, a -20 ºC o de-70a -80ºC.
[0004] Por ejemplo, actualmente, los ácidos nucleicos se almacenan en forma líquida a temperaturas bajas. Para el almacenamiento a corto plazo, los ácidos nucleicos se pueden almacenar a 4 ºC. Para el almacenamiento a 35 largo plazo, la temperatura en general se baja a de -20 ºC a -70 ºC para prevenir la degradación del material genético, en particular en el caso de ADN y ARN genómicos. Los ácidos nucleicos también se almacenan a temperatura ambiente en matrices sólidas tales como membranas de celulosa. Ambos sistemas de almacenamiento están asociados con desventajas. El almacenamiento a baja temperatura requiere equipamiento costoso tal como cámaras frigoríficas, congeladores, sistemas de generadores eléctricos de reserva; dicho equipamiento puede no ser 40 fiable en casos de cortes de energía inesperados o puede ser difícil de usar en zonas sin una fuente de electricidad lista o que tienen sistemas eléctricos no fiables. El almacenamiento de ácidos nucleicos sobre fibras de celulosa también da como resultado una pérdida sustancial de material durante el procedimiento de rehidratación, puesto que el ácido nucleico permanece atrapado y por lo tanto asociado con las fibras de celulosa en lugar de ser cuantitativamente recuperable. El almacenamiento en seco de ácidos nucleicos sobre celulosa también requiere la 45 separación de la celulosa del material biológico, puesto que de lo contrario las fibras de celulosa contaminan las muestras biológicas. La separación de los ácidos nucleicos de las fibras de celulosa requiere la manipulación adicional, incluyendo etapas de pipeteo, transferencia de las muestras a tubos o recipientes nuevos, y centrifugación, todas las cuales pueden dar como resultado rendimientos de recuperación reducidos y más oportunidades para la introducción de contaminante no deseados o la exposición a condiciones que promueven la
50 degradación de muestras, y que también son costosos y laboriosos.
[0005] Las proteínas actualmente se manipulan principalmente en fases líquidas, en entornos enfriados o congelados, típicamente en el intervalo de -20 ºC a almacenamiento en nitrógeno líquido. En algunas excepciones las proteínas se pueden liofilizar o secar a temperatura ambiente en presencia de trehalosa y aplicar directamente a 55 una superficie no tratada. (Garcia de Castro y col., 2000 Appl. Environ. Microbiol. 66:4142; Manzanera y col., 2002 Appl. Environ. Microbiol. 68:4328) Las proteínas a menudo se degradan y/o pierden actividad incluso cuando se almacenan refrigeradas (4 ºC), o congeladas (-20 ºC o -80 ºC). El estrés de la congelación-descongelación en las proteínas reduce la bioactividad de las proteínas (p. ej., la actividad enzimática, la unión específica a un ligando cognado, etc.) en especial si se requiere la congelación-descongelación repetida de partes alícuotas de una muestra
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24-04-2015
de proteína. La consecuente pérdida de actividad de la proteína que puede ser necesaria para ensayos biológicos típicamente requiere el reajuste de la concentración de proteína con el fin de obtener resultados de ensayos comparables, o el rechazo costoso de reactivos de proteínas comprometidos en favor de adquirir nuevos lotes. La práctica común de tener reactivos enzimáticos de múltiples usos almacenados en un laboratorio, en especial por 5 diferente usuarios en diferentes momentos y usando procedimiento de manipulación no estandarizados, reduce más la fiabilidad de los datos experimentales generados con dichos reactivos. Como resultado, la semivida de las proteínas se reduce y con frecuencia deben sustituirse reactivos caros, implicando enormes costes financieros para el usuario. El proveedor de proteínas tiene altos costes para mantener una cadena de suministro congelado no interrumpida que empieza con tratamientos iniciales en cámaras refrigeradas, para el transporte, almacenamiento
10 congelado de la muestra y transporte congelado de la proteína desde la producción al sitio de uso. Por ejemplo, los retrasos durante el transporte pueden producir la inactivación de proteínas, que después deben reemplazarse con un gran coste para el proveedor; la recepción del producto desactivado también puede dar como resultado clientes insatisfechos.
15 [0006] El secado de proteínas y ácidos nucleicos todavía debe ser adoptado de forma universal en la investigación científica, biomédica, biotecnología y otras comunidades empresariales industriales, debido a la falta de estándares establecidos y procedimientos fiables, dificultados con recuperaciones de propiedades cuantitativas y funcionales, compatibilidades y tolerancias de tampones y disolventes variables, y otras dificultades que surgen de las demandas de manipulación de ácidos nucleicos y proteínas. Se aplican los mismos problemas a la manipulación,
20 almacenamiento y uso de otros materiales biológicos, tales como virus, fagos, bacterias, células y organismos multicelulares. Se han descrito por ejemplo disacáridos tales como la trehalosa o lactitol, como aditivos para el almacenamiento en seco de muestras que contienen proteínas (p. ej., patente de EE.UU. nº 4.891.319; patente de EE.UU. nº 5.834.254; patente de EE.UU. nº 6.896.894; patente de EE.UU. nº 5.876.992; patente de EE.UU. nº 5.240.843; WO 90/05182; WO 91/14773), pero la utilidad de dichos compuestos en los contextos descritos está
25 comprometida por servir como fuente de energía para contaminantes microbianos no deseados, por sus efectos estabilizantes limitados cuando se usan como se describe, por su falta de aplicabilidad general en una amplia variedad de muestras biológicas y por otros factores.
[0007] Los recipientes de almacenamiento de muestras presentes representan una multitud de plataformas sin
30 un procedimiento unificado de preparación de muestras, almacenamiento de muestras, inventario de muestras, seguimiento de muestras, recuperación de muestras y análisis de muestras. Está claro que ninguno de los formatos de almacenamiento y procesamiento de muestras actuales resuelve los problemas que surgen de los recipientes de almacenamiento individuales, cierre y auxiliares de depósito inadecuados, contaminación de la muestra, organización inadecuada, sistemas de etiquetado diversos, requisitos de almacenamiento y espacio grandes y
35 restricciones de temperatura.
[0008] La era genómica y el reciente descifrado del genoma humano y muchos otros genomas, proteomas, transcriptomas, etc. han conducido a la industrialización de la investigación de las ciencias biológicas. Se están analizando millones de muestras biológicas que incluyen genes y/o productos génicos de una multitud de 40 organismos, con el fin de avanzar en el conocimiento científico y desarrollar productos comerciales. El desarrollo de tecnologías de alta capacidad ha producido un extenso conjunto de información y muestras, de modo que es necesario integrar el almacenamiento de la muestra, organización de datos y análisis de datos. La generación de innumerables muestras biológicas y datos, supone, por consiguiente, un reto de organización significativo para laboratorios pequeños y grandes. Las opciones de gestión de datos previamente disponibles para las muestras de 45 ciencias biológicas, tales como LIMS (Laboratory Information Management Systems), son incapaces de integrar la información relativa a una muestra o muestras particulares con un dispositivo de almacenamiento de muestras, y típicamente almacenan los datos de las muestras en un servidor central que no está ni física ni electrónicamente conectado con el dispositivo de almacenamiento de muestras. Además, dichos sistemas previamente disponibles requieren configuraciones de rejillas de almacenamiento inconvenientes, que típicamente implican almacenamiento
50 en frío difícil y/o costoso, software complejo que requiere un profesional de soporte técnico de tecnologías de la información dedicado a tiempo completo independientemente de si se va a adquirir un sistema de software de empresa a gran escala y configurar para las necesidades de un usuario particular, o en su lugar se va a desarrollar independientemente un programa personalizado.
55 [0009] El documento US 5089407 describe composiciones secas que comprenden materiales biológicos tales como proteínas y péptidos enzimáticos y polímeros no iónicos tales como poli(alcohol vinílico).
[0010] Liao y col.: International Journal of Pharmaceutics, vol. 304, no. 1-2, 4 de noviembre de 2005, se refieren a los efectos del poli(alcohol vinílico) en la estabilidad in vitro y suministro de partículas de proteína secadas por
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atomización de inhaladores dosificadores presurizados basados en HFA 134a, exentos de tensioactivos.
[0011] Passot S y col.: European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, vol. 60, no. 3, agosto de 2005, páginas 335-348, se refieren a la caracterización física de formulaciones para el desarrollo de dos proteínas 5 liofilizadas estables durante el almacenamiento tanto en seco como líquido.
[0012] El documento WO 00/14505 describe medio sólido seco para la recolección y el almacenamiento de muestras biológicas, que incorpora material para visualización de la muestra.
10 [0013] El documento WO 2004/112476 describe procedimientos de conservación de biomateriales.
[0014] Claramente son necesarios en la industria dispositivos y sistemas de almacenamiento, recuperación, análisis e información correspondiente de muestras de ciencias biológicas. La presente descripción se dirige a dichas necesidades proporcionando una pluralidad de aplicaciones de datos y almacenamiento de muestras de
15 ciencias biológicas, y ofrece otras ventajas relacionadas.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0015] Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que
20 comprende (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (b) al menos un estabilizante, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante. Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra seca, que comprende (a) un material matriz que se
25 disuelve o disocia en un disolvente; y (b) al menos dos estabilizantes, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si al menos uno de los dos estabilizantes comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante. Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que comprende (a) un material matriz que se disuelve o disocia
30 en un disolvente; (b) al menos un estabilizante; y (c) al menos una muestra biológica, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante. Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que comprende (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente,
35 comprendiendo dicho material matriz poli(alcohol vinílico); y (b) al menos un estabilizante.
[0016] Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que comprende (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (b) al menos un estabilizante, en la que dicho al menos un estabilizante comprende un inhibidor de trehalasa. Se proporciona una matriz para el 40 almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que comprende (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (b) al menos uno y no más de dos estabilizante, en la que el estabilizante no es trehalosa, lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán. Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que comprende
(a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (b) al menos un estabilizante, en la que el al
45 menos un estabilizante comprende un inhibidor de glicosidasa que se selecciona de (i) un inhibidor de trehalasa, (ii) un inhibidor de quitinasa), (iii) un inhibidor de α-glucosidasa, (iv) un inhibidor de glicógeno fosforilasa, (vi) un inhibidor de neuraminidasa, (vi) un inhibidor de ceramida glucosiltransferasa, y (vii) un inhibidor de glucosidasa lisosomal.
[0017] El inhibidor de trehalasa se puede seleccionar de suidatrestina, validamicina A, validoxilamina A, MDL
50 26537, trehazolina, salbostatina y casuarina-6-O-α-D-glucopiranósido. En algunas otras realizaciones adicionales, el material matriz se disuelve en un disolvente. Al menos un estabilizante puede comprender un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico. El disolvente puede comprender un disolvente biocompatible. El material matriz se puede disolver en un disolvente biocompatible. El material matriz puede comprender poli(alcohol vinílico). El material matriz se puede secar a partir de una solución que comprende de aproximadamente 0,1% a
55 aproximadamente 10% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico). La matriz se puede secar a partir de una solución que comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico). La matriz se puede secar a partir de una solución que comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico). La matriz se puede secar a partir de una solución que comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico). La matriz se puede
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secar a partir de una solución que se selecciona de (i) una solución que comprende aproximadamente 1% en pesovolumen de poli(alcohol vinílico), (ii) una solución que comprende aproximadamente 3% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico), (iii) una solución que comprende aproximadamente 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico), (iv) una solución que comprende aproximadamente 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5 aproximadamente 5% en peso-volumen de trehalosa, (v) una solución que comprende aproximadamente 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y aproximadamente 5% en peso-volumen de validamicina, y (vi) una solución que comprende aproximadamente 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico), aproximadamente 5% en pesovolumen de trehalosa y aproximadamente 5% en peso-volumen de validamicina. La matriz se puede secar a partir de una solución que se selecciona de (i) una solución que comprende de aproximadamente 1% en peso-volumen de 10 a aproximadamente 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y aproximadamente 5% en peso-volumen de un inhibidor de trehalasa, (ii) una solución que comprende aproximadamente 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en peso-volumen de un inhibidor de trehalasa, y (iii) una solución que comprende aproximadamente 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico), aproximadamente 5% en peso-volumen de trehalosa y aproximadamente 5% en peso-volumen de un inhibidor de trehalasa. El inhibidor de
15 trehalasa se puede seleccionar de suidatrestina, validamicina A, validoxilamina A, MDL 26537, trehazolina, salbostatina y casuarina-6-O-α-D-glucopiranósido.
[0018] El material matriz puede comprender al menos un material seleccionado de polietilenglicol, agarosa, poli-Nvinilacetamida, carboximetilcelulosa, 2-hidroxieticelulosa, poli(2-etil-2-oxazolina), polivinilpirrolidona, poli(420 vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada, polimetacrilato, nanotubos de carbono, polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, proteoglicano sulfato de heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico, dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina, fibronectina, un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua y colágeno. Al menos un estabilizante que está presente puede comprender un inhibidor de
25 trehalasa. El inhibidor de trehalasa puede comprender validamicina, el inhibidor de trehalasa se puede seleccionar de suidatrestina, validamicina A, validoxilamina A, MDL 26537, trehazolina, salbostatina y casuarina-6-O-α-Dglucopiranósido.
[0019] La muestra biológica puede comprender al menos uno de (i) una biomolécula aislada que se selecciona de
30 ADN, ARN, una proteína, un polipéptido, un lípido, un glicoconjugado, un oligosacárido y un polisacárido, y (ii) un material biológico que se selecciona de una célula de mamífero, una bacteria, una célula de levadura, un virus, una vacuna, sangre, orina, un fluido biológico y un frotis bucal. Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que comprende (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente, comprendiendo dicho material matriz poli(alcohol vinílico); y (b) un primer estabilizante que
35 comprende trehalosa; y (c) un segundo estabilizante que comprende validamicina A. La matriz puede comprender un tampón que es capaz de mantener un pH deseado, cuyo tampón puede comprender un compuesto que se selecciona de Tris, citrato, acetato, fosfato, borato, HEPES, MES, MOPS, PIPES, carbonato y bicarbonato. El inhibidor biológico o inhibidor bioquímico se selecciona de validamicina A, TL-3, ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, N-α-tosil-Phe-clorometilcetona, N-α-tosil-Lys-clorometilcetona, aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo y
40 fluorofosfato de diisopropilo, o de un inhibidor de quinasa, un inhibidor de fosfatasa, un inhibidor de caspasa, un inhibidor de granzima, un inhibidor de la adhesión celular, un inhibidor de la división celular, un inhibidor del ciclo celular, un inhibidor de la señalización de lípidos y un inhibidor de proteasa, o de un agente de reducción, un agente alquilante y un agente antimicrobiano.
45 [0020] El material matriz puede comprender al menos un material seleccionado de hidroxietcoína y poliestireno. La matriz puede comprender al menos un indicador detectable, puede comprender indicador colorimétrico, y puede comprender uno o una pluralidad de compuestos con marcador de GCMS. El indicador detectable se puede seleccionar de un indicador fluorescente, un indicador luminiscente, un indicador fosforescente, un indicador radiométrico, un colorante, una enzima, un sustrato de una enzima, una molécula de transferencia de energía, y un
50 marcador de afinidad. El indicador detectable puede ser capaz de indicar de forma detectable la presencia de al menos uno de una amina, un alcohol, un aldehído, agua, un tiol, un sulfuro, un nitrito, avidina, biotina, una inmunoglobulina, un oligosacárido, un ácido nucleico, un polipéptido, una enzima, una proteína citoesquelética, una especie de oxígeno reactiva, un ion metálico, pH, Na+, K+, Cl-, un cianuro, un fosfato y selenio. El indicador detectable se puede seleccionar de rojo de fenol, bromuro de etidio, una ADN polimerasa, una endonucleasa de
55 restricción, cloruro de cobalto, colorante de Reichardt y un sustrato de proteasa fluorogénico.
[0021] El material matriz puede ser capaz de almacenar en seco la muestra biológica sin refrigeración.
[0022] Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que
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comprende (a) al menos un material matriz que comprende un polímero que se disuelve o disocia en un disolvente; y
(b) al menos un estabilizante, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante, en la 5 que (I) el material matriz de (a) no se autoensambla de forma covalente y tiene la estructura -[-X-]n en la que X es -CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CH(OH)-sustituido, -CH2CH(COOH)-, -CH2CH(COOH)-sustituido, -CH=CH2, -CH=CH-, alquilo C1-C24 o alquilo sustituido, alquenilo C2-24 o alquenilo sustituido, polioxietileno, polioxipropileno, o un copolímero aleatorio o de bloques de los mismos; y en la que n es un número entero que tiene un valor de aproximadamente 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, o 1501-3000; y en la que (II) el estabilizante no está unido
10 covalentemente al polímero y comprende trehalosa, un inhibidor de trehalosa, o un compuesto que comprende una estructura que se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas (i)-(xv):
imagen1
15 en las que R se selecciona de -H, -OH, -CH2OH, -NHAc y -OAc.
[0023] El polímero puede ser capaz de autoensamblarse de forma no covalente formando uno o una pluralidad de enlaces de hidrógeno. El polímero puede ser capaz de formar al menos un enlace de hidrógeno con al menos un estabilizante. El polímero puede ser capaz de formar al menos un enlace de hidrógeno con al menos uno de una
20 molécula de ácido nucleico y un polipéptido. El polímero se puede seleccionar de poli(alcohol vinílico), carboximetilcelulosa, 2-hidroxietilcelulosa, poli(2-etil-2-oxazolina) y polivinilpirrolidona. El estabilizante se puede seleccionar de D-(+)-rafinosa, β-gentiobiosa, trehalosa, ectoína, mioinositol, hidroxiectoína, D-gluconato de magnesio, hemisal de calcio del ácido 2-ceto-D-glucónico hidrato, D(+)-melezitosa y lactobionato de calcio monohidrato.
25 [0024] Se proporciona un procedimiento de almacenamiento de una muestra biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, comprendiendo la matriz: (i) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (ii) al menos un estabilizante, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol,
30 celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante, y de esta forma almacenar dicha muestra biológica. El procedimiento puede comprender mantener la matriz sin refrigeración posteriormente a la etapa de contacto.
35 [0025] Se proporciona un procedimiento de almacenamiento de una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica con una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, comprendiendo la matriz: (i) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (ii) al menos un estabilizante, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es
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trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante; y (b) secar la matriz y de esta forma almacenar dicha muestra biológica. Algunos procedimientos adicionales comprenden mantener la matriz sin refrigeración posteriormente a las etapas de contacto y secado. En algunos procedimientos adicionales más, la actividad biológica de la muestra posteriormente a la etapa de mantenimiento, es 5 sustancialmente la misma que la actividad biológica de la muestra antes de la etapa de contacto. En algunos otros procedimientos adicionales más, la degradación de la muestra biológica es menor con respecto a la degradación de una muestra biológica de control mantenida sin refrigeración en ausencia del material matriz. En algunos otros procedimientos relacionados, la etapa de poner en contacto comprende simultáneamente disolver o disociar el material matriz en un disolvente. En algunos otros procedimientos relacionados, la etapa de poner en contacto es
10 precedida por la disolución o disociación del material matriz en un disolvente. En algunos otros procedimientos relacionados, la etapa de poner en contacto es seguida por disolución o disociación del material matriz en un disolvente.
[0026] Se proporciona un procedimiento de preparación de un dispositivo de almacenamiento de muestras
15 biológicas para una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende (a) administrar una matriz a una o una pluralidad de pocillos de muestra de un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, en el que (1) dicho dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas comprende (i) una tapa, y (ii) una placa de muestras que comprende uno o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una muestra biológica, y en el que (2) la matriz comprende (i) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (ii) al menos un estabilizante,
20 en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante; y (b) secar uno o más pocillos de muestra, y de esta forma preparar el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas. En algunos procedimientos adicionales, la etapa de administrar comprende administrar una solución líquida o una suspensión
25 líquida que contiene el material matriz y el disolvente. En algunos otros procedimientos relacionados, al menos un pocillo comprende al menos un indicador detectable, que en algunos procedimientos adicionales comprende un indicador colorimétrico y que en algunos otros procedimientos adicionales, comprende uno o una pluralidad de compuestos con marcador de GCMS. En algunos procedimientos, el indicador detectable se selecciona de un indicador fluorescente, un indicador luminiscente, un indicador fosforescente, un indicador radiométrico, un
30 colorante, una enzima, un sustrato de una enzima, una molécula de transferencia de energía, y un marcador de afinidad, y en algunos otros procedimientos el indicador detectable puede indicar de forma detectable la presencia de al menos uno de una amina, un alcohol, un aldehído, agua, un tiol, un sulfuro, un nitrito, avidina, biotina, una inmunoglobulina, un oligosacárido, un ácido nucleico, un polipéptido, una enzima, una proteína citoesquelética, una especie de oxígeno reactiva, un ion metálico, pH, Na+, K+, Cl-, un cianuro, un fosfato y selenio. En algunos otros
35 procedimientos, el indicador detectable se puede seleccionar de rojo de fenol, bromuro de etidio, una ADN polimerasa, una endonucleasa de restricción, cloruro de cobalto, colorante de Reichardt y un sustrato de proteasa fluorogénico. En algunos otros procedimientos, al menos un pocillo comprende al menos un estabilizante que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico.
40 [0027] Se proporciona un procedimiento de recuperación de una muestra biológica almacenada, que comprende
(a) poner en contacto, simultánea o secuencialmente y en cualquier orden en un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, una o una pluralidad de muestras biológicas con una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, en donde (1) dicho dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas comprende (i) una tapa, y (ii) una placa de muestras que comprende uno o una pluralidad de pocillos de 45 muestra que pueden contener la muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden la matriz, y en el que (2) la matriz comprende (i) un material matriz que se disuelve o disuelve o disocia en un disolvente; y (ii) al menos un estabilizante, en la que el estabilizante no es lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol o chitosán, y en la que si el al menos un estabilizante comprende un primer estabilizante que es trehalosa, entonces también está presente un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante; y (b) secar uno 50 o más pocillos de muestra, y (c) mantener el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas sin refrigeración posteriormente a las etapas de contacto y secado; y (d) volver a suspender o disolver la muestra biológica en un segundo disolvente, y a partir de este recuperar la muestra biológica almacenada. En algunos procedimientos adicionales la actividad biológica de la muestra posteriormente a la etapa de mantenimiento es sustancialmente la misma que la actividad biológica de la muestra antes de la etapa de contacto. En algunos otros procedimientos
55 adicionales, el segundo disolvente se selecciona de (i) un disolvente que es el mismo que el primer disolvente, y (ii) un disolvente que es diferente del primer disolvente. En algunos procedimientos relacionados, al menos uno del primer disolvente y el segundo disolvente es un tampón de actividad.
[0028] Se proporciona una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que
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comprende: (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; (b) al menos un estabilizante; y (c) una composición de tratamiento de muestra. La composición de tratamiento de muestra puede comprender una composición que se selecciona de un tampón de actividad, un tampón de lisis celular, un agente de captura de radicales libres, un desnaturalizante de muestra y un agente neutralizante de patógenos.
5 [0029] Se proporciona un sistema para el procesamiento de datos relacionados con el almacenamiento, organización, seguimiento, recuperación y análisis de muestras biológicas, incluyendo el sistema un dispositivo de muestras biológicas; un sistema implementado por ordenador para la recepción, almacenamiento, procesamiento y comunicación de datos relacionados con el dispositivo de muestras; y una interfaz de radiofrecuencia entre el
10 dispositivo de muestras y el sistema implementado por ordenador para proporcionar una conexión de comunicación entre el sistema implementado por ordenador y el dispositivo de muestras.
[0030] Se proporciona lo siguiente: un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas para una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende: (a) una tapa; (b) una placa de muestras que comprende una o 15 una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden un material matriz; y (c) al menos un dispositivo radiotranspondedor. Un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas relacionado en el que el material matriz se disuelve o disocia en un disolvente o que comprende un medio de cierre para cerrar la tapa sobre la placa de muestras, opcionalmente en el que además el medio de cierre comprende un cierre magnético. Un dispositivo de almacenamiento de muestras
20 biológicas relacionado que comprende una junta de cierre hermético, o que comprende una junta de cierre hermético alrededor de cada pocillo, o que comprende un cierre magnético y una junta de cierre hermético alrededor de cada pocillo. Se proporciona un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas relacionado en el que el material matriz puede almacenar en seco la muestra sin refrigeración.
25 [0031] Se proporciona un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas para una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende: (a) una tapa; (b) una placa de muestras que comprende una o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (c) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia. En algunos dispositivos de almacenamiento de muestras biológicas adicionales
30 descritos, al menos un pocillo comprende al menos un indicador detectable, que puede comprender un indicador colorimétrico, y que puede ser un indicador fluorescente, un indicador luminiscente, un indicador fosforescente, un indicador radiométrico, un colorante, una enzima, un sustrato de una enzima, una molécula de transferencia de energía, o un marcador de afinidad. El indicador detectable puede indicar de forma detectable la presencia de al menos uno de una amina, un alcohol, un aldehído, agua, un tiol, un sulfuro, un nitrito, avidina, biotina, una
35 inmunoglobulina, un oligosacárido, un ácido nucleico, un polipéptido, una enzima, una proteína citoesquelética, una especie de oxígeno reactiva, un ion metálico, pH, Na+, K+, Cl-, un cianuro, un fosfato y selenio. El indicador detectable se puede seleccionar del grupo que consiste en rojo de fenol, bromuro de etidio, una ADN polimerasa, una endonucleasa de restricción, cloruro de cobalto, colorante de Reichardt y un sustrato de proteasa fluorogénico.
40 [0032] El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas puede comprender al menos un pocillo que comprende al menos un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, que puede ser validamicina A, TL-3, ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, N-α-tosil-Phe-clorometilcetona, N-α-tosil-Lys-clorometilcetona, aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, fluorofosfato de diisopropilo, un inhibidor de quinasa, un inhibidor de fosfatasa, un inhibidor de caspasa, un inhibidor de granzima, un inhibidor de la adhesión celular, un inhibidor de la
45 división celular, un inhibidor del ciclo celular, un inhibidor de la señalización de lípidos y un inhibidor de proteasa, un agente de reducción; un agente alquilante o un agente antimicrobiano. El material matriz puede ser capaz de almacenamiento en seco de la muestra sin refrigeración, el material matriz puede comprender poli(alcohol vinílico), y el material matriz puede comprender al menos un material seleccionado de polietilenglicol, agarosa, poli-Nvinilacetamida, polivinilpirrolidona, poli(4-vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada, polimetacrilato,
50 nanotubos de carbono, polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, proteoglicano sulfato de heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico, dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina, fibronectina, un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua, colágeno, hidroxiectoína, poliestireno o trehalosa. Se proporciona un kit, que comprende (I) un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas para una o una pluralidad de
55 muestras biológicas, que comprende (a) una tapa; (b) una placa de muestras que comprende una o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden un material matriz; y (c) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia; y (ii) uno o más reactivos auxiliares. El material matriz se puede disolver o disociar en un disolvente.
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[0033] Se proporciona un procedimiento de almacenamiento de una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende poner en contacto una o una pluralidad de muestras biológicas con un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, comprendiendo dicho dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas (i) una tapa; (ii) una placa de muestras que comprende una o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una 5 muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden un material matriz; y (iii) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia, y de esta forma almacenar dichas muestras biológicas, el procedimiento puede comprender mantener el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas sin refrigeración posteriormente a la etapa de contacto. También se proporciona un procedimiento de almacenamiento de una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende (a) poner en contacto una o una pluralidad de 10 muestras biológicas con un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, comprendiendo dicho dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas (i) una tapa; (ii) una placa de muestras que comprende una o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente; y (iii) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia; y (b) secar uno o más de los pocillos de muestra, y de esta forma almacenar 15 dichas muestras biológicas, el procedimiento puede comprender mantener el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas sin refrigeración posteriormente a las etapas de contacto y secado, en el que la actividad biológica de la muestra posteriormente a la etapa de mantenimiento puede ser sustancialmente la misma que la actividad biológica de la muestra antes de la etapa de contacto, y en el que la degradación de la muestra biológica puede ser menor con respecto a la degradación de una muestra biológica de control mantenida sin refrigeración en
20 ausencia del material matriz. La etapa de contacto comprende disolver o disociar simultáneamente el material matriz en un disolvente, la etapa de contacto puede estar precedida por la disolución o disociación del material matriz en un disolvente, a la etapa de contacto le puede seguir la disolución o disociación del material matriz en un disolvente.
[0034] Se proporciona un procedimiento para preparar un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas 25 para una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende (a) administrar un material matriz que se disuelve
o disocia en un disolvente a uno o una pluralidad de pocillos de muestra de un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, en el que dicho dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas comprende (i) una tapa;
(ii) una placa de muestras que comprende una o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una muestra biológica, y (iii) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia; y (b) secar uno o más de los 30 pocillos de muestra, y preparar de esta forma el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas. En algunos procedimientos adicionales, la etapa de administración comprende administrar una solución líquida o una suspensión líquida que contiene el material matriz y el disolvente, mientras que en algunos otros procedimientos adicionales, al menos un pocillo comprende al menos un indicador detectable, mientras en que algunos otros procedimientos adicionales al menos un pocillo comprende al menos un inhibidor que es un inhibidor biológico o un
35 inhibidor bioquímico.
[0035] Se proporciona un procedimiento de recuperación de una muestra biológica, que comprende (a) poner en contacto, simultánea o secuencialmente y en cualquier orden en un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, una o una pluralidad de muestras biológicas con un material matriz, comprendiendo dicho dispositivo de 40 almacenamiento de muestras biológicas (i) una tapa, y (ii) una placa de muestras que comprende uno o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener la muestra biológica, en el que uno o más de dichos pocillos comprenden el material matriz, y en el que el material matriz se disuelve o disuelve o disocia en un primer disolvente; y (iii) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia; (b) secar uno o más de los pocillos de muestra, y (c) mantener el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas sin refrigeración posteriormente a 45 las etapas de contacto y secado; y (d) volver a suspender o disolver la muestra biológica en un segundo disolvente, y a partir de este recuperar la muestra biológica almacenada, en el que en algunos procedimientos adicionales la actividad biológica de la muestra posteriormente a la etapa de mantenimiento es sustancialmente la misma que la actividad biológica de la muestra antes de la etapa de contacto, mientras que en un procedimiento adicional diferente, el segundo disolvente se selecciona de (i) un disolvente que es el mismo que el primer disolvente, y (ii) un
50 disolvente que es diferente del primer disolvente. En algunos procedimientos relacionados, al menos uno del primer disolvente y el segundo disolvente es un tampón de actividad.
[0036] Se proporciona un sistema para el procesamiento de datos relacionados con el almacenamiento, organización, seguimiento, recuperación y análisis de muestras biológicas, comprendiendo el sistema: un dispositivo 55 de muestras biológicas; un sistema implementado por ordenador para recibir y transmitir datos relacionados con el dispositivo de muestras; y una interfaz de radiofrecuencia entre el dispositivo de muestras y el sistema implementado por ordenador para proporcionar una conexión de comunicación entre el sistema implementado por ordenador y el dispositivo de muestras. El sistema implementado por ordenador puede comprender una estructura de datos para mantener los datos relacionados con el almacenamiento, organización, seguimiento, recuperación y análisis de
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muestras biológicas asociadas con el dispositivo de muestras. El interfaz de radiofrecuencia puede comprender un interrogador de radiofrecuencia acoplado con el sistema implementado por ordenador y al menos un dispositivo transpondedor asociado con el dispositivo de muestra para la comunicación de radiofrecuencia con el interrogador.
5 [0037] Se proporciona un procedimiento para el procesamiento de datos relacionados con el almacenamiento, organización, seguimiento, recuperación y análisis de muestras biológicas, comprendiendo el procedimiento: proporcionar un dispositivo de muestras para el almacenamiento de una o más muestras biológicas; proporcionar un sistema implementado por ordenador para la recepción, almacenamiento y transmisión de datos relacionados con el dispositivo de muestras o la muestra biológica o ambos; proporcionar una interfaz de comunicación de
10 radiofrecuencia entre el dispositivo de muestras y el sistema implementado por ordenador. Un procedimiento adicional comprende generar señales de control desde el sistema implementado por ordenador para hacer que la interfaz de radiofrecuencia recupere datos del dispositivo de muestras, y un procedimiento adicional comprende generar señales de control por el sistema implementado por ordenador para transmitir datos al dispositivo de muestras por el interfaz de radiofrecuencia.
15 [0038] Se proporciona un sistema para el procesamiento de datos relacionados con el almacenamiento, organización, seguimiento, recuperación y análisis de muestras biológicas, comprendiendo el sistema un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, comprendiendo dicho dispositivo de almacenamiento de muestras una tapa; una placa de muestras que comprende uno o una pluralidad de pocillos de muestra que pueden contener una
20 muestra biológica; y al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia; un sistema implementado por ordenador para recibir y transmitir datos relacionados con el dispositivo de almacenamiento de muestras; y una interfaz de radiofrecuencia entre el dispositivo de muestras y el sistema implementado por ordenador para proporcionar una conexión de comunicación entre el sistema implementado por ordenador y el dispositivo de muestras. El sistema implementado por ordenador puede comprender una arquitectura de 3 niveles que tiene un
25 navegador web, un programa de servidor web y un servidor de base de datos, y una aplicación del lado del cliente que controla la operación de la interfaz de radiofrecuencia, y el sistema puede comprender una interfaz USB entre el navegador web y un lector RFID. El sistema implementado por ordenador puede comprender una arquitectura de 2 niveles que tiene un programa macro de Excel en un lado del cliente y un servidor de base de datos. El sistema implementado por ordenador puede comprender una arquitectura de 2 niveles que tiene una aplicación de cliente
30 independiente (stand alone) y un servidor de base de datos en comunicación con la aplicación del cliente. La aplicación del cliente puede ser una aplicación compilada.
[0039] Un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas para una o una pluralidad de muestras biológicas, que comprende (a) una tapa, (b) una placa de muestras que comprende uno o una pluralidad de pocillos 35 de muestra que pueden contener una muestra biológica; y (c) al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia. El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas puede comprender un medio de cierre para cerrar la tapa sobre la placa de muestras, el medio de cierre puede comprender un cierre magnético. El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas puede comprender una junta de cierre hermético, el dispositivo de almacenamiento puede comprender una junta de cierre hermético alrededor de cada pocillo. El
40 dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas puede comprender un cierre magnético y una junta de cierre hermético alrededor de cada pocillo.
[0040] Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos.
45 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0041]
La figura 1 es un diagrama esquemático de una placa de muestras para el almacenamiento en seco de materiales 50 biológicos.
La figura 2 es un diagrama esquemático de la unidad de presión de aire y sus módulos de interbloqueo.
La figura 3 es un diagrama esquemático de los canales de aire de la unidad de presión de aire.
55 La figura 4 es un diagrama esquemático de la unidad de presión de aire y su válvula de regulación de aire.
La figura 5 es un diagrama esquemático de un dispositivo de PCR portátil para proporcionar reactivos para una placa de muestras.
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La figura 6 es un diagrama esquemático de la funda de transporte.
La figura 7 es un diagrama esquemático del soporte de apilamiento. 5 La figura 8 es un diagrama esquemático de la placa de pocillos en tira de almacenamiento de muestras.
La figura 9 es un diagrama esquemático de un sistema de comunicación de radiofrecuencia conocido.
10 La figura 10 es un diagrama esquemático de un sistema.
La figura 11 es un diagrama de bloques de la arquitectura de un sistema implementado por ordenador.
La figura 12 muestra la arquitectura del sistema implementado por ordenador. 15 La figura 13 muestra la arquitectura del sistema implementado por ordenador.
La figura 14 muestra un gel con productos de la PCR de la polimerasa Deep Vent™. La polimerasa Deep Vent™ se almacenó a temperatura ambiente (D) y se hidrató durante o bien 60 minutos (D 60’) o 5 minutos (D 5’) en presencia 20 de tampón de reacción, molde, dNTP y cebadores. Se usó una polimerasa Deep Vent almacenada congelada (F) como control. La flecha indica el producto de la PCR del tamaño esperado.
La figura 15 muestra (A) la longitud de lectura (número de bases) para los productos de reacción de la PCR amplificados usando la enzima Big DyeTM almacenada congelada, y almacenada en seco en una matriz soluble a 25 temperatura ambiente; y (B) resultados de secuenciación cíclica.
La figura 16 muestra la cinética de la proteasa del VIH después de almacenamiento en seco en una matriz soluble.
La figura 17 muestra la cinética de la proteasa del VIF después de almacenamiento en seco en una matriz soluble. 30 La figura 18 muestra la actividad de la proteasa del VIH después de almacenamiento en seco.
La figura 19 muestra la velocidad de transformación de E. coli después de almacenamiento en seco en una matriz soluble. 35 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0042] Se describen en el presente documento composiciones y procedimientos para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, basándose en el descubrimiento sorprendente de que en 40 presencia de algunos materiales matriz que se disuelven o disocian en un disolvente y uno o más estabilizantes, una muestra biológica se puede secar y almacenar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongados, de modo que tras la posterior restauración de las condiciones de disolvente, se puede recuperar sustancialmente toda la actividad biológica de la muestra. Como se describe en el presente documento, algunos aspectos se refieren en parte a las ventajas inesperadas proporcionadas por la selección de materiales matriz que se disuelven o disocian
45 en un disolvente biocompatible (p. ej., un disolvente que es compatible con conservar la estructura y/o actividad de una muestra biológica), y en parte a las ventajas inesperadas proporcionadas por la selección de un estabilizante tal como un inhibidor de trehalosa que tiene actividad antimicrobiana.
[0043] Esto permite el almacenamiento eficaz, conveniente y económico de una amplia variedad de muestras
50 biológicas incluyendo polinucleótidos, enzimas y otras proteínas, y células, sin almacenamiento refrigerado o congelado. Las muestras se pueden secar sin liofilización (aunque se puede usar la liofilización si se desea), y después del almacenamiento en seco las muestras se pueden usar inmediatamente tras la reconstitución con disolvente, sin necesidad de separar la muestra del material matriz, que se disuelve o disocia en el disolvente y no interfiere con la actividad biológica de la muestra. Ventajosamente, se ofrecen recuperaciones superiores de las
55 muestras biológicas almacenadas, incluyendo sensibilidad de detección potenciada para muestras en investigación que contienen cantidades mínimas de biomoléculas de interés, y puede tener usos en contextos clínicos, de salud y diagnóstico, en investigación biomédica, investigación biológica y en la ciencia forense, y en productos biológicos y otros casos en los que se desea el almacenamiento y manipulación de muestras para ciencias biológicas.
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[0044] Se proporciona un sistema de múltiples componentes y procedimiento para el aislamiento, purificación, conservación, almacenamiento, seguimiento, recuperación, comparación de datos, control y/o análisis de muestras biológicas y materiales biológicos, minerales y productos químicos descritos en el presente documento. La descripción se puede usar para el almacenamiento de muestras secas y para el almacenamiento a temperatura 5 ambiente, y también se puede usar para el almacenamiento de diversos materiales biológicos y muestras biológicas, tales como, pero no limitado a ADN, ARN, sangre, orina, otros fluidos biológicos (p. ej., suero, líquidos serosos, plasma, linfa, líquido cefalorraquídeo, saliva, secreciones mucosas de tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, líquido ascítico, líquidos pleural, pericárdico, peritoneal, abdominal y de otras cavidades corporales, medio de cultivo de células y órganos incluyendo medio condicionado de células u órganos, líquidos de lavado, y similares, 10 etc.), frotis bucales, bacterias, virus, células de levaduras, productos de la PCR, ADN clonado, ADN genómico, oligonucleótidos, ADN plasmídico, ARNm, ARNt, ARNr, ARNip, ARNim, ARNhn, ADNc, proteínas, polipéptidos, lípidos, glicoconjugados (p. ej., glicolípidos, glicoproteínas), oligosacáridos, polisacáridos, vacunas (p. ej., naturales o sintéticas, vivas o atenuadas en el caso de partículas biológicas intactas tales como vacunas víricas u otras microbianas, o extractos de materiales naturales, sintéticos o artificiales incluyendo productos de ingeniería
15 genética), células y tejidos, lisatos celulares o tisulares, homogeneizados o extractos celulares o tisulares, y similares, u otras muestras biológicas.
[0045] Por lo tanto, las muestras biológicas pueden incluir también una muestra de sangre, muestra de biopsia, explante de tejido, cultivo de órgano, fluido biológico o cualquier otra preparación tisular o celular, o fracción o 20 derivado de los mismos o aislados de los mismos, de un sujeto o una fuente biológica. El sujeto o fuente biológica puede ser un ser humano o animal no humano, incluyendo mamíferos y no mamíferos, vertebrados e invertebrados, y también puede ser cualquier otro organismo multicelular u organismo unicelular tal como un organismo eucariota (incluyendo plantas) o procariota o arqueas, un cultivo celular primario o cultivo adaptado a línea celular, incluyendo, pero no limitado a líneas celulares genéticamente modificadas que pueden contener secuencias de ácidos nucleicos
25 recombinantes cromosómicamente integradas o episomales, líneas celulares inmortalizadas o inmortalizables, líneas celulares híbridas de células somáticas, líneas celulares diferenciadas o diferenciables, líneas celulares transformadas y similares.
[0046] La muestra biológica puede comprender una biomolécula aislada, donde el término “aislada” significa que el
30 material es retirado de su entorno original (p. ej., el entorno natural si se encuentra de forma natural). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido que se encuentra de forma natural presente en una célula intacta o en un animal vivo, no está aislado, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido, separado de algunos o de todos los materiales con los que coexiste en el sistema natural, está aislado. Dichos ácidos nucleicos podrían ser parte de un vector y/o dichos ácidos nucleicos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía estar aislados en cuanto que
35 dicho vector o composición no son parte de su entorno natural.
[0047] Por lo tanto, la descripción se refiere al almacenamiento a largo plazo de material biológico, químico y bioquímico en condiciones secas, y de una forma fácil para el uso inmediato después de hidratación (p. ej., tras rehidratación). Como se describe en el presente documento, se proporcionan a) la matriz de almacenamiento 40 soluble (o disociable) específica, b) la preparación y optimización de la matriz de almacenamiento con productos químicos que aumentan la durabilidad de las condiciones de almacenamiento a largo plazo, p. ej., el uso de un estabilizante que puede ser un inhibidor biológico o bioquímico, por ejemplo, un estabilizante tal como un inhibidor de trehalasa que tiene actividad antimicrobiana, c) preparación de diferentes materiales biológicos antes del procedimiento de secado que permite la actividad y uso inmediatos de los materiales después de rehidratación, y d)
45 el procedimiento de simplificar procesos bioquímicos complejos mediante el uso de los materiales biológicamente activos almacenados en seco.
[0048] Por lo tanto, esto proporciona sorprendentes ventajas asociadas con el almacenamiento de productos biológicos en seco no refrigerados, incluyendo mejor estabilización y conservación de la actividad biológica en las 50 muestras biológicas, menor degradación de las muestras biológicas durante el almacenamiento a temperatura ambiente en forma seca (y en particular por el uso de una matriz protectora), y simplificación de los procedimientos para preparar muestras biológicas para el posterior uso, reduciendo o eliminando la necesidad de recalibración y formación de partes alícuotas de dichas muestras que requiere tiempo, y eliminando la necesidad de separar físicamente una muestra del medio de almacenamiento. Además, se proporcionan recuperaciones de muestras
55 biológicas inesperadamente superiores reduciendo o eliminando factores que de lo contrario, pueden reducir los rendimientos de recuperación de muestras, tales como desnaturalización de la muestra y/o pérdida de muestra indeseados debido a la adsorción de la muestra en las superficies del recipiente de muestra.
[0049] La descripción permite la purificación y el fraccionamiento por tamaños de ADN, ARN, proteínas y otras
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biomoléculas, células, componentes celulares y otros materiales biológicos, minerales, productos químicos o composiciones derivadas de una muestra biológica u otra muestra relacionada con ciencias biológicas. Permite fácilmente, por ejemplo, el uso de una o una pluralidad de materiales biológicos y/o muestras biológicas en la realización de procedimientos de biología molecular, incluyendo, pero no limitado a la reacción en cadena de la 5 polimerasa o PCR (incluyendo RT-PCR), secuenciación de biopolímeros (p. ej., polinucleótidos, polipéptidos, oligosacáridos u otros biopolímeros), extensión con cebadores de oligonucleótidos, clasificación de haplotipos (p. ej., haplotipos de ADN) y mapas de restricción en una plataforma unificada, integrada y fácil de usar. También permite fácilmente, por ejemplo, el uso de una o una pluralidad de muestras biológicas y/o materiales biológicos para llevar a cabo la cristalografía de proteínas. Se proporciona una plataforma para usar, ensayar o detectar (incluyendo 10 aplicaciones de diagnóstico) de un anticuerpo o molécula pequeña (sea natural o artificial) u otra molécula biológica
(p. ej., una “biomolécula”), por ejemplo, una proteína, polipéptido, péptido, aminoácido, o derivado de los mismos; un lípido, ácido graso o similares, o derivados de los mismos; un hidrato de carbono, sacárido o similares o derivados de los mismos, un ácido nucleico, nucleótido, nucleósido, purina, pirimidina o molécula relacionada, o derivados de los mismos, o similares; u otra molécula biológica que es un constituyente de una muestra biológica.
15 Almacenamiento en seco de una muestra biológica
[0050] Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se refieren al almacenamiento en seco y/o sustancialmente en seco de una muestra biológica, y pueden incluir el uso de cualquier recipiente 20 adecuado, incluyendo, por ejemplo, un dispositivo de almacenamiento en seco. El dispositivo de almacenamiento en seco es una aplicación del dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas como se describe en el presente documento, que contiene un material matriz para usar como una matriz de almacenamiento en seco, que incluye un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente como se describe en el presente documento, para el almacenamiento a largo plazo de una muestra biológica o un material biológico, tales como, pero o limitado a
25 sangre, bacterias, células, virus, compuestos químicos (sean naturales o producidos de forma artificial), ADN plasmídico, fragmentos de ADN, oligonucleótidos, péptidos, sustratos fluorogénicos, ADN genómico, productos de la PCR; ADN clonado, proteínas, ARN, vacunas, minerales y productos químicos, y otras muestras biológicas como se describen en el presente documento.
30 [0051] Esto deriva de la observación sorprendente de que el almacenamiento en seco a largo plazo, estable, de muestras biológicas o materiales biológicos se puede realizar sin refrigeración cuando dichas muestras o materiales se cargan sobre un material matriz adecuado, tal como los descritos en el presente documento, incluyendo un material matriz soluble (o disociable). De acuerdo con la teoría no limitante, las materias biológicas presentes en una muestra biológica pueden interaccionar con el material matriz por absorción, adsorción, unión específica o no
35 específica u otro mecanismo de unión, incluyendo los que implican la formación de enlaces no covalentes y/o covalentes, y/o interacciones asociativas intermoleculares, tales como interacciones hidrófobas y/o hidrófilas, formación de enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, y similares. Por consiguiente, se proporcionan dispositivos para el almacenamiento en seco a largo plazo, estable, de muestras biológicas a temperaturas ambientes interiores comunes (p. ej., típicamente 20-27ºC, pero que varían en función de la geografía, estación e
40 instalación física de aproximadamente 15-19 ºC o aproximadamente 18-23 ºC a aproximadamente 22-29 ºC o aproximadamente 28-32 ºC) para usar en procedimientos y sistemas de procesamiento de datos de muestras descritos en el presente documento.
[0052] Se puede usar el material matriz soluble o un material matriz disociable que se puede secar antes, durante
45 o después de poner en contacto con la muestra para proporcionar el almacenamiento en seco. Por lo tanto, procedimientos relacionados implican el uso de dispositivo de almacenamiento de muestras como se describen en el presente documento, que comprenden un material matriz que puede almacenar en seco una muestra biológica o un material biológico sin refrigeración, por ejemplo, a temperatura ambiente. Se puede llevar a cabo una etapa de secado para realizar la carga de la muestra en el material matriz para el almacenamiento en seco, por ejemplo
50 mediante secado con aire, secado a temperatura elevada o por volatilización del disolvente por exposición del material matriz cargado con muestra a presión atmosférica reducida (p. ej., liofilización u otro procedimiento de secado a vacío) o a una corriente de flujo suave de un gas compatible tal como nitrógeno. Las muestras preferiblemente se almacenan secas en condiciones que estabilizan la muestra, es decir, se produce degradación o modificación química o física pequeña o no detectable (p. ej., con significancia estadística) no deseable de la
55 muestra, de acuerdo con criterios que variarán como factor de la naturaleza de la muestra que se almacena y que en cualquier caso será familiar para los expertos en la materia. En otros procedimientos que usan el dispositivo de almacenamiento en seco, la carga de la muestra da como resultado el almacenamiento en seco, por ejemplo, por el cual una muestra líquida es absorbida, adsorbida o atrapada de otra forma por el material matriz, de modo que después de la carga no hay líquido libre fácilmente discernible en o sobre, o desplazado fácilmente del material
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matriz, que se puede secar como se acaba de describir.
[0053] Se proporcionan composiciones y procedimientos para almacenar material biológico (p. ej., ADN genómico, ADN plasmídico, fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas, péptidos, sustancias fluorogénicas, células, virus, 5 compuestos químicos, vacunas, etc.) u otras muestras biológicas proporcionadas en el presente documento, en una matriz compuesta de un material que se disuelve o se disocia en un disolvente que permite la recuperación completa
o recuperación sustancial (p. ej., recuperación de al menos 50 por ciento, preferiblemente al menos 60 por ciento, más preferiblemente al menos 70 por ciento, más preferiblemente al menos 80 por ciento, y típicamente en realizaciones más preferidas, al menos 85 por ciento, más preferiblemente al menos 90, 91, 92, 93 o 94 por ciento, 10 más preferiblemente al menos 95 por ciento, todavía más preferiblemente mayor que 96, 97, 98 o 99 por ciento) del material de muestra seco después de hidratación, rehidratación o reconstitución de la muestra con otro disolvente. Por ejemplo, una matriz soluble debe poder ser solubilizada en un disolvente adecuado que se puede seleccionar basándose en las propiedades del material matriz y/o de la muestra, dependiendo de la metodología particular que se va a usar, y de una forma que permita la recuperación de una o más propiedades estructurales o funcionales 15 deseadas de la muestra (p. ej., la actividad biológica). Igualmente, como otro ejemplo, el material matriz se puede disociar en un disolvente y puede, pero no es necesario, volverse completamente solubilizado, de modo que se pueda obtener una dispersión, suspensión, coloide, gel, goma, suspensión, jarabe o similar. Un material matriz puede incluir uno o más componentes tales como, pero no limitado a un material de tipo esponja, sílice, polvo de sílice, papel de filtro de sílice, polvo absorbente, algodón, lana, lino, poliéster o papel de filtro, cualquiera de los
20 cuales puede influir en las propiedades fisicoquímicas, incluyendo las propiedades de solubilidad de la matriz de almacenamiento, como apreciarán los expertos en la materia.
[0054] El primer disolvente que se usa para introducir el material matriz y/o la muestra biológica en el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas antes de una etapa de secado para el almacenamiento de la muestra en 25 seco, puede ser el mismo que el segundo disolvente que posteriormente se usa para hidratar, rehidratar, reconstituir
o volver a suspender la combinación de muestra/matriz seca, y el segundo disolvente puede ser diferente del primero. Los criterios para seleccionar un disolvente adecuado para disolver o disociar el material matriz y/o la muestra biológica serán conocidos para los que están familiarizados con la materia relevante, basados, por ejemplo, en las propiedades fisicoquímicas del material matriz particular y la muestra que se usa, y en las propiedades
30 estructurales o funcionales (p. ej., bioactividad) que se desean retener durante el almacenamiento en seco y la posterior reconstitución, así como en otros factores (p. ej., la compatibilidad con otros materiales del dispositivo de almacenamiento, o equipamiento de manipulación de líquidos, seguridad, etc.).
[0055] Al menos un disolvente para usar en las composiciones y procedimientos descritos en el presente
35 documento, puede ser acuoso, por ejemplo, un disolvente biocompatible, tal como un fluido biológico, una solución fisiológica o una solución tampón biológica acuosa seleccionada para soportar una estructura y/o función biológica de una biomolécula, conservando un medio químico favorable para esa biomolécula que es propicio para la estructura y/o función. Los ejemplos no limitantes de dichos disolventes biocompatibles incluyen solución salina fisiológica (p. ej., NaCl aproximadamente 145 mM), solución de Ringer, solución salina equilibrada de Hank, solución
40 salina tamponada de fosfato Dulbecco, solución salina equilibrada de Erle, y otros tampones y soluciones y similares, como conocerán los familiarizados con la materia, incluyendo los que contienen aditivos que puedan ser deseados para biomoléculas particulares de interés.
[0056] Sin embargo, se pueden seleccionar otros disolventes, por ejemplo, basado en el valor de la escala de
45 polaridad/polarizabilidad del disolvente (SPP) usando el sistema de Catalan y col. (p. ej., 1995 Liebigs Ann. 241; véase también Catalan, 2001, en: Handbook of Solvents, Wypych (Ed.), Andrew Publ., NY, y referencias citadas en el mismo), de acuerdo con el cual, por ejemplo, el agua tiene un valor de SPP de 0,962, el tolueno tiene un valor de SPP de 0,655, y el 2-propanol un valor de SPP de 0,848. Se han descrito procedimientos para determinar el valor de SPP de un disolvente basándose en mediciones de ultravioleta de la pareja de sonda/homomorfo 2-N,N-dimetil-7
50 nitrofluoreno/2-fluoro-7-nitrofluoreno (Catalan y col., 1995). Los disolventes con los valores de SPP deseados (sea como disolventes de un solo componente puros o como mezclas de disolventes de 2, 3, 4 o más disolventes; para la miscibilidad de disolventes véase, por ejemplo, Godfrey 1972 Chem. Technol. 2:359) los pueden identificar fácilmente basándose en las propiedades de solubilidad de un material matriz particular, los familiarizados con la materia, en vista de la presente descripción.
55 Matriz soluble
[0057] De acuerdo con la teoría no limitante, el material matriz soluble o disociable puede, por lo tanto, comprender una estructura de polímero que, formando una matriz, crea un espacio tridimensional que permite que el
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material biológico de la muestra biológica se asocie con la matriz. El material matriz soluble o disociable se puede usar para introducir agentes estabilizantes tales como sales y tampones en condiciones deshidratadas (p. ej., secos
o sustancialmente exentos de disolvente). La matriz también permite la inclusión de componentes (p. ej., tampones) para el ajuste del pH y otros parámetros para las condiciones de secado y almacenamiento óptimas, y puede
5 comprender una o una pluralidad de indicadores detectables proporcionados en el presente documento, tales como indicadores de pH basados en color, y/o indicadores de humedad.
[0058] El material matriz puede comprender poli(alcohol vinílico) (PVA), un material matriz soluble. El PVA se puede obtener de una variedad de fuentes comerciales (p. ej., Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Fluka, Milwaukee, WI) y 10 está disponible en pesos moleculares discretos específicos o, alternativamente, como una preparación polidispersa de polímeros con varios intervalos de pesos moleculares fijados basados en grados de polimerización variables. Por ejemplo, las series Mowiol® de productos de PVA se pueden obtener en Fluka con intervalos de pesos moleculares de 16, 27, 31, 47, 55, 61, 67, 130, 145, o 195 kDa, y se conocen otros productos de PVA, tal como la preparación que tiene un peso molecular medio de 30-70 kDa (Sigma Nº P 8136) usada en los ejemplos adjuntos. Basándose en 15 la presente descripción, el experto apreciará que, dependiendo de las propiedades fisicoquímicas (p. ej., masa molecular, hidrofobicidad, distribución de carga superficial, solubilidad etc.) de una biomolécula particular de interés que está presente en una muestra biológica que se va a almacenar en condiciones en seco como se describe en el presente documento, se pueden identificar fácilmente y sin excesiva experimentación estos y otros productos de PVA, u otros materiales matriz adecuados que se disuelven o disocian en un disolvente, para usar de acuerdo con
20 las presentes composiciones y procedimientos.
[0059] Como se describe en el presente documento, una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de la muestra biológica se puede preparar por secado a partir de una solución que comprende de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 10% en peso-volumen de PVA, que puede comprender de aproximadamente 0,5% a 25 aproximadamente 5%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1%, aproximadamente 3%, o aproximadamente 5% en peso-volumen de PVA, donde “aproximadamente” se puede entender que representa la variación cuantitativa que puede ser más o menos que la cantidad citada en menos de 50%, más preferiblemente menos de 40%, más preferiblemente menos de 30% y más preferiblemente menos de 20%, 15%, 10% o 5%. De la misma forma las relaciones en peso-volumen
30 y tolerancias pueden aplicarse a otros materiales matriz secos, en los que el material matriz es distinto del PVA proporcionado en el presente documento, por ejemplo, en el que el material matriz comprende uno o más de polivinilpirrolidona (PVP), carboximetilcelulosa (CMC), 2-hidroxietilcelulosa, poli(2-etil-2-oxazolina) y similares, u otro material matriz como se describe en el presente documento.
35 [0060] El material matriz soluble o disociable puede ser, por lo tanto, cualquier material adecuado, que tenga las características compatibles para el almacenamiento de un tipo particular de muestra biológica, de modo que conserve satisfactoriamente las propiedades estructurales y/o funcionales deseadas, incluyendo dichas características la capacidad de secar de una manera que forme una matriz dentro de los intersticios de la cual se depositen las moléculas biológicas de interés, e incluyendo también la compatibilidad de disolvente adecuada (p. ej.,
40 tampón biológico) que además incluye la capacidad de volver a ser disuelto o suspendido posteriormente al almacenamiento en seco, de una manera por la cual las moléculas de la matriz no interfieran con una o más actividades biológicas de interés en la muestra.
[0061] Ejemplos adicionales no limitantes de un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente incluyen
45 polietilenglicol, agarosa, poli-N-vinilacetamida, polivinilpirrolidona, poli(4-vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada de forma reversible, polimetacrilato, nanotubos de carbono (p. ej., Dyke y col., 2003 JACS 125:1156; Mitchell y col., 2002 Macromolecules 35:8825; Dagani, 2003 C&EN 81:5), polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa
(p. ej., Langer, 1990 Science 249:1527; Langer, 1993 Accounts Chem. Res. 26:537-542), proteoglicano sulfato de
50 heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico (p. ej., Kirn-Safran y col., 2004 Birth Defects Res. C. Embryo Today 72:69-88), dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina (p. ej., Elzie y col., 2004 Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:1090; Pavlov y col., 2004 Birth Defects Res. C. Embryo Today 72:12-24), fibronectina (p. ej., Wierzbicka-Patynowski y col., 2003 J. Cell Set. 116(Pt 16):3269-76), un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua (p. ej., Yamamoto y col., 2002 Curr Drug Targets 3(2):123-30), y colágeno o fragmentos de
55 colágeno que incluyen péptidos de colágeno de la membrana basal (p. ej., Ortega y col., 2002 J. Cell Sci. 115(Pt 22):4201-14).
[0062] Se contemplan algunos ejemplos que excluyen expresamente materiales matriz solubles o disociables tales como polímeros catiónicos solubles (p. ej., DEAE-dextrano) o polímeros aniónicos (p. ej., sulfato de dextrano) o
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agarosa cuando se usan, en ausencia de otros componentes de las realizaciones descritas en el presente documento, con un estabilizante di o trisacárido (p. ej., trehalosa, lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol, o chitosán) como se describe para el almacenamiento de proteínas en seco, por ejemplo, en una o más de la patente de EE.UU. nº 5.240.843, patente de EE.UU. nº 5.834.254, patente de 5 EE.UU. nº 5.556.771, patente de EE.UU. nº 4.891.319, WO 87/00196, WO 89/00012, WO 89/06542, patente de EE.UU. nº 5.876.992, patente de EE.UU. nº 4.451.569, EP 0448146A1, WO 90/05182, y WO 91/14773, pero algunos otros ejemplos contemplan el uso de dichas combinaciones de un material matriz soluble o disociable y al menos uno de dicho primer estabilizante di o trisacárido, junto con un segundo estabilizante que comprende un inhibidor biológico o bioquímico que puede ser un inhibidor de trahalasa como se describe en el presente documento y que 10 tiene actividad antimicrobiana (p. ej., validamicina A, suidatrestina, validoxilamina A, MDL 26537, trehazolina, salbostatina, y/o casuarina-6-O-α-D-glucopiranósido), y/o uno o más de otros estabilizantes distintos y/o componentes de la matriz de almacenamiento en seco adicionales como se describen en el presente documento, cuyas combinaciones no sugieren los documentos citados. Algunos otros ejemplos contemplan el uso de dichas combinaciones de un material matriz soluble o disociable y al menos uno de dicho estabilizante di o trisacárido para
15 el almacenamiento sustancialmente en seco de muestras biológicas distintas de proteínas, por ejemplo, polinucleótidos tales como ADN, ARN, oligonucleótidos sintéticos, ADN genómico, plásmidos de ácidos nucleicos naturales o recombinantes y construcciones, y similares.
[0063] En algunos ejemplos descritos en el presente documento, una matriz para el almacenamiento en seco o
20 sustancialmente seco de una muestra biológica comprende al menos un material matriz que comprende un polímero que se disuelve o disocia en un disolvente y un estabilizante, en el que el polímero no se autoensambla de forma covalente y tiene la estructura:
-[-X-]n
25 en donde X es -CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CH(OH)-sustituido, -CH2CH(COOH)-, -CH2CH(COOH)-sustituido, -CH=CH2, -CH=CH-, alquilo C1-C24 o alquilo sustituido, alquenilo C2-24 o alquenilo sustituido, polioxietileno, polioxipropileno, o un copolímero aleatorio o de bloques de los mismos; y en el que n es un número entero que tiene un valor de aproximadamente 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, o 1501-3000. La síntesis de dichos polímeros
30 (incluyendo, p. ej., PVA, PVP, carboximetilcelulosa (CMC), 2-hidroxietilcelulosa, poli(2-etil-2-oxazolina), etc.) se puede llevar a cabo usando reactivos que están disponibles en el comercio (p. ej., el PVA como se ha descrito antes u otros reactivos tales como el PVP, carboximetilcelulosa (CMC), y/o 2-hidroxietilcelulosa de SigmaAldrich o Fluka, o polímeros Carbopol® de Noveon, Inc., Cleveland, OH, o poli(2-etil-2-oxazolina) de VWR, etc.) y de acuerdo con los procedimientos establecidos, tales como los que se encuentran en Fiesers’ Reagents for Organic Synthesis (T.-L. Ho
35 (Ed.), Fieser, L.F. and Fieser, M., 1999 John Wiley & Sons, NY).
[0064] “Alquilo” significa un hidrocarburo alifático insaturado o saturado, no cíclico o cíclico, de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares; mientras que los alquilos ramificados
40 saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares; mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo, y similares. Los alquilos cíclicos también se denominan en el presente documento “homociclos” o “anillos homocíclicos”. Los alquilos insaturados contienen al menos un doble enlace o triple enlace entre átomos de carbono adyacentes (denominados “alquenilo” o “alquinilo”,
45 respectivamente). Los alquenilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2butenilo, y similares; mientras que los alquinilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo, y similares.
50 [0065] “Alcoxi” significa un resto alquilo unido por un puente de oxígeno (es decir, -O-alquilo) tales como metoxi, etoxi, y similares.
[0066] “Alquiltio” significa un resto alquilo unido por un puente de azufre (es decir, -S-alquilo) tales como metiltio, etiltio, y similares.
55 [0067] “Alquilsulfonilo” significa un resto alquilo unido por un puente de sulfonilo (es decir, -SO2-alquilo) tales como metilsulfonilo, etilsulfonilo, y similares.
[0068] “Alquilamino” y “dialquilamino” significa uno o dos restos alquilo unidos por un puente de nitrógeno (es
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decir, -N-alquilo) tal como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, y similares.
[0069] “Arilo” significa un resto carbocíclico aromático tal como fenilo o naftilo.
5 [0070] “Arilalquilo” significa un alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno del alquilo sustituido por un resto arilo, tal como bencilo, --(CH2)2-fenilo, --(CH2)3-fenilo, --CH(fenilo)2, y similares.
[0071] “Heteroarilo” significa un anillo heterociclo aromático de 5 a 10 miembros y que tiene al menos un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno y azufre, y que contiene al menos 1 átomo de carbono, incluyendo
10 sistemas de anillos monocíclicos y bicíclicos. Los heteroarilos representativos son furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, isoindolilo, azaindolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cinolinilo, ftalazinilo, y quinazolinilo.
15 [0072] “Heteroarilalquilo” significa un alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno del alquilo sustituido por un resto heteroarilo, tal como --CH2-piridinilo, --CH2-pirimidinilo, y similares.
[0073] “Halógeno” significa flúor, cloro, bromo y yodo. “Halogenoalquilo” significa un alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno sustituido por halógeno, tal como trifluorometilo y similares.
20 [0074] “Heterociclo” (también denominado un “anillo heterocíclico”) significa un anillo heterocíclico monocíclico de 4 a 7 miembros, o bicíclico de 7 a 10 miembros, que es saturado, insaturado o aromático, y que contienen de 1 a 4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y en el que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente
25 cuaternizado, incluyendo anillos bicíclicos en los que cualquiera de los heterociclos anteriores está condensado con un anillo de benceno. El heterociclo puede estar unido por cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se han definido antes. Por lo tanto, además de los heteroarilos listados antes, los heterociclos incluyen también morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo,
30 tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, y similares.
[0075] “Heterocicloalquilo” significa un alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno del alquilo sustituido por un heterociclo, tal como --CH2-morfolinilo, y similares.
35 [0076] “Homociclo” (también denominado en el presente documento “anillo homocíclico”) significa un anillo carbocíclico saturado o insaturado (pero no aromático) que contiene 3-7 átomos de carbono, tal como ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, ciclohexeno, y similares.
[0077] El término “sustituido” como se usa en el presente documento significa cualquiera de los grupos anteriores
40 (p. ej., alquilo, alquenilo, alquinilo, homociclo) en los que al menos un átomo de hidrógeno se sustituye por un sustituyente. En el caso de un sustituyente ceto (“-C(=O)-“) se sustituyen dos átomos de hidrógeno. Cuando uno o más de los grupos anteriores están sustituidos, los “sustituyentes” incluyen halógeno, hidroxi, ciano, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo, alcoxi, alquiltio, halogenoalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y heterocicloalquilo, así como --NRaRb, --NRaC(=O)Rb-, NRaC(=O)NRaNRb, --NRaC(=O)ORb, --NRaSO2Rb,
45 --C(=O)Ra, -C(=O)ORa, --C(=O)NRaRb, --OC(=O)NRaRb, --ORa, --SRa, --SORa, -S(=O)2Ra, --OS(=O)2Ra y --S(=O)2ORa. Además, los sustituyentes anteriores pueden estar además sustituidos con uno o más de los sustituyentes anteriores, da modo que el sustituyente es alquilo sustituido, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, heterociclo sustituido o heterocicloalquilo sustituido. Ra y Rb en este contexto pueden ser iguales o diferentes e independientemente hidrógeno, alquilo, halogenoalquilo, arilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilaquilo
50 sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido.
[0078] El polímero preferiblemente comprende una pluralidad de restos que forman enlaces de hidrógeno que pueden ser iguales o diferentes, teniendo cada resto que forma enlace de hidrógeno uno o más grupos capaces de formar un enlace de hidrógeno con el mismo o diferentes restos, que pueden estar presentes en una biomolécula de 55 interés dentro de una muestra biológica. Cada resto que forma enlace de hidrógeno puede tener grupos donadores y/o aceptores de enlace de hidrógeno. Preferiblemente, cada resto que forma enlace de hidrógeno tiene tanto grupos donadores como aceptores. Sin embargo, los restos que forman enlaces de hidrógeno pueden tener solo grupos donadores o aceptores. Así, por ejemplo, un polímero que tiene restos que forman enlaces de hidrógeno con solo grupos donadores se puede usar junto con un polímero que tiene restos que forman enlaces de hidrógeno con
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solo grupos aceptores. También, por ejemplo, un polímero puede comprender tanto restos que forman enlaces de hidrógeno que son grupos totalmente donadores como restos que forman enlaces de hidrógeno que son restos totalmente aceptores.
5 [0079] Los polímeros preferidos además tienen algunas unidades monómeras que tienen solo un grupo que forma enlace de hidrógeno. Dichos monómeros monofuncionales están presentes como monómeros que detienen la cadena y se pueden usar para controlar el peso molecular del polímero. Es preferible si estos monómeros monofuncionales están presentes en 10% o menos del número total del material monómero que comprende el polímero, más preferiblemente menos de 5%. Los polímeros que contienen uno o más grupos que forman enlaces
10 de hidrógeno se denominan también como “capaces de formar al menos un enlace de hidrógeno” y pueden ser capaces de hacerlo con otras moléculas de polímero, con al menos un estabilizante y/o con al menos una biomolécula de interés que está presente en una muestra biológica, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o una molécula de polipéptido.
15 [0080] Preferiblemente, las moléculas de polímero pueden ser capaces de formar al menos un enlace de hidrógeno con un componente de la muestra biológica de una forma que es preferente a la formación de enlace de hidrógeno de polímero-polímero, con la condición de que el polímero no se autoensamble de forma covalente. De acuerdo con una teoría no limitante, las interacciones estabilizantes entre la muestra biológica, la matriz y/o el estabilizante resultan de las interacciones de enlaces de hidrógeno. Sin embargo, otras fuerzas no covalentes
20 también pueden contribuir a los enlaces tales como, por ejemplo, fuerzas electrostáticas, fuerzas de van der Waals y, cuando los restos que forman enlaces de hidrógeno comprenden uno o más anillos aromáticos, apilamiento pi-pi. La fuerza de cada enlace de hidrógeno preferiblemente varía de 1-40 kcal/mol, dependiendo de la naturaleza y funcionalidad de donadores y aceptores implicados.
25 [0081] Los grupos en los restos que forman enlaces de hidrógeno que pueden formar un enlace de hidrógeno con el mismo o diferentes restos, se proporcionan en forma de restos “X sustituidos” y se pueden seleccionar adecuadamente de, por ejemplo, grupos >C=O, -COO-, -COOH, -O-, -O-H, -NH2, >N-H, >N-, -CONH-, -F, -C=N-y mezclas de los mismos. Preferiblemente, los grupos se seleccionan de >C=O, -O-H, -NH2, >NH, -CONH-, -C=N-y mezclas de los mismos.
30 Estabilizante
[0082] La matriz soluble/disociable también se puede preparar en el dispositivo de almacenamiento de muestras de una forma tal que uno o más pocillos contienen al menos un estabilizante, o al menos dos estabilizantes, que 35 pueden incluir cualquier agente que convenientemente pueda estar incluido para conservar, estabilizar, mantener, proteger o contribuir de otra forma a la recuperación de una muestra biológica del dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas, que tenga sustancialmente la misma actividad biológica que estaba presente antes de la etapa de contacto de la muestra con el dispositivo de almacenamiento de muestras. El estabilizante puede comprender un agente que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, como se proporciona en el presente documento. Por
40 consiguiente, el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas comprende al menos un estabilizante que es un inhibidor, por ejemplo, un agente antimicrobiano tal como (pero no limitado a) un agente antifúngico y/o antibacteriano capaz de inhibir o suprimir el crecimiento, viabilidad y/o colonización bacteriana o fúngica, para inhibir la contaminación microbiana de los pocillos y la muestra almacenada durante el almacenamiento a largo plazo.
45 [0083] Los estabilizantes preferidos descritos en el presente documento comprenden inhibidores biológicos o bioquímicos que son inhibidores de glicosidasa, tales como inhibidores de trehalasa (p. ej., suidatrestina, validamicina A, validoxilamina A, MDL 26537, trehazolina, salbostatina, casuarina-6-O-α-D-glucopiranósido) descritos por Asano (2003, Glycobiol. 13(10):93R-104R), Knuesel y col. (1998, Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 120:639), Dong y col. (2001, J. Am. Chem. Soc. 123(12):2733) y Kameda y col. (1980, J. Antibiot. (Tokyo)
50 33(12):1573). Una ventaja inesperada asociada con el uso de dichos inhibidores deriva de las propiedades antimicrobianas de estos inhibidores, además de sus efectos estabilizantes de biomoléculas que se cree, de acuerdo con la teoría no limitante, que derivan de interacciones no covalentes, tales como enlace de hidrógeno, entre el inhibidor y una o más de las biomoléculas en la muestra biológica, el material matriz y/o el disolvente.
55 [0084] Un estabilizante puede ser otro inhibidor de glicosidasa tal como un inhibidor de quitinasa (p. ej., alosamidina, argifina, argadina), un inhibidor de α-glucosidasa (p. ej., valiolamina, voglibosa, nojirimicina, 1desoxinojirimicina, miglitol, salacinol, kotalanol, NB-DNJ, NN-DNJ, glicovir, castanospermina), un inhibidor de glucógeno fosforilasa (p. ej., D-ABI, isofagomina, fagomina), un inhibidor de neuraminidasa (p. ej., DANA, FANA, 4amino-4-desoxi-DANA, zanamivir, BCX 140, GS 4071, GS 4104, peramivir), un inhibidor de ceramida
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glucosiltransferasa o un inhibidor de glicosidasa lisosomal, se describen ejemplos no limitantes de todos los inhibidores de glicosidasa en Asano (2003 Glycobiol. 13(10):93R-104R).
[0085] El estabilizante que comprende un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, puede ser un agente de
5 reducción, un agente alquilante, un agente antimicrobiano, un inhibidor de quinasa, un inhibidor de fosfatasa, un inhibidor de caspasa, un inhibidor de granzima, un inhibidor de la adhesión celular, un inhibidor de la división celular, un inhibidor del ciclo celular, un inhibidor de la señalización de lípidos y/o un inhibidor de proteasa. Los expertos en la materia serán conscientes de una amplia variedad de inhibidores fácilmente disponibles que se pueden seleccionar dependiendo de la naturaleza de la muestra biológica y de la bioactividad particular de interés. Véase, p.
10 ej., Inhibidor Calbiochem® SourceBook™ (2004, EMD Biosciences, La Jolla, CA). Para agentes antimicrobianos, véase p. ej., Pickering, LK, Ed. 2003 “Red Book: Report of the Committee on Infections Diseases”; 26ª edición. Elk Grove Village, IL, pág. 695-97.; American Academy of Pediatrics, 1998, Pediatrics, 101(1), suplemento; “Disinfection Sterilization and Preservation”, Seymour S. Block (Ed.), 2001 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia; “Antimicrobial Inhibitors”, A.I. Laskin and H. A. Lechevalier, (Eds.), 1988 CRC Press, Boca Raton, FL; “Principles and
15 Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization”, A.D. Russell y col., (Eds.), 1999, Blackwell Science, Malden, MA; “Antimicrobial/ anti-infective materials”, S.P. Sawan y col., (Eds.), 2000 Technomic Pub. Co., Lancaster, PA; “Development of novel antimicrobial agents: emerging strategies”, K. Lohner, (Ed.), 2001 Wymondham, Norfolk, UK; Conte, J.E. “Manual of antibiotics and infectious diseases” (9ª Ed.), 2001, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
20 [0086] Como se ha indicado antes, el estabilizante puede ser un inhibidor de trehalasa tal como el fungicida validamicina A (p. ej., Kameda y col., 1980, J. Antibiot. (Tokyo) 33(12):1573; Dong y col., 2001, J. Am. Chem. Soc. 123(12):2733; disponible en Research Products International Corp., Mt. Prospect, IL, nº de catálogo V21020), el estabilizante puede ser, por ejemplo, un estabilizante que comprende un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, puede ser un inhibidor de proteasa tal como TL-3 (Lee y col., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA
25 95:939; Lee y col., 1999, J. Amer. Chem. Soc. 121:1145; Buhler y col., 2001, J. Virol. 75:9502), N-α-tosil-Pheclorometilcetona, N-α-tosil-Lys-clorometilcetona, aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo o fluorofosfato de diisopropilo, o un inhibidor de fosfatasa tal como ortovanadato de sodio o fluoruro de sodio.
[0087] Como se describe en el presente documento, una ventaja añadida de la matriz soluble es que el recipiente
30 de almacenamiento se puede usar directamente como una cámara de reacción después de disolver la matriz y rehidratación del material. La estabilidad y actividad de las proteínas en forma líquida pueden depender de los requisitos de actividad tales como el pH, concentración de sal y cofactores. La estabilidad de muchas proteínas en algunos casos puede ser extremadamente lábil a temperaturas superiores y, por lo tanto, el secado de proteínas a temperatura ambiente (p. ej., de la sala) puede proporcionar un entorno estabilizante.
35 [0088] También como se describe en el presente documento, incluyendo en los ejemplos, la presencia del disacárido trehalosa que se creía que contribuye a la estabilización de muestras biológicas (p. ej., Garcia de Castro y col., 2000, Appl. Environ. Microbiol. 66:4142; Manzanera y col., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:4328), no era suficiente en determinadas condiciones para sostener la recuperación de la actividad enzimática en una proteína
40 después de almacenamiento en seco. Como antecedentes breves, la trehalosa es un sustrato natural de la trehalasa, una enzima que escinde disacáridos. Se sabe que la trehalosa estabiliza material orgánico tal como proteínas (p. ej., documento PCT/GB86/00396), pero cuando está presente en condiciones subóptimas puede ser desventajosa para el almacenamiento a largo plazo de proteínas a temperatura ambiente, puesto que es una fuente de energía natural para hongos y bacterias. La contaminación con bacterias o con hongos de una muestra biológica
45 almacenada en presencia de trehalosa en condiciones inferiores a las condiciones óptimas de almacenamiento en seco, dará como resultado el crecimiento de microbio(s), y puede producirse la contaminación microbiana indeseada de la muestra almacenada. La validamicina, como se ha descrito también antes, es un inhibidor de la trehalasa que tiene una estructura química que difiere de la de la trehalosa. La validamicina es un fungicida no tóxico que inhibe el crecimiento fúngico bloqueando la actividad enzimática de la trehalasa. Sorprendentemente y como se describe en
50 el presente documento y en los ejemplos, la validamicina A es capaz de estabilizar material biológico a temperatura ambiente. Además del efecto protector para el almacenamiento a largo plazo de material biológico, la validamicina también protege a la muestra almacenada de la contaminación de microorganismos.
[0089] Por consiguiente, se describe un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas que no incluye
55 trehalosa como un componente de un pocillo de muestra o de un material matriz, e igualmente se puede excluir expresamente del pocillo de muestra o el material matriz la presencia de poliestireno y/o de hidroxiextoína. Sin embargo, en vista de las ventajas inesperadas descritas en el presente documento relacionadas con la inclusión de un inhibidor de trehalasa tal como la validamicina (p. ej., validamicina A, u otros inhibidores de trehalasa descritos en el presente documento) como un inhibidor en los dispositivos de almacenamiento de muestras biológicas, algunos
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dispositivos pueden incluir un primer estabilizante que puede ser uno cualquiera o más de trehalosa, lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol, chitosán, hidroxiectoína y/o poliestireno, con la condición de que también esté presente un segundo estabilizante que es un inhibidor de trehalasa como se proporciona en el presente documento, por ejemplo un inhibidor de trehalasa seleccionado de suidatrestina, 5 validamicina A, validoxilamina A, MDL 26537, trehazolina, salbostatina y casuarina-6-O-α-D-glucopiranósido. De acuerdo con la teoría no limitante, un inhibidor de trehalasa conocido en la técnica agrícola como fungicida (p. ej., la validamicina A), proporciona un efecto estabilizante sorprendente cuando se usa en combinación con una matriz soluble en los dispositivos de almacenamiento de muestras biológicas, descritos en el presente documento. Alternativa o adicionalmente al uso descrito en el presente documento de la validamicina (u otro inhibidor de 10 trehalasa) junto con la matriz soluble, se pueden incluir de forma útil otras moléculas pequeñas que tienen actividad como inhibidores o activadores de trehalasa, en los dispositivos de almacenamiento, como estabilizantes adicionales
o como aditivos en el material matriz y/o la muestra, incluyendo disacáridos naturales, pseudo-azúcares que también se conocen como carba-azúcares, y/u otros inhibidores/activadores de trehalasa. Además, los inhibidores de trehalasa tales como la validamicina proporcionan una ventaja en cuanto que protegen al medio de almacenamiento
15 a largo plazo de la contaminación fúngica, bacteriana u otros tipos de contaminación microbiana indeseada.
[0090] Pueden estar presentes estabilizantes adicionales en una matriz de almacenamiento en seco, pero no están covalentemente unidos al material matriz polimérico como se describe en el presente documento, y pueden incluir moléculas pequeñas tales como D-(+)-rafinosa (p. ej., disponible como rafinosa pentahidrato), β-gentiobiosa,
20 trehalosa (cuando se usa con un inhibidor de trehalasa como un segundo estabilizante como se describe en el presente documento), ectoína, mioinositol, hidroxiectoína, D-gluconato de magnesio (p. ej., disponible como hidrato), hemisal de calcio del ácido 2-ceto-D-glucónico hidrato, D(+)-melezitosa y lactobionato de calcio monohidrato, y también pueden incluir otras moléculas pequeñas que comprenden las estructuras (i)-(xv), incluyendo varias cadenas laterales de aminoácidos conocidas y mono, di y polisacáridos tales como:
25
imagen2
en los que R se selecciona de -H, -OH, -CH2OH, -NHAc y OAc. Dichas composiciones se conocen en la materia y están fácilmente disponibles en proveedores comerciales. Se puede seleccionar al menos un estabilizante de 30 trehalosa, lactitol, lactosa, maltosa, maltitol, manitol, sacarosa, sorbitol, celobiosa, inositol, chitosán, hidroxiectoína y/o poliestireno, donde, como también se ha indicado antes, también puede estar presentes un inhibidor de trehalasa como se describe en el presente documento, como un segundo estabilizante, y adicional o alternativamente también está presente un material matriz descrito en el presente documento. Como se ha indicado también antes, expresamente las composiciones de almacenamiento en seco de la patente de EE.UU. nº 5.240.843, patente de
35 EE.UU. nº 5.834.254, patente de EE.UU. nº 5.556.771, patente de EE.UU. nº 4.891.319, WO 87/00196, WO 89/00012, WO 89/06542, patente de EE.UU. nº 5.876.992, patente de EE.UU. nº 4.451.569, EP 0448146A1, WO 90/05182, y WO 91/14773.
[0091] Están disponibles en el comercio estabilizantes de ejemplo y tienen estructuras que son bien conocidas, e
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incluyen las siguientes: ß-Lactosa
5
D-(+)-Rafinosa pentahidrato
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10 ß-Gentiobiosa
Trehalosa
15
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Ectoína
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Mioinositol
D-Lactosa monohidrato
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Hidroxiectoína
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15 Maltitol
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D-Gluconato de magnesio hidrato
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Sacarosa
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10 D-(+)-Maltosa monohidrato
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Hemisal de calcio del ácido 2-ceto-D-glucónico hidrato
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D(+)-melezitosa E06848927
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Lactobionato de calcio monohidrato
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5
Indicador detectable
[0092] Los indicadores detectables incluyen composiciones que permiten la detección (p. ej., con significación
10 estadística con respecto a un control adecuado, como sabrá el experto en la materia) o determinación similar de cualquier parámetro detectable que esté directamente relacionado con condiciones, procedimiento, ruta, inducción, activación, inhibición, regulación, estructura dinámica, estado, contaminación, degradación u otro cambio de actividad o funcional o estructural en una muestra biológica, incluyendo, pero no limitado a actividad enzimática (incluyendo proteolítica y/o nucleolítica), respiratoria, metabólica, catabólica, de unión, catalítica, alostérica,
15 conformacional, u otra actividad bioquímica o biofísica alterada en la muestra biológica, e incluyendo también interacciones entre productos intermedios que se pueden formar como resultado de dichas actividades, incluyendo metabolitos, catabolitos, sustratos, precursores, cofactores y similares.
[0093] Se conocen en la materia una amplia variedad de indicadores detectables, y se pueden seleccionar para la
20 inclusión en las presentes composiciones y procedimientos descritos, dependiendo en el parámetro o parámetros particulares que pueden ser de interés para las muestras biológicas particulares en aplicaciones de almacenamiento de muestras particulares. Los ejemplos no limitantes de parámetros que se pueden detectar mediante dichos indicadores detectables incluyen la detección de la presencia de uno o más de una amina, un alcohol, un aldehído, agua, un tiol, un sulfuro, un nitrito, avidina, biotina, una inmunoglobulina, un oligosacárido, un ácido nucleico, un
25 polipéptido, una enzima, una proteína citoesquelética, una especie de oxígeno reactiva, un ion metálico, pH, Na+, K+, Cl-, un cianuro, un fosfato, selenio, una proteasa, una nucleasa, una quinasa, una fosfatasa, una glucosidasa y un contaminante microbiano, y otros.
[0094] Se describen ejemplos de una amplia variedad de indicadores detectables (incluyendo indicadores
30 colorimétricos) que se pueden seleccionar para propósitos específicos, en Haugland, 2002 “Handbook of Fluorescent Probes and Research Products”-9ª Ed., Molecular Probes, Eugene, OR; en Mohr, 1999, J. Mater. Chem., 9: 2259-2264; en Suslick y col., 2004, Tetrahedron 60:11133-11138; y en la patente de EE.UU. nº 6.323.039. (Véase también, p. ej., Fluka Laboratory Products Catalog, 2001 Fluka, Milwaukee, WI; y Sigma Life Sciences Research Catalog, 2000, Sigma, St. Louis, MO). Un indicador detectable puede ser un indicador fluorescente, un
35 indicador luminiscente, un indicador fosforescente, un indicador radiométrico, un colorante, una enzima, un sustrato de una enzima, una molécula de transferencia de energía, o un marcador de afinidad. En algunas realizaciones preferidas, el indicador detectable puede ser uno o más de rojo de fenol, bromuro de etidio, una ADN polimerasa, una endonucleasa de restricción (p. ej., una enzima de restricción usada como una nucleasa de restricción tal como una endonucleasa de restricción específica de sitio o de secuencia), cloruro de cobalto (un indicador de humedad
40 que cambia de color azul cuando hay agua presente a rosa cuando está seco), colorante de Reichardt y un sustrato de proteasa fluorogénico.
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[0095] Un indicador detectable puede comprender una polinucleótido polimerasa y/o un oligonucleótido adecuado, cualquiera de los cuales o ambos se pueden usar como un indicador, o como componentes de otras aplicaciones basadas en ácidos nucleicos de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento. Las polimerasas (incluyendo ADN polimerasas y ARN polimerasas) útiles incluyen, pero no se limitan a la ADN 5 polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermologa neopolitana (Tne), ADN polimerasa de Thermotoga maritima (Tma), ADN polimerasa de Thermococcus litoralis (Tli o VENT™), ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu), ADN polimerasa DEEPVENT™, ADN polimerasa de Pyrococcus woosii (Pwo), ADN polimerasa de Bacillus sterothermophilus (Bst), ADN polimerasa de Bacillus caldophilus (Bca), ADN polimerasa de Sulfolobus acidocaldarius (Sac), ADN polimerasa de Thermoplasma
10 acidophilum (Tac), ADN polimerasas de Thermus flavus (Tfl/Tub), ADN polimerasa de Thermus ruber (Tru), ADN polimerasa de Thermus brockianus (DYNAZYME™), ADN polimerasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth), ADN polimerasa de micobacteria (Mtb, Mlep), y mutantes y variantes y derivados de los mismos. También se pueden usar ARN polimerasas tales como T3, T5 y SP6, y mutantes, variantes y derivados de las mismas.
15 [0096] Las polimerasas usadas pueden ser cualquier enzima que pueda sintetizar una molécula de ácido nucleico a partir de un molde de ácido nucleico típicamente en la dirección de 5’ a 3’. Las ácido nucleico polimerasas usadas pueden ser mesófilas o termófilas, y preferiblemente son termófilas. Las ADN polimerasas mesófilas preferidas incluyen la ADN polimerasa T7, ADN polimerasa T5, ADN polimerasa de fragmento Klenow, ADN polimerasa III y similares. Las ADN polimerasas termoestables preferidas que se pueden usar incluyen las ADN polimerasas Taq,
20 Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, fragmento Stoffel, VENT™ y DEEPVENT™, y mutantes, variantes y derivados de las mismas (patente de EE.UU. nº 5.436.149; patente de EE.UU. nº 4.889.818; patente de EE.UU. nº 4.965.188; patente de EE.UU. nº 5.079.352; patente de EE.UU. nº 5.614.365; patente de EE.UU. nº 5.374.553; patente de EE.UU. nº 5.270.179; patente de EE.UU. nº 5.047.342; patente de EE.UU. nº 5.512.462; documentos WO 92/06188; WO 92/06200; WO 96/10640; Barnes. W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer y col., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993);
25 Flaman y col., Nucl. Acids Res. 22(15):3259-3260 (1994)).
[0097] Otros indicadores detectables para usar contemplados en el presente documento incluyen reactivos de afinidad tales como anticuerpos, lecitinas, proteínas receptoras de inmunoglobulina Fc (p. ej., proteína A, proteína G u otros receptores de Fc de Staphylococcus aureus), avidina, biotina, otros ligandos, receptores o contrarreceptores 30 o sus análogos o miméticos y similares. Para dichas metodologías de afinidad, se pueden preparar reactivos para mediciones inmunométricas, tal como anticuerpos marcados de forma adecuada o lecitinas, incluyendo, por ejemplo, los marcados con radionúclidos, con fluoróforos, con marcadores de afinidad, con biotina o secuencias miméticas de biotina o los preparados como conjugados de anticuerpo-enzima (véase, p. ej., Weir, D.M., “Handbook of Experimental Immunology”, 1986, Blackwell Scientific, Boston; Scouten, W.H., Methods in Enzymology 135:30-65,
35 1987; Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Haugland, 2002 “Handbook of Fluorescent Probes and Research Products”-9ª Ed., Molecular Probes, Eugene, OR; Scopes, R.K., “Protein Purification: Principles and Practice”, 1987, Springer-Verlag, NY; Hermanson, G.T. y col., “Immobilized Affinity Ligand Techniques”, 1992, Academic Press, Inc., NY; Luo y col., 1998 J. Biotechnol. 65:225 y referencias citadas en los mismos).
40 [0098] Se proporcionan composiciones y procedimientos para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, en los que la matriz para el almacenamiento en seco contiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
o más indicadores detectables, cada uno de los cuales comprende una molécula marcadora fácilmente identificable por cromatografía de gases/espectrometría de masas (GCMS) y única. Se conocen muchas de dichas moléculas 45 marcadores de GCMS y se pueden seleccionar para usar solos o en combinación como restos identificadores detectables, por ejemplo, para codificar perfiles espectrométricos de GCMS únicos para matrices de almacenamiento separadas en distintos pocillos del dispositivo de almacenamiento de muestras. A modo de ilustración y no limitante, se pueden añadir varias combinaciones diferentes de uno, dos o más de dichos marcadores de GCMS a los pocillos individuales de una forma que permita que cada pocillo sea identificado 50 basándose en la “firma” de GCMS de su contenido, permitiendo de esta forma que cualquier muestra que posteriormente sea retirada del pocillo del dispositivo de almacenamiento sea rastreada de nuevo a su pocillo de origen con fines de identificación. Los ejemplos de marcadores de GCMS incluyen α,α,α-trifluorotolueno, αmetilestireno, o-anisindina, cualquiera de una serie de análogos de cocaína distintos y otros compuestos marcadores GCMS que tengan firmas de GCMS fácilmente identificables en condiciones definidas, por ejemplo, como están
55 disponibles en SPEX CertiPrep Inc. (Metuchen, NJ) o en SigmaAldrich (St. Louis, MO), incluyendo productos Supelco® descritos en el catálogo de cromatografía de gases de Supelco® 2005 y disponibles en SigmaAldrich.
[0099] La matriz soluble (o disociable) se puede aplicar a los recipientes de almacenamiento para muestras biológicas, por ejemplo, poniendo en contacto o administrando un material matriz que se disuelve o disocia en un
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disolvente, con uno o una pluralidad de pocillos de muestra de un dispositivo de almacenamiento como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el material matriz soluble se puede adherir fácilmente a los tubos y placas hechos de vidrio o plástico tales como polipropileno, poliestireno u otros materiales. El material soluble se seca, lo cual, a modo de ilustración no limitante, se puede llevar a cabo por secado al aire a temperatura ambiente
5 (típicamente en el intervalo de 20 ºC-30 ºC tal como a 22 ºC, 23 ºC, 24 ºC, 25 ºC) y/o a una temperatura elevada adecuada, y/o a presión atmosférica reducida (p. ej., vacío parcial o total) y/o bajo una corriente de gas adecuado tal como una corriente de aire filtrado, CO2 o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, o por otros medios de secado incluyendo liofilización (es decir, liofilización a presión reducida por la cual se produce la sublimación del disolvente congelado a la fase gaseosa).
10 [0100] Después de la etapa de secado para lograr una matriz que está sustancialmente seca, que se puede secar completamente (p. ej., todo o sustancialmente todo el disolvente detectable se ha eliminado, con significación estadística), o si se desea, para lograr solo el secado parcial, la matriz soluble/disociable está lista para aceptar la muestra biológica que se va a almacenar. Se proporciona una matriz que está sustancialmente seca para el
15 almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, que incluye el almacenamiento de una matriz que se ha combinado con una muestra, y de la que se ha eliminado todo o sustancialmente todo el disolvente detectable, con significación estadística. Preferiblemente, que puede ser, de acuerdo con la naturaleza de la muestra que se va a almacenar y los usos a la que se dirige, más de 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del disolvente detectable se ha eliminado para los fines del almacenamiento
20 sustancialmente en seco.
[0101] El material biológico proporcionado en o derivado de una muestra biológica también se puede añadir a los pocillos o tubos en combinación con la matriz de almacenamiento en forma líquida (p. ej., poniendo en contacto simultáneamente el pocillo de muestra con la muestra y la matriz disuelta o disociada en un disolvente), permitiendo 25 que el secado del material biológico y del material matriz procedan al mismo tiempo, por ejemplo, para llegar a una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco como se proporciona en el presente documento. La matriz soluble no interfiere con reacciones bioquímicas de modo que las etapas de purificación pueden no ser necesarias para separar la matriz de la muestra biológica antes del procesamiento posterior de la muestra, por ejemplo, antes de realizar reacciones bioquímicas, tales como ensayos o similares, en los pocillos del dispositivo de
30 almacenamiento de muestras.
[0102] Las condiciones de tamponamiento en la matriz soluble se pueden ajustar de modo que más de al menos 90 por ciento, preferiblemente más de 95 por ciento, más preferiblemente más de 96, 97, 98 o 99 por ciento de la actividad biológica (p. ej., actividad enzimática o de afinidad, o integridad estructural u otra actividad biológica como
35 se describe en el presente documento y se conoce en la materia) de la muestra biológica se mantiene tras la reconstitución con disolvente (p. ej., rehidratación con agua), eliminando la necesidad de separar laboriosamente la muestra del recipiente de almacenamiento y transferirla a un tampón de reacción en un recipiente separado. Esto puede proporcionar la ventaja inesperada de eliminar la necesidad de separar en partes alícuotas y/o calibrar algunos reactivos biológicos cada vez que se va a ensayar una muestra almacenada.
40 [0103] Otros ejemplos no limitantes de materiales matriz que se pueden usar como materiales matriz de almacenamiento en seco incluyen materiales que comprenden uno o más de policarbonato, celulosa (p. ej., papeles de celulosa tales como papel FTA™, Whatman Corp., Florham Park, NJ), acetato de celulosa, nitrato de celulosa, nitrocelulosa, agarosa, agarosa reticulada tal como agarosa reticulada con 2,3-dibromopropanol, 3,6-anhidro-L
45 galactosa, dextranos y otros polisacáridos incluyendo polisacáridos químicamente reticulados tales como dextrano reticulado con epichlorohidrina o dextrano reticulado con N,N’-metilen-bisacrilamida, microfibra de vidrio borosilicato, fibra de vidrio, asbestos, polímeros y plásticos tales como polipropileno, poliestireno, poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), nailon, polisulfona, polietersulfona, politetrafluoroetileno, y derivados de estos materiales (p. ej., documento
U.S. 5.496.562) así como otros materiales similares conocidos en la materia, o que se puede determinar fácilmente
50 que son adecuados para usar en los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento basados en la presente descripción. Véase también, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.089.407, U.S. 4.891.319, U.S. 4.806.343, y U.S. 6.610.531.
[0104] El material matriz se puede tratar para el almacenamiento y conservación de materiales biológicos. Está
55 bien documentado que el ajuste de las condiciones de tamponamiento y la adición de productos químicos y enzimas y otros reactivos, puede estabilizar el ADN y ARN (por ejemplo, Sambrook y col., 1989; “Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology”, Wiley and Sons, 2003) y/o proteínas, enzimas y/u otros materiales biológicos (por ejemplo, sangre, tejido, fluidos corporales) contra la degradación por enzimas, proteasas y factores medioambientales (por ejemplo, “Current Protocols, Protein Sciences, Cell Biology”, Wiley and Sons, 2003). También
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están contempladas composiciones de matriz para el almacenamiento en seco y procedimientos para su uso que combinan determinados componentes químicos para proporcionar efectos beneficiosos en la muestra biológica, y pueden variar de acuerdo con muestras particulares y usos de las mismas.
5 [0105] Varios de dichos componentes químicos pueden incluir, pero no se limitan a un tampón capaz de mantener un nivel de pH deseado, que puede ser seleccionado por los expertos en la materia, por ejemplo, tampones que comprenden Tris, citrato, acetato, fosfato, borato, HEPES, MES, MOPS, PIPES, carbonato y/o bicarbonato u otros tampones (véase, p. ej., Calbiochem® Biochemicals & Immunochemicals Catalog 2004/2005, pág. 68-69 y páginas citadas en las mismas, EMD Biosciences, La Jolla, CA) y solutos adecuados tales como sales (p. ej., KCl, NaCl,
10 CaCl2, MgCl2, etc.) para mantener, conservar, potenciar, proteger o promover de otra forma uno o más componentes de la muestra biológica (p. ej., biomoléculas) o tampones de actividad que se pueden seleccionar y optimizar para actividades particulares de biomoléculas específicas tales como hibridación de ácidos nucleicos o actividades de enzimas, anticuerpos u otras proteínas, u otros tampones, por ejemplo, tampón de Tris (THAM, Trometanol, 2amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol), tampón de Tris-EDTA (TE), tampón de cloruro sódico/citrato sódico (SSC),
15 tampón de MOPS/acetato sódico/EDTA (MOPS), ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), tampón de acetato sódico a pH fisiológico, y similares.
[0106] Otros componentes químicos que se pueden incluir en las matrices de almacenamiento en seco incluyen ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), inhibidor de ribonucleasa de placenta humana, inhibidor de ribonucleasa
20 bovina, inhibidor de ribonucleasa porcina, pirocarbonato de dietilo, etanol, formamida, tiocianato de guanidinio, complejos de vanadilo-ribonucleósido, macaloide, proteinasa K, heparina, hidroxilamina-oxígeno-ion cúprico, bentonita, sulfato amónico, ditiotreitol (DTT), betamercaptoetanol o anticuerpos de inhibición específicos.
[0107] Por consiguiente, se contempla una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una
25 muestra biológica, que comprende un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente, al menos un estabilizante, y una composición de tratamiento de la muestra. La composición de tratamiento de la muestra puede comprender un tampón de actividad como se describe más adelante, y/o la composición de tratamiento de la muestra puede comprender uno o más de un tampón de lisis celular, un agente de captura de radicales libres, un desnaturalizante de muestra y un agente neutralizador de patógenos. La matriz de almacenamiento en seco
30 comprende, por lo tanto, un conjunto de componentes preparados para efectuar un tratamiento deseado en una muestra biológica cuando la muestra se introduce en la matriz, por ejemplo, si la etapa de contacto de la muestra con la matriz se produce simultáneamente con, o inmediatamente antes de la rehidratación o reconstitución con disolvente de la matriz seca. Además, se contempla cualquier tampón (incluyendo un tampón de actividad, un tampón de lisis celular, etc.), aditivos, composición de tratamiento de la muestra o matriz de almacenamiento en
35 seco descritos en el presente documento, que se puede diseñar y/o configurar de modo que después de secado de la matriz de almacenamiento, solo se pueda añadir agua para obtener un disolvente biocompatible reconstituido, funcional, a partir del cual recuperar la muestra biológica.
[0108] Un tampón de actividad puede comprender un disolvente o solución en forma de líquido, incluyendo un
40 concentrado, o uno o más ingredientes secos que, cuando se reconstituyen con, se disuelven en y/o se diluyen con uno o más disolventes adecuados (p. ej., típicamente agua, o alternativamente un alcohol tal como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, butanol, etc., un disolvente orgánico tal como dimetilsulfóxido, acetonitrilo, fenol, cloroformo, etc., u otro disolvente) según sea adecuado para el uso pretendido, produce un líquido que es adecuado para un uso deseado de la muestra biológica, tal como una caracterización funcional o estructural de uno o más componentes de
45 la muestra.
[0109] Los ejemplos no limitantes de dichos usos pueden incluir determinar una o más actividades enzimáticas, determinar interacciones de unión intermoleculares, detectar la presencia de un polinucleótido o secuencia de aminoácidos específico o de un epítopo inmunológicamente definido o de una estructura de oligosacárido definida, la
50 detección de virus o de células microbianas o de células humanas o animales particulares, determinar metabolitos o catabolitos particulares, etc. todo lo cual se puede llevar a cabo usando condiciones que están definidas y son conocidas para los expertos en la materia relevante, incluyendo condiciones adecuadas que se puede proporcionar a través del contacto de la muestra con un tampón de actividad adecuado.
55 [0110] Un tampón de lisis celular puede ser cualquier composición que se selecciona para la lisis (es decir, alterar una membrana limitante de) una célula u orgánulo, y muchas de dichas formulaciones son conocidas en la materia, basadas en principios de choque osmótico (p. ej., choque hipotónico) y/o alteración de una membrana celular tal como una membrana plasmática por el uso de un tensioactivo tal como un sistema de detergente (p. ej., Triton® X100, Nonidet® P-40, dedecilsulfato sódico, desoxicolato, octil-glucopiranósido, betaínas, o similares) y/o soluto (p.
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ej., urea, hidrocloruro de guanidina, isotiocianato de guanidinio, alta concentración salina) y/o de soluto. Se conocen numerosos tampones de lisis celular y se pueden seleccionar adecuadamente en función de la naturaleza de la muestra biológica y de la(s) biomolécula(s), actividades biológicas o estructuras biológicas que se desea recuperar, que en algunas realizaciones también puede incluir la selección de tampones de pH adecuados; inhibidores
5 biológicos o bioquímicos e indicadores detectables.
[0111] Los desnaturalizantes de muestras pueden variar igualmente en función de la muestra biológica y de la matriz de almacenamiento en seco, pero pueden incluir un agente que no altera de forma covalente (p. ej., con significación estadística con respecto a un control adecuado tal como una muestra sin tratar) al menos uno de la
10 conformación tridimensional, estructura cuaternaria, terciaria y/o secundaria, grado de solvatación, perfil de carga superficial, perfil de hidrofobicidad superficial, o capacidad de formación de enlace de hidrógeno de una biomolécula de interés en la muestra. Los ejemplos de desnaturalizantes de muestra incluyen caótropos (p. ej., urea, guanidina, sales de tiocianato), detergentes (p. ej., dodecilsulfato sódico), condiciones salinas altas u otros agentes o combinaciones de agentes que promueven condiciones desnaturalizantes.
15 [0112] Los agentes de captura de radicales libres para usar en algunas realizaciones pueden incluir cualquier agente que sea capaz de absorber de forma estable un electrón desapareado de un radical libre de un compuesto reactivo, tal como especie de oxígeno reactiva (ROS), por ejemplo, los radicales superóxido, peroxinitrito o hidroxilo, y potencialmente otras especies reactivas, y antioxidantes, representan agentes de captura de radicales libres de
20 ejemplo. Por consiguiente, está disponible en el comercio una amplia variedad de agentes de captura de radicales libres y se pueden seleccionar para la inclusión en las composiciones y procedimientos presentes descritos. Los ejemplos incluyen ascorbato, beta-caroteno, vitamina E, licopeno, terc-nitrosobutano, alfa-fenil-terc-butilnitrona, Nóxido de 5,5-dimetilpirrolina, y otros, como se describe, por ejemplo, en Halliwell y Gutteridge (Free Radicals in Biology and Medicine, 1989 Clarendon Press, Oxford, UK, capítulos 5 y 6); Vanin (1999 Meth. Enzymol. 301:269);
25 Marshall (2001 Stroke 32:190); Yang y col. (2000 Exp. Neurol. 163:39); Zhao y col. (2001 Brain Res. 909:46); y en otras partes.
[0113] Como se ha indicado antes, se contempla la inclusión de un agente neutralizante de patógenos en las composiciones y procedimientos presentes descritos, que incluyen cualquier agente que sea capaz de neutralizar, 30 deteriorar, impedir, inhibir, bloquear, prevenir, contrarrestar, reducir, disminuir o bloquear de otra forma, completa o parcialmente, pero en cualquier caso en una forma que tenga significación estadística con respecto a un control adecuado, cualquier efecto patógeno de un patógeno tal como una bacteria, virus, hongo, parásito, prion, levadura, protozoo, agente infeccioso o cualquier otro agente microbiológico que produzca una enfermedad o trastorno en seres humanos o animales vertebrados. Los expertos en la materia relevante reconocerán agentes neutralizadores
35 de patógenos adecuados para usar de acuerdo con la presente descripción. Los agentes de ejemplo incluyen azida sódica, borato, hipoclorito sódico, peróxido de hidrógeno u otros agentes oxidantes, dicloroisocianurato de sodio, etanol, isopropanol, antibióticos, fungicidas, análogos de nucleósidos, compuestos antivíricos y otros microbiocidas; estos y otros se pueden seleccionar de acuerdo con las propiedades de una muestra biológica particular de interés.
40 [0114] Como se desarrolla más adelante, cada pocillo de un dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas típico en el que se puede usar la matriz de almacenamiento en seco presente descrita, se puede usar para que contenga de aproximadamente 5 µl a aproximadamente 100 µl de material de muestra líquida, preferiblemente de aproximadamente 10 µl a aproximadamente 30 µl de material de muestra líquida. Las cantidades de muestra pueden variar de aproximadamente 0,01 µg a aproximadamente 1000 µg de ADN, ARN, proteína,
45 sangre, orina, virus, bacterias, células, tejidos, extracto celular, extracto tisular, metabolitos, productos químicos u otros materiales. La aplicación de la muestra es por aplicación directa en manchas puntuales y se puede automatizar. Se puede proporcionar a los pocillos con las manchas puntuales un indicador detectable tal como un indicador de color que cambia de color indicando un pocillo ocupado. El cambio de color se puede lograr añadiendo un agente de color. Por ejemplo, se puede depositar colorante rojo Ponceau, amarillo nitrazina, azul bromotimol,
50 verde bromocresol, naranja de metilo, rojo Congo, bromoclorofenol, con o antes o después del material de muestra,
o se puede tratar el material matriz antes o después de depositar el material de muestra en el pocillo. Se puede aplicar un reactivo de color dependiente de pH que cambia de color después de depositar una muestra con un pH biológico de 6,5 a 8,5 en la matriz en el pocillo. Los pocillos con las manchas puntuales se secan en el espacio de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente o en el espacio de aproximadamente
55 0,1 a aproximadamente 10 minutos a temperatura elevada. El ADN se puede recuperar por rehidratación del pocillo hasta de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 veces. El reactivo de rehidratación puede ser una solución o tampón de muestra, por ejemplo, uno que tenga un pH biológico de 6,5 -8,5, tal como tampón de Tris, tampón de Tris-EDTA (TE), tampón de cloruro sódico/citrato sódico (SSC), tampón de MOPS/acetato sódico/EDTA (MOPS), tampón de acetato sódico, u otro tampón como se describe en el presente documento y se conoce en la materia. El
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diseño del dispositivo de almacenamiento en seco se puede aplicar sin modificaciones adicionales para el almacenamiento de muestras biológicas, incluyendo, por ejemplo, ADN genómico purificado de bacterias, levaduras, seres humanos, animales, plantas y otras fuentes. Con modificaciones adicionales, tales como, pero no limitadas a recubrimientos de los filtros con agentes desnaturalizantes para proteasas, el dispositivo de almacenamiento en
5 seco también se puede usar para muestras de bacterias, frotis bucales, tejidos de biopsia, semen, orina, sangre, proteínas y otras muestras.
[0115] Los kits que comprenden el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas como se describe en el presente documento, junto con uno o más reactivos auxiliares, se pueden seleccionar para los usos deseados.
10 Opcionalmente, el kit puede incluir también una caja, estuche, frasco, bidón, cajón, armario, caja de cartón, portador, asa, soporte, bandeja, cubeta, depósito, bolsa, sobre, funda, carcasa o similares, tal como cualquier otro recipiente adecuado. Los reactivos auxiliares pueden incluir uno o más disolventes o tampones como se describen en el presente documento y conocidos en la materia, y pueden incluir un tampón de actividad.
15 El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas
[0116] El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas (“dispositivo de almacenamiento”) está compuesto de una placa de muestras y una tapa. Las dimensiones del dispositivo de almacenamiento pueden ser de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de aproximadamente 80 mm a aproximadamente 200 20 mm de longitud y de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el dispositivo de almacenamiento tiene una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 15 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm y una anchura de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm. El dispositivo de almacenamiento puede estar hecho de polipropileno de color y puede contener tantos como 96, 384, 1536 o más pocillos de depósito de muestra. Cada dispositivo de almacenamiento
25 tiene su propia tapa de cierre hermético. El dispositivo de almacenamiento puede estar fabricado por moldeo por inyección y puede estar hecho de una pieza o de múltiples piezas.
[0117] El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas puede estar configurado para usar en un sistema para el procesamiento de datos de muestras que comprende una interfaz de radiofrecuencia entre el dispositivo de 30 almacenamiento y un sistema implementado por ordenador para recibir, almacenar y/o transmitir datos. Los datos pueden referirse al dispositivo de almacenamiento y/o a una o más muestras biológicas contenidas en el mismo. El dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas puede comprender al menos un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia como se describe en el presente documento, que puede ser un componente integral del dispositivo de almacenamiento y/o puede estar fijado en una superficie interior o exterior del dispositivo de almacenamiento.
35 Adicional o alternativamente, el dispositivo de almacenamiento puede estar marcado con un código de barras, y/o puede contener opcionalmente uno o más campos para la codificación usando rotuladores permanentes, y/o puede incluir opcionalmente un protocolo de manipulación impreso. El material plástico de la placa de muestras puede ser de aproximadamente 1/10 de un mm a aproximadamente 2 mm de grosor, transmite el calor instantáneamente y es resistente al calor hasta aproximadamente 100ºC.
40 [0118] La placa de muestras contiene áreas contenedoras o pocillos con un espacio que preferiblemente es de forma redonda, pero también puede ser cuadrada, rectangular, oblonga o de cualquier otra forma. La parte del fondo de los pocillos puede ser plana, cónica, cilíndrica o redonda de forma o de cualquier otra forma. Los bordes de los pocillos pueden ser cilíndricos, cónicos o de otra forma. El número de pocillos puede ser tan bajo como 1 pocillo por
45 placa de muestra y tantos como varios miles. Lo más preferiblemente hay de aproximadamente 96 a aproximadamente 384 pocillos situados en la placa de muestra. Los pocillos de muestra también pueden estar divididos en grupos de 1, 4 y 8 pocillos que se pueden ajustar en la placa de muestras convencional descrita en el presente documento. Los pocillos están dispuestos en las placas en filas. Para las placas con 96 pocillos una fila contiene 8 pocillos. Un aspecto único es que la placa de muestras puede ser una bandeja que acepte un número de
50 portaobjetos de muestras individuales que tienen una pluralidad de pocillos variados. Cada portaobjetos se ajusta en la bandeja y permite el almacenamiento de un número variado de pocillos en una sola placa. La superficie inferior de los pocillos es fina, preferiblemente con un grosor de aproximadamente 1/10 de un mm a aproximadamente 2 mm.
[0119] Está contemplado que la presente descripción tendrá más valor en el cribado de alta capacidad; es decir,
55 en ensayo o cribado automático de un gran número de muestras biológicas. Tiene valor particular, por ejemplo, en el cribado de compuestos activos de bibliotecas de productos sintéticos o naturales. Por lo tanto, el aparato y los procedimientos de la presente descripción se pueden llevar al ensayo de muestras biológicas o cribado de fármacos de alta capacidad, económico, y tienen aplicación inmediata en una amplia variedad de programas de desarrollo de fármacos. Los pocillos pueden estar organizados en un formado de cribado de alta capacidad tal como un formato
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de placa de 96 pocillos, u otra matriz bidimensional regular, tal como un formato de 1536 o 384 pocillos. Por lo tanto, para el cribado de alta capacidad preferiblemente el formato se puede llevar a la automatización. Se prefiere, por ejemplo, que un aparato automático para usar de acuerdo con el cribado de alta capacidad esté controlado por un ordenador u otro controlador programable. El controlador puede vigilar continuamente los resultados de cada etapa
5 del procedimiento, y puede alterar automáticamente el paradigma de ensayo en respuesta a estos resultados.
[0120] Típicamente, tal como para el cribado de fármacos de alta capacidad, los agentes candidato se proporcionan como “bibliotecas” o colecciones de compuestos, composiciones o moléculas. Dichas moléculas típicamente incluyen compuestos conocidos en la materia como “moléculas pequeñas” y que tienen pesos 10 moleculares menores de 105 daltons, preferiblemente menores de 104 daltons y todavía más preferiblemente menores de 103 daltons. Se pueden proporcionar agentes candidatos adicionales como miembros de una biblioteca combinatoria, que preferiblemente incluye agentes sintéticos preparados de acuerdo con una pluralidad de reacciones químicas predeterminadas realizadas en una pluralidad de recipientes de reacción, que se pueden proporcionar como pocillos en un dispositivo de almacenamiento de acuerdo con la presente descripción. Por 15 ejemplo, se pueden preparar diferentes compuestos de partida usando una o más síntesis en fase sólida, metodologías de mezcla aleatoria registrada y técnicas de división de reacciones registradas que permiten que un constituyente dado experimente de forma trazable una pluralidad de permutaciones y/o combinaciones de condiciones de reacción. Los productos resultantes comprenden una biblioteca que se puede cribar seguido de selección iterativa y procedimientos de síntesis, tales como una biblioteca combinatoria sintética de péptidos (véase, 20 por ejemplo, los documentos PCT/US91/08694 y PCT/US91/04666) u otras composiciones que pueden incluir moléculas pequeñas como se proporcionan en el presente documento (véase, p. ej., los documentos PCT/US94/08542, EP 0774464, U.S. 5.798.035, U.S. 5.789.172, U.S. 5.751.629). Los expertos en la materia apreciarán que se pueden preparar una variedad diversa de dichas bibliotecas de acuerdo con procedimientos establecidos, usando dispositivos de almacenamiento como se describen en el presente documento, y/o se pueden
25 ensayar usando dispositivos y procedimientos de acuerdo con la presente descripción. Por ejemplo, los miembros de una biblioteca de compuestos de ensayo se pueden administrar a una pluralidad de muestras biológicas en cada uno de una pluralidad de pocillos en un dispositivo de almacenamiento de muestras para usar como una matriz de cribado de alta capacidad como se proporciona en el presente documento.
30 [0121] Los pocillos pueden acomodar una muestra biológica o un material biológico en forma de material líquido o seco o ambos. El material matriz sólido, tal como, pero no limitado a material de tipo esponja, sílice, polvo de sílice, papel de filtro de sílice, polvo absorbente o papel de filtro u otros materiales matriz como se describen en el presente documento, se puede añadir a los pocillos y permitirá la introducción de materiales biológicos, de acuerdo con la teoría no limitante, por absorción, adsorción, unión específica o no específica u otro mecanismo de unión, incluyendo
35 los que implican la formación de enlaces químicos no covalentes y/o covalentes y/o interacciones asociativas intermoleculares tales como interacciones hidrófobas y/o hidrófilas, formación de enlace de hidrógeno, interacciones electrostáticas, y similares. El material matriz puede estar integrado en el procedimiento de producción de la unidad de placa de muestras, o puede estar unido por interacciones adhesivas o encajado en los pocillos, o introducido posteriormente en los pocillos antes de, simultáneamente con o posteriormente a la introducción de una o más
40 muestras biológicas en uno o más pocillos. El borde de los pocillos puede ser recto o puede contener bordes salientes. Los bordes salientes pueden retener el material matriz dentro de los pocillos con o sin interacciones adhesivas. El almacenamiento de líquidos se puede lograr por la forma cónica inversa de los pocillos con una pequeña abertura en la superficie de la placa inferior. Una forma cónica inversa retendrá el líquido dentro de los pocillos de una forma a prueba de derrames.
45 [0122] La tapa puede ser plana o tener salientes que ajustan en los pocillos de la placa de muestras inferior. La tapa y la placa de muestras cierran bien mediante cierre por ajuste exacto de la placa de muestras y la tapa, o se proporciona una junta de cierre hermético o un amortiguador de material compresible. La junta se puede poner alrededor del perímetro de la palca de muestras y la tapa o alrededor de cada pocillo individual. La junta puede estar
50 unida a la placa de muestras o a la tapa. Preferiblemente, la junta está situada en un borde, o pegada a la tapa usando un material adhesivo. Un ajuste hermético se puede lograr insertando los salientes de la tapa como un cierre de precisión en los pocillos de la placa de muestras.
[0123] La placa de muestras puede estar conectada a la tapa por un sistema de bisagra, situado en uno de los
55 lados de la unidad de almacenamiento, pero también puede estar situado en los dos lados opuestos. La bisagra conecta las dos unidades y permite la apertura y cierre de la unidad de almacenamiento. El dispositivo puede estar hecho de material plástico, mientras que el tipo de plástico se puede determinar dependiendo de su aplicación. La bisagra o bisagras permiten la retirada de la tapa de la placa de muestras.
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[0124] El cierre de la tapa y la placa de muestras para el almacenamiento a largo plazo de material biológico se puede lograr mediante adherencia magnética, aunque se pueden usar otros medios para el cierre de la tapa sobre la placa incluyendo, como ejemplos no limitantes, tapa a presión, sellados, adhesivos, gancho y bucle, cierre roscados, solenoides, troncocónica, cierres, de bayoneta, cierres de pinza, abrazaderas, y similares, u otro medio de cierre. La 5 placa de muestras y la tapa de la unidad de almacenamiento contienen, por lo tanto, imanes que pueden estar en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la placa de muestras y la tapa del dispositivo de almacenamiento. La atracción magnética entre la placa de muestras y la tapa es suficientemente fuerte para permitir el cierre ajustado de la placa de almacenamiento, pero no tan fuerte como para prevenir que se pueda abrir fácilmente, retorcer o deformar la placa de muestras cuando se abre la tapa. El cierre magnético se
10 puede usar para unir otros dispositivos a la unidad de almacenamiento que permiten el procesamiento de material biológico antes de depositarlo en la unidad de almacenamiento. La atracción magnética de la unidad de almacenamiento se puede usar para unir el dispositivo de almacenamiento a dispositivos adicionales bajo la unidad. El magnetismo es el mecanismo de conexión de la unidad básica a otros dispositivos o unidades.
15 [0125] El dispositivo de almacenamiento preferiblemente comprende al menos una etiqueta de identificación y almacenamiento de datos tal como un dispositivo transpondedor de radiofrecuencia o “etiqueta de RF”, para usar como parte de una interfaz de comunicación de radiofrecuencia entre el dispositivo de almacenamiento de muestras biológicas y los sistemas implementados por ordenador descritos en el presente documento. Se describe la inclusión de una pluralidad de etiquetas de RF dentro o sobre el dispositivo de almacenamiento. El dispositivo de
20 almacenamiento también puede comprender partes de reconocimiento visual. Los diferentes pocillos pueden estar, por ejemplo, numerados y marcados mediante el grabado de números y letras sobre la placa de muestras o por la aplicación de un procedimiento de impresión. Opcionalmente, al menos un lado de la placa de muestras puede tener un código de barras unido o grabado sobre su superficie. La tapa del dispositivo de almacenamiento puede tener una zona para notas escritas y comentarios de cualquier tipo. Además, la superficie superior de la tapa puede tener
25 también un código de barras, duplicando el código de barras de la placa de muestras. El código de barras doble permite la identificación única del material biológico y la asociación de la placa de muestras y la tapa. Múltiples etiquetas de RF y/o múltiples sitios de códigos de barras pueden proporcionar un mecanismo de seguridad en caso de que uno de dichos dispositivos de almacenamiento de datos/identificación se desprendan, dañen o sean ilegibles de otra forma.
30 El dispositivo de almacenamiento en húmedo
[0126] El dispositivo de almacenamiento se puede modificar para el almacenamiento en húmedo de muestras mediante uno o más cambios en el diseño de los pocillos. La contaminación cruzada por los pocillos mediante el
35 vertido durante la apertura y cierre de los pocillos, se evita mediante un diseño que proporciona una pequeña abertura en la parte superior de los pocillos a la vez que retiene el líquido en el pocillo por tensión superficial.
[0127] La pequeña abertura en la parte superior del pocillo se puede proporcionar por un diseño de cono invertido
o por aletas de plástico que sobresalen de la parte superior del pocillo al espacio abierto, reduciendo la abertura
40 completa de cada pocillo. El dispositivo de almacenamiento en húmedo está fabricado por moldeo por inyección y puede estar hecho de una pieza o de dos piezas, similar al dispositivo de almacenamiento. El dispositivo de almacenamiento en húmedo aguanta temperaturas en el intervalo de aproximadamente -80ºC a aproximadamente 100ºC.
45 Módulo de pocillos en tiras
[0128] Todos los dispositivos y aplicaciones descritas se pueden usar en un formato de pocillos en tiras con 1, 4 u 8 tiras de pocillos. El módulo de pocillos en tiras tiene el mismo o similar espacio básico que el dispositivo de almacenamiento. Permite el almacenamiento de números de muestras más pequeños que la unidad de placa de 96
50 pocillos. El diseño modular permite la unión de las tiras de pocillos a una plataforma base fina. Una tira puede contener 1, 4 u 8 pocillos. Las tiras pueden estar unidas a una placa base fina por interacciones magnéticas o por abrazaderas presentes en un extremo de las tiras. La altura de una tira, incluyendo el grosor de la placa base es igual a una unidad de almacenamiento básica regular, de modo que la tapa de la unidad permite el cierre del dispositivo.
55 El dispositivo de presión
[0129] El dispositivo de presión está compuesto de varios módulos, que incluyen el dispositivo de almacenamiento de muestras previamente descrito, una unidad de filtro, una unidad de placa de presión y un sistema de aire
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presurizado. Todas las unidades tienen las mismas dimensiones, equivalentes a una placa de muestras biológicas de 96 pocillos, 384 pocillos o 1535 pocillos estándar. Las dimensiones del dispositivo de presión son de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de 80 mm a 200 mm de longitud y de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el dispositivo de presión tiene 5 una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 20 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm y una anchura de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm, pero también puede tener dimensiones menores para acomodar números pequeños de muestras, o sistemas de muestras menores. Todos los módulos pueden variar de dimensiones dependiendo del tamaño del dispositivo de almacenamiento de muestras, mientras que el número de pocillos puede ser tan bajo como 1 pocillo por placa de 10 muestras y tanto como decenas de miles. Lo más preferiblemente, se pueden proporcionar 96 o 384 pocillos en la placa de muestras y procesar por cada una de las unidades de placas de presión. El número de pocillos de muestras de cada dispositivo de presión también se puede dividir en grupos de 1, 4 y 8 pocillos que se pueden ajustar al dispositivo de muestras estándar descrito. El dispositivo de presión está hecho de material plástico de color, o hecho de metal o de combinaciones de ambos. El cuerpo del dispositivo de presión y sus módulos están hechos por
15 moldeo por inyección o máquina de labrado o una combinación de ambos.
[0130] La unidad de filtro puede estar unida al dispositivo de presión y el dispositivo de almacenamiento de muestras y cualesquiera otros dispositivos descritos en el presente documento por fuerzas magnéticas. Se puede proporcionar un cierre adicional para ayudar a aguantar la presión de aire durante la operación. La unidad de filtro
20 puede estar hecha de material sólido de color tal como polipropileno, acrílico, y contiene papel o una matriz sólida para la filtración. Preferiblemente, la unidad de filtro tiene un grosor de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 15 mm dependiendo del sustrato usado para la filtración. La unidad de filtro tiene el número adecuado de agujeros/ranuras que ajustan sobre un dispositivo de almacenamiento de muestras y contiene 96, 384, 1536 o más agujeros de depósito de muestra. Cada unidad de filtro tiene su propia tapa de cierre hermético. El borde de los
25 agujeros puede ser recto o puede contener bordes salientes. Los bordes salientes pueden retener el material matriz dentro de los agujeros con o sin interacciones adhesivas.
[0131] Cada agujero dentro de la unidad de filtro puede contener materiales matriz, tal como pero no limitado a material de tipo esponja, sílice, polvo absorbente y papel de filtro para la filtración de materiales biológicos, tales
30 como, pero no limitado a sangre, bacterias, ADN genómico, ADN mitocondrial, productos de la PCR, ADN clonado, proteínas, ARN, proteínas, minerales o productos químicos. Las matrices se pueden seleccionar para soportar el procesamiento de muestras biológicas, por ejemplo a modo de ilustración y no de limitación, uno o más de la purificación de ADN, amplificación por PCR, fraccionamiento por tamaños de muestras (p. ej., basado en el tamaño molecular o tamaño celular), procesamiento de suero, procesamiento de sangre, purificación de proteínas y
35 clasificación celular. Los materiales matriz pueden estar integrados en el procedimiento de producción de la unidad de la placa de muestras o pueden estar unidos por interacciones adhesivas o encajados en los agujeros. Las matrices se preparan usando la tecnología estándar necesaria para hacer filtros para el fraccionamiento por tamaños, o material tratado para degradar o retener fracciones biológicas no deseadas (por ejemplo, Current Protocols, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). Los materiales matriz también se pueden tratar con
40 anticuerpos, lecitinas u otras moléculas de afinidad, selectivas de cargas, selectivas de iones, selectivas de grupos
(p. ej., grupos funcionales amino o carboxilo), hidrófobas, hidrófilas y otras moléculas de selectividad o similares para retener fracciones del material de muestra, y/o con entidades químicas pequeñas que confieren las funciones biológicas o químicas o grupos funcionales deseados (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 2003; Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; 45 Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell. Scientific, Boston; y Hermanson, G.T. y col., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, Academic Press, Inc., California). Los materiales matriz se pueden pretratar para conservar el material biológico por regulación de las condiciones de tamponamiento y por modificación de aditivos químicos, estabilizantes o reactivos de degradación (por ejemplo, Sambrook y col., 1989; Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Protein Science, Molecular Biology, Cell Biology, Wiley and Sons, 2003). Cada
50 agujero puede procesar de aproximadamente 5 µl a aproximadamente 1000 µl de volumen de muestra. Las cantidades de muestra pueden variar de aproximadamente 0,1 µg de ADN a aproximadamente 1000 µg de ADN, ARN, proteína, sangre, orina, virus, bacterias, células, tejido, extracto celular, extracto tisular, metabolitos, productos químicos y otros materiales. La aplicación de la muestra es por aplicación directa en manchas puntuales y se puede automatizar.
55 [0132] La unidad de placa de presión aplica presión de aire desde la parte superior a los agujeros de la unidad de filtro y fuerza a la muestra a través de matrices al pocillo del dispositivo de almacenamiento situado debajo. La presión se puede aplicar desde un sistema de aire presurizado de laboratorio o de una bombona de aire presurizado. La unidad de presión se puede aplicar para introducir mediante presión por arriba los reactivos en los
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pocillos del dispositivo de almacenamiento de muestras, el dispositivo de PCR, el dispositivo de secuenciación, el dispositivo de análisis de restricción, el dispositivo de cristalografía de proteínas, el dispositivo de diagnóstico, y el dispositivo de pocillos en tiras. La unidad de la placa de presión se proporciona con agujeros que conectan todos los agujeros a una entrada de aire. La entrada de aire está unida a una válvula que tiene un cierre hermético que
5 conecta la unidad de la placa de presión a una fuente de aire presurizado. La unidad de presión se une a una fuente de aire girando y asegurando la válvula. La válvula también puede estar unida a un manómetro que indica la presión requerida para cada unidad de filtro específica.
[0133] Todos los módulos para el dispositivo de presión descritos en el presente documento preferiblemente son
10 herméticos para lograr un cierre que aguante la presión requerida para forzar la muestra a través del sistema de filtro a los pocillos de almacenamiento. Cada módulo puede ser plano o tener salientes que ajustan exactamente en el módulo contiguo. Un ajuste hermético se crea usando una junta o un amortiguador de material compresible. La junta puede estar puesta alrededor del perímetro de cada unidad o alrededor de cada pocillo individual. Preferiblemente, la junta está situada en un borde, o fijada a la tapa usando un material adhesivo. Se puede lograr un ajuste
15 hermético insertando los salientes de cada unidad como un cierre de precisión en la unidad a la que se unirá debajo.
[0134] La unión de todos los módulos, incluyendo una unidad de presión, una unidad de filtro y un dispositivo de almacenamiento, preferiblemente se logra mediante adherencia magnética (pero alternativamente, en estas y otras realizaciones del dispositivo que siguen, se usan otros medios de cierre como se describen en el presente 20 documento). Cada unidad contiene imanes en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes. La atracción magnética entre cada unidad es suficientemente fuerte para permitir el cierre ajustado para el procesamiento del material biológico antes de depositarlo en el dispositivo de almacenamiento de muestras u otro dispositivo. La unión magnética de los tres módulos independientes (unidad de presión, unidad de filtro y dispositivo de almacenamiento) se puede asegurar además mediante abrazaderas. Las abrazaderas pueden estar hechas de
25 material metálico o plástico que está formado para encajar los tres módulos juntos y para reforzar el mecanismo de unión magnético. La abrazadera preferiblemente tiene dimensiones menores que los lados de la unidad de filtración. Las abrazaderas pueden unirse mediante la aplicación de presión exterior que abre la abrazadera, o las abrazaderas se pueden diseñar para deslizarse sobre el exterior del módulo de filtro. Se pueden usar dos o más abrazaderas para asegurar la unidad de filtro.
30 [0135] Cada módulo tiene partes de reconocimiento visual. Los diferentes pocillos pueden estar numerados o marcados mediante grabado de números y letras sobre la placa de muestras o por aplicación de un procedimiento de impresión.
35 Dispositivo de PCR portátil
[0136] La placa de muestras puede estar unida a una unidad de termociclado (dispositivo de PCR) mediante fuerzas magnéticas. La placa de muestras y el dispositivo de PCR contienen imanes en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la placa de muestras. La atracción magnética entre la
40 placa de muestras y el dispositivo de PCR permite la colocación exacta y unión ajustada de la placa de muestras al dispositivo de PCR.
[0137] El dispositivo de PCR contiene una plataforma de temperatura con el espacio del dispositivo de almacenamiento. El dispositivo de PCR produce temperaturas en el intervalo de aproximadamente 4 ºC a 45 aproximadamente 100 ºC. El dispositivo de PCR contiene un componente de ordenador que se puede programar para protocolos de ciclos repetidos que contienen múltiples temperaturas, tiempos de mantenimiento de temperaturas variados, y múltiples cambios de temperatura que pueden estar en el intervalo de 4ºC a 100ºC y que adaptan los requisitos para condiciones de amplificación de PCR estándar y de inicio en caliente (por ejemplo, Qiagen "Taq PCR Handbook", Qiagen "Critical Factors for Successful PCR"). La unidad de PCR puede contener una
50 tapa calentada integrada o cubierta que mantiene y produce temperaturas constantes de hasta aproximadamente 100 ºC. La tapa o cubierta puede estar hecha de metal o material similar y se coloca y mantiene en el sitio mediante fuerza magnética en la parte superior de la placa de muestras. La energía proporcionada para esta unidad de PCR puede venir de una salida eléctrica estándar de 110/220V, de un grupo de baterías o de una fuente de energía de tipo solar.
55 Módulo de reactivos de PCR
[0138] El módulo de reactivos de PCR contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación por PCR. Puede incluir reactivos tales como, pero no limitado a tapones, cebadores, enzima polimerasa y desoxinucléotidos
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(por ejemplo, Qiagen "Taq PCR Handbook", Qiagen "Critical factors for Successful PCR"). Los reactivos se proporcionan en un formato de 96, 384 o 1536 pocillos o mayor que se corresponde con el formato y dimensiones de la placa de muestras. Las dimensiones del módulo de reactivos de PCR son de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de aproximadamente 80 mm a aproximadamente 200 mm de longitud, y de
5 aproximadamente 60 mm a aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el módulo de reactivos de PCR tiene una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 15 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm, y una anchura de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm. El módulo de reactivos de PCR está hecho de polipropileno de color y contiene 96, 384, 1536 o más pocillos de depósito de muestra. El módulo de reactivos de PCR está fabricado por moldeo por inyección.
10 [0139] El magnetismo es el mecanismo de conexión de la placa de muestras al módulo de reactivos de PCR. La placa de muestras y el módulo de reactivos de PCR contienen imanes, preferiblemente en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la placa de muestras. La atracción magnética entre la placa de muestras y el módulo de reactivos de PCR permite la colocación exacta y unión ajustada de la placa de
15 muestras al módulo de reactivos de PCR.
[0140] El módulo de reactivos de PCR puede tener diferentes diseños. Cada pocillo de muestra puede tener o no bordes salientes que llegan a los pocillos de la placa de muestras. Puede requerir la aplicación de presión de aire aplicada por el dispositivo de presión para transferir los reactivos del módulo de reactivos de PCR a la placa de
20 muestras.
Módulo de reactivos de secuenciación
[0141] El módulo de reactivos de secuenciación contiene todos los reactivos necesarios para la secuenciación de
25 ADN o secuenciación por ciclos de ADN. Puede incluir reactivos tales como, pero no limitados a tampones, cebadores, enzima de secuenciación, desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos (por ejemplo, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). Los reactivos se proporcionan en un formato de 96, 384 o 1536 pocillos o mayor que se corresponde con el formato y dimensiones de la placa de muestras. Las dimensiones del módulo de reactivos de secuenciación son de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de
30 aproximadamente 80 mm a aproximadamente 200 mm de longitud, y de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el módulo de reactivos de secuenciación tiene una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 15 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm, y una anchura de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm. El módulo de reactivos de secuenciación está hecho de polipropileno de color y contiene 96, 384, 1536 o más pocillos de depósito de muestra.
35 El módulo de reactivos de secuenciación está fabricado por moldeo por inyección.
[0142] El magnetismo es el mecanismo de conexión de la placa de muestras al módulo de reactivos de secuenciación. La placa de muestras y el módulo de reactivos de secuenciación contienen imanes, preferiblemente en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la placa de muestras. La
40 atracción magnética entre la placa de muestras y el módulo de reactivos de secuenciación permite la colocación exacta y unión ajustada de la placa de muestras al módulo de reactivos de secuenciación.
[0143] El módulo de reactivos de secuenciación puede tener diferentes diseños. Cada pocillo de muestra puede tener o no bordes salientes que llegan a los pocillos de la placa de muestra. Puede requerir la aplicación de presión
45 de aire aplicada por el dispositivo de presión para transferir los reactivos del módulo de reactivos de secuenciación a la placa de muestras.
Módulo de reactivos de extensión de cebador
50 [0144] El módulo de reactivos de extensión de cebador contiene todos los reactivos necesarios para la extensión de cebador. Puede incluir reactivos tales como, pero no limitados a tampones, cebadores, enzima polimerasa, desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos (por ejemplo, Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). Los reactivos se proporcionan en un formato de 96, 384 o 1536 pocillos o mayor que se corresponde con el formato y dimensiones de la placa de muestras. Las dimensiones del módulo de reactivos de
55 extensión de cebador son de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de aproximadamente 80 mm a aproximadamente 200 mm de longitud, y de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el módulo de reactivos de extensión de cebador tiene una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 15 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm, y una anchura de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm. El módulo de reactivos de extensión de cebador
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está hecho de polipropileno de color y contiene 96, 384, 1536 o más pocillos de depósito de muestra. El módulo de reactivos de extensión de cebador está fabricado por moldeo por inyección.
[0145] El magnetismo es el mecanismo de conexión de la placa de muestras al módulo de reactivos de extensión
5 de cebador. La placa de muestras y el módulo de reactivos de extensión de cebador contienen imanes, preferiblemente en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la placa de muestras. La atracción magnética entre la placa de muestras y el módulo de reactivos de extensión de cebador permite la colocación exacta y unión ajustada de la placa de muestras al módulo de reactivos de extensión de cebador.
10 [0146] El módulo de reactivos de extensión de cebador puede tener diferentes diseños. Cada pocillo de muestra puede tener o no bordes salientes que llegan a los pocillos de la placa de muestra. Puede requerir la aplicación de presión de aire aplicada por el dispositivo de presión para transferir los reactivos del módulo de reactivos de extensión de cebador a la placa de muestras.
15 Módulo de reactivos de clasificación de haplotipos
[0147] El módulo de reactivos de clasificación de haplotipos contiene todos los reactivos necesarios para la clasificación de haplotipos de ADN. Puede incluir reactivos tales como, pero no limitados a tampones, cebadores,
20 enzima de secuenciación, desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos (por ejemplo, Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). Los reactivos se proporcionan en un formato de 96, 384 o 1536 pocillos o mayor que se corresponde con el formato y dimensiones de la placa de muestras. Las dimensiones del módulo de reactivos de clasificación de haplotipos son de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de aproximadamente 80 mm a aproximadamente 200 mm de longitud, y de aproximadamente 60 mm a
25 aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el módulo de reactivos de clasificación de haplotipos tiene una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 15 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm, y una anchura de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm. El módulo de reactivos de clasificación de haplotipos está hecho de polipropileno de color y contiene 96, 384, 1536 o más pocillos de depósito de muestra. El módulo de reactivos de clasificación de haplotipos está fabricado por moldeo por
30 inyección.
[0148] El magnetismo es el mecanismo de conexión de la placa de muestras al módulo de reactivos de clasificación de haplotipos. La placa de muestras y el módulo de reactivos de clasificación de haplotipos contienen imanes, preferiblemente en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la
35 placa de muestras. La atracción magnética entre la placa de muestras y el módulo de reactivos de clasificación de haplotipos permite la colocación exacta y unión ajustada de la placa de muestras al módulo de reactivos de clasificación de haplotipos.
[0149] El módulo de reactivos de clasificación de haplotipos puede tener diferentes diseños. Cada pocillo de
40 muestra puede tener o no bordes salientes que llegan a los pocillos de la placa de muestra. Puede requerir la aplicación de presión de aire aplicada por el dispositivo de presión para transferir los reactivos del módulo de reactivos de clasificación de haplotipos a la placa de muestras.
Módulo de reactivos de análisis de restricción
45 [0150] El módulo de reactivos de análisis de restricción contiene todos los reactivos necesarios para el análisis de restricción de ADN. Puede incluir reactivos tales como, pero no limitados a tampones, enzima de restricción, y sal (por ejemplo, Sambrook y col., 1989; Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). Los reactivos se proporcionan en un formato de 96, 384 o 1536 pocillos o mayor que se corresponde con el
50 formato y dimensiones de la placa de muestras. Las dimensiones del módulo de reactivos de análisis de restricción son de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 25 mm de altura, de aproximadamente 80 mm a aproximadamente 200 mm de longitud, y de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 150 mm de anchura. Preferiblemente, el módulo de reactivos de análisis de restricción tiene una altura de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 15 mm, una longitud de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 140 mm, y una anchura
55 de aproximadamente 60 mm a aproximadamente 100 mm. El módulo de reactivos de análisis de restricción está hecho de polipropileno de color y contiene 96, 384, 1536 o más pocillos de depósito de muestra. El módulo de reactivos de análisis de restricción está fabricado por moldeo por inyección.
[0151] El magnetismo es el mecanismo de conexión de la placa de muestras al módulo de reactivos de análisis de
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restricción. La placa de muestras y el módulo de reactivos de análisis de restricción contienen imanes, preferiblemente en forma de una lámina magnética o en forma de pequeños imanes situados dentro de la placa de muestras. La atracción magnética entre la placa de muestras y el módulo de reactivos de análisis de restricción permite la colocación exacta y unión ajustada de la placa de muestras al módulo de reactivos de análisis de
5 restricción.
[0152] El módulo de reactivos de análisis de restricción puede tener diferentes diseños. Cada pocillo de muestra puede tener o no bordes salientes que llegan a los pocillos de la placa de muestras. Puede requerir la aplicación de presión de aire aplicada por el dispositivo de presión para transferir los reactivos del módulo de reactivos de análisis
10 de restricción a la placa de muestras.
Dispositivo de diagnóstico
[0153] El dispositivo de almacenamiento de muestras básico se puede modificar para que funcione como un
15 dispositivo analítico usado en la detección de niveles de hormonas, afecciones fisiológicas, enfermedades humanas, de animales y de plantas. El dispositivo de diagnóstico puede implementar la colocación de un dispositivo de diagnóstico cilíndrico en la parte superior del dispositivo de almacenamiento de muestras. El dispositivo de diagnóstico se puede producir de dos formas: 1) un procedimiento de producción independiente y añadido como el dispositivo completo en el dispositivo de almacenamiento de muestras, o 2) en capas como unidades independientes
20 dentro de cada pocillo del dispositivo de almacenamiento de muestras.
[0154] El dispositivo de diagnóstico puede contener una zona con al menos un anticuerpo específico o reactivo de diagnóstico específico dentro del dispositivo. Los reactivos pueden producir una reacción detectable visualmente cuando se forma un complejo de anticuerpo-antígeno.
25 Funda de transporte
[0155] La funda de transporte se usa para transportar o enviar de forma segura material biológico. La funda de transporte se diseña para que contenga un dispositivo de almacenamiento de muestras y un medio de 30 almacenamiento de información, por ejemplo un disco compacto (CD) que contiene la información relacionada con el material. En casos en los que se transportan materiales peligrosos o infecciosos, los pocillos se pueden sellar con película adhesiva antes del cierre del dispositivo de almacenamiento de muestras. La funda de transporte tiene dos partes, la parte inferior o contendedor del dispositivo de almacenamiento de muestras y la carcasa. La parte inferior puede estar hecha de cartón, plástico o material de espuma que tiene el espacio exacto del dispositivo de
35 almacenamiento de muestras y un CD de software y otro medio de almacenamiento de información. Para el envío o transporte de material biológico la muestra se aplica en manchas puntuales en los pocillos del dispositivo de almacenamiento de muestras, y la tapa se cierra y se sella mediante su cierre de tapa magnético. El dispositivo de almacenamiento de muestras se pone de forma encajada en la parte inferior de la funda de transporte. Se puede añadir el CD.
40 [0156] El tamaño del contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras se puede determinar mediante el tamaño del dispositivo de almacenamiento de muestras, no puede ser más pequeño que el dispositivo de almacenamiento de muestras, pero puede ser mayor que 10 dispositivos de almacenamiento de muestras apilados. El material de relleno de alrededor preferiblemente consiste en al menos aproximadamente 5 mm de relleno
45 adicional y hasta aproximadamente 10 cm. El contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras también contiene espacio para un ajuste seguro de un dispositivo de información. La colocación del contenedor del dispositivo de información dentro de la funda de transporte, depende del tipo de dispositivo de información. Se diseña para proporcionar un ajuste perfecto para uno o múltiples CD o tarjetas de memoria/memorias USB. El contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras se produce preferiblemente de material conformable, tal
50 como cartón o basado en espuma. El contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras que incluye el material de relleno está además rodeado de una carcasa exterior o está integrado en una carcasa que rodea el o los dispositivos de almacenamiento de muestras y el dispositivo de almacenamiento de información por los 6 lados, incluyendo una tapa de apertura, o que rodea el contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras por 5 lados. En el caso de que el contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras incluya una tapa de apertura,
55 la tapa está unida a uno de los lados del contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras, cubre uno de los lados del contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras y se une al lado opuesto y cierra de forma segura la funda de transporte. Para el contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras de 5 lados, alrededor del cierre del 6º lado se proporciona una caja de cierre, que se desliza sobre el contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras entero. La carcasa puede ser de material de empaquetamiento que proporciona
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rigidez al contenedor del dispositivo de almacenamiento de muestras. Se proporciona espacio en el exterior de la funda de transporte para etiquetas de direcciones y sellos.
Módulo de cristalografía de proteínas
5 [0157] El módulo de cristalografía contiene pocillos que se pueden llenar con diferentes soluciones de cristalización de proteínas y deshidratar. El dispositivo de almacenamiento básico puede estar fabricado de plástico transparente para ver a través, y cada pocillo individual contiene unas condiciones de cristalización de proteínas que extienden el intervalo de pH de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 9,4. Cada pocillo puede contener
10 diferentes tampones, tales como, pero no limitado a acetato, tartrato, fosfato, Tris, citrato, HEPES, imidazol, formiato, cacodilato, MES, Bicina, Tris, citrato, HEPES, acetato y diferente sales que precipitan tales como tartrato, fosfato, sulfato de amonio y litio, cloruro de magnesio y calcio, acetato de magnesio, amonio, sodio, cinc y calcio, citrato de sodio, formiato de sodio y magnesio, cloruro de magnesio y sodio, acetato de sodio, citrato de sodio, formiato amónico, sulfato de litio y amonio, imidazol, CTAB y disolventes orgánicos que precipitan como MPD, 2-propanol,
15 etilenglicol, dioxano, etanol, 1,6-hexanodiol. También pueden contener PEG 400, 6000, 1000, 8000, 10000, y 20000, PEG ME 550, 2000, 5000, y 2000, Jeffamine M-600 u otros aditivos como terc-butanol, glicerol, iones Co2+, Cd2+ , Fe3+, Ni2+ y Zn2+, dioxano, etilenglicol, polietilenimina. Los pocillos se pueden llenar con las soluciones anteriores en diferentes concentraciones. Los pocillos se deshidratan, reteniendo las sustancias en las paredes de los pocillos. Los pocillos están listos para usar, se pueden volver a hidratar con agua y se puede añadir la proteína.
20 Soporte de apilamiento
[0158] Las unidades de almacenamiento de muestras individuales se pueden almacenar a temperatura ambiente o refrigeradas en soportes de almacenamiento especialmente diseñados. El soporte (véase las figuras) puede
25 contener diferentes cantidades de unidades de almacenamiento de muestras, preferiblemente el código de barras está visible y las unidades se pueden deslizar fácilmente en rieles de plástico. El soporte de almacenamiento puede ser abierto o estar encerrado en una caja de plástico con puerta de cierre.
[0159] El soporte de apilamiento puede estar hecho de plástico o metal. Puede contener 10, 25 o 50 dispositivos
30 de almacenamiento de muestras. Los dispositivos de almacenamiento de muestras se deslizan en rieles en el soporte de apilamiento. Un mecanismo de cierre evita que las tarjetas caigan del soporte de apilamiento. El soporte de apilamiento puede ser abierto o puede estar completamente encerrado por material protector y una puerta con bisagra en el lado frontal del soporte de apilamiento.
35 Sistema de almacenamiento, seguimiento y recuperación de datos asociados con materiales biológicos
[0160] El dispositivo de almacenamiento anterior descrito antes se puede combinar con otras tecnologías para proporcionar la integración del almacenamiento de muestras y la gestión de muestras para aplicaciones de las ciencias biológicas. Esto permite la integración del almacenamiento, localización, seguimiento, procesamiento de 40 muestras biológicas y la gestión de datos de las muestras. Los datos relacionados con las muestras se pueden asociar con la localización de las muestras mediante la asociación física directa de los datos con los dispositivos de almacenamiento de muestras. La información almacenada se puede actualizar con datos adicionales que proceden de inventario y de seguimiento de muestras en combinación con protocolos de investigación biológica de múltiples etapas, procedimientos de producción, cribado, bioensayos, historias de pacientes, datos de ensayos clínicos y otras
45 fuentes de información desarrollada. Los datos asociados con la muestra se pueden transmitir y compartir mediante un software jerárquico de seguridad y arquitectura de conexión de redes que permite la conexión con múltiples usuarios, múltiples entornos de sitios.
[0161] Idealmente, la información sobre una muestra esté integrada con el dispositivo de almacenamiento de
50 muestras mediante una interfaz electrónica asociada, preferiblemente una interfaz inalámbrica, tal como un transpondedor de identificación de radiofrecuencia (RFID). Aunque en el pasado se han usado códigos de barras para identificar muestras, esta tecnología tiene limitaciones que la hacen inadecuada para usar en la presente descripción. Estas limitaciones incluyen el acceso requerido en la línea visual al código de barras para transferir la información, capacidad de información limitada, e interferencia a través de factores medioambientales tales como
55 polvo, humedad, y similares. La tecnología de identificación por radiofrecuencia supera estas desventajas.
[0162] La comunicación remota usando equipamiento inalámbrico típicamente se basa en tecnología de radiofrecuencia (RF), que se usa en muchas industrias. Una aplicación de la tecnología de RF es en la localización, identificación y seguimiento de objetos, tales como animales, inventarios y vehículos. Los ejemplos de publicaciones
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que describen los sistemas de etiquetas de identificación por RF incluyen las descripciones de las patentes de EE.UU. nº 6.696.028; 6.380.858; y 5.315.505.
[0163] Los sistemas de etiquetas de identificación por RF (RFID) se han desarrollado para facilitar el control de
5 objetos remotos. Como se muestra en la figura 9, un sistema de RFID básico 10 incluye dos componentes: un interrogador o lector 12, y un transpondedor (normalmente llamado una etiqueta de RF) 14. El interrogador 12 y la etiqueta de RF 14 incluyen respectivamente las antenas 16, 18. En el funcionamiento, el interrogador 12 transmite a través de su antena 16 una señal de interrogación de radiofrecuencia 20 a la antena 18 de la etiqueta de RF 14. En respuesta a la recepción de la señal de interrogación 20, la etiqueta de RF 14 produce una señal de respuesta de
10 amplitud modulada 22 que es transmitida de nuevo al interrogador 12 a través de la antena de la etiqueta 18 por un proceso conocido como retrodispersión.
[0164] La etiqueta de RF 14 convencional incluye un modulador de amplitud 24 con un interruptor 26, tal como un transistor MOS, conectado entre la antena de la etiqueta 18 y conectado a tierra. Cuando la etiqueta de RF 14 es 15 activada por la señal de interrogación 20, un controlador (no se muestra) crea una señal moduladora de encendido/apagado 27 basada en un código de información, típicamente un código de identificación, almacenado en una memoria no volátil (no se muestra) de la etiqueta de RF 14. La señal moduladora 27 se aplica a un terminal de control del interruptor 26, que hace que el interruptor 26 se abra y cierre alternativamente. Cuando el interruptor 26 se abre, la antena de la etiqueta 18 refleja una parte de la señal de interrogación 20 de vuelta al interrogador 12 20 como una parte 28 de la señal de respuesta 22. Cuando el interruptor 26 se cierra, la señal de interrogación 20 viaja a través del interruptor 26 a tierra, sin ser reflejada, creando así una parte nula 29 de la señal de respuesta 22. En otras palabras, la señal de interrogación 20 es modulada en amplitud para producir la señal de respuesta 22 reflejando y absorbiendo alternativamente la señal de interrogación 20 de acuerdo con la señal moduladora 27, que es característica del código de información almacenado. La etiqueta de RF 14 también se podría modificar de modo
25 que la señal de interrogación sea reflejada cuando el interruptor 26 se cierra y absorbida cuando el interruptor 26 se abre. Tras recibir la señal de respuesta 22, el interrogador 12 desmodula la señal de respuesta 22 para descodificar el código de información representado por la señal de respuesta. Por lo tanto, los sistemas de RFID convencionales trabajan en un solo oscilador de frecuencia en el que la etiqueta de RF 14 modula una frecuencia de la portadora de RF, para proporcionar una indicación al interrogador 12 de que está presente la etiqueta de RF 14.
30 [0165] La ventaja sustancial de los sistemas de RFID es la capacidad de no contacto, sin línea de visión directa, de la tecnología. El interrogador 12 emite la señal de interrogación 20 con un rango de 2,54 cm (1 pulgada) a 30,48 m (100 pies) o más, dependiendo de su potencia de salida y la radiofrecuencia usada. Las etiquetas se pueden leer a través de una variedad de sustancias tales como olor, niebla, hielo, pintura, suciedad y condiciones
35 medioambientales difíciles donde los códigos de barras u otras tecnologías de lectura óptica serían inútiles. Las etiquetas de RF también pueden leerse a velocidades notables, respondiendo en la mayoría de los casos en menos de cien milisegundos.
[0166] Un sistema de etiquetas de RF típico 10 a menudo contiene una serie de etiquetas de RF 14 y el
40 interrogador 12. Las etiquetas de RF se dividen en tres categorías principales. Estas categorías son etiquetas pasivas asistidas por haz, etiquetas semipasivas asistidas por batería y etiquetas activas. Cada una funciona en formas fundamentalmente diferentes.
[0167] La etiqueta de RF asistida por haz a menudo se denomina un dispositivo pasivo porque deriva la energía
45 necesaria para su funcionamiento de la señal de interrogación emitida al mismo. La etiqueta rectifica el campo y cambia las características de reflexión de la propia etiqueta, creando un cambio en la reflectividad que es vista en el interrogador. Una etiqueta de RF semipasiva asistida por batería funciona de una forma similar, modulando su sección transversal de RF con el fin de relejar un delta al interrogador, para desarrollar una conexión de comunicación. Aquí, la batería es la fuente de energía para el funcionamiento de la etiqueta. Finalmente, en la
50 etiqueta de RF activa, se usa un transmisor para crear su propia energía de radiofrecuencia asistida por la batería.
[0168] El sistema puede consistir en tres partes, un dispositivo de hardware consumible, software de inventarios y gestión, y el interfaz RFID entre el dispositivo de hardware y el software. En relación con la figura 10, se muestra en la misma un sistema 100 formado para incluir el dispositivo de almacenamiento 102 descrito antes, el componente 55 de software de inventarios y gestión 104, preferiblemente implementado en un sistema de ordenador 106, y la interfaz de identificación de radiofrecuencia 108 que conecta el dispositivo de almacenamiento 102 y el softwares
106. Preferiblemente, la interfaz de RFID 108 incluye un transpondedor 100 asociado con el dispositivo de almacenamiento 102 y un interrogador 112, que está acoplado con el sistema implementado por ordenador 106.
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[0169] El transpondedor 110 puede estar asociado con el dispositivo de almacenamiento de muestras 102, tal como mediante fijado del transpondedor 110 a una superficie exterior del dispositivo de almacenamiento 102. Sin embargo, debe entenderse que el transpondedor 110 puede estar fijado o asociado con un tubo, una placa, un soporte o incluso una sala en la que se mantiene el dispositivo de almacenamiento 102. Aunque se prefiere que esté
5 asociado un solo transpondedor 110 con un solo dispositivo de almacenamiento 102, cada muestra particular almacenada en el dispositivo de almacenamiento 102 puede tener un transpondedor 110 asociado con la misma.
[0170] La asociación se puede lograr durante la producción del dispositivo de almacenamiento 102 de modo que el transpondedor 110 es insertado en el dispositivo de almacenamiento 102, o después de haber producido el
10 dispositivo de almacenamiento 102, tal como mediante fijación adhesiva al dispositivo de almacenamiento 102. En la medida en que el magnetismo es el mecanismo de conexión preferido usado en el dispositivo de almacenamiento de muestras 102, un experto en esta tecnología entenderá que puede ser necesaria una protección adecuada para prevenir la alteración involuntaria de la información almacenada en el transpondedor 110 y para prevenir la interferencia con las comunicaciones de radiofrecuencia entre el transpondedor 110 y el interrogador 112.
15 [0171] El transpondedor 110 se puede programar con datos sobre el dispositivo de almacenamiento 102 y las muestras almacenadas en el dispositivo de almacenamiento 102, incluyendo información de la propiedad, información de localización, información de análisis, procedimientos de producción, realización de ensayo clínico, procedimientos de síntesis, recolección de muestras, y otra información conocida para los expertos en la materia que
20 sería valiosa en la gestión de las muestras. Además de preprogramar dichos datos, el transpondedor 110 se puede configurar para permitir la modificación y actualización de los datos dentro de su memoria. Además, el transpondedor 110 contendrá arquitectura de seguridad que define las condiciones de acceso exactas por tipo de dato para así restringir la lectura, escritura y actualización. Por ejemplo, los componentes de la interfaz de RFID 108 se pueden configurar para recibir señales de control desde y responder a, un sistema de procesamiento de datos
25 implementado por ordenador particular, tal como la aplicación de softwares descrita a continuación en el presente documento. Además, los datos escritos en el transpondedor 110 pueden estar encriptados con fines de autenticación y seguridad.
[0172] El uso de los transpondedores RFID o chips ofrece el beneficio de un intervalo de temperatura amplio (de
30 -25ºC a +85ºC) sin pérdida de funcionalidad. Además, los transpondedores 110 se pueden usar para controlar dispositivos remotos, tales como luz de señalización o generador de tonos audibles para alertar y localizar el objeto asociado con el transpondedor 110. El almacenamiento de información en el transpondedor 110 también proporciona una copia de seguridad adicional por si se dañaran o perdieran los datos en el sistema implementado por ordenador 106.
35 [0173] El interrogador 112 es un lector de identificador de radiofrecuencia convencional que está conectado con el sistema implementado por ordenador 106. Las señales de órdenes y control son generadas por el sistema 106 para iniciar la interrogación de uno o más transpondedores 110 y recibir una respuesta de los mismos que es procesada por el software 104 en el sistema implementado por ordenador 106. En una configuración, los transpondedores 110
40 se pueden reprogramar mediante comunicaciones del interrogador 112 para sustituir o actualizar datos almacenados en el mismo.
[0174] En una implementación, se colocan uno o más interrogadores 112 dentro de una instalación con un intervalo suficiente para comunicarse por señales de radiofrecuencia, tales como señales de microondas, con los 45 transpondedores 110. Se pueden usar múltiples interrogadores 112 para múltiples clases de transpondedores 110 o con transpondedores 110 individuales. Alternativamente, un interrogador que usa tecnología conocida puede comunicar con múltiples transpondedores 110 en múltiples frecuencias en serie o de forma simultánea. En aplicaciones donde se procesan un dispositivo de almacenamiento de muestras 102 o muestras individuales, se pueden usar múltiples interrogadores colocados en diferentes sitios dentro de una estructura o a lo largo de un
50 camino de viaje, tal como un sistema de transporte o sistema de envío, tal como líneas de transporte de mercancías, trenes y similares, para seguir la localización y el estado de la muestra. Esto incluye la comprobación de factores ambientales, tales como la temperatura, humedad, presión, y similares, en el que se localiza la muestra o dispositivo de almacenamiento 102.
55 [0175] Por lo tanto, el interfaz de RFID 108 se puede extender para vigilar y procesar datos relacionados con el movimiento y análisis de una muestra o dispositivo de almacenamiento 102 situado en un laboratorio, manipulada por robots de laboratorio, y similares, tal como durante procedimientos de producción biológicos o la ejecución de etapas experimentales. Esto también ayuda en el control de calidad y en el procesamiento de muestras biológicas mediante protocolos de investigación automáticos o semiautomáticos.
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[0176] Como se ha mencionado antes, el almacenamiento y seguimiento de muestras son facilitados localizando la muestra mediante el uso de una interfaz de RF entre el transpondedor de RF en el dispositivo de almacenamiento de muestras y el sistema implementado por ordenador descrito en el presente documento, que se consigue
5 mediante el marcaje y seguimiento de la localización del almacenamiento, tal como un soporte de almacenamiento, una sala de almacenamiento, un congelador, una mesa de laboratorio, una mesa de trabajo o una librería.
[0177] Con el fin de hacer el seguimiento de un dispositivo de almacenamiento 102 o muestra particular, el transpondedor 110 se configura para activar un dispositivo remoto, tal como una luz intermitente situada en el 10 dispositivo de almacenamiento, un dispositivo audible asociado con el dispositivo de almacenamiento, o un cambio de color del dispositivo de almacenamiento que puede ser reconocido por una persona o por un sistema automático, para permitir la recuperación rápida de la muestra. Además, el transpondedor 110 se configura para activar una alarma remota cuando unas condiciones ambientales han superado un intervalo ambiental predeterminado, incluyendo, pero no limitado a temperatura, presión y humedad. En una realización, el transpondedor 110 es un 15 dispositivo pasivo que es activado por la señal de interrogación de la cual extrae la energía de funcionamiento. Cuando el transpondedor 110 se usa para activar un dispositivo remoto o para aumentar el intervalo de comunicación, el transpondedor puede ser semiactivo como se ha descrito antes. Alternativamente, se puede usar un transpondedor activo cuando cantidades grandes de datos se van a leer de o se van a escribir en el transpondedor 110 o se va a aumentar el intervalo, según convenga. Al intervalo también le afecta la frecuencia,
20 como se conoce en la técnica, y un experto en la materia seleccionará el intervalo de frecuencia adecuado de acuerdo con el entorno, y los objetivos funcionales. Por ejemplo, algunas muestras pueden ser sensibles a frecuencias particulares de señales de radio y es necesario que dichas frecuencias sean evitadas o se proteja adecuadamente la muestra cuando se diseña el sistema 100.
25 [0178] El software de inventarios y gestión 104 se diseña para usar con sistemas de comunicación inalámbricos y el procesamiento de datos asociados con las ciencias biológicas. Consiste en una interfaz de usuario adaptada y un conjunto de tablas de bases de datos predefinidas. Un usuario puede introducir datos asociados con la muestra o importar información de fuentes exteriores. Las tablas predefinidas se proporcionan en la base de datos para facilitar la configuración del sistema, pero un usuario puede tener la opción de adaptar campos dentro de las tablas. La base
30 de datos relacional puede incluir tablas para muestras de ADN, clones, oligonucleótidos, fragmentos de PCR, ADNc, compuestos químicos, proteínas, metabolitos, lípidos, fracciones celulares, muestras biológicas de diferentes organismos tales como virus, bacterias u organismos multicelulares, muestras de pacientes tales como sangre, orina y frotis bucales. En las tablas están programados información de muestras detallada y datos asociados con las muestras. La información de las muestras puede incluir, por ejemplo, fuente de la muestra, nombre de clon, nombre
35 de inserto génico, tamaño del inserto, secuencia del inserto, modificaciones, nombre del vector, tamaño del vector, selección de antibióticos, inducción, terminador, sitio de clonación, marcador 5’, marcador 3’, marcador de purificación, nombre del oligonucleótido, purificación, control de calidad, cebador directo, cebador inverso, valor de Tm, y selección de tamaño. La información clínica del paciente puede ser, por ejemplo, edad, género, situación, grupo étnico, índice de masa corporal, historia familiar, medicación, datos de inicio de los síntomas, duración de la
40 enfermedad, y pruebas médicas. Los datos asociados con la muestra pueden consistir en datos de investigación de diferentes fuentes, tales como, por ejemplo, información de secuencia de un secuenciador de ADN, información de perfil transcripcional de chips de micromatriz, datos de proteínas de transferencia Western o hibridación in situ, datos de bioensayos para el descubrimiento de fármacos, datos de cribado de fármacos de alta capacidad, datos de síntesis de bibliotecas químicas, y similares. Los datos se pueden suministrar en forma de texto, números, tablas o
45 imágenes.
[0179] El software también puede conectar otras fuentes de datos e integrar información de dominios públicos, tales como GenBank, SwissProt, y otros dominios similares o fuentes registradas. Idealmente, el software es capaz de interconexión con equipamiento robótico para hacer el seguimiento de la muestra dentro de un procedimiento, y
50 el seguimiento del procedimiento se puede presentar como una historia de la muestra acumulada para el almacenamiento dentro del dispositivo de muestra, así como de las bases de datos, tales como almacenamiento en un transpondedor RFID 110.
[0180] El software se diseña para crear una infraestructura informática donde un solo usuario genera su conjunto
55 de datos e información, que inicialmente es almacenado en una estación de trabajo local en un formato de base de datos local. Sin embargo, el software es capaz de conectar múltiples usuarios en un entorno jerárquico. La información acumulada por un solo usuario puede ser mejor cargada en un sistema de base de datos centralizado en un servidor. La interacción del entorno de la red de trabajo también puede ser un interfaz de un navegador web. El entorno de múltiples usuarios se puede expandir a entornos de múltiples sitios, y el software y las bases de datos
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pueden estar situadas en un ordenador personal, en un servidor dentro de una intranet o en internet tal como un sitio de comercio electrónico. También se proporcionan sistemas de control de acceso y control de sesión en el software.
[0181] En la figura 11 se muestra la arquitectura de un sistema implementado por ordenador 114 para usar una
5 red de área local 116 para la interconexión de un procesador de aplicaciones 118 con uno o más interrogadores 120 que comunican con una o más etiquetas de RFID remotas 122. El procesador de aplicaciones 118 está acoplado con una base de datos 124. Hay que entender que la red de área local puede ser, en su lugar, una red global, tal como internet, en cuyo caso se usarían aplicaciones basadas en la web.
10 [0182] Idealmente, el software de inventarios y gestión 104 tiene tres componentes, un componente de software de front-end, un componente de software intermedio y un componente de software de back-end.
[0183] Se prevé que el software de front-end se use para crear una “interfaz de usuario”. Esto puede ser, por ejemplo, un navegador web, Microsoft Excel o un componente de la red similar. El software del navegador web se
15 usaría para un sistema basado en la web 100, mientras que el software de Microsoft Excel se usaría para un sistema de escritorio. La opción basada en la web proporciona conexión de redes para múltiples usuarios, y se puede extender para para acomodar a miles de usuarios. La opción de escritorio es suficiente para un solo usuario que no tiene previsto compartir los datos e información de la muestra a través de la red.
20 [0184] El software intermedio puede incluir macros de Microsoft Excel o componentes de la red desarrollados para usar en una opción de escritorio o software personalizado creado programando un lenguaje adecuado para usar con los sistemas basados en la web, tal como PHP. El software intermedio se configura como una colección de programas que es capaz de recibir entradas y consultas del usuario y devolver información de base de datos al usuario mediante una salida conocida, tal como impresora, pantalla o salida audible.
25 [0185] El software de back-end preferiblemente es Microsoft Access, que es un software de base de datos registrado ofrecido por Microsoft Corporation y alojado por Microsoft Excel. Este programa particular proporciona suficiente capacidad de base de datos para soportar hasta 50.000 registros, y hasta un máximo de 100.000 registros con niveles crecientes de degradación del rendimiento. Otra opción es MySQL, que es un software de base de datos
30 de distribución libre desarrollado en forma conjunta y disponible sin cargo, que funciona en todos los servidores principales, incluyendo los basados en plataformas de Windows y Linux. Esta base de datos es capaz de manejar millones de registros, y sería adecuada para un usuario institucional grande, tal como agencias gubernamentales, universidades y entidades multinacionales.
35 [0186] El software 104 se configura para proporcionar señales de control a la interfaz de RFID 108 y para recibir datos e información de la interfaz 108. Además, cuando se suministra información a un transpondedor, el software 104 se configura para iniciar la escritura de datos a través del interrogador 112 al transpondedor 110 usando procedimientos y equipamiento conocido en la materia y que está fácilmente disponible en el comercio.
40 [0187] La figura 12 ilustra otra arquitectura de sistema 128 en la que otra base de datos 130 está conectada con una pluralidad de ordenadores de sobremesa 132 por un servidor web 134. Residente en el servidor 134 hay software que proporciona una capa de comunicación entre el usuario, la base de datos 130 y el software de escritorio 236 residente en los ordenadores de sobremesa 132. Con una interfaz de navegador web 138, un usuario se puede conectar al lector de RFID 142 por una conexión USB estándar 140. El usuario después puede controlar
45 las operaciones de lectura y escritura del lector de RFID 142 y la etiqueta RFID 144 remota, usando la conexión inalámbrica 146 proporcionada por las comunicaciones de radiofrecuencia.
[0188] En relación a continuación con la figura 13, se muestra un sistema que usa una arquitectura de 3 niveles 148 que tiene un ordenador de sobremesa 150 con un navegador web front-end 158 conectado a una base de datos 50 back-end 154 por el software intermedio del servidor web 156 en un servidor web 152. El software intermedio busca, recupera y presenta posibilidades a un usuario. Más en particular, la lógica de negocios está contenida en el programa de software intermedio 156 en el servidor web 152. Además, hay (opcionalmente) un lector de RFID 160 acoplado por una conexión USB 162 al programa del lado del cliente 164 en el ordenador de sobremesa 150. La aplicación del lado del cliente que lee y escribe en la etiqueta RFID 166 por el lector 160, es lanzada desde el
55 navegador web 158.
[0189] En una disposición alternativa de 2 niveles de esta arquitectura 148, hay un programa front-end Excel en el ordenador de sobremesa 150 que comunica directamente con la base de datos 154 en el back-end. La lógica de negocios aquí está incluida en el programa macro de Excel. Este procedimiento es particularmente eficaz para la
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carga de datos (p. ej., 96 filas de datos que corresponden a cada pocillo en una placa) en una base de datos para aprovechar las funciones de Excel, tales como copiado, arrastre, etc.
[0190] En una alternativa adicional de disposición de 2 niveles de la arquitectura 148, una aplicación de cliente
5 independiente 170 en el front-end comunica directamente con la base de datos 154 en el back-end. La lógica de negocios está contenida dentro de la aplicación de cliente independiente, y también puede estar contenido un módulo para leer de y escribir en la etiqueta RFID 166 dentro de esta aplicación 170. Aquí, la ventaja es que la aplicación se compila (el código fuente no es visible) y no requiere software de terceros (Excel, servidor web). El inconveniente es que no es tan compatible con la red como la arquitectura de 3 niveles descrita antes.
10 [0191] Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración y no de limitación.
EJEMPLOS
15 EJEMPLO 1
PREPARACIÓN DE LA MATRIZ PARA EL DISPOSITIVO DE ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
[0192] Este ejemplo describe la preparación de dispositivos de almacenamiento de muestras biológicas usando un
20 material matriz soluble. Dependiendo del material biológico almacenado en un ejemplo particular, la matriz se preparó con diferentes tampones de almacenamiento. En estos ejemplos, todos los reactivos eran de Sigma (St. Louis, MO) salvo que se indique otra cosa. Para el almacenamiento en seco de ácidos nucleicos, se usó Tris 20 mM a pH 6,5 para preparar una matriz de almacenamiento básica con 1% de poli(alcohol vinílico) (PVA, Sigma nº P8136). La concentración del polímero se ensayó en un intervalo de 0,1% a 10% (v/p). El pH de la matriz se ensayó
25 en el intervalo de pH 5 a 8. Para la detección conveniente de la muestra biológica, se añadió rojo de fenol a la matriz líquida al 0,0002% (p/v).
[0193] La matriz en forma líquida se aplicó a los pocillos de muestra de una placa de 96 pocillos y se secó completamente a temperatura ambiente a presión estándar o a vacío en una cámara de vacío. El tiempo de secado
30 para un volumen de matriz de 50 µl era toda la noche y a vacío se necesitaba un tiempo más corto de secado. Las placas estaban entonces listas para el almacenamiento de material biológico.
[0194] Se pueden añadir aditivos de almacenamiento adicionales, tales como uno o más de EDTA, NaCl, MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, MgSO4, CaCl2, acetato de Zn, acetato de Na, cisteína, ditiotreitol (DTT, reactivo de Cleland), acetato 35 de potasio, acetato de Tris, acetato de magnesio, KPO4, glicerol, Triton X-100®, dodecilsulfato de sodio (SDS), azida de sodio, inhibidores de proteasa (PMSF, fluoruro de aminoetilbencenosulfonilo, pepstatina, E64, bestatina, leupeptina, aprotinina), 2-mercaptoetanol, polietilenglicol (PEG), albúmina de suero bovino (BSA), dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), ATP, directamente en la matriz de almacenamiento para la estabilización y activación después de rehidratación, dependiendo de la bioactividad que se vaya a ensayar. Para el material biológico 40 asociado con la actividad biológica tales como enzimas, las condiciones de reacción se pueden ajustar directamente en la matriz de almacenamiento. En algunos casos, la única sustancia a añadir para la rehidratación antes de una reacción de actividad es agua. La matriz también puede incluir uno o más inhibidores tales como agentes antibacterianos y/o antifúngicos. La matriz se puede esterilizar por esterilización por filtración o en autoclave antes de repartir en partes alícuotas la matriz en los pocillos de almacenamiento individuales. La matriz tratada en
45 autoclave se aplica en partes alícuotas a los pocillos de almacenamiento en tubos individuales o en placas de múltiples pocillos, con un volumen líquido de 10 a 100 µl por pocillo en el caso de una placa de 96 pocillos.
EJEMPLO 2
50 ALMACENAMIENTO EN SECO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
[0195] Se prepararon dispositivos de almacenamiento de muestras biológicas como se describe en el ejemplo 1. Se usaron los materiales y procedimientos de biología molecular generales, como se ha descrito (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel y
55 col., 1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA). Se llevaron a cabo ensayos de estabilidad para plásmidos, oligonucleótidos, fragmentos de ADN en forma de una escalera de 1 Kb, productos de la PCR, ADN genómico (felino y humano) y ARN. Se llevaron a cabo ensayos de recuperación y estabilidad usando análisis de tasa de transformación y PCR basados en gel.
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A. ALMACENAMIENTO DE PLÁSMIDOS
[0196] Un total de 50 ng de plásmido circular (puc19) (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) en una concentración de 10 ng/µl en agua bidestilada (ddH2O) se aplicaron en manchas puntuales sobre la matriz soluble 5 seca en cada pocillo de una placa de polipropileno de 96 pocillos. La muestra se secó y almacenó a temperatura ambiente. Se almacenó plásmido de control en forma líquida en un congelador a -20ºC. Para la recuperación, se aplicaron 50 µl de ddH2O al pocillo de muestra seca. La muestra se rehidrató durante 15 minutos y se usaron partes alícuotas de 10 µl para transformar células bacterianas DH5-alfa competentes. Las células transformadas se cultivaron en placa en placas de agar LB y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se contaron las células de cada
10 placa. Se calculó el porcentaje de recuperación de ADN basado en la transformación del ADN de control (10 ng de puc19 almacenados a -20ºC).
[0197] La recuperación de ADN era mayor que 50% en una matriz de PVA al 5% después de almacenamiento durante más de 8 meses. Se ensayó una matriz de PVA al 1% en el tiempo de medición de 1 mes, y resultó que la
15 recuperación era mayor que o equivalente al ADN almacenado en congelador. La tasa de transfección para el almacenamiento a largo plazo era estable con una recuperación de 60% para la matriz de PVA al 5% y 100% para la matriz al 1%. No se observó disminución de la recuperación después de 6 meses de almacenamiento. El PVA al 5% no formó solución completamente.
20 [0198] El análisis por PCR de la muestra rehidratada demostró la estabilidad continuada de la muestra en las condiciones descritas. Se diseñaron dos cebadores de PCR (directo e inverso) que amplificaban un tramo de 480 pb del plásmido puc19. Se usaron 5 ng de la muestra rehidratada para la reacción de amplificación en comparación con 5 ng de plásmido de control. Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo en número de ciclos bajo en condiciones de no saturación. Después de 8 meses el material almacenado en seco se podía amplificar sin pérdida detectable de
25 la eficacia de amplificación.
B. ALMACENAMIENTO DE OLIGONUCLEÓTIDOS
[0199] Dos oligonucleótidos (cebador de PCR directo e inverso) para la amplificación de puc19 se aplicaron como
30 manchas puntuales en un volumen de 10 µl en una concentración total 10 µM y 20 µM, cada uno en una matriz de almacenamiento en seco de PVA al 1% en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Los oligonucleótidos se secaron durante la noche a temperatura ambiente y la placa se almacenó a temperatura ambiente. Los oligonucleótidos de control se almacenaron en forma líquida en un congelador a -20ºC. Para la recuperación, los pocillos que contenían ambos oligonucleótidos (cebadores de la PCR) se rehidrataron usando reactivos de PCR que contenían 1 x tampón
35 de PCR, 5 ng de plásmido puc19 y dNTP durante 15 minutos. La mezcla de reacción rehidratada se transfirió a tubos de PCR y se añadió polimerasa Taq. La reacción se llevó a cabo durante 25 ciclos y se analizó por electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
[0200] El análisis del gel puso de manifiesto la amplificación de un producto de la PCR del tamaño esperado.
40 Comparado con el control, se requirió el doble de la cantidad del cebador para obtener la misma cantidad de amplificación comparado con el cebador almacenado en líquido. La tasa de recuperación de una matriz de PVA al 1% era menor que la del control almacenado en líquido. La recuperación se mejoró reduciendo la concentración de PVA en la matriz.
45 C. ALMACENAMIENTO DE FRAGMENTOS DE ADN
[0201] Fragmentos de ADN en forma de una referencia de tamaño de escalera de ADN de 1 Kb (Invitrogen) (0,5 µg) se aplicaron como manchas puntuales sobre una matriz de almacenamiento en seco basada en PVA al 1% en presencia de tampón de carga de ADN que contenía rojo de fenol u otro agente colorante y glicerol al 50%. Se 50 aplicaron en forma de manchas puntuales en cada pocillo 10 µl de escalera de ADN y colorante, equivalente al volumen de la escalera de ADN reciente usada para la visualización de la escalera en un pocillo de un gel de agarosa de electroforesis. Los fragmentos de ADN con el colorante cargado se deshidrataron durante la noche y se almacenaron a temperatura ambiente. Para la recuperación, las células con la referencia del tamaño de la escalera de ADN de 1 Kb y el tampón de carga se rehidrataron con 10 µl de ddH2O. El tiempo de rehidratación era 5 y 10
55 minutos respectivamente, antes de la carga de 10 µl de escalera de 1 Kb en un gel de electroforesis.
[0202] Para el análisis, 10 µl de la escalera de control almacenados en forma líquida en presencia del tampón de carga a -20 ºC se compararon por la intensidad de fluorescencia usando tinción con bromuro de etidio con la referencia de tamaño almacenada en seco rehidratada 5 min y 10 min. No había diferencia en la intensidad de la
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fluorescencia de las bandas de ADN de diferentes tamaños. Ninguna de las bandas mostraba degradación de ADN del almacenamiento en seco a temperatura ambiente.
D. ALMACENAMIENTO DE ADN GENÓMICO
5 a) ADN genómico felino
[0203] Una cantidad total de 20 ng de ADN genómico felino total en 10 µl de tampón de TE a pH 8, se aplicó como manchas puntuales en una matriz de almacenamiento en seco basada en PVA al 5%, por pocillo de una placa de 96 10 pocillos. El ADN genómico se secó durante la noche y se almacenó a temperatura ambiente. El ADN de control se almacenó congelado a -20ºC. Para la recuperación, los pocillos que contienen el ADN genómico felino se rehidrataron usando reactivos de la PCR que contenían 1 X tampón de PCR, 2 cebadores específicos felinos en una concentración 10 µM y dNTP durante 15 minutos. Los cebadores amplificaron un fragmento de 600 pb de ADN felino. La mezcla de reacción rehidratada se transfirió a tubos de PCR y se añadió polimerasa Taq. La reacción se
15 llevó a cabo durante 35 ciclos y se analizó en un gel de agarosa al 1%.
[0204] El análisis por PCR se llevó a cabo una semana y 3,5 meses después de almacenamiento en seco. En ambos puntos de medición el fragmento de ADN del tamaño esperado se podía amplificar sin una disminución de la tasa de amplificación comparado con el ADN genómico almacenado congelado.
20 b) ADN genómico humano
[0205] Una cantidad total de 20 ng de ADN genómico humano total en 10 µl de tampón de TE a pH 8, se aplicó como manchas puntuales en una matriz de almacenamiento en seco basada en PVA al 1% en cada pocillo de una 25 placa de 96 pocillos. El ADN genómico se secó durante la noche y se almacenó a temperatura ambiente. El ADN de control se almacenó congelado a -20ºC.
[0206] Los pocillos que contenían el ADN genómico humano se rehidrataron usando reactivos de PCR que contenían 1 X tampón de PCR, 2 cebadores específicos del factor de crecimiento humano 13 (hFGF13) en una 30 concentración 10 µM y dNTP, durante 15 minutos. La mezcla de reacción rehidratada se transfirió a tubos de PCR y se añadió polimerasa Taq. La reacción se llevó a cabo durante 35 ciclos y se analizó en un gel de agarosa al 1%.
[0207] El análisis de la PCR se llevó a cabo un mes después de almacenamiento en seco. El fragmento del gen del factor de crecimiento humano del tamaño esperado se amplificó sin una disminución de la tasa de amplificación 35 comparado con el ADN genómico almacenado congelado.
EJEMPLO 3
ALMACENAMIENTO EN SECO DE PROTEÍNAS
40 [0208] Se prepararon dispositivos de almacenamiento de muestras biológicas como se describe en el ejemplo 1. Este ejemplo muestra que el almacenamiento en seco de proteínas a temperatura ambiente con recuperación completa de la actividad, ofrece ventajas tremendas comparado con el almacenamiento de proteínas congeladas como muestras líquidas.
45 [0209] Se llevaron a cabo ensayos de estabilidad y actividad para diferentes secuenasas, polimerasas estables al calor, enzimas de restricción, ligasas, proteasas, para demostrar la naturaleza protectora de la matriz soluble. La estabilización de proteínas y su recuperación como moléculas activas se llevó a cabo usando la matriz soluble a largo plazo descrita antes. La matriz se preparó en presencia de TRIS a pH 5-8, rojo de fenol como un indicador de
50 pH y PVA al 1%. La matriz se solidificó por deshidratación y las proteínas se aplicaron como manchas puntuales en la matriz seca en presencia o ausencia de trehalosa (Fluka, nº de catálogo 90210) o validamicina A (Research Products International Corp., nº de catálogo V21020) en forma líquida. El agua en la solución de proteína hidrató y solubilizó el PVA. La mezcla de proteína se sumergió en la matriz solubilizada y se secó a temperatura ambiente. Se añadió validamicina A al material biológico en una concentración de 0,5 a 10% en p/v. La mezcla de la muestra
55 biológica en presencia de validamicina A se aplicó a la matriz de muestra de PVA soluble.
EJEMPLO 4
ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZO DE PROTEÍNAS USANDO LA MATRIZ DE PVA SOLUBLE
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[0210] Este ejemplo describe la recuperación de proteínas activas después de almacenamiento en seco a largo plazo de matrices de PVA solubles preparadas como se describe en los ejemplos precedentes.
5 A. POLIMERASAS [0211]
1) SEQUENASE™--La Sequenase™ (USB, Cleveland, OH) se almacena normalmente a -20 ºC y pierde actividad a lo largo del tiempo en el congelador por las congelaciones y descongelaciones repetidas, dando como resultado una 10 menor longitud de lectura y calidad de la reacción de secuenciación. La Sequenase™ se aplicó a la matriz soluble en 1 x tampón de secuenciación en presencia de una concentración final de trehalosa o validamicina A de 5%. Se usó el kit de secuenciación de ADN Sequenase™ Versión 2.0 de USB (número de producto 70770) de acuerdo con el protocolo de los proveedores. La concentración por pocillo en una placa de 96 pocillos era equivalente a la concentración de la Sequenase™ almacenada congelada usada para una reacción de secuenciación. La 15 Sequenase™ de control se almacenó convencionalmente en un congelador a -20 ºC. Para la recuperación, el pocillo completo se hidrató con 20 µl de 1 x tampón de secuenciación durante 5-45 minutos. Para el análisis de actividad, se prepararon reacciones de secuenciación usando un marcador de S35 y la reacción se llevó a electroforesis en un gel de secuenciación de acrilamida. Las secuencias de la secuenasa congelada y almacenada en seco se compararon mediante la lectura de las escaleras de secuencia. Ambas secuencias tenían la misma calidad de
20 lectura.
2) POLIMERASA TAQ -La polimerasa Taq para las reacciones de PCR se almacena a -20ºC y pierde actividad a lo largo del tiempo por la congelación y descongelación repetida dando como resultado una menor eficacia de amplificación. La polimerasa Taq (5 U por pocillo) se aplicó a una matriz soluble en 1 x tampón de la PCR en
25 presencia de una concentración final de trehalosa o validamicina A de 5%. La concentración por pocillo en una placa de 96 pocillos era equivalente a la concentración de la polimerasa Taq almacenada congelada usada para una reacción de PCR. La polimerasa Taq de control se almacenó convencionalmente en un congelador a -20ºC. Para la recuperación, se hidrató el pocillo completo con 20 µl de 1 x tampón de la PCR durante 5-45 minutos.
30 Para el análisis de actividad, las reacciones de la PCR se prepararon usando protocolos de PCR estándar y el producto de la PCR se llevó a una electroforesis en un gel de agarosa. Los productos de la PCR de la polimerasa almacenada congelada y en seco se compararon por inspección visual. Ambos productos de la PCR tenían la misma intensidad.
35 3) POLIMERASA DE ALTA FIDELIDAD DEEP VENTTM (New England Biolabs Inc, Beverly, MA.) La polimerasa Deep Vent™ para reacciones de PCR se envió sobre hielo seco y se almacenó a -20ºC. Si se interrumpía la cadena de congelación del transporte, la enzima perdía su actividad. La proteína perdía actividad a lo largo del tiempo por la congelación y descongelación repetida, dando como resultado una actividad enzimática reducida. Se aplicó la polimerasa Deep VentTM completamente activa a la matriz de PVA soluble en 1 x tampón de PCR en presencia de
40 una concentración final de trehalosa o validamicina A de 5%. La concentración por pocillo en una placa de 96 pocillos (5 U por pocillo) era equivalente a la concentración de la polimerasa Deep VentTM almacenada congelada usada para una reacción de PCR. La polimerasa Deep VentTM de control se almacenó en un congelador a -20ºC. Se hidrató el pocillo completo con 20 µl de 1 x tampón de la PCR durante 5-45 minutos. Las reacciones de PCR se prepararon usando protocolos de PCR estándar y el producto de la PCR se llevó a electroforesis en un gel de
45 agarosa. Como se muestra en la figura 14, los productos de la PCR de la secuenasa almacenada congelada y en seco se compararon por inspección visual. Ambos productos de la PCR tenían la misma intensidad con bromuro de etidio. No se pudo detectar diferencia cuantitativa entre un tiempo de rehidratación de 5 minutos frente a 60 minutos.
B. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
50 [0212] Se aplicó en manchas puntuales HindIII, con 20 U y 40 U por pocillo, a una matriz soluble en 1 x tampón de digestión en presencia de una concentración final de trehalosa o validamicina A de 5%. La concentración por pocillo en una placa de 96 pocillos era equivalente a la concentración de la polimerasa Taq almacenada congelada usada para una reacción de PCR. HindIII de control se almacenó de forma convencional en un congelador a -20ºC. El
55 pocillo completo se hidrató con 20 µl de 1 x tampón de enzima de restricción durante 5-45 minutos. Se digirió 1 µg de plásmido puc19 con la enzima de restricción rehidratada y el plásmido digerido se llevó a electroforesis en un gel de agarosa. Se comparó el patrón de bandas de ADN de HindIII almacenada congelada y en seco con un plásmido no digerido por inspección visual. La enzima almacenada congelada y en seco mostró actividad equivalente.
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[0213] C. SECUENCIACIÓN CÍCLICA CON BIG DYE™ --La enzima Big Dye™ de ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) para la secuenciación cíclica perdía actividad a lo largo del tiempo después de procesos de congelación y descongelación repetidos, dando como resultado una menor longitud de lectura de la reacción de secuenciación y menor calidad de la lectura.
5 [0214] Se aplicó Big Dye™ (ABI) activa, almacenada de forma adecuada, reciente, a la matriz de PVA soluble en 1 x tampón de reacción en presencia de una concentración final de trehalosa (Fluka nº 90210) de 5%. Para ensayar si la enzima Big Dye™ se podía deshidratar en presencia de plásmido y cebadores de secuenciación sin pérdida de actividad, Big Dye™ se aplicó en manchas puntuales en presencia del cebador directo M13 y puc19. La
10 concentración por pocillo en una placa de 96 pocillos era equivalente a la concentración de la SequenaseTM (USB) almacenada congelada usada para una reacción de secuenciación. La SequenaseTM de control se almacenó de forma convencional en un congelador a -20ºC. El pocillo completo se hidrató con 20 µl de 1 x tampón de reacción durante 30 minutos. Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del proveedor durante 35 ciclos. Los productos de la PCR de la reacción de secuenciación cíclica se purificaron y
15 analizaron usando un instrumento de secuenciación capilar ABI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de Big Dye™ almacenada congelada y en seco, así como Big Dye™ secada en presencia y ausencia del plásmido y cebadores de secuenciación se compararon usando programas de análisis de secuencia de Mac Vector. La calidad de la secuencia era idéntica en las primeras 700 bases. Se obtuvieron lecturas más largas usando los reactivos de Bid Dye secados, como se muestra en la figura 15.
20
D. PROTEASAS
[0215] Las proteasas son dianas principales para los fármacos. Actualmente, se usan proteasas para el cribado de moléculas pequeñas para desarrollar nuevos fármacos contra enfermedades víricas tales como el VIH. Los ensayos 25 de proteasas a menudo son difíciles de llevar a cabo porque la actividad de la proteasa es una reacción enzimática delicada conde debe ajustarse antes de cada ensayo la actividad inicial de la proteasa almacenada. La cinética de la reacción varía basado en cambios en la actividad de proteasa después de cada congelación-descongelación. Esta sección demuestra cómo proteasas secadas en presencia de matriz soluble eran protegidas de la pérdida de actividad y podían ser activadas después de rehidratación sin cambios en el perfil de actividad, dando como
30 resultado ahorros de tiempo tremendos para cualquier uso de la enzima, tal como para un proyecto de cribado de moléculas pequeñas.
1) Proteasa del VIH -La proteasa del VIH se aplicó en manchas puntuales con una concentración 25 nM por pocillo de una placa de 96 pocillos previamente tratada con matriz de PVA soluble en presencia de tampón de actividad 35 (MES 0,5 M, glicerol al 25%, NaCl 1 M, pH 5,25) que contenían trehalosa o validamicina A en una concentración final de 2,5-10% (p/v). Como control se aplicó en manchas puntuales proteasa del VIH en pocillos de placas de polipropileno en presencia de trehalosa o validamicina sin la presencia de matriz de PVA. La proteasa del VIH secada se recuperó en 1 x tampón de actividad en presencia de hidrocloruro de guanidina 150 mM. La recuperación completa se logró 1 h después de la rehidratación. La actividad de la reacción enzimática se siguió en un estudio 40 cinético usando un péptido fluorogénico que contenía dos moléculas fluorescentes en un ensayo FRET a lo largo de un periodo de tiempo de 20 min. La reacción se analizó en un fluorómetro de placa de microvaloración Fusion de Packard de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No se podía restablecer la actividad enzimática usando la proteasa del VIH que se había aplicado en manchas puntuales con trehalosa o validamicina A solos, en ausencia de la matriz de PVA soluble. En cambio, se recuperó 100% de la actividad de proteasa del VIH usando la enzima que
45 se había aplicado en manchas puntuales en la matriz de PVA en presencia de trehalosa y se recuperó 70% de la actividad de la enzima que se había secado usando solo la matriz soluble (PVA) sin agentes estabilizantes adicionales.
2) Proteasa del VIF -El VIF (virus de inmunodeficiencia felina) es un lentivirus estrechamente relacionado con el
50 VIH. La proteasa de VIF se aplicó en manchas puntuales en pocillos previamente tratados con matriz soluble secada con una concentración de 0,5 µg por pocillo en presencia y ausencia del inhibidor basado en péptido TL-3 (Lee y col., 1998 PNAS 95:939). Los pocillos que contenían la matriz, la proteasa y el inhibidor TL-3 se secaron completamente y almacenaron a temperatura ambiente. La proteasa del VIH secada se rehidrató durante 1 h en 1 x tampón de actividad en presencia de hidrocloruro de guanidina 150 mM. La actividad de la reacción enzimática se
55 siguió en un estudio cinético usando un péptido fluorogénico que contenía dos moléculas fluorescentes en un ensayo de FRET a lo largo de un periodo de tiempo de 20 min. La reacción se analizó en un fluorómetro de placa de microvaloración Fusion de Packard. La actividad de la proteasa del VIF se restableció completamente después del procedimiento de rehidratación y la actividad enzimática era bloqueada por TL-3, demostrando que la proteasa y su inhibidor son completamente activos después de almacenamiento en seco a temperatura ambiente.
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[0216] También se compararon la trehalosa y validamicina como se ha descrito antes, en sus efectos en la proteasa del VIF en ensayos de proteasas para la protección de la actividad enzimática durante el almacenamiento en matriz seca a largo plazo de la proteasa a temperatura ambiente en la matriz de almacenamiento soluble.
5 Cualquiera de los aditivos estabilizaba de forma protectora la enzima y no había diferencias detectables en la protección de la enzima (figura 17).
[0217] E. LIGASAS -Se aplicó ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA, nº M0202L) (400 U) por pocillo a la matriz de PVA soluble como se ha descrito antes en 1 x tampón de ligado en presencia de una concentración 10 final de validamicina A de 5%. La ligasa de control se almacenó en un congelador a -20ºC. El pocillo completo se hidrató con 20 µl de 1 x tampón de ligado durante 5-45 minutos. 50 ng del plásmido puc19 digerido con SaII, desfosforilado con fosfatasa intestinal de ternero, se ligó durante la noche con la ligasa rehidratada en paralelo con ligasa almacenada congelada. La mitad de la reacción de ligado se transformó en células bacterianas competentes DH5alfa. Las células se cultivaron en placas de agar LB y la tasa de transformación se analizó por recuentos de
15 colonia. Solo los plásmidos religados podían formar colonias en estas condiciones. La ligasa almacenada en seco tenía recuentos de colonias 5 veces superiores que la ligasa almacenada congelada.
[0218] F. Ensayo de la proteasa del VIH reconstituible -Los ensayos de proteasa del VIH actuales requieren la descongelación de la proteasa, resuspensión en un tampón de actividad, resuspensión del sustrato fluorogénico en 20 su sistema tampón, mezcla de la solución y la aplicación de la mezcla sobre placas de 96 pocillos fluorescentes especiales para un ensayo previo de la actividad de la enzima descongelada. Después de determinar la actividad de la proteasa, puede empezar el ensayo de cribado de los compuestos inhibidores y normalmente se lleva a cabo en un formato de 96 pocillos. Debe repetirse el mismo procedimiento que implica las etapas de pipeteo descritas antes. Esta sección muestra cómo usando la proteasa suministrada de acuerdo con las composiciones y procedimientos de
25 la presente aplicación en la matriz soluble en forma seca, no hay que llevar a cabo ensayo previo, puesto que la actividad de la proteasa del VIH permanece estable en las condiciones secadas.
[0219] Usando la matriz de PVA soluble preparada como se ha descrito antes, la proteasa del VIH y proteasa del VIF se aplicaron en manchas puntuales y se secaron en su respectivo tampón de actividad en la concentración de 30 reacción adecuada. El pocillo de sustrato de proteasa fluorogénico y de control negativo que contenían el inhibidor de proteasa se suministraron en su tampón en forma secada en placas de 96 pocillos también. El operario del cribado solo tenía que añadir agua sola o que contuviera un compuesto de cribado de inhibidor de ensayo para rehidratar el pocillo que contenía proteasa, y agua al pocillo del sustrato fluorescente. Por consiguiente, para rehidratar algunos pocillos de proteasa del VIF se incluyó el inhibidor TL-3 descrito antes. El tiempo de manipulación
35 del ensayo se redujo en más de 10 veces, y los resultados representativos se muestran en la figura 18. Se pueden obtener ahorros de tiempo similares para otros ensayos bioquímicos, cribados o protocolos experimentales.
EJEMPLO 5
40 ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZO DE CÉLULAS USANDO LA MATRIZ DE PVA SOLUBLE
[0220] Este ejemplo describe el almacenamiento a largo plazo en seco a temperatura ambiente de células de E. coli en un material matriz soluble.
45 [0221] Se suspendieron igual número de bacterias Escherichia coli (DH5 alfa) en medio de crecimiento LB y se aplicaron en manchas puntuales en los pocillos de una placa de 96 pocillos: a) sin matriz soluble en medio de crecimiento, b) con matriz de PVA soluble secada, y c) mezclado con validamicina A al 5% y aplicadas en manchas puntuales en matriz soluble seca. Las placas se secaron durante la noche y se almacenaron a temperatura ambiente. Los pocillos con las tres condiciones diferentes se hidrataron con medio de crecimiento durante 1 h y el
50 contenido de los pocillos se cultivó en placas LB de cultivo bacteriano. Las placas se incubaron a 37ºC durante la noche. La tasa de recuperación de E. coli se analizó por recuento de las colonias bacterianas como se muestra en la figura 19.
[0222] La matriz soluble también se prepara y usa para el almacenamiento de células a largo plazo, incluyendo 55 otras bacterias, células de plantas, animales o humanas, y para el almacenamiento en seco de fagos, virus (p. ej., lentivirus, baculovirus, etc.).
[0223] Las composiciones y procedimientos de almacenamiento en matriz seca también están contemplados para usar con anticuerpos, ARN, enzimas y otras muestras biológicas proporcionadas en el presente documento.
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EJEMPLO 6
RECUPERACIÓN DE ADN DESPUÉS DE ALMACENAMIENTO EN SECO BAJO ESTRÉS INDUCIDO POR CALOR
5 [0224] Este ejemplo describe el almacenamiento en seco de ADN a temperatura elevada para mostrar los efectos protectores de diferentes composiciones de matriz de almacenamiento en seco.
[0225] En el primer grupo de experimentos, se prepararon matrices de almacenamiento en seco en tubos de
10 microfuga por aplicación en manchas puntuales de 20 µl de solución de PVA al 1% y secado durante la noche, como se ha descrito antes en el ejemplo 1. A matrices secadas individuales se aplicaron diferentes soluciones de estabilizantes individuales (1% en p/v) y las matrices se secaron de nuevo durante la noche. Los estabilizantes (obtenidos de SigmaAldrich, Fluka y Research Products Int’l.) usados en las diferentes matrices eran como sigue: βlactosa, D-(+)-rafinosa pentahidrato, β-gentiobiosa, trehalosa, ectoína, mioinositol, D-lactosa monoidrato,
15 hidroxiectoína, maltitol, D-gluconato de magnesio hidrato, sacarosa, D-maltosa, hemisal de calcio del ácido 2-ceto-Dglucónico hidrato, D(+)-melezitosa, lactobionato de calcio monohidrato. Las matrices de control recibieron vehículo líquido que no contenía estabilizante.
[0226] ADN plasmídico (500 ng) en solución acuosa se aplicó en manchas puntuales en matrices secas, que
20 después se dejaron secar al aire. Las matrices que contenían las muestras de ADN secas después se sometieron a estrés inducido por calor, poniéndolas en un horno a temperatura controlada a 70ºC durante 3 días. Después, las matrices se retiraron del horno y se recuperaron muestras individuales para la hidratación en 16 µl de agua, y después se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Una banda de control del gel contenía una muestra de ADN que se había mantenido a 4 ºC en lugar de ser sometida a estrés inducido por calor. Se
25 visualizaron bandas discretas de ADN correspondientes a ADN circular abierto (oc) y ADN superenrollado (sc) por tinción con bromuro de etidio con iluminación ultravioleta.
[0227] Después del estrés inducido por calor, se podía ver menos de 10% del nivel del control (almacenado a 4 ºC) de las bandas de ADN oc y sc por tinción con bromuro de etidio, en las muestras que se almacenaron en una 30 matriz seca en ausencia de cualquier estabilizante. En las muestras que se sometieron a estrés inducido por calor durante el almacenamiento en seco en una matriz que contenía extoína o maltitol como estabilizante, la intensidad de la tinción de bromuro de etidio aparente era aproximadamente 50-70% de la vista en la banda del control (almacenado a 4 ºC). En las muestras que se sometieron a estrés inducido por calor durante el almacenamiento en seco en una matriz que contenía como estabilizante uno de β-lactosa, D-(+)-rafinosa pentahidrato, β-gentiobiosa,
35 trehalosa, ectoína, mioinositol, D-lactosa monoidrato, hidroxiectoína, maltitol, D-gluconato de magnesio hidrato, sacarosa, D-maltosa, hemisal de calcio del ácido 2-ceto-D-glucónico hidrato, D(+)-melezitosa o lactobionato de calcio monohidrato, la intensidad de la tinción del bromuro de etidio aparente era aproximadamente 80% o más de la observada en la banda de control (almacenado a 4 ºC).
40 [0228] En el segundo grupo de experimentos, se usaron materiales matriz distintos del PVA. Las matrices de almacenamiento en seco se prepararon en tubos de microfuga como se ha descrito antes, excepto que en lugar de PVA, se prepararon matrices a partir de soluciones al 1% de cada uno de: carboximetilcelulosa (CMC, SigmaAldrich, peso molecular 5.000-40.000 Da); 2-hidroxietil-celulosa ((C2H6O2)x, SigmaAldrich, peso molecular 30.000-48.000 Da); poli(2-etil-2-oxazolina), ([-N(COC2H5)CH2CH2-]n, VWR, West Chester, PA, peso molecular 5.000-80.000 Da); y
45 polivinilpirrolidona (PVP, SigmaAldrich, peso molecular 15.000-35.000).
[0229] Se aplicó en manchas puntuales 1 µg de ADN plasmídico sobre matriz seca y se dejó secar al aire durante la noche. Después los tubos se incubaron a 70 ºC para evaluar el estrés inducido por calor como se ha descrito antes, y después de 3 días a 70 ºC, los tubos se retiraron y las matrices secas se hidrataron con 16 µl de agua. Las
50 muestras rehidratadas después se llevaron a electroforesis en un gel de agarosa (0,8%) teñido con bromuro de etidio junto con una muestra de ADN de control que se había mantenido a 4 ºC en lugar de 70ºC. Para los cuatro materiales matriz, CMC, PVP, 2-hidroxietilcelulosa, y poli(2-etil-2-oxazolina), las recuperaciones del ADN estresado con calor a 70 ºC evaluado por la tinción con bromuro de etidio aparentes de las bandas de ADN oc y sc intactas superaron las de la muestra de ADN de control que se había mantenido a 4 ºC en lugar de 70 ºC.
55

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica, que comprende:
    5 (a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente, que permite la recuperación completa o sustancial de una muestra biológica secada o un material biológico, después de hidratación, rehidratación u otra reconstitución con disolvente de la muestra, en la que el material matriz comprende un material seleccionado de poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, 2-hidroxietilcelulosa y poli(2-etil-2-oxazolina), o en donde el material matriz comprende al menos un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, agarosa,
    10 poli-N-vinilacetamida, poli(4-vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada, polimetacrilato, nanotubos de carbono, polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetatosuccinato de hidroxipropilmetilcelulosa, proteoglicano sulfato de heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico, dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina, fibronectina, un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua y colágeno, o comprende al menos un material matriz que
    15 comprende un polímero, en el que el polímero no se autoensambla de forma covalente y tiene la fórmula
    -[-X-]n
    en la que X es -CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CH(OH)-sustituido, -CH2CH(COOH)-, -CH2CH(COOH)-sustituido,
    20 -CH=CH2, -CH=CH-, alquilo C1-C24 o alquilo sustituido, alquenilo C2-24 o alquenilo sustituido, polioxietileno, polioxipropileno, o un copolímero aleatorio o de bloques de los mismos; y en el que n es un número entero que tiene un valor de aproximadamente 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, o 1501-3000; y
    (b) al menos un estabilizante que comprende un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, en 25 el que el inhibidor biológico o inhibidor bioquímico es validamicina A;
    en la que la matriz se prepara por secado de una solución que comprende de 0,1% a 10% en peso-volumen del material matriz;
    30 en la que la matriz se obtiene por secado al aire a temperatura ambiente o a una temperatura elevada adecuada, y/o por secado bajo una corriente de gas adecuado, tal como una corriente de aire filtrado, CO2, o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, de una solución.
  2. 2. La matriz de la reivindicación 1, en la que el disolvente comprende un disolvente biocompatible. 35
  3. 3.
    La matriz de la reivindicación 2, en la que el material matriz se disuelve en el disolvente biocompatible.
  4. 4.
    La matriz de la reivindicación 1, en la que el material matriz comprende poli(alcohol vinílico).
    40 5. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de 0,1% a 10% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).
  5. 6. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de
    0,5% a 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico). 45
  6. 7. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de 1% a 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).
  7. 8. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de 50 0,5% a 1,5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).
  8. 9. La matriz de la reivindicación 4, en donde la matriz se seca a partir de una solución que se selecciona del grupo que consiste en:
    55 (i) solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico),
    (ii) solución que comprende 3% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico),
    (iii) solución que comprende 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico),
    49
    (iv) solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5% en peso-volumen de trehalosa,
    (v) una solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5% en peso-volumen de 5 validamicina A, y
    (vi) una solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico), 5% en peso-volumen de trehalosa y 5% en peso-volumen de validamicina A.
    10 10. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que se selecciona del grupo que consiste en:
    (i) una solución que comprende de 1% en peso-volumen a 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5% en
    peso-volumen de validamicina A; y 15
    (ii) una solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y de 1% a 10% en peso-volumen de validamicina A.
  9. 11. Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 20 1, que además comprende un tampón que puede mantener un pH deseado.
  10. 12. La matriz de la reivindicación 11, en la que el tampón comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en Tris, citrato, acetato, fosfato, borato, HEPES, MES, MOPS, PIPES, carbonato y bicarbonato.
    25 13. Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un indicador detectable.
  11. 14. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable comprende un indicador
    colorimétrico. 30
  12. 15.
    La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable comprende uno o una pluralidad de compuestos de marcador de GCMS.
  13. 16.
    La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable se selecciona del grupo que
    35 consiste en un indicador fluorescente, un indicador luminiscente, un indicador fosforescente, un indicador radiométrico, un colorante, una enzima, un sustrato de una enzima, una molécula de transferencia de energía, y un marcador de afinidad.
  14. 17. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable puede indicar de forma detectable
    40 la presencia de al menos uno de una amina, un alcohol, un aldehído, agua, un tiol, un sulfuro, un nitrito, avidina, biotina, una inmunoglobulina, un oligosacárido, un ácido nucleico, un polipéptido, una enzima, una proteína citoesquelética, una especie de oxígeno reactiva, un ion metálico, pH, Na+, K+, Cl-, un cianuro, un fosfato y selenio.
  15. 18. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable se selecciona del grupo que
    45 consiste en rojo de fenol, bromuro de etidio, una ADN polimerasa, una endonucleasa de restricción, cloruro de cobalto, colorante de Reichardt y un sustrato de proteasa fluorogénico.
  16. 19. La matriz de la reivindicación 1, en la que el material matriz puede almacenar en seco la muestra
    biológica sin refrigeración. 50
  17. 20. Un procedimiento de almacenamiento de una muestra biológica, que comprende:
    poner en contacto una muestra biológica con una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, comprendiendo la matriz 55
    (i)
    un material matriz como se define en la reivindicación 1; y
    (ii)
    al menos un estabilizante como se define en la reivindicación 1,
    50
    en el que la matriz se prepara por secado a partir de una solución que comprende de 0,1% a 10% en peso-volumen del material matriz;
    en el que la matriz se obtiene por secado al aire a temperatura ambiente o a una temperatura elevada adecuada, y/o 5 por secado bajo una corriente de gas adecuado, tal como una corriente de aire filtrado, CO2, o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, de una solución;
    y así almacenar la muestra biológica.
    10 21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el material matriz comprende poli(alcohol vinílico).
    51
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