KR20220139426A - 핵산 안정화 시약, 키트들, 및 그 이용 방법들 - Google Patents

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KR20220139426A
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제이슨 엠 맥퀸
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버클리 라잇츠, 인크.
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Abstract

생물학적 세포의 핵산을 안정화시키기 위한 시약, 조성물, 키트 및 이들의 사용 방법이 기재되어 있다. 안정화 시약은 저장을 위해 생물학적 세포 내의 핵산을 준비하고, 추후 격리 및 분석을 위해 핵산의 대표 모집단을 보존할 수도 있다.

Description

핵산 안정화 시약, 키트들, 및 그 이용 방법들 {NUCLEIC ACID STABILIZATION REAGENT, KITS, AND METHODS OF USE THEREOF}
본 출원은 2016 년 3 월 31 일에 출원된 미국 특허 가출원 제 62/316,514 호의 35 U.S.C. 119(e) 하에서의 이점을 주장하는 정규 출원이고, 그 개시물은 전체 본원에 참조로서 통합된다.
생명과학들 및 관련된 분야들에서는, 분석을 위해 생물학적 세포들로부터 핵산 모집단을 격리하기 전에 수 시간에서 밤새 내지 수 일 범위의 기간 동안 생물학적 세포들을 저장하는 것이 유용할 수 있다. 분석되고 있는 핵산의 모집단 또는 그의 적어도 일부는 저장 전에 세포의 상태를 나타내는 것이 바람직하다. 저장에 의한 핵산 발현의 변화들은 최소화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일부 실시형태들은 후속 격리를 위해 생물학적 세포 내에서 핵산을 안정화시키고, 개입하는 저장으로 인한 변경된 핵산 발현의 발생을 유리하게 감소시키는 시약들 및 프로세스들을 포함한다.
생물학적 세포 내에서 핵산을 안정화시키기 위한 키트들이 본원에서 설명되며, 여기서 키트는 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제 (irreversible protein translation inhibitor); 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제 (ribonucleic acid transcription inhibitor); 및 전자 전달 사슬 저해제 (electron transport chain inhibitor) 및 전자 전달 사슬 디커플링제 (electron transport chain decoupling agent) 로부터 선택된 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제 (electron transport chain agent) 를 포함한다.
다른 양태에서, 생물학적 세포에서 핵산을 안정화시키기 위한 방법이 설명되며, 생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 접촉하는 단계는 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하는데 충분한 기간 동안 수행된다. 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 본원에 기재된 임의의 핵산 안정화 시약일 수 있는 핵산 안정화 시약의 성분들일 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 그 방법은 본원에서 설명된 것과 같은 임의의 기간 동안, 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 각각의 존재시 안정화된 생물학적 세포를 저장하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 저장하는 단계는 20°C 미만의 온도에서 수행될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 저장하는 단계는 0 ℃ 내지 약 4 ℃ 의 온도에서 수행될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 인클로저를 갖는 미세유체 디바이스 내에 위치하는 생물학적 세포에서 핵산을 안정화시키는 방법이 설명되며, 그 방법은: 생물학적 세포를 미세유체 디바이스의 인클로저 내에 배치하는 단계로서, 상기 인클로저는 유동 영역 및 적어도 하나의 챔버를 포함하고 적어도 하나의 챔버는 상기 유동 영역에 유체 연결되며, 상기 유동 영역 및 상기 적어도 하나의 챔버는 유체 매질을 수용하도록 구성되는, 상기 배치하는 단계; 및 생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 접촉하는 단계는 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하는데 충분한 기간 동안 수행된다. 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 본원에 기재된 임의의 핵산 안정화 시약일 수 있는 핵산 안정화 시약의 성분들일 수도 있다. 적어도 하나의 챔버는 시퀘스트레이션 펜일 수 있다. 유동 영역은 미세유체 채널일 수 있다.
도 1a 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와의 이용을 위한 시스템의 예를 예시한다.
도 1b 및 도 1c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스를 예시한다.
도 2a 및 도 2b 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 시퀘스트레이션 펜들을 예시한다.
도 2c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 상세한 시퀘스트레이션 펜을 예시한다.
도 2d 내지 도 2f 는 발명의 일부 다른 실시형태들에 따른 시퀘스트레이션 펜들을 예시한다.
도 2g 는 본 개시의 실시형태에 따른 미세유체 디바이스를 예시한다.
도 2h 는 본 개시의 실시형태에 따른 미세유체 디바이스의 코팅된 표면을 예시한다.
도 3a 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와의 이용을 위한 시스템의 특정 예를 예시한다.
도 3b 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 이미징 디바이스를 예시한다.
도 4 는 예 1 의 5 가지 저장 준비 방법의 각각의 복제로부터 회수된 RNA 및 DNA 의 양의 그래픽 표현이다.
도 5a 는 예 1 에서 LC (Lysis Control) 로 처리된 세포들로부터 회수된 cDNA 의 사이즈 분포의 그래픽 표현이다.
도 5b 는 예 1 의 개시 (In) 의 안정화 시약의 일 실시형태로 처리된 세포들로부터 회수된 cDNA 의 사이즈 분포의 그래픽 표현이다.
도 5b 는 예 1 의 개시 (NA) 의 안정화 시약의 일 실시형태로 처리되지 않은 세포들로부터 회수된 cDNA 의 사이즈 분포의 그래픽 표현이다.
도 6 은 예 1 에서의 LC (Lysis Control) 샘플과 비교하여 안정화 시약 (In) 으로 처리된 세포들에 대한 차동 발현 (DE) 의 도표 표현이다.
도 7 은 예 1 에서 안정화 시약 (NA) 없이 4 ℃ 에서 저장된 세포들과 비교하여 -80 ℃ 에서 저장된 LC (Lysis Control) 세포들에 대한 차동 발현 (DE) 의 도표 표현이다.
도 8 은 80 ℃ 에서 저장된 LC (Lysis Control) 세포들과 비교하여 예 1 의 안정화 시약의 후속 부가 (WIn) 및 4 ℃ 에서의 저장으로, PBS 로 세척된 세포들에 대한 차동 발현 (DE) 의 도표 표현이다.
도 9 는 예 1 의 -80 ℃ 에서 저장된 LC (Lysis Control) 샘플들과 비교하여 4 ℃ 에서의 저장으로, 아무것도 부가되지 않은 (W) PBS 로 세척된 세포들에 대한 차동 발현 (DE) 의 도표 표현이다.
이 명세서는 본 개시의 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들을 설명한다. 그러나, 본 개시는 이 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들로, 또는 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들이 본원에서 동작하거나 설명되는 방식으로 제한되지는 않는다. 또한, 도면들은 간략화된 또는 부분적인 도면들을 도시할 수도 있고, 도면들에서의 엘리먼트들의 치수들은 과장될 수도 있거나, 또는 그렇지 않을 경우에 비례적이지 않을 수도 있다. 게다가, 용어들 "~ 상에 (on)", "~ 에 부착된 (attached to)", "~에 연결된", "~ 에 결합된 (coupled to)", 또는 유사한 단어들이 본원에서 이용되는 바와 같이, 하나의 엘리먼트가 다른 엘리먼트의 바로 위에 있거나, 그것에 부착되거나, 그것에 연결되거나, 또는 그것에 결합되든지, 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 매개하는 엘리먼트들이 있든지에 관계 없이, 하나의 엘리먼트 (예컨대, 재료, 층, 기판 등) 는 또 다른 엘리먼트의 "상에" 있을 수 있거나, 그것에 "부착될" 수 있거나, 그것에 "연결될" 수 있거나, 또는 그것에 "결합될" 수 있다. 게다가, 엘리먼트들 (예컨대, 엘리먼트들 a, b, c) 의 리스트에 대해 참조가 행해질 경우, 이러한 참조는 열거된 엘리먼트들 자체, 전부보다 더 적은 열거된 엘리먼트들의 임의의 조합, 및/또는 열거된 엘리먼트들의 전부의 조합 중의 임의의 하나를 포함하도록 의도된다.
명세서에서의 섹션 분할들은 오직 검토의 용이함을 위한 것이고, 논의된 엘리먼트들의 임의의 조합을 제한하지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "실질적으로" 는 의도된 목적을 위하여 작동하기에 충분하다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로" 는 이에 따라, 당해 분야의 당업자에 의해 예상될 것이지만, 전체적인 성능에 인식가능하게 영향을 주지 않는 바와 같은, 절대적인 또는 완벽한 상태, 치수, 측정, 결과, 또는 등으로부터의 작은 중요하지 않은 변형들을 허용한다. 수치 값들, 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특성들에 대하여 이용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "하나들" 은 하나를 초과하는 것을 의미한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과일 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "투명한" 은 가시광이 통과할 때 광을 실질적으로 변경하지 않고 통과하게 하는 재료를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "배치된" 은 "위치된" 을 그 의미 내에서 망라한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "미세유체 디바이스" 또는 "미세유체 장치" 는 유체를 유지하도록 구성된 하나 이상의 개별 미세유체 회로들을 포함하는 디바이스이며, 각각의 미세유체 회로는 영역(들), 유체 경로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (및 옵션으로 유체 내에 현탁된 미세 물체들) 가 미세유체 디바이스 내로 및/또는 외부로 흐르게 하도록 구성된 적어도 2 개의 포트들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유동적으로 상호연결된 회로 엘리먼트들로 구성된다. 통상적으로, 미세유체 디바이스의 미세유체 회로는 적어도 하나의 미세유체 채널 및 적어도 하나의 챔버를 포함할 것이고, 약 1 mL 미만, 예컨대, 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체의 체적을 유지할 것이다. 특정 실시형태들에서, 미세유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250 또는 50-300 μL 를 유지할 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "나노유체 디바이스" 또는 "나노유체 장치" 는 약 1 μL 미만, 예컨대, 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 또는 그 미만의 유체의 체적을 유지하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 포함하는 미세유체 회로를 가지는 미세유체 디바이스의 타입이다. 통상적으로, 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 초과) 을 포함할 것이다. 특정 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중의 하나 이상 (예컨대, 전부) 은 약 100 pL 내지 1 nL, 약 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체의 체적을 홀딩하도록 구성될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중의 하나 이상 (예컨대, 전부) 은 약 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL 의 유체의 체적을 홀딩하도록 구성될 수도 있다.
미세유체 디바이스 또는 나노유체 디바이스는 본 명세서에서 "미세유체 칩" 또는 "칩"; 또는 "나노유체 칩" 또는 "칩" 으로 지칭될 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같은 "미세유체 채널" 또는 "유동 채널" 은 양자의 수평 및 수직 치수들보다 상당히 더 긴 길이를 가지는 미세유체 디바이스의 유동 영역을 지칭한다. 예를 들어, 유동 채널은 수평 또는 수직 치수의 어느 하나의 길이의 적어도 5 배, 예컨대, 길이의 적어도 10 배, 길이의 적어도 25 배, 길이의 적어도 100 배, 길이의 적어도 200 배, 길이의 적어도 500 배, 길이의 적어도 1,000 배, 길이의 적어도 5,000 배, 또는 더 길 수 있다. 일부 실시형태들에서, 유동 채널의 길이는 그 사이의 임의의 범위를 포함하는, 약 100,000 마이크론으로부터 약 500,000 마이크론까지의 범위에 있다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 마이크론 내지 약 1000 마이크론 (예컨대, 약 150 내지 약 500 마이크론) 의 범위에 있고 수직 치수는 약 25 마이크론 내지 약 200 마이크론, 예컨대, 약 40 내지 약 150 마이크론의 범위에 있다. 유동 채널은 미세유체 디바이스에서의 다양한 상이한 공간적 구성들을 가질 수도 있고, 이에 따라, 완벽하게 선형인 엘리먼트로 한정되지는 않는다는 것이 주목된다. 예를 들어, 유동 채널은 다음의 구성들일 수도 있거나, 다음의 구성들을 가지는 하나 이상의 섹션들을 포함할 수도 있다: 곡선, 굴곡부, 나선, 경사부 (incline), 하강부 (decline), 포크 (fork) (예컨대, 다수의 상이한 유동 경로들), 및 그 임의의 조합. 게다가, 유동 채널은 그 안에서 희망된 유체 유동을 제공하기 위하여 넓어지고 수축되는, 그 경로를 따르는 상이한 단면적들을 가질 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "장애물" 은 일반적으로, 미세유체 디바이스에서의 2 개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이에서 타겟 미세-객체들의 이동을 부분적으로 (그러나 완전히는 아님) 지연시키기 위하여 충분히 큰 범프 (bump) 또는 유사한 타입의 구조체를 지칭한다. 2 개의 상이한 영역들/회로 엘리먼트들은 예를 들어, 미세유체 시퀘스트레이션 펜 및 미세유체 채널, 또는 미세유체 시퀘스트레이션 펜의 연결 영역 및 격리 영역일 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "수축" 은 일반적으로, 미세유체 디바이스에서의 회로 엘리먼트 (또는 2 개의 회로 엘리먼트들 사이의 계면) 의 폭의 좁힘 (narrowing) 을 지칭한다. 수축은, 예를 들어, 미세유체 시퀘스트레이션 펜과 미세유체 채널 간의 인터페이스, 또는 미세유체 시퀘스트레이션 펜의 연결 영역과 격리 영역 간의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "투명한" 은 가시 광이 통과될 때에 광을 실질적으로 변경하지 않으면서 통과하는 것을 허용하는 재료를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "미세-객체" 는 일반적으로, 본 개시에 따라 격리 및/또는 조작될 수도 있는 임의의 미세한 객체를 지칭한다. 미세-객체들의 비-제한적인 예들은 미세입자들; 미세비드 (microbead) 들 (예컨대, 폴리스티렌 비드들, Luminex™ 비드들, 또는 등); 자기적 비드들; 마이크로로드 (microrod) 들; 마이크로와이어 (microwire) 들; 양자 도트 (quantum dot) 들 등과 같은 과 같은 무생물의 미세-객체들; 세포들; 생물학적 세포소기관 (organelle) 들; 소포 (vesicle) 들 또는 복합체 (complexe) 들; 합성 소포들; 리포좀 (liposome) 들 (예컨대, 합성 또는 멤브레인 준비 (membrane preparation) 들로부터 유도됨); 지질 나노래프트 (lipid nanoraft) 들, 및 등과 같은 생물학적 미세-객체들; 또는 무생물의 미세-객체들 및 생물학적 미세-객체들의 조합 (예컨대, 세포들에 부착된 미세비드들, 리포좀-코팅된 미세-비드들, 리포좀-코팅된 자기적 비드들, 또는 등) 을 포함한다. 비드들은 형광 라벨 (fluorescent label) 들, 단백질들, 탄수화물들, 항원 (antigen) 들, 소분자 시그널링 모이어티 (small molecule signaling moiety) 들, 또는 시험에서의 이용이 가능한 다른 화학적/생물학적 종들과 같은, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된 모이어티 (moiety) 들/분자들을 포함할 수도 있다. 지질 나노래프트들은 예를 들어, Ritchie 등 (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs", Methods Enzymol., 464:211-231 에서 설명되었다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포" 는 용어 "생물학적 세포" 와 상호교환가능하게 이용된다. 생물학적 세포들의 비-제한적인 예들은 진핵 세포 (eukaryotic cell) 들, 식물 세포 (plant cell) 들, 동물 세포들 예컨대, 포유류 세포 (mammalian cell) 들, 파충류 세포 (reptilian cell) 들, 조류 세포 (avian cell) 들, 어류 세포 (fish cell) 들, 또는 등, 원핵 세포 (prokaryotic cell) 들, 박테리아 세포 (bacterial cell) 들, 진균 세포 (fungal cell) 들, 원충 세포 (protozoan cell) 들, 또는 등, 근육 (muscle), 연골 (cartilage), 지방 (fat), 피부 (skin), 간 (liver), 폐 (lung), 신경 조직 (neural tissue) 등과 같은 조직으로부터 해리된 세포들, T 세포들, B 세포들, 천연 살생 세포 (natural killer cell) 들, 대식세포 (macrophage) 들, 및 등과 같은 면역 세포 (immunological cell) 들, 배아 (embryo) 들 (예컨대, 접합자 (zygote) 들), 난모세포 (oocyte) 들, 난자 (ovum) 들, 정자 세포 (sperm cell) 들, 혼성세포 (hybridoma) 들, 배양된 세포들, 세포주 (cell line) 로부터의 세포들, 암 세포들, 감염된 세포들, 형질주입된 (transfected) 및/또는 형질전환된 (transformed) 세포들, 보고자 세포 (reporter cell) 들, 및 등을 포함한다. 포유류 세포는 예를 들어, 인간, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 말, 염소, 양, 소, 영장류 (primate), 또는 등으로부터일 수 있다.
생물학적 세포들의 군체 (colony) 는 재현할 수 있는 군체에서의 살아 있는 세포들의 전부가 단일의 부모 세포 (parent cell) 로부터 유도된 딸 세포 (daughter cell) 들일 경우에 "클론성 (clonal)" 이다. 어떤 실시형태들에서, 클론성 군체에서의 모든 딸 세포들은 10 개를 초과하지 않는 분할들에 의해 단일의 부모 세포로부터 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론성 군체에서의 모든 딸 세포들은 14 개를 초과하지 않는 분할들에 의해 단일의 부모 세포로부터 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론성 군체에서의 모든 딸 세포들은 17 개를 초과하지 않는 분할들에 의해 단일의 부모 세포로부터 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론성 군체에서의 모든 딸 세포들은 20 개를 초과하지 않는 분할들에 의해 단일의 부모 세포로부터 유도된다. 용어 "클론성 세포들" 은 동일한 클론성 군체의 세포들을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 생물학적 세포들의 "군체" 는 2 개 이상의 세포들 (예컨대, 약 2 내 약 20, 약 4 내지 약 40, 약 6 내지 약 60, 약 8 내지 약 80, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 200, 약 40 내지 약 400, 약 60 내지 약 600, 약 80 내지 약 800, 약 100 내지 약 1000, 또는 1000 개 이상의 세포) 을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포 (들) 를 유지한다" 는 양자의 유체 및 기체 컴포넌트들을 포함하는 환경과, 임의적으로, 세포들을 생존가능하고 및/또는 확장하는 것으로 유지하기 위하여 필요한 조건들을 제공하는 표면을 제공하는 것을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 세포들을 지칭할 때의 용어 "확장 (expanding)" 은 세포 수에서의 증가를 지칭한다.
유체 매질의 "컴포넌트 (component)" 는 용매 분자 (solvent molecule) 들, 이온들, 소분자 (small molecule) 들, 항생제 (antibiotic) 들, 뉴클레오티드 (nucleotide) 들 및 뉴클레오시드 (nucleoside) 들, 핵산 (nucleic acid) 들, 아미노산 (amino acid) 들, 펩티드 (peptide) 들, 단백질 (protein) 들, 당 (sugar) 들, 탄수화물 (carbohydrate) 들, 지질들, 지방산 (fatty acid) 들, 콜레스테롤 (cholesterol), 대사물질 (metabolite) 들, 또는 등을 포함하는, 매질에서 존재하는 임의의 화학적 또는 생화학적 분자이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "포획 모이어티 (capture moiety)" 는 미세-객체를 위한 인식 부위를 제공하는 화학적 또는 생물학적 종, 기능부, 또는 모티프 (motif) 이다. 미세-객체들의 선택된 부류는 인 시츄-생성된 포획 모이어티를 인식할 수도 있고, 인 시츄-생성된 포획 모이어티를 바인딩할 수도 있거나 포획 모이어티에 대한 친화도를 가질 수도 있다. 비-제한적인 예들은 항원들, 항체들, 및 세포 표면 바인딩 모티프들을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "유동가능한 폴리머" 는 유체 매질 (예를 들어, 프리-폴리머 용액) 내에서 용해가능하거나 분산가능한 폴리머 모노머 (monomer) 또는 매크로머 (macromer) 이다. 유동가능한 폴리머는 미세유체 유동 영역으로 입력될 수도 있고, 그 안의 유체 매질의 다른 컴포넌트들과 함께 유동할 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "광개시된 폴리머" 는 광에 대한 노출 시에, 공유결합으로 교차연결 (crosslink) 할 수 있거나, 특정 공유 결합들을 형성할 수 있거나, 강성화된 화학적 모티프 주위의 위치화학 (regiochemistry) 을 변경할 수 있거나, 물리적 상태에 있어서의 변경을 야기시킴으로써, 폴리머 네트워크를 형성하는 이온 쌍들을 형성할 수 있는 폴리머 (또는 폴리머를 생성하기 위하여 이용될 수 있는 모노머 분자) 를 지칭한다. 일부 사례들에서, 광개시된 폴리머는 공유결합으로 교차연결할 수 있거나, 특정 공유 결합들을 형성할 수 있거나, 강성화된 화학적 모티프 주위의 위치화학을 변경할 수 있거나, 물리적 상태에 있어서의 변경을 야기시키는 이온 쌍들을 형성할 수 있는 하나 이상의 화학적 모이어티들에 바인딩된 폴리머 세그먼트 (polymer segment) 를 포함할 수도 있다. 일부 사례들에서, 광개시된 폴리머는 (예컨대, 폴리머의 폴리머화를 통해) 폴리머 네트워크의 형성을 개시할 것을 광활성화가능한 라디컬 개시자 (radical initiator) 에게 요구할 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "항체" 는 면역글로불린 (immunoglobulin) (Ig) 을 지칭하고, 양자의 다클론성 (polyclonal) 및 단클론성 (monoclonal) 항체들; 영장류화 (예컨대, 인간화); 쥐과 (murine); 생쥐-인간; 생쥐-영장류; 및 키메라 (chimeric) 를 포함하고; 손상되지 않은 분자, (scFv, Fv, Fd, Fab, Fab', 및 F(ab)'2 단편들과 같은) 그 단편, 또는 손상되지 않은 분자들 및/또는 단편들의 멀티머 (multimer) 들 또는 응집체 (aggregate) 들일 수도 있고; 천연적으로 발생할 수도 있거나, 예컨대, 면역법 (immunization), 합성, 또는 유전 공학 (genetic engineering) 에 의해 생성될 수도 있다. 본원에서 이용된 바와 같은 "항체 단편 (antibody fragment)" 은, 항원을 바인딩하고, 일부 실시형태들에서, 예컨대, 갈락토스 잔기 (galactose residue) 들의 편입에 의해 클리어런스 (clearance) 및 업테이크 (uptake) 를 용이하게 하는 구조적 특징부 (structural feature) 들을 나타내기 위하여 유도체화될 수도 있는, 항체로부터 유도되거나 항체에 관련된 단편들을 지칭한다. 이것은 예컨대, F(ab), F(ab)'2, scFv, 경사슬 가변 영역 (light chain variable region; VL), 중사슬 가변 영역 (heavy chain variable region; VH), 및 그 조합들을 포함한다.
유체 매질을 참조하여 본원에서 이용된 바와 같이, "확산시키다 (diffuse)" 및 "확산 (diffusion)" 은 농도 경도 아래로의 유체 매질의 컴포넌트의 열역학적 이동을 지칭한다.
어구 "매질의 유동 (flow of a medium)" 은 주로 확산 이외의 임의의 메커니즘으로 인한 유체 매질의 대량 이동을 의미한다. 예를 들어, 매질의 유동은 포인트들 사이의 압력 차이로 인한 하나의 포인트로부터 또 다른 포인트로의 유체 매질의 이동을 수반할 수 있다. 이러한 유동은 액체의 연속적인, 펄스화된, 주기적인, 랜덤, 간헐적인, 또는 왕복하는 유동, 또는 그 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 유체 매질이 또 다른 유체 매질로 유동할 때, 매질들의 난류 (turbulence) 및 혼합이 발생할 수 있다.
어구 "실질적으로 유동 없음 (substantially no flow)" 은 시간에 대하여 평균화되면, 유체 매질로의, 또는 유체 매질 내에서의 재료 (예컨대, 관심 있는 피분석물) 의 컴포넌트들의 확산의 레이트보다 더 작은 유체 매질의 유동의 레이트를 지칭한다. 이러한 재료의 컴포넌트들의 확산의 레이트는 예를 들어, 온도, 컴포넌트들의 크기, 및 컴포넌트들과 유체 매질 사이의 상호작용들의 강도에 종속될 수 있다.
미세유체 디바이스 내의 상이한 영역들을 참조하여 본원에서 이용된 바와 같이, 어구 "유체적으로 접속된" 은, 상이한 영역들이 유체 매질들과 같은 유체로 실질적으로 충전될 때, 영역들의 각각에서의 유체는 유체의 단일의 본체를 형성하도록 접속된다는 것을 의미한다. 이것은 상이한 영역들에서의 유체들 (또는 유체 매질들) 이 조성 (composition) 에 있어서 반드시 동일하다는 것을 의미하지는 않는다. 오히려, 미세유체 디바이스의 상이한 유체적으로 접속된 영역들에서의 유체들은, 용질 (solute) 들이 그 개개의 농도 경도들 아래로 이동시키고 및/또는 유체들이 디바이스를 통해 유동할 때에 플럭스 (flux) 내에 있는 상이한 조성물들 (예컨대, 단백질들, 탄수화물들, 이온들, 또는 다른 분자들과 같은 용질들의 상이한 농도들) 을 가질 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "유동 경로" 는 매질의 유동의 궤적을 정의하고 그것에 지배되는 하나 이상의 유체적으로 접속된 회로 엘리먼트들 (예컨대, 채널 (들), 영역 (들), 챔버 (들), 및 등) 을 지칭한다. 유동 경로는 이에 따라, 미세유체 디바이스의 스윕된 영역 (swept region) 의 예이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예컨대, 스윕되지 않은 영역 (unswept region) 들) 은 유동 경로에서의 매질의 유동에 지배되지 않으면서, 유동 경로를 포함하는 회로 엘리먼트들과 유체적으로 접속될 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "미세-객체를 격리시키는 것" 은 미세-객체를 미세유체 디바이스 내의 정의된 에어리어에 한정시킨다.
미세유체 (또는 나노유체) 디바이스는 "스윕된" 영역들 및 "스윕되지 않은" 영역들을 포함할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "스윕된" 영역은 미세유체 회로의 하나 이상의 유체적으로 상호접속된 회로 엘리먼트들로 이루어지고, 엘리먼트들의 각각은 유체가 미세유체 회로를 통해 유동하고 있을 때에 매질의 유동을 경험한다. 스윕된 영역의 회로 엘리먼트들은 예를 들어, 영역들, 채널들, 및 챔버들의 전부 또는 일부들을 포함할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "스윕되지 않은" 영역은 미세유체 회로의 하나 이상의 유체적으로 상호접속된 회로 엘리먼트로 이루어지고, 엘리먼트 각각은 유체가 미세유체 회로를 통해 유동하고 있을 때에 유체의 플럭스를 실질적으로 경험하지 않는다. 유체 접속들이 확산을 가능하게 하지만, 스윕된 영역과 스윕되지 않은 영역 사이의 매질들의 유동이 실질적으로 없도록 구조화된다면, 스윕되지 않은 영역은 스윕된 영역에 유체적으로 접속될 수 있다. 미세유체 디바이스는 이에 따라, 스윕된 영역과 스윕되지 않은 영역 사이의 실질적으로 오직 확산 유체 연통을 가능하게 하면서, 스윕된 영역에서의 매질의 유동으로부터 스윕되지 않은 영역을 실질적으로 격리시키도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스의 유동 채널은 스윕된 영역의 예인 반면, (이하에서 더욱 상세하게 설명된) 미세유체 디바이스의 격리 영역은 스윕되지 않은 영역의 예이다.
특정 생물학적 재료들 (예컨대, 항체 (antibody) 들과 같은 단백질들) 을 생성하기 위한 생물학적 미세-객체들 (예컨대, 생물학적 세포들) 의 능력은 이러한 미세유체 디바이스에서 시험될 수 있다. 시험의 특정 실시형태에서, 관심 있는 피분석물의 생성을 위하여 시험되어야 할 생물학적 미세-객체들 (예컨대, 세포들) 을 포함하는 샘플 재료는 미세유체 디바이스의 스윕된 영역으로 로딩될 수 있다. 생물학적 미세-객체들 (예컨대, 인간 세포들과 같은 포유류 세포들) 중의 객체들은 특정한 특성들을 위하여 선택될 수 있고 스윕되지 않은 영역들에서 배치될 수 있다. 그 다음으로, 나머지 샘플 재료는 스윕된 영역의 외부로 유동될 수 있고, 시험 재료는 스윕된 영역으로 유동될 수 있다. 선택된 생물학적 미세-객체들은 스윕되지 않은 영역들에 있으므로, 선택된 생물학적 미세-객체들은 나머지 샘플 재료의 외부로의 유동 또는 시험 재료의 내부로의 유동에 의해 실질적으로 영향받지 않는다. 선택된 생물학적 미세-객체들은 스윕되지 않은 영역들로부터 스윕된 영역으로 확산할 수 있는 관심 있는 피분석물을 생성하는 것이 허용될 수 있고, 여기서, 관심 있는 피분석물은, 그 각각이 특정한 스윕되지 않은 영역에 상관될 수 있는 국소화된 검출가능한 반응들을 생성하기 위하여 시험 재료와 반응할 수 있다. 검출된 반응과 연관된 임의의 스윕되지 않은 영역은, 존재할 경우, 스윕되지 않은 영역에서의 생물학적 미세-객체들의 어느 것이 관심 있는 피분석물의 충분한 생성자 (producer) 들인지를 결정하기 위하여 분석될 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, "안정화된 생물학적 세포" 는 전형적인 배양 조건들 또는 생체 내 조건과 상이한 조건들 하에 유지되는 생물학적 세포이며, 이러한 조건들 (즉, "유지 조건들") 은 세포의 핵산 또는 전사체를 안정화시켜 핵산 또는 전사체의 개체군이 전형적인 배양 조건들 또는 생체 내 조건들 하에서 핵산의 개체군 또는 세포의 전사체와 실질적으로 동일하게 한다. 유지 조건은 감소된 온도에서의 저장을 포함하여, 안정화된 생물학적 세포의 저장에 도움이 되는 조건들을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 안정화된 생물학적 세포의 안정화된 전사체는 전형적인 배양 조건들 또는 생체 내 조건들 하에서 성장하는 상응하는 세포의 전사체 (즉, 동일한 유형 및/또는 출처) 와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "가역성" 저해제는 생체 분자와 비공유 결합하여 생체 분자 (예를 들어, 단백질, 핵산, 리보자임, 복합체 등) 의 활동을 저해함으로써, 결합하는 동안 생체 분자의 활동을 감소시키거나 제거한다. 가역성 저해제는 저해된 생체 분자에 대한 운동 파라미터들 (예를 들어, 결합 친화도, 결합 속도 또는 "온 레이트" 및 해리 속도 또는 "오프 속도") 의 특징적인 세트를 갖는다. 따라서, 특정 생체 분자의 상이한 가역성 저해제는 상이한 결합 친화도, 결합 속도 및/또는 해리 속도를 가질 수도 있다. 이러한 운동 파라미터들의 차이들은 표적 생체 분자의 상이한 부분들에 대한 결합과 같은, 가역성 저해제들과 표적 생체 분자 사이의 화학적 상호 작용들의 차이를 반영한다.
본원에서 언급된 바와 같이, "비가역성" 저해제는 생체 분자에 공유 결합을 형성함으로써 또는 생체 분자에 대해 높은 결합 친화도를 가짐으로써 저해제가 임의의 적당한 실험 기간 내에 생체 분자로부터 해리되지 않음으로써 생체 분자의 활동을 저해하고, 따라서 본질적으로 비가역성이다.
본원에 언급된 바와 같이, "세포막 투과성" 은 효율적으로 세포 내 활성이기에 충분한 양으로 세포막을 통해 수동적으로 확산하는 분자의 능력을 지칭하며, 이온 성질 (전하), 극성 및 크기 (몰 질량) 의 함수이다. 더 작고 더 지용성 (lipid soluble) 인 분자들은 더 크고 더 하전된 분자들보다 더 투과성일 수도 있다.
본 명세서에 언급된 "마스터 믹스" 는 미리 혼합되어 즉시 사용할 수 있는 시약의 조합이다. 안정화 시약에 대한 마스터 믹스는 시약의 모든 성분들 (예컨대, 단백질 번역 저해제, 핵산 전사 저해제, 및 옵션의 프로테아제 저해제) 를 가질 수도 있다. 마스터 믹스는 안정화 반응에서 실제로 사용되는 농도의 약 1X 에서 약 1000X (예컨대, 2X, 5X, 10X, 20X, 100X 또는 1000X) 의 어디에서의 농도로 존재하는 성분들을 가질 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 마스터 믹스는 완전한 시약에 필요한 일부 (예를 들어, 2, 3 등) 의 성분들을 가질 수도 있으며, 여기서 나머지 성분들은 사용 직전에 첨가될 수도 있다.
핵산 안정화 시약 및 그 이용 방법들. 이는 세포가 수 시간 내지 수 일의 범위의 기간 동안 저장된 후에, 생물학적 세포로부터 핵산의 모집단을 격리하는 것이 바람직할 수도 있다. 저장시, 전형적으로 저온에서, 생물학적 세포의 핵산의 서브세트들은 저장 조건에 대한 세포의 노출 또는 저장을 위해 세포를 준비하는데 사용된 제제들과의 접촉의 결과로서 생산될 시 (예를 들어, 감소된 비율들로) 손상되거나, 또는 과잉 생산될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 배열 또는 교배 실험들을 통한 핵산의 검출은 회수되는 핵산이 저장 이전에 세포에 존재하는 핵산의 모모집단 빈도 또는 유형에서 대표인 경우에만 생물학적 세포의 상태에 대한 유의 정보를 초래할 수도 있다. 저장을 위해 세포들을 준비하기 위해 현재 이용가능한 처리법은 일반적으로, 단백질, 핵산 등의 가교 결합을 포함하지만, 가교 결합 없이 저장하기 위해 세포들을 안정화시킬 수 있는 개선점이며, 이는 "고정된" 세포 (예를 들어, 가교 시약으로 처리됨) 의 가교 결합된 재료들의 질량 내로부터 원하는 핵산의 복구는 손상될 수 있고 재료의 양이 감소될 수 있기 때문이다. 이것은 단일 세포로부터 핵산을 회수하는데 있어 특히 문제가 된다.
생물학적 세포를 저장하기 전에, 생물학적 세포에 존재하는 핵산을 안정화시키기 위한 조성물들, 방법들 및 키트들이 본원에 기술된다. 안정화는 규범적 조건들 하에서 생물학적 세포가 생산한 것과 관련하여, 상이한 핵산 또는 변경된 양의 동일한 핵산을 생산할 수 있는 세포 프로세스들을 정지시키는 것을 포함한다. 온도 변화들 또는 방부제들의 노출은 물리적 변화들 (예컨대, 수성 성분들의 결정화), 화학적 변화들 또는 응력 또는 세포사 경로의 유도와 같은 생물학적 변화들을 유도할 수도 있다. 따라서, 생물학적 세포로부터 회수된 이들 외인성으로 유도된 핵산의 검출은, 저장 전에 세포의 상태에 대한 실제의 이해를 허용하지 않을 수도 있다.
놀랍게도, 세포내 핵산 생성 및/또는 기능을 정지시키도록 설계된 제제의 혼합물을 함유하는 안정화 시약이 그들의 생산의 패턴 및 레벨들을 저장 조건들/안정화 시약에 노출되기 전에 관측된 레벨들과 실질적으로 유사한 레벨들로 유지함으로써 저장 동안 (및 저장 후 격리를 위해) 핵산을 안정화시킬 수 있다는 것이 본 출원인에 의해 발견되었다.
일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 저장 및 후속 DNA 격리를 위해 데 옥시 핵산을 안정화시키는데 사용될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 안정화 시약은 저장 및 후속 격리를 위해 리보 핵산 (RNA) 을 안정화시킬 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 저장 및 후속 격리를 위해 메신저 RNA (mRNA) 을 안정화시킬 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 DNA 및 RNA (예컨대, mRNA) 양자를 안정화시킬 수도 있다.
안정화 시약. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함한다. 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬 저해제일 수도 있거나, 전자 전달 디커플링제일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 제 1 비가역성 단백질 번역 저해제와 상이한 제 2 단백질 번역 저해제를 포함할 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 가역성 저해제일 수도 있고 및/또는 비가역성 단백질 번역 저해제와 비교하여 신속하게 작용할 수도 있다.
비가역성 단백질 번역 저해제. 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 안정화 시약의 성분일 수도 있다. 비가역성 단백질 번역 저해제는 새로운 단백질의 합성을 실질적으로 방지할 수도 있다. 비가역성은 시약 도입 시점과 임의의 다른 저장 조건들 또는 시약들로의 노출 전에 단백질 합성을 중지시키는 것이 바람직하며, 그 노출에 대한 반응으로 단백질 합성의 변화들을 개시할 수도 있다. 비가역성 저해제는 빠르게 작용하거나 (예를 들면, 약 10 분 내지 약 30 분의 기간 내에 효력을 나타냄) 또는 천천히 작용할 (1 이상의 시간 내에 효력을 나타냄) 수도 있다. 비가역성 단백질 번역 저해제는 세포 내로보다 용이하게 확산하고 단백질 번역을 저해하기에 충분한 양으로 세포에 들어가기 위해, 예를 들어, 지질 상의 용해도를 갖는 세포막 투과성일 수도 있다. 비가역성 단백질 번역 저해제는 아미노글리코시드 항생제 (아미카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신 및 토브라마이신을 포함하나 이에 한정되지는 않음), D-갈락토사민 및/또는 에메틴으로부터 선택될 수도 있다 (CAS No. 483-18-1). 일부 실시형태들에서, 비가역성 단백질 번역 저해제는 에메틴일 수도 있다. 비가역성 단백질 번역 저해제는 리보솜에 결합하여 리보솜의 스톨링 (stalling) 을 야기함으로써 단백질 합성을 중지함으로써 단백질 번역을 저해할 수도 있다. 하나의 비-한정적인 예에서, 에메틴은 리보솜 스톨링을 개시하기 위해 진핵생물 (포유류 또는 인간을 포함하나 이에 한정되지는 않음) 리보솜의 40S 서브유닛에 비가역적으로 결합한다. 비가역성 단백질 번역 저해제는, 비가역성 단백질 번역 저해제가 약 1.0 마이크로몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 5 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 15 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 10 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 5 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재하는, 용액의 첨가에 의해 생물학적 세포와 접촉할 수도 있다.
제 2 단백질 번역 저해제. 제 2 단백질 번역 저해제는 안정화 시약의 성분일 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 안정화 시약의 제 1 단백질 번역 저해제와 상이하다. 제 2 단백질 번역 저해제는 비가역성 또는 가역성 단백질 번역 저해제일 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 세포막 투과성일 수도 있으며, 예를 들어 세포막을 통과하여 단백질 번역을 저해하기에 충분한 양으로 세포에 들어갈 수 있을 만큼 충분히 지용성이다. 제 2 단백질 번역 저해제는 새로운 단백질 합성을 중지시키기 위해 동일한 메커니즘을 통해 또는 안정화 시약의 비가역성 단백질 번역 저해제와 상이한 메커니즘에 의해 작용할 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 신속하게 작용할 수도 있다. 신속한 작용에 의해, 본 출원은 저해제가 생물학적 세포에 첨가되고 30 분 이내에 단백질 합성을 실질적으로 정지시킨다 (단백질 합성의 적어도 90% 종료를 의미하는 단백질 합성을 실질적으로 정지시킨다) 는 것을 의미한다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 고속 작용 단백질 번역 저해제는 약 1 분, 2 분, 3 분, 5 분 또는 약 10 분 내지 약 30 분의 기간 내에 단백질 합성을 실질적으로 정지시킬 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는 디아조옥사이드, 글루타르이미드 항생제, 및/또는 이페칵 알칼로이드로부터 선택될 수도 있다. 글루타르이미드 항생제들은 시클로헥시미드, 아세톡시시클로헥시미드, 스트렙티미돈, 스트렙토비타신, 인악톤, 에피더스타틴, 아세티케탈 및 도리고신을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시형태들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는 시클로헥시미드일 수도 있다 (CAS No. 66-81-9). 시클로헥시미드는 가역성 저해제가며, 60S 리보솜 단위에 결합하고 수용체 (아미노아실) 로부터 펩티딜-RNA 가 리보솜 상의 공여체 (펩티딜) 부위로 이동하는 것을 차단함으로써 번역 신장을 저해할 수 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는, 제 2 단백질 번역 저해제가 약 1.0 마이크로몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 5 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 15 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 10 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 5 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재하는, 용액의 첨가에 의해 생물학적 세포와 접촉할 수도 있다.
리보 핵산 전사 저해제. 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 안정화 시약의 성분일 수도 있다. 리보 핵산 전사 저해제는 비가역성 또는 가역성 리보 핵산 전사 저해제일 수도 있다. 가역성 리보 핵산 전사 저해제는 CDK9 저해제들 (예컨대 5,6-디클로로-1-베타-D-리보푸라노실벤즈 이미다졸 (DRB)) 및 플라바피리돌 (flavorpiridol) 을 포함 할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 비가역성 리보 핵산 전사 저해제는 오레트리신, 티올루틴, 아미니틴, 또는 트립토라이드를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 다른 실시형태들에서, 비가역성 리보 핵산 전사 저해제는 액티노마이신 (Actinomycin) 일 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 리보 핵산 전사 저해제는 트립토리드일 수도 있다 (CAS no. 38748-32-2). 리보 핵산 전사 저해제는 세포막 투과성일 수도 있으며, 리보 핵산 전사를 저해하기에 충분한 양으로 세포에 침투할 수도 있다. 리보 핵산 전사 저해제는 빠르게 작용하거나 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 5, 10 분 내지 약 30 분의 기간 내에 효력을 나타냄) 또는 천천히 작용할 (1 시간 이상 내에 효력을 나타냄) 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리보 핵산 전사 저해제는 신속하게 작용할 수도 있다. 리보 핵산 전사 저해제는, 리보 핵산 전사 저해제가 약 10 나노몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.01 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 500 마이크로몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 50 마이크로몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재하는, 용액의 첨가에 의해 생물학적 세포와 접촉할 수도 있다.
전자 전달 사슬 제제. 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 안정화 시약의 성분일 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 세포막 투과성일 수도 있으며, 전자 전달 사슬을 파괴하기에 충분한 양으로 세포에 침투할 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 빠르게 작용하거나 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 5, 10 분 내지 약 30 분의 기간 내에 효력을 나타냄) 또는 천천히 작용할 (1 시간 이상 내에 효력을 나타냄) 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 전자 전달 사슬 제제는 신속하게 작용할 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬에 있어서 가역성 또는 비가역성 활동을 가질 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 로테논, 안티마이신 A1, 2-테노일트리플루오로아세톤, 카복시린, 시안화물, 아지드화 나트륨, 및 올리고마이신을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전자 전달 사슬 저해제일 수도 있다. 대안적으로, 전자 전달 사슬 제제는 2,4-디니트로페놀, 디쿠마롤 및 카르보닐시아나이드-4-(트리플루오로메톡시)-페닐히드라존을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있다. 전자 전달 디커플링제들은 그들의 일반적인 지용성 특징으로 인해, 전자 전달 사슬 제제로서 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 전자 전달 사슬 제제는 아지드화 나트륨일 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는, 전자 전달 사슬 제제가 약 0.1 마이크로몰 내지 약 100 밀리몰; 약 10 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.3 밀리몰 내지 약 25 밀리몰; 약 0.3 밀리몰 내지 약 15 밀리몰; 약 0.5 밀리몰 내지 약 10 밀리몰; 약 1 밀리몰 내지 약 5 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재하는, 용액의 첨가에 의해 생물학적 세포와 접촉할 수도 있다.
안정화 시약은 단일 용액 내에서 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 제공할 수도 있거나, 또는 단일 용액 내에 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 모두 미만을 가질 수도 있다. 안정화 시약의 개별 성분들은 각각 별도의 용액으로서 제공될 수도 있다. 안정화 시약의 개별 성분들은 순차적으로 또는 동시에 생물학적 세포에 접촉할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약의 성분들은 생물학적 세포와 동시에 접촉하고, 예를 들어 동일한 용액에 존재하여, 동시에 첨가된다. 다른 실시형태들에서, 성분들은 리보 핵산 전사 저해제를 먼저, 그 후에 안정화 시약의 다른 성분을 순차적으로 첨가시킴으로써 순차적으로 첨가될 수도 있다.
안정화 시약의 다른 성분들. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 RNase 저해제를 포함하지 않을 수도 있다. 단백질 번역 저해제(들), 리보 핵산 전사 저해제 및 전자 전달 사슬 제제의 조합은 RNase 저해제의 첨가 없이, 세포 내 프로세스들을 충분히 정지시킴으로써 핵산을 안정화시킬 수도 있다.
RNase 저해제들. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 하나 이상의 RNase 저해제를 포함하지 않을 수도 있다. 임의의 적합한 RNase 저해제가 포함될 수 있으며, 이는 리보뉴클레아제 저해제 단백질 (예를 들어, 49kDA, 류신 및 시스테인 풍부 단백질; 오로소로그; 또는 그 호모로그) 또는 다음의 상업적으로 입수가능한 임의의 시약들의 활성 성분(들) 또는 제제(들) 을 포함하지만 그에 제한되지 않을 수도 있다: RNasin® 리보핵산가수분해효소 저해제 (Promega); RNasin® 및 리보핵산가수분해효소 저해제 (Promega); SUPERase·In™ RNase 저해제 (ThermoFisher Scientific); RNaseOUT™ 재조합형 리보핵산가수분해효소 저해제 (ThermoFisher Scientific); ANTI-RNase (ThermoFisher Scientific); RNAsecure™ 제제 (ThermoFisher Scientific).
프로테아제 저해제. 다양한 실시형태들에서, 생물학적 세포에서 핵산을 안정화시키기 위한 안정화 시약은 프로테아제 저해제를 추가로 포함할 수도 있다. 프로테아제 저해제는 세린, 시스테인, 아스파르트산 또는 메탈로프로테아제 저해제일 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 프로테아제 저해제는 트레오닌 또는 글루탐산 프로테아제 저해제일 수도 있다.
세린 프로테아제 저해제. 세린 프로테아제 저해제는 가역성 또는 비가역성 저해제일 수도 있다. 세린 프로테아제 저해제는 세포막 투과성일 수도 있다 (예를 들어, 세포막을 통해 확산하여 세린 프로테아제를 저해하기에 충분한 양으로 세포에 들어갈 수도 있다). 세린 프로테아제 저해제들은 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 3,4-디클로로이소쿠마린, 디이소 프로필플루오로 포스페이트, N-p-토실-L-리신 클로로메틸케톤 (TLCK), 및 N-p-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸케톤 (TPCK) 을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
시스테인 프로테아제 저해제. 시스테인 프로테아제 저해제는 가역성 또는 비가역성 저해제일 수도 있으며, 추가로 세포막 투과성일 수도 있다 (예를 들어, 세포막을 통해 확산하여 시스테인 프로테아제를 저해하기에 충분한 양으로 세포에 들어갈 수도 있다). 시스테인 프로테아제 저해제는 카스파제 프로테아제의 저해제 또는 카텝신 시스테인 프로테아제의 저해제일 수도 있다. 시스테인 프로테아제 저해제는 E-64 (N-(트랜스-에폭시숙시닐)-L-류신-4-구아니디노부틸아미드, Selleck Chem), N-벤조일 페닐알라닌 플루오로메틸 케톤 (Z-FA-FMK ), 및 N-벤조일 발레닐 알라닐 아스파르트산 플루오로메틸 케톤 (Z-VAD-FMK) 중 임의의 것일 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다.
메탈로프로테아제 저해제. 메탈로프로테아제 저해제는 가역성 또는 비가역성 저해제일 수도 있다. 메탈로프로테아제 저해제는 세포막 투과성일 수도 있다 (예를 들어, 세포막을 통해 확산하여 메탈로프로테아제를 저해하기에 충분한 양으로 세포에 들어갈 수도 있다). 적합한 메탈로프로테아제 저해제들의 예들은 포스포르아미돈, 베스타틴, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 마림스타트, 바티마스타트, 아연 메타크릴레이트 및 MMP 저해제 III (CAS No. 927827-98-3, N'-히드록시-N-(1-메틸카르바모일)-3-페닐-프로필)-2-(2-메틸프로필)부탄디아미드) 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
안정화 시약용 완충액 및 매질. 안정화 시약은 안정화 시약의 성분을 용해시키기 위해 수성 및/또는 비-수성 용매를 포함할 수도 있다. 이들 용매들은 저해제들 및 에너지 전달 사슬 제제의 조합들의 장기 저장을 허용하도록 선택될 수도 있다. 유용한 용매들은 디메틸설폭시드 (DMSO), 글리세롤, 물, 에틸 알코올 등을 포함할 수도 있다. 비-수성 용매가 사용되는 경우, 완충제들은 필요하지 않을 수도 있다. 수용액들의 완충은 안정화 시약의 성분들의 저하를 방지하고 안정화 반응 자체에 적합한 pH 범위를 제공하는 양자를 위해 구성될 것이다. -20℃ 와 같은 감소된 온도에서의 저장이 바람직한 경우, 글리세롤 또는 DMSO 와 같지만 이에 제한되지 않는 부동액 또는 첨가제가 안정화 시약에 포함될 수도 있다.
핵산을 안정화시키는 방법. 조직 샘플, 미세 바늘 흡인 샘플, 세척 샘플 등과 같은 생물학적 샘플로부터 세포를 격리할 때, 편의상 또는 다른 이유로, 추가의 분석을 위해 핵산을 추출하는 단계를 수행하기 전에, 세포를 샘플로부터 부분적으로 처리한 다음, 세포를 저장하는 것이 바람직할 수도 있다. 저장 전에 (및 저장 중에) 생물학적 세포 내에서 핵산을 안정화시키는 방법이 제공된다. 저장 후에, 생물학적 세포의 핵산 또는 그 모집단은 세포로부터 격리될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 저장 후 격리를 위해 안정화될 핵산은 데옥시 핵산 (DNA) 일 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 저장 후 격리를 위해 안정화될 핵산은 리보 핵산 (RNA) 일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 저장 후 격리를 위해 안정화될 RNA 는 메신저 RNA (mRNA) 일 수도 있다. mRNA 는 안정화된 세포의 안정화된 핵산으로부터 격리되어 생물학적 세포의 전사체를 분석할 수도 있다. 생물학적 세포의 전사체의 분석은 생물학적 세포에 의해 차동적으로 발현되는 유전자를 확인하는데 사용될 수도 있다. 차등 발현은 비교가능한 "건강한" 세포의 발현 레벨 또는 다른 세포 유형의 발현 레벨과 비교할 수도 있다. 생물학적 세포의 전사체는 바람직하게는 안정화 및 저장 프로세스 중에 실질적으로 파괴되지 않아 생물학적 세포 내의 RNA 작용제의 양 및 정체성들을 검사할 수도 있다.
따라서, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 방법이 설명되며, 생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 접촉하는 단계는 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하는데 충분한 기간 동안 수행된다. 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 핵산 안정화 시약으로서 제공되며, 생물학적 세포의 핵산의 생산 및 분해를 위해 세포 내 기계장치의 상이한 부분들을 타겟으로 하는 1 초과의 저해 또는 디커플링 제제를 포함한다. 안정화된 생물학적 세포의 핵산은 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 안정화 시약으로의 처리시 안정화된다. 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬 저해제일 수도 있고, 및/또는 전자 전달 디커플링제일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 제 1 비가역성 단백질 번역 저해제와 상이한 제 2 단백질 번역 저해제를 더 포함할 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 가역성 저해제일 수도 있다. 비가역성 단백질 번역 저해제, 리보 핵산 전사 저해제, 전자 전달 사슬 제제, 및 옵션으로 제 2 단백질 번역 저해제는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 적합한 저해제 또는 전자 전달 사슬 제제일 수도 있으며, 임의의 조합으로 독립적으로 선택될 수도 있다. 안정화 시약은 독립적으로 및 임의의 조합으로 선택된, 본원에 설명된 임의의 추가 성분들 (예컨대, 프로테아제 저해제, RNase 저해제, 완충액 등) 을 함유할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 RNase 저해제를 포함하지 않을 수도 있다.
생물학적 세포는 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 안정화 시약으로 접촉된다. 생물학적 세포를 함유하는 컨테이너 (예컨대, 튜브, 우물, 챔버, 배양 챔버) 에 안정화 시약 (예컨대, 마스터 믹스) 의 성분들의 일부 또는 전부의 미리 만들어진 용액을 첨가하여 접촉이 실행될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 생물학적 세포와의 접촉은 안정화 반응의 개시 시에, 각각이 모든 성분보다 적은 (예를 들어, 일부 성분들이 개별적으로 피펫팅되도록 상이한 용액에 존재함) 각각의 성분을 갖는 복수의 용액을 첨가함으로써 수행될 수도 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 생물학적 세포를 안정화 시약의 각 성분과 접촉하는 것이 동시에 수행 될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 생물학적 세포와의 접촉은 안정화 시약의 성분들의 부분 집합과 순차적으로 수행될 수도 있다. 미리 제조된 용액들의 성분들의 농도는 안정화 반응 자체에 필요한 최종 농도의 약 1X, 2X, 5X, 10X, 20X, 50X, 100X 또는 약 1000X 일 수도 있다.
본원에 설명된 임의의 방법들에서, 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는, 약 1.0 마이크로몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 5 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 15 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 10 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 5 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재할 수도 있다.
본원에 설명된 임의의 방법에서, 리보 핵산 전사 저해제는 약 10 나노몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.01 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 500 마이크로몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 50 마이크로몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 범위의 농도로 존재할 수도 있다.
본원에 설명된 임의의 방법에서, 전자 전달 사슬 제제는 약 0.1 마이크로몰 내지 약 100 밀리몰; 약 10 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.3 밀리몰 내지 약 25 밀리몰; 약 0.3 밀리몰 내지 약 15 밀리몰; 약 0.5 밀리몰 내지 약 10 밀리몰; 약 1 밀리몰 내지 약 5 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 범위의 농도로 존재할 수도 있다.
본원에 설명된 임의의 방법들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는, 약 1.0 마이크로몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 5 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 15 밀리몰; 약 5 마이크로몰 내지 약 10 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 5 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재할 수도 있다.
생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 안정화 시약으로 접촉하는 단계는 약 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 그 이상의 주기 동안 수행될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 접촉 주기는 약 5 분 내지 약 1 시간, 약 5 분 내지 약 45 분, 약 5 분 내지 약 30 분, 또는 약 5 분 내지 약 15 분 범위일 수도 있다. 접촉하는 단계는 약 38 ℃, 37 ℃, 35 ℃, 30 ℃, 25 ℃, 20 ℃, 15 ℃, 10 ℃, 5 ℃ 또는 약 0 ℃에서 수행될 수도 있다.
생물학적 세포를 안정화 시약과 접촉시킨 후, 핵산의 모집단은 이제 안정화되고, 생물학적 세포는 안정화 된 생물학적 세포로 전환되며, 예를 들어 전사 및 번역의 세포 내 프로세스가 중단될 수도 있다. 그 후에, 세포는 임의의 원하는 기간 동안, 예컨대 수 시간 내지 수일 또는 그 이상 동안 저장될 수도 있다. 안정화된 세포는 약 2 시간, 5 시간, 8 시간, 14 시간, 20 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 수 개월 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 저장될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화된 세포는 약 2 시간 이상 및 약 1 주 미만; 약 8 시간 이상 약 2 주 미만; 약 8 시간 이상 및 약 1 주 미만; 또는 약 14 시간 이상 및 약 5 일 미만 동안 저장될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화된 세포는 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 6 시간 내지 약 18 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 약 18 시간 내지 약 30 시간, 약 24 시간 내지 약 36 시간, 약 30 시간 내지 약 42 시간, 약 36 시간 내지 약 48 시간, 약 42 시간 내지 약 54 시간, 약 48 내지 약 60 시간, 또는 이들 범위 중 임의의 시간 길이 동안 저장될 수도 있다. 안정화된 세포를 일반적인 실내 온도보다 낮은 온도, 예를 들어 20 ℃ 에서 저장하는 것이 바람직할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 세포는 약 0 ℃ 내지 약 10 ℃ (예를 들어, 약 0 ℃ 내지 약 5 ℃ 또는 약 2 ℃ 내지 약 5 ℃) 범위의 온도로 저장될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 세포는 약 -30 ℃ 내지 약 -25 ℃, 약 -30 ℃ 내지 약 0 ℃, 약 -25 ℃ 내지 약 0 ℃, 약 -25 ℃ 내지 약 4 ℃, 또는 이들 범위의 임의의 선택된 온도에서 저장될 수도 있다.
핵산을 안정화시키는 방법은 안정화된 생물학적 세포를 용해 시약과 접촉함으로써 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계를 더 포함할 수도 있다. 용해 시약은 DNA 모집단 또는 RNA 모집단을 격리하도록 구성될 수도 있다. DNA 를 격리하기 위한 용해 시약은 모든 DNA 를 격리하고, 게놈 DNA (gDNA) 또는 미토콘드리아 DNA (mDNA) 를 선택적으로 격리하도록 추가로 구성될 수도 있다. RNA 를 격리하기 위한 용해 시약은 모든 RNA, 또는 바람직하게는 메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA) 또는 트랜스퍼 RNA (tRNA) 일 수도 있는 단 하나의 유형의 RNA 를 격리하도록 구성될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화된 생물학적 세포를 용해 시약으로 처리하기 전에, 생물학적 세포를 둘러싼 매질에서 초과의 안정화 시약 및 다른 가용성 재료들을 제거하기 위해 안정화된 생물학적 세포는 매질 또는 수성 세척액으로 세척될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계는 용해된 생물학적 세포로부터 원하는 핵산을 회수하기 위해 용해된 생물학적 세포를 제조하기 위한 추가 조작들을 추가로 포함할 수도 있다.
핵산을 안정화시키는 방법은 용해된 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단의 적어도 일부를 격리하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 격리는 침전, 용매 추출, 올리고 뉴클레오타이드 포획 리간드를 갖는 매트릭스 또는 비드상의 특정 포획, 또는 전하 포획 매트릭스 상의 친화도 포획에 의해 수행될 수도 있다.
그 방법은 용해된 안정화된 생물학적 세포로부터 격리된 핵산의 모집단의 적어도 일부를 분석하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 격리된 핵산의 모집단의 모든 부류들이 분석되거나 또는 오직 선택된 부류의 핵산 만이 분석될 수도 있다. 임의의 gDNA, mDNA, mRNA, rRNA 및/또는 tRNA 가 분석될 수도 있다. 분석은 서열 분석 (예컨대, 합성, 단일 분자, 이온 반도체, 파이로서열 분석, 나노포어 서열 분석 등에 의한 서열 분석을 포함할 수도 있는 전기 영동의, 차세대 서열 분석), 하이브리드화 실험들 (인-시츄 하이브리드화, FISH, qPCR, dPCR, TaqMan® (ThermoFisher Scientific), 분자 표지 및 기타 형광 프로브 분석들을 포함하지만 이에 재한되지 않음), 풋 프린트, 어레이 상의 포획 및 겔 전기영동을 포함할 수도 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 트랜스크립톰 분석을 수행하기 위해 서열 분석에 의해 mRNA 를 분석한다. 트랜스크립톰 분석은 생물학적 세포의 전체적 유전자 발현 변화들을 검사하는데 유용할 수 있는데, 이는 병리학적 세포 상태를 확인하고 및/또는 병리학을 다루는 옵션을 탐색하는 데 유용할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 이들 방법들은 미세유체 환경 내에서 생물학적 세포를 조작하는 것을 포함할 수도 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 미세유체 디바이스는 본원에서 설명된 임의의 미세유체 디바이스들 (예를 들어, 이하 설명되는 것과 같은 DEP 구성 및/또는 전기습윤 구성을 포함할 수도 있는 디바이스들 (100, 200, 240, 290)) 과 같이 구성될 수도 있으며, 이는 광학적으로 작동될 수도 있다. 미세유체 디바이스는 인클로저를 가질 수도 있으며, 여기서 인클로저는 유체 매질을 수용하도록 구성된 유동 영역; 및 상기 유체 매질을 수용하도록 구성된 적어도 하나의 챔버를 포함하며, 상기 챔버는 상기 유동 영역에 유체 연결된다. 생물학적 세포는 미세유체 디바이스 내에 배치될 수도 있고, 또한 인클로저 내의 적어도 하나의 챔버 내에 배치될 수도 있다. 생물학적 세포는 전기영동력 (DEP) 을 사용하여 미세유체 디바이스 내로 도입될 수도 있다. 또한, 생물학적 세포가 미세유체 디바이스의 인클로저 내의 적어도 하나의 챔버로 도입될 때, 챔버 내에 배치하는 단계는 DEP 힘을 사용하여 수행될 수도 있다. 세포는 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉될 수도 있고, 여기서 접촉하는 것은 핵산의 모집단을 안정화시키는데 충분한 기간 동안 수행된다. 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 안정화 시약은 생물학적 세포를 접촉하는 단계에서 사용될 수도 있고, 본원에 기재된 안정화 시약의 임의의 실시형태일 수도 있다. 상기 방법은 미세유체 디바이스 외부의 생물학적 세포를 안정화시키는 방법에 대해 상기 기술된 단계들 중 임의의 단계를 더 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 인클로저 내의 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역 (예를 들어, 미세유체 채널) 에 유체 연결하는 연결 영역을 갖는 시퀘스트레이션 펜일 수도 있으며, 격리 및 연결 영역들은 매질의 성분들이 실질적으로 오직 확산에 의해서만 시퀘스트레이션 펜의 유동 영역과 격리 영역 사이에서 교환되도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 세포는 미세유체 디바이스의 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역 내에 배치될 수도 있다. 안정화 시약은 미세유체 디바이스의 유동 영역 (채널일 수도 있음) 에 유입될 수도 있으며, 이후 챔버 내로 확산함으로써 (또는, 챔버가 시퀘스트레이션 펜일 경우, 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역 내로 확산함으로써) 생물학적 세포를 접촉시킬 수도 있다.
생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 안정화 시약으로 접촉하는 단계는 약 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 그 이상의 주기 동안 수행될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 접촉 주기는 약 5 분 내지 약 1 시간, 약 5 분 내지 약 45 분, 약 5 분 내지 약 30 분, 또는 약 5 분 내지 약 15 분 범위일 수도 있다. 접촉하는 단계는 약 38 ℃, 37 ℃, 35 ℃, 30 ℃, 25 ℃, 20 ℃, 15 ℃, 10 ℃, 5 ℃ 또는 약 0 ℃에서 수행될 수도 있다.
방법들은 일정 기간 동안 안정화된 생물학적 세포를 저장할 수도 있다. 세포는 미세유체 디바이스 내에 저장될 수도 있는데, 예를 들어, 저장 중에 안정화된 세포가 챔버 (또는 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역) 로부터 이동되지 않는다. 따라서, 전체 미세유체 디바이스가 저장될 수도 있다. 세포는 약 2 시간, 5 시간, 8 시간, 14 시간, 20 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 수 개월 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 저장될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화된 세포는 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 6 시간 내지 약 18 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 약 18 시간 내지 약 30 시간, 약 24 시간 내지 약 36 시간, 약 30 시간 내지 약 42 시간, 약 36 시간 내지 약 48 시간, 약 42 시간 내지 약 54 시간, 약 48 내지 약 60 시간, 또는 이들 범위 중 임의의 시간 길이 동안 저장될 수도 있다. 안정화된 세포를 일반적인 실내 온도보다 낮은 온도, 예를 들어 20 ℃ 에서 미세유체 디바이스에 온보드로 저장하는 것이 바람직할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 세포는 약 0 ℃ 내지 약 4 ℃ 의 범위의 온도에서 미세유체 디바이스 내에서 저장될 수도 있다. 0 ℃ 내지 약 10 ℃ (예를 들어, 약 0 ℃ 내지 약 5 ℃ 또는 약 2 ℃ 내지 약 5 ℃). 다른 실시형태들에서, 세포는 약 -30 ℃ 내지 약 -25 ℃, 약 -30 ℃ 내지 약 0 ℃, 약 -25 ℃ 내지 약 0 ℃, 약 -25 ℃ 내지 약 4 ℃, 또는 이들 범위의 임의의 선택된 온도에서 저장될 수도 있다.
미세유체 디바이스 내의 생물학적 세포에서 핵산을 안정화시키는 방법은 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계를 더 포함할 수도 있다. 예를 들어, 안정화된 생물학적 세포는 생물학적 세포를 용해 시약과 접촉함으로써 용해될 수도 있다. 안정화된 생물학적 세포는 미세유체 디바이스 내부 또는 미세유체 디바이스 외부에서 (예컨대, 미세유체 디바이스로부터 안정화된 생물학적 세포를 배출한 후에) 용해 시약과 접촉될 수도 있다. DNA 를 격리하기 위한 용해 시약은 모든 DNA 를 격리하고, 게놈 DNA (gDNA) 또는 미토콘드리아 DNA (mDNA) 를 선택적으로 격리하도록 추가로 구성될 수도 있다. RNA 를 격리하기 위한 용해 시약은 모든 RNA, 또는 바람직하게는 메신저 RNA (mRNA), 리보솜 RNA (rRNA) 또는 트랜스퍼 RNA (tRNA) 일 수도 있는 단 하나의 유형의 RNA 를 격리하도록 구성될 수도 있다. 용해 시약과 안정화된 생물학적 세포의 접촉은 미세유체 디바이스 (채널일 수도 있음) 의 유동 영역 내로 용해 시약을 유동시키는 것을 포함할 수도 있다. 따라서, 용해 시약은 유동 영역으로부터 챔버 내로 확산함으로써 (또는, 챔버가 시퀘스트레이션 펜인 경우, 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역 내로 확산함으로써) 생물학적 세포와 접촉할 수도 있다. 안정화된 생물학적 세포를 세척하여, 용해 시약에서 미세유체 디바이스의 유동 영역으로 유동하기 전에 챔버 내의 안정화된 세포 (또는 시퀘트레이션 펜의 격리 영역) 를 둘러싸는 매질의 다른 성분들 또는 초과의 안정화 시약들을 제거할 수도 있다. 세척은 미세유체 디바이스의 유동 영역 (채널) 내로 및/또는 그를 통해 세척 용액 또는 완충액을 유동시킴으로써 수행될 수도 있으며, 이 때 초과의 안정화 시약 및/또는 세포를 둘러싸는 매질의 다른 성분들은 유동 영역 (채널) 에서 매질 내로 확산함하고 따라서 안정화된 세포을 둘러싸는 환경으로부터 제거함으로써 교환할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계는 용해된 생물학적 세포로부터 원하는 안정화된 핵산의 모집단을 회수하기 위해 용해된 생물학적 세포를 제조하기 위한 추가 조작들을 추가로 포함할 수도 있다. 대안적으로, 안정화된 생물학적 세포는 미세유체 디바이스로부터 세척 용액 또는 완충액 내로 배출될 수도 있다. 안정화된 생물학적 세포의 배출은 전기영동력을 사용하여 수행될 수도 있다. 전기영동력은 광학적으로 작동될 수도 있다.
미세유체 디바이스 내에서 생물학적 세포 내의 핵산을 안정화시키는 방법은, 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단의 적어도 일부를 격리하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 안정화된 핵산의 격리는 안정화된 핵산의 방출된 모집단을 포획 매트릭스 (비드 상의 포획 올리고뉴클레오타이드 또는 미세유체 디바이스의 표면 상에 프린트된 프라이머들일 수도 있는 비드 또는 포획 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 로 포획함으로써 달성될 수도 있다. 안정화된 생물학적 세포가 미세유체 디바이스 내에서 용해되는 실시형태들에서, 방출된 안정화된 핵산은 미세유체 디바이스 내에 포획될 수도 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스가 DEP 구성을 포함하는 실시형태들에서, 포획 매트릭스 (예를 들어, 비드들) 는 세포가 용해될 때 안정화된 생물학적 세포와 동일한 챔버/시퀘스트레이션 펜 내에 위치될 수 있거나, 또는 대안적으로 포획 매트릭스는 안정화된 생물학적 세포가 용해된 후에 챔버/시퀘스트레이션 펜으로 이동될 수 있다. 포획 매트릭스는 일부 실시형태들에서 광학적으로 작동될 수도 있는 전기영동력에 의해 안정화/용해 된 생물학적 세포와 함께 챔버/시퀘스트레이션 펜으로 배치될 수도 있다. 미세유체 디바이스가 전기 습윤 구성 (예컨대, 광학 전기 습윤 구성) 을 포함하는 실시형태들에서, 용해된 세포의 핵산의 격리는, 포획 매트릭스를 핵산을 함축하는 수성 매질의 액적 내로 도입함으로써 (예를 들어, 포획 매트릭스를 함유하는 액적과 방출된 핵산을 포함하는 액적을 병합함으로써); 방출된 핵산을 포함하는 수성 매질의 액적을 포획 매트릭스가 위치하는 미세유체 디바이스 상의 다른 영역으로 이동시킴으로써 또는 추가의 프로세싱를 위해 미세유체 디바이스 외부로 액적을 배출시킴으로써 수행될 수도 있다. 방출된 핵산들을 포함하는 수성 매질의 액적이 포획될 미세유체 디바이스 상의 다른 영역으로 이동될 때, 방출된 핵산은 포획 비드들과 같은 포획 매트릭스들에 의해 포획될 수도 있거나 또는 방출된 핵산이 미세유체 디바이스의 표면에 고정화 (예를 들어, 프린트) 될 수도 있는 프라이머일 수도 있는 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수도 있다. 프린트된 프라이머들은 용해가 수행된 영역 내에 또는 미세유체 디바이스의 다른 영역에 위치될 수도 있다. 대안적으로, 핵산은 방출된 핵산을 포획하는 비드들을 포함하는 수성 매질의 액적을 미세유체 디바이스의 다른 영역으로 이동시키거나 또는 방출된 핵산을 포획하는 비드들을 함유하는 액적을 미세유체 디바이스 외부로 배출하는 것에 의해 격리될 수도 있다.
방법은 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 안정화된 핵산의 모집단의 적어도 일부로부터 핵산의 적어도 하나의 부류를 분석하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 분석은 기술된 바와 같이 핵산이 결합된 핵산 또는 포획 매트릭스를 배출함으로써 오프 칩 (off-chip) 으로 수행될 수도 있거나, 미세유체 디바이스의 다른 영역에서 온 칩 (on-chip) 으로 수행될 수도 있다. 온 칩 분석은 하이브리드화 분석법 또는 다른 형광 검출 방법 (예컨대, 인-시츄 하이브리드화, FISH, qPCR, dPCR, TaqMan, 분자 비콘 등) 을 포함할 수도 있다.
미세유체 디바이스 외부에서 수행되는 분석은 서열 분석, 하이브리드화 실험들 (인-시츄 하이브리드화, FISH, qPCR, dPCR, TaqMan® (ThermoFisher Scientific), 분자 표지 및 기타 형광 프로브 분석들을 포함하지만 이에 재한되지 않음), 풋 프린트, 어레이 상의 포획 및 겔 전기영동을 포함하지만, 이에 제한되지 않을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랜스크립톰 분석을 수행하기 위해 서열 분석에 의해 mRNA 를 분석한다.
세포들. 생물학적 세포는 임의의 종류의 생물학적 세포, 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 세포는 포유류일 수도 있다. 포유류 생물학적 세포는 인간, 영장류, 돼지, 쥐과, 쥐, 개 등일 수도 있다. 생물학적 세포는 증식성, 감염성, 자가 면역성 및/또는 내분비성 장애를 포함하는 세포 장애를 갖는 개체로부터 유도될 수도 있다. 생물학적 세포는 정상 개체 또는 유전적으로 조작된 개체에서 유도될 수도 있다. 생물학적 세포는 하이브리도마, 배양된 세포 샘플, 또는 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포주와 같은 세포주로부터 유도될 수도 있다. 대안적으로, 생물학적 세포는 개체, 특히 인간 피검자의 혈액, 소변, 눈물, 땀 또는 대변으로부터 유도될 수도 있다. 또 다른 실시형태들에서, 생물학적 세포는 절제된 종양 샘플 및 생검 샘플, 미세 바늘 흡인 및 포르말린-고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 샘플을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 개체로부터 절제된 조직 샘플로부터 유도될 수도 있다 . 생물학적 세포는 면역 세포 (예컨대, 백혈구, T 세포, B 세포, 대식세포, 자연사 세포, 수지상 세포 등), 유방 세포, 췌장 세포, 전립선 세포, 폐 세포 또는 흑색종, 유방 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 순환 종양 세포와 같은 종양 세포일 수도 있다.
조성물. 일부 실시형태들에서, 조성물이 제공된다. 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 세포 및 안정화 시약을 포함할 수도 있다. 안정화 시약은 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약은 제 2 단백질 번역 저해제를 더 포함할 수도 있다. 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제, 및 옵션으로 제 2 단백질 번역 저해제는 앞서 설명된 바와 같은 각각의 부류의 임의의 적합한 종들일 수도 있다. 조성물은 안정화 시약의 임의의 부가적으로 기술된 성분들 (예를 들어, 프로테아제 저해제, RNase 저해제, 완충제 등) 을 추가로 포함할 수도 있다.
키트들. 일부 실시형태들에서, 세포 내 핵산 모집단을 안정화시키기 위한 키트가 제공될 수도 있다. 키트는 적어도 하나의 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및 전자 전달 사슬 디커플링제로부터 선택된 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 안정화 시약을 포함할 수도 있다. 적어도 제 1 단백질 번역 저해제는 비가역성 저해제일 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 키트는 저장 및 후속 DNA 격리를 위해 데옥시 핵산을 안정화시키기 위한 안정화 시약을 제공할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 키트는 저장 및 후속 격리를 위해 리보 핵산 (RNA) 을 안정화시킬 안정화 시약을 제공할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 키트는 저장 및 후속 격리를 위해 메신저 RNA (mRNA) 을 안정화시키기 위한 안정화 시약을 제공할 수도 있다. 안정화 시약은 본원에 기재된 것과 같은 임의의 안정화 시약일 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 적어도 하나의 단백질 번역 저해제 (예를 들어, 비가역성) 는 세포막 투과성일 수도 있다. 비가역성 단백질 번역 저해제는 아미노글리코시드 항생제, D-갈락토사민, 및 에메틴으로부터 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 비가역성 단백질 번역 저해제는 에메틴일 수도 있다.
키트의 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 세포막 투과성일 수도 있다. 리보 핵산 전사 저해제는 CDK9 저해제, 오레트리신, 티올루틴, 아마니틴, 및/또는 트립토라이드로부터 선택될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 리보 핵산 전사 저해제는 비가역성 저해제일 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 리보 핵산 전사 저해제는 트립토리드일 수도 있다.
키트의 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬 저해제일 수도 있거나, 전자 전달 사슬 디커플링제일 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 그 표적에 대해 가역성 활동을 가질 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 전자 전달 사슬 제제는 그 표적에 대해 비가역성 활동을 가질 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 세포막 용해성일 수도 있다. 전자 전달 사슬 제제는 전술한 임의의 전자 전달 사슬 제제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 전자 전달 사슬 제제일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬 저해제일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 전자 전달 사슬 제제는 아지드화 나트륨일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 일 초과의 전자 전달 사슬 제제가 키트에 포함될 수도 있다.
키트는 제 2 단백질 번역 저해제를 추가로 포함할 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 제 1 단백질 번역 저해제와 상이하다. 일부 실시형태들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는 임의의 적합한 단백질 번역 저해제일 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 비가역성 저해제일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는 가역성 단백질 번역 저해제일 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 신속하게 작용할 수도 있으며, 예를 들어 저해의 효과는 약 1, 2, 3, 5, 10 분 내지 약 30 분의 기간 내에 나타난다. 제 2 단백질 번역 저해제는 세포막 투과성일 수도 있다. 제 2 단백질 번역 저해제는 디아족사이드, 글루타르이미드 항생제, 및 이페칵 알칼로이드 중에서 선택될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는 시클로헥시미드일 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 안정화 시약의 성분들의 일부 또는 전부는 안정화 시약의 1 초과의 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는 미리 제조된 용액 (예컨대, 마스터 믹스) 로서 제공될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 마스터 믹스는 안정화 시약의 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함할 수도 있다. 마스터 믹스는 본 명세서에 기술된 임의의 안정화 시약의 임의의 다른 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 마스터 믹스의 안정화 시약의 성분들의 농도는 안정화 반응 자체에 필요한 최종 농도의 약 1X, 2X, 5X, 10X, 20X, 50X, 100X 또는 약 1000X 일 수도 있다.
키트의 다른 성분들. 다양한 실시형태들에서, 키트는 RNase 저해제를 포함하지 않는다. 키트는 프로테아제 저해제를 추가로 포함할 수도 있다. 프로테아제 저해제는 안정화 시약 내에 혼입될 수도 있거나 또는 키트의 독립형 성분으로서 제공될 수도 있다. 프로테아제 저해제는 시스테인 프로테아제, 세린 프로테아제 저해제, 또는 메탈로프로테아제 저해제일 수도 있다. 프로테아제 저해제는 앞서 설명된 임의의 프로테아제 저해제들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 프로테아제 저해제일 수도 있다.
용해 완충액. 키트는 용액 완충액을 추가로 포함할 수도 있다. 용해 완충액은 안정화 시약 또는 안정화 시약을 포함하는 임의의 용액들에 포함되지 않는다. 용해 완충액은 키트의 다른 성분들과는 별도의 컨테이너에 제공될 수도 있다. 용해 완충액은 게놈 또는 미토콘드리아 DNA 를 격리하도록 구성될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 용해 완충액은 전체 RNA 또는 RNA의 서브 세트를 격리하도록 설계될 수도 있다. 용해 완충액은 변성될 수도 있다. 용해 완충액은 비-이온성 또는 양성 이온성일 수도 있는 세제를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 이온성 세제는 예를 들어, DNA 를 격리할 때, 사용될 수도 있다. 적합한 용해 완충액 세제는 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드 (Tris-HCl), 소듐 디옥시콜레이트, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS), 폴리소르베이트 20, 폴리옥시에칠렌 소르비탄 모노라우레이트, PEG (20) 소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20), 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올 (NP40), 옥틸 페녹시폴리에톡시에탄올 (Nonidet P-40), 또는 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton™ X -100) 을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 용해 완충액 세제는 SDS 를 포함할 수도 있다.
용해 완충액은 EDTA 와 같은 킬레이트 제제를 추가로 포함할 수도 있다. 용해 완충액은 프로테아제 저해제들을 포함할 수도 있으며, 프로테아제 저해제의 혼합물을 추가로 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 용해 완충액은 하나 이상의 포스파타제 저해제들을 포함할 수도 있다.
RNA 격리. 용해 완충액들 RNA 가 격리될 때 pH 7-8 사이에서 완충될 수도 있다. RNA 용 용해 완충액은 (RNA 분해를 방지하기 위한) 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트 (guanidinium isothiocyanate) (RNase 와 DNase 효소를 변성시키는 카오트로프) 를 포함할 수도 있다. 용해 완충액은 하나 이상의 RNase 저해제들을 포함할 수도 있다.
키트의 일부 실시양태들에서, 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 리보 핵산 전사 저해제, 및 전자 전달 사슬 제제는 용액에 제공될 수도 있다. 적어도 제 1 비가역성 단백질 번역 저해제, 리보 핵산 전사 저해제 및 전자 전달 사슬 제제의 각각은 임의의 조합으로, 별도의 용기들에서 별도의 용액으로 제공될 수도 있거나, 또는 키트의 하나 이상의 성분의 혼합물로서 제공될 수도 있다. 키트는 임의의 적합한 프로테아제 저해제 (본원에 기재된 프로테아제 저해제를 포함하지만 이에 한정되지 않음) 일 수도 있는 하나 이상의 프로테아제 저해제들을 추가로 포함할 수도 있다. 키트는 임의의 적합한 RNase 저해제 (본원에 기술된 RNase 저해제들을 포함하지만 이에 한정되지 않음) 일 수도 있는, 하나 이상의 RNase 저해제들을 추가로 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 안정화 시약의 모든 성분들은 단일 용액으로서 키트에 제공된다. 안정화 시약의 성분들의 일부 또는 전부가 용액(들)로서 제공되는 경우, 성분들의 농도는 세포의 핵산을 안정화하는데 사용되는 최종 농도의 1X, 2X, 3X, 5X, 10X, 50X, 100X 또는 1000X 일 수도 있고, 따라서 생물학적 세포에 첨가하기 전에 키트의 용액(들)의 희석을 허용한다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 약 1.0 마이크로몰 내지 약 2M; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 0.5 M; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 500 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 250 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 50 밀리몰; 약 1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1 밀리몰 내지 약 50 밀리몰, 약 10 밀리몰 내지 약 1 몰 또는 이들 범위 사이의 임의의 값으로부터의 농도로 용액 내에 존재할 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 약 10 나노몰 내지 약 500 밀리몰; 약 0.01 마이크로몰 내지 약 500 밀리몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 50 밀리몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 5 밀리몰; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 500 마이크로몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값으로부터의 범위의 농도로 용액 내에 존재한다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 약 0.1 마이크로몰 내지 약 5 M; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 1 M; 약 0.1 마이크로몰 내지 약 500 밀리몰; 약 0.3 밀리몰 내지 약 250 밀리몰; 약 0.3 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 0.5 밀리몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 500 밀리몰; 약 1.0 밀리몰 내지 약 100 밀리몰; 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 농도로 존재한다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 제 2 단백질 번역 저해제는 약 1.0 마이크로몰 내지 약 2M; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 0.5 M; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 500 밀리몰; 약 1.0 마이크로몰 내지 약 250 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 0.1 밀리몰 내지 약 50 밀리몰; 약 1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰; 약 1 밀리몰 내지 약 50 밀리몰, 약 10 밀리몰 내지 약 1 몰 또는 이들 범위 사이의 임의의 값으로부터의 농도로 용액 내에 존재할 수도 있다.
미세유체 디바이스들 및 이러한 디바이스들을 동작시키고 관찰하기 위한 시스템들. 도 1a 는 본 개시의 실시형태들에 따라 미세-객체들을 유지하고, 확장하고, 분석하기 위하여 이용될 수 있는 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 예를 예시한다. 미세유체 디바이스 (100) 의 사시도는 미세유체 디바이스 (100) 로의 부분적인 뷰를 제공하기 위하여 그 커버 (110) 의 부분적인 절개부를 가지는 것으로 도시된다. 미세유체 디바이스 (100) 는 일반적으로, 유동 경로 (106) 를 포함하는 미세유체 회로 (120) 를 포함하고, 이 유동 경로를 통해, 유체 매질 (180) 은 유동할 수 있어서, 임의적으로, 하나 이상의 미세-객체들 (도시되지 않음) 을 미세유체 회로 (120) 내로 및/또는 미세유체 회로 (120) 를 통해 운반할 수 있다. 단일의 미세유체 회로 (120) 가 도 1a 에서 예시되어 있지만, 적당한 미세유체 디바이스들은 복수의 (예컨대, 2 또는 3 개의) 이러한 미세유체 회로들을 포함할 수 있다. 여하튼, 미세유체 디바이스 (100) 는 나노유체 디바이스가 되도록 구성될 수 있다. 도 1a 에서 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 미세유체 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 및 130) 을 포함할 수도 있고, 여기서, 각각의 시퀘스트레이션 펜들은 유동 경로 (106) 와 유체 연통하는 하나 이상의 개구부들을 가질 수도 있다. 도 1a 의 디바이스의 일부 실시형태들에서, 시퀘스트레이션 펜들은 유동 경로 (106) 와 유체 연통하는 단일의 개구부를 오직 가질 수도 있다. 이하에서 추가로 논의된 바와 같이, 미세유체 시퀘스트레이션 펜들은 매질 (180) 이 유동 경로 (106) 를 통해 유동하고 있을 때에도, 미세유체 디바이스 (100) 와 같은 미세유체 디바이스에서 미세-객체들을 보유하기 위하여 최적화되었던 다양한 특징부들 및 구조체들을 포함한다. 그러나, 상기한 것으로 돌아가기 전에, 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 간단한 설명이 제공된다.
도 1a 에서 일반적으로 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 인클로저 (102) 에 의해 정의된다. 인클로저 (102) 는 상이한 구성들로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1a 에서 도시된 예에서, 인클로저 (102) 는 지지 구조체 (104) (예컨대, 기저부), 미세유체 회로 구조체 (108), 및 커버 (110) 를 포함하는 것으로서 도시된다. 지지 구조체 (104), 미세유체 회로 구조체 (108), 및 커버 (110) 는 서로에 부착될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 구조체 (108) 는 지지 구조체 (104) 의 내부 표면 (109) 상에서 배치될 수 있고, 커버 (110) 는 미세유체 회로 구조체 (108) 상부에 배치될 수 있다. 지지 구조체 (104) 및 커버 (110) 와 함께, 미세유체 회로 구조체 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 엘리먼트들을 정의할 수 있다.
지지 구조체 (104) 는 도 1a 에서 예시된 바와 같이 미세유체 회로 (120) 의 하단에 있을 수 있고, 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있다. 대안적으로, 지지 구조체 (104) 및 커버 (110) 는 다른 배향들에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조체 (104) 는 미세유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있고 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 의 하단에 있을 수 있다. 여하튼, 각각이 인클로저 (102) 의 내부 또는 외부로의 통로를 포함하는 하나 이상의 포트들 (107) 이 있을 수 있다. 통로의 예들은 밸브, 게이트, 관통 홀 (pass-through hole), 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107) 는 미세유체 회로 구조체 (108) 에서의 갭에 의해 생성된 관통 홀이다. 그러나, 포트 (107) 는 커버 (110) 와 같은, 인클로저 (102) 의 다른 컴포넌트들에서 위치될 수 있다. 오직 하나의 포트 (107) 가 도 1a 에서 예시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 2 개 이상의 포트들 (107) 을 가질 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 (120) 에 진입하는 유체에 대한 유입구 (inlet) 로서 기능하는 제 1 포트 (107) 가 있을 수 있고, 미세유체 회로 (120) 를 진출하는 유체에 대한 유출구 (outlet) 로서 기능하는 제 2 포트 (107) 가 있을 수 있다. 포트 (107) 가 유입구 또는 유출구으로서 기능하는지 여부는 유체가 유동 경로 (106) 를 통해 유동하는 방향에 종속될 수 있다.
지지 구조체 (104) 는 하나 이상의 전극들 (도시되지 않음), 및 기판 또는 복수의 상호접속된 기판들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조체 (104) 는 하나 이상의 반도체 기판들을 포함할 수 있고, 기판들의 각각은 전극에 전기적으로 접속된다 (예컨대, 반도체 기판들의 전부 또는 서브세트는 단일의 전극에 전기적으로 접속될 수 있음). 지지 구조체 (104) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (printed circuit board assembly) ("PCBA") 를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판 (들) 은 PCBA 상에서 장착될 수 있다.
미세유체 회로 구조체 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들을 정의할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트들은 (하나 이상의 유동 채널들을 포함할 수도 있는) 유동 영역들, 챔버들, 펜들, 트랩 (trap) 들, 및 등과 같은, 미세유체 회로 (120) 가 유체로 충전될 때에 유체적으로 상호접속될 수 있는 공간들 또는 영역들을 포함할 수 있다. 도 1a 에서 예시된 미세유체 회로 (120) 에서, 미세유체 회로 구조체 (108) 는 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 를 포함한다. 프레임 (114) 은 미세유체 회로 재료 (116) 를 부분적으로 또는 완전히 봉입 (enclose) 할 수 있다. 프레임 (114) 은 예를 들어, 미세유체 회로 재료 (116) 를 실질적으로 포위하는 상대적으로 강성의 구조체일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114) 은 금속 재료를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 재료 (116) 는 미세유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들 및 상호접속들을 정의하기 위하여 공동 (cavity), 등으로 패턴화될 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 는 기체 투과성일 수 있는 플렉시블 폴리머 (예컨대, 고무, 플라스틱, 엘라스토머 (elastomer), 실리콘 (silicone), 폴리디메틸실록산 ("PDMS"), 등) 와 같은 플렉시블 재료를 포함할 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 를 포함할 수 있는 재료들의 다른 예들은 몰딩된 유리, 실리콘 (silicone) (예컨대, 포토-패턴화가능한 실리콘 (silicone) 또는 "PPS") 과 같은 에칭가능한 재료, 포토-레지스트 (예컨대, SU8), 등을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 재료들 - 그리고 이에 따라, 미세유체 회로 재료 (116) - 은 강성일 수 있고 및/또는 기체에 대해 실질적으로 불투과성일 수 있다. 여하튼, 미세유체 회로 재료 (116) 는 지지 구조체 (104) 상에 그리고 프레임 (114) 내부에 배치될 수 있다.
커버 (110) 는 프레임 (114) 및/또는 미세유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 대안적으로, 커버 (110) 는 도 1a 에서 예시된 바와 같이, 구조적으로 별개의 엘리먼트일 수 있다. 커버 (110) 는 프레임 (114) 및/또는 미세유체 회로 재료 (116) 와 동일하거나 상이한 재료들을 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조체 (104) 는 예시된 바와 같이, 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 와는 별도의 구조체일 수 있거나, 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 마찬가지로, 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 는 도 1a 에서 도시된 바와 같은 별도의 구조체들 또는 동일한 구조의 일체형 부분들일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리 또는 유사한 성질들을 갖는 재료일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 변형가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형가능한 재료는 PDMS 와 같은 폴리머일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 및 변형가능한 재료들의 양자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 커버 (110) 의 하나 이상의 부분들 (예컨대, 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 130) 상에서 위치된 하나 이상의 부분들) 은 커버 (110) 의 강성 재료들과 인터페이싱하는 변형가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 하나 이상의 전극들을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극들은 유리 또는 유사한 절연 재료 상에서 코팅될 수도 있는, 인듐-주석-옥사이드 (indium-tin-oxide) (ITO) 와 같은 전도성 옥사이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 전극들은 폴리머 (예컨대, PDMS) 와 같은 변형가능한 재료에서 내장된, 단일-벽 나노튜브들, 멀티-벽 나노튜브들, 나노와이어들, 전기적 전도성 나노입자들의 클러스터들, 또는 그 조합들과 같은 플렉시블 전극들일 수 있다. 미세유체 디바이스들에서 이용될 수 있는 플렉시블 전극들은 예를 들어, 그 내용들이 참조로 본원에 편입되는 미국 제 2012/0325665 호 (Chiou 등) 에서 설명되었다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 세포 부착, 생존성, 및/또는 성장을 지원하기 위하여 (예컨대, 미세유체 회로 (120) 를 향해 내측으로 대면하는 표면의 전부 또는 일부를 조절함으로써) 개질될 수 있다. 개질 (modification) 은 합성 또는 천연 폴리머의 코팅을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 및/또는 지지 구조체 (104) 는 광에 대해 투명할 수 있다. 커버 (110) 는 또한, 기체 투과성인 적어도 하나의 재료 (예컨대, PDMS 또는 PPS) 를 포함할 수도 있다.
도 1a 는 또한, 미세유체 디바이스 (100) 와 같은 미세유체 디바이스들을 동작시키고 제어하기 위한 시스템 (150) 을 도시한다. 시스템 (150) 은 전기적 전원 (192), 이미징 디바이스 (194) (이미징 모듈 (164) 내에 편입되고, 여기서, 디바이스 (194) 는 그 자체로 도 1a 에서 예시되지 않음), 및 틸팅 디바이스 (190) (틸팅 모듈 (166) 의 일부, 여기서, 디바이스 (190) 는 도 1a 에서 예시되지 않음) 를 포함한다.
전기적 전원 (192) 은 전기 전력을 미세유체 디바이스 (100) 및/또는 틸팅 디바이스 (190) 에 제공할 수 있고, 필요할 때에 바이어싱 전압들 또는 전류들을 제공할 수 있다. 전기적 전원 (192) 은 예를 들어, 하나 이상의 교류 (alternating current; AC) 및/또는 직류 (direct current; DC) 전압 또는 전류 소스들을 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) (이하에서 논의된 이미징 모듈 (164) 의 일부) 는 미세유체 회로 (120) 내부의 이미지들을 캡처하기 위한, 디지털 카메라와 같은 디바이스를 포함할 수 있다. 일부 사례들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 (예컨대, 낮은 광 애플리케이션들을 위한) 고속의 프레임 레이트 및/또는 높은 감도를 가지는 검출기를 더 포함한다. 이미징 디바이스 (194) 는 또한, 시뮬레이팅 방사 및/또는 광 빔들을 미세유체 회로 (120) 로 지향시키고 미세유체 회로 (120) (또는 그 안에 포함된 미세-객체들) 로부터 반사되거나 방출된 방사 및/또는 광 빔들을 수집하기 위한 메커니즘을 포함할 수 있다. 방출된 광 빔들은 가시적 스펙트럼에 있을 수도 있고, 예컨대, 형광 방출들을 포함할 수도 있다. 반사된 광 빔들은 수은 램프 (예컨대, 고압 수은 램프) 등 (예컨대, 고 압력 수은등) 또는 크세논 아크 램프 (Xenon arc lamp) 와 같은 LED 또는 넓은 스펙트럼 램프로부터 발신되는 반사된 방출들을 포함할 수도 있다. 도 3b 에 대하여 논의된 바와 같이, 이미징 디바이스 (194) 는 아이피스 (eyepiece) 를 포함할 수도 있거나 포함하지 않을 수도 있는 현미경 (또는 광학적 트레인 (optical train)) 을 더 포함할 수도 있다.
시스템 (150) 은 하나 이상의 회전 축들 주위로 미세유체 디바이스 (100) 를 회전시키도록 구성된 틸팅 디바이스 (190) (이하에서 논의된 틸팅 모듈 (166) 의 일부) 를 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 디바이스 (100) (및 이에 따라, 미세유체 회로 (120)) 가 레벨 배향 (즉, x- 및 y-축들에 대한 0°), 수직 배향 (즉, x-축 및/또는 y-축에 대한 90°), 또는 그 사이의 임의의 배향에서 홀딩될 수 있도록 적어도 하나의 축 주위로 미세유체 회로 (120) 를 포함하는 인클로저 (102) 를 지지 및/또는 홀딩하도록 구성된다. 축에 대한 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 배향은 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 의 "틸트 (tilt)" 로서 본원에서 지칭된다. 예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 는 x-축에 대한 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90° 에서 또는 그 사이의 임의의 각도에서 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 수 있다. 레벨 배향 (및 이에 따라, x- 및 y-축들) 은 중력에 의해 정의된 수직 축에 대한 법선으로서 정의된다. 틸팅 디바이스는 또한, x-축 및/또는 y-축에 대한 90° 보다 더 큰 임의의 각도까지 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅할 수 있거나, 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 완전히 반전시키기 위하여 x-축 또는 y-축에 대한 180° 로 미세유체 디바이스 (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅할 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 회로 (120) 의 유동 경로 (106) 또는 일부 다른 부분에 의해 정의된 회전 축 주위로 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅한다.
일부 사례들에서, 미세유체 디바이스 (100) 는 유동 경로 (106) 가 하나 이상의 시퀘스트레이션 펜들 위 또는 아래에 위치되도록 수직 배향으로 틸팅된다. 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "~ 위" 는 유동 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 시퀘스트레이션 펜들보다 더 높게 위치된다 (즉, 유동 경로 (106) 위의 시퀘스트레이션 펜에서의 객체는 유동 경로에서의 객체보다 더 높은 중력 포텐셜 에너지 (gravitational potential energy) 를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다. 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "~ 아래" 는 유동 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 시퀘스트레이션 펜들보다 더 낮게 위치된다 (즉, 유동 경로 (106) 아래의 시퀘스트레이션 펜에서의 객체는 유동 경로에서의 객체보다 더 낮은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다.
일부 사례들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 유동 경로 (106) 에 대해 평행한 축 주위로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또한, 미세유체 디바이스 (100) 는 유동 경로 (106) 가 시퀘스트레이션 펜들 바로 위 또는 아래에 위치되지 않으면서, 하나 이상의 시퀘스트레이션 펜들 위 또는 아래에 위치되도록 90° 미만의 각도로 틸팅될 수 있다. 다른 사례들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 유동 경로 (106) 에 대해 수직인 축 주위로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또 다른 사례들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 유동 경로 (106) 에 대해 평행하지도 않거나 수직이지도 않은 축 주위로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다.
시스템 (150) 은 매질 소스 (178) 를 더 포함할 수 있다. 매질 소스 (178) (예컨대, 컨테이너 (container), 저장소 (reservoir), 등) 는 각각이 상이한 유체 매질 (180) 을 홀딩하기 위한 다수의 섹션들 또는 컨테이너들을 포함할 수 있다. 이에 따라, 매질 소스 (178) 는 도 1a 에서 예시된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (100) 의 외부에 있고 미세유체 디바이스 (100) 로부터 격리되어 있는 디바이스일 수 있다. 대안적으로, 매질 소스 (178) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 인클로저 (102) 내부에 전체적으로 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 매질 소스 (178) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 일부인 저장소들을 포함할 수 있다.
도 1a 는 또한, 시스템 (150) 의 일부를 구성하고 미세유체 디바이스 (100) 와 함께 사용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들의 간략화된 블록도 도시들을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들은 매질 소스 (178) 를 제어하기 위한 매질 모듈 (160), 미세유체 회로 (120) 에서의 미세-객체들 (도시되지 않음) 및/또는 매질 (예컨대, 매질의 액적 (droplet) 들) 의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 기동 모듈 (162), 이미지들 (예컨대, 디지털 이미지들) 을 캡처하기 위한 이미징 디바이스 (194) (예컨대, 카메라, 현미경, 광원, 또는 그 임의의 조합) 를 제어하기 위한 이미징 모듈 (164), 및 틸팅 디바이스 (190) 를 제어하기 위한 틸팅 모듈 (166) 을 포함한다. 제어 장비 (152) 는 또한, 미세유체 디바이스 (100) 에 대한 다른 기능들을 제어하거나, 모니터링하거나, 수행하기 위한 다른 모듈들 (168) 을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비 (152) 는 디스플레이 디바이스 (170) 및 입력/출력 디바이스 (172) 를 더 포함할 수 있다.
마스터 제어기 (154) 는 제어 모듈 (156) 및 디지털 메모리 (158) 를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156) 은 예를 들어, 메모리 (158) 에서 비-일시적 데이터 또는 신호들로서 저장된 머신 실행가능 명령들 (예컨대, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드, 등) 에 따라 동작하도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제어 모듈 (156) 은 하드와이어링된 (hardwired) 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 매질 모듈 (160), 기동 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 유사하게 구성될 수 있다. 이에 따라, 미세유체 디바이스 (100) 또는 임의의 다른 미세유체 장치에 대하여 수행되는 것으로서 본원에서 논의된 기능들, 프로세스들, 액트들, 액션들, 또는 프로세스의 단계들은 위에서 논의된 바와 같이 구성된 마스터 제어기 (154), 매질 모듈 (160), 기동 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 중의 임의의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 마스터 제어기 (154), 매질 모듈 (160), 기동 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 본원에서 논의된 임의의 기능, 프로세스, 액트, 액션, 또는 단계에서 이용된 데이터를 송신하고 수신하도록 통신가능하게 결합될 수도 있다.
매질 모듈 (160) 은 매질 소스 (178) 를 제어한다. 예를 들어, 매질 모듈 (160) 은 선택된 유체 매질 (180) 을 (예컨대, 유입구 포트 (107) 를 통해) 인클로저 (102) 내로 입력하기 위하여 매질 소스 (178) 를 제어할 수 있다. 매질 모듈 (160) 은 또한, (예컨대, 유출구 포트 (도시되지 않음) 를 통해) 인클로저 (102) 로부터의 매질의 제거를 제어할 수 있다. 하나 이상의 매질은 이에 따라, 선택적으로 미세유체 회로 (120) 내로 입력될 수 있고 미세유체 회로 (120) 로부터 제거될 수 있다. 매질 모듈 (160) 은 또한, 미세유체 회로 (120) 내부의 유동 경로 (106) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 매질 모듈 (160) 은 틸팅 모듈 (166) 이 틸팅 디바이스 (190) 로 하여금 희망된 경사각으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅하게 하기 이전에, 유동 경로 (106) 에서 그리고 인클로저 (102) 를 통한 매질 (180) 의 유동을 정지시킨다.
기동 모듈 (162) 은 미세유체 회로 (120) 에서의 미세-객체들 (도시되지 않음) 의 선택, 트래핑 (trapping), 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1b 및 도 1c 에 대하여 이하에서 논의된 바와 같이, 인클로저 (102) 는 유전영동 (DEP), 광전 트위저들 (optoelectronic tweezer; OET) 및/또는 광-전기습윤 (opto-electrowetting; OEW) 구성 (도 1a 에서 도시되지 않음) 을 포함할 수 있고, 기동 모듈 (162) 은 유동 경로 (106) 및/또는 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 130) 에서 매질의 미세-객체들 (도시되지 않음) 및/또는 액적들을 선택하고 이동시키기 위하여 전극들 및/또는 트랜지스터들 (예컨대, 포토트랜지스터들) 의 활성화를 제어할 수 있다.
이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 를 제어할 수 있다. 예를 들어, 이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 로부터 이미지 데이터를 수신할 수 있고 이미지 데이터를 프로세싱할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 로부터의 이미지 데이터는 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 임의의 타입의 정보 (예컨대, 미세-객체들의 존재 또는 부재, 매질의 액적들, 형광 라벨과 같은 라벨의 축적 등) 를 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보를 이용하여, 이미징 모듈 (164) 은 객체들 (예컨대, 미세-객체들, 매질의 액적들) 의 위치 및/또는 미세유체 디바이스 (100) 내에서의 이러한 객체들의 움직임의 레이트를 추가로 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 디바이스 (190) 의 틸팅 움직임들을 제어할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 틸팅 모듈 (166) 은 중력들을 통한 하나 이상의 시퀘스트레이션 펜들로의 미세-객체들의 전달을 최적화하기 위하여 틸팅 레이트 및 타이밍을 제어할 수 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 미세유체 회로 (120) 에서의 매질의 미세-객체들 및/또는 액적들의 움직임을 설명하는 데이터를 수신하기 위하여 이미징 모듈 (164) 과 통신가능하게 결합된다. 이 데이터를 이용하여, 틸팅 모듈 (166) 은 매질의 미세-객체들 및/또는 액적들이 미세유체 회로 (120) 에서 이동하는 레이트를 조절하기 위하여 미세유체 회로 (120) 의 틸트를 조절할 수도 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 또한, 미세유체 회로 (120) 에서의 매질의 미세-객체 및/또는 액적의 위치를 반복적으로 조절하기 위하여 이 데이터를 이용할 수도 있다.
도 1a 에서 도시된 예에서, 미세유체 회로 (120) 는 미세유체 채널 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 130) 을 포함하는 것으로서 예시되어 있다. 각각의 펜은 채널 (122) 로의 개구부를 포함하지만, 그렇지 않을 경우에는, 펜들이 채널 (122) 의 유동 경로 (106) 에서 또는 다른 펜들에서의 유체 매질 (180) 및/또는 미세-객체들로부터 펜 내부의 미세-객체들을 실질적으로 격리시킬 수 있도록 봉입된다. 시퀘스트레이션 펜의 벽들은 인클로저를 제공하기 위하여 기저부의 내부 표면 (109) 으로부터 커버 (110) 의 내부 표면으로 연장된다. 미세유체 채널 (122) 로의 펜의 개구부는 유동 (106) 이 펜들로 지향되지 않도록, 유체 매질 (180) 의 유동 (106) 에 대한 각도로 배향된다. 유동은 펜의 개구부의 평면에 대해 접할 수도 있거나 직교할 수도 있다. 일부 사례들에서, 펜들 (124, 126, 128, 130) 은 미세유체 회로 (120) 내에서 하나 이상의 미세-객체들을 물리적으로 가두도록 구성된다. 본 개시에 따른 시퀘스트레이션 펜들은 이하에서 상세하게 논의되고 도시되는 바와 같이, DEP, OET, OEW, 유체 유동, 및/또는 중력들과의 이용을 위하여 최적화되는 다양한 형상들, 표면들, 및 특징부들을 포함할 수 있다.
미세유체 회로 (120) 는 임의의 수의 미세유체 시퀘스트레이션 펜들을 포함할 수도 있다. 5 개의 시퀘스트레이션 펜들이 도시되어 있지만, 미세유체 회로 (120) 는 더 적거나 더 많은 시퀘스트레이션 펜들을 가질 수도 있다. 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 의 미세유체 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 및 130) 은 각각, 생물학적 미세-객체들을 유지하거나, 격리하거나, 분석하거나, 배양하는데 유용한 하나 이상의 이득들을 제공할 수도 있는 상이한 특징부들 및 형상들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 동일한 미세유체 시퀘스트레이션 펜들을 포함한다.
도 1a 에서 예시된 실시형태에서는, 단일의 채널 (122) 및 유동 경로 (106) 가 도시된다. 그러나, 다른 실시형태들은 각각이 유동 경로 (106) 를 포함하도록 구성된 다수의 채널들 (122) 을 포함할 수도 있다. 미세유체 회로 (120) 는 유동 경로 (106) 및 유체 매질 (180) 과 유체 연통하는 유입구 밸브 또는 포트 (107) 를 더 포함함으로써, 유체 매질 (180) 은 유입구 포트 (107) 를 통해 채널 (122) 을 액세스할 수 있다. 일부 사례들에서, 유동 경로 (106) 는 단일의 경로를 포함한다. 일부 사례들에서, 단일의 경로는 지그재그 패턴으로 배열됨으로써, 유동 경로 (106) 는 교번하는 방향들에서 2 회 이상 미세유체 디바이스 (100) 를 가로질러 이동한다.
일부 사례들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 병렬 채널들 (122) 및 유동 경로들 (106) 을 포함하고, 여기서, 각각의 유동 경로 (106) 내의 유체 매질 (180) 은 동일한 방향으로 유동한다. 일부 사례들에서, 각각의 유동 경로 (106) 내의 유체 매질은 순방향 또는 역방향 중의 적어도 하나로 유동한다. 일부 사례들에서, 복수의 시퀘스트레이션 펜들은 시퀘스트레이션 펜들이 평행하게 타겟 미세-객체들로 로딩될 수 있도록 (예컨대, 채널 (122) 에 대해) 구성된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 하나 이상의 미세-객체 트랩들 (132) 을 더 포함한다. 트랩들 (132) 은 일반적으로, 채널 (122) 의 경계를 형성하는 벽에서 형성되고, 미세유체 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 130) 중의 하나 이상의 시퀘스트레이션 펜의 개구부에 대향하게 위치될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 유동 경로 (106) 로부터 단일의 미세-객체를 수신하거나 캡처하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 유동 경로 (106) 로부터 복수의 미세-객체들을 수신하거나 캡처하도록 구성된다. 일부 사례들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 미세-객체의 체적과 대략 동일한 체적을 포함한다.
트랩들 (132) 은 트랩들 (132) 로의 타겟화된 미세-객체들의 유동을 보조하도록 구성되는 개구부를 더 포함할 수도 있다. 일부 사례들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 미세-객체의 치수들과 대략 동일한 높이 및 폭을 가지는 개구부를 포함함으로써, 더 큰 미세-객체들은 미세-객체 트랩 내로 진입하는 것이 방지된다. 트랩들 (132) 은 트랩 (132) 내에서의 타겟화된 미세-객체들의 보유를 보조하도록 구성된 다른 특징부들을 더 포함할 수도 있다. 일부 사례들에서, 트랩 (132) 은 미세유체 시퀘스트레이션 펜의 개구부에 대한 채널 (122) 의 반대 측부와 정렬되고 이 반대 측부 상에서 위치되어, 미세유체 채널 (122) 에 대해 평행한 축 주위로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 시에, 트래핑된 미세-객체는 미세-객체로 하여금 시퀘스트레이션 펜의 개구부 내로 하강하게 하는 궤적에서 트랩 (132) 을 진출한다. 일부 사례들에서, 트랩 (132) 은 트랩 (132) 을 통한 유동을 용이하게 함으로써, 트랩 (132) 에서 미세-객체를 캡처할 가능성을 증가시키기 위하여, 타겟 미세-객체보다 더 작은 측부 통로 (134) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP) 힘들은 그 안에 위치된 미세-객체들을 조작하고, 이송하고, 격리시키고, 소팅하기 위하여 하나 이상의 전극들 (도시되지 않음) 을 통해 (예컨대, 유동 경로에서 및/또는 시퀘스트레이션 펜들에서) 유체 매질 (180) 을 가로질러서 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 단일의 미세-객체를 유동 경로 (106) 로부터 희망된 미세유체 시퀘스트레이션 펜 내로 전달하기 위하여 미세유체 회로 (120) 의 하나 이상의 부분들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 시퀘스트레이션 펜 (예컨대, 시퀘스트레이션 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 미세-객체가 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위하여 이용된다. 추가로, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 현재 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 미세-객체를 시퀘스트레이션 펜으로부터 제거하기 위하여 이용된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 광전 트위저 (OET) 힘들을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 광-전기습윤 (OEW) 힘들은 미세유체 회로 (120) 에서 위치된 액적들을 조작하고, 이송하고, 격리시키고, 소팅하기 위하여 하나 이상의 전극들 (도시되지 않음) 을 통해 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조체 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들 (예컨대, 유동 경로 및/또는 시퀘스트레이션 펜들을 정의하는 것을 돕는 위치들) 에 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, OEW 힘들은 단일의 액적을 유동 경로 (106) 로부터 희망된 미세유체 시퀘스트레이션 펜 내로 전달하기 위하여 지지 구조체 (104)(및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 힘들은 시퀘스트레이션 펜 (예컨대, 시퀘스트레이션 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 액적이 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위하여 이용된다. 추가로, 일부 실시형태들에서, OEW 힘들은 현재 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 액적을 시퀘스트레이션 펜으로부터 제거하기 위하여 이용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 미세유체 회로 (120) 내의 미세-객체들 및/또는 액적들을 조작하고, 이송하고, 격리시키고, 소팅하기 위하여, 유동 및/또는 중력과 같은 다른 힘들과 조합된다. 예를 들어, 인클로저 (102) 는 유동 경로 (106) 및 그 안에 위치된 미세-객체들을 미세유체 시퀘스트레이션 펜들 위에 위치시키기 위하여 (예컨대, 틸팅 디바이스 (190) 에 의해) 틸팅될 수 있고, 중력은 미세-객체들 및/또는 액적들을 펜들 내로 이송할 수 있다. 일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 이전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 후에 인가될 수 있다. 또 다른 사례들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들과 동시에, 또는 다른 힘들과 교번하는 방식으로 인가될 수 있다.
도 1b, 도 1c, 및 도 2a 내지 도 2h 는 본 개시의 실시형태들에서 이용될 수 있는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들을 예시한다. 도 1b 는 미세유체 디바이스 (200) 가 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (electrokinetic device) 로서 구성되는 실시형태를 도시한다. 광전자 트위저 (OET) 구성을 가지는 디바이스들 및 광-전기습윤 (OEW) 구성을 가지는 디바이스들을 포함하는, 다양한 광학적으로-작동된 동전기 디바이스들이 당해 분야에서 알려져 있다. 적당한 OET 구성들의 예들은 다음의 미국 특허 문헌들에서 예시되고, 이 문헌들의 각각은 그 전체적으로 참조로 본원에 편입된다: 미국 특허 제 RE 44,711 호 (Wu 등)(미국 특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨); 및 미국 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등). OEW 구성들의 예들은 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등) 및 미국 특허 출원 공개 제 2012/0024708 호 (Chiou 등) 에서 예시되고, 이들의 양자는 그 전체적으로 본원에 참조로 편입된다. 광학적으로-작동된 동전기 디바이스의 또 다른 예는 조합된 OET/OEW 구성을 포함하고, 이 구성의 예들은 미국 특허 공개 제 20150306598 호 (Khandros 등) 및 제 20150306599 호 (Khandros 등) 및 그 대응하는 PCT 공개들 제 WO2015/164846 호 및 제 WO2015/164847 호에서 도시되고, 이들 모두는 그 전체적으로 참조로 본원에 편입된다.
생물학적 미세-객체들이 배치될 수 있고, 배양될 수 있고, 및/또는 모니터링될 수 있는 펜들을 가지는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어, 미국 제 2014/0116881 호 (2013 년 10 월 22 일자로 출원된 출원 번호 제 14/060,117 호), 미국 제 2015/0151298 호 (2014 년 10 월 22 일자로 출원된 출원 번호 제 14/520,568 호), 및 미국 제 2015/0165436 호 (2014 년 10 월 22 일자로 출원된 출원 번호 제 14/521,447 호) 에서 설명되었고, 이들의 각각은 그 전체적으로 참조로 본원에 편입된다. 미국 출원 번호들 제 14/520,568 호 및 제 14/521,447 호는 또한, 미세유체 디바이스에서 배양된 세포들의 분비들을 분석하는 예시적인 방법들을 설명한다. 상기한 출원들의 각각은 광전자 트위저들 (OET) 과 같이, 유전영동 (DEP) 힘들을 생성하도록 구성되거나, 광-전기습윤 (OEW) 을 제공하도록 구성된 미세유체 디바이스들을 추가로 설명한다. 예를 들어, 미국 제 2014/0116881 호의 도 2 에서 예시된 광전 트위저들 디바이스는 개별적인 생물학적 미세-객체 또는 생물학적 미세-객체들의 그룹을 선택하고 이동시키기 위하여 본 개시의 실시형태들에서 사용될 수 있는 디바이스의 예이다.
미세유체 디바이스 기동 구성들. 위에서 설명된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링 장비는 미세유체 디바이스의 미세유체 회로에서 미세-객체들 또는 액적들과 같은 객체들을 선택하고 이동시키기 위한 기동 모듈을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는 이동되고 있는 객체의 타입 및 다른 고려사항들에 따라, 다양한 기동 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 미세유체 회로에서 미세-객체들을 선택하고 이동시키기 위하여 사용될 수 있다. 이에 따라, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조체 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서 유체 매질 (180) 에서의 미세-객체들 상에 DEP 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함할 수 있음으로써, 개별적인 미세-객체들 또는 미세-객체들의 그룹들을 선택할 수 있고, 캡처할 수 있고, 및/또는 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조체 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서 유체 매질 (180) 에서의 액적들 상에 EW 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (electrowetting; EW) 구성을 포함할 수 있음으로써, 개별적인 액적들 또는 액적들의 그룹들을 선택할 수 있고, 캡처할 수 있고, 및/또는 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 의 하나의 예는 도 1b 및 도 1c 에서 예시되어 있다. 간략함의 목적들을 위하여, 도 1b 및 도 1c 는 영역/챔버 (202) 를 가지는 미세유체 디바이스 (200) 의 인클로저 (102) 의 부분의 측단면도 및 상단 단면도를 각각 도시하지만, 영역/챔버 (202) 는 성장 챔버, 시퀘스트레이션 펜, 유동 영역, 또는 유동 채널과 같은, 더 상세한 구조체를 가지는 유체 회로 엘리먼트의 일부일 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 미세유체 디바이스 (200) 는 다른 유체 회로 엘리먼트들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스 (200) 는 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 본원에서 설명된 것들과 같은, 복수의 성장 챔버들 또는 시퀘스트레이션 펜들 및/또는 하나 이상의 유동 영역들 또는 유동 채널들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 미세유체 디바이스 (200) 의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트들 내로 편입될 수도 있거나, 그 부분들을 선택할 수도 있다. 위에서 또는 이하에서 설명된 미세유체 디바이스 컴포넌트들 및 시스템 컴포넌트들 중의 임의의 것은 미세유체 디바이스 (200) 에서 편입될 수도 있고 및/또는 미세유체 디바이스 (200) 와 조합하여 이용될 수도 있다는 것이 추가로 인식되어야 한다. 예를 들어, 위에서 설명된 제어 및 모니터링 장비 (152) 를 포함하는 시스템 (150) 은 매질 모듈 (160), 기동 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 다른 모듈들 (168) 중의 하나 이상을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 와 함께 이용될 수도 있다.
도 1b 에서 알 수 있는 바와 같이, 미세유체 디바이스 (200) 는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 놓이는 전극 활성화 기판 (206) 을 가지는 지지 구조체 (104), 및 상단 전극 (210) 을 가지는 커버 (110) 를 포함하고, 상단 전극 (210) 은 하단 전극 (204) 으로부터 떨어져서 이격된다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206) 은 영역/챔버 (202) 의 대향하는 표면들을 정의한다. 영역/챔버 (202) 에서 함유된 매질 (180) 은 이에 따라, 상단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 사이의 저항성 접속을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210) 에 접속되고, 영역/챔버 (202) 에서의 DEP 힘들의 생성을 위하여 요구된 바와 같이, 전극들 사이에서 바이어싱 전압을 생성하도록 구성된 전원 (212) 이 또한 도시된다. 전원 (212) 은 예를 들어, 교류 (AC) 전원일 수 있다.
어떤 실시형태들에서, 도 1b 및 도 1c 에서 예시된 미세유체 디바이스 (200) 는 광학적으로-작동된 DEP 구성을 가질 수 있다. 따라서, 기동 모듈 (162) 에 의해 제어될 수도 있는, 광원 (216) 으로부터의 광 (218) 의 패턴들을 변경하는 것은 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 의 영역들 (214) 에서 DEP 전극들의 패턴들을 변경하는 것을 선택적으로 활성화할 수 있고 비활성화할 수 있다. (이하에서, DEP 구성을 가지는 미세유체 디바이스의 영역들 (214) 은 "DEP 전극 영역들" 로서 지칭된다.) 도 1c 에서 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 상으로 지향된 광 패턴 (218) 은 정사각형과 같은 패턴으로 선택 DEP 전극 영역들 (214a) (백색으로 도시됨) 을 조명할 수 있다. 비-조명된 DEP 전극 영역들 (214) (십자-해칭됨) 은 "어두운" DEP 전극 영역들 (214) 로서 이하에서 지칭된다. DEP 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터, 유동 영역 (106) 에서 매질 (180) 과 인터페이싱하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스는 각각의 어두운 DEP 전극 영역 (214) 에서 영역/챔버 (202) 에서의 매질 (180) 을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 은 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 에서 영역/챔버 (202) 에서의 매질 (180) 을 통한 상대적인 임피던스보다 더 작은 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 감소된 상대적인 임피던스를 나타낸다.
전원 (212) 이 활성화됨으로써, 상기한 DEP 구성은 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 과 인접한 어두운 DEP 전극 영역들 (214) 사이의 유체 매질 (180) 에서 전계 구배 (electric field gradient) 를 생성하고, 이것은 결국, 유체 매질 (180) 에서 근처의 미세-객체들 (도시되지 않음) 을 끌어당기거나 밀어내는 국소적 DEP 힘들을 생성한다. 유체 매질 (180) 에서 미세-객체들을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 이에 따라, 광원 (216) 으로부터 미세유체 디바이스 (200) 로 투영된 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 영역/챔버 (202) 의 내부 표면 (208) 에서의 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화될 수 있고 비활성화될 수 있다. DEP 힘들이 근처의 미세-객체들을 끌어당기거나 밀어내는지 여부는 전원 (212) 의 주파수 및 매질 (180) 및/또는 미세-객체들 (도시되지 않음) 의 유전체 성질들과 같은 이러한 파라미터들에 종속될 수 있다.
도 1c 에서 예시된 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 의 정사각형 패턴 (220) 은 오직 예이다. DEP 전극 영역들 (214) 의 임의의 패턴은 미세유체 디바이스 (200) 로 투영된 광의 패턴 (218) 에 의해 조명될 수 있고 (그리고 이것에 의하여 활성화됨), 조명된/활성화된 DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴은 광 패턴 (218) 을 변경하거나 이동시킴으로써 반복적으로 변경될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 광전도성 재료를 포함할 수 있거나, 광전도성 재료로 구성될 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 은 특징부가 없을 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (hydrogenated amorphous silicon) (a-Si:H) 을 포함할 수 있거나, 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 으로 구성될 수 있다. a-Si:H 는 예를 들어, (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 실리콘 (silicon) 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8 % 내지 40 % 의 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 μm 의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, DEP 전극 영역들 (214) 은 광 패턴 (218) 에 따라, 전극 활성화 기판 (208) 의 내부 표면 (206) 상에서 어디든지 그리고 임의의 패턴으로 생성될 수 있다. DEP 전극 영역들 (214) 의 수 및 패턴은 이에 따라 고정될 필요가 없지만, 광 패턴 (218) 에 대응할 수 있다. 위에서 논의된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 가지는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어, 미국 특허 제 RE 44,711 호 (Wu 등)(미국 특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨) 에서 설명되었고, 그 전체 내용들은 참조로 본원에 편입된다.
다른 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 반도체 분야들에서 알려진 바와 같은, 반도체 집적 회로들을 형성하는 복수의 도핑된 층들, 전기적 절연 층들 (또는 영역들), 및 전기적 전도성 층들을 포함하는 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 예를 들어, 횡방향 바이폴라 포토트랜지스터 (lateral bipolar phototransistor) 들을 포함하는 복수의 포토트랜지스터들을 포함할 수 있고, 각각의 포토트랜지스터는 DEP 전극 영역 (214) 에 대응할 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예컨대, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있고, 각각의 이러한 전극은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 이러한 포토트랜지스터들 또는 포토트랜지스터-제어된 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은 예를 들어, 도 2b 에서 도시된 바와 같은, 행 (row) 들 및 열 (column) 들로 배열된 실질적으로 정사각형의 포토트랜지스터들 또는 포토트랜지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형의 포토트랜지스터들 또는 포토트랜지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계 없이, 전기 회로 엘리먼트들은 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 에서의 DEP 전극 영역들 (214) 과 하단 전극 (210) 사이의 전기적 접속들을 형성할 수 있고, 그 전기적 접속들 (즉, 포토트랜지스터들 또는 전극들) 은 광 패턴 (218) 에 의해 선택적으로 활성화될 수 있고 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않을 때, 각각의 전기적 접속은 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터, 영역/챔버 (202) 에서 매질 (180) 과 인터페이싱하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 까지의) 상대적인 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 매질 (180) 을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적인 임피던스보다 더 크도록, 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나, 광 패턴 (218) 에서의 광에 의해 활성화될 때, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 상대적인 임피던스는 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214) 에서 매질 (180) 을 통한 상대적인 임피던스보다 더 작음으로써, 위에서 논의된 바와 같이 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서의 DEP 전극을 활성화한다. 매질 (180) 에서 미세-객체들 (도시되지 않음) 을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 이에 따라, 광 패턴 (218) 에 의해 결정된 방식으로 영역/챔버 (202) 에서의 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 에서의 많은 상이한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화될 수 있고 비활성화될 수 있다.
포토트랜지스터들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 가지는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어, 미국 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등) (예컨대, 도 21 및 도 22 에서 예시된 디바이스 (300) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되었고, 그 전체 내용들은 참조로 본원에 편입된다. 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 가지는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어, 미국 특허 공개 제 2014/0124370 호 (Short 등) (예컨대, 도면들 전반에 걸쳐 예시된 디바이스들 (200, 400, 500, 600, 및 900) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되었고, 그 전체 내용들은 참조로 본원에 편입된다.
DEP 구성된 미세유체 디바이스의 일부 실시형태들에서, 상단 전극 (210) 은 인클로저 (102) 의 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 일부이고, 전극 활성화 기판 (206) 및 하단 전극 (204) 은 인클로저 (102) 의 제 2 벽 (또는 지지 구조체 (104)) 의 일부이다. 영역/챔버 (202) 는 제 1 벽과 제 2 벽 사이에 있을 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전극 (210) 은 제 2 벽 (또는 지지 구조체 (104)) 의 일부이고, 전극 활성화 기판 (206) 및/또는 전극 (210) 중의 하나 또는 양자는 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 일부이다. 또한, 광원 (216) 은 아래로부터 인클로저 (102) 를 조명하기 위하여 대안적으로 이용될 수 있다.
DEP 구성을 가지는 도 1b 및 도 1c 의 미세유체 디바이스 (200) 로, 기동 모듈 (162) 은 미세-객체를 포위하고 캡처하는 패턴 (예컨대, 정사각형 패턴 (220)) 에서 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 의 DEP 전극 영역들 (214a) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 1 세트를 활성화하기 위하여 광 패턴 (218) 을 미세유체 디바이스 (200) 로 투영함으로써, 영역/챔버 (202) 에서의 매질 (180) 에서 미세-객체 (도시되지 않음) 를 선택할 수 있다. 그 다음으로, 기동 모듈 (162) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서의 하나 이상의 DEP 전극들의 제 2 세트를 활성화하기 위하여 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 광 패턴 (218) 을 이동시킴으로써 인 시츄-생성된 캡처된 미세-객체를 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (200) 는 광 패턴 (218) 에 대해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 에서의 DEP 전극들의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면 (예컨대, 커버 (110)) 에 대향하게 위치된 선택적으로 어드레싱가능하고 급전가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치들 (예컨대, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서의 DEP 전극들을 활성화하거나 비활성화하기 위하여 선택적으로 개방될 수도 있고 폐쇄될 수도 있음으로써, 활성화된 DEP 전극들 근처에서 영역/챔버 (202) 에서의 미세-객체 (도시되지 않음) 상에서 순 (net) DEP 힘을 생성할 수도 있다. 전원 (212) 의 주파수 및 영역/챔버 (202) 에서의 매질 (도시되지 않음) 및/또는 미세-객체들의 유전체 성질들과 같은 이러한 특성들에 따라, DPE 힘은 근처의 미세-객체를 끌어당길 수 있거나 밀어낼 수 있다. (예컨대, 정사각형 패턴 (220) 을 형성하는 DEP 전극 영역들 (214) 의 세트에서의) DEP 전극들의 세트를 선택적으로 활성화하고 비활성화함으로써, 영역/챔버 (202) 에서의 하나 이상의 미세-객체들은 영역/챔버 (202) 내에서 트래핑될 수 있고 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 기동 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어할 수 있고, 이에 따라, 영역/챔버 (202) 주위의 특정한 미세-객체들 (도시되지 않음) 을 선택하고, 트래핑하고, 이동시키기 위하여 DEP 전극들의 개별적인 전극들을 활성화할 수 있고 비활성화할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능하고 급전가능한 전극들을 포함하는 DEP 구성을 가지는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에서 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 제 6,294,063 호 (Becker 등) 및 제 6,942,776 호 (Medoro) 에서 설명되었고, 그 전체 내용들은 참조로 본원에 편입된다.
또 다른 예에서, 미세유체 디바이스 (200) 는 DEP 구성을 대신할 수 있거나, DEP 구성을 가지는 부분으로부터 격리되어 있는 미세유체 디바이스 (200) 의 부분에 위치될 수 있는 전기습윤 (EW) 구성을 가질 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성 (OEW) 또는 유전체 상의 전기습윤 (electrowetting on dielectric; EWOD) 구성일 수 있고, 이 양자는 당해 분야에 알려져 있다. 일부 EW 구성들에서, 지지 구조체 (104) 는 유전체 층 (도시되지 않음) 과 하단 전극 (204) 사이에서 끼워진 전극 활성화 기판 (206) 을 가진다. 유전체 층은 이하에서 설명된 바와 같이, 소수성 재료 (hydrophobic material) 를 포함할 수 있고 및/또는 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 가지는 미세유체 디바이스들 (200) 에 대하여, 지지 구조체 (104) 의 내부 표면 (208) 은 유전체 층 또는 그 소수성 코팅의 내부 표면이다.
유전체 층 (도시되지 않음) 은 하나 이상의 옥사이드 층들을 포함할 수 있고, 또는 약 50 nm 내지 약 250 nm (예컨대, 약 125 nm 내지 약 175 nm) 의 두께를 가질 수 있다. 어떤 실시형태들에서, 유전체 층은 금속 옥사이드 (예컨대, 알루미늄 옥사이드 또는 하프늄 옥사이드) 와 같은 옥사이드의 층을 포함할 수도 있다. 어떤 실시형태들에서, 유전체 층은 실리콘 옥사이드 (silicon oxide) 또는 나이트라이드 (nitride) 와 같은, 금속 옥사이드 이외의 유전체 재료를 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께에 관계 없이, 유전체 층은 약 10 kOhm 내지 약 50 kOhm 의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 영역/챔버 (202) 를 향해 내측으로 대면하는 유전체 층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어, 플루오르화된 탄소 분자들을 포함할 수 있다. 플루오르화된 탄소 분자들의 예들은 폴리테트라플루오로에틸렌 (예컨대, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸레닐-퍼플루오로테트라히드로푸란) (예컨대, CYTOP™) 과 같은 퍼플루오로-폴리머들을 포함한다. 소수성 재료를 구성하는 분자들은 유전체 층의 표면에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자들은 실록산 기, 포스폰산 기, 또는 티올 기와 같은 연결자 (linker) 에 의해 유전체 층의 표면에 공유 결합될 수 있다. 이에 따라, 일부 실시형태들에서, 소수성 재료는 알킬-종단된 실록산, 알킬-종단 포스폰산, 또는 알킬-종단된 티올을 포함할 수 있다. 알킬 기는 (예컨대, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 16, 18, 20, 22, 또는 그 초과하는 탄소들의 사슬을 가지는) 긴-사슬 (long-chain) 탄화수소들일 수 있다. 대안적으로, 플루오르화된 (또는 퍼플루오르화된) 탄소 사슬들은 알킬 기들 대신에 이용될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-종단된 실록산, 플루오로알킬-종단된 포스폰산, 또는 플루오로알킬-종단된 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 가진다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅은 10 nm 미만 (예컨대, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 nm 내지 3.0 nm) 의 두께를 가진다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 가지는 미세유체 디바이스 (200) 의 커버 (110) 는 소수성 재료 (도시되지 않음) 로 마찬가지로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조체 (104) 의 유전체 층을 코팅하기 위하여 이용된 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅은 지지 구조체 (104) 의 유전체 층 상의 소수성 코팅의 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 또한, 커버 (110) 는 지지 구조체 (104) 의 방식으로, 유전체 층과 상단 전극 (210) 사이에서 끼워진 전극 활성화 기판 (206) 을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 및 커버 (110) 의 유전체 층은 전극 활성화 기판 (206) 및 지지 구조체 (104) 의 유전체 층과 동일한 조성 및/또는 치수들을 가질 수 있다. 이에 따라, 미세유체 디바이스 (200) 는 2 개의 전기습윤 표면들을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 위에서 설명된 바와 같은 광전도성 재료를 포함할 수 있다. 따라서, 어떤 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화된 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함할 수 있거나, 수소화된 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층으로 구성될 수 있다. a-Si:H 는 예를 들어, (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 실리콘 (silicon) 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8 % 내지 40 % 의 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 μm 의 두께를 가질 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 위에서 설명된 바와 같이, 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예컨대, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 가지는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에서 알려져 있고, 및/또는 당해 분야에서 알려진 전극 활성화 기판들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용들이 참조로 본원에 편입되는 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등) 는 a-Si:H 와 같은 광전도성 재료를 가지는 광-전기습윤 구성들을 개시하는 반면, 위에서 참조된 미국 특허 공개 제 2014/0124370 호 (Short 등) 는 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 가지는 전극 활성화 기판들을 개시한다.
미세유체 디바이스 (200) 는 이에 따라, 광-전기습윤 구성을 가질 수 있고, 광 패턴들 (218) 은 전극 활성화 기판 (206) 에서 광전도성 EW 영역들 또는 광응답성 EW 전극들을 활성화하기 위하여 이용될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 의 이러한 활성화된 EW 영역들 또는 EW 전극들은 지지 구조체 (104) 의 내부 표면 (208) (즉, 위에 놓이는 유전체 층 또는 그 소수성 코팅의 내부 표면) 에서 전기습윤 힘을 생성할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 상에 입사한 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 (또는 광원 (216) 에 대하여 미세유체 디바이스 (200) 를 이동시킴으로써), 지지 구조체 (104) 의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 (예컨대, 수성 매질, 용액, 또는 용매를 함유하는) 액적들은 영역/챔버 (202) 에서 존재하는 비혼합 유체 (예컨대, 오일 매질) 를 통해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스들 (200) 은 EWOD 구성을 가질 수 있고, 전극 활성화 기판 (206) 은 활성화를 위하여 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능하고 급전가능한 전극들을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 이에 따라, 이러한 전기습윤 (EW) 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은 예를 들어, 도 2b 에서 도시된 바와 같은, 행들 및 열들로 배열된 실질적으로 정사각형의 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형의 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계 없이, EW 전극들은 전기적 스위치들 (예컨대, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 에 의해 선택적으로 활성화 (또는 비활성화) 될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 에서의 EW 전극들을 선택적으로 활성화하고 비활성화함으로써, 위에 놓이는 유전체 층 또는 그 소수성 코팅의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 액적들 (도시되지 않음) 은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 기동 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어할 수 있고, 이에 따라, 영역/챔버 (202) 주위의 특정한 액적들을 선택하고 이동시키기 위하여 개별적인 EW 전극들을 활성화할 수 있고 비활성화할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능하고 급전가능한 전극들을 갖는 EWOD 구성을 가지는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 제 8,685,344 호 (Sundarsan 등) 에서 설명되었고, 그 전체 내용들은 참조로 본원에 편입된다.
미세유체 디바이스 (200) 의 구성에 관계 없이, 전원 (212) 은 미세유체 디바이스 (200) 의 전기적 회로들에 전력을 공급하는 전위 (예컨대, AC 전압 전위) 를 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 전원 (212) 은 도 1 에서 참조된 전원 (192) 과 동일할 수 있거나, 또는 전원 (192) 의 컴포넌트일 수 있다. 전원 (212) 은 AC 전압 및/또는 전류를 상단 전극 (210) 및 하단 전극 (204) 에 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압에 대하여, 전원 (212) 은 위에서 논의된 바와 같이, 영역/챔버 (202) 에서 개별적인 미세-객체들 (도시되지 않음) 을 트래핑하고 이동시키고 및/또는 위에서 또한 논의된 바와 같이, 영역/챔버 (202) 에서 지지 구조체 (104) (즉, 유전체 층 및/또는 유전체 층 상의 소수성 코팅) 의 내부 표면 (208) 의 습윤 성질들을 변경하기에 충분히 강한 순 DEP 힘들 (또는 전기습윤 힘들) 을 생성하기 위하여 충분한 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력 (예컨대, 전압 또는 전류) 범위를 제공할 수 있다. 이러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 당해 분야에서 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711 호 (Wu 등)(미국 특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨), 및 미국 특허 출원 공개 제 US2014/0124370 호 (Short 등), 제 US2015/0306598 호 (Khandros 등), 및 제 US2015/0306599 호 (Khandros 등) 을 참조한다.
시퀘스트레이션 펜들. 일반적인 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 및 228) 의 비-제한적인 예들은 도 2a 내지 도 2c 에서 도시된 미세유체 디바이스 (230) 내에서 도시된다. 각각의 시퀘스트레이션 펜 (224, 226, 및 228) 은 격리 영역 (240), 및 격리 영역 (240) 을 채널 (122) 에 유체적으로 접속시키는 접속 영역 (236) 을 정의하는 격리 구조체 (232) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은 미세유체 채널 (122) 로의 근위 개구부 (234) 및 격리 영역 (240) 으로의 원위 개구부 (238) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 시퀘스트레이션 펜 (224, 226, 228) 내로 유동하는 유체 매질 (도시되지 않음) 의 유동의 최대 침투 깊이가 격리 영역 (240) 내로 연장되지 않도록 구성될 수 있다. 이에 따라, 접속 영역 (236) 으로 인해, 시퀘스트레이션 펜 (224, 226, 228) 의 격리 영역 (240) 에서 배치된 미세-객체 (도시되지 않음) 또는 다른 재료 (도시되지 않음) 는 이에 따라, 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동으로부터 격리될 수 있고, 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동에 의해 실질적으로 이에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2a 내지 도 2c 의 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 및 228) 은 각각 미세유체 채널 (122) 로 직접적으로 개방되는 단일의 개구부를 가진다. 시퀘스트레이션 펜의 개구부는 미세유체 채널 (122) 로부터 횡방향으로 개방된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 양자의 미세유체 채널 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 및 228) 의 아래에 놓인다. 시퀘스트레이션 펜의 바닥을 형성하는, 시퀘스트레이션 펜의 인클로저 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면은 미세유체 디바이스의 유동 채널 (또는 각각 유동 영역) 의 바닥을 형성하는, 미세유체 채널 (122) (또는 채널이 존재하지 않을 경우에 유동 영역) 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면의 동일한 레벨 또는 실질적으로 동일한 레벨에서 배치된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 특징부가 없을 수도 있거나, 약 3 마이크론, 2.5 마이크론, 2 마이크론, 1.5 마이크론, 1 마이크론, 0.9 마이크론, 0.5 마이크론, 0.4 마이크론, 0.2 마이크론, 0.1 마이크론, 또는 그 미만의 것보다 더 작은 것만큼 그 최고 융기 (elevation) 로부터 그 최저 침하 (depression) 까지 변동되는 불규칙적인 또는 패턴화된 표면을 가질 수도 있다. 양자의 미세유체 채널 (122) (또는 유동 영역) 및 시퀘스트레이션 펜들을 가로지르는 기판의 상부 표면에서의 융기의 변동은 시퀘스트레이션 펜의 벽들 또는 미세유체 디바이스의 벽들의 높이의 약 3 %, 2 %, 1 %, 0.9 %, 0.8 %, 0.5 %, 0.3 %, 또는 0.1 % 미만일 수도 있다. 미세유체 디바이스 (200) 에 대하여 상세하게 설명되었지만, 이것은 또한, 본원에서 설명된 미세유체 디바이스들 (100, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 450, 500, 700) 중의 임의의 것에 적용된다.
미세유체 채널 (122) 은 이에 따라, 스윕된 영역의 예일 수 있고, 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 228) 의 격리 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 영역들의 예들일 수 있다. 언급된 바와 같이, 미세유체 채널 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 228) 은 하나 이상의 유체 매질들 (180) 을 함유하도록 구성될 수 있다. 도 2a 내지 도 2b 에서 도시된 예에서, 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 에 접속되고, 유체 매질 (180) 이 미세유체 디바이스 (230) 로 도입되거나 미세유체 디바이스 (230) 로부터 제거되는 것을 허용한다. 유체 매질 (180) 의 도입 이전에, 미세유체 디바이스는 이산화탄소 기체와 같은 기체로 프라이밍 (prime) 될 수도 있다. 일단 미세유체 디바이스 (230) 가 유체 매질 (180) 을 함유하면, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 은 선택적으로 생성될 수 있고 정지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이, 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 의 상이한 로케이션들 (예컨대, 반대 단부들) 에서 배치될 수 있고, 매질의 유동 (242) 은 유입구로서 기능하는 하나의 포트 (222) 로부터 유출구으로서 기능하는 또 다른 포트 (222) 로 생성될 수 있다.
도 2c 는 본 개시에 따른 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 예의 상세한 도면을 예시한다. 미세-객체들 (246) 의 예들이 또한 도시된다.
알려진 바와 같이, 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 근위 개구부 (234) 를 지난 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 은 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 내부 및/또는 외부로의 매질 (180) 의 이차적인 유동 (244) 을 야기시킬 수 있다. 이차적인 유동 (244) 으로부터 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 격리 영역 (240) 에서의 미세-객체들 (246) 을 격리시키기 위하여, (즉, 근위 개구부 (234) 로부터 원위 개구부 (238) 로의) 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 접속 영역 (236) 의 길이 Lcon 는 접속 영역 (236) 으로의 이차적인 유동 (244) 의 침투 깊이 Dp 보다 더 커야 한다. 이차적인 유동 (244) 의 침투 깊이 Dp 는 미세유체 채널 (122) 에서 유동하는 유체 매질 (180) 의 속도 (velocity) 와, 미세유체 채널 (122) 및 미세유체 채널 (122) 로의 접속 영역 (236) 의 근위 개구부 (234) 의 구성에 관련되는 다양한 파라미터들에 종속된다. 소정의 미세유체 디바이스에 대하여, 미세유체 채널 (122) 및 개구부 (234) 의 구성들은 고정될 것인데 반해, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 의 레이트는 가변적일 것이다. 따라서, 각각의 시퀘스트레이션 펜 (224) 에 대하여, 이차적인 유동 (244) 의 침투 깊이 Dp 가 접속 영역 (236) 의 길이 Lcon 를 초과하지 않는다는 것을 보장하는, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 에 대한 최대 속도 Vmax 가 식별될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 의 레이트가 최대 속도 Vmax 를 초과하지 않는 한, 결과적인 이차적인 유동 (244) 은 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역 (236) 으로 제한될 수 있고, 격리 영역 (240) 의 외부에서 유지될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 은 이에 따라, 미세-객체들 (246) 을 격리 영역 (240) 의 외부로 인출하지 않을 것이다. 오히려, 격리 영역 (240) 에서 위치된 미세-객체들 (246) 은 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 에 관계 없이, 격리 영역 (240) 에서 머무를 것이다.
또한, 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 의 레이트가 Vmax 를 초과하지 않는 한, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 격리 영역 (240) 으로 잡다한 입자들 (예컨대, 미세입자들 및/또는 나노입자들) 을 이동시키지 않을 것이다. 접속 영역 (236) 의 길이 Lcon 가 이차적인 유동 (244) 의 최대 침투 깊이 Dp 보다 더 크게 하는 것은 이에 따라, 미세유체 채널 (122) 또는 또 다른 시퀘스트레이션 펜 (예컨대, 도 2d 에서의 시퀘스트레이션 펜들 (226, 228)) 로부터의 잡다한 입자들에 의한 하나의 시퀘스트레이션 펜 (224) 의 오염을 방지할 수 있다.
미세유체 채널 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 228) 의 접속 영역들 (236) 이 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역들 (236) 은 미세유체 디바이스 (230) 의 스윕된 (또는 유동) 영역들로 간주될 수 있다. 한편으로, 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 228) 의 격리 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 (또는 비-유동) 영역들로 간주될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 유체 매질 (180) 에서의 컴포넌트들 (도시되지 않음) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 격리 영역 (240) 에서의 제 2 유체 매질 (248) 로의 제 1 매질 (180) 의 컴포넌트들의 확산에 의해 오직 실질적으로, 격리 영역 (240) 에서의 제 2 유체 매질 (248) 과 혼합할 수 있다. 유사하게, 격리 영역 (240) 에서의 제 2 매질 (248) 의 컴포넌트들 (도시되지 않음) 은 격리 영역 (240) 으로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 매질 (180) 로의 제 2 매질 (248) 의 컴포넌트들의 확산에 의해 오직 실질적으로, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 매질 (180) 과 혼합할 수 있다. 일부 실시형태들에서는, 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역과 확산에 의한 유동 영역 사이의 유체 매질 교환의 한도는 유체 교환의 약 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 보다 더 크거나, 약 99 % 보다 더 크다. 제 1 매질 (180) 은 제 2 매질 (248) 과 동일한 매질 또는 상이한 매질일 수 있다. 또한, 제 1 매질 (180) 및 제 2 매질 (248) 는 동일하게 시작할 수 있고, 그 다음으로, (예컨대, 격리 영역 (240) 에서의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 매질 (248) 의 조절을 통해, 또는 미세유체 채널 (122) 을 통해 유동하는 매질 (180) 을 변경함으로써) 상이해질 수 있다.
미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 에 의해 야기된 이차적인 유동 (244) 의 최대 침투 깊이 Dp 는 위에서 언급된 바와 같이, 다수의 파라미터들에 종속될 수 있다. 이러한 파라미터들의 예들은: 미세유체 채널 (122) 의 형상 (예컨대, 채널은 매질을 접속 영역 (236) 으로 지향시킬 수 있거나, 매질을 접속 영역 (236) 으로부터 떨어져서 전환시킬 수 있거나, 매질을 미세유체 채널 (122) 로의 접속 영역 (236) 의 근위 개구부 (234) 에 대해 실질적으로 수직인 방향으로 지향시킬 수 있음); 근위 개구부 (234) 에서의 미세유체 채널 (122) 의 폭 Wch (또는 단면적); 및 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon (또는 단면적); 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 의 속도 V; 제 1 매질 (180) 및/또는 제 2 매질 (248) 의 점성 (viscosity), 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 채널 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 228) 의 치수들은 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 의 벡터에 대하여 다음과 같이 배향될 수 있다: 미세유체 채널 폭 Wch (또는 미세유체 채널 (122) 의 단면적) 은 매질 (180) 의 유동 (242) 에 대해 실질적으로 수직일 수 있고; 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon (또는 단면적) 은 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 에 대해 실질적으로 평행할 수 있고; 및/또는 접속 영역의 길이 Lcon 는 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 에 대해 실질적으로 수직일 수 있다. 상기한 것은 오직 예들이고, 미세유체 채널 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (224, 226, 228) 의 상대적인 위치는 서로에 대하여 다른 배향들로 되어 있을 수 있다.
도 2c 에서 예시된 바와 같이, 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 은 근위 개구부 (234) 로부터 원위 개구부 (238) 까지 균일할 수 있다. 원위 개구부 (238) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 은 이에 따라, 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 에 대하여 본원에서 식별된 범위들 중의 임의의 것에서 있을 수 있다. 대안적으로, 원위 개구부 (238) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 은 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 보다 더 클 수 있다.
도 2c 에서 예시된 바와 같이, 원위 개구부 (238) 에서의 격리 영역 (240) 의 폭은 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 과 실질적으로 동일할 수 있다. 원위 개구부 (238) 에서의 격리 영역 (240) 의 폭은 이에 따라, 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 에 대하여 본원에서 식별된 범위들 중의 임의의 것에서 있을 수 있다. 대안적으로, 원위 개구부 (238) 에서의 격리 영역 (240) 의 폭은 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 보다 더 클 수 있거나 또는 더 작을 수 있다. 또한, 원위 개구부 (238) 는 근위 개구부 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 은 근위 개구부 (234) 와 원위 개구부 (238) 사이에서 좁혀질 수도 있다. 예를 들어, 접속 영역 (236) 은 다양한 상이한 기하구조들 (예컨대, 접속 영역을 챔퍼링 (chamfering) 하는 것, 접속 영역을 베벨링 (beveling) 하는 것) 을 이용하여 근위 개구부와 원위 개구부 사이에서 좁혀질 수도 있다. 추가로, 접속 영역 (236) 의 임의의 일부 또는 하위일부는 좁혀질 수도 있다 (예컨대, 근위 개구부 (234) 에 인접한 접속 영역의 부분).
도 2d 내지 도 2f 는 도 1a 의 개개의 미세유체 디바이스 (100), 회로 (132), 및 채널 (134) 의 변형들인, 미세유체 회로 (262) 및 유동 채널들 (264) 을 포함하는 미세유체 디바이스 (250) 의 또 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 미세유체 디바이스 (250) 는 또한, 전술된 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226, 또는 228) 의 추가적인 변형들인 복수의 시퀘스트레이션 펜들 (266) 을 가진다. 특히, 도 2d 내지 도 2f 에서 도시된 디바이스 (250) 의 시퀘스트레이션 펜들 (266) 은 디바이스들 (100, 200, 230, 280, 290, 300) 에서의 전술된 시퀘스트레이션 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226, 또는 228) 중의 임의의 것을 대체할 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 마찬가지로, 미세유체 디바이스 (250) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 또 다른 변형이고, 또한, 전술된 미세유체 디바이스 (100, 200, 230, 280, 290, 300) 뿐만 아니라, 본원에서 설명된 다른 미세유체 시스템 컴포넌트들 중의 임의의 것과 동일하거나 상이한 DEP 구성을 가질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 의 미세유체 디바이스 (250) 는 지지 구조체 (도 2d 내지 도 2f 에서 가시적이지 않지만, 도 1a 에서 도시된 디바이스 (100) 의 지지 구조체 (104) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음), 미세유체 회로 구조체 (256), 및 커버 (도 2d 내지 2f 에서 가시적이지 않지만, 도 1a 에서 도시된 디바이스 (100) 의 커버 (122) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음) 를 포함한다. 미세유체 회로 구조체 (256) 는 도 1a 에서 도시된 디바이스 (100) 의 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 를 포함한다. 도 2d 에서 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 재료 (260) 에 의해 정의된 미세유체 회로 (262) 는 다수의 시퀘스트레이션 펜들 (266) 이 유체적으로 접속되는 다수의 채널들 (264) (2 개가 도시되지만 더 많이 있을 수 있음) 을 포함할 수 있다.
각각의 시퀘스트레이션 펜 (266) 은 격리 구조체 (272), 격리 구조체 (272) 내의 격리 영역 (270), 및 접속 영역 (268) 을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 (264) 에서의 근위 개구부 (274) 로부터 격리 구조체 (272) 에서의 원위 개구부 (276) 까지, 접속 영역 (268) 은 미세유체 채널 (264) 을 격리 영역 (270) 에 유체적으로 접속시킨다. 일반적으로, 도 2b 및 도 2c 의 상기 논의에 따르면, 채널 (264) 에서의 제 1 유체 매질 (254) 의 유동 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 시퀘스트레이션 펜들 (266) 의 개개의 접속 영역들 (268) 내로 및/또는 외부로의 제 1 매질 (254) 의 이차적인 유동들 (282) 을 생성할 수 있다.
도 2e 에서 예시된 바와 같이, 각각의 시퀘스트레이션 펜 (266) 의 접속 영역 (268) 은 일반적으로, 채널 (264) 로의 근위 개구부 (274) 와 격리 구조체 (272) 로의 원위 개구부 (276) 사이에서 연장되는 에어리어를 포함한다. 접속 영역 (268) 의 길이 Lcon 는 이차적인 유동 (282) 의 최대 침투 깊이 Dp 보다 더 클 수 있고, 이 경우, 이차적인 유동 (282) 은 (도 2d 에서 도시된 바와 같이) 격리 영역 (270) 을 향해 재지향되지 않으면서, 접속 영역 (268) 으로 연장될 것이다. 대안적으로, 도 2f 에서 예시된 바와 같이, 접속 영역 (268) 은 최대 침투 깊이 Dp 보다 더 작은 길이 Lcon 를 가질 수 있고, 이 경우, 이차적인 유동 (282) 은 접속 영역 (268) 을 통해 연장될 것이고 격리 영역 (270) 을 향해 재지향될 것이다. 이 후자의 상황에서, 접속 영역 (268) 의 길이들 Lc1 및 Lc2 의 합은 최대 침투 깊이 Dp 보다 더 커서, 이차적인 유동 (282) 은 격리 영역 (270) 으로 연장되지 않을 것이다. 접속 영역 (268) 의 길이 Lcon 가 침투 깊이 Dp 보다 더 크거나, 접속 영역 (268) 의 길이들 Lc1 및 Lc2 의 합이 침투 깊이 Dp 보다 더 크든지 간에, 최대 속도 Vmax 를 초과하지 않는 채널 (264) 에서의 제 1 매질 (254) 의 유동 (278) 은 침투 깊이 Dp 를 가지는 이차적인 유동을 생성할 것이고, 시퀘스트레이션 펜 (266) 의 격리 영역 (270) 에서의 미세-객체들 (도시되지 않지만, 도 2c 에서 도시된 미세-객체들 (246) 과 동일할 수 있거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음) 은 채널 (264) 에서의 제 1 매질 (254) 의 유동 (278) 에 의해 격리 영역 (270) 의 외부로 인출되지 않을 것이다. 채널 (264) 에서의 유동 (278) 도 채널 (264) 로부터 시퀘스트레이션 펜 (266) 의 격리 영역 (270) 으로 잡다한 재료들 (도시되지 않음) 을 인출하지 않을 것이다. 이와 같이, 확산은 미세유체 채널 (264) 에서의 제 1 매질 (254) 에서의 컴포넌트들이 미세유체 채널 (264) 로부터 시퀘스트레이션 펜 (266) 의 격리 영역 (270) 에서의 제 2 매질 (258) 로 이동할 수 있게 하는 유일한 메커니즘이다. 마찬가지로, 확산은 시퀘스트레이션 펜 (266) 의 격리 영역 (270) 에서의 제 2 매질 (258) 에서의 컴포넌트들이 격리 영역 (270) 으로부터 미세유체 채널 (264) 에서의 제 1 매질 (254) 로 이동할 수 있게 하는 유일한 메커니즘이다. 제 1 매질 (254) 은 제 2 매질 (258) 과 동일한 매질일 수 있거나, 제 1 매질 (254) 은 제 2 매질 (258) 과 상이한 매질일 수 있다. 대안적으로, 제 1 매질 (254) 및 제 2 매질 (258) 은 동일하게 시작할 수 있고, 그 다음으로, 예컨대, 격리 영역 (270) 에서의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 매질의 조절을 통해, 또는 미세유체 채널 (264) 을 통해 유동하는 매질을 변경함으로써 상이해질 수 있다.
도 2e 에서 예시된 바와 같이, 미세유체 채널 (264) 에서의 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (278) 에 의해 표시된 미세유체 채널을 통한 유체 매질 유동의 방향을 횡단하여 취해진) 미세유체 채널들 (264) 의 폭 Wch 은 근위 개구부 (274) 의 폭 Wcon1 에 대해 실질적으로 수직일 수 있고, 이에 따라, 원위 개구부 (276) 의 폭 Wcon2 에 대해 실질적으로 평행할 수 있다. 그러나, 근위 개구부 (274) 의 폭 Wcon1 및 원위 개구부 (276) 의 폭 Wcon2 은 서로에 대해 실질적으로 수직일 필요가 없다. 예를 들어, 근위 개구부 (274) 의 폭 Wcon1 이 배향되는 축 (도시되지 않음) 과 원위 개구부 (276) 의 폭 Wcon2 이 배향되는 또 다른 축 사이의 각도는 수직이 아닐 수 있고, 이에 따라, 90° 가 아닐 수 있다. 대안적으로 배향된 각도들의 예들은 다음의 범위들 중의 임의의 것에서의 각도들을 포함한다: 약 30° 로부터 약 90° 까지, 약 45° 로부터 약 90° 까지, 약 60° 로부터 약 90° 까지, 등.
시퀘스트레이션 펜들 (예컨대, 124, 126, 128, 130, 224, 226, 228, 또는 266) 의 다양한 실시형태들에서, 격리 영역 (예컨대, 240 또는 270) 은 복수의 미세-객체들을 함유하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 격리 영역은 오직 1, 2, 3, 4, 5, 또는 유사한 상대적으로 작은 수의 미세-객체들을 함유하도록 구성될 수 있다. 따라서, 격리 영역의 체적은 예를 들어, 적어도 1x106, 2x106, 4x106, 6x106 세제곱 마이크론, 또는 그 초과일 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 미세유체 채널 (예컨대, 122) 의 폭 Wch 은 다음의 범위들 중의 임의의 것 내에 있을 수 있다: 50 내지 1000 마이크론, 50 내지 500 마이크론, 50 내지 400 마이크론, 50 내지 300 마이크론, 50 내지 250 마이크론, 50 내지 200 마이크론, 50 내지 150 마이크론, 50 내지 100 마이크론, 70 내지 500 마이크론, 70 내지 400 마이크론, 70 내지 300 마이크론, 70 내지 250 마이크론, 70 내지 200 마이크론, 70 내지 150 마이크론, 90 내지 400 마이크론, 90 내지 300 마이크론, 90 내지 250 마이크론, 90 내지 200 마이크론, 90 내지 150 마이크론, 100 내지 300 마이크론, 100 내지 250 마이크론, 100 내지 200 마이크론, 100 내지 150 마이크론, 및 100 내지 120 마이크론. 일부 다른 실시형태들에서, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 미세유체 채널 (예컨대, 122) 의 폭 Wch 은 약 200 내지 800 마이크론, 200 내지 700 마이크론, 또는 200 내지 600 마이크론에 있을 수 있다. 상기한 것은 오직 예들이고, 미세유체 채널 (122) 의 폭 Wch 은 다른 범위들 (예컨대, 위에서 열거된 종점들 중의 임의의 것에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 또한, 미세유체 채널 (122) 의 폭 Wch 은 시퀘스트레이션 펜의 근위 개구부에서 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이 범위들 중의 임의의 것에 있도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 시퀘스트레이션 펜은 약 30 내지 약 200 마이크론, 또는 약 50 내지약 150 마이크론의 높이를 가진다. 일부 실시형태들에서, 시퀘스트레이션 펜은 약 1x104 내지 3x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 2x106 제곱 마이크론, 4x104 내지 1x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 5x105 제곱 마이크론, 2x104 내지 1x105 제곱 마이크론, 또는 약 2x105 내지 2x106 제곱 마이크론의 단면적을 가진다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 미세유체 채널 (예컨대, 122) 의 높이 Hch 는 다음의 범위들 중의 임의의 것 내에 있을 수 있다: 20 내지 100 마이크론, 20 내지 90 마이크론, 20 내지 80 마이크론, 20 내지 70 마이크론, 20 내지 60 마이크론, 20 내지 50 마이크론, 30 내지 100 마이크론, 30 내지 90 마이크론, 30 내지 80 마이크론, 30 내지 70 마이크론, 30 내지 60 마이크론, 30 내지 50 마이크론, 40 내지 100 마이크론, 40 내지 90 마이크론, 40 내지 80 마이크론, 40 내지 70 마이크론, 40 내지 60 마이크론, 또는 40 내지 50 마이크론. 상기한 것은 오직 예들이고, 미세유체 채널 (예컨대, 122) 의 높이 Hch 는 다른 범위들 (예컨대, 위에서 열거된 종점들 중의 임의의 것에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 미세유체 채널 (122) 의 높이 Hch 는 시퀘스트레이션 펜의 근위 개구부에서 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이 범위들 중의 임의의 것에 있도록 선택될 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 미세유체 채널 (예컨대, 122) 의 단면적은 다음의 범위들 중의 임의의 것 내에 있을 수 있다: 500 내지 50,000 제곱 마이크론, 500 내지 40,000 제곱 마이크론, 500 내지 30,000 제곱 마이크론, 500 내지 25,000 제곱 마이크론, 500 내지 20,000 제곱 마이크론, 500 내지 15,000 제곱 마이크론, 500 내지 10,000 제곱 마이크론, 500 내지 7,500 제곱 마이크론, 500 내지 5,000 제곱 마이크론, 1,000 내지 25,000 제곱 마이크론, 1,000 내지 20,000 제곱 마이크론, 1,000 내지 15,000 제곱 마이크론, 1,000 내지 10,000 제곱 마이크론, 1,000 내지 7,500 제곱 마이크론, 1,000 내지 5,000 제곱 마이크론, 2,000 내지 20,000 제곱 마이크론, 2,000 내지 15,000 제곱 마이크론, 2,000 내지 10,000 제곱 마이크론, 2,000 내지 7,500 제곱 마이크론, 2,000 내지 6,000 제곱 마이크론, 3,000 내지 20,000 제곱 마이크론, 3,000 내지 15,000 제곱 마이크론, 3,000 내지 10,000 제곱 마이크론, 3,000 내지 7,500 제곱 마이크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 마이크론. 상기한 것은 오직 예들이고, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 미세유체 채널 (예컨대, 122) 의 단면적은 다른 범위들 (예컨대, 위에서 열거된 종점들 중의 임의의 것에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역 (예컨대, 236) 의 길이 Lcon 는 다음의 범위들 중의 임의의 것에 있을 수 있다: 약 1 내지 600 마이크론, 5 내지 550 마이크론, 10 내지 500 마이크론, 15 내지 400 마이크론, 20 내지 300 마이크론, 20 내지 500 마이크론, 40 내지 400 마이크론, 60 내지 300 마이크론, 80 내지 200 마이크론, 또는 약 100 내지 150 마이크론. 상기한 것은 오직 예들이고, 접속 영역 (예컨대, 236) 의 길이 Lcon 는 상기한 예들과 상이한 범위 (예컨대, 위에서 열거된 종점들 중의 임의의 것에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 접속 영역 (예컨대, 236) 의 폭 Wcon 은 다음의 범위들 중의 임의의 것에 있을 수 있다: 20 내지 500 마이크론, 20 내지 400 마이크론, 20 내지 300 마이크론, 20 내지 200 마이크론, 20 내지 150 마이크론, 20 내지 100 마이크론, 20 내지 80 마이크론, 20 내지 60 마이크론, 30 내지 400 마이크론, 30 내지 300 마이크론, 30 내지 200 마이크론, 30 내지 150 마이크론, 30 내지 100 마이크론, 30 내지 80 마이크론, 30 내지 60 마이크론, 40 내지 300 마이크론, 40 내지 200 마이크론, 40 내지 150 마이크론, 40 내지 100 마이크론, 40 내지 80 마이크론, 40 내지 60 마이크론, 50 내지 250 마이크론, 50 내지 200 마이크론, 50 내지 150 마이크론, 50 내지 100 마이크론, 50 내지 80 마이크론, 60 내지 200 마이크론, 60 내지 150 마이크론, 60 내지 100 마이크론, 60 내지 80 마이크론, 70 내지 150 마이크론, 70 내지 100 마이크론, 및 80 내지 100 마이크론. 상기한 것은 오직 예들이고, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 접속 영역 (예컨대, 236) 의 폭 Wcon 은 상기한 예들 (예컨대, 위에서 열거된 종점들 중의 임의의 것에 의해 정의된 범위) 과 상이할 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 접속 영역 (예컨대, 236) 의 폭 Wcon 은 시퀘스트레이션 펜이 의도되는 미세-객체 (예컨대, T 세포, B 세포, 또는 난자일 수도 있는 생물학적 세포) 의 가장 큰 치수만큼 적어도 클 수 있다. 상기한 것은 오직 예들이고, 근위 개구부 (예컨대, 234) 에서의 접속 영역 (예컨대, 236) 의 폭 Wcon 은 상기한 예들 (예컨대, 위에서 열거된 종점들 중의 임의의 것에 의해 정의된 범위) 과 상이할 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역의 근위 개구부의 폭 Wpr 은 시퀘스트레이션 펜이 의도되는 미세-객체 (예컨대, 세포와 같은 생물학적 미세-객체) 의 가장 큰 치수만큼 적어도 클 수도 있다. 예를 들어, 폭 Wpr 은 약 50 마이크론, 약 60 마이크론, 약 100 마이크론, 약 200 마이크론, 약 300 마이크론일 수도 있거나, 약 50 내지 300 마이크론, 약 50 내지 200 마이크론, 약 50 내지 100 마이크론, 약 75 내지 150 마이크론, 약 75 내지 100 마이크론, 또는 약 200 내지 300 마이크론에 있을 수도 있다.
시퀘스트레이션 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (예컨대, 236) 의 폭 Wcon 에 대한 접속 영역 (예컨대, 236) 의 길이 Lcon 의 비율은 다음의 비율들 중의 임의의 것 이상일 수 있다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 또는 그 초과. 상기한 것은 오직 예들이고, 근위 개구부 (234) 에서의 접속 영역 (236) 의 폭 Wcon 에 대한 접속 영역 (236) 의 길이 Lcon 의 비율은 상기한 예들과 상이할 수 있다.
미세유체 디바이스들 (100, 200, 23, 250, 280, 290, 300) 의 다양한 실시형태들에서, Vmax 는 0.2, 0.5, 0.7, 1.3, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.7, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 마이크로리터/초 주위에서 설정될 수 있다.
시퀘스트레이션 펜들을 가지는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역 (예컨대, 240) 의 체적은 예를 들어, 적어도 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106, 8x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 또는 8x108 세제곱 마이크론, 또는 그 초과일 수 있다. 시퀘스트레이션 펜들을 가지는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 시퀘스트레이션 펜의 체적은 약 5x105, 6x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106, 1x107, 3x107, 5x107, 또는 약 8x107 세제곱 마이크론, 또는 그 초과일 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 시퀘스트레이션 펜의 체적은 약 1 나노리터 내지 약 50 나노리터, 2 나노리터 내지 약 25 나노리터, 2 나노리터 내지 약 20 나노리터, 약 2 나노리터 내지 약 15 나노리터, 또는 약 2 나노리터 내지 약 10 나노리터일 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는 본원에서 논의된 실시형태들 중의 임의의 것에서와 같이 구성된 시퀘스트레이션 펜들을 가지고, 여기서, 미세유체 디바이스는 약 5 내지 약 10 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 10 내지 약 50 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 100 내지 약 500 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 200 내지 약 1000 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 500 내지 약 1500 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 1000 내지 약 2000 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 1000 내지 약 3500 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 2500 내지 약 5000 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 3000 내지 약 7000 개의 시퀘스트레이션 펜들, 약 5000 내지 약 10,000 개의 시퀘스트레이션 펜들, 또는 약 8000 내지 약 12,0000 개의 시퀘스트레이션 펜들을 가진다. 시퀘스트레이션 펜들은 모두 동일한 크기일 필요가 없고, 다양한 구성들 (예컨대, 시퀘스트레이션 펜 내의 상이한 폭들의 상이한 특징부들) 을 포함할 수도 있다.
도 2g 는 하나의 실시형태에 따른 미세유체 디바이스 (280) 를 예시한다. 도 2g 에서 예시된 미세유체 디바이스 (280) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 미세유체 디바이스 (280) 및 그 구성 회로 엘리먼트들 (예컨대, 채널들 (122) 및 시퀘스트레이션 펜들 (128)) 은 본원에서 논의된 치수들을 가질 것이다. 도 2g 에서 예시된 미세유체 회로 (120) 는 2 개의 포트들 (107), 4 개의 별개의 채널들 (122), 및 4 개의 별개의 유동 경로들 (106) 을 가진다. 미세유체 디바이스 (280) 는 각각의 채널 (122) 에서 개방되는 복수의 시퀘스트레이션 펜들을 더 포함한다. 도 2g 에서 예시된 미세유체 디바이스에서, 시퀘스트레이션 펜들은 도 2c 에서 예시된 펜들과 유사한 기하구조를 가지고, 이에 따라, 양자의 접속 영역들 및 격리 영역들을 가진다. 따라서, 미세유체 회로 (120) 는 양자의 스윕된 영역들 (예컨대, 채널들 (122) 및 이차적인 유동 (244) 의 최대 침투 깊이 Dp 내의 접속 영역들 (236) 의 부분들) 및 비-스윕된 영역들 (예컨대, 격리 영역들 (240) 및 이차적인 유동 (244) 의 최대 침투 깊이 Dp 내에 있지 않은 접속 영역들 (236) 의 부분들) 을 포함한다.
도 3a 내지 도 3b 는 본 개시에 따른 미세유체 디바이스들 (예컨대, 100, 200, 230, 250, 280, 290, 300) 을 동작시키고 관찰하기 위하여 이용될 수 있는 시스템 (150) 의 다양한 실시형태들을 도시한다. 도 3a 에서 예시된 바와 같이, 시스템 (150) 은 미세유체 디바이스 (100) (도시되지 않음), 또는 본원에서 설명된 임의의 다른 미세유체 디바이스를 홀딩하도록 구성된 구조체 ("네스트 (nest)") (300) 를 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 미세유체 디바이스 (320) (예컨대, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (100)) 와 인터페이싱할 수 있고 전원 (192) 으로부터 미세유체 디바이스 (320) 로의 전기적 접속들을 제공할 수 있는 소켓 (302) 을 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 집적된 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 더 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 바이어싱 전압이 미세유체 디바이스가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되고 있을 때에 미세유체 디바이스 (320) 에서의 한 쌍의 전극들을 가로질러서 인가되도록, 바이어싱 전압을 소켓 (302) 에 공급하도록 구성될 수 있다. 이에 따라, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 전원 (192) 의 일부일 수 있다. 바이어싱 전압을 미세유체 디바이스 (320) 에 인가하기 위한 능력은 바이어싱 전압이 미세유체 디바이스 (320) 가 소켓 (302) 에 의해 홀딩될 때에 항상 인가될 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 오히려, 대부분의 경우들에는, 바이어싱 전압이 간헐적으로, 예컨대, 미세유체 디바이스 (320) 에서 유전영동 또는 전기습윤과 같은 동전기력들의 생성을 용이하게 하기 위하여 오직 필요할 때에 인가될 것이다.
도 3a 에서 예시된 바와 같이, 네스트 (300) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA) (322) 를 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 PCBA (322) 상에 장착될 수 있고 PCBA (322) 내로 전기적으로 집적될 수 있다. 예시적인 지지체는 마찬가지로, PCBA (322) 상에 장착된 소켓 (302) 을 포함한다.
전형적으로, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기 (도시되지 않음) 를 포함할 것이다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 오실로스코프 (도시되지 않음) 및/또는 파형 증폭 회로 (도시되지 않음) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는 존재할 경우, 소켓 (302) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 에 공급된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 어떤 실시형태들에서, 오실로스코프는 미세유체 디바이스 (320) 에 대한 근위부 (그리고 파형 생성기에 대한 원위부) 인 로케이션에서 파형을 측정하고, 이에 따라, 디바이스에 실제적으로 인가된 파형을 측정할 시에 더 큰 정확도를 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 획득된 데이터는 예를 들어, 파형 생성기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 생성기는 이러한 피드백에 기초하여 그 출력을 조절하도록 구성될 수 있다. 적당한 조합된 파형 생성기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™ 이다.
어떤 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 감지하고 및/또는 제어하기 위하여 이용된 마이크로프로세서와 같은 제어기 (308) 를 더 포함한다. 적당한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino Nano™ 와 같은 Arduino™ 마이크로프로세서들을 포함한다. 제어기 (308) 는 기능들 및 분석을 수행하기 위하여 이용될 수도 있거나, 기능들 및 분석을 수행하기 위하여 (도 1a 에서 도시된) 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수도 있다. 도 3a 에서 예시된 실시형태에서, 제어기 (308) 는 인터페이스 (310) (예컨대, 플러그 또는 커넥터) 를 통해 마스터 제어기 (154) 와 통신한다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 Red Pitaya™ 파형 생성기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 생성된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 미세유체 디바이스 (100) 로 전달하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 미세유체 디바이스 (320) 에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 다음으로, 미세유체 디바이스 (320) 에서의 측정된 전압이 희망된 값이 되도록, 필요할 때에 그 자신의 출력 전압을 조절하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는 PCBA (322) 상에 장착된 한 쌍의 DC-DC 컨버터들에 의해 생성된 +6.5 V 내지 -6.5 V 전력 공급을 가질 수 있어서, 미세유체 디바이스 (100) 에서 최대 13 Vpp 의 신호로 귀착될 수 있다.
도 3a 에서 예시된 바와 같이, 지지 구조체 (300) (예컨대, 네스트) 는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 지지 구조체 (300) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306) 은 펠티어 (Peltier) 열전기 디바이스 (도시되지 않음) 및 냉각 유닛 (도시되지 않음) 을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스는 미세유체 디바이스 (320) 의 적어도 하나의 표면과 인터페이싱하도록 구성된 제 1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은 예를 들어, 예컨대 수냉식 (liquid-cooled) 알루미늄 블록과 같은 냉각 블록 (도시되지 않음) 일 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스의 제 2 표면 (예컨대, 제 1 표면의 반대 표면) 은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이싱하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유체 경로 (314) 에 접속될 수 있다. 도 3a 에서 예시된 실시형태에서, 지지 구조체 (300) 는 외부 저장소 (도시되지 않음) 로부터 냉각된 유체를 수용하고, 냉각된 유체를 유체 경로 (314) 로 그리고 냉각 블록을 통해 도입하고, 그 다음으로, 냉각된 유체를 외부 저장소로 복귀시키기 위하여 유입구 (316) 및 유출구 (318) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 디바이스, 냉각 유닛, 및/또는 유체 경로 (314) 는 지지 구조체 (300) 의 케이싱 (340) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 미세유체 디바이스 (320) 를 위한 목표 온도를 달성하기 위하여 펠티어 열전기 디바이스의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 디바이스의 온도 조절은 예를 들어, Pololu™ 열전기 전력 공급 장치 (PololuRobotics and Electronics Corp.) 와 같은 열전기 전력 공급 장치에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안적으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 (예컨대, 저항 1 kOhm+/-0.1 %, 온도 계수 +/-0.02 ppm/C0 를 갖는) 저항기 및 (예컨대, 공칭 저항 1 kOhm+/-0.01 % 를 갖는) NTC 서미스터를 포함하는 아날로그 전압 분배 회로 (도시되지 않음) 인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306) 을 포함할 수 있다. 일부 사례들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 다음으로, 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력으로서 계산된 온도 값을 이용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력은 열전기 전력 공급 장치를 작동시키기 위하여 Pololu™ 모터 드라이브 (도시되지 않음) 상에서 예를 들어, 양자의 방향성 및 펄스-폭-변조된 신호 핀을 구동할 수 있음으로써, 펠티어 열전기 디바이스를 제어할 수 있다.
네스트 (300) 는 제어기 (308) 의 마이크로프로세서가 인터페이스 (310) (도시되지 않음) 를 통해 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324) 를 포함할 수 있다. 게다가, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 과 (예컨대, Plink 툴 (도시되지 않음) 을 통해) 통신할 수 있다. 이에 따라, 제어기 (308), 인터페이스 (310), 및 직렬 포트 (324) 의 조합을 통해, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 은 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수 있다. 이 방식으로, 마스터 제어기 (154) 는 그 중에서도, 출력 전압 조절들을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 보조할 수 있다. 외부 마스터 제어기 (154) 에 결합된 디스플레이 디바이스 (170) 를 통해 제공된 그래픽 사용자 인터페이스 (Graphical User Interface; GUI) (도시되지 않음) 는 각각 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 으로부터 획득된 온도 및 파형 데이터를 도표화하도록 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, GUI 는 제어기 (308), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 에 대한 업데이트들을 허용할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 시스템 (150) 은 이미징 디바이스 (194) 를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 광 조절 서브시스템 (330) (도 3b 참조) 을 포함한다. 광 조절 서브시스템 (330) 은 디지털 미러 디바이스 (digital mirror device; DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (microshutter array system; MSA) 을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332) 으로부터 광을 수광하고 수광된 광의 서브세트를 현미경 (350) 의 광학적 트레인으로 투과하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 광 조절 서브시스템 (330) 은 유기 발광 다이오드 (organic light emitting diode) 디스플레이 (OLED), 액정 온 실리콘 (liquid crystal on silicon; LCOS) 디바이스, 강유전성 액정 온 실리콘 (ferroelectric liquid crystal on silicon; FLCOS) 디바이스, 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 와 같은, 그 자신의 광을 생성하는 (그리고 이에 따라, 광원 (332) 에 대한 필요성을 없애는) 디바이스를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 은 예를 들어, 프로젝터일 수 있다. 이에 따라, 광 조절 서브시스템 (330) 은 양자의 구조화된 및 비구조화된 광을 방출할 수 있다. 어떤 실시형태들에서, 시스템 (150) 의 이미징 모듈 (164) 및/또는 기동 모듈 (162) 은 광 조절 서브시스템 (330) 을 제어할 수 있다.
어떤 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 현미경 (350) 을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350) 은 예를 들어, 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 이에 따라, 네스트 (300) 는 현미경 (350) 의 스테이지 (426) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고, 및/또는 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 포트 상에 장착하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 본원에서 설명된 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 일체형 컴포넌트들일 수 있다.
어떤 실시형태들에서, 현미경 (350) 은 하나 이상의 검출기들 (348) 을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 검출기 (348) 는 이미징 모듈 (164) 에 의해 제어된다. 검출기 (348) 는 아이 피스 (eye piece), 전하-결합 디바이스 (charge-coupled device; CCD), 카메라 (예컨대, 디지털 카메라), 또는 그 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2 개의 검출기들 (348) 이 존재할 경우, 하나의 검출기는 예를 들어, 고속-프레임-레이트 (fast-frame-rate) 카메라일 수 있는 반면, 다른 검출기는 고 감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350) 은 미세유체 디바이스 (320) 로부터 반사된 및/또는 방출된 광을 수광하고, 반사된 및/또는 방출된 광의 적어도 부분을 하나 이상의 검출기들 (348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학적 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학적 트레인은 또한, 상이한 검출기들을 위한 상이한 튜브 렌즈들 (도시되지 않음) 을 포함할 수 있어서, 각각의 검출기 상의 최종적인 배율은 상이할 수 있다.
어떤 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 적어도 2 개의 광원들을 이용하도록 구성된다. 예를 들어, 제 1 광원 (332) 은 (예컨대, 광 조절 서브시스템 (330) 을 통해) 구조화된 광을 생성하기 위하여 이용될 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 제 1 광원 (332) 은 광학적으로-작동된 동전기 및/또는 형광성 여기를 위한 구조화된 광을 생성할 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 밝은 필드 조명을 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 이 실시형태들에서, 기동 모듈 (164) 은 제 1 광원 (332) 을 제어하기 위하여 이용될 수 있고, 이미징 모듈 (164) 은 제 2 광원 (334) 을 제어하기 위하여 이용될 수 있다. 현미경 (350) 의 광학적 트레인은 (1) 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 구조화된 광을 수광하고, 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되고 있을 때, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스와 같은 미세유체 디바이스에서의 적어도 제 1 영역 상에 구조화된 광을 포커싱하고, (2) 미세유체 디바이스로부터 반사된 및/또는 방출된 광을 수광하고 이러한 반사된 및/또는 방출된 광의 적어도 부분을 검출기 (348) 상으로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학적 트레인은 제 2 광원으로부터 비구조화된 광을 수광하고, 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩될 때, 미세유체 디바이스의 적어도 제 2 영역 상에 비구조화된 광을 포커싱하도록 추가로 구성될 수 있다. 어떤 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 제 1 및 제 2 영역들은 중첩하는 영역들일 수 있다. 예를 들어, 제 1 영역은 제 2 영역의 서브세트일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 광의 임의의 적절한 파장을 가질 수도 있는 레이저를 부가적으로 또는 대안적으로 포함할 수도 있다. 도 3b 에 도시된 광학 시스템의 표현은 오직 개략적 표현이고, 광학 시스템은 추가의 필터들, 노치 필터들, 렌즈들 등을 포함할 수도 있다. 제 2 광원 (334) 이 명암 및/또는 형광 여기에 대한 하나 이상의 광원(들) 뿐만 아니라 레이저 조명을 포함 할 때, 광원(들)의 물리적 배열은 도 3b 에 도시된 것과 다를 수도 있으며, 레이저 조명은 광학 시스템 내의 임의의 적절한 물리적 위치에 도입될 수도 있다. 광원 (432) 및 광원 (402)/광 변조 서브 시스템 (404) 의 개략적 인 위치는 또한, 상호 교환될 수도 있다.
도 3b 에서, 제 1 광원 (332) 은 구조화된 광을 시스템 (355) (도시되지 않음) 의 현미경 (355) 의 광학적 트레인에 제공하는 광 조절 서브시스템 (330) 에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 빔 스플리터 (336) 를 통해 광학적 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 구조화된 광 및 제 2 광원 (334) 으로부터의 비구조화된 광은 제 2 빔 스플리터 (424) (또는 광 조절 서브시스템 (330) 에 의해 제공된 광에 따라서는, 이색성 필터 (338)) 에 도달하기 위하여 빔 스플리터 (336) 로부터 광학적 트레인을 통해 함께 이동하고, 여기서 광은 대물렌즈 (336) 를 통해 샘플 평면 (342) 으로 아래로 반사된다. 그 다음으로, 샘플 평면 (342) 으로부터의 반사된 및/또는 방출된 광은 대물렌즈 (340) 를 통해, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (338) 를 통해, 그리고 이색성 필터 (346) 로 다시 위로 이동한다. 이색성 필터 (346) 에 도달하는 광의 오직 부분이 통과하고 검출기 (348) 에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 청색 광을 방출한다. 적절한 이색성 필터 (346) 로, 샘플 평면 (342) 으로부터 반사된 청색 광은 이색성 필터 (346) 를 통과할 수 있고 검출기 (348) 에 도달할 수 있다. 대조적으로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 나오는 구조화된 광은 샘플 평면 (342) 으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346) 를 통과하지는 않는다. 이 예에서, 이색성 필터 (346) 는 495 nm 보다 더 긴 파장을 가지는 가시 광을 필터링하고 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 광의 이러한 필터링은 광 조절 서브시스템으로부터 방출된 광이 495 nm 보다 더 짧은 임의의 파장들을 포함하지 않았을 경우에 (도시된 바와 같이) 완전할 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 나오는 광이 495 nm 보다 더 짧은 파장들 (예컨대, 청색 파장들) 을 포함할 경우, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 검출기 (348) 에 도달하기 위하여 필터 (346) 를 통과할 것이다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346) 는 제 1 광원 (332) 및 제 2 광원 (334) 으로부터 검출기 (348) 에 도달하는 광의 양 사이의 균형을 변경하도록 작동한다. 이것은 제 1 광원 (332) 이 제 2 광원 (334) 보다 상당히 더 강할 경우에 유익할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 적색 광을 방출할 수 있고, 이색성 필터 (346) 는 적색 광 이외의 가시 광 (예컨대, 650 nm 보다 더 짧은 파장을 가지는 가시 광) 을 필터링할 수 있다.
코팅 용액들 및 코팅제들. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않으면서, 미세유체 디바이스 (예컨대, DEP-구성된 및/또는 EW-구성된 미세유체 디바이스) 내에서의 생물학적 미세-객체 (예컨대, 생물학적 세포) 의 유지는, 미세유체 디바이스의 적어도 하나 이상의 내부 표면들이 미세유체 디바이스와 그 안에서 유지된 생물학적 미세-객체 (들) 사이의 일차적인 계면을 제공하는 유기 및/또는 친수성 (hydrophilic) 분자들의 층을 제공하기 위하여 컨디셔닝 (condition) 되었거나 코팅되었을 때에 용이하게 될 수도 있다 (즉, 생물학적 미세-객체는 미세유체 디바이스 내에서 증가된 생존성 (viability), 더 큰 확장, 및/또는 더 큰 이식성 (portability) 을 나타냄). 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 내부 표면들 (예컨대, DEP-구성된 미세유체 디바이스의 전극 활성화 기판의 내부 표면, 미세유체 디바이스의 커버, 및/또는 회로 재료의 표면들) 중의 하나 이상은 유기 및/또는 친수성 분자들의 희망된 층을 생성하기 위하여 코팅 용액 및/또는 코팅제로 처리될 수도 있거나 코팅 용액 및/또는 코팅제에 의해 개질될 수도 있다.
코팅은 생물학적 미세-객체 (들) 의 도입 전 또는 후에 적용될 수도 있거나, 생물학적 미세-객체 (들) 와 동시에 도입될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 미세-객체 (들) 는 하나 이상의 코팅제들을 포함하는 유체 매질에서 미세유체 디바이스로 임포트 (import) 될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (예컨대, DEP-구성된 미세유체 디바이스) 의 내부 표면 (들) 은 미세유체 디바이스로의 생물학적 미세-객체 (들) 의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리 또는 "프라이밍" 된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 표면은 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지 및/또는 확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 (예컨대, 이하에서 설명된 바와 같은 컨디셔닝된 표면을 제공하는) 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면들은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면 (들) 은 유동 영역 (예컨대, 채널), 챔버, 또는 시퀘스트레이션 펜의 표면, 또는 그 조합을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 복수의 시퀘스트레이션 펜들의 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 가진다. 다른 실시형태들에서, 복수의 유동 영역들 또는 채널들의 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 가진다. 일부 실시형태들에서, 복수의 시퀘스트레이션 펜들의 각각 및 복수의 채널들의 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료들로 코팅된다.
코팅제/용액. 혈청 (serum) 또는 혈청 인자, 소혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA), 폴리머들, 세정제 (detergent) 들, 효소 (enzyme) 들, 및 그 임의의 조합을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 이용될 수 있다.
폴리머계 코팅 재료들. 적어도 하나의 내부 표면은 폴리머를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수도 있다. 폴리머는 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 적어도 하나의 표면에 바인딩될 수도 있다 (또는 비-구체적으로 유착 (adhere) 될 수도 있음). 폴리머는 블록 폴리머들 (및 코폴리머들), 스타 폴리머 (star polymer) 들 (스타 코폴리머들), 및 그래프트 (graft) 또는 콤 (comb) 폴리머들 (그래프트 코폴리머들) 에서 발견된 바와 같은 다양한 구조적 모티프들을 가질 수도 있고, 그 전부는 본원에서 개시된 방법들을 위하여 적당할 수도 있다.
폴리머는 알킬렌 에테르 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 광범위한 알킬렌 에테르 함유 폴리머들은 본원에서 설명된 미세유체 디바이스들에서의 이용을 위하여 적당할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 비-제한적인 예시적인 부류는 상이한 비율들 및 폴리머 사슬 내의 로케이션들에서의 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양친매성의 비이온성 블록 코폴리머들이다. Pluronic® 폴리머들 (BASF) 은 이 타입의 블록 코폴리머들이고, 살아 있는 세포들과 접촉할 때의 이용을 위하여 적당한 것으로 당해 분야에서 알려져 있다. 폴리머들은 약 2000 Da 로부터 약 20 KDa 까지의 평균 분자 질량 MW 의 범위일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 보다 큰 (예컨대, 12 내지 18) 친수성-친유성 균형 (hydrophilic-lipophilic balance; HLB) 을 가질 수 있다. 코팅된 표면을 산출하기 위하여 유용한 특정 Pluronic® 폴리머들은 Pluronic® L44, L64, P85, 및 (F127NF 을 포함하는) F127 을 포함한다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 또 다른 부류는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000 Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000 Da, 5000 Da, 10,000 Da, 또는 20,000 Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 카르복실산 모이어티들을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 카르복실산 서브유닛은 알킬, 알케닐, 또는 방향족 모이어티 함유 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비-제한적인 예는 폴리락트산 (polylactic acid; PLA) 이다. 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 폴리머 백본의 말단 또는 폴리머의 백본으로부터의 펜던트 (pendant) 중의 어느 하나에서 포스페이트 모이어티들을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 술폰산 모이어티들을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 술폰산 서브유닛은 알킬, 알케닐, 또는 방향족 모이어티 함유 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비-제한적인 예는 폴리스티렌 술폰산 (PSSA) 또는 폴리아네톨 술폰산이다. 추가의 실시형태들에서, 코팅 재료는 아민 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 폴리아미노 폴리머는 천연 폴리아민 폴리머 또는 합성 폴리아민 폴리머를 포함할 수도 있다. 천연 폴리아민들의 예들은 스페르민, 스페르미딘, 및 푸트레신을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 당류 모이어티들을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 비-제한적인 예에서, 잔탄검 또는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드들은 미세유체 디바이스에서의 세포 스티킹 (cell sticking) 을 감소시킬 수도 있거나 방지할 수도 있는 재료를 형성하기 위하여 적당할 수도 있다. 예를 들어, 약 3 kDa 크기를 가지는 덱스트란 폴리머는 미세유체 디바이스 내의 표면을 위한 코팅 재료를 제공하기 위하여 이용될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 폴리전해질 표면을 제공하는, 리보뉴클레오티드 모이어티들 또는 디옥시리보뉴클레오티드 모이어티들을 가질 수도 있는 뉴클레오티드 모이어티들, 즉, 핵산을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 핵산은 오직 천연 뉴클레오티드 모이어티들을 함유할 수도 있거나, 7-디아자아데닌, 펜토오스, 메틸 포스포네이트, 또는 포스포로티오에이트 모이어티들과 같은 핵염기, 리보오스, 또는 포스페이트 모이어티 유사체들을 제한 없이 포함하는 비-천연 뉴클레오티드 모이어티들을 함유할 수도 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 아미노산 모이어티들을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 아미노산 모이어티들을 함유하는 폴리머는 천연 아미노산 함유 폴리머 또는 비천연 아미노산 함유 폴리머를 포함할 수도 있고, 이들 중의 어느 하나는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 단백질은 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질들을 코팅제들로서 포함하는 소혈청 알부민 (BSA) 및/또는 혈청 (또는 다수의 상이한 혈청들의 조합) 일 수도 있다. 혈청은 태아 송아지 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청, 및 등을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 임의의 편리한 소스로부터의 것일 수 있다. 어떤 실시형태들에서, 코팅 용액에서의 BSA 는 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 초과, 또는 그 사이의 어느 곳을 포함하는 약 1 mg/mL 로부터 약 100 mg/mL 까지에서 존재한다. 어떤 실시형태들에서, 코팅 용액에서의 혈청은 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 또는 그 초과, 또는 그 사이의 어느 곳을 포함하는 약 20 % (v/v) 내지 약 50 % v/v 의 범위에서 존재할 수도 있다. 일부 실시형태들에서는, BSA 가 5 mg/mL 에서의 코팅 용액에서의 코팅제로서 존재할 수도 있는 반면, 다른 실시형태에서는, BSA 가 70 mg/mL 에서의 코팅 용액에서의 코팅제로서 존재할 수도 있다. 어떤 실시형태들에서, 혈청은 30 % 에서의 코팅 용액에서의 코팅제로서 존재한다. 일부 실시형태들에서, 세포외 매트릭스 (extracellular matrix; ECM) 단백질은 세포 성장을 촉진하기 위하여 최적화된 세포 부착을 위한 코팅 재료 내에서 제공될 수도 있다. 코팅 재료에서 포함될 수도 있는 세포 매트릭스 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예컨대, 파이브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 또 다른 실시형태들에서, 성장 인자들, 시토카인들, 호르몬들, 또는 다른 세포 시그널링 종들은 미세유체 디바이스의 코팅 재료 내에서 제공될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실산 모이어티들, 술폰산 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 또는 아미노산 모이어티들 중의 하나를 초과하는 것을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 폴리머 컨디셔닝된 표면은 코팅 재료로 독립적으로 또는 동시에 편입될 수도 있는, 각각이 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실산 모이어티들, 술폰산 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 및/또는 아미노산 모이어티들을 가지는 하나를 초과하는 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료들. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 이러한 세포들을 위한 컨디셔닝된 표면을 제공하는, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 공유결합으로 연결된 분자들을 포함한다.
공유결합으로 연결된 분자들은 연결 기 (linking group) 를 포함하고, 여기서, 연결 기는 이하에서 설명된 바와 같이, 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들에 공유결합으로 연결된다. 연결 기는 또한, 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유결합으로 연결된다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만, 이것으로 제한되지는 않는) 모노- 또는 폴리사카라이드들; (프로파르길 알콜을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는) 알콜들; 폴리비닐 알콜을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 폴리알콜들; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 알킬렌 에테르들; (폴리아크릴산 또는 폴리비닐 포스폰산을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는) 폴리전해질들; (알킬화된 아민들, 히드록시알킬화된 아미노 기, 구아니디늄, 및 모르폴린일 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이것으로 제한되지는 않는 비방향족 질소 링 원자를 함유하는 헤테로사이클릭 기들과 같은, 그러나 이것으로 제한되지는 않는 그 유도체들을 포함하는) 아미노 기들; (카르복실레이트 음이온 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올산을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 카르복실산들; (포스포네이트 음이온 표면을 제공할 수도 있는) 에틴일 포스폰산을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 포스폰산들; 설포네이트 음이온들; 카르복시베타인들; 술포베타인들; 술팜산들; 또는 아미노산들을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 모이어티, (퍼플루오로알킬을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는) 플루오로알킬 모이어티와 같은 치환된 알킬 모이어티, 아미노산 모이어티, 알콜 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실산 모이어티, 포스폰산 모이어티, 술폰산 모이어티, 술팜산 모이어티, 또는 당류 모이어티와 같은 비-폴리머 모이어티들을 포함할 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 모이어티는 위에서 설명된 모이어티들 중의 임의의 것일 수도 있는 폴리머성 모이어티들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 선형 사슬 (예컨대, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22, 또는 그 초과하는 탄소들의 선형 사슬) 을 형성하는 탄소 원자들을 포함할 수도 있고, 비분기된 알킬 모이어티일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 치환된 알킬 기를 포함할 수도 있다 (예컨대, 알킬 기에서의 탄소들의 일부는 플루오르화될 수 있거나 또는 퍼플루오르화될 수 있음). 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 비-치환된 알키 기를 포함할 수도 있는 제 2 세그먼트에 접합된, 퍼플루오로알킬 기를 포함할 수도 있는 제 1 세그먼트를 포함할 수도 있고, 여기서, 제 1 및 제 2 세그먼트들은 (예컨대, 에테르 연결부에 의하여) 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수도 있다. 알킬 기의 제 1 세그먼트는 연결 기에 대한 원위부에서 위치될 수도 있고, 알킬 기의 제 2 세그먼트는 연결 기에 대한 근위부에서 위치될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 하나를 초과하는 아미노산을 포함할 수도 있는 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수도 있다. 이에 따라, 공유결합으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존성, 이식성, 또는 그 임의의 조합을 지원하기 위하여 쌍성이온 표면 (zwitterionic surface) 을 제공할 수도 있는 아미노산을 포함할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 적어도 하나의 알킬렌 옥사이드 모이어티를 포함할 수도 있고, 위에서 설명된 바와 같은 임의의 알킬렌 옥사이드 폴리머를 포함할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 유용한 부류는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000 Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000 Da, 5000 Da, 10,000 Da, 또는 20,000 Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 당류들을 포함할 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류들은 모노-, 디-, 또는 폴리사카라이드들일 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류들은 표면에 부착하기 위한 결합 또는 정교화 (elaboration) 를 허용하는 반응성 페어링 모이어티를 도입하도록 개질될 수도 있다. 예시적인 반응성 페어링 모이어티들은 알데히드, 알킨, 또는 할로 모이어티들을 포함할 수도 있다. 폴리사카라이드는 랜덤 방식으로 개질될 수도 있고, 여기서, 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수도 있는 반응성 페어링 모이어티를 제공하기 위하여, 당류 모노머들의 각각이 개질될 수도 있거나, 폴리사카라이드 내의 당류 모노머들의 오직 부분이 개질된다. 하나의 표본은 비분기된 연결자를 통해 표면에 간접적으로 결합될 수도 있는 덱스트란 폴리사카라이드를 포함할 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노 기들을 포함할 수도 있다. 아미노 기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소-함유 헤테로사이클릭 모이어티, 또는 헤테로아릴 모이어티일 수도 있다. 아미노 함유 모이어티들은 미세유체 디바이스 내의, 그리고 임의적으로, 시퀘스트레이션 펜들 및/또는 유동 영역들 (예컨대, 채널들) 내의 환경의 pH 개질을 허용하는 구조체들을 가질 수도 있다.
컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 오직 하나의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있거나, 하나를 초과하는 상이한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 컨디셔닝된 표면들은 모두 동일한, 예컨대, 표면에 대한 동일한 연결 기 및 공유 부착, 동일한 전체적인 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 수의 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 복수의 공유결합으로 연결된 모이어티들을 가질 수도 있다. 대안적으로, 코팅 재료는 표면에 부착된 하나를 초과하는 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정된 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 공유결합으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티들을 가지는 분자들을 포함할 수도 있고, 코팅된 표면에서 더 대량의 모이어티들을 제공하기 위한 용량을 제공할 수도 있는 더 큰 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 공유결합으로 부착된 하전된 모이어티 (charged moiety) 들을 가지는 분자들의 추가의 세트를 더 포함할 수도 있다. 이 사례에서, 상이한 덜 입체적으로 요구하는 말단들 및 더 작은 백본 원자들을 가지는 분자들의 제 1 세트는 전체 기판 표면을 기능화하는 것을 도울 수 있음으로써, 기판 자체를 구성하는 실리콘/실리콘 옥사이드, 하프늄 옥사이드, 또는 알루미나와의 비희망된 부착 또는 접촉을 방지할 수 있다. 또 다른 예에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들은 표면 상에서 랜덤 방식으로 교번하는 전하들을 제공하는 쌍성이온 표면을 제공할 수도 있다.
컨디셔닝된 표면 성질들. 컨디셔닝된 표면의 조성을 제외하고, 소수성 재료의 물리적 두께와 같은 다른 인자들이 DEP 힘에 영향을 줄 수 있다. 컨디셔닝된 표면이 기판 상에 형성되는 방식 (예컨대, 기상 증착, 액체상 증착, 스핀 코팅, 플러딩 (flooding), 및 정전 코팅) 과 같은, 다양한 인자들이 컨디셔닝된 표면의 물리적 두께를 변경할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 1 nm 내지 약 7 nm; 약 1 nm 내지 약 5 nm; 또는 그 사이의 임의의 개별적인 값의 범위에서의 두께를 가진다. 다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 가질 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본원에서 설명된 바와 같이 준비된 컨디셔닝된 표면은 10 nm 미만의 두께를 가진다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면의 공유결합으로 연결된 모이어티들은 미세유체 디바이스의 표면 (예컨대, DEP 구성된 기판 표면) 에 공유결합으로 연결될 때에 단층을 형성할 수도 있고, 10 nm 미만 (예컨대, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 가질 수도 있다. 이 값들은 예를 들어, 약 30 nm 의 범위에서의 통상적으로 두께를 가질 수도 있는 스핀 코팅에 의해 준비된 표면의 그것과 대조적이다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 완벽하게 형성된 단층이 DEP-구성된 미세유체 디바이스 내에서의 동작을 위하여 적당하게 기능적일 것을 요구하지 않는다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 바람직한 전기적 성질들을 제공할 수도 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않으면서, 특정한 코팅 재료로 코팅된 표면의 강인성에 영향을 주는 하나의 인자는 내인성 전하 트래핑이다. 상이한 코팅 재료들은 코팅 재료의 파손을 초래할 수 있는 전자들을 트래핑할 수도 있다. 코팅 재료에서의 결함들은 전하 트래핑을 증가시킬 수도 있고, 코팅 재료의 추가의 파손을 초래할 수도 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료들은 전하 트래핑에 영향을 줄 수도 있는 상이한 유전체 강도들 (즉, 유전체 파손으로 귀착되는 최소 인가된 전기장) 을 가진다. 어떤 실시형태들에서, 코팅 재료는 전하 트래핑의 그 양을 감소시키거나 또는 제한하는 전체적인 구조 (예컨대, 밀집-팩킹된 단층 구조) 를 가질 수 있다.
그 전기적인 성질들에 추가하여, 컨디셔닝된 표면은 또한, 생물학적 분자들과의 이용 시에 유익한 성질들을 가질 수도 있다. 예를 들어, 플루오르화된 (또는 퍼플루오르화된) 탄소 사슬들을 함유하는 컨디셔닝된 표면은 표면 파울링 (surface fouling) 의 양을 감소시킬 시에 알킬-종단된 사슬들에 비해 이득을 제공할 수도 있다. 본원에서 이용된 바와 같은 표면 파울링은 단백질 및 그 분해 산물 (degradation product) 들, 핵산들 및 개개의 분해 산물들, 및 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반-영구적인 증착을 포함할 수도 있는, 미세유체 디바이스의 표면 상에서의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭한다.
단일 또는 멀티-파트 컨디셔닝된 표면. 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 이하에서 설명되는 바와 같이, 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를, 자체로 표면에 공유결합으로 연결되었던 표면 개질 리간드 (surface modifying ligand) 에 결합함으로써 2-파트 시퀀스로 형성될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료를 준비하는 방법들. 일부 실시형태들에서, (예컨대, 시퀘스트레이션 펜들 및/또는 유동 영역들의 적어도 하나의 표면을 포함하는) 미세유체 디바이스의 표면에 공유결합으로 연결되는 코팅 재료는 식 1 또는 식 2 의 구조를 가진다. 코팅 재료가 하나의 단계에서 표면으로 도입될 때, 그것은 식 1 의 구조를 가지는 반면, 코팅 재료가 다수 단계 프로세스에서 도입될 때에는, 그것이 식 2 의 구조를 가진다.
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코팅 재료는 DEP-구성된 또는 EW-구성된 기판의 표면의 옥사이드들에 공유결합으로 연결될 수도 있다. DEP- 또는 EW-구성된 기판은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 알루미나, 또는 하프늄 옥사이드를 포함할 수도 있다. 옥사이드들은 기판의 타고난 화학적 구조의 일부로서 존재할 수도 있거나, 이하에서 논의된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 옥사이드들과의 실록산 또는 포스폰산 기의 반응으로부터 형성된 실록시 또는 포스포네이트 에스테르 기일 수도 있는 연결 기 ("LG") 를 통해 옥사이드들에 부착될 수도 있다. 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 본원에서 설명된 모이어티들 중의 임의의 것일 수 있다. 연결 기 LG 는 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접속될 수도 있다. 연결 기 (LG) 가 모이어티에 직접적으로 접속될 때, 임의적인 연결자 ("L") 는 존재하지 않고, n 은 0 이다. 연결 기 (LG) 가 모이어티에 간접적으로 접속될 때, 연결자 L 는 존재하고, n 은 1 이다. 연결자 L 는 선형 부분을 가질 수도 있고, 여기서, 선형 부분의 백본은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 화학적 결합 제한들에 지배된, 실리콘, 탄소, 질소, 산소, 황, 및 인 원자들 중의 임의의 조합으로부터 1 내지 200 개의 비-수소 원자들을 포함할 수도 있다. 그것은 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도, 또는 포스포네이트 기들, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로사이클릭 기들로부터 선택된 하나 이상의 모이어티들의 임의의 조합으로 차단될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 연결자 L 의 백본은 10 내지 20 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 연결자 L 의 백본은 약 5 개의 원자들 내지 약 200 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 80 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 50 개의 원자들; 또는 약 10 개의 원자들 내지 약 40 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 백본 원자들은 모두 탄소 원자들이다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 멀티-단계 프로세스에서 기판의 표면에 추가될 수도 있고, 위에서 도시된 바와 같이, 식 2 의 구조를 가진다. 모이어티는 위에서 설명된 모이어티들 중의 임의의 것일 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 결합 기 (coupling group) CG 는 반응성 모이어티 Rx 및 반응성 페어링 모이어티 Rpx (즉, 반응성 모이어티 Rx 와 반응하도록 구성된 모이어티) 의 반응으로부터의 결과적인 기를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 전형적인 결합 기 CG 는 활성화된 에스테르, 산 클로라이드, 등과 같은 카르복실산의 유도체와의 아미노 기의 반응의 결과인 카르복사미딜 기를 포함할 수도 있다. 다른 CG 는 트리아졸일렌 기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 메르캡틸, 디설파이드, 에테르, 또는 알케닐 기, 또는 그 개개의 반응성 페어링 모이어티와의 반응성 모이어티의 반응 시에 형성될 수도 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 결합 기 CG 는 위에서 설명된 바와 같은 원소들의 임의의 조합을 포함할 수도 있는 연결자 L 의 제 2 단부 (즉, 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 대한 근위부인 단부) 에서 위치될 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 결합 기 (CG) 는 연결자 (L) 의 백본을 차단할 수도 있다. 결합 기 CG 가 트리아졸일렌일 때, 그것은 클릭 결합 반응 (Click coupling reaction) 으로부터 기인하는 산물일 수도 있고, 추가로 치환될 수도 있다 (예컨대, 디벤조사이클로옥테닐 융합된 트리아졸일렌 기).
일부 실시형태들에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드) 는 화학적 기상 증착을 이용하여 미세유체 디바이스의 내부 표면들 상에서 증착된다. 기상 증착 프로세스는 예를 들어, 용매 배스 (solvent bath) 로의 노출, 음파처리 (sonication), 또는 그 조합에 의해, 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판 (예컨대, DEP-구성된 기판의 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성된 기판의 지지 구조체 (104) 의 유전체 층) 을 사전-세정함으로써 임의적으로 개선될 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 사전-세정은 산화된 표면 (예컨대, 본원에서 설명된 바와 같이 공유결합으로 개질될 수도 있는 표면에서의 옥사이드들) 을 동시에 도입하면서, 다양한 불순물들을 제거할 수 있는 산소 플라즈마 세정기에서 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 염산 및 과산화수소의 혼합물 또는 황산 및 과산화수소의 혼합물 (예컨대, 약 3:1 로부터 약 7:1 까지의 범위에서 황산 대 과산화수소의 비율을 가질 수도 있는 피라나 용액 (piranha solution)) 과 같은 액상 처리제들은 산소 플라즈마 세정기 대신에 이용될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 기상 증착은 미세유체 디바이스 (200) 가 미세유체 회로 (120) 를 정의하는 인클로저 (102) 를 형성하기 위하여 조립된 후에 미세유체 디바이스 (200) 의 내부 표면들을 코팅하기 위하여 이용된다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않으면서, 완전히-조립된 미세유체 회로 (120) 상에서 이러한 코팅 재료를 증착하는 것은 미세유체 회로 재료 (116) 와 전극 활성화 기판 (206) 유전체 층 및/또는 커버 (110) 사이의 약화된 결합에 의해 야기된 디라미네이션 (delamination) 을 방지할 시에 유익할 수도 있다. 2-단계 프로세스가 채용되는 실시형태들에서는, 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티의 후속 도입과 함께, 표면 개질 리간드는 위에서 설명된 바와 같은 기상 증착을 통해 도입될 수도 있다. 후속 반응은 표면 개질된 미세유체 디바이스를 용액에서의 적당한 결합 시약에 노출함으로써 수행될 수도 있다.
도 2h 는 컨디셔닝된 표면을 제공하는 예시적인 공유결합으로 연결된 코팅 재료를 가지는 미세유체 디바이스 (290) 의 단면도를 도시한다. 예시된 바와 같이, 코팅 재료들 (298) (개략적으로 도시됨) 은 미세유체 디바이스 (290) 의 DEP 기판일 수도 있는 기판 (286) 의 내부 표면 (294) 및 커버 (288) 의 내부 표면 (292) 의 양자에 공유결합으로 바인딩된 밀집-팩킹된 분자들의 단층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298) 는 일부 실시형태들에서, 그리고 위에서 논의된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (290) 내의 회로 엘리먼트들 및/또는 구조체들을 정의하기 위하여 이용된 미세유체 회로 재료 (도시되지 않음) 의 표면들을 포함하는, 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 에 대한 근위부이며 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 를 향해 내측으로 대면하는 실질적으로 모든 내부 표면들 (294, 292) 상에서 배치될 수 있다. 대안적인 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 는 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들의 오직 하나 또는 일부 상에서 배치될 수 있다.
도 2h 에서 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 유기실록산 분자들의 단층을 포함할 수 있고, 각각의 분자는 실록시 연결자 (296) 를 통해 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들 (292, 294) 에 공유 결합될 수 있다. 위에서 논의된 코팅 재료들 (298) 중의 임의의 것이 이용될 수 있고 (예컨대, 알킬-종단된, 플루오로알킬 종단된 모이어티, PEG-종단된 모이어티, 덱스트란 종단된 모이어티, 또는 유기실록시 모이어티들을 위한 포지티브 또는 네거티브 전하들을 함유하는 말단 모이어티), 여기서, 말단 모이어티는 그 인클로저-대면 말단 (즉, 내부 표면들 (292, 294) 에 바인딩되지 않고 인클로저 (284) 에 대한 근위부인 코팅 재료 (298) 의 단층의 부분) 에서 배치된다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면 (들) (292, 294) 을 코팅하기 위하여 이용된 코팅 재료 (298) 는 음이온, 양이온, 또는 쌍성이온 모이어티들, 또는 그 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않으면서, 미세유체 회로 (120) 의 인클로저 (284) 의 내부 표면들에서 양이온 모이어티들, 음이온 모이어티들, 및/또는 쌍성이온 모이어티들을 제공함으로써, 수화의 결과적인 물이 비-생물학적 분자들 (예컨대, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 옥사이드) 와의 상호작용들로부터 생물학적 미세-객체들을 격리시키는 층 (또는 "차폐부") 으로서 작동하도록, 코팅 재료 (298) 는 물 분자들과의 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다. 게다가, 코팅 재료 (298) 가 코팅제들과 함께 이용되는 실시형태들에서는, 코팅 재료 (298) 의 음이온들, 양이온들, 및/또는 쌍성이온들이 인클로저 (284) 에서의 매질 (180) (예컨대, 코팅 용액) 에서 존재하는 비-공유 코팅제들 (예컨대, 용액에서의 단백질들) 의 하전된 부분들과의 이온 결합들을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 그 인클로저-대면 말단에서 친수성 코팅제를 제공하도록 포함할 수도 있거나 화학적으로 개질될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 PEG 와 같은 알킬렌 에테르 함유 폴리머를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드를 포함할 수도 있다. 위에서 논의된 하전된 모이어티들 (예컨대, 음이온, 양이온, 및 쌍성이온 모이어티들) 과 같이, 수화의 결과적인 물이 비-생물학적 분자들 (예컨대, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 옥사이드) 와의 상호작용들로부터 생물학적 미세-객체들을 격리시키는 층 (또는 "차폐부") 으로서 작동하도록, 친수성 코팅제는 물 분자들과의 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다.
적절한 코팅 처리들 및 개질들의 추가의 세부사항들은 2016 년 4 월 22 일자로 출원된 미국 출원 제 15/135,707 호에서 발견될 수도 있고, 그 전체적으로 참조로 편입된다.
미세유체 디바이스의 시퀘스트레이션 펜들 내에서의 세포들의 생존성의 유지를 위한 추가적인 시스템 컴포넌트들. 세포 개체군들의 성장 및/또는 확장을 촉진하기 위하여, 기능적인 세포들을 유지하기 위하여 도움이 되는 환경 조건들은 시스템의 추가적인 컴포넌트들에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 추가적인 컴포넌트들은 영양분들, 세포 성장 시그널링 종들, pH 조절, 기체 교환, 온도 제어, 및 세포들로부터의 노폐물들의 제거를 제공할 수 있다.
실험
예 1. 핵산 안정화 시약 사용의 여부에 따른 핵산 격리 프로토콜들 간의 비교.
재료들. 에메틴 (Sigma, 카탈로그 번호 E2375); 시클로헥시미드 (Sigma, 카탈로그 번호 C7698); 트립톨라이드 (Sigma, 카탈로그 번호 T3652); 및 소듐 아지드 (Sigma, 카탈로그 번호 S2002) 는 모두 상업적으로 공급되었다. 용해 시약은 TCL 용해 완충액 (Qiagen, 카탈로그 번호 070498) 이었다. RNA 격리는 Agencourt® RNAClean® XP 비드들 (Beckman Coulter, 카탈로그 번호 A63987) 를 사용하여 수행되었다. RNA 서열 분석은 Nextera® XT 키트 (Illumina®, 카탈로그 번호 FC-131-1024) 및 Nextera® XT 인덱스 키트 (Illumina®, 카탈로그 번호 FC-131-1001) 를 사용하여 수행되었다.
생물학적 세포. OKT3 세포, 쥐과 골수종 하이브리도마 세포주는 ATCC (ATCC® Cat.# CRL-8001™) 로부터 획득되었다. 배양에서, 세포는 현탁 세포주로서 작용한다. 배양은 5 % 이산화탄소 가스 환경을 사용하여 20% 태아 소 혈청 (FBS) 과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 20ml IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 에서, 약 2x104 내지 약 5x105 의 생존 세포/mL 를 접종하고 37 ℃ 에서 배양함으로써 유지되었다. 세포는 2 ~ 3 일 간격으로 분할되었다. OKT3 세포 수 및 생존률이 카운팅되었고, 세포 밀도는 미세유체 디바이스 상에 세포를 로딩하기 위해 5x105/ml 로 조정되었다.
모액들은 표 1 에 도시된 것과 같이 제조되었다.
안정화 시약 성분들의 모액.
성분 농도 및 용제
에메틴 DMSO 에서 180mM
시클로헥시미드 DMSO 에서 360mM
트립톨라이드 DMSO 에서 6mM
소듐 아지드 물에서 1.6M
표 2 에 나타낸 바와 같이, 안정화 시약의 100 배 마스터 믹스가 제조되었다. 마스터 믹스는 -80 ℃ 에서 30 마이크로리터의 분량으로 저장되었다.
안정화 시약을 위한 마스터 믹스 조성.
성분 마스터 믹스에서 농도 1X 안정화 반응에서 사용된 것과 같은 최종 농도
에메틴 36 mM 0.36 mM
시클로헥시미드 18 mM 0.18 mM
트립톨라이드 300 마이크로몰 3 마이크로몰
소듐 아지드 310 mM 3.10 mM
OKT3 세포의 단일 부분표본이 약 0.5x105 농도에서 획득되었다. (20% 태아 소 혈청 (FBS) 과 1% 페니실린-스트렙토 마이신을 갖는 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium 에서) 50 마이크로리터의 세포 배양액은 테스트되는 5 가지 조건들 각각에 대해 3 개씩 분주되었다.
테스트된 조건들.
조건 프로토콜
1. 안정화된 핵산 샘플 (In) a. 안정화 시약 (100x 마스터 믹스) 의 0.5 마이크로리터 부분 표본을 세포 배양액의 50 마이크로리터에 첨가함;
b. 혼합함;
c. 3 일동안 4℃ 에서 혼합물을 저장함.
2. 용해 대조군 (LC) a. TCL 용해 완충액 (2X) 의 0.5 마이크로리터 부분 표본을 세포 배양액의 50 마이크로리터에 첨가함;
b. 혼합함;
c. 3 일동안 -80℃ 에서 혼합물을 저장함.
주의: 어떤 안정화 시약도 용해 전에 세포에 첨가되지 않는다.
3. 네거티브 대조군 (NA) a. 3 일동안 4℃ 에서 혼합물을 저장함.
주의: 어떤 안정화 시약도 저장 전에 세포에 첨가되지 않는다.
4. PBS 에서 안정화된 핵산 샘플 (WIn) a. 세포 배양액의 50 마이크로리터를 스핀 다운함;
b. PBS 에서 상청액을 제거하고 세포를 세척함;
c. 안정화 시약 (100x 마스터 믹스) 의 0.5 마이크로리터 부분 표본을 함유하는 PBS 의 50 마이크로리터에서 세포를 스핀 다운하고, 상청액을 제거하고, 세포들을 재현탁함;
d. 3 일동안 4℃ 에서 현탁액을 저장함.
5. PBS 에서 네거티브 대조군 (W)




 a. 세포 배양액의 50 마이크로리터를 스핀 다운함;
b. PBS 에서 상청액을 제거하고 세포를 세척함;
c. PBS 의 50 마이크로리터에서 세포를 스핀 다운하고, 상청액을 제거하고, 세포들을 재현탁함;
d. 3 일동안 4℃ 에서 현탁액을 저장함.
e. 주의: 어떤 안정화 시약도 저장 전에 세포에 첨가되지 않는다.
각 복제물의 각 튜브는 위 아래로 피펫팅 (pipetting) 함으로써 혼합되었다. 샘플들은 얼음에 15 분간 두었다가 4 ℃ 실험실 냉장고로 옮겨졌다. 용해 조절 샘플들은 4 ℃ 가 아닌 80 ℃ 에 저장되었다.
저장된 샘플의 저장 후 처리. 3 일간 저장한 후 샘플들이 처리되었다. 4 ℃ 에서 저장된 각 세포 샘플에 대하여, 샘플은 3.2 mM 소듐 아지드를 함유한 PBS 로 2 회 세척되었다. 간략하게, 세포들은 2 분간 0.3g 에서 원심 격리하여 펠릿화되었다; 상청액을 제거하였다; 세포 펠릿을 3.2mM 소듐 아지드를 함유하는 500 마이크로리터 PBS 에서 재현탁시켰다. 이것이 반복되었다. 제 3 원심격리 후에, 각 샘플의 세포를 3.2 mM 소듐 아지드를 함유하는 50 마이크로리터 PBS 에서 재현탁시켰다.
RNA 격리 및 후속 서열 분석. 모든 저장된 샘플 (In, NA, WIn 및 W 샘플들 각각) 의 세포 현탁액의 2 마이크로리터를 1.25x TCL 용해 완충액의 8 마이크로리터에 개별적으로 첨가하고 위 아래로 피펫팅하였다. 용해 대조군 (LC) 샘플들의 각각에 대해, 4 마이크로리터의 Cell/TCL 용해 완충액 믹스를 6 마이크로리터 1x TCL 용해 완충액에 첨가하고 위 아래로 피펫팅하였다.
각 샘플에 대해, Agencourt® RNAClean® XP 비드들을 사용하여 RNA 를 정제했다. 격리된 RNA 는 Picelli 등, Nature Methods, 10, 1096-1098 (2013) 에 기재된 것과 같은 SMART-Seq2 프로토콜을 사용하여 12 사이클 동안 증폭시켰다. Nextera® XT 키트와 바코드들 (Nextera XT 인덱스 키트) 를 사용하여 RNAseq cDNA 서열 분석 라이브러리들을 생성했다. 서열 분석은 Illumina® MiSeq 에서 수행되었으며 결과적으로 샘플 당 3 ~ 5 백만의 2x75bp 판독이 이루어졌다.
증폭 후 회수된 cDNA 양의 비교는 도 4 에 도시된다. 형광 측정법 (Qubit™ fluorometer, ThermoFisher Scientific) 을 사용하여 cDNA 정량을 측정하였다; 도시된 양들은 회수된 cDNA 의 총 나노그램들이다. Ct1 로 표시된 최초 2 개의 열들은 용해 대조군 (LC) 샘플 1 (Ct1) 을 사용하여 cDNA 증폭 반응의 기술적 복제들을 나타냈다. 나머지 열들은 좌측에서 우측으로 한 쌍씩 나타난다: 2 개의 추가 용해 대조군 (LC) 샘플들 (Ct2 및 Ct3); 안정화 시약 (In1, In2, In3) 으로 처리된 3 개의 저해된 (In) 샘플들; 3 개의 네거티브 제어 (NA) 샘플들 (NA1, NA2, NA3); 안정화 시약 (WIn1, WIn2, WIn3) 으로 처리된 3 개의 PBS-세척된 샘플들 (WIn); 어떤 추가의 첨가들 (W1, W2, W3) 이 없는 3 개의 PBS-세척된 샘플들 (W). 각 쌍의 열들 (기술적 복제물들) 은 각각의 복제물의 특정 조건 하에서 회수된 cDNA 의 양을 나타낸다. 안정화 시약의 첨가로 (WIn 열 쌍들) 또는 첨가 없이 (W 열 쌍들) 세포들을 PBS 완충액으로 세척하는 것은 LC, In 및 NA 샘플들에 대한 cDNA 의 회수와 비교하여, 전반적으로 핵산의 수율이 매우 낮아진다는 것을 알 수 있다. Ct 및 NA 샘플들로부터 회수된 cDNA 의 양들은 수율 면에서 유사하지만, 안정화 시약으로 처리된 샘플들로부터 격리된 RNA 의 품질은 후술하는 바와 같이, 라이브러리 제조에 보다 적합했다.
1 일에 존재하고 -80 ℃ 에서 저장된 안정화 시약 없이 용해된 용해 대조군 (LC) 샘플로부터 회수된 cDNA 의 크기 분포들 (도 5a) 및 안정화 시약으로 처리되고 4 ℃ 에서 72 시간 동안 저장되고 그 후에 용해된 샘플 (도 5b) 이 도 5 에 도시된다. 곡선들은 매우 유사하며, 용해 대조군 샘플 (LC) 와 비교하여 저해된 샘플 (In) 의 cDNA 크기 분포 사이에 어떤 유의한 차이들도 없음을 보여준다. 각 샘플 세트에 대한 Bioanalyzer 트레이스들은 서열 분석에 들어가기 위한 양호한 상관 관계 및 상대 분포를 보여준다. 도 5c 는 NA 샘플로부터 회수된 cDNA 의 크기의 분포를 도시한다. 도 5a 및 5b 에 도시된 트레이스들과 비교하여, 추가의 저 분자량 재료가 트레이스의 메인 분포 피크의 더 낮은 분자량 측을 따라 명백하였다. 바이오분석기 트레이스에 도시된 더 낮은 분자량의 cDNA 는 NA 샘플에서 회수된 RNA 가 LC 및 In 샘플들에 비해 증가된 분해를 경험한 것을 나타냈다. 따라서, 관찰된 풍부한 양의 cDNA 에도 불구하고 (도 4), NA 샘플들은 서열 분석을 위해 최적화된 cDNA 라이브러리들을 제공하지 않았다.
서열 분석 데이터 분석은 Illumina BaseSpace 를 통해 입수가능한 TopHat 정렬 및 Cufflinks DE 표현 모듈들을 사용하여 수행되었다. 참조용으로 사용된 용해 대조군 샘플들 (Ct1, Ct2, Ct3) 로 안정화 시약 (In1, In2, In3) 으로 처리된 저해 샘플들에 대해서, 차동 발현 (DE) 분석이 도 6 에 도시된다. DE 분석은, In 샘플들의 140 개 유전자들이 3.4X 에서 1.2X 범위의 변경된 발현 레벨들을 나타낸 것을 도시하였다. 38 개 유전자는 1.5x 컷오프 (데이터는 도시되지 않음) 를 사용하여 평가될 때 발현이 감소했다. 최대 감소는 2.09 배 감소했다. 유전자 온톨로지 분석은 발현이 감소한 유전자의 특정 경로 강화를 예측하지 못했다. 1.5X 컷오프를 사용하여 평가될 때 18 개의 유전자는 발현이 증가되었다. 가장 큰 증가는 히스톤 (Histone) 단백질에 대해 3.4X 였다. 유전자 온톨로지 분석은 하나의 특정 농축, 아민 분비 경로 (2 개의 유전자) 를 예측했다. 전반적으로, 변화들은 랜덤하고 사소한 것으로 보였다. 따라서, -80 ℃ (LC) 에서의 직접적인 용해 및 저장과 비교하여 4℃ (In) 에서 저장하기 전에 안정화된 세포들의 프로파일링 실험에 대한 효과는 거의 예측되지 않는다.
DE 분석은 용해 대조군 세포 (Ct1, Ct2, Ct3) 를 기준으로 사용하여 어떤 안정화 (NA1, NA2, NA3) 도 없이 4 ℃에서 저장된 네거티브 제어 세포에 대하여 도 7 에 도시된다. 303 개의 유전자들은 8.2X 에서 1.2X 변화에 이르기까지 차별적으로 발현되었다. 139 개 유전자들은 1.5x 컷오프 (데이터는 도시되지 않음) 를 사용하여 평가될 때 발현이 감소했다. 가장 큰 감소는 8.2X 였고, 유전자 온톨로지 분석은 세포 단백질 변형들 (GO : 0006464) (28 개 유전자) 및 대사 프로세서 (GO: 0008152), 66 개 유전자에 대한 경로 농축을 예측했다. 18 개의 유전자는 1.5x 컷오프 (데이터는 도시되지 않음) 를 사용하여 평가될 때 발현이 증가되었다. 가장 큰 증가는 5.4X 였다. 유전자 온톨로지 분석은 임의의 특정 경로 농축을 예측하지 못했다. 안정화 제제로 처리된 In 샘플들에서 상향 조절된 유전자들은 안정화 시약을 첨가하지 않은 NA 세포들에서 상향조절된 유전자와 중첩하며, 안정화 방법 자체에서 어느 것도 발현의 증가를 유발하지 않은 것을 나타냈지만 환경 노출 및/또는 취급으로 인한 것으로 나타냈다.
DE 분석은 PBS 로 세척된 WIn 세포들에 대해 도 8 에 도시되고, 여기서 이후 안정화 시약을 첨가하고, 4 ℃ (WIn1, WIn2, WIn3) 로 저장하고, 용해 대조군 세포를 기준으로 사용하였다. 다수의 유전자들, 1160 은 1.5x 컷오프 (데이터는 도시되지 않음) 를 사용하여 평가될 때 발현이 감소했다. 가장 큰 감소는 8.2X 였다. 유전자 온톨로지 분석은 10 초과의 특정 경로들에서 농축을 예측했다. 유사하게, 다수의 유전자들, 1108 은 1.5x 컷오프를 사용하여 평가될 때 발현이 증가되었고, 최대 증가는 8.4X 이다 (데이터는 도시되지 않음). 유전자 온톨로지 분석은 10 초과의 특정 경로들에서 농축을 예측했다. 2 개의 특정 유전자들 Samd11 및 Samd1 은 각각 8.4X 및 7.9X 에서 가장 높게 활성화되었다. 이 2 개의 상상적인 전사 인자들은 관측된 많은 수의 유전자 발현 변화를 유도할 수 있었다.
PBS로 세척하고 안정화 시약을 첨가하지 않은 W 세포들 (W1, W2, W3) 에 대한 DE 분석을 도 9 에 도시하고, 용해 대조군 샘플들 (Ct1, Ct2, Ct3) 이 기준으로 사용된다. 다수의 유전자들, 744 은 1.5x 컷오프 (데이터는 도시되지 않음) 를 사용하여 평가될 때 발현이 감소했다. 가장 큰 감소는 13X 였다. 유전자 온톨로지 분석은 10 초과의 특정 경로들에서 농축을 예측했다. 유사하게, 다수의 유전자들, 774 은 1.5x 컷오프를 사용하여 평가될 때 발현이 증가되었고, 최대 증가는 5.1X 이다 (데이터는 도시되지 않음). 유전자 온톨로지 분석은 10 초과의 특정 경로들에서 농축을 예측했다. Samd11 은 다시, 4.6X 의 농축을 가진 가장 활성화된 유전자들 중 하나이다. 이 전사 인자는 특성이 불량하고 많은 수의 유전자 발현 변화들을 유도할 수도 있다.
결과들은 4 ℃ 에서 매질에 세포들을 저장하는 효과가, 대사 유전자 발현이 유의한 감소를 보여주었음에도 불구하고 큰 변화를 유발하지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, 대사 유전자 발현 변화들은 안정화 시약 (60 개 이상의 유전자들이 영향을 받음) 을 사용하여 차단된다. 안정화 시약은 PBS 와 같은 매질로 세척하기 전에 세포들에 첨가되어야 한다.
예 2. 저장 후 미세유체 디바이스 내에서 안정화된 핵산의 격리.
시스템 및 디바이스: OptoSelect™ 칩, Berkeley Lights, Inc. 에 의해 제조되고 Berkeley Lights, Inc. 의해 또한 제조된 광학 기기로 제어되는 나노유체 디바이스가 채용되었다. 기기는: 온도 제어기에 결합된 칩을 위한 장착 스테이지; 펌프 및 유체 매질 조절 컴포넌트; 및 칩 내의 포토트랜지스터들을 활성화하는데 적합한 구조화된 광원 및 카메라를 포함하는 광학 트레인을 포함한다. OptoSelect 칩은 포토트랜지스터 활성화된 OET 힘을 제공하는, OptoElectroPositioning (OEP™) 기술로 구성된 기판을 포함한다. 칩은 또한, 다수의 미세유체 채널들을 포함했고, 각각은 유체 접속된 복수의 NanoPen™ 챔버 (또는 시퀘스트레이션 펜들) 을 갖는다. 각 시퀘스트레이션 펜의 체적은 약 1x106 입방 미크론이다.
세포 및 배양 매질: 상기 예 1 에서와 동일.
미세유체 디바이스 프라이밍. 250 마이크로리터의 100% 이산화탄소는 12 마이크로리터/초의 속도로 유동되고, 다음에 0.1% Pluronic® F27 (Life Technologies® Cat # P6866) 을 함유하는 250 마이크로리터의 PBS 가 12 마이크로리터/초로 유동되고, 최종적으로 250 마이크로리터의 PBS 가 12 마이크로리터/초로 유동된다. 배양 매질의 도입은 다음과 같다.
매질 관류. 매질은 다음 두 가지 방법 중 하나에 따라 미세유체 디바이스를 통해 관류된다:
1. 2 시간 동안 0.01 마이크로리터/초에서 관류; 64 초 동안 2 마이크로리터/초에서 관류; 및 반복.
2. 100 초 동안 0.02 마이크로리터/초에서 관류; 500 초 동안 유동을 중지; 64 초 동안 2 마이크로리터/초에서 관류; 및 반복.
세포는 예 1 에 기재된 것과 같은 밀도로 2 개의 OptoSelect 디바이스들로 도입되고, 개별적으로 NanoPen 챔버들로 위치되고 37 ℃ 에서 24 시간 동안 배양된다.
배양된 세포의 절반은 OEP 기술에 의해 생성된 광학적으로 작동된 전기영동력을 사용하여 각 디바이스 1 및 2 에서 배출된다. OKT3 세포의 이러한 대조군 샘플들은 TCL 용해 완충액 (2X) 으로 배출되고, 혼합되어, -80 ℃ 에서 동결된다.
OptoSelect 디바이스 1 내에 남아있는 세포는 50 마이크로리터 안정화 시약 (표 2 의 100X 마스터 믹스로부터 희석된 2X, 0.72 mM 시클로헥시미드, 0.36 mM 에메틴, 6 마이크로몰 트립토라이드, 6.20 mM 소듐 아지드) 을 1 마이크로리터/초의 속도로 미세유체 채널로 유동시키고, 배양 매질을 배치함으로써 저장을 위해 안정화된다. 안정화 시약은 5 분의 주기 동안 NanoPen 챔버 내로 확산하도록 허용되며, OptoSelect 디바이스 1 를 기기에서 제거하기 전에 OKT3 세포를 안정화 시약과 추가로 15 분 주기 동안 접촉시킨다. 안정화된 세포 (Stabilized) 들을 함유하는 OptoSelect 디바이스 1 는 증발을 방지하기 위해 밀봉되고 4 ℃ 에서 밤새 저장된다.
OptoSelect 디바이스 2 내에 남아있는 세포는 안정화 시약을 첨가하지 않고 저장을 위해 4 ℃ 로 이동된다. 안정화되지 않은 세포들 (Non-Stabilized) 을 함유하는 OptoSelect 디바이스 2 는 증발을 방지하기 위해 밀봉되고 4 ℃ 에서 밤새 저장된다.
다음 날, OptoSelect 디바이스 1 가 기기로 반송되고, 안정화 칵테일을 함유하는 매질이 디바이스를 통해 플러싱되어 저장 매질을 교체한다. 그 후에, 안정화된 세포들의 그룹은 실험 1 에서 앞서 설명된 것과 같이, OptoSelect 디바이스에서 TCL 용해 완충액 (2X) 으로 배출되고 라이브러리 생성, 핵산 서열 분석 및 서열 분석을 위해 처리된다. OptoSelect 디바이스 2 는 또한, OptoSelect 디바이스 1 과 동일한 밤새 저장 주기 후에도 기기로 교체되며, 디바이스를 플러시 및 재조정하는데 새로운 매질 (안정화 시약을 함유하지 않음) 이 사용된다. 그 후에, 안정화되지 않은 세포들의 그룹 (Non-Stabilized) 은 실험 1 에서 앞서 설명된 것과 같이, OptoSelect 디바이스에서 TCL 용해 완충액 (2X) 으로 배출되고 라이브러리 생성, 핵산 서열 분석 및 서열 분석을 위해 처리된다.
안정화 및 대조군 샘플들의 서열 분석 결과들은 안정화되지 않은 세포와 대조군 세포 사이의 유전자 발현의 다양성과 비교하여, 안정화된 세포와 대조군 세포 사이의 유전자 발현의 가변성이 감소하는 것을 도시하는 것으로 예측된다.
실시형태들의 언급
1. 생물학적 세포 내에서 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트로서, 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함한다.
2. 실시형태 1 의 키트에 있어서, 상기 키트는 제 2 단백질 번역 저해제를 더 포함한다.
3. 실시형태 2 의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 가역성 단백질 번역 저해제가다.
4. 실시형태 2 또는 실시형태 3 의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 비가역성 단백질 번역 저해제와 비교하여 신속하게 작용한다.
5. 실시형태 2 내지 실시형태 4 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 세포막 투과성이다.
6. 실시형태 2 내지 실시형태 5 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 디아족사이드, 글루타르이미드 항생제, 및/또는 이페칵 알칼로이드이다.
7. 실시형태 2 내지 실시형태 6 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 시클로헥시미드이다.
8. 실시형태 1 내지 실시형태 7 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 세포막 투과성이다.
9. 실시형태 1 내지 실시형태 8 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 아미노글리코시드 항생제, D-갈락토사민, 및/또는 에메틴이다.
10. 실시형태 1 내지 실시형태 9 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 세포막 투과성이다.
11. 실시형태 1 내지 실시형태 10 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 세포막 투과성이다.
12. 실시형태 1 내지 실시형태 11 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 CDK9 저해제, 오레트리신, 티올루틴, 아마니틴, 및/또는 트립토라이드이다.
13. 실시형태 1 내지 실시형태 12 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 비가역성 저해제가다.
14. 실시형태 1 내지 실시형태 13 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 트립톨라이드이다.
15. 실시형태 1 내지 실시형태 14 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 가역성 활동을 갖는다.
16. 실시형태 1 내지 실시형태 15 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 세포막 투과성이다.
17. 실시형태 1 내지 실시형태 16 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬 저해제가다.
18. 실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 전자 전달 사슬 제제는 소듐 아지드이다.
19. 실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제 중 적어도 하나는 용액에 제공된다.
20. 실시형태 19 의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 용액에 제공된다.
21. 실시형태 20 의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제는 1.0 마이크로몰 내지 2 M 의 농도로 용액 내에 존재한다.
22. 실시형태 1 내지 실시형태 21 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 용액에 제공된다.
23. 실시형태 22 의 키트에 있어서, 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 1.0 마이크로몰 내지 2 M 의 농도로 용액 내에 존재한다.
24. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 용액에 제공된다.
25. 실시형태 24 의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 1.0 나노몰 내지 500 밀리몰의 농도로 용액 내에 존재한다.
26. 실시형태 1 내지 실시형태 25 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 용액에 존재한다.
27. 실시형태 26 의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 0.1 마이크로몰 내지 1 M 의 농도로 존재한다.
28. 실시형태 1 내지 실시형태 27 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 키트는 RNase 저해제를 포함하지 않는다.
29. 실시형태 1 내지 실시형태 28 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 키트는 프로타아제 저해제를 더 포함한다.
30. 실시형태 29 의 키트에 있어서, 상기 프로테아제 저해제는 시스테인 프로테아제 또는 세린 프로테아제 저해제가다.
31. 실시형태 1 내지 실시형태 30 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 핵산의 안정화된 모집단은 리보 핵산의 모집단을 포함한다.
32. 실시형태 1 내지 실시형태 31 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제 중 1 초과는 마스터 믹스에서 제공된다.
33. 실시형태 32 의 키트에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 모두 3 개는 마스터 믹스에서 제공된다.
34. 실시형태 1 내지 실시형태 33 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 키트는 용해 완충액을 더 포함한다.
35. 실시형태 1 내지 실시형태 34 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 키트의 하나 이상의 성분들은 별개의 컨테이너에 제공된다.
36. 실시형태 1 내지 실시형태 35 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 생물학적 세포는 포유류 세포이다.
37. 실시형태 1 내지 실시형태 36 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 생물학적 세포는 인간 세포이다.
38. 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나의 키트에 있어서, 상기 생물학적 세포는 암 세포이다.
39. 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 방법으로서, 생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 접촉하는 단계는 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하는데 충분한 기간 동안 수행된다.
40. 실시형태 39 의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포는 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 각각과 동시에 접촉된다.
41. 실시형태 39 또는 실시형태 40 의 방법에 있어서, 상기 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 각각의 존재 시 안정화된 생물학적 세포를 저장하는 단계를 더 포함한다.
42. 실시형태 41 의 방법에 있어서, 상기 저장하는 단계는 적어도 8 시간 동안이다.
43. 실시형태 41 또는 실시형태 42 의 방법에 있어서, 상기 저장하는 단계는 0 ℃ 내지 4 ℃ 의 온도에서 수행된다.
44. 실시형태 39 내지 실시형태 43 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 안정화된 생물학적 세포를 용해 시약과 접촉함으로써 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계를 더 포함한다.
45. 실시형태 44 의 방법에 있어서, 용해된 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단의 적어도 일부를 격리하는 단계를 더 포함한다.
46. 실시형태 44 또는 실시형태 45 의 방법에 있어서, 상기 용해시키는 단계는 상기 안정화된 생물학적 세포를 상기 용해 시약과 접촉하기 전에 상기 안정화된 생물학적 세포를 세척하는 단계를 더 포함한다.
47. 실시형태 44 내지 실시형태 46 중 어느 하나의 방법에 있어서, 안정화된 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 모집단의 적어도 일부로부터 핵산의 적어도 하나의 부류를 분석하는 단계를 더 포함한다.
48. 실시형태 47 의 방법에 있어서, 상기 분석하는 단계는 핵산의 적어도 하나의 부류를 서열 분석하는 단계를 포함한다.
49. 실시형태 48 의 방법에 있어서, 상기 핵산의 적어도 하나의 부류는 리보 핵산이다.
50. 인클로저를 포함하는 미세유체 디바이스 내의 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법으로서: 생물학적 세포를 미세유체 디바이스의 인클로저 내에 배치하는 단계로서, 상기 인클로저는 유동 영역 및 적어도 하나의 챔버를 포함하고 적어도 하나의 챔버는 상기 유동 영역에 유체 연결되며, 상기 유동 영역 및 상기 적어도 하나의 챔버는 유체 매질을 수용하도록 구성되는, 상기 배치하는 단계; 및 생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 접촉하는 단계는 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하는데 충분한 기간 동안 수행된다.
51. 실시형태 50 의 방법에 있어서, 상기 미세유체 디바이스 내에 상기 생물학적 세포를 배치하는 단계는 상기 적어도 하나의 챔버 내에 상기 생물학적 세포를 배치하는 단계를 포함한다.
52. 실시형태 50 또는 실시형태 51 의 방법에 있어서, 적어도 하나의 챔버는 격리 영역; 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 갖는 시퀘스트레이션 펜을 포함하며, 상기 격리 영역 및 연결 영역은 매질의 성분들이 실질적으로 오직 확산에 의해서만 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역과 유동 영역 사이에서 교환되도록 구성된다.
53. 실시형태 52 의 방법에 있어서, 상기 적어도 하나의 챔버 내에 상기 생물학적 세포를 배치하는 단계는 상기 시퀘스트레이션 펜의 격리 영역 내에 생물학적 세포를 배치하는 단계를 포함한다.
54. 실시형태 53 의 방법에 있어서, 상기 적어도 하나의 챔버 내에 상기 생물학적 세포를 배치하는 단계는 전기영동력을 사용하여 상기 생물학적 세포를 이동시키는 단계를 더 포함한다.
55. 실시형태 54 의 방법에 있어서, 상기 전기영동력은 광학적으로 작동된다.
56. 실시형태 50 내지 실시형태 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 일정 기간 동안 상기 안정화된 생물학적 세포를 저장하는 단계를 더 포함한다.
57. 실시형태 56 의 방법에 있어서, 상기 저장하는 단계는 적어도 8 시간 동안 수행된다.
58. 실시형태 56 또는 실시형태 57 의 방법에 있어서, 상기 저장하는 단계는 0 ℃ 내지 4 ℃ 의 온도에서 수행된다.
59. 실시형태 50 내지 실시형태 58 중의 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 미세유체 디바이스 외부로 상기 안정화된 생물학적 세포를 배출하는 단계를 더 포함한다.
60. 실시형태 59 의 방법에 있어서, 상기 안정화된 생물학적 세포를 배치하는 단계는 전기영동력으로 상기 생물학적 세포를 이동시키는 단계를 포함한다.
61. 실시형태 60 의 방법에 있어서, 상기 전기영동력은 광학적으로 작동된다.
62. 실시형태 50 내지 실시형태 61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 안정화된 생물학적 세포를 용해 시약과 접촉함으로써 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계를 더 포함한다.
63. 실시형태 62 의 방법에 있어서, 용해된 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단의 적어도 일부를 격리하는 단계를 더 포함한다.
64. 실시형태 62 또는 실시형태 63 의 방법에 있어서, 상기 용해시키는 단계는 상기 안정화된 생물학적 세포를 상기 용해 시약과 접촉하기 전에 상기 안정화된 생물학적 세포를 세척하는 단계를 더 포함한다.
65. 실시형태 63 또는 실시형태 64 의 방법에 있어서, 용해된 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단의 적어도 일부로부터 핵산의 적어도 하나의 부류를 분석하는 단계를 더 포함한다.
66. 실시형태 65 의 방법에 있어서, 상기 분석하는 단계는 핵산의 적어도 하나의 부류를 서열 분석하는 단계를 포함한다.
67. 실시형태 65 또는 66 의 방법에 있어서, 상기 핵산의 적어도 하나의 부류는 리보 핵산이다.
68. 실시형태 39 내지 실시형태 67 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포는 포유류 세포이다.
69. 실시형태 39 내지 실시형태 68 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포는 인간 세포이다.
70. 실시형태 39 내지 실시형태 69 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포는 암 세포이다.
71. 실시형태 39 내지 실시형태 70 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포는 면역 세포이다.
72. 실시형태 71 의 방법에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 또는 대식 세포이다.
73. 실시형태 50 내지 실시형태 72 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포를 상기 인클로저 내에 배치하는 단계는 생물학적 세포를 이동시키기 위해 전기영동력을 사용하는 단계를 포함한다.
74. 실시형태 73 의 방법에 있어서, 전기영동력은 광학적으로 작동된다.
75. 실시형태 39 내지 실시형태 74 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 생물학적 세포를 적어도 하나의 비가역성 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 및/또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계는 생물학적 세포를 실시형태 1 내지 실시형태 33 중 어느 하나의 키트의 하나 이상의 성분들과 접촉하는 단계를 포함한다.
앞의 기재된 설명은 당업자로 하여금 실시형태들을 실시하게 하는데 충분한 것으로 고려된다. 전술한 설명 및 예들은 특정 실시형태들을 상세하게 설명하고, 고려된 최상의 모드를 설명하고, 단지 예시적인 것이다. 그러나, 앞의 설명이 본문에 아무리 상세하게 나타날 수도 있어도, 그 실시형태는 다수의 방식들로 실시될 수도 있고 첨부된 청구항들 및 임의의 등가물들에 따라 고려되어야만 한다는 것이 인식될 것이다.

Claims (37)

  1. 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트로서,
    적어도 하나의 단백질 번역 저해제;
    적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및
    전자 전달 사슬 저해제 또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제를 포함하는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 키트는 제 2 단백질 번역 저해제를 더 포함하는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 2 단백질 번역 저해제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트:
    (i) 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 가역성 단백질 번역 저해제임;
    (ii) 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제와 비교하여 신속하게 작용함; 및
    (iii) 상기 제 2 단백질 번역 저해제는 세포막 투과성임.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 2 단백질 번역 저해제는 디아족사이드, 글루타르이미드 항생제, 시클로헥시미드, 및 이페칵 알칼로이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    (i) 상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제,
    (ii) 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및
    (iii) 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제 중 하나 이상이 세포막 투과성인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제는 아미노글리코시드 항생제, D-갈락토사민, 또는 에메틴인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 CDK9 저해제, 오레트리신, 티올루틴, 아마니틴, 또는 트립토라이드인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제는 비가역성 저해제인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 가역성 활동을 갖는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 전자 전달 사슬 저해제인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제는 소듐 아지드인, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제, 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제 중 적어도 하나는 용액에 제공되는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  13. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 RNase 저해제를 포함하지 않는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 프로테아제 저해제, 용해 완충액, 또는 프로테아제 저해제 및 용해 완충액을 더 포함하는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  15. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제; 상기 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 상기 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제 중 1 초과는 마스터 믹스에 제공되는, 생물학적 세포 내의 핵산의 모집단을 안정화시키기 위한 키트.
  16. 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법으로서,
    생물학적 세포를, 적어도 하나의 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고,
    상기 접촉하는 단계는 상기 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 상기 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하기에 충분한 기간 동안 수행되는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 생물학적 세포는 상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 각각과 동시에 접촉되는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 단백질 번역 저해제, 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제, 및 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제의 각각의 존재 시 상기 안정화된 생물학적 세포를 저장하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 저장하는 단계는 적어도 8 시간 동안 수행되거나, 0 ℃ 내지 4 ℃ 의 온도에서 수행되거나, 또는 적어도 8 시간 동안 0 ℃ 내지 4 ℃ 의 온도에서 수행되는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화된 생물학적 세포를 용해 시약과 접촉함으로써 상기 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    용해된 상기 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단을 격리하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    안정화된 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 상기 핵산의 안정화된 모집단으로부터 핵산의 적어도 하나의 부류를 분석하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 분석하는 단계는 상기 핵산의 적어도 하나의 부류를 서열 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 핵산의 적어도 하나의 부류는 리보 핵산인, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  25. 인클로저를 포함하는 미세유체 디바이스 내의 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법으로서,
    상기 생물학적 세포를 상기 미세유체 디바이스의 상기 인클로저 내에 배치하는 단계로서, 상기 인클로저는 유동 영역 및 상기 유동 영역에 유체 연결된 적어도 하나의 챔버를 포함하고, 상기 유동 영역 및 상기 적어도 하나의 챔버는 유체 매질을 수용하도록 구성되는, 상기 생물학적 세포를 상기 미세유체 디바이스의 상기 인클로저 내에 배치하는 단계; 및
    상기 생물학적 세포를, 적어도 하나의 단백질 번역 저해제; 적어도 하나의 리보 핵산 전사 저해제; 및 전자 전달 사슬 저해제 또는 전자 전달 사슬 디커플링제를 포함하는 적어도 하나의 전자 전달 사슬 제제와 접촉하는 단계를 포함하고,
    상기 접촉하는 단계는 상기 생물학적 세포에서 상기 핵산의 모집단을 안정화시키고 그에 의해 상기 생물학적 세포를 안정화된 생물학적 세포로 전환하는데 충분한 기간 동안 수행되는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 생물학적 세포를 상기 미세유체 디바이스 내에 배치하는 단계는 상기 생물학적 세포를 상기 적어도 하나의 챔버 내에 배치하는 단계를 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 챔버는 격리 영역 및 상기 격리 영역을 상기 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 갖는 시퀘스트레이션 펜을 포함하며,
    상기 격리 영역 및 상기 연결 영역은 상기 유체 매질의 성분들이 확산에 의해 상기 시퀘스트레이션 펜의 상기 격리 영역과 상기 유동 영역 사이에서 교환되도록 구성되는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 생물학적 세포를 상기 미세유체 디바이스의 상기 인클로저 내에 배치하는 단계는 상기 생물학적 세포를 상기 시퀘스트레이션 펜의 상기 격리 영역 내에 배치하는 단계를 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스에 상기 안정화된 생물학적 세포를 저장하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 저장하는 단계는 적어도 8 시간 동안 수행되거나, 0 ℃ 내지 4 ℃ 의 온도에서 수행되거나, 또는 적어도 8 시간 동안 0 ℃ 내지 4 ℃ 의 온도에서 수행되는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  31. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스로부터 상기 안정화된 생물학적 세포를 배출하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  32. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화된 생물학적 세포를 용해 시약과 접촉함으로써 상기 안정화된 생물학적 세포를 용해시키는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    용해된 상기 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산의 안정화된 모집단을 격리하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    용해된 상기 안정화된 생물학적 세포로부터 방출된 상기 핵산의 안정화된 모집단으로부터 핵산의 적어도 하나의 부류를 분석하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  35. 제 16 항 내지 제 19 항 또는 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 세포는 포유류 세포인, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  36. 제 16 항 내지 제 19 항 또는 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 세포는 면역 세포인, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 또는 대식 세포인, 생물학적 세포에서 핵산의 모집단을 안정화시키는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110268108B (zh) 2016-12-12 2022-09-06 埃克切拉生物科学公司 用于使用微毛细管阵列进行筛选的方法和系统
CN110719956A (zh) 2017-06-06 2020-01-21 齐默尔根公司 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台
WO2019133874A1 (en) * 2017-12-31 2019-07-04 Berkeley Lights, Inc. General functional assay
BR112020024839A2 (pt) 2018-06-06 2021-05-18 Zymergen Inc. manipulação de genes envolvidos em transdução de sinal para controlar a morfologia fúngica durante a fermentação e produção
EP3962652A4 (en) 2019-04-30 2023-01-18 Berkeley Lights, Inc. METHODS FOR ENCAPSULATION AND TESTING OF CELLS
KR20220044212A (ko) 2019-08-09 2022-04-06 넛크래커 테라퓨틱스 인코포레이티드 미세유체 장치 및 이의 사용 방법
WO2021072306A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 1859, Inc. Methods and systems for microfluidic screening
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6204375B1 (en) * 1998-07-31 2001-03-20 Ambion, Inc. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples
GB9828709D0 (en) 1998-12-24 1999-02-17 Novartis Ag Assay
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6942776B2 (en) 1999-05-18 2005-09-13 Silicon Biosystems S.R.L. Method and apparatus for the manipulation of particles by means of dielectrophoresis
WO2001035819A1 (en) 1999-11-17 2001-05-25 Glaxo Group Limited Infrared thermography
ATE396255T1 (de) * 2000-10-17 2008-06-15 Zeptometrix Corp Nicht-pathogene mikroorganismen
CN100386441C (zh) * 2000-11-08 2008-05-07 贝克顿迪肯森公司 收集和稳定生物样品的装置、抑制体外基因诱导的方法和制备全血样品的方法
US20020197637A1 (en) * 2001-06-02 2002-12-26 Willson Richard C. Process and compositions for protection of nucleic acids
US6958132B2 (en) 2002-05-31 2005-10-25 The Regents Of The University Of California Systems and methods for optical actuation of microfluidics based on opto-electrowetting
US7977049B2 (en) 2002-08-09 2011-07-12 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms
US7700276B2 (en) 2003-07-10 2010-04-20 Universite Libre De Bruxelles Device, kit and method for pulsing biological samples with an agent and stabilising the sample so pulsed
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US7612355B2 (en) 2004-04-12 2009-11-03 The Regents Of The University Of California Optoelectronic tweezers for microparticle and cell manipulation
WO2008091848A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Advanced Liquid Logic, Inc. Surface assisted fluid loading and droplet dispensing
WO2008119066A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 The Regents Of The University Of California Single-sided lateral-field and phototransistor-based optoelectronic tweezers
JP2011500092A (ja) 2007-10-26 2011-01-06 ロゼッタ、インファーマティクス、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー 非ランダムプライマーを用いたｃＤＮＡ合成の方法
EP3369827B1 (en) 2008-03-12 2020-12-23 The Rockefeller University Methods and compositions for translational profiling and molecular phenotyping
FR2952072B1 (fr) 2009-11-05 2013-09-27 Pf Medicament Procede de production de triptolide
US9533306B2 (en) 2010-08-02 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Single sided continuous optoelectrowetting (SCEOW) device for droplet manipulation with light patterns
EP2606154B1 (en) * 2010-08-20 2019-09-25 Integenx Inc. Integrated analysis system
US9051563B2 (en) * 2011-01-14 2015-06-09 Zymo Research Corporation Nucleic acid purification
US9227200B2 (en) 2011-06-03 2016-01-05 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices with flexible optically transparent electrodes
US9857333B2 (en) 2012-10-31 2018-01-02 Berkeley Lights, Inc. Pens for biological micro-objects
US9403172B2 (en) 2012-11-08 2016-08-02 Berkeley Lights, Inc. Circuit based optoelectronic tweezers
CA2898696A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 European Molecular Biology Laboratory Improved baculoviral expression system and methods of producing the same
EP2976426A1 (en) * 2013-03-18 2016-01-27 Qiagen GmbH Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
EP3007556B1 (en) * 2013-06-13 2020-05-20 Biomatrica, INC. Cell stabilization
US9889445B2 (en) 2013-10-22 2018-02-13 Berkeley Lights, Inc. Micro-fluidic devices for assaying biological activity
IL283153B2 (en) 2013-10-22 2023-04-01 Berkeley Lights Inc Microfluidic devices with isolation pens and methods for testing microbiological items using them
US20150166326A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-18 Berkeley Lights, Inc. Capturing Specific Nucleic Acid Materials From Individual Biological Cells In A Micro-Fluidic Device
KR20160143731A (ko) 2014-04-08 2016-12-14 뉴로바이브 파마슈티컬 에이비 Atp 생산을 증가시키기 위한 숙신산 프로드러그
US20150306598A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. DEP Force Control And Electrowetting Control In Different Sections Of The Same Microfluidic Apparatus
US20150306599A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. Providing DEP Manipulation Devices And Controllable Electrowetting Devices In The Same Microfluidic Apparatus
KR102232094B1 (ko) 2014-04-25 2021-03-25 버클리 라잇츠, 인크. 동일한 미세유체 장치에의 dep 처리 디바이스들 및 제어가능 전기습윤 디바이스들의 제공
WO2015188171A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Berkeley Lights, Inc. Isolating microfluidic structures and trapping bubbles
EP3155395B1 (en) * 2014-06-10 2021-06-02 Biomatrica, INC. Methods and compositions for stabilization of nucleic acids in a blood sample at ambient temperatures
JP6682734B2 (ja) 2015-01-27 2020-04-15 ビージーアイ シェンチェン 生体試料を保存するための安定化剤
CN105158455B (zh) * 2015-09-17 2018-10-16 深圳市钠科生物有限公司 一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用

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