CN115896099A - 核酸稳定试剂、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于稳定生物细胞的核酸的试剂、组合物、试剂盒及其使用方法。稳定试剂可以准备在生物细胞内的核酸用于储存并保护代表性核酸群用于随后的分离和分析。

Description

核酸稳定试剂、试剂盒及其使用方法

本申请是申请日为2017年3月30日、申请号为201780033808.1、发明名称为“核酸稳定试剂、试剂盒及其使用方法”的专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请是一项非临时申请，根据35 U.S.C 119(e)要求2016年3月31日提交的第62/316,514号美国临时申请的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

背景技术

在生物科学和相关领域中，在从生物细胞中隔离核酸群体用于分析之前，将生物细胞储存数小时至过夜至数天的时间段可能是有用的。期望被分析的核酸群或其至少一部分代表储存前细胞的状态。优选使由于储存引起的核酸表达的变化最小化。本公开的一些实施例包括用于稳定生物细胞内的核酸用于后续隔离的试剂和方法，有利地降低由于干预储存而改变的核酸表达的发生率。

发明内容

本文描述了一种用于稳定生物细胞内的核酸的试剂盒，其中试剂盒包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和选自电子传递链抑制剂和电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂。

在另一方面，描述了一种用于稳定生物细胞中的核酸的方法，包括使生物细胞与至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，其中所述接触进行足以稳定核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂可以是核酸稳定试剂的组分，其可以是本文所述的任何核酸稳定试剂。在各种实施例中，该方法可以进一步包括在存在至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂中的每一种的情况下将稳定的生物细胞储存任何时间段，如本文所述。在一些实施例中，储存步骤可以在低于20℃的温度下进行。在各种实施例中，储存步骤可以在0℃至约4℃的温度下进行。

在另一方面，描述了一种用于稳定位于具有封壳的微流体设备内的生物细胞中的核酸的方法，包括以下步骤：将生物细胞置于微流体设备的封壳内，其中封壳包括流动区域和至少一个腔室，并且至少一个腔室流体连接到流动区域，其中流动区域和至少一个腔室被配置为容纳流体介质；以及使生物细胞与至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，其中所述接触进行足以稳定生物细胞中核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂可以是核酸稳定试剂的组分，其可以是本文所述的任何核酸稳定试剂。至少一个腔室可以是隔绝围栏。流动区域可以是微流体通道。

附图说明

图1A示出了根据本公开的一些实施例的与微流体设备和相关联控制设备一起使用的系统的示例。

图1B和1C示出了根据本公开的一些实施例的微流体设备。

图2A和2B示出了根据本公开的一些实施例的隔离围栏。

图2C示出了根据本公开的一些实施例的详细的隔绝围栏。

图2D-F示出了根据本公开的一些其他实施例的隔绝围栏。

图2G示出了根据本公开的实施例的微流体设备。

图2H示出了根据本公开的实施例的微流体设备的涂覆表面。

图3A示出了根据本公开的一些实施例的与微流体设备和相关联控制设备一起使用的系统的具体示例。

图3B示出了根据本公开的一些实施例的成像设备。

图4是从示例1的五种储存制备方法的每个重复中回收的RNA和DNA的量的图示。

图5A是从示例1中作为裂解对照(LC)处理的细胞中回收的cDNA的大小分布的图示。

图5B是从用示例1中的本公开的稳定试剂(In)的实施例处理的细胞中回收的cDNA的大小分布的图示。

图5C是从未用示例1中的本公开的稳定试剂(NA)的实施例处理的细胞中回收的cDNA的大小分布的图示。

图6是用稳定试剂(In)处理的细胞与示例1中的裂解对照样本(LC)相比的差异表达(DE)的表格表示。

图7是与在示例1中没有稳定试剂(NA)的4℃下储存的细胞相比，储存在-80℃的裂解对照细胞(LC)的差异表达(DE)的表格表示。

图8是用于随后添加示例1的稳定试剂(WIn)并在4℃下储存的洗涤到PBS中的细胞与储存在-80℃的裂解对照细胞相比(LC)的差异表达(DE)的表格表示。

图9是用于在4℃下储存的没有添加(W)的洗涤到PBS中的细胞与示例1的储存在-80℃的裂解对照样本(LC)相比的差异表达(DE)的表格表示。

具体实施方式

本说明书描述了本公开的示例性实施例和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施例和应用，也不限于示例性实施例和应用在此处操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或部分视图，并且附图中的元件的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，当本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词时，一个元件(例如，材料、层、衬底等)可以“在”另一元件“上”、“附接到”、“连接到”或“耦合到”另一元件，不管该一个元件是否直接在另一元件上、附接到、连接到或耦合到该另一元件，还是在该一个元件和该另一个元件之间存在一个或更多个中间元件。此外，在提及元素列表(例如，元素a、b、c)时，这样的提及意图包括列出的元素中的任何一个、少于所有列出的元素的任何组合、以及/或所有列出的元素的组合。

说明书中的章节划分仅为了便于查看，并不限制所讨论元素的任何组合。

如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许绝对或完美的状态、尺寸、测量、结果等的微小的、不显著的变化，例如本领域普通技术人员所预期的，但不会显著影响整体性能。当关于数值或参数或可以以数值表示的特征来使用时，“基本上”意味着在百分之十内。

如本文所用，术语“多个”意味着不止一个。如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。

如本文所用，术语“设置”在其含义内包括“位于”。

如本文所用，“微流体设备”或“微流体装置”是包括被配置成保持流体的一个或更多个离散微流体回路的设备，每个微流体回路包括：流体互连的回路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或围栏；以及被配置为允许流体(以及可选地，悬浮在流体中的微物体)流动进入和/或离开微流体设备的至少两个端口。通常，微流体设备的微流体回路将包括至少一个微流体通道和至少一个腔室，并且将保持小于约1mL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL。在某些实施例中，微流体回路保持约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。

如本文所用，“纳米流体设备”或“纳米流体装置”是一种具有微流体回路的微流体设备，所述微流体回路包含至少一个回路元件，所述回路元件被配置为容纳少于约1μL体积的流体，例如小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。通常，纳流体设备将包括多个回路元件(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施例中，至少一个回路元件中的一个或更多个(例如全部)可以被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL体积的流体。在其他实施例中，至少一个回路元件中的一个或更多个(例如全部)可以被配置为容纳约100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或250至750nL体积的流体。

微流体设备或纳米流体设备在本文中可称为“微流体芯片”或“芯片”；或“纳米流体芯片”或“芯片”。

如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指具有明显长于水平和垂直尺寸的长度的微流体设备的流动区域。例如，流动通道可以具有是水平或垂直尺寸至少5倍的长度，例如，至少10倍的长度、至少25倍的长度、至少100倍的长度、至少200倍的长度、至少500倍的长度、至少1,000倍的长度、至少5,000倍的长度或更长的长度。在一些实施例中，流动通道的长度在约100,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施例中，水平尺寸在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内，并且垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，从约40到约150微米。应注意，流动通道可在微流体设备中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美的线性元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或更多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降、叉支(例如，多个不同的流动路径)以及它们的任何组合。另外，流动通道沿其路径可具有不同的截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。

如本文所用，术语“障碍”通常指的是隆起物或类似类型的结构，其足够大而部分(但不完全)阻止目标微物体在微流体设备中的两个不同区域或回路元件之间的移动。两个不同区域/回路元件可以是例如微流体隔离围栏和微流体通道、或微流体隔绝围栏的连接区域和隔离区域。

如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体设备中的回路元件(或两个回路元件之间的接口)的宽度变窄。收缩可以位于例如微流体隔离围栏和微流体通道之间的交界处，或微流体隔绝围栏的隔离区域和连接区域的交界处。

如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过但在通过时基本上不改变光的材料。

如本文所用，术语“微物体”通常是指可根据本公开被隔离和/或操纵的任何微观物体。微物体的非限制性示例包括：无生命的微物体，诸如微颗粒、微珠(例如，聚苯乙烯珠粒、Luminex^TM珠粒等)、磁珠、微棒、微丝、量子点等；生物微物体，诸如细胞、生物细胞器、囊泡或复合物、合成囊泡、脂质体(例如，合成的或衍生自膜制备)、脂质纳米杆等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包被的微珠、脂质体包被的磁珠等)。珠粒可以包括共价或非共价连接的部分/分子，诸如荧光标记、蛋白质、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分、或能够用于测定的化学/生物物质。例如，Ritchie等(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs(在磷脂双层纳米圆盘中重建膜蛋白)”，Methods Enzymol.，464：211-231中描述了脂质纳米杆。

如本文所用，术语“细胞”可与术语“生物细胞”互换使用。“生物细胞”的非限制性示例包括真核细胞、植物细胞、动物细胞(诸如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等)、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等、从组织(诸如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞、免疫细胞(诸如T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞等)、胚胎(例如，受精卵)、卵母细胞、卵子、精子细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染细胞、转染和/或转化细胞、报告细胞等。哺乳动物细胞可以来自例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。

如果集落中能够繁殖的所有活细胞是来自单个母细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施例中，克隆集落中的所有子细胞由单个母细胞通过不超过10次分裂而产生。在其他实施例中，克隆集落中的所有子细胞由单个母细胞通过不超过14次分裂而产生。在其他实施例中，克隆集落中的所有子细胞由单个母细胞通过不超过17次分裂而产生。在其他实施例中，克隆集落中的所有子细胞由单个母细胞通过不超过20次分裂而产生。术语“克隆细胞”是指相同克隆集落的细胞。

如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如，约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20约200、约40约400、约60约600、约80至约800、约100至约1000、或大于1000个细胞)。

如本文所用，术语“维持(一个或更多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。

如本文所用，当用于细胞时，术语“扩增”指的是细胞数量的增加。

流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。

如本文所用，“捕获部分”是为微观物体提供识别位点的化学或生物物质、功能或基序。选定类型的微物体可以识别原位(就地)生成的捕获部分并且可以与原位生成的捕获部分结合或对原位生成的捕获部分具有亲和力。非限制性示例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。

如本文所用，“可流动聚合物”是可溶于或可分散在流体介质(例如，预聚物溶液)中的聚合物单体或大分子单体。可流动聚合物可以输入微流体流动区域并与其中的流体介质的其他组分一起流动。

如本文所用，“光引发聚合物”是指这样的聚合物(或可用于产生聚合物的单体分子)，其在暴露于光时能够共价交联，形成特定的共价键，改变围绕固定化学基序的区域选择性化学(regiochemistry)，或形成导致物理状态变化的离子对，从而形成聚合物网络。在一些情况下，光引发聚合物可包括这样的聚合物片段，其与能够共价交联的一个或更多个化学部分键合，形成特定的共价键，改变固定化学基序周围的区域选择化学，或形成引起物理状态变化的离子对。在一些情况下，光引发聚合物可能需要可光活化的自由基引发剂以引发聚合物网络的形成(例如，通过聚合物的聚合)。

如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)，并包括多克隆和单克隆抗体、灵长源化的(例如，人源化的)、鼠类、小鼠-人、小鼠-灵长类、和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如，scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体，并且可以自然地产生或者例如通过免疫、合成或基因工程产生。如本文所用，“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其结合抗原并且在一些实施例中可衍生化以显示促进清除和摄取的结构特征，例如通过结合半乳糖残留物。这包括例如F(ab)、F(ab)'2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)及其组合。

如本文所用，关于流体介质，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿浓度梯度的热力学运动。

短语“介质流动”是指主要由于扩散以外的任何机制导致的流体介质的大量移动。例如，由于点之间的压力差，介质的流动可能涉及流体介质从一点移动到另一点。这种流动可以包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动、或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致介质的湍流和混合。

短语“基本上不流动”是指流体介质的随时间平均得到的流动速率小于材料(例如，感兴趣分析物)的组分扩散到流体介质中或流体介质内的速率。这种材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分与流体介质之间相互作用的强度。

如本文关于微流体设备内的不同区域所使用的，短语“流体连接”是指，当不同区域基本上充满流体(诸如流体介质)时，每个区域中的流体连接以形成一个单一的流体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。而是，微流体设备的不同流体连接区中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，诸如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子)，其在流动中作为溶质沿着其各自的浓度梯度下移和/或流体流过该设备。

如本文所用，“流动路径”是指一个或更多个流体连接的回路元件(例如，通道、区域、腔室等)，其限定并受制于介质流动的轨迹。因此，流动路径是微流体设备的被扫过的区域的示例。其他回路元件(例如，未被扫过的区域)可以与包括流动路径的回路元件流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。

如本文所用，“隔离微物体”将微物体限制在微流体设备内的限定区域。

微流体(或纳流体)设备可以包括“被扫过的”区域和“未被扫过的”区域。如本文所使用的，“被扫过的”区域包括微流体回路的一个或更多个流体互连的回路元件，当流体流过微流体回路时，每个回路元件经历介质流。被扫过的区域的回路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所使用的，“未被扫过的”区域包括微流体回路的一个或更多个流体互连的回路元件，当流体流过微流体回路时，每个回路元件基本上不经历流体通量。未被扫过的区域可以流体连接到被扫过的区域，只要流体连接被构造成能够使扩散进行但基本上没有介质在被扫过的区域和未被扫过的区域之间流动。因此，微流体设备可被构造成基本上将未被扫过的区域与被扫过的区域中的介质流隔离开，同时在被扫过的区域和未被扫过的区域之间基本上仅允许扩散流体连通。例如，微流体设备的流动通道是被扫过的区域的示例，而微流体设备的隔离区(下面进一步详细描述)是未被扫过的区域的示例。

可以在这种微流体设备中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，诸如抗体的蛋白质)的能力。在测定的一个具体实施例中，可以将包含待测定的用于产生感兴趣分析物的生物微物体(例如，细胞)的样本材料加载到微流体设备的被扫过的区域中。可以选择多个生物微物体(例如，诸如人细胞的哺乳动物细胞)用于特定特征并将其置于未被扫过的区域中。然后，剩余的样本材料可以从被扫过的区域流出，并且测定材料流入被扫过的区域。因为所选择的生物微物体处于未被扫过的区域，所选择的生物微物体基本上不受剩余样本材料流出或测定材料流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生感兴趣的分析物，其可以从未被扫过的区域扩散到被扫过的区域，其中感兴趣的分析物可以与测定材料反应以产生局部可检测的反应，每个反应可以是与特定的未被扫过的区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何未被扫过的区域，以确定未被扫过的区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是感兴趣分析物的足够生产者。

如本文所提及的，“稳定的生物细胞”是在不同于典型培养条件或体内条件的条件下维持的生物细胞，其中这些条件(即“维持条件”)稳定细胞的核酸或转录组，使得核酸群或转录组与典型培养条件或体内条件下的核酸群或细胞转录组基本相同。维持条件可包括有助于稳定的生物细胞的储存的条件，包括在降低的温度下储存。在某些实施例中，稳定化的生物细胞的稳定化转录组与在典型培养条件或体内条件下生长的相应细胞(即相同类型和/或起源)的转录组基本相同。

如本文所用，“可逆”抑制剂通过与生物分子非共价结合来抑制生物分子(例如，蛋白质、核酸、核酶、复合物等)的活性，从而在结合时减少或消除生物分子的活性。可逆抑制剂相对于抑制的生物分子具有动力学参数(例如，结合亲和力、缔合速率或“结合速率”和解缔合速率或“解离速率”)的特征组。因此，特定生物分子的不同可逆抑制剂可具有不同的结合亲和力、缔合速率和/或解缔合速率。这些动力学参数的差异反映了可逆抑制剂与靶生物分子之间的化学相互作用(例如，与靶生物分子的不同部分的结合)的差异。

如本文所提及的，“不可逆”抑制剂通过与生物分子形成共价键或通过对生物分子具有如此高的结合亲和力来抑制生物分子的活性，使得抑制剂不会在任何合理的实验时间段从生物分子解离，并且因此基本上是不可逆转的。

如本文所提及的，“细胞膜可渗透的”是指分子以足够的量被动地扩散通过细胞膜以使其活性在细胞内有效的能力，并且是离子性质(电荷)、极性和分子的大小(摩尔质量)的函数。较小、较多脂溶性分子可能比较大、较带电的分子更具渗透性。

如本文所提及的，“主混合物”是预混合的，即用型试剂组合。用于稳定试剂的主混合物可具有试剂的所有组分(例如，蛋白质翻译抑制剂、核酸转录抑制剂和任选的蛋白酶抑制剂)。主混合物可以具有以稳定反应中实际使用的浓度的约1X至约1000X(例如，2X、5X、10X、20X、100X或1000X)中的任意浓度而存在的组分。在一些其他实施例中，主混合物可具有完整试剂所需的一些(例如，2、3等)组分，其中可在即将使用之前添加其余组分。

核酸稳定试剂及其使用方法。可能需要在细胞储存一段时间(范围从几小时到几天)后从生物细胞中隔离核酸群。在储存(通常在降低的温度下)时，由于细胞暴露于储存条件或与用于准备细胞进行储存的试剂接触，生物细胞的核酸子集可能被破坏、过低量产生(例如，以减小比例)或过多量产生。在一些实施例中，只有当回收的核酸在储存前存在于细胞中的核酸的类型和群体频率中具有代表性时，通过测序或杂交实验检测核酸可以导致关于生物细胞状态的有意义的信息。目前用于制备用于储存的细胞的可用处理通常包括蛋白质、核酸等的交联，但是稳定细胞用于储存而不交联是一种改进，因为从“固定”细胞(例如，用交联剂处理)的大量交联材料中回收的所需核酸可能受损并可能导致材料量减少。这对于从单个细胞中回收核酸尤其是个问题。

本文描述了用于在使生物细胞进行储存之前稳定存在于生物细胞中的核酸的组合物、方法和试剂盒。稳定化包括停止以下细胞过程：与生物细胞在其规范条件下生产的相比，该细胞过程可能导致产生不同的核酸或改变量的相同核酸。暴露于温度变化或防腐剂可能会引起物理变化(例如水性组分的结晶)、化学变化或生物变化，例如诱导压力或细胞死亡途径。因此，检测从生物细胞中回收的这些外源诱导的核酸可能无法真正理解在储存之前的细胞的状态。

申请人惊奇地发现，含有设计用于阻止细胞内核酸产生和/或功能的试剂混合物的稳定试剂可以通过将其产生的模式和水平保持在与暴露于储存条件/稳定试剂之前观察到的水平基本相似的水平来在储存期间稳定核酸(和用于储存后分离)。

在一些实施例中，稳定试剂可用于稳定脱氧核酸以用于储存和随后的DNA分离。在其他实施例中，稳定试剂可以稳定核糖核酸(RNA)用于储存和随后的分离。在一些实施例中，稳定试剂可稳定信使RNA(mRNA)用于储存和随后的分离。在一些实施例中，稳定试剂可稳定DNA和RNA(例如mRNA)两者。

稳定试剂。在一些实施例中，稳定试剂包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂。电子传递链剂可以是电子传递链抑制剂，或者可以是电子传递解耦剂。在一些实施例中，稳定试剂可包括不同于第一不可逆蛋白质翻译抑制剂的第二蛋白质翻译抑制剂。与不可逆蛋白质翻译抑制剂相比，第二蛋白质翻译抑制剂可以是可逆抑制剂和/或可以是快速作用的。

不可逆蛋白质翻译抑制剂。至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂可以是稳定试剂的组分。不可逆蛋白质翻译抑制剂可以基本上阻止新蛋白质的合成。需要不可逆性以在试剂引入时和暴露于任何其他储存条件或试剂之前停止蛋白质合成，暴露于任何其他储存条件或试剂可响应于暴露而引发蛋白质合成的变化。不可逆抑制剂可以是快速作用的(例如，在约10分钟至约30分钟的时间内起作用)或缓慢作用的(在一小时或更多小时内起作用)。不可逆蛋白质翻译抑制剂可以是细胞膜可渗透的，例如在脂质相中具有溶解性，以便更容易地扩散到细胞中并以足以抑制蛋白质翻译的量进入细胞。不可逆蛋白质翻译抑制剂可选自氨基糖苷类抗生素(包括但不限于阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素和妥布霉素)、D-半乳糖胺和/或依米丁(CAS号483-18-1)。在一些实施例中，不可逆蛋白质翻译抑制剂可以是依米丁。不可逆蛋白质翻译抑制剂可通过与核糖体结合抑制蛋白质翻译，并导致核糖体停滞，从而阻止蛋白质合成。在一个非限制性示例中，依米丁不可逆地结合真核(包括但不限于哺乳动物或人)核糖体的40S亚基以引发核糖体停滞。不可逆蛋白质翻译抑制剂可通过加入一溶液接触生物细胞，该溶液中不可逆蛋白质翻译抑制剂的浓度为约1.0微摩尔至约100毫摩尔；约1.0微摩尔至约50毫摩尔；约1.0微摩尔至约5毫摩尔；约5微摩尔至约15毫摩尔；约5微摩尔至约10毫摩尔；约0.1毫摩尔至约5毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

第二蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂可以是稳定试剂的组分。第二蛋白质翻译抑制剂不同于稳定试剂的第一蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂可以是不可逆的或可逆的蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂可以是细胞膜可渗透的，例如，足够脂溶性的，能够穿过细胞膜并以足以抑制蛋白质翻译的量进入细胞。第二蛋白质翻译抑制剂可以经由相同的机制起作用以阻止新蛋白质合成或通过与稳定试剂的不可逆蛋白质翻译抑制剂组分不同的机制起作用。第二蛋白质翻译抑制剂可以是快速作用的。通过快速作用，该应用意味着抑制剂在加入生物细胞后30分钟内基本上停止蛋白质合成(基本上停止蛋白质合成，意味着蛋白质合成终止至少90％)。因此，在一些实施例中，快速作用的蛋白质翻译抑制剂可在约1分钟、2分钟、3分钟、5分钟或约10分钟至约30分钟的时间段内基本上停止蛋白质合成。在一些实施例中，第二蛋白质翻译抑制剂可选自重氮氧化物、戊二酰亚胺抗生素和/或吐根生物碱。戊二酰亚胺抗生素可包括但不限于环己酰亚胺、乙酸环已基酰亚胺、链米酮、链菌生素(streptovitacins)、钝酮素(inactone)、表皮抑素(epiderstatin)、acetiketal和dorrigocin。在一些实施例中，第二蛋白质翻译抑制剂可以是环己酰亚胺(CAS号66-81-9)。环己酰亚胺是一种可逆抑制剂，可通过与60S核糖体单元结合并阻止肽基-RNA从受体(氨基酰基)向核糖体上的供体(肽基)位点移动来抑制翻译延伸。第二蛋白质翻译抑制剂可通过加入一溶液接触生物细胞，该溶液中第二蛋白质翻译抑制剂的浓度为约1.0微摩尔至约100毫摩尔；约1.0微摩尔至约50毫摩尔；约1.0微摩尔至约5毫摩尔；约5微摩尔至约15毫摩尔；约5微摩尔至约10毫摩尔；约0.1毫摩尔至约5毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

核糖核酸转录抑制剂。至少一种核糖核酸转录抑制剂可以是稳定试剂的组分。核糖核酸转录抑制剂可以是不可逆的或可逆的核糖核酸转录抑制剂。可逆的核糖核酸转录抑制剂可包括但不限于CDK9抑制剂(例如，5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑(DRB))和黄铜吡醇(flavorpiridol)。不可逆的核糖核酸转录抑制剂可包括但不限于金丝菌素(aureothricin)、硫藤黄素(thiolutin)、鹅膏霉素(aminitin)或雷公藤甲素(triptolide)。在其他实施例中，不可逆的核糖核酸转录抑制剂可以是放线菌素。在各种实施例中，核糖核酸转录抑制剂可以是雷公藤甲素(CAS号38748-32-2)。核糖核酸转录抑制剂可以是细胞膜可渗透的并且以足以抑制核糖核酸转录的量进入细胞。核糖核酸转录抑制剂可以是快速作用的(例如，在约1、2、3、5、10分钟至约30分钟的时间内起作用)或可以是缓慢作用的(在一小时或更长时间内起作用)。在一些实施例中，核糖核酸转录抑制剂可以是快速作用的。核糖核酸转录抑制剂可通过加入一溶液与生物细胞接触，该溶液中核糖核酸转录抑制剂的浓度为约10纳摩尔至约50毫摩尔；约0.01微摩尔至约50毫摩尔；约0.1微摩尔至约500微摩尔；约0.1微摩尔至约50微摩尔；或这些范围之间的任何值。

电子传递链剂。至少一种电子传递链剂可以是稳定试剂的组分。电子传递链剂可以是细胞膜可渗透的并以足以破坏电子传递链的量进入细胞。电子传递链剂可以是快速作用的(例如，在约1、2、3、5、10分钟至约30分钟的时间内起作用)或可以是缓慢作用的(在一小时或更长时间内起作用)。在一些实施例中，电子传递链剂可以是快速作用的。电子传递链剂可以在电子传递链上具有可逆或不可逆的活性。电子传递链剂可以是电子传递链抑制剂，其示例包括但不限于鱼藤酮、抗霉素A₁、2-噻吩甲酰三氟丙酮、萎锈灵、氰化物、叠氮化钠和寡霉素。或者，电子传递链剂可以是电子传递链解偶联剂，其示例包括但不限于2,4-二硝基苯酚、双香豆素和羰基氰-4-(三氟甲氧基)-苯基腙。可以选择电子传递解耦剂作为电子传递链剂，因为它们具有脂溶性的一般特征。在一些实施例中，电子传递链剂可以是叠氮化钠。电子传递链剂可以通过加入一溶液接触生物细胞，该溶液中电子传递链剂的浓度为约0.1微摩尔至约100毫摩尔；约10微摩尔至约50毫摩尔；约0.3毫摩尔至约25毫摩尔；约0.3毫摩尔至约15毫摩尔；约0.5毫摩尔至约10毫摩尔；约1毫摩尔至约5毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

稳定试剂可以在单一溶液中提供至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂，或者可以在单一溶液中具有少于全部的至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂。稳定试剂的各个组分每个可以作为单独的溶液提供。稳定试剂的各个组分可以顺序或同时接触生物细胞。在一些实施例中，稳定试剂的组分同时接触生物细胞，例如，存在于相同溶液中，从而同时加入。在其他实施例中，可以通过首先添加核糖核酸转录抑制剂，然后添加稳定试剂的其他组分来顺序添加组分。

稳定试剂的其他组分。在一些实施例中，稳定试剂可以不包括RNA酶抑制剂。蛋白质翻译抑制剂、核糖核酸转录抑制剂和电子传递链剂的组合可以充分地停止细胞内过程，从而稳定核酸，而不需要添加RNA酶抑制剂。

RNA酶抑制剂。在其他实施例中，稳定试剂可包括一种或多种RNA酶抑制剂。可以包括任何合适的RNA酶抑制剂，其可以包括但不限于核糖核酸酶抑制剂蛋白(例如，49kDA，富含亮氨酸和半胱氨酸的蛋白质；直向同源物；或其同源物)或以下任何市售试剂的活性成分或试剂：

Ribonuclease Inhibitor(Promega)；

Plus RibonucleaseInhibitor(Promega)；SUPERase In^TM RNA酶抑制剂(ThermoFisher Scientific)；RNaseOUT^TM重组核糖核酸酶抑制剂(ThermoFisher Scientific)；ANTA-RNase(ThermoFisher Scientific)；RNAsecure^TM试剂(ThermoFisher Scientific)。

蛋白酶抑制剂。在各种实施例中，用于稳定生物细胞中的核酸的稳定试剂还可包括蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂可以是丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或金属蛋白酶抑制剂。在其他实施例中，蛋白酶抑制剂可以是苏氨酸或谷氨酸蛋白酶抑制剂。

丝氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以是可逆的或不可逆的抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以是细胞膜可渗透的(例如，可以扩散通过细胞膜并以足以抑制丝氨酸蛋白酶的量进入细胞)。丝氨酸蛋白酶抑制剂包括但不限于苯甲基磺酰氟(PMSF)、3,4二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸(diisopropylfluoro phosphate)、N-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)和N-对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以是可逆的或不可逆的抑制剂，并且还可以是细胞膜可渗透的(例如，可以能够扩散通过细胞膜并以足以抑制半胱氨酸蛋白酶的量进入细胞)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以是半胱天冬酶蛋白酶的抑制剂或组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶的抑制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以是但不限于E-64(N-(反式环氧琥珀酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁酰胺，Selleck Chem)、N-苯甲酰基苯丙氨酸氟甲基酮(Z-FA-FMK)和N-苯甲酰基缬氨酰基丙氨酰基天冬氨酸氟甲基酮(Z-VAD-FMK)中的任何一种。

金属蛋白酶抑制剂。金属蛋白酶抑制剂可以是可逆的或不可逆的抑制剂。金属蛋白酶抑制剂可以是细胞膜可渗透的(例如，可能能够扩散通过细胞膜并以足以抑制金属蛋白酶的量进入细胞)。合适的金属蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于磷酰二肽、乌苯美司(bestatin)、乙二胺四乙酸(EDTA)、marimistat、巴马司他(batimastat)、甲基丙烯酸锌和MMP抑制剂III(CAS号927827-98-3、N'-羟基-N-(1-甲基氨基甲酰基)-3-苯基-丙基)-2-(2-甲基丙基)丁二酰胺)。

用于稳定试剂的缓冲液和介质。稳定试剂可包括水性和/或非水性溶剂以溶解稳定试剂的组分。可以选择这些溶剂以允许长期储存抑制剂和能量转移链剂的组合。有用的溶剂可包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、水、乙醇等。如果使用非水溶剂，则可能不需要缓冲剂。水溶液的缓冲将配置成既防止稳定试剂的组分劣化又为稳定反应本身提供合适的pH范围。如果需要在-20℃的低温下储存，则可以在稳定试剂中包括防冻添加剂或溶剂，例如但不限于甘油或DMSO。

稳定核酸的方法。当从生物样本(例如组织样本、细针抽吸样本、灌洗样本等)中分离细胞时，为了方便或其他原因，在进行提取核酸的步骤以进行进一步分析之前，可能希望从样本中部分处理细胞然后储存细胞。提供了用于在储存之前(和期间)稳定生物细胞内的核酸的方法。在储存后，可以从细胞中分离生物细胞的核酸或其群体。在各种实施例中，待稳定以在储存后分离的核酸可以是脱氧核酸(DNA)。在其他实施例中，待稳定在储存后用于分离的核酸可以是核糖核酸(RNA)。在一些实施例中，待稳定在储存后用于分离的RNA可以是信使RNA(mRNA)。可以从稳定化细胞的稳定化核酸中分离mRNA，以分析生物细胞的转录组。对生物细胞的转录组的分析可用于鉴定由生物细胞差异表达的基因。差异表达可以与可比较的“健康”细胞的表达水平或不同细胞类型的表达水平进行比较。优选在稳定化和储存过程中基本上不破坏生物细胞的转录组，从而允许检查生物细胞内RNA操作子的量和身份。

因此，提供了稳定生物细胞中的核酸群的方法，其包括使生物细胞与以下接触的步骤：至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂；至少一种核糖核酸转录抑制剂；和可以是电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂，其中接触进行足以稳定核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。提供所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、以及可以是电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂作为核酸稳定试剂，其包括多于一种的抑制剂或解偶联剂，靶向细胞内机器的不同部分，用于生产和降解生物细胞的核酸。用稳定试剂处理时，稳定的生物细胞的核酸被稳定，所述稳定试剂包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂；至少一种核糖核酸转录抑制剂；和可以是电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂。电子传递链剂可以是电子传输链抑制剂和/或可以是电子传递解耦剂。在一些实施例中，稳定试剂可以进一步包括第二蛋白质翻译抑制剂，其不同于第一不可逆蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂可以是可逆抑制剂。不可逆蛋白质翻译抑制剂、核糖核酸转录抑制剂、电子传递链剂和任选的第二蛋白质翻译抑制剂可以是如本文所述的任何合适的抑制剂或电子传递链剂，并且可以以任何组合独立地选择。稳定试剂可以含有本文所述的任何其他组分(例如，蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂、缓冲剂等)，其独立地和以任何组合选择。在一些实施例中，稳定试剂不含RNA酶抑制剂。

使生物细胞与稳定试剂接触，所述稳定试剂至少包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂；至少一种核糖核酸转录抑制剂；和可以是电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂。可以通过将稳定试剂的一些或所有组分(例如，主混合物)的预制溶液添加到包含生物细胞的容器(例如，管、孔、室、孵育室)中来进行接触。在其他实施例中，可以通过添加多种溶液来进行与生物细胞的接触，每种溶液在稳定化反应开始时少于所有组分(例如，一些组分存在于不同的溶液中以单独移液)。因此，在一些实施例中，可以同时进行使生物细胞与稳定试剂的每种组分接触。在其他实施例中，接触生物细胞可以与稳定试剂的组分的子集顺序进行。预制溶液的组分浓度可以是稳定反应本身所需的最终浓度的约1X、2X、5X、10X、20X、50X、100X或约1000X。

在本文所述的任何方法中，至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂的浓度可以为约1.0微摩尔至约100毫摩尔；约1.0微摩尔至约50毫摩尔；约1.0微摩尔至约5毫摩尔；约5微摩尔至约15毫摩尔；约5微摩尔至约10毫摩尔；约0.1毫摩尔至约5毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

在本文所述的任何方法中，核糖核酸转录抑制剂的浓度的范围可以为约10纳摩尔至约50毫摩尔；约0.01微摩尔至约50毫摩尔；约0.1微摩尔至约500微摩尔；约0.1微摩尔至约50微摩尔；或这些范围之间的任何值。

在本文所述的任何方法中，电子传递链剂的浓度的范围可以为约0.1微摩尔至约100毫摩尔；约10微摩尔至约50毫摩尔；约0.3毫摩尔至约25毫摩尔；约0.3毫摩尔至约15毫摩尔；约0.5毫摩尔至约10毫摩尔；约1毫摩尔至约5毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

在本文所述的任何方法中，第二蛋白质翻译抑制剂的浓度的范围可以为约1.0微摩尔至约100毫摩尔；约1.0微摩尔至约50毫摩尔；约1.0微摩尔至约5毫摩尔；约5微摩尔至约15毫摩尔；约5微摩尔至约10毫摩尔；约0.1毫摩尔至约5毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

使生物细胞与稳定试剂(所述稳定试剂至少包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂；至少一种核糖核酸转录抑制剂；可以是电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂)接触的步骤可以进行约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时或更长时间的时间。在一些实施例中，接触时间的范围可以为约5分钟至约1小时、约5分钟至约45分钟、约5分钟至约30分钟、或约5分钟至约15分钟。接触步骤可在约38℃、37℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、5℃或约0℃下进行。

在使生物细胞与稳定试剂接触后，现在可以稳定核酸群并将生物细胞转化为稳定的生物细胞，例如可以破坏转录和翻译的细胞内过程。然后可将细胞储存任何所需的时间段，例如几小时至几天或甚至更长。稳定的细胞可以储存约2小时、5小时、8小时、14小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、数月、或其间的任何时间。在一些实施例中，稳定的细胞可以储存超过约2小时且少于约1周；超过8小时且少于约2周；超过8小时且少于约1周；或超过约14小时且少于约5天。在一些实施例中，稳定的细胞可以储存约1小时至约24小时、约6小时至约18小时、约12小时至约24小时、约18小时至约30小时、约24小时至约36小时、约30小时至约42小时、约36小时至约48小时、约42小时至约54小时、约48至约60小时、或任何这些范围内的任何长度的时间。可能需要将稳定化的细胞储存在低于典型室温(例如20℃)的温度。在一些实施例中，细胞可以在约0℃至约10℃(例如，约0℃至约5℃或约2℃至约5℃)的温度下储存。在其他实施例中，细胞可以在约-30℃至约-25℃、约-30℃至约0℃、约-25℃至约0℃、约-25℃至约4℃、或这些范围内的任何选定温度的温度下储存。

稳定核酸的方法可以进一步包括通过使稳定的生物细胞与裂解试剂接触来裂解稳定的生物细胞的步骤。裂解试剂可以配置成分离DNA群或RNA群。用于分离DNA的裂解试剂可进一步配置为分离所有DNA、选择性分离基因组DNA(gDNA)或线粒体DNA(mDNA)。用于分离RNA的裂解试剂可以被配置为分离所有RNA或优选仅一种类型的RNA，其可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。在一些实施例中，在用裂解试剂处理稳定的生物细胞之前，可以用介质或含水洗涤溶液洗涤稳定的生物细胞以除去生物细胞周围的介质中的过量稳定试剂和其他可溶性物质。在一些实施例中，裂解稳定的生物细胞的步骤可以进一步包括另外的操作以制备裂解的生物细胞以从裂解的生物细胞中回收所需的核酸。

稳定核酸的方法可以进一步包括分离从裂解的稳定的生物细胞释放的稳定的核酸群的至少一部分。分离可以通过沉淀、溶剂提取、特异性捕获到具有寡核苷酸捕获配体的基质或珠子上或者亲和捕获到电荷捕获基质上来进行。

该方法可以进一步包括分析从裂解的稳定化生物细胞中分离的至少一部分核酸群。可以分析所有类别的分离的核酸群，或者可以仅分析选定类别的核酸。可以分析gDNA、mDNA、mRNA、rRNA和/或tRNA中的任何一种。分析可包括测序(例如，电泳、下一代测序，其可包括通过合成测序、单分子、离子半导体、焦磷酸测序、纳米孔测序等)、杂交实验(包括但不限于原位杂交、FISH、qPCR、dPCR、

(ThermoFisher Scientific)、分子信标和其他荧光探针分析)、足迹法、捕获到阵列和凝胶电泳。在一个特定的实施例中，通过测序分析mRNA以进行转录组分析。转录组分析可用于检查生物细胞中的全局基因表达变化，其可用于鉴定病理细胞状态和/或探索解决病理学的选择。

在一些实施例中，这些方法可包括在微流体环境内操纵生物细胞。因此，本文提供了一种用于稳定微流体设备内的生物细胞中的核酸群的方法。微流体设备可以被配置为像本文所述的任何微流体设备(例如，设备100、200、240、290，其中任何一个可以包括如下所述的DEP配置和/或电润湿配置)，其可以是光学致动的。微流体设备可以具有封壳，其中封壳包括配置成容纳流体介质的流动区域；配置成容纳流体介质的至少一个腔室，其中腔室流体连接到所述流动区域。生物细胞可以设置在微流体设备内，并且可以进一步设置在封壳内的至少一个腔室内。可以使用介电泳力(DEP)将生物细胞引入微流体设备中。此外，当将生物细胞引入微流体设备的封壳内的至少一个腔室中时，可以使用DEP力来执行在腔室内设置的步骤。可以使细胞与至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包括电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，其中所述接触进行足以稳定核酸群的一段时间。稳定试剂包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、包括电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂，所述稳定试剂可用于接触生物细胞的步骤，并且可以是本文所述稳定试剂的任何实施例。该方法可以进一步包括上述用于稳定微流体设备外部的生物细胞的方法的任何步骤。

在一些实施例中，封壳内的腔室可以是隔绝围栏，其具有隔离区域和将隔离区域流体连接到流动区域(例如微流体通道)的连接区域，隔离区域和连接区域被配置成使得介质的组分基本上仅通过扩散在流动区域和隔绝围栏的隔离区域之间交换。在一些实施例中，生物细胞可以设置在微流体设备的隔绝围栏的隔离区域内。稳定试剂可以流入微流体设备的流动区域(可以是通道)，并且随后可以通过扩散到腔室中(或者，如果腔室是隔绝围栏，通过扩散到隔绝围栏的隔离区域中)接触生物细胞。

使生物细胞与稳定试剂(至少包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、可以是电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂)接触的步骤可以进行约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时或更长时间的时间。在一些实施例中，接触时间的范围可以为约5分钟至约1小时、约5分钟至约45分钟、约5分钟至约30分钟、或约5分钟至约15分钟。接触步骤可在约38℃、37℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、5℃或约0℃下进行。

该方法可包括将稳定的生物细胞储存一段时间。细胞可以储存在微流体设备内，例如，稳定的细胞在储存期间不从腔室(或隔绝围栏的隔离区域)移动。因此，可以储存整个微流体设备。细胞可以储存在微流体设备内约2小时、5小时、8小时、14小时、20小时、1天、2天、3天4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、几个月、或其间的任何时间。在一些实施例中，稳定的细胞可以储存约1小时至约24小时、约6小时至约18小时、约12小时至约24小时、约18小时至约30小时、约24小时至约36小时、约30小时至约42小时、约36小时至约48小时、约42小时至约54小时、约48至约60小时、或任何这些范围内的任何长度的时间。可能需要将稳定化的细胞储存在微流体设备上，温度低于典型的室温(例如20℃)。在一些实施例中，细胞可以在约0℃至约4℃范围的温度下储存在微流体设备内。0℃至约10℃(例如，约0℃至约5℃或约2℃至约5℃)。在其他实施例中，细胞可以在约-30℃至约-25℃、约-30℃至约0℃、约-25℃至约0℃、约-25℃至约4℃、或这些范围内的任何选定温度的温度下储存。

稳定微流体设备内的生物细胞中的核酸的方法可以进一步包括裂解稳定化的生物细胞。例如，可以通过使生物细胞与裂解试剂接触来裂解稳定化的生物细胞。稳定的生物细胞可以在微流体设备内或微流体设备外(例如，在从微流体设备输出稳定的生物细胞之后)与裂解试剂接触。用于分离DNA的裂解试剂可进一步配置为分离所有DNA，选择性分离基因组DNA(gDNA)或线粒体DNA(mDNA)。用于分离RNA的裂解试剂可以被配置为分离所有RNA或优选仅一种类型的RNA，其可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。裂解试剂与稳定的生物细胞的接触可以包括使裂解试剂流入微流体设备的流动区域(其可以是通道)。因此，裂解试剂可以通过从流动区域扩散到腔室中(或者，如果腔室是隔绝围栏，则通过扩散到隔绝围栏的隔离区域中)而接触生物细胞。在将裂解试剂流入微流体设备的流动区域之前，可以洗涤稳定的生物细胞以去除腔室内(或隔绝围栏的隔离区域)内的稳定细胞周围的过量稳定试剂或介质的其他组分。洗涤可以通过使洗涤溶液或缓冲液流入和/或通过微流体设备的流动区域(通道)来完成，因此过量的稳定试剂和/或细胞周围的介质的其他组分可以通过扩散进入流动区域(通道)中的介质中而交换，从而将其从稳定化细胞周围的环境中除去。在一些实施例中，裂解稳定的生物细胞的步骤可以进一步包括另外的操作以制备裂解的生物细胞以从裂解的生物细胞中回收所需的稳定的核酸群。或者，稳定化的生物细胞可以从微流体设备输出到洗涤溶液或缓冲液中。可以使用介电泳力进行稳定的生物细胞的输出。介电泳力可以是光学致动的。

在微流体设备内稳定生物细胞内的核酸的方法可以进一步包括分离从裂解的生物细胞释放的稳定的核酸群的至少一部分。稳定核酸的分离可以通过将释放的稳定核酸群捕获到捕获基质(包括但不限于珠上的捕获寡核苷酸或捕获寡核苷酸，其可以是引物，印刷到微流体设备的表面上)来实现。在其中稳定的生物细胞在微流体设备内裂解的实施例中，释放的稳定的核酸可以被捕获在微流体设备内。例如，在微流体设备包括DEP配置的实施例中，当细胞被裂解时，捕获基质(例如，珠子)可以位于与稳定的生物细胞相同的腔室/隔绝围栏内，或者可替代地，在稳定的生物细胞裂解后，可以将捕获基质移入腔室/隔绝围栏中。捕获基质可以通过介电泳力与稳定/裂解的生物细胞一起置于腔室/隔绝围栏中，在一些实施例中，介电泳力可以是光学致动的。在微流体设备包括电润湿配置(例如，光电润湿配置)的实施例中，可以通过将捕获基质引入包含核酸的水性介质液滴中来实现裂解细胞的核酸的分离(例如，通过将含有捕获基质的液滴与包含释放的核酸的液滴合并)；通过将包含释放的核酸的水性介质液滴移动到微流体设备上捕获基质所在的另一区域，或者通过将液滴输出微流体设备进行进一步处理来实现裂解细胞的核酸的分离。当包含释放的核酸的水性介质液滴移动到微流体设备上的另一个区域以被捕获时，释放的核酸可以被捕获基质(诸如捕获珠)捕获，或者释放的核酸可以被捕获寡核苷酸(其可以是引物，其可以固定(例如，印刷)到微流体设备的表面)捕获。印刷的引物可以位于已经进行裂解的区域内或微流体设备的另一区域内。或者，可以通过将包含捕获释放的核酸的珠子的水性介质液滴移动到微流体设备的另一区域或通过将包含捕获了释放的核酸的珠子的液滴输出微流体设备来分离核酸。

该方法可以进一步包括分析来自从裂解的生物细胞释放的稳定化核酸群的至少一部分的至少一类核酸。分析可以在芯片外进行，通过输出核酸或如上所述结合核酸的捕获基质；或者可以在微流体设备的另一区域中在芯片上进行。芯片上分析可包括杂交测定或其他荧光检测方法(例如，原位杂交、FISH、qPCR、dPCR、TaqMan、分子信标等)。

在微流体设备外部进行的分析可包括但不限于测序、杂交实验(包括但不限于原位杂交、FISH、qPCR、dPCR、

(ThermoFisher Scientific)、分子信标和其他荧光探针分析)、足迹法、捕获到阵列和凝胶电泳。在一些实施例中，通过测序分析mRNA以进行转录组分析。

细胞。生物细胞可以是任何种类的生物细胞，原核生物的或真核生物的。在一些实施例中，生物细胞可以是哺乳动物细胞。哺乳动物生物细胞可以是人、灵长类动物、猪、鼠、大鼠、犬等。生物细胞可以源自患有细胞病症的受试者，包括增殖性、感染性、自身免疫性和/或内分泌病症。生物细胞可以源自正常受试者或来自基因工程受试者。生物细胞可以来自杂交瘤、培养的细胞样本或细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。或者，生物细胞可以源自受试者的血液、尿液、泪液、汗液或粪便，特别是人类受试者。在其他实施例中，生物细胞可以源自从受试者切除的组织样本，包括但不限于切除的肿瘤样本和活检样本、细针抽吸物和福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样本。生物细胞可以是免疫细胞(例如白细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞等)、乳腺细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、肺细胞或任何类型的肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞，包括但不限于黑素瘤、乳房等。

组合物。在一些实施例中，提供了组合物。组合物可包括如本文所述的生物细胞和稳定试剂。稳定试剂可包括至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂。在一些实施例中，稳定试剂可以进一步包括第二蛋白质翻译抑制剂。至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、至少一种电子传递链剂和任选的第二蛋白质翻译抑制剂可以是如上所述的每种类型的任何合适种类。该组合物可以进一步包括任何另外描述的稳定试剂的组分(例如，蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂、缓冲剂等)。

试剂盒。在一些实施例中，可提供用于稳定细胞内核酸群的试剂盒。试剂盒可包括稳定试剂，其包括至少一种蛋白质翻译抑制剂；至少一种核糖核酸转录抑制剂；和选自电子传递链抑制剂和电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂。至少第一蛋白质翻译抑制剂可以是不可逆的抑制剂。

在一些实施例中，试剂盒可以提供稳定试剂以稳定脱氧核酸以用于储存和随后的DNA分离。在其他实施例中，试剂盒可以提供稳定试剂，其将稳定核糖核酸(RNA)用于储存和随后的分离。在一些实施例中，试剂盒可以提供稳定试剂以稳定信使RNA(mRNA)用于储存和随后的分离。稳定试剂可以是如本文所述的任何稳定试剂。

在试剂盒的各种实施例中，至少一种蛋白质翻译抑制剂(例如，不可逆的)可以是细胞膜可渗透的。不可逆蛋白质翻译抑制剂可选自氨基糖苷类抗生素、D-半乳糖胺和依米丁。在一些实施例中，不可逆蛋白质翻译抑制剂可以是依米丁。

试剂盒的至少一种核糖核酸转录抑制剂可以是细胞膜可渗透的。核糖核酸转录抑制剂可选自CDK9抑制剂、金丝菌素(aurethricin)、硫藤黄素(thiolutin)、amanitin和/或雷公藤甲素(triptolide)。在各种实施例中，核糖核酸转录抑制剂可以是不可逆的抑制剂。在一些实施例中，核糖核酸转录抑制剂可以是雷公藤甲素。

试剂盒的至少一种电子传递链剂可以是电子传递链抑制剂或电子传递链解偶联剂。电子传递链剂可具有针对其靶标的可逆活性。在一些其他实施例中，电子传递链剂可具有针对其靶标的不可逆活性。电子传递链剂可以是细胞膜可溶的。电子传递链剂可以是任何合适的电子传输链剂，包括但不限于上述任何电子传输链剂。在一些实施例中，电子传递链剂可以是电子传递链抑制剂。在一些实施例中，电子传递链剂可以是叠氮化钠。在一些实施例中，试剂盒中可包含多于一种的电子传递链剂。

试剂盒可以进一步包括第二蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂与第一蛋白质翻译抑制剂不同。在一些实施例中，第二蛋白翻译抑制剂可以是任何合适的蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂可以是不可逆的抑制剂。在一些实施例中，第二蛋白质翻译抑制剂可以是可逆蛋白质翻译抑制剂。第二蛋白质翻译抑制剂可以是快速作用的，例如，在约1、2、3、5、10分钟至约30分钟的时间段内观察到抑制作用。第二蛋白质翻译抑制剂可以是细胞膜可渗透的。第二蛋白质翻译抑制剂可选自重氮氧化物、戊二酰亚胺抗生素和吐根生物碱。在各种实施例中，第二蛋白质翻译抑制剂可以是环己酰亚胺。

在试剂盒的各种实施例中，稳定试剂的一些或所有组分可以作为预制溶液(例如，主混合物)提供，所述预制溶液包括所述稳定试剂的至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、所述至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂中的不止一种。在一些实施例中，主混合物可包含稳定试剂的至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂。主混合物可进一步包括如本文所述的任何稳定试剂的任何其他组分。主混合物中稳定试剂的组分浓度可以是稳定反应本身所需的最终浓度的约1X、2X、5X、10X、20X、50X、100X或约1000X。

试剂盒的其他组分。在各种实施例中，试剂盒不包含RNA酶抑制剂。试剂盒可以进一步包括蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂可以掺入稳定试剂中，或者可以作为试剂盒的独立组分提供。蛋白酶抑制剂可以是半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂或金属蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂可以是任何合适的蛋白酶抑制剂，包括但不限于上述任何蛋白酶抑制剂。

裂解缓冲液。该试剂盒还可以包括裂解缓冲液。裂解缓冲液不包括在稳定试剂或包含稳定试剂的任何溶液中。裂解缓冲液可以在与试剂盒的其他组分分开的容器中提供。裂解缓冲液可以配置为分离基因组或线粒体DNA。在其他实施例中，可以设计裂解缓冲液以分离总RNA或RNA的子集。裂解缓冲液可以变性。裂解缓冲液可包括洗涤剂，其可以是非离子的或两性离子的。在一些实施例中，可以使用离子洗涤剂，例如，当分离DNA时。合适的裂解缓冲液洗涤剂可包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、三(羟甲基)氨基甲基盐酸盐(Tris-HCl)、脱氧胆酸钠、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、聚山梨醇酯20、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、PEG(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、壬基酚聚氧乙烯醚(NP40)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)或聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton^TMX-100)。在一些实施例中，裂解缓冲液洗涤剂可包括SDS。

裂解缓冲液可进一步包括螯合剂，例如EDTA。裂解缓冲液可包括蛋白酶抑制剂，并可进一步包括蛋白酶抑制剂的混合物。在一些实施例中，裂解缓冲液可包括一种或多种磷酸酶抑制剂。

RNA分离。当分离RNA时，裂解缓冲液可以在pH 7-8之间缓冲。RNA的裂解缓冲液可以包括苯酚(以防止RNA降解)和异硫氰酸胍(一种使RNA酶和DNase酶变性的离液剂)。裂解缓冲液可包括一种或多种RNA酶抑制剂。

在试剂盒的一些实施例中，可以在溶液中提供至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、核糖核酸转录抑制剂和电子传递链剂。至少第一不可逆蛋白质翻译抑制剂、核糖核酸转录抑制剂和电子传递链剂中的每一种可以作为单独的容器中的单独溶液提供，或者可以作为试剂盒的一种或多种组分的混合物以任何组合形式提供。试剂盒可以进一步包括一种或多种蛋白酶抑制剂，其可以是任何合适的蛋白酶抑制剂(包括但不限于本文所述的蛋白酶抑制剂)。试剂盒可以进一步包括一种或多种RNA酶抑制剂，其可以是任何合适的RNA酶抑制剂(包括但不限于本文所述的RNA酶抑制剂)。在一些实施例中，稳定试剂的所有组分作为单一溶液提供在试剂盒中。当稳定试剂的任何或所有组分以溶液形式提供时，组分的浓度可以是用于稳定细胞的核酸的最终浓度的1X、2X、3X、5X、10X、50X、100X或1000X，因此，允许在添加到生物细胞之前稀释试剂盒的溶液。

在试剂盒的各种实施例中，至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂在溶液中的浓度可以为约1.0微摩尔至约2M；约1.0微摩尔至约0.5M；约1.0微摩尔至约500毫摩尔；约1.0微摩尔至约250毫摩尔；约0.1毫摩尔至约150毫摩尔；约0.1毫摩尔至约50毫摩尔；约1毫摩尔至约100毫摩尔；约1毫摩尔至约50毫摩尔；约10毫摩尔至约1摩尔，或这些范围之间的任何值。

在试剂盒的各种实施例中，至少一种核糖核酸转录抑制剂存在于溶液中的浓度为约10纳摩尔至约500毫摩尔；约0.01微摩尔至约500毫摩尔；约0.1微摩尔至约50毫摩尔；约0.1微摩尔至约5毫摩尔；约0.1微摩尔至约500微摩尔；或这些范围之间的任何值。

在试剂盒的各种实施例中，至少一种电子传递链剂的浓度为：约0.1微摩尔至约5M；约0.1微摩尔至约1M；约0.1微摩尔至约500毫摩尔；约0.3毫摩尔至约250毫摩尔；约0.3毫摩尔至约150毫摩尔；约0.5毫摩尔至约100毫摩尔；约1.0微摩尔至约500毫摩尔；约1.0毫摩尔至约100毫摩尔；或这些范围之间的任何值。

在试剂盒的各种实施例中，第二蛋白质翻译抑制剂在溶液中的浓度可以为：约1.0微摩尔至约2M；约1.0微摩尔至约0.5M；约1.0微摩尔至约500毫摩尔；约1.0微摩尔至约250毫摩尔；约0.1毫摩尔至约150毫摩尔；约0.1毫摩尔至约50毫摩尔；约1毫摩尔至约100毫摩尔；约1毫摩尔至约50毫摩尔；约10毫摩尔至约1摩尔，或这些范围之间的任何值。

用于操作和观察这种设备的微流体设备和系统。图1A示出了根据本公开实施例的可用于维持、扩增和分析微物体的微流体设备100和系统150的示例。示出了微流体设备100的透视图，其具有其盖110的局部切割以提供微流体设备100的局部视图。微流体设备100通常包括微流体回路120，该微流体回路120包括流体路径106，流体介质180可通过该流体路径106流动，可选地将一个或更多个微物体(未示出)携带到微流体回路120中和/或通过微流体回路120。尽管在图1A中示出了单个微流体回路120，但是合适的微流体设备可以包括多个(例如2个或3个)这样的微流体回路。无论如何，微流体设备100可以配置成纳米流体设备。如图1A所示，微流体回路120可以包括多个微流体隔绝围栏124、126、128和130，每个隔绝围栏可以具有与流动路径106流体连通的一个或更多个开口。在图1A的设备的一些实施例中，隔绝围栏可以仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。如下面进一步讨论的，微流体隔绝围栏包括各种特征和结构，这些特征和结构已经被优化用于将微物体保持在诸如微流体设备100的微流体设备中，即使当介质180流过流动路径106时。然而，在转向前述之前，提供微流体设备100和系统150的简要描述。

如图1A中大体所示，微流体回路120由封壳102限定。虽然封壳102可以物理构造成不同的配置，但在图1A所示的示例中，封壳102被描绘为包括支撑结构104(例如基部)、微流体回路结构108和盖110。支撑结构104、微流体回路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体回路结构108可以设置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以设置在微流体回路结构108上方。与支撑结构104和盖110一起，微流体回路结构108可以限定微流体回路120的元件。

如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体回路120底部，并且盖110可以位于微流体回路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他方位配置。例如，支撑结构104可以位于微流体回路120的顶部，并且盖110可以位于微流体回路120的底部。无论如何，可以有一个或更多个端口107，每个端口包括进入或离开封壳102的通道。通道的示例包括阀门、闸门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于封壳102的其他部件中，例如盖110。图1A中仅示出一个端口107，但微流体回路120可具有两个或更多个端口107。例如，可以存在用作流体进入微流体回路120的入口的第一端口107，并且可以存在用作流体离开微流体回路120的出口的第二端口107。端口107作为入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。

支撑结构104可以包括一个或更多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或更多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，全部或部分半导体衬底可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。

微流体回路结构108可以限定微流体回路120的回路元件。这样的回路元件可以包括当微流体回路120充满流体时，可以流体上互连的空间或区域，诸如流动区(其可以包括或可以是一个或更多个流动通道)、腔室、围栏、捕集器等。在图1A所示的微流体回路120中，微流体回路结构108包括框架114和微流体回路材料116。框架114可以部分地或完全封闭微流体回路材料116。框架114可以是例如基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。

可以用空腔等来图案化微流体回路材料116以限定微流体回路120的回路元件和互连。微流体回路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅树脂、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气的。可构成微流体回路材料116的材料的其他示例包括模制玻璃、诸如硅树脂的可蚀刻材料(例如可光图案化聚硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如SU8)等。在一些实施例中，这样的材料(并且因此微流体回路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体回路材料116可以设置在支撑结构104上并且设置在框架114内部。

盖110可以是微流体回路材料116和/或框架114的整体部分。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体回路材料116相同或不同的材料。类似地，如图所示，支撑结构104可以是与微流体回路材料116或框架114分开的结构，或者是微流体回路材料116或框架114的整体部分。类似地，框架114和微流体回路材料116可以是如图1A所示的分离结构或相同结构的整体部分。

在一些实施例中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有相似性质的材料。在一些实施例中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施例中，盖110可以包括刚性和可变形材料。例如，盖110的一个或更多个部分(例如，位于隔绝围栏124、126、128、130上方的一个或更多个部分)可以包括与盖110的刚性材料相接的可变形材料。在一些实施例中，盖110可以进一步包括一个或更多个电极。该一个或更多个电极可以包括导电氧化物，诸如氧化铟锡(ITO)，其可以被涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，所述一个或更多个电极可以是嵌入可变形材料中的柔性电极，例如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合，所述可变形材料例如聚合物(例如，PDMS)。例如，在US2012/0325665(Chiou等人)中描述了可用于微流体设备的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，盖110可以被修改(例如，通过调节向内面向微流体回路120的表面的全部或部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修改可以包括合成或天然聚合物的涂覆。在一些实施例中，盖110和/或支撑结构104可以对光是透明的。盖110还可以包括至少一种气体可渗透的材料(例如，PDMS或PPS)。

图1A还示出了用于操作和控制微流体设备(例如微流体设备100)的系统150。系统150包括电源192、成像设备194(包括在成像模块164中，其中设备194本身未在图1A中示出)和倾斜设备190(倾斜模块166的一部分，其中设备190未在图1A中示出)。

电源192可以向微流体设备100和/或倾斜设备190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。例如，电源192可以包括一个或更多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像设备194(下面讨论的成像模块164的一部分)可以包括用于捕获微流体回路120内的图像的设备，例如数码相机。在一些情况下，成像设备194还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度的检测器(例如，用于低光照应用)。成像设备194还可以包括用于将刺激辐射和/或光束引导到微流体回路120中并且收集从微流体回路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。反射光束可以包括源自LED或宽光谱灯(例如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯)的反射的发射。如关于图3B所讨论的，成像设备194可以进一步包括显微镜(或光学系列)，其可以包括或不包括目镜。

系统150进一步包括倾斜设备190(下面讨论的倾斜模块166的一部分)，倾斜设备190被配置成围绕一个或更多个旋转轴线旋转微流体设备100。在一些实施例中，倾斜设备190被配置为围绕至少一个轴支撑和/或保持包括微流体回路120的封壳102，使得微流体设备100(并且因此微流体回路120)可以保持在水平方位(即相对于x轴和y轴成0°)、垂直方位(即相对于x轴和/或y轴成90°)或其间的任何方位。微流体设备100(和微流体回路120)相对于轴线的方位在本文中被称为微流体设备100(和微流体回路120)的“倾斜”。例如，倾斜设备190可以使微流体设备100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平方位(以及x轴和y轴)被定义为垂直于由重力定义的垂直轴。倾斜设备还可以使微流体设备100(和微流体回路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的角度，或使微流体设备100(和微流体回路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体设备100(和微流体回路120)。类似地，在一些实施例中，倾斜设备190使微流体设备100(和微流体回路120)围绕由流动路径106或微流体回路120的一些其他部分限定的旋转轴线倾斜。

在一些情况下，微流体设备100倾斜成垂直方位，使得流动路径106位于一个或更多个隔绝围栏的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106在由重力限定的垂直轴线上定位成高于一个或更多个隔绝围栏(即，位于流动路径106上方的隔绝围栏中的物体将具有比流动区/通道中的物体更高的重力势能)。本文使用的术语“下方”表示流动路径106在由重力限定的垂直轴线上定位成低于一个或更多个隔绝围栏(即，位于流动路径106下方的隔绝围栏中的物体将具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。

在一些情况下，倾斜设备190使微流体设备100围绕平行于流动路径106的轴线倾斜。此外，微流体设备100可以倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或更多个隔绝围栏的上方或下方，而不会位于隔绝围栏的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜设备190使微流体设备100围绕垂直于流动路径106的轴线倾斜。在又一些情况下，倾斜设备190使微流体设备100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴线倾斜。

系统150还可以包括介质源178。介质源178(例如容器、储存器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，如图1A所示，介质源178可以是位于微流体设备100之外并与微流体设备100分离的设备。或者，介质源178可全部或部分位于微流体设备100的封壳102内。例如，介质源178可以包括作为微流体设备100的一部分的储存器。

图1A还示出了构成系统150的一部分并且可以与微流体设备100结合使用的控制和监测设备152的示例的简化框图描绘。如图所示，这种控制和监测设备152的示例包括主控制器154，包括用于控制介质源178的介质模块160、用于控制微流体回路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质的液滴)的移动和/或选择的动力模块162、用于控制用于捕获图像(例如数字图像)的成像设备194(例如，照相机、显微镜、光源或其任何组合)的成像模块164、以及用于控制倾斜设备190的倾斜模块166。控制设备152还可以包括用于控制、监测或执行关于微流体设备100的其他功能的其他模块168。如图所示，设备152还可以包括显示设备170和输入/输出设备172。

主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据存储为存储器158中的非暂时性数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。可替代地地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。介质模块160、动力模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以类似地进行配置。因此，可以由如上配置的主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任何一个或更多个来执行本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体装置所执行的功能、过程动作、动作或过程步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中所使用的数据。

介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到封壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从封壳102中去除介质(例如，通过输出端口(未示出))。因此可将一个或更多个介质选择性地输入到微流体回路120中或从微流体回路120移除。介质模块160还可以控制微流体回路120内的流动路径106的流体介质180的流动。例如，在一些实施例中，介质模块160在倾斜模块166使倾斜设备190将微流体设备100倾斜期望的倾斜角度之前停止介质180在流动通路106中并且穿过封壳102的流动。

动力模块162可以被配置为控制微流体回路120中的微物体的选择、捕集和移动。如下面针对图1B和图1C所讨论的，封壳102可以包括介电泳(DEP)、光电子镊子(OET)和光-电润湿(OEW)配置(在图1A中未示出)，动力模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔绝围栏124、126、128、130中的介质的液滴(未示出)和/或微物体(未示出)。

成像模块164可以控制成像设备194(未示出)。例如，成像模块164可以接收并处理来自成像设备194的图像数据。来自成像设备194的图像数据可以包括由成像设备194捕获的任何类型的信息(例如，微物体的存在或不存在、介质的液滴、标签(诸如荧光标签等)的积聚)。使用由成像设备194捕获的信息，成像模块164可以进一步计算物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体在微流体设备100内的运动速率。

倾斜模块166可以控制倾斜设备190的倾斜运动。可选择地或者另外，倾斜模块166可以控制倾斜速率和定时，以优化通过重力将微物体转移到一个或更多个隔绝围栏。倾斜模块166与成像模块164通信地耦合以接收描述微流体回路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用这个数据，倾斜模块166可以调整微流体回路120的倾斜，以便调整的微物体和/或介质液滴在微流体回路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用这个数据迭代地调整微流体回路120中的微物体和/或介质液滴的位置。

在图1A所示的示例中，微流体回路120被图示为包括微流体通道122以及隔绝围栏124、126、128、130。每个围栏包括通向通道122的开口，除此而外被包围，使得围栏可以将围栏内的微物体与通道122的流动路径106中或其他围栏中的流体介质180和/或微物体基本上隔离。隔绝围栏的壁从基部的内表面109延伸到盖110的内表面而提供围壁。围栏到微流体通道122的开口相对于流体介质180的流动106成一定角度定向，使得流动106不被引导到围栏中。该流动可以与围栏的开口的平面相切或正交。在一些情况下，围栏124、126、128、130被配置为物理地围住微流体回路120内的一个或更多个微物体。根据本公开的隔绝围栏可以包括为了与DEP、OET、OEW、流体流动和/或重力一起使用而优化的各种形状、表面和特征，如将在下面详细讨论的。

微流体回路120可以包括任何数量的微流体隔绝围栏。尽管显示了五个隔绝围栏，但微流体回路120可以具有更少或更多的隔绝围栏。如图所示，微流体回路120的微流体隔绝围栏124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供对维持、隔离、分析或培养生物微物体有用的一个或更多个益处。在一些实施例中，微流体回路120包括多个相同的微流体隔绝围栏。

在图1A所示的实施例中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施例可包含多个通道122，每个通道配置成包括流动路径106。微流体回路120还包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径以Z字形图案布置，由此流动路径106在交替方向上两次或更多次穿过微流体设备100。

在一些情况下，微流体回路120包括多个平行通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质在正向或反向中的至少一个方向上流动。在一些情况下，配置多个隔绝围栏(例如，相对于通道122)，使得隔绝围栏可以并行地加载目标微物体。

在一些实施例中，微流体回路120还包括一个或更多个微物体捕集器132。捕集器132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔绝围栏124、126、128、130中的一个或更多个隔绝围栏的开口相对地定位。在一些实施例中，捕集器132配置成从流动路径106接收或捕获单个微物体。在一些实施例中，捕集器132配置成从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，捕集器132包括大约等于单个目标微物体的体积的容积。

捕集器132还可包括开口，该开口被配置为帮助目标微物体流入捕集器132。在一些情况下，捕集器132包括开口，该开口的高度和宽度近似等于单个目标微物体的尺寸，由此防止较大的微物体进入微物体捕集器。捕集器132还可以包括其他特征，其被配置为帮助将目标微物体保持在捕集器132内。在一些情况下，捕集器132相对于微流体隔绝围栏的开口与通道122的相对侧对齐并位于该相对侧，使得在使微流体设备100围绕平行于微流体通道122的轴线倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离围栏的开口中的轨迹离开捕集器132。在一些情况下，捕集器132包括小于目标微物体的侧通道134，以便于通过捕集器132的流动，从而增加在捕集器132中捕获微物体的可能性。

在一些实施例中，介电泳(DEP)力经由一个或更多个电极(未示出)施加穿过流体介质180(例如，在流动路径和/或隔绝围栏中)以操纵、运输、分离和分选位于其中的微物体。例如，在一些实施例中，DEP力被施加到微流体回路120的一个或更多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔绝围栏中。在一些实施例中，DEP力用于防止隔绝围栏(例如，隔绝围栏124、126、128或130)内的微物体从其移位。此外，在一些实施例中，使用DEP力来选择性地根据本公开的实施例从隔绝围栏移除先前收集的微物体。在一些实施例中，DEP力包括光电镊子(OET)力。

在其他实施例中，光电润湿(OEW)力通过一个或更多个电极(未示出)被施加到微流体设备100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或更多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或隔绝围栏的位置)，来操纵、运输、分离和分选位于微流体回路120中的液滴。例如，在一些实施例中，OEW力被施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或更多个位置，以便将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔绝围栏中。在一些实施例中，OEW力用于防止隔绝围栏(例如，隔绝围栏124、126、128或130)内的液滴从其移位。此外，在一些实施例中，OEW力用于根据本公开的实施例从隔绝围栏选择性地移除先前收集的液滴。

在一些实施例中，DEP和/或OEW力与其他力(例如，流动和/或重力)组合，以便在微流体回路120内操纵、传输、分离和分选微物体和/或液滴。例如，封壳102可以倾斜(例如，通过倾斜设备190)以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔绝围栏上方，并且重力可以将微物体和/或液滴传输进入围栏中。在一些实施例中，可以在其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施例中，DEP和/或OEW力可以在其他力之后施加。在其他情况下，DEP和/或OEW力可以与其他力同时施加或以与其他力交替的方式施加。

图1B、1C和2A-2H示出了可用于实施本公开的实施例的微流体设备的各种实施例。图1B描绘了其中微流体设备200被配置为光学致动的电动设备的实施例。本领域中已知多种光学致动的电动设备，包括具有光电镊子(OET)配置的设备和具有光电润湿(OEW)配置的设备。在下列美国专利文献中说明了合适的OET配置的例子，每个专利文献的全部内容通过引用包含在此：第RE 44,711号美国专利(Wu等人)(最初作为第7,612,355号美国专利公布)；和第7,956,339号美国专利(Ohta等人)。OEW配置的示例在第6,958,132号美国专利(Chiou等人)和公开号为2012/0024708的美国专利申请(Chiou等人)中示出，这两个专利的全部内容通过引用并入本文。光学致动的电动设备的又一个例子包括组合的OET/OEW配置，其示例见于公开号为20150306598(Khandros等人)和公开号为20150306599(Khandros等人)的美国专利及其相应的PCT公开文本WO2015/164846和WO2015/164847，所有这些都通过引用整体并入本文。

已经描述了具有可以放置、培养和/或监测生物微物体的围栏的微流体设备的示例，例如，在US 2014/0116881(2013年10月22日提交的第14/060,117号申请)、US 2015/0151298(2014年10月22日提交的第14/520,568号申请)和US 2015/0165436(2014年10月22日提交的第14/521,447申请)，其每个的全部内容通过引用并入本文。第14/520,568和14/521,447号美国申请还描述了分析在微流体设备中培养的细胞分泌物的示例性方法。前述申请中的每一个进一步描述了微流体设备，其被配置为产生介电泳(DEP)力，例如光电镊子(OET)，或被配置为提供光电润湿(OEW)。例如，US 2014/0116881的图2中所示的光电镊子设备是可以在本公开的实施例中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的设备的示例。

微流体设备动力配置。如上所述，系统的控制和监测设备可以包括动力模块，用于在微流体设备的微流体回路中选择和移动物体，例如微物体或液滴。微流体设备可具有各种动力配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，介电电泳(DEP)配置可用于选择和移动微流体回路中的微物体。因此，微流体设备100的支撑结构104和/或盖110可包括DEP配置，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上引发DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体设备100的支撑结构104和/或盖110可包括电润湿(EW)配置，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的液滴上引发EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴组。

包含DEP配置的微流体设备200的一个示例在图1B和IC中示出。尽管为了简单起见，图1B和1C分别示出了具有区域/腔室202的微流体设备200的封壳102的一部分的侧剖视图和俯视剖视图，应当理解的是，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体回路元件的一部分，诸如生长腔室、隔绝围栏、流动区或流动通道。此外，微流体设备200可以包括其他流体回路元件。例如，微流体设备200可以包括多个生长腔室或隔绝围栏和/或一个或更多个流动区或流动通道，例如本文关于微流体设备100所描述的那些。DEP配置可以结合到微流体设备200的任何这种流体回路元件或其选择部分中。应该进一步理解的是，任何上述或下面描述的微流体设备部件和系统部件可以并入微流体设备200和/或与微流体设备200结合使用。例如，包括上述控制和监测设备152的系统150可以与微流体设备200(包括介质模块160、动力模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或更多个)一起使用。

如图1B所示，微流体设备200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104、以及具有顶部电极210的盖110，其中顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。包含在区域/腔室202中的介质180因此在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接。还示出了被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并在电极之间产生偏置电压的电源212，如在区域/腔室202中产生DEP力所需的那样。电源212可以是例如交流(AC)电源。

在某些实施例中，图1B和1C中所示的微流体设备200可具有光学致动的DEP配置。因此，可以由动力模块162控制的来自光源216的光218的改变图案可以选择性地激活和停用电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的改变图案。(在下文中，具有DEP配置的微流体设备的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，引导到电极活化衬底206的内表面208上的光图案218可以以诸如正方形的图案照射选择的DEP电极区域214a(以白色显示)。以下将未被照射的DEP电极区域214(交叉影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到电极活化衬底206的与流动区106中的介质180交界的内表面208)的相对阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，被照射的DEP电极区域214a呈现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，该相对阻抗小于在每个被照射的DEP电极区域214a处通过区域/腔室202中的介质180的相对阻抗。

在激活电源212的情况下，上述DEP配置在被照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生吸引或排斥流体介质180中的附近的微物体(未示出)的局部DEP力。因此，可以在区域/腔室202的内表面208的许多不同的这种DEP电极区域214处通过改变从光源216投射到微流体设备200中的光图案218而选择性地激活和停用吸引或排斥流体介质180中的微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电性质等参数。

图1C中所示的被照射的DEP电极区域214a的正方形图案220仅是示例。可以通过投射到微流体设备200中的光图案218来照射(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且照射/激活的DEP电极区域214的图案可以通过改变或移动光图案218来重复改变。

在一些实施例中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由光电导材料组成。在这样的实施例中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si：H)层或由其组成。a-Si：H可以包含例如约8％至40％的氢(按100*氢原子数/氢原子和硅原子的总数计算)。a-Si：H层可具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施例中，根据光图案218，DEP电极区域214可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成。因此，DEP电极区域214的数量和图案不需要是固定的，而是可以对应于光图案218。例如在第RE 44,711号美国专利(Wu等人)(最初作为第7,612,355号美国专利公开)中已经描述了具有包括如上所述的光电导层的DEP配置的微流体设备的示例，其全部内容通过引用并入本文。

在其他实施例中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，诸如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，例如包括横向双极光电晶体管，每个光电晶体管对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，每个这样的电极对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括这种光电晶体管或光电晶体管控制电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列，如图2B所示。或者，该图案可以是形成六方点阵的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列。不管何种图案，电路元件可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和停用那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对阻抗大于在相应DEP电极区域214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208至盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照射的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而激活相应DEP电极区域处的DEP电极，如上所述。因此，以由光图案218确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和停用吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。

在例如第7,956,339号美国专利(Ohta等人)中已经描述了具有包括光电晶体管的电极活化衬底的微流体设备的示例(参见例如图21和图22中所示的设备300及其描述)，其全部内容通过引用并入本文。具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体设备的示例已经在例如公开号为2014/0124370的美国专利(Short等人)中描述(参见例如整个附图示出的设备200、400、500、600和900及其描述)，其全部内容通过引用并入本文。

在DEP配置的微流体设备的一些实施例中，顶部电极210是封壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可位于第一壁和第二壁之间。在其他实施例中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一者或两者是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照射封壳102。

利用图1B至图1C的具有DEP配置的微流体设备200，动力模块162可以通过将光图案218投射到微流体设备200中来选择区域/腔室202中的介质180中的微物体(未示出)，以在围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案220)中激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或更多个DEP电极。然后，动力模块162可以通过相对于微流体设备200移动光图案218来移动原位生成的捕获的微物体以激活在DEP电极区域214处的第二组一个或更多个DEP电极。或者，微流体设备200可以相对于光图案218移动。

在其他实施例中，微流体设备200可以具有不依赖于在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对定位的选择性可寻址和可激励电极。开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)可以选择性地打开和闭合，以激活或钝化DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202内的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和介质(未示出)和/或区域/腔室202中的微物体的介电特性的这样的特性，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和停用成组的DEP电极(例如，在形成正方形图案220的成组的DEP电极区域214处)，区域/腔室202中的一个或更多个微物体可被捕集并在区域/腔室202内移动。图1A中的动力模块162可以控制这样的开关并因此激活和停用DEP电极中的单独的DEP电极以选择、捕集和移动围绕区域/腔室202的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励电极的DEP配置的微流体设备在本领域中是已知的，并且已经在第6,294,063号(Becker等)和第6,942,776号(Medoro)美国专利中已经描述，其全部内容通过引用并入本文。

作为又一个示例，微流体设备200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体设备200的与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置(OEW)或电介质上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下所述。对于具有EW配置的微流体设备200，支撑结构104的内表面208是介电层的内表面或其疏水涂层。

介电层(未示出)可包括一个或更多个氧化物层，并且可具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施例中，介电层可包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)。在某些实施例中，介电层可包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅的氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可具有约10k欧姆至约50k欧姆的阻抗。

在一些实施例中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的示例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如

)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如CYTOP^TM)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施例中，疏水性材料可包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施例中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施例中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5-3.0nm)。

在一些实施例中，具有电润湿配置的微流体设备200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体设备200可具有两个电润湿表面。

在一些实施例中，电极活化衬底206可包括光电导材料，例如上文所述。因此，在某些实施例中，电极活化衬底206可包括氢化非晶硅层(a-Si：H)或由其组成。a-Si：H可包含例如约8％至40％的氢(以100*氢原子数/氢和硅原子总数计算)。a-Si：H层可具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，电极活化衬底206可包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，如上所述。具有光电润湿配置的微流体设备在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底构造。例如，第6,958,132号美国专利(Chiou等人，其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si：H的光电导材料的光电润湿配置，而上面引用的公开号为2014/0124370的美国专利(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。

因此，微流体设备200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这种激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体设备200)，接触支撑结构104的内表面208的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)可以移动通过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。

在其他实施例中，微流体设备200可具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括选择性可寻址和可激励的电极，其不依赖于光来激活。因此，电极活化衬底206可包括这种电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是按行和列布置的基本上正方形的EW电极阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边形网格的基本上六边形的EW电极的阵列。无论图案如何，EW电极都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或停用)。通过选择性地激活和停用电极活化衬底206中的EW电极，接触覆盖的介电层或其疏水涂层的的内表面208液滴(未示出)可以在区域/腔室202内移动。图1A中的动力模块162可以控制这样的开关，从而激活和停用各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有选择性可寻址和可激励电极的EWOD配置的微流体设备在本领域中是已知的，并且已在例如第8,685,344号美国专利(Sundarsan等人)中进行了描述，其全部内容通过引用合并于此。

无论微流体设备200的配置如何，电源212都可用于提供为微流体设备200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中参考的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围，其足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以捕集和移动区域/腔室202中的各个微物体(未示出)，如上所述，和/或改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质，也如上所述。这种频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。例如参见第6,958,132号美国专利(Chiou等人)、第RE44,711号美国专利(Wu等人)(最初作为第7,612,355号美国专利公布)以及公开号为US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)的美国专利申请。

隔绝围栏。在图2A-2C所示的微流体设备230内示出了通用隔绝围栏224、226和228的非限制性示例。每个隔绝围栏224、226和228可以包括限定隔离区240的隔离结构232和将隔离区240流体连接到通道122的连接区236。连接区236可以包括通向微流体通道122的近侧开口234和通向隔离区240的远侧开口238。连接区236可以配置成使得从微流体通道122流入隔绝围栏224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到隔离区240中。因此，由于连接区236，设置在隔绝围栏224、226、228的隔离区240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)因此可以与微流体通道122中的介质180的流动分离并且基本上不受其影响。

图2A-2C的隔绝围栏224、226和228各自具有直接通向微流体通道122的单个开口。隔绝围栏的开口从微流体通道122横向打开。电极活化衬底206位于微流体通道122和隔绝围栏224、226和228两者的下面。形成隔绝围栏的底面的隔绝围栏的封壳内的电极活化衬底206的上表面设置在形成微流体设备的流动通道(或流动区)的底面的微流体通道122(或者如果通道不存在则为流动区)内的电极活化衬底206的上表面的相同高度或基本上相同的高度处。电极活化衬底206可以是无特征的或者可以具有不规则或图案化的表面，该表面从其最高高度到最低的凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。通过微流体通道122(或流动区)和隔绝围栏的衬底的上表面中的高度的变化可小于隔绝围栏壁或微流体设备的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体设备200，但这也适用于本文所述的任何微流体设备100、230、250、280、290、320、400、450、500、700。

微流体通道122因此可以是被扫过的区域的示例，并且隔绝围栏224、226、228的隔离区240可以是未被扫过的区域的示例。如上所述，微流体通道122和隔绝围栏224、226、228可以被配置为包含一个或更多个流体介质180。在图2A-2B所示的示例中，端口222连接到微流体通道122并且允许流体介质180被引入微流体设备230或从微流体设备230移除。在引入流体介质180之前，微流体设备可以用诸如二氧化碳气体的气体填装。一旦微流体设备230包含流体介质180，微流体通道122中的流体介质180的流动242可被选择性地产生并停止。例如，如图所示，端口222可以设置在微流体通道122的不同位置(例如，相对的端部)处，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222创建介质的流动242。

图2C示出了根据本公开的隔绝围栏224的示例的详细视图。还示出了微物体246的示例。

如已知的，流体介质180在微流体通道122中经过隔绝围栏224的近侧开口234的流动242可引起介质180进入和/或离开隔绝围栏224的二次流动244。为了将隔绝围栏224的隔离区240中的微物体246与二次流动244隔离，隔绝围栏224的连接区236的长度L_con(即，从近侧开口234到远侧开口238)应该是大于二次流动244进入连接区236的穿透深度D_p。二次流动244的穿透深度D_p取决于在微流体通道122中流动的流体介质180的速度以及与微流体通道122的配置和连接区236到微流体通道122的近侧开口234有关的各种参数。对于给定的微流体设备，微流体通道122和开口234的配置将是固定的，而微流体通道122中的流体介质180的流动242的速率将是可变的。因此，对于每个隔绝围栏224，可以识别通道122中的流体介质180的流动242的最大速度V_max，其确保二次流动244的穿透深度D_p不超过连接区236的长度L_con。只要微流体通道122中的流体介质180的流动242的速率不超过最大速度V_max，则所产生的二次流动244可以被限制到微流体通道122和连接区236并且保持在隔离区240之外。因此，介质180在微流体通道122中的流动242不会将微物体246拉出隔离区240。相反，位于隔离区240中的微物体246将停留在隔离区240中，而与微流体通道122中的流体介质180的流动242无关。

而且，只要微流体通道122中的介质180的流动242的速率不超过V_max，微流体通道122中的流体介质180的流动242将不会使混杂颗粒(例如，微米颗粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122中移动进入隔绝围栏224的隔离区240。因此，连接区236的长度L_con大于二次流动244的最大穿透深度D_p可以防止来自微流体通道122或另一隔绝围栏(例如图2D中的隔绝围栏226、228)的混杂颗粒对一个隔绝围栏224的污染。

因为微流体通道122和隔绝围栏224、226、228的连接区236可能受微流体通道122中的介质180的流动242影响，所以微流体通道122和连接区236可以被认为是微流体设备230的被扫过(或流动)区域。另一方面，隔绝围栏224、226、228的隔离区240可以被认为是未被扫过(或非流动)区域。例如，微流体通道122中第一流体介质180中的组分(未示出)可基本上仅通过第一介质180的组分的扩散从微流体通道122通过连接区236并进入隔离区240中的第二流体介质248而与隔离区240中的第二流体介质248混合。类似地，隔离区240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分的扩散从隔离区240穿过连接区236并且进入微流体通道122中的第一介质180而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施例中，隔绝围栏的隔离区与流动区之间通过扩散进行的流体介质交换程度大于流体交换的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始是相同的，然后变得不同(例如，通过隔离区240中的一个或更多个细胞对第二介质248的调节，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。

如上所述，由微流体通道122中的流体介质180的流动242导致的二次流动244的最大穿透深度D_p可以取决于多个参数。这样的参数的示例包括：微流体通道122的形状(例如，通道可以将介质引导到连接区236中，使介质转移出连接区236，或者在基本上垂直于微流体通道122的连接区236的近侧开口234的方向上将介质引导到微流体通道122中)；微流体通道122在近侧开口234处的宽度W_ch(或截面积)；和在近侧开口234处的连接区236的宽度W_con(或截面积)；流体介质180在微流体通道122中的流动242的速度V；第一介质180和/或第二介质248的粘度等。

在一些实施例中，微流体通道122和隔绝围栏224、226、228的尺寸可相对于微流体通道122中的流体介质180的流动242的矢量如下定向：微流体通道宽度W_ch(或微流体通道122的截面积)可以基本上垂直于介质180的流动242；连接区236在开口234处的宽度W_con(或截面积)可以基本平行于微流体通道122中的介质180的流动242；和/或连接区的长度L_con可以基本垂直于微流体通道122中的介质180的流动242。以上仅是示例，并且微流体通道122和隔绝围栏224、226、228的相对位置可以相对于彼此处于其他方位。

如图2C所示，连接区236的宽度W_con可以从近侧开口234到远侧开口238是均匀的。因此，在远侧开口238处的连接区236的宽度W_con可以是本文为连接区236在近侧开口234处的宽度W_con所标识的任何范围内。或者，远侧开口238处的连接区236的宽度W_con可以大于近侧开口234处的连接区236的宽度W_con。

如图2C所示，远侧开口238处的隔离区240的宽度可以与近侧开口234处的连接区236的宽度W_con基本相同。因此，在远侧开口238处的隔离区240的宽度可以是本文为连接区236在近侧开口234处的宽度W_con所标识的任何范围内。或者，远侧开口238处的隔离区240的宽度可以大于或小于近侧开口234处的连接区236的宽度W_con。而且，远侧开口238可以小于近侧开口234，并且连接区236的宽度W_con可以在近侧开口234和远侧开口238之间变窄。例如，连接区236可以使用各种不同的几何形状(例如倒角连接区，斜切连接区)而在近侧开口和远侧开口之间变窄。此外，连接区236的任何部分或子部分(例如，连接区与近侧开口234相邻的一部分)可以变窄。

图2D-2F描绘了包含微流体回路262和流动通道264的微流体设备250的另一个示例性实施例，其是图1A的相应微流体设备100、回路132和通道134的变型。微流体设备250还具有多个隔绝围栏266，所述隔绝围栏266是上述隔绝围栏124、126、128、130、224、226或228的附加变型。特别地，应该理解的是，图2D-2F中示出的设备250的隔绝围栏266可以代替设备100、200、230、280、290、300中的任何上述隔绝围栏124、126、128、130、224、226或228。类似地，微流体设备250是微流体设备100的另一种变型，并且也可以具有与上述微流体设备100、200、230、280、290、300相同或不同的DEP配置以及本文描述的任何其他微流体系统部件。

图2D-2F的微流体设备250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中描绘的设备100的支撑结构104相同或基本相似)、微流体回路结构256和盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中描绘的设备100的盖122相同或基本相似)。微流体回路结构256包括框架252和微流体回路材料260，其可以与图1A中示出的设备100的框架114和微流体回路材料116相同或基本相似。如图2D所示，由微流体回路材料260限定的微流体回路262可包括多个隔绝围栏266流体连接到的多个通道264(示出两个，但可以有更多)。

每个隔绝围栏266可以包括隔离结构272、隔离结构272内的隔离区270和连接区268。从微流体通道264处的近侧开口274到隔离结构272处的远侧开口276，连接区268将微流体通道264流体连接到隔离区270。通常，根据图2B和2C的上述讨论，通道264中的第一流体介质254的流动278可以产生第一介质254从微流体通道264进入和/或离开隔绝围栏266的相应连接区268的二次流动282。

如图2E所示，每个隔绝围栏266的连接区268通常包括在通向通道264的近侧开口274与通向隔离结构272的远侧开口276之间延伸的区域。连接区268的长度L_con可以大于二次流动282的最大穿透深度D_p，在这种情况下，二次流动282将延伸到连接区268中而不被重新引导到隔离区270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区268可以具有小于最大穿透深度D_p的长度，在这种情况下，二次流动282将延伸穿过连接区268并且朝向隔离区270重新引导。在后一种情况下，连接区268的长度L_c1和L_c2之和大于最大穿透深度D_p，使得二次流动282不会延伸到隔离区270中。无论连接区268的长度L_con是大于穿透深度D_p还是连接区268的长度L_c1和L_c2之和大于穿透深度D_p，不会超过最大速度V_max的第一介质254在通道264中的流动278都将产生具有穿透深度D_p的二次流动，并且在隔绝围栏266的隔离区270中的微物体(未示出，但可以与图2C中所示的微物体246相同或基本相似)将不会被通道264中的第一介质254的流动278从隔离区270中拉出。通道264中的流动278也不会将来自通道264的杂物(未示出)带入隔绝围栏266的隔离区270中。如此，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264移动到隔绝围栏266的隔离区270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是隔绝围栏266的隔离区270中的第二介质258中的组分可以从隔离区270移动到微流体通道264中的第一介质254的唯一机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以开始相同，然后变得不同，例如通过隔离区270中的一个或更多个单元对第二介质进行调节，或者通过改变流过微流体通道264的介质。

如图2E所示，微流体通道264中的微流体通道264的宽度W_ch(即，横向于通过图2D中的箭头278所指示的微流体通道的流体介质流动的方向所取的方向)可以基本垂直于近侧开口274的宽度W_con1并且因此基本平行于远侧开口276的宽度W_con2。然而，近侧开口274的宽度W_con1和远侧开口276的宽度W_con2不必基本上彼此垂直。例如，近侧开口274的宽度W_con1所定向的轴线(未示出)与远侧开口276的宽度W_con2所定向的另一轴线之间的角度可以不是垂直的，因此不是90°。可选方位角度的示例包括以下任何范围内的角度：约30°至约90°，约45°至约90°，约60°至约90°等。

在隔绝围栏(例如124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施例中，隔离区(例如240或270)被配置为包含多个微物体。在其他实施例中，隔离区可以被配置为仅包含一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数量的微物体。因此，隔离区的容积可以是例如至少1x10⁶、2x10⁶、4x10⁶、6x10⁶立方微米或更多。

在隔绝围栏的各种实施例中，近侧开口(例如，234)处的微流体通道(例如，122)的宽度W_ch可以在以下范围中的任何一个范围内：约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米、和100-120微米。在一些其他实施例中，近侧开口(例如234)处的微流体通道(例如，122)的宽度W_ch可以为约200-800微米、200-700微米或200-600微米。以上仅是示例，并且微流体通道122的宽度W_ch可以处于其他范围内(例如，由上面列出的任何端点限定的范围)。此外，在微流体通道的除了隔绝围栏的近侧开口处之外的区域中，微流体通道122的W_ch可以被选择为处于这些范围中的任何范围中。

在一些实施例中，隔绝围栏具有约30至约200微米或约50至约150微米的高度。在一些实施例中，隔绝围栏的截面积为约1x10⁴–3x10⁶平方微米、2x10⁴–2x10⁶平方微米、4x10⁴–1x10⁶平方微米、2x10⁴–5x10⁵平方微米、2x10⁴–1x10⁵平方微米或约2x10⁵–2x10⁶平方微米。

在隔绝围栏的各种实施例中，近侧开口(例如，234)处的微流体通道(例如，122)的高度H_ch可以在以下范围中的任何一个范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。以上仅是示例，并且微流体通道(例如122)的高度H_ch可以处于其他范围(例如，由以上列出的任何端点所定义的范围)中。在微流体通道的除隔绝围栏的近侧开口处之外的区域中，微流体通道122的高度H_ch可以被选择为在任何一个这些范围内。

在隔绝围栏的各种实施例中，近侧开口(例如，234)处的微流体通道(例如，122)的截面积可以在以下范围中的任何一个范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且近侧开口(例如，234)处的微流体通道(例如，122)的截面可以处于其他范围(例如，由以上列出的任何端点限定的范围)内。

在隔绝围栏的各种实施例中，连接区(例如，236)的长度L_con可以处于以下范围中的任一个：约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米或约100-150微米。以上仅是示例，并且连接区(例如236)的长度L_con可以处于与前述示例不同的范围(例如，由上面列出的任何端点限定的范围)中。

在隔绝围栏的各种实施例中，在近侧开口(例如，234)处的连接区(例如，236)的宽度W_con可以处于以下范围中的任一个：20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。前述仅仅是示例，并且近侧开口(例如，234)处的连接区(例如，236)的宽度W_con可以不同于前述示例(例如，由以上列出的任何端点限定的范围)。

在隔绝围栏的各种实施例中，近侧开口(例如，234)处的连接区(例如，236)的宽度W_con可以至少与隔绝围栏所要用于的微物体(例如，可以是T细胞、B细胞或卵子或胚胎的生物细胞)的最大尺寸一样大。前述仅仅是示例，并且近侧开口(例如，234)处的连接区(例如，236)的宽度W_con可以不同于前述示例(例如，由以上列出的任何端点限定的范围)。

在隔绝围栏的各种实施例中，连接区的近侧开口的宽度W_pr可以至少与隔绝围栏所要用于的微物体(例如，诸如细胞的生物微物体)的最大尺寸一样大。例如，宽度W_pr可以是约50微米，约60微米，约100微米，约200微米，约300微米或者可以在约50-300微米，约50-200微米，约50-100微米，约75-150微米，约75-100微米或约200-300微米。

在隔绝围栏的各种实施例中，连接区(例如236)的长度L_con与近侧开口234处的连接区(例如236)的宽度W_con的比率可以大于或等于以下任一比率：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。前述仅是示例，并且连接区236的长度L_con与近侧开口234处的连接区236的宽度W_con的比率可以与前述示例不同。

在微流体设备100、200、23、250、280、290、300的各种实施例中，V_max可设定为约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14或15微升/秒。

在具有隔绝围栏的微流体设备的各种实施例中，隔绝围栏的隔离区(例如，240)的容积可以是例如至少5x10⁵、8x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、4x10⁶、6x10⁶、8x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸或8x10⁸立方微米或更大。在具有隔绝围栏的微流体设备的各种实施例中，隔绝围栏的容积可以是约5x10⁵、6x10⁵、8x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、4x10⁶、8x10⁶、1x10⁷、3x10⁷、5x10⁷或约8x10⁷立方微米或更大。在一些其他实施例中，隔绝围栏的容积可以是约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升。

在各种实施例中，微流体设备具有如本文讨论的任何实施例中配置的隔绝围栏，其中微流体设备具有约5至约10个隔绝围栏、约10至约50个隔绝围栏、约100至约500个隔绝围栏；约200至约1000个隔绝围栏、约500至约1500个隔绝围栏、约1000至约2000个隔绝围栏、约1000至约3500个隔绝围栏、约2500至约5000个隔绝围栏、约3000至约7000个隔绝围栏、约5000至约10000个隔绝围栏或约8000至约12000个隔绝围栏。隔绝围栏不需要全部具有相同的尺寸，并且可以包括多种配置(例如，隔绝围栏内的不同宽度、不同特征)。

图2G示出了根据一个实施例的微流体设备280。图2G中示出了微流体设备280是微流体设备100的程式化图。实际上，微流体设备280及其组成回路元件(例如通道122和隔绝围栏128)将具有本文讨论的尺寸。图2G中示出的微流体回路120具有两个端口107、四个不同通道122和四个不同流动路径106。微流体设备280进一步包括在每个通道122打开的多个隔绝围栏。在图2G所示的微流体设备中，隔绝围栏具有与图2C所示的围栏相似的几何形状，因此具有连接区和隔离区两者。因此，微流体回路120包括被扫过的区域(例如，通道122和连接区236的在二次流动244的最大穿透深度D_p内的部分)和未被扫过的区域(例如，隔离区240和连接区236不在二次流动244的最大穿透深度D_p内的部分)。

图3A至图3B示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体设备(例如100、200、230、250、280、290、300)的系统150的各种实施例。如图3A所示，系统150可以包括被配置为容纳微流体设备100(未示出)或本文描述的任何其他微流体设备的结构(“巢”)300。巢300可以包括能够与微流体设备320(例如，光致动电动设备100)接口并提供从电源192到微流体设备320的电连接的插座302。巢300可以进一步包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当微流体设备320由插座302保持时，偏置电压被施加在微流体设备320中的一对电极上。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。向微流体设备320施加偏置电压的能力并不意味着当微流体设备320由插座302保持时将始终施加偏置电压。而是，在大多数情况下，将间歇地(例如，仅在需要时)施加偏置电压，以便于微流体设备320中的电动力(例如介电电泳或电润湿)的产生。

如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以安装在并且电集成到PCBA 322中。示例性支撑件还包括安装在PCBA 322上的插座302。

通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果存在的话)可以被配置为测量提供给由插座302保持的微流体设备320的波形。在某些实施例中，示波器测量在微流体设备320近侧(并且在波形发生器的远侧)的位置处的波形，从而确保更准确地测量实际施加到设备的波形。从示波器测量中获得的数据可以例如作为反馈提供给波形发生器，并且波形发生器可以被配置为基于这种反馈来调整其输出。一个合适的组合波形发生器和示波器的示例是Red Pitaya^ＴＭ。

在某些实施例中，巢300还包括控制器308，诸如用于感测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的示例包括Arduino^TM微处理器，例如ArduinoNano^TM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(在图1A中示出)通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施例中，控制器308通过接口310(例如插头或连接器)与主控制器154通信。

在一些实施例中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red Pitaya^TM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和放大由Red Pitaya单元生成的波形并传递放大的电压到微流体设备100的波形放大电路。在一些实施例中，Red Pitaya单元被配置成测量微流体设备320处的放大电压，然后根据需要调整其自己的输出电压，使得微流体设备320处的测量电压是期望值。在一些实施例中，波形放大电路可具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V电力供应，从而在微流体设备100处产生高达13Vpp的信号。

如图3A所示，支撑结构300(例如，巢)可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置成调节由支撑结构300保持的微流体设备320的温度。例如，热控制子系统306可以包括帕尔贴(Peltier)热电设备(未示出)和冷却单元(未示出)。帕尔贴热电设备可具有配置成与微流体设备320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。帕尔贴热电设备的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面相交界。冷却块可以连接到流体路径314，流体路径314配置成使冷却流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施例中，支撑结构300包括入口316以及出口318，以接收来自外部储存器(未示出)的冷却流体，将冷却流体引入流体路径314并通过冷却块，然后将冷却流体返回到外部储存器。在一些实施例中，帕尔贴热电设备、冷却单元和/或流体路径314可以安装在支撑结构300的壳体312上。在一些实施例中，热控制子系统306被配置为调节帕尔贴热电设备的温度，以便实现微流体设备320的目标温度。帕尔贴热电设备的温度调节可以例如通过诸如Pololu^TM热电电源(Pololu机器人技术和电子集团)的热电电源来实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，诸如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。

在一些实施例中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是模拟分压器电路(未示出)，其包括电阻器(例如电阻为1kOhm+/-0.1％，温度系数+/-0.02ppm/C0)和NTC热敏电阻(例如标称电阻为1kOhm+/-0.01％)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用所计算的温度值作为板载PID控制回路算法的输入。来自PID控制回路算法的输出可驱动例如Pololu^TM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制信号引脚，以致动热电电源，从而控制帕尔贴热电设备。

巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由接口310(未示出)与外部主控制器154通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，通过控制器308、接口310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154通信。以这种方式，主控制器154尤其可以通过执行用于输出电压调整的缩放计算来辅助电信号生成子系统304。经由耦合到外部主控制器154的显示设备170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。可替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。

如上所述，系统150可以包括成像设备194。在一些实施例中，成像设备194包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜设备(DMD)或微型快门阵列系统(MSA)，其中的任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并且将所接收的光的子组传输到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自己的光(并因此不需要光源332)的设备，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)设备、铁电液晶硅设备(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构化光和非结构化光。在某些实施例中，系统150的成像模块164和/或动力模块162可以控制光调制子系统330。

在某些实施例中，成像设备194还包括显微镜350。在这样的实施例中，巢300和光调制子系统330可以被单独配置成安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置成安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置成安装在显微镜350的端口上。在其他实施例中，这里描述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的整体部件。

在某些实施例中，显微镜350可以进一步包括一个或更多个检测器348。在一些实施例中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如数字相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧速率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括配置成接收来自微流体设备320的反射光和/或发射光并且将反射光和/或发射光的至少一部分聚焦在一个或更多个检测器348上的光具组。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以不同。

在某些实施例中，成像设备194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构化光(例如，经由光调制子系统330)，并且可以使用第二光源334来提供非结构化光。第一光源332可以产生用于光致电激励和/或荧光激发的结构化光，并且第二光源334可以用于提供明场照明。在这些实施例中，动力模块164可以用于控制第一光源332并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光具组可以被配置为(1)当设备被巢300保持时，接收来自光调制子系统330的结构化光并且将结构化光聚焦在微流体设备(例如光致电动设备)中的至少第一区域上，以及(2)接收来自微流体设备的反射光和/或发射光并且将这种反射光和/或发射光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组还可以被配置成当设备被巢300保持时接收来自第二光源的非结构化光并将非结构化光聚焦在微流体设备的至少第二区域上。在某些实施例中，微流体设备的第一区域和第二区域可以是重叠区域。例如，第一区域可以是第二区域的子组。在其他实施例中，第二光源334可另外或可选择地包括激光，激光可具有任何合适波长的光。图3B中示出的光学系统的表示仅是示意性表示，该光学系统可以包括附加滤光器、陷波滤光器、透镜等。当第二光源334包括用于明视野和/或荧光激发以及激光照射的一个或更多个光源时，光源的布置可以从图3B中示出的布置来改变，并且激光照射可以引入到光学系统中的任何合适物理位置。光源432和光源402/光调制子系统404的示意性位置也可以互换。

在图3B中，第一光源332被示为将光提供给光调制子系统330，光调制子系统330向系统355(未示出)的显微镜350的光具组提供结构化光。第二光源334被示为经由分束器336将非结构化的光提供给光具组。来自光调制子系统330的结构化光和来自第二光源334的非结构化光从分束器336穿过光具组一起行进，到达第二分束器(或二向色滤波器338，取决于由光调制子系统330提供的光)，其中光被反射向下通过物镜336到达样本平面342。然后，来自样本平面342的反射光和/或发射光向上返回穿过物镜340，穿过分束器和/或二向色滤光器338，并且到达二向色滤光器346。只有到达二向色滤光器346的一部分光穿过并且到达检测器348。

在一些实施例中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样本平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构化光从样本平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在这个示例中，二向色滤光器346滤除波长大于495nm的可见光。如果从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长，则来自光调制子系统330的光的这种滤除才算完成(如图所示)。实际上，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光将穿过滤波器346到达检测器348。在这样的实施例中，滤波器346用于改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332明显强于第二光源334，则这可以是有益的。在其他实施例中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除红光之外的可见光(例如具有短于650nm的波长的可见光)。

涂覆溶液和涂覆试剂。不希望受理论限制，当微流体设备的至少一个或更多个内表面已得到调理或涂覆，以呈现提供微流体设备与其中维持的生物微物体之间的主要界面的有机和/或亲水分子层时，可以促进在微流体设备(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体设备)内维持(即，生物微物体在微流体设备内表现出增强的活力、更大的扩增和/或更大的便携性)生物微物体(例如，生物细胞)。在一些实施例中，微流体设备的一个或更多个内表面(例如，DEP配置的微流体设备的电极活化衬底的内表面、微流体设备的盖和/或回路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆试剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。

涂覆可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施例中，生物微物体可以在包含一种或更多种涂覆试剂的流体介质中输入微流体设备中。在其他实施例中，微流体设备(例如，DEP配置的微流体设备)的内表面在将生物微物体引入微流体设备之前用包含涂覆试剂的涂覆溶液处理或“涂底漆”。

在一些实施例中，微流体设备的至少一个表面包括涂覆材料，其提供适于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下面所述的经调理表面)。在一些实施例中，微流体设备的基本上所有内表面都包括涂覆材料。涂覆的内表面可包括流动区(例如，通道)、腔室或隔绝围栏的表面或其组合。在一些实施例中，多个隔绝围栏中的每一个具有至少一个内表面涂有涂覆材料。在其他实施例中，多个流动区或通道中的每一个具有至少一个内表面涂覆有涂覆材料。在一些实施例中，多个隔绝围栏中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂覆材料。

涂覆试剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆试剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任何组合。

聚合物类涂覆材料。至少一个内表面可包括包含聚合物的涂覆材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可具有多种结构基序，例如，嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中发现的所有结构基序，所有这些都可适用于本文公开的方法。

聚合物可包括含有亚烃醚部分的聚合物。多种含亚烃醚的聚合物可适用于本文所述的微流体设备。一类非限制性示例性的含亚烃醚的聚合物是两亲性非离子嵌段共聚物，其包括聚合物链内不同比例和位置的聚环氧乙烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)亚单元的嵌段。

聚合物(BASF)是这种类型的嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量M_w可以为约2000Da至约20KDa。在一些实施例中，PEO-PPO嵌段共聚物可具有大于约10(例如，约12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生涂覆表面的特定

聚合物包括

L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烃醚的聚合物是聚乙二醇(PEG M_w<100,000Da)或聚环氧乙烷(PEO，M_w>100,000)。在一些实施例中，PEG可具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的M_w。

在其他实施例中，涂覆材料可包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸亚单元可以是含有亚单元的烷基、链烯基或芳族部分。一个非限制性示例是聚乳酸(PLA)。在其他实施例中，涂覆材料可包括含有磷酸酯部分(在聚合物主链的末端或在聚合物主链的侧基上)的聚合物。在其他实施例中，涂覆材料可包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸亚单元可以是含有亚单元的烷基、链烯基或芳族部分。一个非限制性示例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴脑磺酸。在进一步的实施例中，涂覆材料可包括含有胺部分的聚合物。聚氨聚合物可包括天然聚氨聚合物或合成聚氨聚合物。天然聚氨的示例包括精胺、亚精胺和腐胺。

在其他实施例中，涂覆材料可包括含有糖部分的聚合物。在非限制性示例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可适合于形成可减少或防止微流体设备中的细胞粘附的材料。例如，大小为约3kDa的葡聚糖聚合物可用于为微流体设备内的表面提供涂覆材料。

在其他实施例中，涂覆材料可包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可仅含有天然核苷酸部分或可含有非天然核苷酸部分，其包含碱基、核糖或磷酸酯部分的类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。

在其他实施例中，涂覆材料可包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可包括含天然氨基酸的聚合物或含非天然氨基酸的聚合物，其中任一种可包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性示例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)和/或血清(或多种不同血清的组合)，其包含白蛋白和/或一种或更多种其他类似蛋白质作为涂覆试剂。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施例中，涂覆溶液中的BSA以约1mg/mL至约100mg/mL存在，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、或更多或介于之间。在某些实施例中，涂覆溶液中的血清可以以约20％(v/v)至约50％v/v存在，包括25％、30％、35％、40％、45％、或更多或介于其间。在一些实施例中，BSA可以作为涂覆试剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施例中，BSA可以作为涂覆试剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施例中，血清作为涂覆试剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施例中，可以在涂覆材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于优化细胞粘附以促进细胞生长。可包含在涂覆材料中的细胞基质蛋白可包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施例中，可以在微流体设备的涂覆材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物种。

在一些实施例中，涂覆材料可包括含有环氧烷烃部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中多于一种的聚合物。在其他实施例中，聚合物调理表面可包括多于一种聚合物的混合物，每种聚合物具有环氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以是独立地或同时地掺入涂覆材料中。

共价连接的涂覆材料。在一些实施例中，所述至少一个内表面包括共价连接的分子，所述分子提供适于维持/扩增微流体设备内的生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供经调理表面。

共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团共价连接到微流体设备的一个或更多个表面，如下所述。连接基团还与被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。

在一些实施例中，配置成提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接部分可包括烷基或氟代烷基(包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烃醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(可提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺酸甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。

在各种实施例中，配置成提供适于维持/扩增微流体设备中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接部分可包括非聚合部分，例如烷基部分、诸如氟烷基部分的取代烷基部分(包括但不限于全氟烷基部分)、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可包括聚合部分，其可以是上述任何部分。

在一些实施例中，共价连接的烷基部分可包含形成直链的碳原子(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施例中，烷基可包括取代烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施例中，烷基可包括连接至第二片段的第一片段，第一片段可包括全氟烷基，第二片段可包括未取代烷基，其中第一片段和第二片段可直接或间接连接(例如，通过醚键的方式)。烷基的第一片段可位于连接基团的远端，并且烷基的第二片段可位于连接基团的近端。

在其他实施例中，共价连接部分可包括至少一个氨基酸，其可包括多于一种类型的氨基酸。因此，共价连接部分可包括肽或蛋白质。在一些实施例中，共价连接部分可包括氨基酸，其可提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、便携性或其任何组合。

在其他实施例中，共价连接部分可包括至少一个环氧烷部分，并且可包括如上所述的任何环氧烷聚合物。一类有用的含亚烃醚的聚合物是聚乙二醇(PEG M_w<100,000Da)或者聚环氧乙烷(PEO，M_w>100,000)。在一些实施例中，PEG可具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的M_w。

共价连接部分可包括一种或更多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以改性共价连接的糖以引入反应性配对部分，其允许偶联或精制以附着于表面。示例性的反应性配对部分可包括醛、炔烃或卤素部分。多糖可以以随机方式改性，其中可以改性每种糖单体或仅改性多糖内的一部分糖单体以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个示例可以包括葡聚糖多糖，其可以通过未支化的接头间接地偶联到表面。

共价连接部分可包括一个或更多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许微流体设备内(并且任选地，在隔绝围栏和/或流动区(例如，通道)内)的环境的pH改变的结构。

提供经调理表面的涂覆材料可以仅包含一种共价连接部分，或者可以包括多于一种的不同种类的共价连接部分。例如，氟烷基调理表面(包括全氟烷基)可具有全部相同的多个共价连接部分，例如具有相同的连接基团和与表面的共价附着、相同的总长度和相同数量的包含氟代烷基部分的氟亚甲基单元。或者，涂覆材料可具有附着于表面的多于一种的共价连接部分。例如，涂覆材料可包括具有共价连接的烷基或氟代烷基部分(具有指定数量的亚甲基或氟亚甲基单元)的分子，并且还可包括另一组分子，其具有共价附着到具有更多数量的亚甲基或氟亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可提供在涂覆表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求较低的末端和较少的主链原子的第一组分子可以帮助使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个示例中，共价连接部分可以提供在表面上以随机方式呈现交替电荷的两性离子表面。

经调理表面特性。除了经调理表面的组成之外，诸如疏水材料的物理厚度的其他因素可以影响DEP力。各种因素可以改变经调理表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调理表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、浸渍和静电涂覆)。在一些实施例中，经调理表面的厚度的范围为约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何个别值。在其他实施例中，由共价连接部分形成的经调理表面可具有约10nm至约50nm的厚度。在各种实施例中，如本文所述制备的经调理表面具有小于10nm的厚度。在一些实施例中，经调理表面的共价连接部分可在共价连接至微流体设备的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时形成单层，并且可具有小于10nm的厚度(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。这些值与通过旋涂制备的表面的厚度(其通常可具有约30nm的范围内的厚度)形成鲜明对比。在一些实施例中，经调理表面不需要完美形成的单层，以适于在DEP配置的微流体设备内的操作。

在各种实施例中，提供微流体设备的经调理表面的涂覆材料可提供所需的电性质。不受理论的限制，影响涂覆有特定涂覆材料的表面的鲁棒性的一个因素是固有电荷捕集。不同的涂覆材料可能捕集电子，这可能导致涂覆材料的破坏。涂覆材料中的缺陷可能增加电荷捕集并导致涂覆材料的进一步破坏。类似地，不同的涂覆材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕集。在某些实施例中，涂覆材料可具有整体结构(例如，致密堆积的单层结构)，其减少或限制电荷捕集量。

除了其电性质之外，经调理表面还可具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，含有氟化(或全氟化)碳链的经调理表面可提供相对于烷基封端链的减少表面结垢量的益处。如本文所用，表面污垢是指在微流体设备的表面上不加区别材料的沉积量，其可包括例如蛋白质及其降解产物、核酸和相应降解产物等生物材料的永久或半永久沉积。

单一或多部分经调理表面。共价连接涂覆材料可以通过已经含有以下部分的分子的反应来形成，该部分配置成提供适于维持/扩增微流体设备中的生物微物体的有机和/或亲水分子层，如同如下面所描述的。或者，共价连接涂覆材料可以通过将被配置成提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至本身已与表面共价连接的表面改性配体而形成为两部分序列。

制备共价连接涂覆材料的方法。在一些实施例中，共价连接至微流体设备表面(例如，包括隔绝围栏和/或流动区的至少一个表面)的涂覆材料具有式1或式2的结构。当在一个步骤中将涂覆材料引入表面时，它具有式1的结构，而当以多步骤过程引入涂覆材料时，它具有式2的结构。

涂覆材料可以共价连接到DEP配置或EW配置的衬底的表面的氧化物。DEP或EW配置的衬底可包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的天然化学结构的一部分存在，或者可以如下所述引入。

涂覆材料可以通过连接基团(“LG”)与氧化物附接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。配置成在微流体设备中提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到配置成提供适于维持/扩增微流体设备中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接基(“L”)且n为0。当连接基团LG间接连接到该部分时，存在连接基L并且n为1。连接基L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子，其受到化学键合限制，如在本领域中已知的。它可以被从醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团、亚芳基、亚杂芳基或杂环基团组成的组中选择的一个或更多个的任意组合中断。在一些实施例中，连接基L的主链可包含10至20个原子。在其他实施例中，连接基L的主链可包含约5个原子至约200个原子；大约10个原子到大约80个原子；大约10个原子到大约50个原子；或大约10个原子到大约40个原子。在一些实施例中，主链原子都是碳原子。

在一些实施例中，配置成提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以在多步骤过程中添加到衬底的表面，并且具有式2的结构，如上所示。该部分可以是上述任何部分。

在一些实施例中，偶联基团CG代表来自反应部分R_x和反应配对部分R_px(即，配置为与反应部分Rx反应的部分)的反应的所得基团。例如，一个典型的偶联基团CG可以包括甲酰胺基，其是氨基与羧酸衍生物反应的结果，例如活化酯、酰基氯等。其他CG可包括三唑基、甲酰胺基、硫代酰胺基、肟基、巯基、二硫化物、醚或烯基，或可在反应部分与其各自的反应配对部分反应时形成的任何其它合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基L的第二端(即，配置成提供适于维持/扩增微流体设备中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的近端)，其可以包括如上所述的任何元素组合。在一些其它实施例中，偶联基团CG可以中断连接基L的主链。当偶联基团CG是三唑基时，它可以是Click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合三唑基)。

在一些实施例中，使用化学气相沉积将涂覆材料(或表面改性配体)沉积在微流体设备的内表面上。可任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合来预清洁盖110、微流体回路材料116和/或衬底(例如，DEP配置衬底的电极活化衬底206的内表面208，或者EW配置衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可包括在氧等离子体清洁器中处理盖110、微流体回路材料116和/或衬底，其可去除各种杂质，同时引入氧化表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价改性)。或者，代替氧等离子体清洁器来使用液相处理，例如，盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其硫酸与过氧化氢的比率可以为约3：1至约7：1)。

在一些实施例中，在微流体设备200已经组装以形成限定微流体回路120的封壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体设备200的内表面。不希望受理论限制，将这种涂覆材料沉积在完全组装的微流体回路120上可有益于防止由微流体回路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间的弱化结合引起的分层。在采用两步工艺的实施例中，表面改性配体可以通过如上所述的气相沉积引入，随后引入配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。随后的反应可以通过将表面改性的微流体设备暴露于溶液中的合适的偶联剂来进行。

图2H描绘了微流体设备290的截面图，所述微流体设备290具有提供经调理表面的示例性共价连接涂覆材料。如图所示，涂覆材料298(示意性地示出)可包括单层密集填充的分子，其共价地结合到基底286(其可以是DEP衬底)的内表面294和微流体设备290的盖288的内表面292。涂覆材料298可以设置在邻近并向内朝向微流体设备290的封壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施例中并且如上所述，包括用于限定微流体设备290内的回路元件和/或结构的微流体回路材料(未示出)的表面。在替代实施例中，涂覆材料298可以仅设置在微流体设备290的一个或一些内表面上。

在图2H所示的实施例中，涂覆材料298可包括单层有机硅氧烷分子，每个分子经由甲硅烷氧基连接体296共价键合到微流体设备290的内表面292、294。可以使用任何上述涂覆材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、PEG封端的部分、葡聚糖封端的部分、或含有用于有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分设置在其面向封壳的末端(即，涂覆材料298的单层的未与内表面292、294结合并且靠近封壳284的部分)。

在其他实施例中，用于涂覆微流体设备290的内表面292、294的涂覆材料298可包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不受理论的限制，通过在微流体回路120的封壳284的内表面上呈现阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂覆材料298可以与水分子形成强氢键，使得水合作用所得到的水充当将生物微物体与非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。此外，在涂覆材料298与涂层剂结合使用的实施例中，涂覆材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以在封壳284中与介质180(例如，涂覆溶液)中存在的非共价涂层剂(例如，溶液中蛋白质)的带电部分形成离子键。

在其他实施例中，涂覆材料可在其面向封壳的末端处包括亲水性涂层剂，或者可被化学改性为在其面向封壳的末端处呈现亲水性涂层剂。在一些实施例中，涂覆材料可包括含亚烃醚的聚合物，例如PEG。在一些实施例中，涂覆材料可包括多糖，例如葡聚糖。与上面讨论的带电部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)类似，亲水性涂层剂可以与水分子形成强氢键，使得水合作用所得到的水充当将生物微物体与非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。

适当的涂层处理和改进的进一步细节可以在2016年4月22日提交的序号为15/135,707的美国申请中找到，并且其全部内容通过引用并入本文。

用于维持微流体设备的隔绝围栏内的细胞活力的附加系统组件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的其他组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，这种附加的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、pH调节、气体交换、温度控制和细胞废物除去。

实验

示例1.在使用或不使用核酸稳定试剂的情况下核酸分离方案之间的比较。

材料。依米丁(Sigma，目录号E2375)、环己酰亚胺(Sigma，目录号C7698)、雷公藤甲素(Sigma，目录号T3652)、叠氮化钠(Sigma，目录号S2002)均为商业供应。裂解试剂是TCL裂解缓冲液(Qiagen，目录号070498)。使用

XP珠(BeckmanCoulter，目录号A63987)进行RNA分离。使用

XT试剂盒(

目录号FC-131-1024)和

XT Index试剂盒(

目录号FC-131-1001)进行RNA测序。

生物细胞。从ATCC获得OKT3细胞，即小鼠骨髓瘤杂交瘤细胞系(

目录号CRL-8001^TM)。在培养中，细胞表现为悬浮细胞系。通过接种约2×10⁴至约5×10⁵活细胞/mL，并在37℃在20ml伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)(含20％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素)中，使用5％二氧化碳气体环境进行培养来保持培养物。细胞每2-3天分裂。计数OKT3细胞数和活力，并将细胞密度调节至5×10⁵/ml，以将细胞加载到微流体设备上。

如表1所示制备储备溶液。

表1.稳定试剂组分的储备溶液。

如表2所示制备稳定试剂的100x主混合物。将主混合物在-80℃下以30微升等分试样储存。

表2.用于稳定试剂的主混合物组合物。

以约0.5×10⁵浓度获得单个等份的OKT3细胞。对于所测试的五种条件中的每一种，将50微升细胞培养物(在具有20％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM))中一式三份等分。

表3.测试的条件。

通过上下移液将每个副本的每个管混合。将样本置于冰上15分钟，然后移至4℃实验室冰箱中。裂解对照样本在-80℃下储存，而不是在4℃下储存。

存储的样本的存储后处理。储存3天后，处理样本。对于在4℃下储存的每个细胞样本，用含有3.2mM叠氮化钠的PBS洗涤样本2次。简言之，通过以0.3g离心2分钟使细胞沉淀。除去上清液；将细胞沉淀重悬于含有3.2mM叠氮化钠的500微升PBS中。进行重复。第三次离心后，将每个样本中的细胞重悬于含有3.2mM叠氮化钠的50微升PBS中。

RNA分离和随后的测序分析。将所有储存样本(In、NA、WIn和W样本中每种)的2微升细胞悬浮液分别加入到8微升1.25x TCL裂解缓冲液中并上下移液。对于每个裂解对照(LC)样本，将4微升细胞/TCL裂解缓冲液混合物加入到6微升1x TCL裂解缓冲液中并上下移液。

对于每个样本，使用

XP珠粒纯化RNA。如Picelli等，Nature Methods，10,1096-1098(2013)中所述，使用SMART-Seq2方案将分离的RNA扩增12个循环。使用

XT试剂盒和条形码(Nextera XT Index试剂盒)产生RNAseq cDNA测序文库。在

MiSeq上进行测序，每个样本产生3-5百万个2x75bp的读数。

扩增后回收的cDNA量的比较显示在图4中。使用荧光测定法(Qubit^TM荧光计，ThermoFisher Scientific)测量cDNA定量；显示的量是回收的cDNA的总纳克数。标记为Ct1的前两柱代表使用裂解对照(LC)样本1(Ct1)的cDNA扩增反应的技术副本。其余的柱从左到右成对表示：另外两个裂解对照(LC)样本(Ct2和Ct3)；用稳定试剂(In1、In2、In3)处理的三个抑制(In)样本；三个阴性对照(NA)样本(NA1、NA2、NA3)；用稳定试剂(WIn1、WIn2、WIn3)处理的三个PBS洗涤的样本(WIn)；和没有进一步添加(W1、W2、W3)的三个PBS洗涤的样本(W)。每对柱(技术副本)代表在每个副本的特定条件下回收的cDNA的量。可以看出，与对LC、In和NA样本回收的cDNA相比，用(WIn柱对)或不用(W柱对)添加稳定试剂时将细胞洗涤到PBS缓冲液中，导致整体核酸产率非常低。虽然从Ct和NA样本中回收的cDNA的量在产率上相似，但是用稳定试剂处理的样本中分离的RNA的质量更适合于文库制备，如下所述。

从裂解对照样本(LC)和抑制样本(In)回收的cDNA的大小分布如图5所示，裂解对照样本(LC)在第1天没用稳定试剂裂解并且在-80℃下储存(图5A)，抑制样本(In)用稳定试剂处理并在4℃下保存72小时，然后裂解(图5B)。曲线看起来非常相似，表明抑制样本(In)的cDNA大小分布与裂解对照样本(LC)的相比没有显著差异。每组样本的生物分析仪迹线显示出良好的相关性和用于进入测序的相对分布。图5C显示了从NA样本中回收的cDNA的大小分布。与图5A和5B中所示的迹线相比，沿迹线的主分布峰的较低分子量侧明显存在另外的低分子量材料。生物分析仪迹线中显示的较低分子量cDNA表明，相对于LC和In样本，在NA样本中回收的RNA具有增加的降解。因此，尽管观察到大量的cDNA(图4)，但NA样本不提供针对测序优化的cDNA文库。

使用通过Illumina BaseSpace获得的TopHat比对和Cufflinks DE表达模块进行测序数据的分析。差异表达(DE)分析显示在图6中，其针对用稳定试剂(In1、In2、In3)处理的抑制样本，其用裂解对照样本(Ct1、Ct2、Ct3)作为参照。DE分析显示In样本中的140个基因表现出改变的表达水平，范围为3.4X至1.2X。使用1.5x截止值评估，38个基因的表达降低(数据未显示)。降幅最大的是2.09X降低。基因本体分析没有预测表达减少的基因中的特定途径富集。使用1.5X截止值评估，18个基因的表达增加。组蛋白的最大增幅为3.4X。基因本体分析预测了一种特异性富集，即胺分泌途径(2种基因)。总体而言，这些变化似乎是随机的和次要的。因此，与直接裂解和在-80℃下储存(LC)相比，预测在4℃(In)储存之前稳定的细胞的分析实验几乎没有效果。

图7显示了DE分析，其针对储存在4℃的没有稳定化(NA1、NA2、NA3)的阴性对照细胞，其中裂解对照细胞(Ct1、Ct2、Ct3)用作参考。差异表达了三百零三个基因，范围从8.2X到1.2X变化。使用1.5X截止值评估，139个基因的表达降低(数据未显示)。最大降幅为8.2X，基因本体分析预测细胞蛋白修饰(GO：0006464)(28个基因)和代谢过程(GO：0008152)，66个基因的途径富集。使用1.5x截止值评估，18个基因表达增加(数据未显示)。最大增幅是5.4X。基因本体分析没有预测任何特定的途径富集。在用稳定试剂处理的In样本中上调的基因与没有添加稳定试剂的NA细胞中上调的基因重叠，这表明稳定化方法本身没有引发表达增加，但似乎是由于环境暴露和/或处理。

对于用PBS洗涤的WIn细胞，在图8中显示DE分析，其中随后加入稳定试剂，并在4℃下(WIn1、WIn2、WIn3)储存，其中裂解对照细胞用作参照。如使用1.5X截止值所评估的，大量(1160)基因的表达降低(数据未显示)。最大降幅是8.2X。基因本体分析预测了超过10种特定途径的富集。同样地，使用1.5X截止值评估，大量(1108个)基因的表达增加，最大增加为8.4X(数据未显示)。基因本体分析预测了超过10种特定途径的富集。两种特异性基因Samd11和Samd1分别在8.4X和7.9X处激活最高。这两个推定的转录因子可以驱动观察到的大量基因表达变化。

对于用PBS洗涤并且不添加稳定试剂(W1、W2、W3)的W细胞，用裂解对照样本(Ct1、Ct2、Ct3)作为参照，DE分析显示在图9中。如使用1.5X截止值评估的，大量(744个)基因表达降低(数据未显示)。最大降幅是13X。基因本体分析预测了超过10种特定途径的富集。同样地，使用1.5X截止值评估，大量(774个)基因表达增加，最大增加为5.1X(数据未显示)。基因本体分析预测了超过10种特定途径的富集。Samd11再次成为激活最高的基因之一，具有4.6X富集。该转录因子的特征很差，并且可能驱动大量的基因表达变化。

结果显示，在4℃下将细胞储存在介质中的效果不会引发重大变化，尽管代谢基因表达显示出显著降低。然而，通过使用稳定试剂阻断了代谢基因表达的变化(超过60个基因受到影响)。在用PBS等介质洗涤之前，应将稳定试剂添加到细胞。

示例2.在储存后在微流体设备内分离稳定化的核酸。

系统和设备：使用OptoSelect^TM芯片，其是由Berkeley Lights公司制造并由也由Berkeley Lights公司制造的光学仪器控制的纳米流体设备。该仪器包括：用于芯片的安装台，其耦合到温度控制器；泵和流体介质调节组件；以及包括照相机和结构光源的光学系统，适用于激活芯片内的光电晶体管。OptoSelect芯片包括采用OptoElectroPositioning(OEP^TM)技术配置的基板，该技术可提供光电晶体管激活的OET力。芯片还包括多个微流体通道，每个微流体通道具有与其流体连接的多个NanoPen^TM腔室(或隔绝围栏)。每个隔绝围栏的体积约为1×10⁶立方微米。

细胞和培养介质：如上示例1。

微流体设备启动。以12微升/秒的速率流入250微升的100％二氧化碳，然后以12微升/秒流入250微升含有0.1％

F27(Life Technologies，目录号P6866)的PBS，最后以12微升/秒流入250微升的PBS。随后介绍培养介质。

介质灌注。根据以下两种方法之一，将介质灌注通过微流体设备：

1.以0.01微升/秒的速度灌注2小时；以2微升/秒的速度灌注64秒；并重复。

2.以0.02微升/秒的速度灌注100秒；停止流动500秒；以2微升/秒灌注64秒；并重复。

将细胞以如示例1所述的密度引入两个OptoSelect设备中，分别置于NanoPen腔室中并在37℃下培养24小时。

使用由OEP技术产生的光学驱动的介电泳力，从设备1和2中的每一个输出一半的培养细胞。将OKT3细胞的这些对照样本输出到TCL裂解缓冲液(2X)中，混合并在80℃冷冻。

通过以1微升/秒的速率使50微升稳定试剂(2X，从表2的100X主混合物稀释，0.72mM环己酰亚胺、0.36mM依米丁、6微摩尔雷公藤甲素、6.20mM叠氮化钠)流动进入到微流体通道中置换培养介质，稳定OptoSelect设备1内剩余的细胞用于储存。允许稳定试剂扩散到NanoPen腔室中5分钟，并且使OKT3细胞与稳定试剂接触另外15分钟，然后从仪器中取出OptoSelect设备1。将含有稳定化细胞(稳定化)的OptoSelect设备1密封以防止蒸发并在4℃下储存过夜。

将OptoSelect设备2中剩余的细胞移至4℃进行储存，而不添加稳定试剂。将含有非稳定化细胞(非稳定化)的OptoSelect设备2密封以防止蒸发并在4℃下储存过夜。

第二天，将OptoSelect设备1返回仪器，并将含有稳定化混合物的介质冲洗通过设备以更换存储介质。然后将稳定化细胞组从OptoSelect设备输出到TCL裂解缓冲液(2X)中并进行处理以进行文库生成、核酸测序和序列分析，如上文实验1中所述。在与OptoSelect设备1一样存储过夜之后，也将OptoSelect设备2替换到仪器上，用新鲜介质(不含稳定试剂)冲洗并更新装置。然后将该组非稳定化细胞(非稳定化的)从OptoSelect设备输出到TCL裂解缓冲液(2X)中并进行处理以进行文库生成、核酸测序和序列分析，如上文实验1中所述。

与非稳定化细胞和对照细胞之间的基因表达的可变性相比，预期稳定化和对照样本的测序结果显示稳定细胞和对照细胞之间基因表达的可变性降低。

叙述实施例

1.一种用于稳定生物细胞内核酸群的试剂盒，包括：至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂；至少一种核糖核酸转录抑制剂；以及包括电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂。

2.根据实施例1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含第二蛋白质翻译抑制剂。

3.根据实施例2所述的试剂盒，其中所述第二蛋白质翻译抑制剂是可逆蛋白质翻译抑制剂。

4.根据实施例2-3中任一项所述的试剂盒，其中与所述不可逆蛋白质翻译抑制剂相比，所述第二蛋白质翻译抑制剂是快速作用的。

5.根据实施例2-4中任一项所述的试剂盒，其中所述第二蛋白质翻译抑制剂是细胞膜可渗透的。

6.根据实施例2-5中任一项所述的试剂盒，其中所述第二蛋白质翻译抑制剂是重氮氧化物、戊二酰亚胺抗生素和/或吐根生物碱。

7.根据实施例2-6中任一项所述的试剂盒，其中所述第二蛋白质翻译抑制剂是环己酰亚胺。

8.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂是细胞膜可渗透的。

9.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂是氨基糖苷类抗生素、D-半乳糖胺和/或依米丁。

10.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂是依米丁。

11.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种核糖核酸转录抑制剂是细胞膜可渗透的。

12.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种核糖核酸转录抑制剂是CDK9抑制剂、金丝菌素、硫藤黄素、鹅膏霉素和/或雷公藤甲素。

13.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种核糖核酸转录抑制剂是不可逆抑制剂。

14.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种核糖核酸转录抑制剂是雷公藤甲素。

15.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种电子传递链剂具有可逆活性。

16.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种电子传递链剂是细胞膜可渗透的。

17.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述电子传递链剂是电子传递链抑制剂。

18.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述电子传递链剂是叠氮化钠。

19.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、所述至少一种核糖核酸转录抑制剂和所述至少一种电子传递链剂中的至少一种以溶液形式提供。

20.根据实施例19所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂以溶液提供。

21.根据实施例20所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂以1.0微摩尔至2M的浓度存在于所述溶液中。

22.根据实施例1-21中任一项所述的试剂盒，其中所述第二蛋白质翻译抑制剂以溶液提供。

23.根据实施例22所述的试剂盒，其中所述第二蛋白质翻译抑制剂以1.0微摩尔至2M的浓度存在于溶液中。

24.根据实施例1-23中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种核糖核酸转录抑制剂以溶液提供。

25.根据实施例24所述的试剂盒，其中所述至少一种核糖核酸转录抑制剂以10纳摩尔至500毫摩尔的浓度存在于所述溶液中。

26.根据实施例1-25中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种电子传递链剂以溶液提供。

27.根据实施例26所述的试剂盒，其中所述至少一种电子传递链剂以0.1微摩尔至1M的浓度存在。

28.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒不包含RNA酶抑制剂。

29.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含蛋白酶抑制剂。

30.根据实施例29所述的试剂盒，其中所述蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶抑制剂。

31.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中稳定的核酸群包含核糖核酸群。

32.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、所述至少一种核糖核酸转录抑制剂、所述至少一种电子传输链剂中的多于一种以主混合物提供。

33.根据实施例32所述的试剂盒，其中所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、所述至少一种核糖核酸转录抑制剂、以及至少一种电子传输链剂中的所有三种以主混合物提供。

34.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含裂解缓冲液。

35.根据前述实施例中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒的一种或多种组分在单独的容器中提供。

36.根据实施例1-35中任一项所述的试剂盒，其中所述生物细胞是哺乳动物细胞。

37.根据实施例1-36中任一项所述的试剂盒，其中所述生物细胞是人细胞。

38.根据实施例1-37中任一项所述的试剂盒，其中所述生物细胞是癌细胞。

39.一种稳定生物细胞中核酸群的方法，包括以下步骤：使生物细胞与至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，其中所述接触进行足以稳定核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。

40.根据实施例39所述的方法，其中所述生物细胞同时与所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、所述至少一种核糖核酸转录抑制剂和所述至少一种电子传递链剂中的每一种接触。

41.根据实施例39或40所述的方法，还包括在所述至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂和至少一种电子传递链剂中的每一种的存在下储存稳定的生物细胞。

42.根据实施例41所述的方法，其中储存步骤长达至少8小时。

43.根据实施例41或42所述的方法，其中储存步骤在0℃至4℃的温度下进行。

44.根据实施例39-43中任一项所述的方法，还包括：通过使稳定的生物细胞与裂解试剂接触来裂解稳定的生物细胞。

45.根据实施例44所述的方法，进一步包括分离从裂解的稳定的生物细胞释放的稳定的核酸群的至少一部分。

46.根据实施例44或45所述的方法，其中裂解步骤还包括在使稳定的生物细胞与裂解试剂接触之前洗涤稳定的生物细胞。

47.根据实施例44-46中任一项所述的方法，其还包括分析至少一类核酸，该至少一类核酸来自由稳定的裂解的生物细胞释放的核酸群的至少一部分。

48.根据实施例47所述的方法，其中分析包括对所述至少一类核酸进行测序。

49.根据实施例48所述的方法，其中所述至少一类核酸是核糖核酸。

50.一种稳定包括封壳的微流体设备内的生物细胞中的核酸群的方法，包括以下步骤：将所述生物细胞置于所述微流体设备的封壳内，其中所述封壳包括流动区域和至少一个腔室，至少一个腔室流体连接到所述流动区域，其中所述流动区域和至少一个腔室被配置为容纳流体介质；并且使生物细胞与至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，其中所述接触进行足以稳定生物细胞中核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。

51.根据实施例50所述的方法，其中将所述生物细胞设置在所述微流体设备内包括将所述生物细胞设置在所述至少一个腔室内。

52.根据实施例50或51所述的方法，其中所述至少一个腔室包括隔绝围栏，隔绝围栏具有隔离区域以及将所述隔离区域流体连接到所述流动区域的连接区域，其中所述隔离区域和所述连接区域被配置为使得介质的组分基本上仅通过扩散在所述流动区域和所述隔绝围栏的所述隔离区域之间交换。

53.根据实施例52所述的方法，其中将所述生物细胞设置在所述至少一个腔室内包括将所述生物细胞设置在所述隔绝围栏的隔离区域内。

54.根据实施例53所述的方法，其中将所述生物细胞设置在所述至少一个腔室内还包括使用介电泳力移动所述生物细胞。

55.根据实施例54所述的方法，其中介电泳力是光学致动的。

56.根据实施例50-55中任一项所述的方法，还包括将稳定的生物细胞储存一段时间。

57.根据实施例56所述的方法，其中储存步骤进行至少8小时。

58.根据实施例56或57所述的方法，其中储存步骤在0℃至4℃的温度下进行。

59.根据实施例50-58中任一项所述的方法，还包括将稳定的生物细胞输出所述微流体设备的步骤。

60.根据实施例59所述的方法，其中输出稳定的生物细胞的步骤包括用介电泳力移动生物细胞。

61.根据实施例60所述的方法，其中所述介电泳力是光学致动的。

62.根据实施例50-61中任一项所述的方法，还包括通过使稳定的生物细胞与裂解试剂接触来裂解稳定的生物细胞。

63.根据实施例62所述的方法，还包括分离从裂解的稳定的生物细胞释放的稳定的核酸群的至少一部分。

64.根据实施例62或63所述的方法，其中裂解步骤还包括在使稳定的生物细胞与裂解试剂接触之前洗涤稳定的生物细胞。

65.根据实施例63或64中任一项所述的方法，还包括分析至少一类核酸，该至少一类核酸来自从裂解的稳定的生物细胞释放的稳定的核酸群的至少一部分。

66.根据实施例65所述的方法，其中分析包括对所述至少一类核酸进行测序。

67.根据实施例65或66所述的方法，其中所述至少一类核酸是核糖核酸。

68.根据实施例39-67中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是哺乳动物细胞。

69.根据实施例39-68中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是人细胞。

70.根据实施例39-69中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是癌细胞。

71.根据实施例39-70中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是免疫细胞。

72.根据实施例71所述的方法，其中免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。

73.根据实施例50-72中任一项所述的方法，其中将生物细胞置于所述封壳内的步骤包括使用介电泳力移动生物细胞。

74.根据实施例73所述的方法，其中所述介电泳力是光学致动的。

75.根据实施例39-74中任一项所述的方法，其中使生物细胞与至少一种不可逆蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触的步骤包括使生物细胞与根据实施例1-33中任一项所述的试剂盒的一种或多种组分接触。

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践这些实施例。前面的描述和实施例详述了某些实施例，描述了预期的最佳模式并且仅是示例性的。然而，应当理解，无论前述内容如何详细地出现在文本中，该实施例可以以许多方式实践，并且应该根据所附权利要求和任何等同物来解释。

Claims (10)

1.一种用于稳定生物细胞内核酸群的试剂盒，包括：

至少一种蛋白质翻译抑制剂；

至少一种核糖核酸转录抑制剂；以及

至少一种电子传递链剂，包括电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含第二蛋白质翻译抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，

所述试剂盒还包含蛋白酶抑制剂，和/或

所述试剂盒还包含裂解缓冲液。

4.一种稳定生物细胞中核酸群的方法，包括以下步骤：

使生物细胞与至少一种蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，

其中，所述接触进行足以稳定核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括：在所述至少一种蛋白质翻译抑制剂、所述至少一种核糖核酸转录抑制剂和所述至少一种电子传递链剂中的每一种的存在下储存所述稳定的生物细胞。

6.一种稳定包括封壳的微流体设备内的生物细胞中的核酸群的方法，包括以下步骤：

将所述生物细胞置于所述微流体设备的封壳内，其中，所述封壳包括流动区域和至少一个腔室，所述至少一个腔室流体连接到所述流动区域，其中，所述流动区域和所述至少一个腔室被配置为容纳流体介质；以及

使生物细胞与至少一种蛋白质翻译抑制剂、至少一种核糖核酸转录抑制剂、和包含电子传递链抑制剂和/或电子传递链解偶联剂的至少一种电子传递链剂接触，

其中，所述接触进行足以稳定生物细胞中核酸群的一段时间，从而将生物细胞转化为稳定的生物细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述至少一个腔室包括隔绝围栏，隔绝围栏具有隔离区域以及将所述隔离区域流体连接到所述流动区域的连接区域，其中，所述隔离区域和所述连接区域被配置为使得流体介质的组分基本上仅通过扩散在所述流动区域和所述隔绝围栏的所述隔离区域之间交换；其中，将所述生物细胞置于所述微流体设备内包括将所述生物细胞设置在所述隔绝围栏的隔离区域内。

8.根据权利要求4或6所述的方法，还包括通过使稳定的生物细胞与裂解试剂接触来裂解所述稳定的生物细胞。

9.根据权利要求4或6所述的方法，其中，所述生物细胞是哺乳动物细胞。

10.根据权利要求4或6所述的方法，其中，所述生物细胞是免疫细胞。

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