KR20080085003A - 생명과학용 시료 보관 및 시료 관리의 통합 - Google Patents

생명과학용 시료 보관 및 시료 관리의 통합 Download PDF

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주디 뮬러-콘
롤프 뮬러
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바이오매트리카 인코포레이티드
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Abstract

생물학적 활성 물질을 복원할 수 있는 용해 가능한 건조 보관 매트릭스를 사용하여 주위온도에서 핵산, 단백질(효소 포함) 및 세포를 건조 보관하는 것을 포함하는, 생물학적 시료를 자동 보관, 추적, 수집 및 분석하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 여기서, 용해가능하거나 해리가능한 매트릭스를 특징으로 하는 RFID-태그화된 생물학적 시료 보관 장치는 생물학적 시료의 지지체로서 사용하기 위해 기재되고, 상기 매트릭스는 건조될 수 있고 시료 복원 시에는 후속적으로 재수화될 수 있다. 또한, 시료 데이타를 관리하는 컴퓨터 실행 시스템 및 방법도 기재한다.
생물학적 시료, 건조 보관 매트릭스

Description

생명과학용 시료 보관 및 시료 관리의 통합{Integration of sample storage and sample management for life science}
본 발명은 일반적으로 생물학적 시료 보관을 위한 개선된 조성물 및 방법과 생물학적 물질 및 시료를 받아 재고 시스템에 보관하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 생물학적 물질 및 시료의 사용, 계통화, 보관, 추적, 수집 및 분석 방법들과 이러한 방법들의 자동화에 관한 것이다.
생명과학 분야의 연구는 생물학적 물질 및 시료, 예컨대 DNA, RNA, 혈액, 소변, 구강 면봉채취물, 세균, 바이러스, PCR 산물, 클로닝된 DNA, 단백질, 세포 및 조직의 분석과 무기물 또는 화학 물질의 분석에 기초한다. 이러한 시료들은 일반적으로 적당한 급원에서 수집되거나 수득되어 이후 공정과 분석을 위해 보관 및 재고품으로 보관된다.
이러한 시료의 보관 용기로는 병, 튜브, 바이알, 백(bag), 박스, 랙(rack), 다중웰 접시 및 다중웰 플레이트가 있으며, 이들은 보통 각각 스크류캡이나 스냅캡, 스냅 또는 밀봉 마개, 뚜껑, 접착 스트립 또는 테이프, 또는 다중캡 띠로 밀봉된다. 처리량이 중간 내지 대량일 때 시료 보관, 처리 및 생물학적 공정의 자동화 에 유용한 표준 용기 형태는 96웰, 384웰 또는 1536웰 플레이트 또는 어레이이다. 이러한 용기들과 여기에 함유된 시료들은 다양한 온도, 예컨대 주위 온도 또는 4℃ 또는 0℃ 이하의 온도, 전형적으로 약 -20℃ 또는 -70℃ 내지 -80℃의 온도에서 보관된다. 이러한 장치들에 보관되는 시료들은 흔히 액체 배지 또는 완충 용액에 함유된 것이 대부분이며, 상기와 같은 0℃ 이하의 온도(예, -20℃ 또는 -70 내지 -80℃)에서 보관될 필요가 있다. 몇몇 경우에, 시료들은 먼저 건조된 다음 주위 온도나 4℃, -20℃ 또는 -70 내지 -80℃에서 보관되기도 한다.
예를 들면, 핵산은 현재 저온에서 액체 형태로 보관된다. 단기간 동안 보관하기 위한 경우에는 핵산은 4℃에서 보관할 수 있다. 장기간 동안 보관하기 위한 경우에는 유전자 물질, 구체적으로 게놈 DNA 및 RNA인 경우에 분해 방지를 위해 온도가 -20 내지 -70℃로 낮아지는 것이 일반적이다. 또한, 핵산은 셀룰로스 막과 같은 고체 매트릭스 위에서 실온에서 보관되기도 한다. 이러한 보관 시스템들은 모두 단점을 갖고 있다. 즉, 저온에서의 보관은 저온실, 냉동기, 발전기 보조 시스템과 같은 값비싼 장비를 필요로 하고, 이러한 장비들은 뜻밖의 정전과 같은 경우에 믿을 수 없으며 준비된 전원이 없거나 전기 시스템이 믿을 수 없는 지역에서는 사용하기 어려운 점이 있다. 또한, 핵산의 셀룰로스 섬유 상에서의 보관은 재수화 동안 물질의 상당한 손실이 일어날 수 있는데, 그 이유는 핵산이 셀룰로스 섬유에 포획되어 결합된 상태로 남아 있어 정량적으로 복원(recover)될 수 없기 때문이다. 또한, 핵산의 셀룰로스 상에서의 건조 보관은 생물학적 시료로부터 셀룰로스를 분리해야 할 필요가 있는데, 그렇지 않으면 셀룰로스 섬유에 의해 생물학적 시료가 오 염되기 때문이다. 셀룰로스 섬유로부터 핵산의 분리는 또한 새로운 튜브나 용기로 시료를 피펫팅하여 옮기는 단계 및 원심분리하는 단계를 비롯한 부가적인 처리를 필요로 하고, 이들 모두 복원율을 감소시키고, 불필요한 불순물이 도입될 가능성 또는 시료 분해를 촉진하면서 비용 및 노동 집약적인 조건에 노출될 가능성을 증가시킬 수 있다.
단백질은 현재 주로 액체 상태에서, 또는 냉동되거나 동결된 환경, 전형적으로 -20℃ 내지 액체 질소 보관 온도에서 취급된다. 일부 예외로서, 단백질은 동결건조되거나 트레할로스의 존재하에 실온에서 건조된 후, 처리가 안된 표면에 직접 적용되기도 한다(참조: Garcia de Castro et al., 2000 Appl. Environ. Microbiol. 66:4142; Manzanera et al., 2002 Appl. Environ. Microbiol. 68:4328). 단백질은 종종 냉장(4℃) 또는 동결(-20℃ 또는 -80℃) 보관 시에도 분해 및/또는 활성 상실을 일으킨다. 단백질에 대한 동결-해동 압박은 특히 단백질 시료의 분취량이 반복적인 동결-해동을 필요로 하는 경우에 생물활성(예, 효소 활성, 동족 리간드에 대한 특이적 결합 등)을 저하시킨다. 결과적으로 생물학적 분석에 필요할 수 있는 단백질 활성의 상실은 비교할 수 있는 분석 결과를 얻기 위한 단백질 농도의 재조정 또는 새로운 시약을 마련하기 위한 손상된 단백질 시약의 값비싼 폐기를 필요로 한다. 또한, 통상적인 관행인 실험실에 보관된 효소 시약을 복수 사용하거나, 특히 여러 사용자가 여러번 사용하거나 표준화되지 않은 처리 절차를 이용하면 이러한 시약으로 수득한 실험 데이타의 신뢰성은 더욱 떨어지게 된다. 결과적으로, 단백질의 반감기가 감소하면 값비싼 시약을 빈번하게 교체해 주어야 하며, 사용자는 막대 한 재정 비용을 감당해야 한다. 또한, 단백질 공급업자는 처음 저온실 검사에서부터 운송을 위한 시료의 냉동 보관, 및 생산에서 사용 장소까지 단백질의 냉동 수송에 이르기까지 중단없는 냉동 공급 사슬을 유지하기 위해서 높은 비용을 지불해야 한다. 예를 들어, 선적 중의 지연은 단백질을 실활시킬 수 있고, 불활성 산물의 수령시 고객은 불만을 표명할 수 있는 바, 공급업자는 교체를 위해 막대한 비용을 들여야 한다.
단백질 및 핵산의 건조는 아직 확립된 믿을만한 표준 처리 공정의 부족, 정량적 및 기능적 성질의 복원 어려움, 다양한 완충액과 용매 상용성 및 내성, 기타 핵산 및 단백질 취급 시 요구 사항에 따른 난점으로 인해, 연구 과학, 생물의학, 생물공학 및 다른 산업 단체 협회들에 의한 보편적인 승인을 받아야 한다. 이와 같은 문제점은 다른 생물학적 재료, 예컨대 바이러스, 파지, 세균, 세포 및 다세포 유기체의 취급, 보관 및 사용 시에도 마찬가지이다. 디삭카라이드, 예를 들면, 트레할로스 또는 락티톨은 단백질-함유 시료의 건조 보관을 위한 첨가제로서 기재되어 있지만[참조: US 4,891,319; US 5,834,254; US 6,896,894; US 5,876,992; US 5,240,843; WO 90/05182; WO 91/14773], 당해 기재된 이러한 화합물의 유용성은 목적하지 않은 미생물 오염물에 대한 에너지 공급원으로서 작용, 기재된 바와 같이 사용되는 경우 제한된 안정화 효과, 생물학적 시료의 광범위한 어레이에 걸친 일반적인 적용성의 부족 및 다른 요인에 의해 절충되었다.
현재 사용되는 시료 보관 용기는 시료 제조, 시료 보관, 시료 재고, 시료 추적, 시료 수집 및 시료 분석에 대한 어떠한 통일된 지침이 없는 다수의 플랫 폼(platform)을 나타낸다. 따라서, 현재 통용되는 시료 처리 및 보관 형식은 각 보관 용기, 부적당한 밀봉 및 봉쇄 보조기, 시료 오염, 부적당한 계통화, 다양한 라벨링 시스템, 큰 공간 및 보관 필요조건들과 온도 제약에서 발생되는 문제점들을 전혀 해결하지 못한다는 것은 너무 자명하다.
게놈 시대이며 최근 사람 및 많은 다른 게놈, 프로테옴, 트란스크립톰 등에 대한 판독은 생명과학 연구의 산업화를 이끌었다. 많은 유기체 유래의 유전자 및/또는 유전자 산물을 비롯한 수많은 생물학적 시료는 과학적 지식을 발전시키고 상업적 산물을 개발하기 위해 분석되고 있다. 고 처리량 기술의 개발은 광범위한 정보와 시료의 풀(pool)을 생산하여 시료 보관, 데이타 계통화 및 데이타 분석을 통합할 필요가 생겼다. 무수한 생물학적 시료와 데이타 생산은 결과적으로 크고 작은 실험실마다 상당한 계통화 문제를 부각시켰다. 생명 과학 시료에 대하여 종래 이용할 수 있는 데이타 관리 선택권, 예컨대 LIMS(Laboratory Information Management Systems)는 시료 보관 장치와 특정 시료 또는 시료들에 관한 정보를 통합할 수 없고, 일반적으로 시료 보관 장치와 어떠한 물리적 또는 전기적 연결도 이루어지지 않은 중앙 서버에 시료 데이타를 보관하는 것이다. 더욱이, 이러한 종래 통용되는 시스템은 대형 기업의 소프트웨어 시스템을 구매하여 사용자 개개인의 요구에 맞게 구성해야 하거나 대신에 맞춤 프로그램이 개별적으로 개발되어야 하는지의 여부를 불문하고 전용 풀타임 정보기술 지원 전문가를 필요로 하는 값비싸고 복잡한 소프트웨어 및/또는 성가신 저온 보관을 일반적으로 수반하는, 불편한 보관 랙 구성을 필요로 한다.
따라서, 당해 산업에 보편적인 생명과학 시료 보관, 수집, 분석 및 정보 매칭 장치 및 시스템의 필요성이 있음은 너무나 분명하다. 이에, 본 발명은 다수의 생명과학 시료 보관 및 데이타 사용분야를 제공하여 그러한 필요성을 해결하고 다른 관련 장점들도 제공한다.
발명의 요약
본원에 기재된 발명의 양태에 따라, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스,이노시톨 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재한다. 또다른 양태에서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 2개 이상의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니고, 여기서, 2개 이상의 안정화제 중 하나가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재한다. 또다른 양태에서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; (b) 하나 이상의 안정화제; 및 (c) 하나 이상의 생물학적 시료를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토 스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재한다. 또다른 양태에서, (a) 폴리비닐 알콜을 포함하는, 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공한다.
또다른 양태에서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 트레할라스 억제제를 포함하는 하나 이상의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공한다. 또다른 양태에서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 하나 이상 및 2개 이하의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공하고, 여기서, 안정화제는 트레할로스, 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니다. 또다른 양태에서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공하고, 여기서, 하나 이상의 안정화제는 (i) 트레할라스 억제제, (ii) 키티나제 억제제, (iii) α-글리코시다제 억제제, (iv) 글리코겐 포스포릴라제 억제제, (vi) 뉴라미니다제 억제제, (vi) 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제, 및 (vii) 리소좀 글리코시다제 억제제로부터 선택된 글리코시다제 억제제를 포함한다.
특정한 추가의 양태에서, 트레할라스 억제제는 수이다트레스틴, 발리다마이 신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로부터 선택된다. 특정한 추가의 양태에서, 매트릭스 물질은 용매에 용해된다. 다른 추가의 양태에서, 하나 이상의 안정화제는 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 억제제를 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 용매는 생체적합성 용매를 포함한다. 특정한 추가의 양태에서, 매트릭스 물질은 생체적합성 용매에 용해된다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스 물질은 폴리비닐 알콜을 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 약 0.1% 내지 약 10%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조된다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 약 0.5% 내지 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조된다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 약 1% 내지 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조된다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 약 0.5% 내지 약 1.5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조된다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 (i) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액, (ii) 약 3%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액, (iii) 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액, (iv) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 5%(중량/용적) 트레할로스를 포함하는 용액, (v) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 5%(중량/용적) 발리다마이신을 포함하는 용액, 및 (vi) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜, 약 5%(중량/용적) 트레할로스 및 약 5%(중량/용적) 발리다마이신을 포함하는 용액으로부터 선택된 용액으로부터 건조된다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 (i) 약 1%(중량/용적) 내지 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 5%(중 량/용적)의 트레할라스 억제제를 포함하는 용액, (ii) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 1% 내지 약 10%(중량/용적)의 트레할라스 억제제를 포함하는 용액, 및 (iii) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜, 약 5%(중량/용적) 트레할로스 및 약 5%(중량/용적)의 트레할라스 억제제를 포함하는 용액으로부터 선택된 용액으로부터 건조된다. 또다른 추가의 양태에서, 트레할라스 억제제는 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로부터 선택된다.
특정한 추가의 양태에서, 매트릭스 물질은 폴리에틸렌 글리콜, 아가로스, 폴리-N-비닐아세트아미드, 카복시메틸 셀룰로스, 2-하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리비닐피롤리돈, 폴리(4-비닐피리딘), 폴리페닐렌 옥사이드, 가교된 아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 카본 나노튜브, 폴리락타이드, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 하이드록시메타크릴레이트 공중합체, 칼슘 펙티네이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 석시네이트, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알우론산, 글루쿠론산, 트롬보스폰딘-1 N-말단 헤파린-결합 도메인, 피브로넥틴, 펩타이드/수용성 중합체 변형제 접합체 및 콜라겐으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 존재하는 하나 이상의 안정화제는 트레할라스 억제제를 포함한다. 또한 추가의 양태에서, 트레할라스 억제제는 발리다마이신을 포함하고, 다른 추가의 양태에서, 트레할라스 억제제는 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로부터 선택된다.
다른 추가의 양태에서, 생물학적 시료는 (i) DNA, RNA, 단백질, 폴리펩타이드, 지질, 당포합체(glyconconjugate), 올리고삭카라이드, 및 폴리삭카라이드로부터 선택된 분리된 생체분자, 및 (ii) 포유동물의 세포, 세균, 효모세포, 바이러스, 백신, 혈액, 소변, 생물학적 유체, 및 구강 면봉채취물로부터 선택된 생물학적 물질 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 또다른 양태에서, (a) 폴리비닐 알콜을 포함하는, 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (b) 트레할로스를 포함하는 제1 안정화제; 및 (c) 발리다마이신 A를 포함하는 제2 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공한다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스 목적하는 pH를 유지할 수 있는 완충제를 포함하고, 여기서, 완충제는 특정한 추가의 양태에서, Tris, 시트레이트, 아세테이트, 인산염, 붕산염, HEPES, MES, MOPS, PIPES, 탄산염 및 중탄산염으로부터 선택된 화합물을 포함한다. 본원에 기재된 발명의 다른 추가의 양태에서, 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제는 발리다마이신 A, TL-3, 나트륨 오르토바나데이트, 불화나트륨, N-α-토실-Phe-클로로메틸케톤, N-α-토실-Lys-클로로메틸케톤, 아프로티닌, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 디이소프로필플루오로-포스페이트로부터 선택되거나, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 카스파제 억제제, 그랜자임 억제제, 세포 부착 억제제, 세포 분열 억제제, 세포 주기 억제제, 지질 시그널링 억제제 및 프로테아제 억제제로부터 선택되거나, 환원제, 알킬화제 및 항미생물제로부터 선택된다.
다른 추가의 양태에서, 매트릭스 물질은 하이드록시엑토인 및 폴리스티렌으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 매트릭스는 하나 이상의 검출성 지시제를 함유하고, 특정한 추가의 양태에서, 비색 지시제를 포함하고, 특정한 다른 추가의 양태에서, 하나 또는 다수의 GCMS 태그 화합물을 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 검출성 지시제는 형광 지시제, 발광 지시제, 인광 지시제, 방사분석 지시제, 염료, 효소, 효소의 기질, 에너지 전달 분자, 및 친화성 표지로부터 선택된다. 다른 추가의 양태에서, 검출성 지시제는 아민, 알콜, 알데하이드, 물, 티올, 설파이드, 니트라이트, 아비딘, 비오틴, 면역글로불린, 올리고삭카라이드, 핵산, 폴리펩타이드, 효소, 세포골격 단백질, 반응성 산소 종, 금속 이온, pH, Na+, K+, Cl-, 시아나이드, 포스페이트 및 셀레늄 중 하나 이상의 존재를 검출가능하게 나타낼 수 있다. 다른 추가의 양태에서, 검출성 지시제는 페놀 레드, 에티디움 브로마이드, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제, 코발트 클로라이드, 레이챠드(Reichardt) 염료 및 형광원성 프로테아제 기질로부터 선택된다.
본원에 기재된 특정한 양테에 따라, 매트릭스 물질은 냉동하지 않고 생물학적 시료의 건조 보관을 가능하게 한다.
본 발명의 또다른 양태에 따라서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 중합체를 포함하는 하나 이상의 매트릭스 물질; 및 (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재하고, 여 기서, (I) (a)의 매트릭스 물질은 공유결합으로 자가-조립되지 않고, 다음의 구조를 갖고:
-[-X-]n-
여기서, X는 CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, 치환된 -CH2CH(OH)-, -CH2CH(COOH)-, 치환된 -CH2CH(COOH)-, -CH=CH2, -CH=CH-, C1-C24 알킬 또는 치환된 알킬, C2-24알케닐 또는 치환된 알케닐, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 또는 이의 랜덤 또는 블록 공중합체이고; n은 약 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, 또는 1501-3000의 값을 갖는 정수이고; (II) 안정화제는 중합체에 공유결합되지 않고, 트레할로스, 트레할라스 억제제, 또는 화학식 (i)-(xv)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 포함하는 화합물이다:
Figure 112008047676800-PCT00001
여기서, R은 -H, -OH, -CH2OH, -NHAc 및 -OAc로부터 선택된다.
특정한 추가의 양태에서, 중합체는 하나 또는 다수의 수소결합을 형성하여 비-공유결합으로 자가-조립될 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 중합체는 하나 이 상의 안정화제로 하나 이상의 수소결합을 형성할 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 중합체는 핵산 분자 및 폴리펩타이드 중의 하나 이상으로 하나 이상의 수소결합을 형성할 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 중합체는 폴리비닐 알콜, 카복시메틸 셀룰로스, 2-하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된다. 특정한 다른 양태에서, 안정화제는 D-(+)-라피노스, β-겐티오비오스, 트레할로스, 엑토인, 미오-이노시톨, 하이드록시엑토인, 마그네슘 D-글루코네이트, 2-케토-D-글루콘산 헤미칼슘 염 수화물, D(+)-멜레지토스 및 칼슘 락토비오네이트 일수화물으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은
생물학적 시료를 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스와 접촉시키고, 여기서, 매트릭스는 (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재하고;
이에 따라 생물학적 시료를 보관함을 포함하는, 생물학적 시료의 보관 방법을 제공한다. 특정한 양태에서, 당해 방법은 접촉 단계에 후속하여 매트릭스를 냉동하지 않고 유지함을 포함한다.
또다른 양태에서,
(a) 생물학적 시료를 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스와 접 촉시키고, 여기서, 매트릭스는 (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (ii) 하나 이상의 안정화제, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재하고;
(b) 매트릭스를 건조시키고, 이에 따라 생물학적 시료를 보관하는, 생물학적 시료를 보관하는 방법을 제공한다. 특정한 추가의 양태는 매트릭스를 냉동하지 않고 접촉 및 건조 단계 이후에 유지함을 포함한다. 특정한 추가의 양태에서, 유지 단계 이후에 시료의 생물학적 활성은 실질적으로 접촉 단계 이전의 시료의 생물학적 활성과 동일하다. 특정한 다른 추가의 양태에서, 생물학적 시료의 분해는 냉동하지 않고 매트릭스 물질의 부재하에 유지된 대조 생물학적 시료의 분해에 비하여 감소된다. 특정한 다른 관련된 양태에서, 접촉 단계는 동시에 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리함을 포함한다. 특정한 다른 관련된 양태에서, 접촉 단계는 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리한 후 수행한다. 특정한 다른 관련된 양태에서, 접촉 단계 이후 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리한다.
다른 양태에서,
(a) 매트릭스를 생물학적 시료 보관 장치의 하나 또는 다수의 시료 웰에 투여하고, 여기서, (1) 생물학적 시료 보관 장치는 (i) 뚜껑, 및 (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 다수의 시료 웰을 포함하는 시료 플레이트를 포함하고, (2) 매트릭스는 (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재하고;
(b) 하나 이상의 시료 웰을 건조시키고, 이에 따라 생물학적 시료 보관 장치를 제조함을 포함하는, 하나 또는 다수의 생물학적 시료를 위한 생물학적 시료 보관 장치를 제조하는 방법을 제공한다. 특정한 추가의 양태에서, 투여 단계는 매트릭스 물질 및 용매를 함유하는 액체 용액 또는 액체 현탁액을 투여함을 포함한다. 특정한 다른 관련된 양태에서, 하나 이상의 웰은 하나 이상의 검출성 지시제를 포함하고, 특정한 추가의 양태에서, 비색 지시제를 포함하고, 특정한 추가의 양태에서, 하나 또는 다수의 GCMS 태그 화합물을 포함한다. 특정한 양태에서, 검출성 지시제는 형광 지시제, 발광 지시제, 인광 지시제, 방사분석 지시제, 염료, 효소, 효소의 기질, 에너지 전달 분자, 및 친화성 표지로부터 선택되고, 특정한 다른 양태에서, 검출성 지시제는 아민, 알콜, 알데하이드, 물, 티올, 설파이드, 니트라이트, 아비딘, 비오틴, 면역글로불린, 올리고삭카라이드, 핵산, 폴리펩타이드, 효소, 세포골격 단백질, 반응성 산소 종, 금속 이온, pH, Na+, K+, Cl-, 시아나이드, 포스페이트 및 셀레늄 중 하나 이상의 존재를 검출가능하게 나타낼 수 있다. 특정한 다른 양태에서, 검출성 지시제는 페놀 레드, 에티디움 브로마이드, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제, 코발트 클로라이드, 레이챠드 염료 및 형광원성 프로테아제 기질로부터 선택된다. 특정한 다른 양태에서, 하나 이상의 웰은 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 하나 이상의 안정화제를 포함한다.
또다른 양태에서,
(a) 동시에 또는 연속적으로 및 임의의 순서로, 생물학적 시료 보관 장치내에서 하나 또는 다수의 생물학적 시료를 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스와 접촉시키고, 여기서, (1) 생물학적 시료 보관 장치는 (i) 뚜껑, 및 (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 다수의 시료 웰을 포함하는 시료 플레이트를 포함하고, 하나 이상의 웰은 매트릭스를 포함하고, (2) 매트릭스는 (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질, 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재하고;
(b) 하나 이상의 시료 웰을 건조시키고;
(c) 접촉 및 건조 단계에 후속적으로 생물학적 시료 보관 장치를 냉동하지 않고 유지시키고;
(d) 생물학적 시료를 제2 용매 중 재현탁 또는 재용해시키고, 이로부터 보관된 생물학적 시료를 복원하는 것을 포함하는 보관된 생물학적 시료를 복원하는 방법을 제공한다. 특정한 추가의 양태에서, 유지하는 단계 이후에 시료의 생물학적 활성은 실질적으로 접촉 단계 전의 시료의 생물학적 활성과 동일하다. 특정한 추 가의 양태에서, 제2 용매는 (i) 제1 용매와 동일한 용매 및 (ii) 제1 용매와 상이한 용매로부터 선택된다. 특정한 관련 양태에서, 제1 용매 및 제2 용매의 하나 이상은 활성 완충제이다.
또다른 양태에서, (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; (b) 하나 이상의 안정화제; 및 (c) 시료 처리 조성물을 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 제공한다. 추가의 양태에서, 시료 처리 조성물은 활성 완충제, 세포 용해 완충제, 유리 라디칼, 포획제, 시료 변성제 및 병원균-중화제로부터 선택되는 조성물을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 생물학적 시료의 보관, 계통화, 추적, 수집 및 분석에 관한 데이타 처리 시스템으로서, 생물학적 시료 장치; 이 시료 장치에 관계하는 데이타를 수신, 보관, 처리 및 통신하는 컴퓨터 실행 시스템; 및 이 시료 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이에 통신 링크(link)을 제공하기 위한 상기 시료 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이의 무선 주파 인터페이스를 포함하는 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 여러 양태들에 따르면, 다음과 같은 것이 제공된다: (a) 뚜껑; (b) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하되, 이러한 하나 또는 그 이상의 웰이 매트릭스 물질을 함유하는 시료 플레이트; 및 (c) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 하나 또는 복수의 생물학적 시료에 유용한 생물학적 시료 보관 장치. 매트릭스 물질이 용매에 용해 또는 해리해 있거나, 또는 시료 플레이트 위에 뚜껑을 밀봉하는데 유용한 덮개(closure) 수단을 포 함하고, 경우에 따라 그 덮개 수단이 자석 덮개를 포함하는 것이 특징인 상기 생물학적 시료 보관 장치. 기밀성 덮개 조인트를 포함하거나, 또는 각 웰 주위에 기밀성 덮개 조인트를 포함하거나, 또는 각 웰 주위에 자석 덮개와 기밀성 덮개 조인트를 포함하는 것이 특징인 상기 생물학적 시료 보관 장치. 특정 양태에 따르면, 매트릭스 물질이 냉동 없이 시료를 건조 보관할 수 있는 것인 상기 생물학적 시료 보관 장치가 제공된다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 뚜껑; (b) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하되, 이러한 하나 또는 그 이상의 웰이 용매에 용해하거나 해리하는 매트릭스 물질을 함유하는 시료 플레이트; 및 (c) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 하나 또는 복수의 생물학적 시료에 유용한 생물학적 시료 보관 장치를 제공한다. 전술한 생물학적 시료 보관 장치의 다른 특정 양태에 따르면, 적어도 하나의 웰이 적어도 하나의 검출성 지시제를 함유하고, 다른 특정 양태에서는 비색 지시제를 함유하고, 다른 특정 양태에서는 형광 지시제, 발광 지시제, 인광 지시제, 방사분석 지시제, 염료, 효소, 효소의 기질, 에너지 전달 분자 또는 친화성 표지이다. 또다른 특정 양태에서는 검출성 지시제는 아민, 알콜, 알데하이드, 물, 티올, 설파이드, 니트라이트, 아비딘, 비오틴, 면역글로불린, 올리고삭카라이드, 핵산, 폴리펩타이드, 효소, 세포골격 단백질, 반응성 산소 종, 금속 이온, pH, Na+, K+, Cl-, 시아나이드, 포스페이트 및 셀레늄 중 적어도 하나의 존재를 검출가능하게 나타낼 수 있다. 또다른 특정 양태에 따르면, 검출성 지시제는 페놀 레드, 에티디움 브로마이드, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제, 코발트 클로라이드, 레이챠드 염료 및 형광원성 프로테아제 기질로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
다른 관련 특정 양태에 따르면, 생물학적 시료 보관 장치는 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 적어도 하나의 억제제를 함유하는 적어도 하나의 웰을 함유하며, 그 예로는 발리다마이신 A, TL-3, 나트륨 오르토바나데이트, 불화나트륨, N-α-토실-Phe-클로로메틸케톤, N-α-토실-Lys-클로로메틸케톤, 아프로티닌, 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 디이소프로필플루오로-포스페이트, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 카스파제 억제제, 그랜자임 억제제, 세포 부착 억제제, 세포 분열 억제제, 세포 주기 억제제, 지질 시그널링 억제제 및 프로테아제 억제제, 환원제, 알킬화제 또는 항미생물제일 수 있다. 특정 양태에서, 매트릭스 물질은 냉동 없이 시료를 건조 보관할 수 있고, 특정 양태에서, 매트릭스 물질은 폴리비닐 알콜을 함유하며, 다른 특정 양태에서, 매트릭스 물질은 폴리에틸렌 글리콜, 아가로스, 폴리-N-비닐아세트아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(4-비닐피리딘), 폴리페닐렌 옥사이드, 가교된 아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 카본 나노튜브, 폴리락타이드, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 하이드록시메타크릴레이트 공중합체, 칼슘 펙티네이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 석시네이트, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알우론산, 글루쿠론산, 트롬보스폰딘-1 N-말단 헤파린-결합 도메인, 피브로넥틴, 펩타이드/수용성 중합체 변형제 접합체, 콜라겐, 하이드록시엑토인, 폴리스티렌 또는 트레할로스 중에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 함유한다. 다른 양태에서, 본 발명은 (I) (a) 뚜껑; (b) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하되, 이러한 하나 또는 복수의 웰이 매트릭스 물질을 함유하고 있는 시료 플레이트; 및 (c) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 하나 또는 복수의 생물학적 시료에 유용한 생물학적 시료 보관 장치; 및 (II) 하나 또는 그 이상의 보조 시약을 함유하는 키트를 제공한다. 또다른 특정 양태에서, 매트릭스 물질은 용매에 용해 또는 해리한다.
또다른 본 발명의 양태에 따르면, (i) 뚜껑; (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하되, 이러한 하나 또는 복수의 웰이 매트릭스 물질을 함유하고 있는 시료 플레이트; 및 (iii) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 생물학적 시료 보관 장치와 하나 또는 복수의 생물학적 시료를 접촉시키는 단계, 이로써 상기 생물학적 시료를 보관하는 단계를 포함하는, 하나 또는 복수의 생물학적 시료 보관 방법이 제공된다. 이러한 방법의 또다른 특정 양태에 따르면, 접촉 단계 이후에 냉동 없이 생물학적 시료 보관 장치를 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 본 발명의 양태로서, (a) (i) 뚜껑; (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하되, 이러한 하나 또는 복수의 웰이 용매에 용해 또는 해리하는 매트릭스 물질을 함유하고 있는 시료 플레이트; 및 (iii) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 생물학적 시료 보관 장치와 하나 또는 복수의 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 하나 또는 그 이상의 시료 웰을 건조시켜 상기 생물학적 시료를 보관하는 단계를 포함하는, 하나 또는 복수의 생물학적 시료를 보관하는 방법을 제공하며, 이러한 방법의 다른 특정 양태에서는 접촉 및 건조 단계 이후에 냉동 없이 상기 생물학적 시료 보관 장치를 유지시키는 단계를 포함하며, 또다른 특정 양태에서는 상기 유지시키는 단계 이후에 시료의 생물학적 활성이 접촉 단계 이전의 시료의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하고, 또다른 특정 양태에서는 상기 생물학적 시료의 분해가 상기 매트릭스 물질의 부재 하에 냉동 없이 유지된 대조용 생물학적 시료의 분해에 비해 감소된 것을 특징으로 한다. 이와 관련된 특정 양태에 따르면, 접촉시키는 단계가 동시에 상기 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리시키는 단계를 포함하며, 또다른 관련 특정 양태에 따르면 접촉시키는 단계가 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리시키는 단계 후 실시되며, 또다른 관련 특정 양태에 따르면, 접촉시키는 단계가 그 다음 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 용매에 용해 또는 해리하는 매트릭스 물질을 (i) 뚜껑; (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하는 시료 플레이트; 및 (iii) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 생물학적 시료 보관 장치의 하나 또는 복수의 시료 웰에 투여하는 단계; 및 (b) 하나 또는 그 이상의 시료 웰을 건조하여 생물학적 시료 보관 장치를 제조하는 단계를 포함하여, 하나 또는 복수의 생물학적 시료에 유용한 생물학적 시료 보관 장치를 제조하는 방법을 제공한다. 추가 특정 양태에 따르면, 투여하는 단계가 매트릭스 물질과 용매를 함유하는 액체 용액 또는 액체 현탁액을 투여하는 단계를 포함하고, 또다른 특정 추가 양태에 따르면, 적어도 하나의 웰이 적어도 하나의 검출성 지시제를 함유하며, 또다른 특정 추가 양태에 따르면, 적어도 하나의 웰이 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 적어도 하나의 억제제를 함유한다.
다른 양태로서, 본 발명은 (a) (i) 뚜껑; (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하되, 이러한 하나 또는 복수의 웰이 제1 용매에 용해 또는 해리하는 매트릭스 물질을 함유하고 있는 시료 플레이트; 및 (iii) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 생물학적 시료 보관 장치에서 상기 매트릭스 물질과 하나 또는 복수의 생물학적 시료를 동시에 또는 순차적인 임의의 순서대로 접촉시키는 단계; (b) 하나 또는 복수의 시료 웰을 건조시키는 단계; (c) 접촉 및 건조시키는 단계 이후에 상기 생물학적 시료 보관 장치를 냉동 없이 유지시키는 단계; 및 (d) 상기 생물학적 시료를 제2 용매에 재현탁 또는 재용해시키고, 이로부터 보관된 생물학적 시료를 복원하는 단계를 포함하는, 보관된 생물학적 시료의 복원 방법을 제공하며, 특정 추가 양태에 따르면, 상기 유지시키는 단계 이후의 시료의 생물학적 활성이 접촉시키는 단계 이전의 시료의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하고, 또다른 추가 양태에 따르면 상기 제2 용매가 (i) 상기 제1 용매와 동일한 용매 및 (ii) 상기 제1 용매와 다른 용매 중에서 선택된다. 관련 특정 양태에 따르면, 제1 용매와 제2 용매 중 적어도 하나는 활성 완충액이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료 장치; 이 시료 장치에 관한 데이타를 수신 및 전송하는 컴퓨터 실행 시스템; 및 상기 시료 장치와 상기 컴퓨터 실행 시스템 사이에 통신 링크를 제공하기 위한 상기 시료 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이의 무선 주파 인터페이스를 포함하여, 생물학적 시료의 보관, 계통화, 추 적, 수집 및 분석에 관한 데이타를 처리하는 시스템을 제공한다. 추가 양태에 따르면, 상기 컴퓨터 실행 시스템은 시료 장치와 연결된 생물학적 시료의 보관, 계통화, 추적, 수집 및 분석에 관한 데이타를 보유하는 데이타 구조를 포함한다. 관련 양태에 따르면, 무선 주파 인터페이스는 컴퓨터 실행 시스템에 연결된 무선 주파 송신기 및 이러한 송신기와 무선 주파 통신하기 위한 시료 장치와 연결된 적어도 하나의 응답기 장치를 함유한다.
또다른 양태에 따르면, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 생물학적 시료를 보관하기 위한 시료 장치를 제공하는 단계; 시료 장치 또는 생물학적 시료 또는 이 둘 모두에 관한 데이타를 수신, 보관 및 송신하기 위한 컴퓨터 실행 시스템을 제공하는 단계; 상기 시료 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이에 무선 주파 통신 인터페이스를 제공하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료의 보관, 계통화, 추적, 수집 및 분석에 관한 데이타를 처리하는 방법을 제공한다. 추가 양태에 따르면, 이 방법은 무선 주파 인터페이스가 시료 장치로부터 데이타를 수집하도록 하기 위해 컴퓨터 실행 시스템으로부터 제어 시그널을 발생시키는 단계를 포함하며, 또다른 특징적인 양태에 따르면, 이 방법은 무선 주파 인터페이스를 통해 시료 장치로 데이타를 전송하도록 하기 위하여 컴퓨터 실행 시스템에 의한 제어 시그널을 발생시키는 단계를 포함한다.
또다른 양태에 따르면, 본 발명은 뚜껑; 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하는 시료 플레이트; 및 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 생물학적 시료 보관 장치; 이러한 시료 보관 장치에 관한 데이타를 수신 및 전송하는 컴퓨터 실행 시스템; 및 상기 시료 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이에 통신 링크를 제공하기 위한, 상기 시료 장치와 상기 컴퓨터 실행 시스템 사이의 무선 주파 인터페이스를 포함하는, 생물학적 시료의 보관, 계통화, 추적, 수집 및 분석에 관한 데이타 처리 시스템을 제공한다. 추가 특정 양태에 따르면, 컴퓨터 실행 시스템은 웹 브라우저, 웹 서버 프로그램 및 데이타베이스 서버를 갖춘 3계층 구조, 및 무선 주파 인터페이스의 작동을 제어하는 고객측의 어플리케이션(application)을 포함하며, 또다른 특정 양태에 따르면, 상기 시스템은 웹 브라우저와 RFID 판독기 사이에 USB 인터페이스를 포함한다. 관련 다른 양태에 따르면, 컴퓨터 실행 시스템은 고객측과 데이타베이스 서버에 엑셀(Excel) 매크로 프로그램을 갖춘 2계층 구조를 포함한다. 또다른 관련 양태에 따르면, 컴퓨터 실행 시스템은 자립형 고객 어플리케이션과 이 고객 어플리케이션과 통신하는 데이타베이스 서버를 갖춘 2계층 구조를 포함한다. 특정 추가 양태에 따르면, 고객 어플리케이션은 컴파일러형 어플리케이션이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 뚜껑; (b) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 복수의 시료 웰을 함유하는 시료 플레이트; 및 (c) 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 구비하는 하나 또는 복수의 생물학적 시료에 유용한 생물학적 시료 보관 장치를 제공한다. 추가 양태에 따르면, 상기 생물학적 시료 보관 장치는 뚜껑을 시료 플레이트 위로 밀봉하기 위한 덮개 수단을 포함하고, 추가 특정 양태에 따르면, 상기 덮개 수단은 자석 덮개를 포함한다. 다른 양태에 따르면, 생물학적 시료 보관 장치는 기밀성 덮개 조인트를 포함하고, 다른 양태에 따르면 보관 장치는 각 웰 주위에 기밀성 덮개 조인트를 포함한다. 다른 양태에 따르면, 생물학적 시료 보관 장치는 각 웰 주위에 기밀성 덮개 조인트와 자석 덮개를 포함한다.
이러한 관점들과 기타 다른 본 발명의 관점들은 이하 상세한 설명과 후속되는 도면을 참조로 할 때 분명해질 것이다. 본 명세서에 개시된 모든 참고 문헌은 각각 인용되고 있지만 전반적으로 참고 인용된 것이다.
도 1은 생물학적 물질을 건조 보관하기 위한 시료 플레이트의 모식도이다.
도 2는 공기 압력 유닛과 이의 연결 모듈을 도시한 모식도이다.
도 3은 공기 압력 유닛의 공기 채널을 도시한 모식도이다.
도 4는 공기 압력 유닛과 이의 공기 조절 밸브를 도시한 모식도이다.
도 5는 시료 플레이트에 시약을 제공하는 휴대용 PCR 장치의 모식도이다.
도 6은 운송 슬리브(shipping sleeve)의 모식도이다.
도 7은 적층 랙(rack)의 모식도이다.
도 8은 시료 보관 스트립 웰 플레이트의 모식도이다.
도 9는 공지된 무선 주파 통신 시스템의 모식도이다.
도 10은 본 발명의 일 양태에 따라 형성된 시스템의 모식도이다.
도 11은 본 발명의 다른 관점에 따라 형성된 컴퓨터 실행 시스템 구조의 블록도이다.
도 12는 본 발명의 특정 양태에 따른 컴퓨터 실행 시스템 구조이다.
도 13은 본 발명의 특정 양태에 따른 컴퓨터 실행 시스템 구조이다.
도 14는 Deep Vent™ 폴리머라제의 PCR 산물이 분석된 겔을 도시한 것이다. Deep Vent™ 폴리머라제는 주위온도(D)에서 보관되고, 반응 완충액, 템플레이트, dNTP 및 프라이머의 존재 하에 60분(D 60') 또는 5분(D 5') 동안 수화되었다. 동결 보관된 Deep Vent 폴리머라제(F)를 대조군으로 사용했다. 화살표는 예상된 크기의 PCR 산물을 나타낸다.
도 15는 동결 보관된 Big Dye™ 효소 및 주위온도에서 용해성 매트릭스에 건조 보관된 Big Dye™ 효소를 이용하여 증폭시킨 PCR 산물의 판독 길이(염기 수); 및 (B) 주기 서열분석 결과를 도시한 것이다.
도 16은 용해성 매트릭스에 건조 보관한 후의 HIV 프로테아제 동역학을 도시한 것이다.
도 17은 용해성 매트릭스에 건조 보관한 후의 FIV 프로테아제 활성을 도시한 것이다.
도 18은 건조 보관 후의 HIV 프로테아제 활성을 도시한 것이다.
도 19는 용해성 매트릭스에 건조 보관한 후의 이. 콜리 형질전환율을 도시한 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 특정한 양태에서, 용매에 용해 또는 해리되는 특정한 매트릭스 물질 및 하나 이상의 안정화제의 존재에서, 생물학적 시료는 주위 온도에서 연장된 시간 동안 건조 및 보관될 수 있고, 이에 따라 용매 상태의 후속적인 재보관시 실질적으로 모든 시료의 생물학적 활성을 회복될 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 하는, 생물학적 시료의 실질적으로 건조 보관을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 특정한 본 발명의 양태는 부분적으로 생체적합성 용매(예를 들면, 생물학적 시료의 구조 및/또는 활성을 보존에 적합한 용매)에서 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질의 선택에 의해 제공되는 예상치 못한 이점에 관한 것이고, 부분적으로 항균성 활성을 갖는 안정화제, 예를 들면, 트레할라스 억제제의 선택에 의해 제공되는 예상치 못한 이점에 관한 것이다.
이들 및 관련된 양태는 냉동하지 않고 또는 냉동 보관으로 폴리뉴클레오타이드, 효소 및 다른 단백질, 및 세포를 포함하는 다양한 생물학적 시료의 효율적이고 용이하고 경제적인 보관을 허용한다. 시료는 동결건조 없이 건조될 수 있고(목적하는 경우 동결건조가 사용될 수 있지만), 보관 시료의 건조후 매트릭스 물질로부터 시료를 분리할 필요 없이 용매 재구성 즉시 사용될 수 있고, 여기서, 매트릭스 물질은 용매에 용해 또는 해리되고, 시료의 생물학적 활성을 방해하지 않는다. 본 발명의 양태는 유리하게는 보관된 생물학적 시료의 우수한 복원을 제공하고, 이는 미세한 양의 관심이 있는 생체분자를 포함하는 시료를 알아내기 위해 개선된 검출 민감성을 포함하고, 임상적, 건강관리 및 진단적 상황에서, 생물의학적 연구, 생물학적 연구 및 법의학에서, 및 생물학적 생성물 및 생명과학용 시료 보관 및 관리가 목적일 수 있는 다른 셋팅에서의 용도가 발견될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정한 양태는 본원에 기재된 바와 같은 생물학적 시료 및 생물학적 물질, 광물질 및 화학물질의 분리, 정제, 보존, 보관, 추적, 회복, 데이타 매칭, 모니터링 및/또는 분석을 위한 다성분 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 건조 시료의 보관 및 실온에서의 보관을 위해 사용될 수 있고, 또한 다양한 생물학적 물질 및 생물학적 시료, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA, RNA, 혈액, 소변, 다른 생물학적 유체(예를 들면, 혈청, 장막체, 혈장, 림프, 뇌척수액, 타액, 분비 조직 및 기관의 점막 분비물, 질 분비물, 복수 유체, 흉막, 심장막, 복막, 복부 및 다른 체내 공동의 유체, 세포 또는 기관 컨디셔닝 배지를 포함하는 세포 및 기관 배양 배지, 세척 유체 등), 구강 면봉채취물, 세균, 바이러스, 효모균, PCR 생성물, 클로닝된 DNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드, 플라스미드 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, hnRNA, cDNA, 단백질, 폴리펩타이드, 지질, 당접합체(예를 들면, 당지질, 당단백질), 올리고삭카라이드, 폴리삭카라이드, 백신(예를 들면, 손상되지 않은 생물학적 분자, 예를 들면, 바이러스 또는 다른 미생물 백신, 또는 유전 공학의 생성물을 포함하는 천연, 합성 또는 인공 물질의 추출물의 경우 천연 또는 합성의 살아있는 또는 희석된 것), 세포 및 조직, 세포 또는 조직 용해물, 세포 또는 조직 균질현탁액 또는 추출물 등 또는 다른 생물학적 시료를 보관을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 생물학적 시료는 또한 혈액 시료, 생검 표본, 조직 외식편, 기관 배양물, 생물학적 유체 또는 다른 조직 또는 세포 제조물, 또는 단편 또는 이의 유도체 또는 이로부터 분리된 것을, 피험자 또는 생물학적 공급원으로부터 포함할 수 있다. 피험자 또는 생물학적 공급원은 포유동물 및 비-포유동물을 포함하는 사람 또는 비-사람 동물, 척추동물 및 무척추동물일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 유전 공학 세포주를 포함하는 다른 다세포 유기체 또는 단일-세포 유기체, 예를 들면, 진핵(식물을 포함함) 또는 원핵 유기체 또는 고세균, 초대 배양 또는 배양 개조된 세포주일 수 있고, 당해 세포주는 염색체 통합된 또는 에피솜 재조합 핵산 서열, 무한증식 또는 무한증식 가능한 세포주, 체강 세포 하이브리드 세포주, 분화된 또는 분화 가능한 세포주, 형질전환된 세포주 등을 포함한다.
특정한 양태는 분리된 생체분자를 포함할 수 있는 생물학적 시료에 관한 것이고, 여기서, 용어 "분리된"은 물질이 이의 원래 환경(예를 들면, 천연 발생된 경우 천연 환경)으로부터 제거되는 것을 의미한다. 예를 들면, 손상되지 않은 세포 또는 살아있는 동물에 존재하는 천연 발생 핵산 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않지만, 천연 시스템에서 공-존재 물질 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩타이드는 분리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있거나/있고, 이러한 핵산 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한 천연 환경의 일부가 아닌 이러한 벡터 또는 조성물은 분리될 수 있다.
특정한 양태에서, 따라서, 본 발명은 건조 조건하에서, 및 수화 후 즉시 사용되는 방법(예를 들면, 재수화시)으로 생물학적, 화학적 및 생화학적 물질의 장기간 보관에 관한 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, a) 특정한 용해성(또는 해리성) 보관 매트릭스, b) 특정한 양태에서, 예를 들면, 생물학적 또는 생화학적 억제제, 예를 들면, 항균성 활성을 갖는 안정화제, 예를 들면, 트레할라스 억제제일 수 있는 안정화제의 용도를 포함하는, 장기간 보관 조건의 내구성을 증가시키는 화학물질을 사용한 보관 매트릭스의 제조 및 최적화, c) 즉시 활성 및 재수화 후 물질의 이용가능성을 허용하는 건조 과정 전 상이한 생물학적 물질의 제조, 및 d) 건조 보관된 생물학적 활성 물질의 사용을 통한 복잡한 생화학적 과정을 간단히 하는 방법을 포함하는 양태를 제공한다.
이들 및 관련된 양태는 따라서 생물학적 시료에서 생물학적 활성의 개선된 안정화 및 보존, 실온에서 건조된 형태(및 특히 보호 매트릭스의 용도를 통해)로 보관하는 동안 생물학적 시료의 감소된 분해, 및 이러한 시료의 시간-소모적인 재측정(re-calibration) 및 분취의 필요성을 감소시키거나 제거하고 보관 배지로부터 시료를 물리적으로 분리하여 추가로 사용하기 위한 생물학적 시료의 제조방법의 단순화를 포함하는 생물학적 물질의 냉동되지 않은 건조 보관과 관련된 놀라운 이점을 제공한다. 본원에 기재된 양태는 추가로 그외에 시료 복원 수율을 감소시킬 수 있는 인자, 예를 들면, 시료 용기 표면에서 시료의 흡수로 인한 목적하지 않은 시료 변성 및/또는 시료 손실을 감소시키거나 제거하여 예상치 못한 우수한 생물학적 시료 복원을 제공한다.
특정한 양태에 따라서, 본 발명은 DNA, RNA, 단백질 및 다른 생체분자, 세포, 세포 성분 및 다른 생물학적 물질, 광물질, 화학물질, 또는 생물학적 시료 또는 다른 생명과학 관련 시료로부터 유도된 조성물의 정제 및 크기 분포화를 허용한다. 특정한 양태에서, 따라서 본 발명은 용이하게, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR(RT-PCR 포함), 생물중합체(예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 올리고삭카라이드 또는 다른 생물중합체) 서열분석, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 연장, 일배체화(예를 들면, DNA 일배체화) 및 하나의 통일의, 통합된 및 사용하기 용이한 플랫폼에서 제한 맵핑을 포함하는 분자 생물학 과정의 수행에서 하나 또는 다수의 생물학적 물질 및/또는 생물학적 시료의 용도를 허용한다. 본 발명은 또한 용이하게 예를 들면 특정한 양태에서, 단백질 결정학의 수행을 위한 하나 또는 다수의 생물학적 시료 및/또는 생물학적 물질의 용도를 허용한다. 다른 양태에서, 항체 또는 소분자(천연 발생 또는 인공적인 것) 또는 다른 생물학적 분자(예를 들면, "생체분자"), 예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 아미노산, 또는 이의 유도체; 지질, 지방산 등, 또는 이의 유도체; 탄수화물, 삭카라이드 등 또는 이의 유도체, 핵산, 뉴클레오타이드, 뉴클레오시드, 푸린, 피리미딘 또는 관련 분자, 또는 이의 유도체 등; 또는 생물학적 시료의 성분인 또다른 생물학적 분자의 사용, 시험 또는 검출(진단적 적용을 포함함)용 플래폼을 제공한다.
생물학적 시료의 건조 보관
본원에 기재된 조성물 및 방법은 생물학적 시료의 건조 및/또는 실질적으로 건조 보관에 관한 것이고, 적합한 용기, 예를 들면, 건조 보관 장치의 사용를 포함할 수 있다. 건조 보관 장치는 건조 보관 매트릭스로서 사용하기 위한 매트릭스 물질을 포함하는 본원에 기재된 생물학적 시료 보관 장치의 어플리케이션이고, 이는 생물학적 시료 또는 생물학적 물질, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 세균, 세포, 바이러스, 화학적 화합물(천연 또는 인공적으로 제조됨), 플라스미드 DNA, DNA 단편, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 형광원성 기질, 게놈 DNA, PCR 생성물, 클로닝된 DNA, 단백질, RNA, 백신, 광물질 및 화학물질, 및 본원에 기재된 다른 생물학적 시료의 장기간 보관 동안 특정한 바람직한 양태에서 본원에 기재된 바와 같은 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질을 포함한다.
이들 및 관련된 양태는 생물학적 시료 또는 생물학적 물질의 안정한 장기간 건조 보관은, 이러한 시료 또는 물질이 적합한 매트릭스 물질, 예를 들면, 용해가능한(또는 해리가능한) 매트릭스 물질을 포함하는 본원에 기재된 것으로 적하되는 경우, 냉동하지 않고 유효할 수 있다는 놀라운 관찰로부터 유도된다. 비제한적인 이론에 따라서, 생물학적 시료에 존재하는 생물학적 물질은 흡수, 흡착, 특이 또는 비특이 결합 또는 다른 부착 메카니즘에 의해 매트릭스 물질과 상호작용할 수 있고, 비-공유결합 및/또는 공유 화학 결합의 형성 및/또는 분자간 연관된 상호작용, 예를 들면, 소수성 및/또는 친수성 상호작용, 수소결합 형성, 정전기 상호작용 등에 관련된 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 일반적인 실내 주위 실온(예를 들면, 통상적으로 20-27℃이지만, 기하학, 계절 및 물리적 플랜트의 작용으로 변할 수 있음, 약 15-19℃ 또는 약 18-23℃ 내지 약 22-29℃ 또는 약 28-32℃)에서 본원에 기재된 시료 데이타 프로세싱 방법 및 시스템에 사용하기 위한 생물학적 시료의 안정한 장기간 건조 보관용 장치를 제공한다.
바람직한 양태는 건조 보관하기 위해 시료가 접촉되기 전후, 또는 접촉되는 동안 건조될 수 있는 용해가능한 매트릭스 물질 또는 해리가능한 매트릭스 물질을 이용한다. 관련된 바람직한 양태는 따라서 생물학적 시료 또는 생물학적 물질을 냉동하지 않고, 예를 들면, 주위 실온에서 건조 보관할 수 있는 매트릭스 물질을 포함하는 본원에 기재된 시료 보관 장치의 용도에 관한 것이다. 특정한 관련 양태에서, 건조 단계는, 예를 들면 매트릭스 물질이 적재된 시료를 감소된 대기압(예를 들면, 동결건조 또는 다른 진공 건조 방법)으로 노출 또는 혼화성 기체, 예를 들면, 질소의 온화한 흐름으로 노출하여 공기 건조, 승온에서 건조 또는 용매의 휘발에 의해, 시료를 매트릭스 물질로 건조 보관 동안 적하하는데 효과적이기 위해 수행될 수 있다. 시료는 바람직하게는 시료를 안정화하는 조건하에서 건조 보관된다. 즉, 시료의 약간 검출가능하거나 또는 검출되지 않은 (예를 들면, 통계적 유의성을 가짐) 분해 또는 목적하지 않은 화학적 또는 물리적 변형은 보관된 시료의 특성의 인자로서 가변할 수 있는 임의의 경우 관련 기술 분야의 숙련가들에게 친숙할 수 있는 기준에 따라 가해진다. 다른 양태에서, 건조 보관 장치를 사용한, 시료 적재는 건조 보관을 야기하고, 예를 들면, 이에 따라 액체 시료는 흡수되어 또는 그렇지 않으면 매트릭스 물질에 의해 포획되어 적재 후 유리 액체가 없는 것은 용이하게 인식되고, 또는 상기된 바와 같이 건조될 수 있는 매트릭스 물질로부터 용이하게 제거된다.
특정한 바람직한 양태는 생물학적 물질(예를 들면, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, DNA 단편, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 형광원성 물질, 세포, 바이러스, 화학적 화합물, 백신 등) 또는 본원에 기재된 다른 생물학적 시료를 용매 중 용해 또는 해리되는 물질로 이루어진 매트릭스 위에 보관하는 조성물 및 방법을 제공하고, 이는 시료의 수화, 재수화 또는 다른 용매 재구성 후 건조된 시료 물질의 완전한 복원 또는 실질적 복원(예를 들면, 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 및 통상적으로 보다 바람직한 양태에서, 85% 이상, 보다 바람직하게는 90, 91, 92, 93 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 96, 97, 98 또는 99% 이상의 복원)을 허용한다. 예를 들면, 용해가능한 매트릭스는 매트릭스 물질 및/또는 시료의 특성을 기준으로 하여 사용되는 특정한 방법에 좌우되어 시료의 하나 이상의 목적하는 구조적 또는 기능적 특성(예를 들면, 생물학적 활성)의 회복을 허용하는 방법으로 선택될수 있는 적합한 용매에서 안정화될 수 있다. 유사하게, 또다른 예로서, 매트릭스 물질은 용매에 해리될 수 있고, 필수적이지는 않지만, 완전히 용해될 수 있고, 이에 따라 분산물, 현탁물, 콜로이드, 겔, 수액(sap), 슬러리, 시럽 등을 수득할 수 있다. 다른 양태에서, 매트릭스 물질은 하나 이상의 성분, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 스폰지 유사물질, 실리카, 실리카 분말, 실리카 여과지, 흡수분말, 코튼, 울, 린넨, 폴리에스테르 또는 여과지, 보관 매트릭스의 용해도 특성을 포함하는 물리화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 것을 포함할 수 있고, 이는 당해 기술 분야에 숙련가들에게 인지될 수 있다.
이들 및 관련된 특정한 양태에서, 건조 시료 보관을 위한 건조 단계 전에 생물학적 시료 보관 장치에 매트릭스 물질 및/또는 생물학적 시료에 도입되는 사용되는 제1 용매는 건조된 시료/매트릭스 조합물을 수화, 재수화, 재구성 또는 재현탁하기 위해 사용되는 제2 용매와 동일할 수 있고, 다른 양태에서, 제2 용매는 제1 용매와 상이할 수 있다. 매트릭스 물질을 용해 또는 해리하는데 적합한 용매 및/또는 생물학적 시료의 선택을 위한 기준은, 예를 들면, 사용되는 특정한 매트릭스 물질 및 시료의 물리화학적 특성, 및 건조 보관 및 후속적인 재구성 동안 목적하는 대로 유지되는 구조적 또는 기능적 특성(예를 들면, 생물활성)을 기초로 하여, 뿐만 아니라 다른 인자(예를 들면, 다른 보관 장치 물질, 또는 액체 취급 장치와의 상용성, 안전성 등)에 기초로 하여 관련 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.
바람직한 특정한 양태에서, 본원의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 하나 이상의 용매는 생체분자를 구조 및/또는 기능에 도움이 되는 바람직한 화학적 환경에서 보존하여 수성, 예를 들면, 생체적합성 용매, 예를 들면, 생체분자의 생물학적 구조 및/또는 기능을 유지하기 위해 선택된 생물학적 유체, 물리학적 용액 또는 수성 생물학적 완충제 용액일 수 있다. 이러한 생체적합성 용매의 비제한적인 예는 물리학적 염수(예를 들면, 약 145 mM NaCl), 링거 용액, 핸크 밸런스 염 용액, 둘베코 포스페이트 완충된 염수, 얼(Erle) 밸런스 염 용액, 및 다른 완충제 및 당해 기술분야에 공지된 용액 등을 포함하고, 이들은 관심이 되는 특정한 생체분자를 위해 바람직한 첨가제를 포함한다.
그러나, 다른 양태에 따라, 본 발명은 제한될 필요는 없으며, 다른 용매는, 예를 들면, 용매 극성/극성화가능성(SPP) 규모 값에 기초하여 문헌의 시스템을 사용하여 선택될 수 있다(참조: Catalan et al. 1995 Liebigs Ann. 241; see also Catalan, 2001 In: Handbook of Solvents, Wypych (Ed.), Andrew Publ., NY, 본원에 참조로서 기재됨), 이에 따라서, 예를 들면, 물의 SPP 값은 0.962이고, 톨루엔의 SPP 값은 0.655이고, 2-프로판올의 SPP 값은 0.848이다. 용매의 SPP 값의 측정 방법은 2-N,N-디메틸-7-니트로플루오렌/2-플루오로-7-니트로플루오렌 프로프/이체동형의 자외선 측정을 기초로 하여 문헌에 기재되어 있다(참조: Catalan et al., 1995). 목적하는 SPP 값을 갖는 용매(순수한 단일-성분 용매 또는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 용매 혼합물로서; 용매 혼화성(참조: Godfrey 1972 Chem. Technol. 2:359)는 특정한 매트릭스 물질의 용해도 특성을 기준으로 하여 당해 출원의 관점에서 당해 기술분야의 숙련가들에 의해 확인될 수 있다.
용해가능한 매트릭스
비제한적인 이론에 따라서, 용해가능한 또는 해리가능한 매트릭스 물질은 이에 따라 중합체 구조를 포함할 수 있고, 매트릭스를 형성하여 생물학적 시료의 생물학적 물질이 매트릭스에 관련되게 하는 2차원 공간을 생성한다. 용해가능한 또는 해리가능한 매트릭스 물질은 안정화제, 예를 들면, 염 및 완충제를 탈수화된 (예를 들면, 건조 또는 실질적으로 용매-비함유) 조건하에 도입하는데 사용된다. 매트릭스는 또한 성분(예를 들면, 완충제)의 혼입을 최적 건조 및 보관 조건을 위한 pH 및 다른 파라미터의 조절을 위해 허용하고, 임의로 본원에 기재된 하나 또는 다수의 검출성 지시제, 예를 들면, 색을 기초로 하는 pH 지시제, 및/또는 습도 지시제를 포함할 수 있다.
특정한 바람직한 양태에서, 매트릭스 물질은 폴리비닐 알콜 (PVA), 용해가능한 매트릭스 물질을 포함한다. PVA는 다양한 시판원으로부터 수득될 수 있고(예를 들면, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Fluka, Milwaukee, WI), 특정한 다른 분자량으로 이용가능하고, 대안적으로 다양한 정도의 중합화에 기초한 몇몇의 기술된 분자량 범위내에서 중합체의 다분산 제조로서 이용할 수 있다. 예를 들면, PVA 생성물의 Mowiol® 시리즈는 Fluka로부터 수득될 수 있고, 분쟈량의 범위는 약 16, 27, 31, 47, 55, 61, 67, 130, 145, 또는 195 kDa이고, 다른 PVA 생성물은, 예를 들면, 첨부된 실시예에서 사용된 평균 분자량 30-70kDa(Sigma No. P 8136)의 제형으로 공지된다. 당해 기재에 기초하여, 숙련가들은 본원에 기재된 바와 같이 건조 조건 하에 보관되는 생물학적 시료에 존재하는 관심이 되는 특정한 생체분자의 물리화학적 특성(예를 들면, 분자량, 소수성화도, 표면 전하 분산도, 용해도 등)에 좌우되고, 이들 또는 다른 PVA 생성물, 또는 용매에 용해 또는 해리되는 다른 적합한 매트릭스 물질은 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 사용하기 위해 용이하게 과도한 실험없이 확인될 수 있다는 것이 인지된다.
본원에 기재된 바와 같이, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스는, 특정한 양태에 따라서, 약 0.1% 내지 약 10%(중량/용적) PVA을 포함하는 용액을 건조하여 제조될 수 있고, 특정한 관련 양태에서, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 1%, 약 3%, 또는 약 5%(중량/용적) PVA를 포함할 수 있고, 여기서, "약"은 50%, 보다 바람직하게는 40% 미만, 보다 바람직하게는 30% 미만, 보다 바람직하게는 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만으로 인용된 양보다 많거나 적을 수 있는 정량적 다양성을 나타내는 것으로 이해될 수 있다. 유사한 중량/용적 비 및 내성은 다른 건조 매트릭스 물질에 대해 적어도 약간 상이한 양태로 관련될 수 있고, 여기서, 매트릭스 물질은 당해 제공된 PVA가 아니고, 예를 들면, 여기서, 매트릭스 물질은 하나 이상의 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카복시메틸셀룰로스(CMC), 2-하이드록시에틸셀룰로스, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 등, 또는 본원에 기재된 바와 같은 또다른 매트릭스 물질을 포함한다.
특정한 다른 양태에 따라서, 용해가능한 또는 해리가능한 매트릭스 물질은 이에 따라 목적하는 구조적 및/또는 기능성 특성을 만족스럽게 보존하는 방법으로 특정한 형태의 생물학적 시료를 보관하기 위해 혼화성 특성을 갖는 적합한 물질일 수 있고, 당해 특성은 관련된 생물학적 분자가 부착된 간격 내에서 매트릭스를 형성하는 방법에서 건조 가능성을 포함하고, 또한 적합한 용매(예를 들면, 생물학적 완충제) 혼화성을 포함하고, 추가로 매트릭스 분자가 시료에서 관심이 되는 하나 이상의 생물학적 활성에 간섭하지 않는 방법으로 건조 보관 후에 재용해되거나 재현탁되는 가능성을 포함한다.
용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질의 추가의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜, 아가로스, 폴리-N-비닐아세트아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(4-비닐피리딘), 폴리페닐렌 옥사이드, 가역적으로 가교된 아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 카본 나노튜브(예를 들면, Dyke et al., 2003 JACS 125:1156; Mitchell et al., 2002 Macromolecules 35:8825; Dagani, 2003 C&EN81:5), 폴리락타이드, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 하이드록시메타크릴레이트 공중합체, 칼슘 펙티네이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 석시네이트(예를 들면, Langer, 1990 Science 249:1527; Langer, 1993 Accounts Chem. Res.26:537-542), 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알우론산, 글루쿠론산(예를 들면, Kirn-Safran et al., 2004 Birth Defects Res. C. Embryo Today 72:69-88), 트롬보스폰딘-1 N-말단 헤파린-결합 도메인(예를 들면, Elzie et al., 2004 Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:1090; Pavlov et al., 2004 Birth Defects Res. C. Embryo Today 72:12-24), 피브로넥틴(예를 들면, Wierzbicka-Patynowski et al., 2003 J Cell Sci.116(Pt 16):3269-76), 펩타이드/수용성 중합체성 변형제 접합체(예를 들면, Yamamoto et al., 2002 Curr Drug Targets 3(2):123-30), 및 하부 막 콜라겐 펩타이드을 포함하는 콜라겐 또는 콜라겐 단편(예를 들면, Ortega et al., 2002 J Cell Sci. 115(Pt 22):4201-14)을 포함한다.
본 발명의 특정한 양태는 용해가능한 또는 해리가능한 매트릭스 물질, 예를 들면, 용해성 양이온성 중합체(예를 들면, DEAE-덱스트란) 또는 음이온성 중합체(예를 들면, 덱스트란 설페이트) 또는 사용되는 경우, 아가로스를 특히 배제하고, 본원의 양태에 다른 성분이 부재하에, 건조 단백질 보관용으로, 예를 들면, 하나 이상의 US 5,240,843, US 5,834,254, US 5,556,771, US 4,891,319, WO 87/00196, WO 89/00012, WO 89/06542, US 5,876,992, US 4,451,569, EP 0448146A1, WO 90/05182, 및 WO 91/14773에 기재된 디- 또는 트리삭카라이드 안정화제(예를 들면, 트레할로스, 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산)를 갖는 것을 포함하지만, 본 발명의 특정한 다른 양태는 용해가능한 또는 해리가능한 매트릭스 물질 및 하나 이상의 이러한 제1 디- 또는 트리삭카라이드 안정화제의 배합물을, 본원에 기재된 트레할라스 억제제일 수 있고 항균성 활성을 갖는 생물학적 또는 생화학적 억제제를 포함하는 제2 안정화제(예를 들면, 발리다마이신 A, 수이다트레스틴, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴, 및/또는 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드)와 함께, 및/또는 하나 이상의 다른 안정화제 및/또는 본원에 기재된 추가의 건조 보관 매트릭스 성분와 함께 포함하고, 이러한 배합물은 인용 문헌에 제안되지 않았다. 본 발명의 특정한 다른 양태는 용해가능한 또는 해리가능한 매트릭스 물질 및 이러한 하나 이상의 디- 또는 트리삭카라이드 안정화제의 배합물의 단백질 이외의 생물학적 시료, 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, DNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오타이드, 게놈 DNA, 천연 및 재조합 핵산 플라스미드 및 작제물 등의 실질적으로 건조 보관을 위한 용도를 포함한다.
본원에 기재된 특정한 양태에서, 생물학적 시료의 건조 또는 실질적인 건조 보관용 매트릭스는 용매에 용해 또는 해리되는 중합체 및 안정화제를 포함하는 하나 이상의 매트릭스 물질을 포함하고, 여기서, 중합체는 공유결합으로 자가-조립되지 않고, 다음 구조를 갖는다:
-[-X-]n-
여기서,
X는 CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, 치환된 -CH2CH(OH)-, -CH2CH(COOH)-, 치환된 -CH2CH(COOH)-, -CH=CH2, -CH=CH-, C1-C24 알킬 또는 치환된 알킬, C2-24 알케닐 또는 치환된 알케닐, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 또는 이의 랜덤 또는 블록 공중합체이고; n은 약 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, 또는 1501-3000의 값을 갖는 정수이다. 이러한 중합체(예를 들면, PVA, PVP, 카복시메틸셀룰로스 (CMC), 2-하이드록시에틸셀룰로스, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린 등을 포함함)의 합성은 시판되는 시료(예를 들면, 상기한 PVA 또는 다른 시료, 예를 들면, PVP, 카복시메틸셀룰로스 (CMC), 및/또는 2-하이드록시에틸셀룰로스(제조원: SigmaAldrich 또는 Fluka), 또는 카보폴 중합체(제조원: Noveon, Inc., Cleveland, OH), 또는 폴리(VWR로부터의 2-에틸-2-옥사졸린 등) 및 출판된 방법에 따라, 예를 들면, 문헌[참조: Fiesers' Reagents for Organic Synthesis (T.-L. Ho (Ed.), Fieser, L.F. and Fieser, M., 1999 John Wiley & Sons, NY]에 기재된 시약을 사용하여 수행된다.
"알킬"은 1 내지 10개의 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 측쇄, 비(non)-사이클릭 또는 사이클릭, 불포화된 또는 포화된 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화된 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하고; 포화된 측쇄 알킬은 이소프로필, 2급-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화된 사이클릭 알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하고; 불포화된 사이클릭 알킬은 사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐 등을 포함한다. 사이클릭 알킬은 또한 "단독사이클" 또는 "단독사이클릭환"이다. 불포화된 알킬은 인접한 탄소원자 사이의 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함한다("알케닐" 또는 "알키닐"로 각각 언급됨). 대표적인 직쇄 및 측쇄 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함하고; 대표적인 직쇄 및 측쇄 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐 등을 포함한다.
"알콕시"는 산소 브릿지(즉, --O--알킬)를 통해 부착된 알킬 잔기를 의미하고, 예를 들면, 메톡시, 에톡시 등이다.
"알킬티오"는 황 브릿지(즉, --S-알킬)를 통해 부착된 알킬 잔기를 의미하고, 예를 들면, 메틸티오, 에틸티오 등이다.
"알킬설포닐"은 설포닐 브릿지(즉, --SO2-알킬)를 통해 부착된 알킬 잔기를 의미하고, 예를 들면, 메틸설포닐, 에틸설포닐 등이다.
"알킬아미노" 및 "디알킬아미노"는 질소 브릿지(즉, --N-알킬)를 통해 부착된 하나 또는 2개의 알킬 잔기를 의미하고, 예를 들면, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노 등이다.
"아릴"은 방향족 카보사이클릭 잔기, 예를 들면, 페닐 또는 나프틸을 의미한다.
"아릴알킬"은 아릴 잔기로 대체된 하나 이상의 알킬 수소원자를 갖는 알킬이고, 예를 들면, 벤질, --(CH2)2 페닐, --(CH2)3 페닐, --CH(페닐)2 등이다.
"헤테로아릴"은 5- 내지 10원의 방향족 헤테로사이클 환을 의미하고, 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖고, 1개 이상의 탄소원자를 포함하고, 모노- 및 바이사이클릭환 시스템을 포함한다. 대표적인 헤테로아릴은 푸릴, 벤조푸라닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 피롤릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 아자인돌릴, 피리딜, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 벤족사졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 이소티아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 및 퀴나졸리닐이다.
"헤테로아릴알킬"은 헤테로아릴 잔기로 치환된 하나 이상의 알킬 수소원자를 갖는 알킬, 예를 들면, --CH2 피리디닐, --CH2 피리미디닐 등을 의미한다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.
"할로알킬"은 할로겐으로 대체된 하나 이상의 수소원자를 갖는 알킬을 의미하고, 예를 들면, 트리플루오로메틸 등이다.
"헤테로사이클"(또한 "헤테로사이클릭환"으로 언급됨)은 4- 내지 7-원 모노사이클릭, 또는 7- 내지 10-원 바이사이클릭, 헤테로사이클릭환을 의미하고, 이는 포화된, 불포화된, 또는 방향족이고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서, 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있고, 바이사이클릭환을 포함하고, 상기 헤테로사이클은 벤젠 환에 융합된다. 헤테로사이클은 헤테로원자 또는 탄소원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 상기한 헤테로아릴을 포함한다. 따라서, 상기한 헤테로아릴에 부가하여, 헤테로사이클은 또한 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 하이단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로프리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐 등을 포함한다.
"헤테로사이클알킬"은 헤테로사이클로 치환된 하나 이상의 알킬 수소원자를 갖는 알킬, 예를 들면, --CH2 모르폴리닐 등을 의미한다.
"호모사이클"(본원에서 "단독사이클릭환"으로 언급됨)은 3-7개의 탄소원자를 갖는 포화된 또는 불포화된(방향족이 아닌) 카보사이클릭환, 예를 들면, 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 사이클로헵탄, 사이클로헥센 등을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치환된"은 상기한 그룹(예를 들면, 알킬, 알케닐, 알키닐, 호모사이클)을 의미하고, 여기서, 하나 이상의 수소원자는 치환체로 대체된다. 케토 치환체("-C(=O)-")의 경우, 2개의 수소원자가 대체된다. 치환된 하나 이상의 상기한 그룹이 치환된 경우, 본 발명에서 "치환체"는 할로겐, 하이드록시, 시아노, 니트로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알킬, 알콕시, 알킬티오, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클 및 헤테로사이클알킬, 뿐만 아니라, --NRaRb, --NRaC(=O)Rb --, NRaC(=O)NRaNRb, --NRaC(=O)ORb --NRaSO2Rb, --C(=O)Ra, --C(=O)ORa, --C(=O)NRaRb, --OC(=O) NRaRb, --ORa, --SRa, --SORa, --S(=O)2Ra, --OS(=O)2Ra 및 --S(=O)2ORa를 포함한다. 또한, 상기한 치환체는 하나 이상의 상기한 치환체로 추가로 치환될 수 있고, 치환체는 치환된 알킬, 치환된 아릴, 치환된 아릴알킬, 치환된 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클알킬이다. Ra 및 Rb는 본원에서 동일하거나 상이할 수 있고, 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 치환된 아릴, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클, 헤테로사이클알킬 또는 치환된 헤테로사이클알킬일 수 있다.
중합체는 바람직하게는 동일하거나 상이할 수 있는 다수의 수소-결합 잔기를 포함하고, 각 수소-결합 잔기는 동일하거나 상이한 잔기로 수소결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 그룹을 갖고, 이는 생물학적 시료에서 관심이 있는 생체분자에 존재할 수 있다. 각 수소-결합 잔기는 수소-결합 공여체 및/또는 수용체 그룹을 가질 수 있다. 바람직하게는 각각의 수소-결합 잔기는 공여체 및 수용체 그룹 둘 다를 갖는다. 그러나, 수소-결합 잔기는 단지 공여체 또는 수용체 그룹만을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 단독 공여체 그룹으로 수소-결합 잔기를 갖는 중합체는 단독 수용체 그룹으로 수소-결합 잔기를 갖는 중합체과 함께 사용될 수 있다. 또한, 예를 들면, 하나의 중합체는 전적으로 공여체 그룹인 수소-결합 잔기 및 전적으로 수용체 그룹인 수소-결합 잔기를 포함할 수 있다 .
바람직한 중합체는 추가로 단지 하나의 수소결합 그룹을 갖는 몇몇의 단량체성 단위일 수 있다. 이러한 모노-기능성 단량체는 쇄 스톱퍼(stopper)로서 존재하고, 중합체의 분자량을 조절하는데 사용될 수 있다. 이들 모노-기능성 단량체는 중합체를 포함하는 단량체 물질의 전체의 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 미만으로 존재하는 경우가 바람직할 수 있다. 하나 이상의 수소결합 그룹을 함유하는 본 발명에 따른 중합체는 또한 "하나 이상의 수소결합을 형성할 수 있는"으로 언급되고, 중합체 분자, 하나 이상의 안정화제 및/또는 생물학적 시료에 존재하는 관심이 되는 하나 이상의 생체분자, 예를 들면, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자를 사용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는 중합체 분자는 중합체-중합체 수소결합 형성에 바람직한 방법으로 생물학적 시료의 성분으로 하나 이상의 수소결합을 형성할 수 있지만, 본 발명의 양태는 중합체가 공유결합으로 자가-조립되지 않는 한 제안되지 않는다. 이론에 제한되지 않고, 생물학적 시료, 매트릭스 및/또는 안정화제 사이의 상호작용의 안정화는 수소-결합 상호작용을 야기한다. 그러나, 수소-결합 잔기가 하나 이상의 방향족 환, pi-pi 스택(stacking)을 포함하는 경우, 다른 비-공유결합력은 또한 결합, 예를 들면, 정전기력, 반데르 발스힘에 기인할 수 있다. 각 수소결합의 강도는 바람직하게는 1-40 kcal/mol로 가변적이고, 관련된 공여체 및 수용체의 특성 및 기능에 의존한다.
동일하거나 상이한 잔기로 수소결합을 형성할 수 있는 수소-결합 잔기에서 그룹은 "치환된 X" 잔기 형태로 제공되고, 적합하게는, 예를 들면, >C=O, -COO-, -COOH, -O-, -O-H, -NH2, >N-H, >N-, -CONH-, -F, -C=N- 그룹 및 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 그룹은 >C=O, -O-H, -NH2, >NH, -CONH-, -C=N- 및 이의 혼합물로부터 선택된다.
안정화제
용해가능한/ 해리가능한 매트릭스는 또한 하나 이상의 웰이 하나 이상의 안정화제, 및 특정한 양태에서, 2개 이상의 안정화제를 포함하는 방법으로 시료 보관 장치 내에 제조될 수 있고, 목적하는 대로 보존, 안정화, 유지, 보호하는데 포함될 수 있거나, 또는 그밖에 접촉 단계 전에 시료의 시료 보관 장치와 접촉 단계 전에 존재하는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 생물학적 시료의 생물학적 시료 보관 장치의 복원에 영향을 줄 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 안정화제는 특정한 양태에서, 본원에 제공된 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 제제를 포함할 수 있다. 따라서, 특정한 바람직한 양태에서, 생물학적 시료 보관 장치는 억제제, 예를 들면, 항-미생물제, 예를 들면, (이에 제한되는 것은 아니지만) 항진균 및/또는 세균 또는 진균 성장, 생존력 및/또는 콜로니형성을 억제 또는 억압할 수 있는 웰 및 보관된 시료의 미생물 오염을 장기간 보관 동안 억제하기 위한 항균제인 하나 이상의 안정화제를 포함한다.
바람직한 안정화제 특정한 양태에 따라서, 글리코시다제 억제제, 예를 들면, 문헌에 기재된 트레할라스 억제제(예를 들면, 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴, 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드)인 생물학적 또는 생화학적 억제제를 포함한다[참조: Asano, (2003 Glycobiol. 13(10):93R-104R), Knuesel et al. (1998 Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 120:639), Dong et al. (2001 J. Am. Chem. Soc. 123(12):2733) and Kameda et al. (1980 J. Antibiot. (Tokyo)33(12):1573)]. 본 발명의 양태에서 이러한 억제제의 사용과 관련된 예상치 못한 이점이 이의 생체분자-안정화 효과 이외에 이들 억제제의 항균성 특성으로부터 유도되고, 비제한적인 이론에 따라 비-공유결합 상호작용, 예를 들면, 억제제 및 생물학적 시료에서 하나 이상의 생체분자, 매트릭스 물질 및/또는 용매 사이의 수소결합으로부터 유도되는 것으로 여겨진다.
다른 양태에서, 안정화제는 또다른 글리코시다제 억제제, 예를 들면, 키티나제 억제제(예를 들면, 알로사미딘, 아르기핀, 아르가딘), α-글리코시다제 억제제(예를 들면, 발리올아민, 보글리보스, 노지리마이신, 1-데옥시노지리마이신, 미글리톨, 살라시놀, 코탈라놀, NB-DNJ, NN-DNJ, 글리코비르, 카스타노스페르민), 글리코겐 포스포릴라제 억제제(예를 들면, D-ABI, 이소파고민, 파고민), 뉴라미니다제 억제제(예를 들면, DANA, FANA, 4-아미노-4-데옥시-DANA, 자나미비르, BCX 140, GS 4071, GS 4104, 페라미비르), 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 또는 리소좀 글리코시다제 억제제, 문헌에 기재된 글리코시다제 억제제의 전부의 비제한적인 예[참조: Asano (2003 Glycobiol. 13(10):93R-104R)]일 수 있다.
특정한 관련 양태에서, 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제를 포함하는 안정화제는 환원제, 알킬화제, 항미생물제, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 카스파제 억제제, 그랜자임 억제제, 세포 부착 억제제, 세포 분열 억제제, 세포 주기 억제제, 지질 시그널링 억제제 및/또는 프로테아제 억제제일 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가들은 생물학적 시료의 특성 및 관심이 있는 특정한 생물활성에 의존하여 선택될 수 있는 광범위한 이용가능한 억제제를 인지할 수 있다[참조: Calbiochem®Inhibitor SourceBook™ (2004, EMD Biosciences, La Jolla, CA). 항미생물제는, 예를 들면, 문헌을 참조한다[참조: Pickering, LK, Ed. 2003 Red Book: Report of the Committee on Infectious Diseases, 26th edition. Elk Grove Village, IL, pp. 695-97.; American Academy of Pediatrics, 1998, Pediatrics, 101(1), supplement Disinfection Sterilization and Preservation, Seymour S. Block (Ed.), 2001 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia; Antimicrobial Inhibitors, A.I. Laskin and H. A. Lechevalier, (Eds.), 1988 CRC Press, Boca Raton, FL; Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, A.D. Russell et al., (Eds.), 1999, Blackwell Science, Malden, MA; Antimicrobial/ anti-infective materials, S.P. Sawan et al., (Eds.), 2000 Technomic Pub. Co., Lancaster, PA; Development of novel antimicrobial agents: emerging strategies, K. Lohner, (Ed.), 2001 Wymondham, Norfolk, UK; Conte, J.E. Manual of antibiotics and infectious diseases (9th Ed.), 2001, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia].
상기 언급된 바와 같이, 특정한 바람직한 양태에서, 안정화제는 트레할라스 억제제, 예를 들면, 항진균제 발리다마이신 A(참조: Kameda et al., 1980 J. Antibiot. (Tokyo) 33(12):1573; Dong et al., 2001 J. Am. Chem. Soc.123(12):2733; 제조원: Research Products International Corp., Mt. Prospect, IL, catalog no. V21020)일 수 있고, 특정한 다른 양태에서, 안정화제, 예를 들면, 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 억제제를 포함하는 안정화제는 프로테아제 억제제, 예를 들면, TL-3[참조: Lee et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:939; Lee et al., 1999 J. Amer. Chem. Soc. 121:1145; Buhler et al., 2001 J. Virol. 75:9502], N-α-토실-Phe-클로로메틸케톤, N-α-토실-Lys-클로로메틸케톤, 아프로티닌, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 또는 디이소프로필플루오로-포스페이트, 또는 포스파타제 억제제, 예를 들면, 나트륨 오르토바나데이트 또는 불화나트륨일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 용해가능한 매트릭스의 추가되는 이점은 보관 용기가 매트릭스의 용해 및 물질의 재수화 후 반응 챔버로서 직접적으로 사용될 수 있다는 것이다. 액체 형태의 단백질의 안정성 및 활성은 활성 요구조건, 예를 들면, pH, 염 농도, 및 공인자에 의존할 수 있다. 다수의 단백질의 안정성은 몇몇의 경우 승온에서 극단적으로 불안정할 수 있고, 이에 따라 주위 온도(예를 들면, 실온)에서 단백질의 건조는 환경을 안정화시킬 수 있다.
실시예를 포함하는 본원에 기재된 바와 같이, 디삭카라이드 트레할로스의 존재는, 생물학적 시료의 안정화를 야기하는 것으로 여겨지고(예를 들면, Garcia de Castro et al., 2000 Appl. Environ. Microbiol. 66:4142; Manzanera et al., 2002 Appl. Environ. Microbiol. 68:4328), 건조 보관 후 단백질에서 효소적 활성의 회복을 지지하는 특정한 조건하에서 충분하지 않다. 간단한 배경으로서, 트레할로스는 트레할라스의 천연 기질이고, 디삭카라이드를 분해하는 효소이다. 트레할로스는 유기 물질, 예를 들면, 단백질을 안정화시키는 것으로 공지되어 있지만(예를 들면, PCT/GB86/00396), 차선 조건하에서 존재하는 경우 진균 및 세균에 대한 천연 에너지 공급원이 존재하므로 주위 온도에서 단백질의 장기간 보관에 불리할 수 있다. 최적 건조 보관 조건 이하에서 트레할로스의 존재하에 보관되는 생물학적 시료의 세균 또는 진균으로의 오염은 미생물(들)의 성장을 야기할 수 있고, 보관된 시료의 목적하지 않은 미생물 오염을 야기할 수 있다. 상기한 바와 같이, 발리다마이신은 트레할로스와 상이한 화학적 구조를 갖는 트레할라스 억제제이다. 발리다마이신은 트레할라스의 효소 활성을 방해하여 진균 성장을 억제하는 비독성 항진균제이다. 놀랍게도, 본원 및 실시예에 기재된 바와 같이, 발리다마이신 A는 생물학적 물질을 실온에서 안정화시킬 수 있다. 생물학적 물질의 장기간 보관을 위한 보호 효과 이외에, 발리다마이신은 또한 보관된 시료를 미생물의 오염으로부터 보호한다.
따라서, 본 발명의 특정한 양태는 특히 트레할로스를 시료 웰 또는 매트릭스 물질의 성분으로서 포함하지 않는 생물학적 시료 보관 장치에 관한 것이고, 유사하게 특정한 양태는 특히 시료 웰 또는 매트릭스 물질로부터 폴리스티렌 및/또는 하이드록시엑토인의 존재를 배제할 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 예상치 못한 이점에서, 본 발명은 트레할라스 억제제, 예를 들면, 발리다마이신(예를 들면, 발리다마이신 A, 또는 본원에 기재된 다른 트레할라스 억제제)의 생물학적 시료 보관 장치에서 억제제로서 혼입에 관한 것이고, 특정한 다른 양태는 하나 이상의 트레할로스, 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 키토산, 하이드록시엑토인, 및/또는 폴리스티렌일 수 있는 제1 안정화제를 포함할 수 있고, 예를 들면, 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴, 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로부터 선택된 트레할라스 억제제가 존재하는 제2 안정화제를 제공한다. 비제한적인 이론에 따라서, 농학기술에서 항진균제(예를 들면, 발리다마이신 A)로서 공지된 트레할라스 억제제는 본원에 기재된 생물학적 시료 보관 장치에서 용해가능한 매트릭스를 갖는 배합물에 사용되는 경우 놀라운 안정화 효과를 제공한다. 대안적으로 또는 추가적으로 발리다마이신(또는 또다른 트레할라스 억제제)를 용해가능한 매트릭스와 함께 사용하는 용도에서, 트레할라스의 억제제 또는 활성화제로서 활성을 갖는 다른 소분자는 보관 장치에서 추가의 안정화제 또는 첨가제로서 매트릭스 물질 및/또는 시료로 유용하게 포함될 수 있고, 여기에는 천연 디삭카라이드, 카르바-당으로 공지된 슈도-당, 및/또는 트레할라스의 다른 억제제/활성화제를 포함한다. 또한, 트레할라스 억제제, 예를 들면, 발리다마이신은 본원의 유리한 특정한 양태에 따라서, 장기간 보관 매질을 진균, 세균 또는 다른 종류의 목적하지 않은 미생물 오염으로부터 보호한다.
본 발명의 특정한 다른 양태에 따른 사용을 위해 고려되는 추가의 안정화제는 건조 보관 매트릭스 내에 존재할 수 있지만, 본원에 기재된 중합체성 매트릭스 물질에 공유결합되지 않고, 소분자, 예를 들면, D-(+)-라피노스(예를 들면, 라피노스 펜타하이드레이트로서 이용가능함), β-겐티오비오스, 트레할로스(트레할라스 억제제와 함께 본원의 제2 안정화제로서 사용되는 경우), 엑토인, 미오-이노시톨, 하이드록시엑토인, 마그네슘 D-글루코네이트(예를 들면, 하이드레이트로 이용가능함), 2-케토-D-글루콘산 헤미칼슘 염 수화물, D(+)-멜레지토스, 및 칼슘 락토비오네이트 일수화물을 포함할 수 있고, 또한 수개의 공지된 아미노산 측쇄 및 모노-, 디- 및 폴리삭카라이드를 포함하는, 예를 들면, 구조 (i)-(xv)를 포함하는 다른 소분자를 포함할 수 있다:
Figure 112008047676800-PCT00002
여기서, R은 -H, -OH, -CH2OH, -NHAc 및 OAc로부터 선택된다. 이러한 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 공급업자로부터 용이하게 이용가능하다. 특정한 양태에서, 하나 이상의 안정화제는 트레할로스, 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 키토산, 하이드록시엑토인, 및/또는 폴리스티렌로부터 선택될 수 있고, 여기서, 상기한 바와 같이 이러한 특정한 양태에 따라, 본원에 기재된 트레할라스 억제제는 또한 제2 안정화제로서 존재하고, 추가로 또는 대안적으로 특정한 다른 양태에 따라, 본원에 기재된 매트릭스 물질이 또한 존재한다. 상기한 바와 같이, 본원에 기재된 양태는 특히 다음의 건조 보관 조성물을 배제한다[US 5,240,843, US 5,834,254, US 5,556,771, US 4,891,319, WO 87/00196, WO 89/00012, WO 89/06542, US 5,876,992, US 4,451,569, EP 0448146A1, WO 90/05182, 및 WO 91/14773].
예시적인 안정화제는 시판되고, 공지된 구조를 갖고, 다음 화합물을 포함한다:
β-락토스
Figure 112008047676800-PCT00003
D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트
Figure 112008047676800-PCT00004
β-겐티오비오스
Figure 112008047676800-PCT00005
트레할로스
Figure 112008047676800-PCT00006
엑토인
Figure 112008047676800-PCT00007
미오 이노시톨
Figure 112008047676800-PCT00008
D-락토스 일수화물
Figure 112008047676800-PCT00009
하이드록시엑토인
Figure 112008047676800-PCT00010
말티톨
Figure 112008047676800-PCT00011
마그네슘 D 글루코네이트 하이드레이트
Figure 112008047676800-PCT00012
수크로스
Figure 112008047676800-PCT00013
D-(+)-말토스 일수화물
Figure 112008047676800-PCT00014
2-케토-D-글루콘산 헤미칼슘 염 수화물
Figure 112008047676800-PCT00015
D(+)-멜레지토스
Figure 112008047676800-PCT00016
칼슘 락토비오네이트 일수화물
Figure 112008047676800-PCT00017
검출성 지시제
검출성 지시제는 검출을 허용하는 조성물(예를 들면, 숙련가들에게 공지된 적합한 조절과 비교하여 통계학적 중요성을 가짐)을 포함하고, 또는 조건, 방법, 경로, 유도, 활성화, 억제, 조절, 동적 구조, 상태, 오염, 분해 또는 다른 활성 또는 생물학적 시료의 기능적 또는 구조적 변화에 관련된 검출 가능한 파라미터의 유사한 측정을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 변화된 효소적(단백질 가수 분해 및/또는 뉴클레오리틱(nucleolytic)을 포함함), 호흡, 대사적, 이화작용, 결합, 촉매적, 알로스테릭(allosteric), 배좌(conformational), 또는 생물학적 시료에서 다른 생화학적 또는 생물 물리학적 활성을 포함하고, 또한 대사산물, 이화 생성물, 기질, 전구체, 공인자 등을 포함하는 이러한 활성의 결과로서 형성된 중간체간의 상호작용을 포함한다.
다양한 검출성 지시제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 포함하기 위해 특정한 파라미터 또는 특정한 시료 보관 적용에서 관심이 있는 특정한 생물학적 시료에 존재할 수 있는 파라미터에 좌우되어 선택될 수 있다. 이러한 검출성 지시제로 검출될 수 있는 파라미터의 비제한적인 예는 하나 이상의 아민, 알콜, 알데하이드, 물, 티올, 설파이드, 니트라이트, 아비딘, 비오틴, 면역글로불린, 올리고삭카라이드, 핵산, 폴리펩타이드, 효소, 세포골격 단백질, 반응성 산소 종, 금속 이온, pH, Na+, K+, Cl-, 시아나이드, 포스페이트, 셀레늄, 프로테아제, 뉴클레아제, 키나제, 포스파타제, 글루코시다제, 및 미생물 오염물, 및 다른 물질의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
특정한 목적을 위해 선택될 수 있는 광범위한 검출성 지시제(비색 지시제를 포함)의 예는 문헌에 기재되어 있다[참조: Haugland, 2002 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products- Ninth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR; in Mohr, 1999 J. Mater. Chem., 9: 2259-2264; in Suslick et al., 2004 Tetrahedron 60:11133-11138; 및 US 6,323,039]. 참조(Fluka Laboratory Products Catalog, 2001 Fluka, Milwaukee, WI; and Sigma Life Sciences Research Catalog, 2000, Sigma, St. Louis, MO.) 검출성 지시제는 형광 지시제, 발광 지시제, 인광 지시제, 방사분석 지시제, 염료, 효소, 효소의 기질, 에너지 전달 분자, 또는 친화성 표지일 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 검출성 지시제는 하나 이상의 페놀 레드, 에티디움 브로마이드, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제(예를 들면, 제한 뉴클레아제, 예를 들면, 서열-특이 제한 엔도뉴클레아제로서 사용되는 제한 효소), 코발트 클로라이드(물이 존재하는 경우 청색에서 건조되는 경우 핑크색으로 변화되는 습도 지시제), 레이챠드 염료(Aldrich Chemical) 및 형광원성 프로테아제 기질일 수 있다.
검출성 지시제 특정한 양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 지시제로서, 또는 특정한 다른 양태에서, 다른 핵산-기초 적용의 성분으로서 사용될 수 있는, 또는 이들 둘 다로 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 폴리머라제 및/또는 적합한 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정한 양태에 따라 유용한 폴리머라제(DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제)는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)(Tth) DNA 폴리머라제, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq) DNA 폴리머라제, 테르몰로가 네오폴리타나(Thermologa neopolitana)(Tne) DNA 폴리머라제, 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima)(Tma) DNA 폴리머라제, 테르모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)(Tli 또는 VENTTM) DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu) DNA 폴리머라제, DEEPVENTTM DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 우시(Pyrococcus woosii)(Pwo) DNA 폴리머라제, 바실러스 스테로테르모필루스(Bacillus sterothermophilus)(Bst) DNA 폴리머라제, 바실러스 칼도필루스(Bacillus caldophilus)(Bca) DNA 폴리머라제, 술폴로부스 아시도칼다리우르(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac) DNA 폴리머라제, 테르모플라즈마 아시도필리움(Thermoplasma acidophilum)(Tac) DNA 폴리머라제, 테르무스 플라부스(Thermus flavus)(Tfl/Tub) DNA 폴리머라제, 테르무스 루베르(Thermus ruber)(Tru) DNA 폴리머라제, 테르무스 브록키아누스(Thermus brockianus)(DYNAZYMETM) DNA 폴리머라제, 메타노박테리움 테르모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth) DNA 폴리머라제, 마이코박테리아 DNA 폴리머라제(Mtb, Mlep), 및 돌연변이, 및 이의 변형물 및 유도체를 포함한다. RNA 폴리머라제, 예를 들면, T3, T5 및 SP6 및 이의 돌연변이, 및 변형물 및 유도체는 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 폴리머라제는 핵산 분자를 핵산 템플레이트로부터, 통상적으로 5' 내지 3' 위치에서 합성할 수 있는 효소일 수 있다. 본 발명에 사용되는 핵산 폴리머라제는 중온성 또는 호열성, 바람직하게는 호열성일 수 있다. 바람직한 중온성 DNA 폴리머라제는 T7 DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, Klenow 단편 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 III 등을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 바람직한 열 안정성 DNA 폴리머라제는 Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, Stoffel 단편, VENTTM 및 DEEPVENTTM DNA폴리머라제, 및 이의 돌연변이, 변형물 및 유도체를 포함한다(참조: US 5,436,149; US 4,889,818; US 4,965,188; US 5,079,352; US 5,614,365; US 5,374,553; US 5,270,179; US 5,047,342; US 5,512,462; WO 92/06188; WO 92/06200; WO 96/10640; Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman et al., Nucl. Acids Res. 22(15):3259-3260 (1994)).
특정한 양태에서 사용하기 위한 본원에서 고려되는 다른 검출성 지시제는 친화성 시료, 예를 들면, 항체, 렉틴, 면역글로불린 Fc 수용체 단백질(예를 들면, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A, 단백질 G 또는 다른 Fc 수용체), 아비딘, 비오틴, 다른 리간드, 수용체 또는 카운터수용체 또는 이의 유사체 또는 미메틱 등을 포함한다. 친화성 방법론에 대해서, 면역분석 측정을 위한 시료, 예를 들면, 적합하게 표지화된 항체 또는 렉틴을, 예를 들면, 방사성 핵종, 형광물질, 친화성 태그, 비오틴 또는 비오틴 미메틱 서열 또는 항체-효소 접합체로 표지화된 것을 포함하여 제조할 수 있다(참조: Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; Scouten, W.H., Methods in Enzymology 135:30-65, 1987; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Haugland, 2002 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products- Ninth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR; Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Hermanson, G.T. et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, Academic Press, Inc., NY; Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225 및 본원에 인용된 참조).
본 발명의 특정한 다른 양태는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 조성물 및 방법에 관한 것이고, 여기서, 건조 보관용 매트릭스는 하나 이상의, 특정한 관련 양태에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 검출성 지시제를 포함하고, 이들 각각은 독특하고 용이하게 식별가능한 기체 크로마토그래피/질량 스펙트럼(GCMS) 태그 분자를 포함한다. 다수의 이러한 GCMS 태그 분자는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 단독으로, 또는, 예를 들면, 별개의 시료 보관 장치 웰에서 분리된 보관 매트릭스를 위한 독특한 GCMS 스펙트럼 프로파일을 암호화하기 위한 검출성 식별자 잔기와 배합하여 사용하기 위해 선택될 수 있다. 이에 제한되지 않고 예시의 방법으로, 1, 2개 또는 그 이상의 GCMS 태그의 다양한 상이한 배합물이 개별적인 웰에 부가하여 이의 내용물의 GCMS "시그니처"를 기초로 각 웰을 식별하는 방법으로 후속적으로 보관 장치 웰로부터 제거되는 시료를 식별 목적을 위해 원래의 웰에 다시 되돌아가서 추적한다. GCMS 태그의 예는 α-트리플루오로톨루엔, α,α,α-메틸스티렌, o-아니시딘, 다수의 특정한 코카인 유사체 또는 특정 조건하에 용이하게 식별가능한 GCMS 시그니처를 갖는 다른 GCMS 태그 화합물을 포함하고, 예를 들면, SPEX CertiPrep Inc.(Metuchen, NJ) 또는 SigmaAldrich(St. Louis, MO)로부터 이용 가능하고, Supelco® 2005 기체 크로마토그래피 카탈로그에 기재되고 SigmaAldrich에서 시판되는 Supelco® 제품을 포함한다.
용해가능한(또는 해리가능한) 매트릭스는, 예를 들면, 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질을 본원에 기재된 바와 같은 보관 장치의 하나 또는 다수의 시료 웰에 접촉시키거나 투여하여 생물학적 시료용 보관 용기에 적용될 수 있다. 예를 들면, 용해가능한 매트릭스 물질은 유리 또는 플라스틱, 예를 들면, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 다른 물질로 제조된 관 및 플레이트에 용이하게 부착될 수 있다. 용해가능한 물질은 건조되고, 비제한적이 예시로서 주위 온도에서(통상적으로 20℃-30℃, 예를 들면, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃) 및/또는 적합한 승온에서, 및/또는 감소된 대기압하에서(예를 들면, 부분 또는 완전한 진공) 및/또는 적합한 기체 스트림, 예를 들면, 여과된 공기, CO2 또는 불활성 기체, 예를 들면, 질소 또는 다른 적합한 건조 기체 하에서 공기 건조하여, 또는 동결건조(즉, 감압하에 냉동-건조, 이에 따른 기체상으로의 냉동된 용매 승화 증발)를 포함하는 다른 건조 방법으로 수행될 수 있다.
완전하게 건조될 수 있는(예를 들면, 통계학적 중요성을 갖는, 모든 또는 실질적으로 모든 검출 가능한 용매가 제거됨) 실질적으로 건조된 매트릭스를 성취하기 위한, 목적하는 경우, 단지 부분적으로 건조를 성취하기 위한 단계 후에, 용해가능한/해리가능한 매트릭스 물질은 보관된 생물학적 시료를 수용할 준비가 된다. 특정한 바람직한 양태에서, 실질적으로 건조된 매트릭스는 생물학적 시료의 실질적으로 건조 보관을 제공하고, 여기서, 시료와 배합되고 통계학적 중요성을 갖는, 모든 또는 실질적으로 모든 검출 가능한 용매가 제거된 매트릭스의 보관을 포함한다. 보관되는 시료의 특성 및 및 이의 의도된 용도에 따라 가변적일 수 있는 바람직하게는 및 특정한 양태에서, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 검출 가능한 용매는 실질적으로 건조 보관의 목적을 위해 제거된다.
생물학적 시료로부터 유도되거나 제공된 생물학적 물질을 액체 형태의 보관 매트릭스와 배합하여 웰 또는 관에 첨가하여(예를 들면, 동시에 시료 웰을 시료 및 용매에 용해되거나 해리된 매트릭스와 접촉시킴으로서), 생물학적 물질 및 매트릭스 물질이 건조되게 동시에 수행하여, 예를 들면, 본원에 제공된 실질적으로 건조 보관을 위한 매트릭스에 도달하게 한다. 용해가능한 매트릭스는, 바람직한 양태에서 생화학적 반응을 간섭하지 않아서 정제 단계는 시료의 추가의 프로세싱 전에, 예를 들면, 시료 보관 장치의 웰에서 생화학적 반응, 예를 들면, 검정 등의 수행 전에, 생물학적 시료로부터 매트릭스를 분리할 것이 요구되지 않는다.
용해가능한 매트릭스에서 완충제 조건은 조절될 수 있고 이에 따라 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96, 97, 98 또는 99% 이상의 생물학적 시료의 생물학적 활성(예를 들면, 효소적 또는 친화성 활성, 또는 구조적 통합 또는 본원에 기재되고 당해 기술분야에 공지된 다른 생물학적 활성)이 용매 재구성시(예를 들면, 물로 재수화) 유지되어, 시료를 보관 용기로부터 면밀하게 제거할 필요성을 없애고 분리된 용기 중 반응 완충제에 이를 이동시킨다. 특정한 이러한 발명의 양태는 상응하게 보관된 시료가 검출되는 각 시점에서 특정한 생물학적 시료의 개별적인 분취 및/또는 조정의 필요성을 없애는 예상치 못한 이점을 제공한다.
건조 보관 매트릭스 물질로서 사용될 수 있는 매트릭스 물질의 다른 비제한적인 예는 하나 이상의 폴리카보네이트, 셀룰로스(예를 들면, 셀룰로스 페이퍼, 예를 들면, FTA™ 페이퍼, Whatman Corp., Florham Park, NJ), 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 니트로셀룰로스, 아가로스, 가교결합 아가로스, 예를 들면, 2,3-디브로모프로판올-가교결합 아가로스, 3,6-무수-L-갈락토스, 덱스트란 및 화학적으로 가교결합 폴리삭카라이드를 포함하는 다른 폴리삭카라이드, 예를 들면, 에피클로로하이드린-가교결합 덱스트란 또는 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드-가교결합 덱스트란, 보로실리케이트 미세섬유 유리, 섬유유리, 석면, 중합체 및 플라스틱, 예를 들면, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 및 이들 물질의 유도체(예를 들면, US 5,496,562), 뿐만 아니라, 당해 기술분야에 공지된 다른 유사한 물질, 또는 본원 기술에 기초한 본원에 기재된 장치 및 방법에서 사용하기에 적합한 것으로 용이하게 결정될 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 참조: US 5,089,407, 4,891,319, 4,806,343, 및 6,610,531.
매트릭스 물질은 생물학적 물질의 보관 및 보존을 위해 처리될 수 있다. 완충제 조건의 조절 및 화학물질 및 효소 및 다른 시료의 첨가는 DNA 및 RNA(참조: Sambrook et al., 1989; Current Protocols, Nucleic Acid, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003) 및/또는 단백질, 효소 및/또는 다른 생물학적 물질(예를 들면, 혈액, 조직, 체내 유체)을 효소, 프로테아제 및 환경적 요인으로부터 분해에 대항하여 안정화시킬 수 있다는 것이 보고된다(참조: Current Protocols, Protein Sciences, Cell Biology, Wiley and Sons, 2003). 건조 보관용 매트릭스 조성물 및 생물학적 시료에 유익한 효과를 제공하기 위해 특정한 화학적 성분을 배합하는 이의 사용 방법은 또한 특정한 시료 및 이의 용도에 따라 가변적일 수 있다는 것이 고려된다.
다양한 이러한 화학적 성분은 이에 제한되는 것은 아니지만 목적하는 pH 수준을 유지할 수 있는 당해 기술분야의 숙련가들에 의해 선택될 수 있는 완충제를 포함할 수 있고, 예를 들면, 완충제는 Tris, 시트레이트, 아세테이트, 인산염, 붕산염, HEPES, MES, MOPS, PIPES, 탄산염 및/또는 중탄산염 또는 다른 완충제(참조: Calbiochem® Biochemicals & Immunochemicals Catalog 2004/2005, pp. 68-69 and pages cited therein, EMD Biosciences, La Jolla, CA) 및 적합한 용질, 예를 들면, 염(예를 들면, KCl, NaCl, CaCl2, MgCl2 등)을 포함하고, 이들은 하나 이상의 생물학적 시료 성분(예를 들면, 생체분자), 또는 특정한 생체분자의 특정한 활성, 예를 들면, 핵산 하이브리드화 또는 효소, 항체 또는 다른 단백질, 또는 다른 완충제, 예를 들면, Tris 완충제(THAM, 트로메탄올, 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판 디올), Tris-EDTA 완충제(TE), 염화나트륨/나트륨 시트레이트 완충제(SSC), MOPS/나트륨 아세테이트/EDTA 완충제(MOPS), 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 나트륨 아세테이트 완충제의 물리학적 pH에서의 활성 등을 최적화하거나 선택할 수 있는 활성 완충제를 유지, 보존, 개선, 보호 또는 그렇지 않으면 촉진한다.
건조 보관 매트릭스에 포함될 수 있는 다른 화학적 성분은 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 사람 태반 리보뉴클레아제 억제제, 소 리보뉴클레아제 억제제, 돼지 리보뉴클레아제 억제제, 디에틸 피로탄산염, 에탄올, 포름아미드, 구아니디늄 티오시아네이트, 바니딜-리보뉴클레오시드 착체, 마칼로이드, 프로테아제 K, 헤파린, 하이드록실아민-산소-제2구리 이온, 벤토나이트, 암모늄 설페이트, 디티오트레이톨(DTT), 베타-머캅토에탄올 또는 특정한 억제 항체를 포함한다.
따라서, 특정한 본 발명의 양태는 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질, 하나 이상의 안정화제, 및 시료 처리 조성물을 포함하는 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 고려한다. 시료 처리 조성물은 하기한 활성 완충제를 포함할 수 있거나/있고, 시료 처리 조성물은 세포 용해 완충제, 유리 라디칼 포획제, 시료 변성제, 및 병원균-중화제를 포함할 수 있다. 이러한 양태에 제공되는 바와 같이, 건조 보관 매트릭스는 이에 따라 시료가 매트릭스로 도입되는 경우, 예를 들면, 시료의 매트릭스와 접촉 단계가 동시에 또는 건조된 매트릭스의 재수화 또는 용매 재구성의 직전에 일어나는 양태에서 생물학적 시료 상에 목적하는 처리를 효과적으로 하기 위해 제조되는 성분의 세트를 포함한다. 또한, 특정하게 고려되는 양태에서, 완충제(활성 완충제, 세포 용해 완충제 등을 포함함), 첨가제, 시료 처리 조성물 또는 본원에 기재된 건조 보관 매트릭스는 설계되거나/되고 배치되어, 보관 매트릭스의 건조 후, 단지 물을 첨가하여 기능적, 재구성된 생체적합성 용매를 수득하여 이로부터 생물학적 시료를 복원할 수 있다.
활성 완충제는 용매 또는 용액을 액체 형태로 포함할 수 있고, 이는 농축물, 또는 하나 이상의 건조 성분을 포함히고, 하나 이상의 적합한 용매(예를 들면, 물 통상적으로, 또는 대안적으로, 알콜, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등, 유기 용매, 예를 들면, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴, 페놀, 클로로포름 등 또는 다른 용매)에 용해되거나/되고 희석되어 의도하는 용도에 적합하게 재구성되는 경우, 생물학적 시료의 목적하는 용도, 예를 들면, 시료의 하나 이상의 성분의 기능적 또는 구조적 특성에 적합한 액체를 수득한다.
이러한 용도의 비제한적인 예는 하나 이상의 효소 활성의 결정, 분자간 결합 상호작용의 결정, 특이 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 또는 면역학적으로 정의된 에피토프 또는 한정된 올리고삭카라이드 구조의 존재의 검출, 특정한 바이러스 또는 미생물 세포 또는 사람 또는 동물 세포의 검출, 특정한 대사산물 또는 이화 생성물의 결정 등을 포함하고, 이들 모두는 당해 기술 분야에 공지되고 한정된 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 시료를 적합한 활성 완충제와 접촉시켜 제조될 수 있는 적합한 조건을 포함한다.
세포 용해 완충제는 세포 또는 세포기관을 용해(즉, 경계 막 붕괴)하기 위해 선택된 조성물일 수 있고, 이러한 다수의 제형은 삼투압 충격 원리(예를 들면, 저삼투압 충격) 및/또는 계면활성제, 예를 들면, 세제(예를 들면, Triton X-100, Nonidet® P-40, 나트륨 도데실 설페이트, 데옥시콜레이트, 옥틸-글루코피라노시드, 베타인 등) 및/또는 용질(예를 들면, 우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 높은 염 농도) 시스템의 사용을 통한 세포 막, 예를 들면, 혈장 막의 붕괴를 기초로 하여 당해 기술분야에 공지되어 있다. 다수의 세포 용해 완충제는 공지되어 있고, 생물학적 시료 및 생체분자(들)의 특성의 기능, 복원되는 것을 목적으로 하는 생물학적 활성 또는 생물학적 구조에 따라 선택될 수 있고, 이는 또한 몇몇의 양태에서, 적합한 pH 완충제, 생물학적 또는 생화학적 억제제 및 검출성 지시제의 선택을 포함할 수 있다.
시료 변성제는 생물학적 시료 및 건조 보관 매트릭스의 기능에 따라 가변적일 수 있지만, 하나 이상의 3차원 배치, 4급, 3급 및/또는 2급화 구조, 용매화 정도, 표면 전하 프로파일, 표면 친수성 프로파일, 또는 시료 중 관심이 있는 생체분자의 수소결합-형성 능력을 비공유결합으로 변경시키는 (예를 들면, 적합한 대조군과 비교하여, 예를 들면, 미처리된 시료와 비교하여 통계적 중요성을 갖는) 제제를 포함할 수 있다. 시료 변성제의 예는 카오트로프(예를 들면, 우레아, 구아니딘, 티오시아네이트 염), 세제(예를 들면, 나트륨 도데실 설페이트), 고-염 조건 또는 다른 제제 또는 변성 조건을 촉진하는 제제와의 배합물이다.
특정한 양태에서, 사용하기 위한 유리 라디칼 포획제는 반응성 화합물로부터 짝이 없는 유리 라디칼 전자를 안정하게 흡수할 수 있는 제제를 포함할 수 있고, 예를 들면, 반응성 산소 종 (ROS), 예를 들면, 초과산화물, 퍼옥시니트라이트 또는 하이드록실 라디칼, 및 잠재적으로 다른 반응성 종이고, 항산화제는 예시적인 유리 라디칼 포획제이다. 따라서 다양한 공지된 유리 라디칼 포획제는 시판되고, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 특정한 양태에서 혼입을 위해 선택될 수 있다. 이의 예는 아스코르베이트, 베타-카로텐, 비타민 E, 리코펜, 3급-니트로소부탄, 알파-페닐-3급-부틸니트론, 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 및 예를 들면, 문헌에 기재된 것들을 포함한다(참조: Halliwell and Gutteridge Free Radicals in Biology and Medicine, 1989 Clarendon Press, Oxford, UK, Chapters 5 and 6); Vanin (1999 Meth. Enzymol. 301:269); Marshall (2001 Stroke 32:190); Yang et al. (2000 Exp. Neurol. 163:39); Zhao et al. (2001 Brain Res.909:46); 등).
상기 언급된 바와 같이, 특정한 양태는 본 발명의 조성물 및 방법의 병원균-중화제의 혼입이 고려되고, 이는 적합한 대조군과 비교하여 통계적으로 중요한 방법으로, 완전히 또는 부분적으로 병원균, 예를 들면, 세균, 바이러스, 진균, 기생충, 프리온, 효모, 원생동물, 감염 제제 또는 사람 또는 척추동물에서 질환 또는 장애를 야기하는 다른 미생물학적 제제의 병원성 효과를 적합하게 중화, 손상, 지연, 억제, 방해, 예방, 반작용, 감퇴, 감소, 또는 그렇지 않으면 저지할 수 있는 제제를 포함한다. 당해 기술분야의 숙련가들은 본원에 따른 용도를 위한 적합한 병원균-중화제를 인지할 수 있다. 예시적인 제제는 나트륨 아자이드, 붕산염, 나트륨 차아염소산염, 과산화수소 또는 다른 산화제, 나트륨 디클로로이소시아누레이트, 에탄올, 이소프로판올, 항생제, 진균제, 뉴클레오사이드 유사체, 항바이러스 화합물, 및 다른 살균제를 포함하고; 이러한 또는 다른 것들이 관심이 있는 특정한 생물학적 시료의 특성에 따라 선택될 수 있다.
하기 고려된 바와 같이, 본원의 건조 보관 매트릭스가 사용될 수 있는 통상적 생물학적 시료 보관 장치의 각 웰은 약 5㎕ 내지 약 100㎕의 액체 시료 물질, 바람직하게는 약 10㎕ 내지 약 30㎕의 액체 시료 물질을 유지한다. 시료 양은 약 0.01㎍ 내지 약 1000㎍의 DNA, RNA, 단백질, 혈액, 소변, 바이러스, 세균, 세포, 조직, 세포 추출물, 조직 추출물, 대사산물, 화학물질, 또는 다른 물질로 가변적일 수 있다. 시료 적용은 직접적 스폿팅(spotting)을 통해서 하고, 자동으로 할 수 있다. 스폿팅된 웰을 검출성 지시제, 예를 들면, 사용되는 웰이 나타내는 색이 변하는 색 지시제로 제공할 수 있다. 색 변화는 착색제를 첨가하여 성취할 수 있다. 예를 들면, 폰코 레드 다이, 니트라진 옐로우, 브롬 티몰 블루, 브로모크레솔 그린, 메틸 오렌지, 콩고 레드, 브로모클로로페놀은 시료 물질과 함께 또는 전후에 적재할 수 있거나, 또는 매트릭스 물질을 시료 물질을 웰로 적재하기 전후에 처리한다. pH-의존 착색 시료는 적용될 수 있고, 이는 생물학적 pH가 6.5 내지 8.5인 시료를 웰 내의 매트릭스로 적재 후 색을 변화시킨다. 스폿팅된 웰을 약 1 내지 약 20분 내에 실온에서 또는 약 0.1 내지 약 10분 내에 승온에서 건조시킨다. DNA는 약 50 내지 약 80회 이하로 웰의 재수화를 통해 복원할 수 있다. 재-수화 시약은 용액 또는 시료 완충제, 예를 들면, 생물학적 pH 6.5 - 8.5를 갖는 완충제, 예를 들면, Tris 완충제, Tris-EDTA 완충제(TE), 염화나트륨/나트륨 시트레이트 완충제(SSC), MOPS/나트륨 아세테이트/EDTA 완충제(MOPS), 나트륨 아세테이트 완충제, 또는 본원에 기재되고 당해 기술분야에 공지된 다른 완충제일 수 있다. 건조 보관 장치 설계는 생물학적 시료의 보관을 위한 추가의 변형 없이 적용될 수 있고, 예를 들면, 세균, 효모, 사람, 동물, 식물 및 다른 원으로부터 정제된 게놈 DNA를 포함한다. 추가의 변형, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 프로테아제에 대한 변성 제제를 사용하는 필터의 피복의 경우, 건조 보관 장치는 또한 세균, 구강 면봉채취물, 생검 조직, 정액, 소변, 혈액, 단백질 및 다른 시료에 대해 사용될 수 있다.
관련된 양태는 본원에 기재된 바와 같은 생물학적 시료 보관 장치를 바람직한 용도를 위해 선택될 수 있는 하나 이상의 보조 시료와 함께 포함하는 키트를 지시한다. 임의로, 키트는 또한 박스, 케이스, 병, 드럼, 서랍, 캐비넷, 카톤, 담체, 핸들, 랙(rack), 트레이, 팬, 탱크, 백, 봉투, 슬리브, 하우징 등, 예를 들면, 다른 적합한 용기를 포함할 수 있다. 보조 시료는 본원에 기재되고 당해 기술분야에 공지된 하나 이상의 용매 또는 완충제를 포함할 수 있고, 특정한 양태에서, 활성 완충제를 포함할 수 있다.
생물학적 시료 보관 장치
본 발명의 생물학적 시료 보관 장치(이하 "보관 장치")는 시료 플레이트와 뚜껑으로 구성된다. 보관 장치의 크기는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 약 80mm 내지 약 200mm, 폭 약 60mm 내지 약 150mm 범위일 수 있다. 바람직하게는, 보관 장치는 높이 약 3mm 내지 약 15mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm 범위인 것이다. 보관 장치는 유색의 폴리프로필렌으로 제조될 수 있고, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 시료 적재 웰을 보유할 수 있다. 각 보관 장치는 각각 정밀한 봉인 뚜껑을 보유한다. 보관 장치는 사출 성형으로 제조될 수 있고 일체형 또는 복합형으로 제조될 수 있다.
바람직한 양태 및 전술한 바에 따르면, 생물학적 시료 보관 장치는 데이타를 수신, 보관 및/또는 송신하기 위하여 보관 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이에 무선 주파 인터페이스를 함유하는 시료 데이타 처리 시스템에 유용하게 형성된다. 데이타는 보관 장치 및/또는 여기에 함유된 하나 또는 그 이상의 생물학적 시료에 관한 것일 수 있다. 특정 관련 양태에 따르면, 생물학적 시료 보관 장치는 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 무선 주파 응답기 장치를 포함하는데, 이것은 보관 장치의 필수 부재일 수 있고(있거나) 보관 장치의 내면 또는 외면에 부착될 수도 있다. 추가로 또는 대안으로 보관 장치는 바코드가 표지되고(되거나) 경우에 따라 지울 수 없는 마커펜으로 코드화하기 위한 하나 또는 그 이상의 영역을 함유할 수 있고(있거나) 경우에 따라 각인된 취급 프로토콜을 포함할 수 있다. 시료 플레이트의 플라스틱 물질은 두께가 약 0.1mm 내지 약 2mm일 수 있고, 열을 즉시 전달하고 약 100℃까지의 열에 내성인 것이다.
시료 플레이트는 바람직하게는 구형이지만, 다른 임의의 형태, 즉 사각형, 직사각형, 타원형 등일 수 있는 예정위치(footprint)를 가진 수용 영역 또는 웰을 함유한다. 이러한 웰의 바닥부는 형태가 편평하거나, 원추형이거나, 원기둥형이거나 구형이거나, 임의의 다른 형태일 수 있다. 웰의 가장자리는 원기둥, 원추형 또는 다른 형태일 수 있다. 웰의 수는 시료 플레이트 당 적게는 1개부터, 많게는 수천개일 수도 있다. 가장 바람직하게는 시료 플레이트에 위치한 웰이 약 96개 내지 약 384개인 것이다. 또한, 시료 웰은 본 명세서에 기술된 표준 시료 플레이트에 맞출 수 있는 1, 4 및 8 웰의 그룹으로 나뉠 수도 있다. 웰은 플레이트에 여러 줄로 배열된다. 96웰을 보유한 플레이트의 경우, 한 줄은 8개의 웰을 함유한다. 독특한 점은 상기 시료 플레이트가 다양한 복수의 웰을 보유한 각 시료 슬라이드를 다수 수용하는 트레이일 수 있다는 점이다. 각 슬라이드는 트레이에 끼워지고 하나의 플레이트에 다양한 수의 웰을 보관할 수 있게 해준다. 웰의 하부면은 얇고, 바람직하게는 두께가 약 0.1mm 내지 약 2mm인 것이 좋다.
본 발명은 고처리량 선별(high throughput screening)에, 즉 다수의 생물학적 시료를 자동 검사 또는 선별하는데 중요한 가치가 있을 것으로 생각된다. 특히, 예컨대 활성 화합물의 합성 또는 천연 산물 라이브러리를 선별하는데 중요하다. 따라서, 본 발명의 장치 및 방법은 경제적인 자동 고처리량 생물학적 시료 검사 또는 약물 선별에 쉽게 사용될 수 있고, 다양한 약학적 약물 개발 프로그램에 직접 사용가능하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 웰은 96웰 플레이트 포맷, 또는 다른 정규 2차원 어레이, 예컨대 1536웰 또는 384웰 포맷과 같은 고처리량 선별 포맷으로 구성된다. 따라서, 고처리량 선별용 포맷은 자동화되기 쉬운 것이 바람직하다. 예컨대, 본 발명의 고처리량 선별 양태에 따라 사용되는 자동화 장치는 컴퓨터 또는 다른 프로그램 가능 제어기의 통제 하에 있는 것이 바람직하다. 제어기는 공정의 각 단계마다 결과를 지속적으로 모니터할 수 있고, 이러한 결과에 따라 검사 전형을 자동 변경할 수 있다.
전형적으로, 고처리량 약물 선별과 같은 바람직한 특정 양태에 따르면, 후보 제제는 "라이브러리" 또는 화합물, 조성물 또는 분자의 수집물로서 제공된다. 이러한 분자들은 일반적으로 "소분자"로서 당업계에 공지되고 분자량이 105 달톤 미만, 바람직하게는 104 달톤 미만, 더욱 바람직하게는 103 달톤 미만인 화합물을 포함한다. 또한, 후보 제제로는 바람직하게는 본 발명에 따른 보관 장치에 함께 구비될 수 있는 복수의 반응 용기에서 수행된 복수의 소정 화학 반응에 따라 제조된 합성 제제를 포함하는 조합 라이브러리의 성분들이 제공될 수 있다. 예컨대, 다양한 원료 화합물은 예컨대 고상 합성법, 핵심 랜덤 혼합물 방법론 및 소정의 구성물이 복수의 과돌연변이 및/또는 반응 조건의 조합으로 추적가능하게 처리될 수 있게 하는 핵심 반응 분할 기술 중 하나 이상을 이용하여 제조할 수 있다. 수득되는 산물은 선별 후 반복적인 선발과 합성 절차로 처리될 수 있는 라이브러리, 예컨대 펩타이드의 합성 조합 라이브러리(예, PCT/US91/08694 및 PCT/US91/04666 참조) 또는 본 명세서에 제시된 바와 같은 소분자를 포함할 수 있는 다른 조성물(예, PCT/US94/08542, EP 0774464, US 5,798,035, US 5,789,172, US 5,751,629)을 포함한다. 당업자는 이러한 라이브러리의 다양한 조합이 본 명세서에 기술된 바와 같은 보관 장치를 사용하여 확립된 절차에 따라 제조할 수 있고(있거나) 본 명세서에 기술된 바와 같은 장치 및 방법을 사용하여 검사될 수 있음을 잘 이해할 것이다. 예컨대, 검사 화합물의 라이브러리 성분들은 본 명세서에 제공된 바와 같은 고처리량 선별 어레이로서 유용한 시료 보관 장치에서 복수의 웰 각각에 존재하는 복수의 생물학적 시료에 투여될 수 있다.
웰은 액체 또는 건조 물질 중 어느 한 형태 또는 두 형태인 생물학적 시료 또는 생물학적 물질을 수용할 수 있다. 고체 매트릭스 물질, 예컨대 스폰지 유사 물질, 실리카, 실리카 분말, 실리카 여지, 흡수성 분말 또는 여지 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 매트릭스 물질 등(이에 국한되지 않는다)이 웰에 첨가될 수 있고, 따라서 비제한적 논리인 흡수, 흡착, 특이적 또는 비특이적 결합 또는 다른 부착 기작, 예컨대 비공유 및/공유 화학 결합 및/또는 분자간 회합적 상호작용, 예컨대 소수성 및/또는 친수성 상호작용, 수소 결합 형성, 정전기적 상호작용 등의 형성을 수반하는 기작 등에 따라 생물학적 물질을 도입할 수 있다. 매트릭스 물질은 시료 플레이트 유닛의 생산 공정 중에 통합되거나, 또는 접착제 상호작용을 통해 부착되거나, 웰에 끼워 넣어지거나, 또는 이후에 하나 이상의 웰에 하나 이상의 생물학적 시료를 첨가하기 전, 첨가하면서 또는 첨가한 후에 웰에 첨가할 수 있다. 웰의 가장자리는 평면이거나 또는 돌출 엣지(edge)를 함유할 수 있다. 돌출 엣지는 특정 양태에 따르면 접착제 상호작용의 유무에 관계없이 매트릭스 물질을 웰 내부에 보유할 수 있다. 액체 보관은 바닥 플레이트의 표면에 작은 개구부가 있는 웰의 역원추형을 통해 달성할 수 있다. 역원추형은 누출 방지 방식으로 웰 안에 액체를 보유할 것이다.
뚜껑은 바닥 시료 플레이트의 웰에 잘 맞는 돌출부를 보유하거나 편평할 수 있다. 뚜껑과 시료 플레이트는 시료 플레이트와 뚜껑의 끼워맞춤식으로 밀봉되거나 또는 압축성 물질의 쿠션이나 기밀성 덮개 조인트를 구비할 수 있다. 조인트는 시료 플레이트와 뚜껑의 경계선 주위에 또는 각 단일 웰 주위에 배치될 수 있다. 조인트는 시료 플레이트가나 뚜껑에 부착될 수 있다. 조인트는 가장자리에 위치하거나 또는 접착제 물질로 뚜껑에 부착하는 것이 바람직하다. 기밀성 끼워맞춤은 뚜껑의 돌출부를 정밀한 봉인처럼 시료 플레이트 웰에 삽입하여 달성할 수 있다.
시료 플레이트는 보관 유닛의 양면 중 한 면에 위치한 힌지 시스템을 통해 뚜껑에 연결될 수 있지만, 대향하는 양면에 위치할 수도 있다. 상기 힌지는 두 유닛을 연결하며 보관 장치의 개방 및 밀봉을 담당한다. 힌지 장치는 플라스틱 물질로 제조될 수 있지만, 플라스틱의 종류는 그 용도에 따라 결정될 수 있다. 힌지(들)는 시료 플레이트으로부터 뚜껑을 제거하는 역할도 한다.
생물학적 물질을 장기 보관하기 위한 뚜껑과 시료 플레이트의 밀봉은 바람직한 특정 양태에 따르면 자석 부착을 통해서 이루어질 수 있지만, 본 발명에 따라 생각될 수 있는 다른 양태로서 플레이트 위에 뚜껑을 밀봉하는 다른 수단이 이용될 수도 있으며, 그 예로는 스냅, 봉인, 접착제, 후크와 루프, 스레딩(threading) 덮개, 솔레노이드, 프러스트로코니컬(frustroconical) 덮개, 베요넷(bayonet), 핀치 덮개, 죔쇠 등이나 다른 덮개 수단이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 따라서 보관 단위의 뚜껑과 시료 플레이트는 바람직한 양태에 따르면 보관 장치의 뚜껑과 시료 플레이트 안에 위치한 작은 자석 형태 또는 자석 시트 형태일 수 있는 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 뚜껑 사이의 자석 인력은 보관 플레이트를 빈틈없이 봉인할 수 있을 정도로 충분히 강하지만, 뚜껑을 열 때 시료 플레이트의 용이한 개방, 꼬임 또는 변형을 방해할 만큼 강하지는 않다. 이러한 자석 덮개는 보관 유닛에 다른 장치를 부착하는 데에도 사용될 수 있어, 보관 유닛에 적재하기 전에 생물학적 물질의 처리도 가능하다. 보관 유닛의 자석 인력은 보관 장치를 이 유닛 아래의 추가 장치에 부착시킬 때에도 사용될 수 있다. 자성은 기본 유닛을 다른 장치 또는 유닛에 연결하는 기구이다.
보관 장치는 적어도 하나의 식별 및 데이타 보관 태그, 예컨대 무선 주파 응답기 장치 또는 "RF 태그"를, 본 명세서에 기술된 생물학적 시료 보관 장치와 컴퓨터 실행 시스템 사이의 무선 주파 통신 인터페이스의 부품으로서 함유하는 것이 바람직하다. 특정 양태로서, 보관 장치 안이나 위에 복수의 RF 태그가 포함될 수 있다. 보관 장치는 또한 특정 양태에 따라 가시적 인식 부품을 포함하기도 한다. 여러 웰들은 예컨대 시료 플레이트 위에 숫자 및 문자를 새기거나 또는 인쇄 공정을 통해 숫자를 매기고 표식을 새길 수 있다. 경우에 따라, 시료 플레이트의 적어도 한 면은 그 표면에 바코드가 부착되거나 새겨질 수 있다. 보관 장치의 뚜껑은 모든 종류의 각주 및 설명을 위한 영역을 보유할 수 있다. 또한, 뚜껑의 상부 표면에도 바코드가 있을 수 있어 시료 플레이트의 바코드와 짝을 이룰 수 있다. 이중 바코드화는 생물학적 물질의 고유 식별은 물론 시료 플레이트와 뚜껑을 연결시켜 줄 수 있다. 복수의 RF 태그 및/또는 복수의 바코드화 부위는 이러한 식별/데이타 보관 장치 중 하나가 탈착되거나, 손상되거나 또는 다른 방식으로 판독할 수 없게 된 경우에 보안 장치 역할을 할 수 있다.
습윤성 보관 장치
보관 장치는 웰 디자인에 하나 또는 그 이상의 변화를 통해 시료를 습윤 보관할 수 있게 변형될 수 있다. 웰을 열고 닫을 때 유출을 통해 웰을 따라 일어나는 교차 오염은 표면 장력을 통해 웰에 액체를 보유시키면서 웰의 상부에 작은 개구(opening)를 제공하는 디자인을 통해 방지할 수 있다.
웰 상부의 작은 개구는 웰의 상부로부터 개방 공간으로 돌출하여 각 웰의 전체 개구를 감소시키는 플라스틱 플랩을 통해 또는 역 원추형 디자인을 통해 제공될 수 있다. 습윤성 보관 장치는 사출 성형을 통해 제조하고, 전술한 보관 장치와 마찬가지로 일체형 또는 이체형으로 제조할 수 있다. 습윤성 보관 장치는 약 -80℃ 내지 약 100℃ 범위의 온도에 내성이 있다.
스트립 웰 모듈
본원에 기재된 모든 장치 및 적용은 1, 4 또는 8개의 웰 스트립을 장착한 스트립 웰 포맷으로 사용될 수 있다. 스트립 웰 모듈은 보관 장치로서 동일하거나 유사한 기본 풋프린트를 갖는다. 96웰 미만의 웰 플레이트 유닛 보다 적은 시료수의 보관을 허용한다. 모듈 디자인은 웰 스트립이 얇은 기저 기판에 부착되도록 한다. 하나의 스트립은 1, 4 또는 8개의 웰을 함유할 수 있다. 당해 스트립은 얇은 자기 작용 또는 스트립 말단에 존재하는 클립을 통해 기저-플레이트에 부착될 수 있다. 기저 플레이트의 두께를 포함하는 하나의 스트립의 높이는 통상의 기본 보관 유닛과 동일하여 유닛의 뚜껑은 당해 장치를 차폐한다.
압력 장치
본 발명의 압력 장치는 전술한 시료 보관 장치, 필터 유닛, 압력 플레이트 유닛 및 가압 공기 시스템을 포함하는 여러 모듈로 구성된다. 모든 유닛은 표준 생물학적 시료 플레이트인 96웰, 384웰 또는 1535웰 플레이트와 동등한 동일 크기이다. 압력 장치의 치수는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 80mm 내지 200mm, 및 폭 약 60mm 내지 약 150mm이다. 바람직하게는, 압력 장치의 높이는 약 3mm 내지 약 20mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm이지만, 시료 수가 적으면 치수가 더 작아질 수도 있고, 또는 시료 시스템이 더 작아질 수도 있다. 모든 모듈은 시료 보관 장치 치수의 크기에 따라 치수가 다양할 수 있는 반면, 웰의 수는 적게는 시료 플레이트당 1웰에서부터 많게는 수만 웰일 수 있다. 가장 바람직하게는, 96웰 또는 384웰이 시료 플레이트에 구비되고 각 압력 플레이트 유닛을 통해 처리되는 것이 좋다. 또한, 각 압력 장치의 시료 웰의 수는 본 발명에 기술된 표준 시료 장치에 끼울 수 이는 1웰, 4웰 및 8웰의 그룹으로 분할될 수도 있다. 압력 장치는 유색 플라스틱 물질로 제조되거나 금속으로 제조되거나 또는 이 둘의 조합으로 제조되기도 한다. 압력 장치 및 이의 모듈의 본체는 사출 성형 또는 공작 기계 또는 이 둘 모두에 의해 제조된다.
필터 유닛은 압력 장치, 시료 보관 장치 및 본 명세서에 기술된 임의의 다른 장치에 자석력으로 부착될 수 있다. 작동 중의 공기 압력을 견디는데 도움을 주기 위해 추가 죔쇠를 구비할 수도 있다. 필터 유닛은 폴리프로필렌, 아크릴과 같은 유색 고형재로 제조될 수 있고 여과용 종이 또는 고체 매트릭스를 함유한다. 필터 유닛은 여과에 사용되는 기질에 따라 두께가 약 1mm 내지 약 15mm인 것이 바람직하다. 필터 유닛은 시료 보관 장치 위에 끼워지는 적당한 수의 구멍/홈을 보유하고, 96, 384, 1536 또는 그 이상의 시료 적재 구멍을 갖고 있다. 각 필터 유닛은 자체적으로 강한 봉인 뚜껑을 보유한다. 구멍의 가장자리는 평면이거나 또는 돌출 엣지(edge)를 함유할 수 있다. 돌출 엣지는 접착제 상호작용의 유무에 관계없이 매트릭스 물질을 구멍 안에 보유시킬 수 있다.
필터 유닛의 각 구멍은 혈액, 세균, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, PCR 산물, 클로닝된 DNA, 단백질, RNA, 단백질, 무기물 또는 화학물질(이에 국한되지 않는다)과 같은 생물학적 물질의 여과를 위한 여과지, 스폰지유사 물질, 실리카, 흡수성 분말 등(이에 국한되지 않는다)의 매트릭스 물질을 함유할 수 있다. 매트릭스는 생물학적 시료 처리, 예컨대 DNA 정제, PCR 증폭, 시료 크기 분별(예컨대, 분자 크기 또는 세포 크기 기준), 혈청 처리, 혈액 처리, 단백질 정제 및 세포 분류 중 하나 또는 그 이상(이에 국한되지 않는다)을 지속할 수 있는 것으로 선택할 수 있다. 매트릭스 물질은 시료 플레이트 유닛의 제조 과정에서 통합될 수도 있고, 또는 접착제 상호작용을 통해 부착되거나 또는 구멍에 끼워 넣을 수 있다. 매트릭스는 크기 분별 필터 제조에 필수적인 표준 기술을 제조하거나, 또는 불필요한 생물학적 분획을 분해 또는 보유하는 물질로 처리된다(예컨대, Current Protocols, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). 매트릭스 물질은 또한 시료 물질의 분획을 보유하기 위한 항체, 렉틴, 다른 친화성, 전하 선택성, 이온 선택성, 기 선택성(예, 아미노 작용기 또는 카르복실 작용기), 소수성, 친수성 또는 다른 선택성 분자 등으로 처리되고(되거나) 바람직한 생물학적 또는 화학적 기능 또는 작용기를 부여하는 작은 화학적 실체로 처리될 수 있다(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 2003; Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; and Hermanson, GT. et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, Academic Press, Inc., California). 매트릭스 물질은 완충액 조건의 조절 및 화학적 첨가제, 안정제 또는 분해 시약의 변형을 통해 생물학적 물질을 보존하는 전처리가 이루어질 수 있다(예컨대, Sambrook et al., 1989; Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Protein Science, Molecular Biology, Cell Biology, Wiley and Sons, 2003). 각 구멍은 약 5㎕ 내지 약 1000㎕의 시료 용량을 처리할 수 있다. 시료 양은 약 0.1㎍의 DNA 내지 약 1000㎍의 DNA, RNA, 단백질, 혈액, 소변, 바이러스, 세균, 세포, 조직, 세포 추출물, 조직 추출물, 대사산물, 화학물질 또는 다른 물질로 다양할 수 있다. 시료 적용은 직접 점적을 통해 수행하며 자동화될 수 있다.
압력 플레이트 유닛은 상부에서부터 필터 유닛 구멍으로 공기 압력을 가하여, 시료를 매트릭스를 통해 아래에 위치한 보관 장치의 웰로 압입시킨다. 압력은 압축 실험실 공기 시스템 또는 압축 공기 캐니스터로 적용할 수 있다. 압력 유닛은 상부 압력을 통해 시약을 시료 보관 장치, PCR 장치, 서열분석 장치, 제한효소 분석 장치, 단백질 결정학 장치, 진단 장치 및 스트립 웰 장치의 웰로 도입시키기 위해 적용할 수 있다. 압력 플레이트 유닛은 모든 구멍을 공기 흡입구에 연결하는 구멍을 구비한다. 공기 흡입구는 압력 플레이트 유닛을 가압 공기 급원에 연결시키는 기밀성 봉인을 보유한 밸브에 부착된다. 압력 유닛은 밸브를 돌려 고정시킴으로써 공기 급원에 부착한다. 또한, 밸브는 각 특정 필터 유닛에 필요한 압력을 표시하는 압력 게이지에 부착될 수도 있다.
본 명세서에 기술된 압력 장치의 모든 모듈은 시료를 필터 시스템을 통해 보관 웰로 압입시키는데 필요한 압력을 견디는 봉인에 도달하기 위하여 기밀성인 것이 바람직하다. 각 모듈은 인접 모듈에 정확하게 끼워지는 돌출부를 갖거나 편평할 수 있다. 기밀성 끼워맞춤은 조인트 또는 압축성 재료의 쿠션을 이용하여 달성한다. 조인트는 각 유닛의 둘레 주위에 위치하거나 각 웰의 주위마다 위치할 수도 있다. 조인트는 가장자리에 위치하거나 또는 접착제 물질로 뚜껑에 부착하는 것이 바람직하다. 기밀성 끼워맞춤은 각 유닛의 돌출부를 정밀한 봉인처럼 아래에 부착될 유닛에 삽입하여 달성할 수 있다.
압력 유닛, 필터 유닛 및 보관 장치를 비롯한 모든 모듈의 부착은 자석 접착을 통해 달성하는 것이 바람직하다(대안적으로, 이러한 장치 양태 및 이하에 기술되는 다른 장치 양태에서는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 덮개 수단을 이용할 수 있다). 각 유닛은 자석 시트 또는 작은 자석 형태의 자석을 함유한다. 각 유닛 사이의 자석 인력은 시료 보관 또는 다른 장치에 적재하기 전 생물학적 물질의 처리에 필요한 강한 봉인을 제공하기에 충분히 강한 것이다. 독립된 세 모듈(압력 유닛, 필터 유닛 및 보관 장치)의 자석 부착은 죔쇠에 의해 더욱 고정될 수 있다. 죔쇠는 상기 모듈들을 함께 끼워서 자석 부착 기구를 강화시키기 위해 형성된, 금속이나 플라스틱 물질로 제조될 수 있다. 죔쇠는 여과 유닛의 측면보다 치수가 작은 것이 바람직하다. 죔쇠는 이 죔쇠를 여는 외부 압력의 적용을 통해 부착될 수 있고, 또는 필터 모듈의 외면 상으로 활주 이동하도록 설계될 수 있다. 필터 유닛의 고정을 위해 2개 이상의 죔쇠가 이용될 수 있다.
각 모듈은 육안 확인부를 보유한다. 각 웰은 시료 플레이트 우에 수와 문자를 각인하거나 인쇄 공정을 통해 수를 매기고 표식을 만들 수 있다.
휴대용 PCR 장치
시료 플레이트는 자석력을 통해 열순환 유닛(PCR 장치)에 부착될 수 있다. 이러한 시료 플레이트와 PCR 장치는 시료 플레이트의 내면에 위치한 작은 자석 형태 또는 자석 시트 형태의 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 PCR 장치 사이의 자석 인력은 시료 플레이트가 PCR 장치에 정확하게 위치하고 강하게 부착할 수 있게 한다.
PCR 장치는 보관 장치의 예정 위치가 있는 온도 기판을 함유한다. PCR 장치는 약 4℃ 내지 약 100℃ 범위의 온도를 형성한다. PCR 장치는 다양한 온도, 다양한 온도 유지 시간 및 4℃ 내지 100℃ 범위일 수 있는 다양한 온도 변화를 함유하고 표준 PCR 증폭 조건 및 핫스타트(hot-start) PCR 증폭 조건에 대한 요건을 조정하는 반복 순환 프로토콜에 대해 프로그램될 수 있는 컴퓨터 부재를 함유한다(예컨대, Qiagen "Taq PCR Handbook", Qiagen "Critical Factors for Successful PCR"). PCR 유닛은 약 100℃ 이하의 일정 온도를 유지 및 형성시키는 일체형 가열 뚜껑이나 덮개를 함유할 수 있다. 이러한 뚜껑이나 덮개는 금속이나 유사 물질로 제조될 수 있고 위치한 후 시료 플레이트의 상부에 자석력을 통해 유지될 수 있다. 이러한 PCR 유닛에 공급되는 에너지는 표준 110/220V 전기 코드, 배터리 팩 또는 태양 광선을 이용한 에너지원으로부터 유입될 수 있다.
PCR 시약 모듈
PCR 시약 모듈은 PCR 증폭에 필요한 모든 시약을 함유한다. 여기에는 완충액, 프라이머, 폴리머라제 효소 및 데옥시뉴클레오타이드와 같은 시약(이에 국한되지 않는다)을 포함할 수 있다(예컨대, Qiagen "Taq PCR Handbook", Qiagen "Critical Factors for Successful PCR"). 이러한 시약은 시료 플레이트의 포맷과 치수에 부합하는 96웰, 384웰 또는 1536웰 또는 이보다 큰 포맷에 제공된다. PCR 시약 모듈의 치수는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 약 80mm 내지 약 200mm, 폭 약 60mm 내지 약 150mm 이다. 바람직하게는, PCR 시약 모듈은 높이 약 3mm 내지 약 15mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm 범위인 것이다. PCR 시약 모듈은 유색의 폴리프로필렌으로 제조되며, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 시료 적재 웰을 보유한다. PCR 시약 모듈은 사출 성형으로 제조한다.
자성은 시료 플레이트를 PCR 시약 모듈에 연결하는 기구이다. 시료 플레이트와 PCR 시약 모듈은 시료 플레이트의 내면에 위치한 자석, 바람직하게는 작은 자석 또는 자석 시트 형태의 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 PCR 시약 모듈 사이의 자석 인력은 시료 플레이트가 PCR 시약 모듈에 정확하게 위치하여 강하게 부착할 수 있게 한다.
PCR 시약 모듈은 여러 디자인으로 설계될 수 있다. 각 시료 웰은 시료 플레이트의 웰 안으로 향하는 돌출성 엣지를 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 또한, PCR 시약 모듈로부터 시료 플레이트으로 시약을 전달하기 위하여 압력 장치에 의해 적용되는 공기 압력의 적용을 필요로 할 수 있다.
서열분석 시약 모듈
서열분석 시약 모듈은 DNA 서열분석 또는 DNA 순환 서열분석에 필수적인 모든 시약을 함유한다. 예컨대, 완충액, 프라이머, 서열분석 효소, 데옥시뉴클레오타이드 및 디데옥시뉴클레오타이드 등(이에 국한되지 않는다)과 같은 시약을 함유할 수 있다(예컨대, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). 시약은 시료 플레이트의 포맷과 치수에 부합하는 96웰, 384웰 또는 1536웰 또는 이보다 큰 포맷에 제공된다. 서열분석 시약 모듈의 치수는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 약 80mm 내지 약 200mm, 폭 약 60mm 내지 약 150mm 이다. 바람직하게는, 서열분석 시약 모듈은 높이 약 3mm 내지 약 15mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm 범위인 것이다. 서열분석 시약 모듈은 유색의 폴리프로필렌으로 제조되며, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 시료 적재 웰을 보유한다. 서열분석 시약 모듈은 사출 성형으로 제조한다.
자성은 시료 플레이트를 서열분석 시약 모듈에 연결하는 기구이다. 시료 플레이트와 서열분석 시약 모듈은 시료 플레이트의 내면에 위치한 자석, 바람직하게는 작은 자석 또는 자석 시트 형태의 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 서열분석 시약 모듈 사이의 자석 인력은 시료 플레이트가 서열분석 시약 모듈에 정확하게 위치하여 강하게 부착할 수 있게 한다.
서열분석 시약 모듈은 여러 디자인으로 설계될 수 있다. 각 시료 웰은 시료 플레이트의 웰 안으로 향하는 돌출성 엣지를 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 또한, 서열분석 시약 모듈로부터 시료 플레이트으로 시약을 전달하기 위하여 압력 장치에 의해 적용되는 공기 압력의 적용을 필요로 할 수 있다.
프라이머 연장 시약 모듈
프라이머 연장 시약 모듈은 프라이머 연장에 필요한 모든 시약을 함유한다. 그 예로는 완충액, 프라이머, 폴리머라제 효소, 데옥시뉴클레오타이드 및 디데옥시뉴클레오타이드와 같은 시약을 함유할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). 시약은 시료 플레이트의 포맷과 치수에 부합하는 96웰, 384웰 또는 1536웰 또는 이보다 큰 포맷에 제공된다. 프라이머 연장 시약 모듈의 치수는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 약 80mm 내지 약 200mm, 폭 약 60mm 내지 약 150mm 이다. 바람직하게는, 프라이머 연장 시약 모듈은 높이 약 3mm 내지 약 15mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm 범위인 것이다. 프라이머 연장 시약 모듈은 유색의 폴리프로필렌으로 제조되며, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 시료 적재 웰을 보유한다. 프라이머 연장 시약 모듈은 사출 성형으로 제조한다.
자성은 시료 플레이트를 프라이머 연장 시약 모듈에 연결하는 기구이다. 시료 플레이트와 프라이머 연장 시약 모듈은 시료 플레이트의 내면에 위치한 자석, 바람직하게는 작은 자석 또는 자석 시트 형태의 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 프라이머 연장 시약 모듈 사이의 자석 인력은 시료 플레이트가 프라이머 연장 시약 모듈에 정확하게 위치하여 강하게 부착할 수 있게 한다.
프라이머 연장 시약 모듈은 여러 디자인으로 설계될 수 있다. 각 시료 웰은 시료 플레이트의 웰 안으로 향하는 돌출성 엣지를 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 또한, 프라이머 연장 시약 모듈로부터 시료 플레이트으로 시약을 전달하기 위하여 압력 장치에 의해 적용되는 공기 압력의 적용을 필요로 할 수 있다.
일배체형 시약 모듈
일배체형 시약 모듈은 DNA 일배체형에 필요한 모든 시약을 함유한다. 그 예로는 완충액, 프라이머, 서열분석 효소, 데옥시뉴클레오타이드 및 디데옥시뉴클레오타이드와 같은 시약을 함유할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). 시약은 시료 플레이트의 포맷과 치수에 부합하는 96웰, 384웰 또는 1536웰 또는 이보다 큰 포맷에 제공된다. 일배체형 시약 모듈의 치수는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 약 80mm 내지 약 200mm, 폭 약 60mm 내지 약 150mm 이다. 바람직하게는, 일배체형 시약 모듈은 높이 약 3mm 내지 약 15mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm 범위인 것이다. 일배체형 시약 모듈은 유색의 폴리프로필렌으로 제조되며, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 시료 적재 웰을 보유한다. 일배체형 시약 모듈은 사출 성형으로 제조한다.
자성은 시료 플레이트를 일배체형 시약 모듈에 연결하는 기구이다. 시료 플레이트와 일배체형 시약 모듈은 시료 플레이트의 내면에 위치한 자석, 바람직하게는 작은 자석 또는 자석 시트 형태의 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 일배체형 시약 모듈 사이의 자석 인력은 시료 플레이트가 일배체형 시약 모듈에 정확하게 위치하여 강하게 부착할 수 있게 한다.
일배체형 시약 모듈은 여러 디자인으로 설계될 수 있다. 각 시료 웰은 시료 플레이트의 웰 안으로 향하는 돌출성 엣지를 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 또한, 일배체형 시약 모듈로부터 시료 플레이트으로 시약을 전달하기 위하여 압력 장치에 의해 적용되는 공기 압력의 적용을 필요로 할 수 있다.
제한효소 분석 시약 모듈
제한효소 분석 시약 모듈은 DNA 제한효소 분석에 필요한 모든 시약을 함유한다. 그 예로는 완충액, 제한효소 및 염과 같은 시약을 함유할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, Sambrook et al., 1989; Current Protocols, Nucleic Acid Chemistry, Molecular Biology, Wiley and Sons, 2003). 시약은 시료 플레이트의 포맷과 치수에 부합하는 96웰, 384웰 또는 1536웰 또는 이보다 큰 포맷에 제공된다. 제한효소 분석 시약 모듈의 치수는 높이 약 2mm 내지 약 25mm, 길이 약 80mm 내지 약 200mm, 폭 약 60mm 내지 약 150mm 이다. 바람직하게는, 제한효소 분석 시약 모듈은 높이 약 3mm 내지 약 15mm, 길이 약 100mm 내지 약 140mm, 폭 약 60mm 내지 약 100mm 범위인 것이다. 제한효소 분석 시약 모듈은 유색의 폴리프로필렌으로 제조되며, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 시료 적재 웰을 보유한다. 제한효소 분석 시약 모듈은 사출 성형으로 제조한다.
자성은 시료 플레이트를 제한효소 분석 시약 모듈에 연결하는 기구이다. 시료 플레이트와 제한효소 분석 시약 모듈은 시료 플레이트의 내면에 위치한 자석, 바람직하게는 작은 자석 또는 자석 시트 형태의 자석을 함유한다. 시료 플레이트와 제한효소 분석 시약 모듈 사이의 자석 인력은 시료 플레이트가 제한효소 분석 시약 모듈에 정확하게 위치하여 강하게 부착할 수 있게 한다.
제한효소 분석 시약 모듈은 여러 디자인으로 설계될 수 있다. 각 시료 웰은 시료 플레이트의 웰 안으로 향하는 돌출성 엣지를 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 또한, 제한효소 분석 시약 모듈로부터 시료 플레이트으로 시약을 전달하기 위하여 압력 장치에 의해 적용되는 공기 압력의 적용을 필요로 할 수 있다.
진단 장치
기본 시료 보관 장치는 호르몬 농도, 생리적 조건, 사람, 동물 및 식물의 질병을 검출하는데 사용되는 분석 장치로서 변형될 수 있다. 진단 장치는 시료 보관 장치의 상부에 원통형 진단 장치를 배치시킬 수 있다. 진단 장치는 2가지 방식으로 제조할 수 있다: 1) 독립된 제조 공정 및 완전한 장치로서 시료 보관 장치에 첨가하거나, 또는 2) 시료 보관 장치의 각 웰에 독립 유닛들로서 적층한다.
진단 장치는 이 장치 안에 적어도 하나의 특정 항체 또는 특정 진단 시약이 있는 구역을 함유할 수 있다. 시약은 항체-항원 복합체가 형성될 때 육안으로 검출할 수 있는 반응을 생산할 수 있다.
운송 슬리브
운송 슬리브는 생물학적 물질은 안전하게 수송 또는 운송하는데 사용된다. 운송 슬리브는 시료 보관 장치와 정보 저장 매체, 예컨대 생물학적 물질에 관한 정보를 함유하는 컴팩트 디스크(CD)로 구성되어 있다. 운송되어야 하는 물질이 유해하거나 감염성인 경우에는 시료 보관 장치를 밀봉하기 전에 웰을 접착성 필름으로 봉인할 수 있다. 운송 슬리브는 2개의 부분, 즉 바닥부 또는 시료 보관 장치 홀더와 엔클로저(enclosure)를 보유한다. 바닥부는 판지, 플라스틱 또는 발포 재료로 제조될 수 있으며, 여기에는 시료 보관 장치 및 소프트웨어 CD 또는 다른 정보 저장 매체의 정확한 예정 위치가 존재한다. 생물학적 물질의 운송 또는 수송을 위하여, 시료 보관 장치의 웰에 시료를 점적한 다음, 뚜껑을 닫고 자석 뚜껑 덮개로 봉인한다. 시료 보관 장치는 운송 슬리브 바닥부에 강한 끼워맞춤식으로 배치된다. CD가 첨부될 수 있다.
시료 보관 장치 홀더의 크기는 시료 보관 장치의 크기에 따라 결정될 수 있고, 시료 보관 장치보다 작지 않고, 10개의 적층된 시료 보관 장치보다 클 수 있다. 주위 패딩 물질은 적어도 약 5mm의 부가 패딩 및 최고 약 10cm로 구성되는 것이 바람직하다. 시료 보관 장치 홀더는 또한 정보 장치를 고착시키기 위한 공간을 함유한다. 수송 슬리브 안의 정보 장치 홀더의 위치는 정보 장치의 형태에 따라 달라진다. 하나 또는 복수의 CD 또는 메모리카드/메모리 스틱인 경우에는 딱 맞도록 설계한다. 시료 보관 장치 홀더는 판지 또는 발포계와 같은 발포성 물질로 제조하는 것이 바람직하다. 패딩 물질을 비롯한 시료 보관 장치 홀더는 엔클로저로 싸여 있거나, 시료 보관 장치 홀더 주위의 5면 또는 개구 뚜껑을 포함한 총 6면에서부터 시료 보관 장치와 정보 저장 장치를 둘러싼 엔클로저에 통합되어 있다. 시료 보관 장치 홀더가 개구 뚜껑을 포함하는 경우에 뚜껑은 시료 보관 장치 홀더의 한 면에 부착되어, 시료 보관 장치 홀더의 면 중 하나의 면을 덮고 대향 면에 부착하여 수송 슬리브를 확실하게 닫는다. 5면으로 된 시료인 경우에는 보관 장치 홀더를 둘러싸는 덮개의 제6면은 전체 시료 보관 장치 홀더 위로 활주 이동하는 밀봉 박스로 제공된다. 엔클로저는 시료 보관 장치 홀더에 강성을 제공하는 패키지 물질일 수 있다. 주소 표지와 우표를 위한 공간이 수송 슬리브의 외면에 구비된다.
단백질 결정학 모듈
결정학 모듈은 여러 단백질 결정화 용액이 충전되고 탈수되는 웰을 함유한다. 기본 보관 장치는 투명한 플라스틱으로 제조될 수 있고, 각 웰은 pH 약 4.6에서 약 9.4에 이르는 단백질 결정화 조건을 함유한다. 각 웰은 다른 완충액을 함유할 수 있으며, 그 예로는 아세트산염, 인산염, 트리스, 구연산염, HEPES, 이미다졸, 포름산염, 카코딜레이트, MES, 비신(Bicine), 트리스, 구연산염, HEPES, 아세트산염 및 다른 침전성 염, 예컨대 타르타르산염, 인산염, 황산암모늄 및 황산리튬, 염화마그네슘 및 염화칼슘, 마그네슘, 암모늄, 나트륨, 아연 및 칼슘 아세테이트, 구연산나트륨, 포름산 나트륨 및 포름산 마그네슘, 염화마그네슘 및 염화나트륨, 아세트산 나트륨, 수연산나트륨, 포름산암모늄, 황산리튬 및 황산암모늄, 이미다졸, CTAB 및 침전성 유기 용매, 예컨대 MPD, 2-프로판올, 에틸렌 글리콜, 디옥산, 에탄올, 1,6-헥산디올이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, PEG400, 6000, 1000, 8000, 10000 및 20000, PEG MME 550, 2000, 5000 및 2000, Jeff아민 M-600 또는 다른 첨가제, 예컨대 3급-부탄올, 글리세롤, Co2+, Cd2+, Fe3+, Ni2+ 및 Zn2+ 이온, 디옥산, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 웰은 다른 농도의 상기 용액으로 충전될 수 있다. 웰은 이 웰의 벽에 물질을 보유시키면서 탈수된다. 웰은 즉시 사용할 수 있고, 물로 재수화된 다음 단백질이 첨가될 수 있다.
적층 랙
각 시료 보관 유닛은 실온에서 보관되거나 특별하게 설계된 보관 랙에서 냉동될 수 있다. 랙(도면 참조)은 다른 양의 시료 보관 유닛을 보유할 수 있고, 바코드가 분명한 것이 바람직하며, 유닛들은 플라스틱 트랙 위에서 쉽게 활주 이동할 수 있다. 보관 랙은 노출되어 있거나 밀봉 도어를 갖춘 플라스틱 박스에 들어 있을 수 있다.
적층 랙은 플라스틱이나 금속으로 제조될 수 있다. 10개, 25개 또는 50개의 시료 보관 장치를 보유할 수 있다. 시료 보관 장치는 적층 랙의 트랙 위에서 활주 이동한다. 잠금 기구는 판지가 적층 랙에서 떨어지지 않게 한다. 적층 랙은 노출되어 있거나 또는 적층 랙의 앞면에 하나의 힌지식 도어와 보호재로 완전히 싸여 있을 수 있다.
생물학적 재료와 관련된 데이타 보관, 추적 및 수집 시스템
전술한 다양한 양태들의 상기 보관 장치는 생명과학 분야의 시료 보관 및 시료 관리를 통합할 수 있는 다른 기술과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태는 생물학적 시료 보관, 위치, 추적, 처리 및 시료 데이타 관리의 통합을 가능케 한다. 시료에 관한 데이타는 시료 보관 장치와 데이타의 직접적인 물리적 연결을 통해 시료 위치와 연결될 수 있다. 저장된 정보는 다단계 생물학적 연구 프로토콜, 생산 과정, 선별, 생물분석, 환자 이력, 임상 시험 데이타 및 다른 개발 정보의 급원과 함께 시료의 추적과 재고에서 얻은 추가 데이타로 갱신될 수 있다. 시료와 관련된 데이타는 멀티유저, 멀티사이트 환경의 인터페이스화를 가능케하는 보안 계층 소프트웨어 및 네트워크 구성을 통해 전송 및 공유될 수 있다.
이상적으로, 시료에 대한 정보는 연결된 전자 인터페이스, 바람직하게는 무선 주파 식별(RFID) 응답기와 같은 무선 인터페이스에 의해 시료 보관 장치와 통합된다. 과거에는 시료의 식별을 위해 바코드가 사용되었지만, 이 기술은 본 발명에 사용하기에는 부적절한 단점이 있다. 이러한 단점에는 정보 전달을 위해 바코드에 필수적인 직선적인(line-of-sight) 접근, 제한적인 정보 용량 및 먼지, 수분 등과 같은 환경 요인에 의한 방해 등이 있다. 무선 주파 식별 기술은 이러한 단점을 극복한다.
무선 장비를 이용한 원격 통신은 일반적으로 많은 산업에서 이용되는 무선 주파(RF) 기술에 좌우된다. RF 기술의 일 용도는 동물, 재고 및 매개체와 같은 물체의 위치 측정, 식별 및 추적에 관한 것이다. RF 식별 태그 시스템을 개시하는 공보에는 US 6,696,028; 6,380,858; 및 5,315,505가 있다.
RF 식별(RFID) 태그 시스템은 원격 물체의 모니터링을 용이하게 하기 위해 개발되었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 기본 RFID 시스템(10)은 2가지 구성 부재, 송신기 또는 판독기(12) 및 응답기(흔히 RF 태그라 불린다)(14)를 포함한다. 송신기(12) 및 RF 태그(14)는 각각 안테나(16, 18)를 함유한다. 작동 시, 송신기(12)는 안테나(16)를 통해 무선 주파 송신 시그널(20)을 RF 태그(14)의 안테나(18)로 전송한다. 송신 시그널(20)을 수신하고, RF 태그(14)는 진폭 변조된 응답 시그널(22)을 생산하고, 이 시그널은 후방산란으로 알려진 과정에 의해 태그 안테나(18)를 통해 송신기(12)로 역전송된다.
종래의 RF 태그(14)는 태그 안테나(18)와 그라운드 사이에 접속된 MOS 트랜지스터와 같은 스위치(26)와 진폭 변조기(24)를 포함한다. RF 태그(14)가 송신 시그널(20)에 의해 활성화되면 드라이버(도시 안됨)는 RF 태그(14)의 비휘발성 메모리(도시 안됨)에 저장된 정보 코드, 일반적으로 식별 코드에 기초하여 변조 점멸(on/off) 시그널(27)을 발생한다. 변조 시그널(27)은 스위치(26)의 제어 말단에 적용되어 스위치(26)는 교대로 개폐를 유발한다. 스위치(26)가 열리면, 태그 안테나(18)는 송신 시그널(20)의 일부를 응답 시그널(22)의 일부(28)로서 송신기(12)로 역반사한다. 스위치(26)가 닫히면, 송신 시그널(20)은 스위치(26)를 통해 그라운드로 반사됨이 없이 이동하여 응답 시그널(22)의 널 부위(29)를 형성한다. 즉, 송신 시그널(20)은 진폭 변조되어 저장된 정보 코드의 특징인 변조 시그널(27)에 따라 송신 시그널(20)을 교대로 반사 및 흡수하여 응답 시그널(22)을 생산한다. 또한, RF 태그(14)는 스위치(26)가 닫힐 때 송신 시그널이 반사되고 스위치(26)가 열릴 때 그 시그널이 흡수되도록 변형될 수도 있다. 응답 시그널(22)의 수신 시, 송신기(12)는 응답 시그널(22)을 복조하여 응답 시그널에 의해 표현되는 정보 코드를 해독한다. 따라서, 종래의 RFID 시스템은 RF 태그(14)가 RF 반송파 주파수를 변조하는 단일 주파수 진동자에 작용하여 RF 태그(14)가 존재하는 표시를 송신기(12)로 제공한다.
RFID 시스템의 실질적인 장점은 이 기술의 비접촉 비직선적 수행력이다. 송신기(12)는 출력과 사용된 무선 주파에 따라서 범위가 1인치부터 백피트 이상에 이르는 송신 시그널(20)을 방출한다. 태그는 바코드 또는 다른 광학 판독 기술이 소용없는 악취, 흐림, 얼음, 도료, 먼지 및 다른 육안적 및 환경적으로 곤란한 조건과 같은 다양한 물질을 통해 판독될 수 있다. RF 태그는 또한 대부분 100 밀리초 안에 응답하는 놀라운 속도로 판독될 수 있다.
전형적인 RF 태그 시스템(10)은 종종 다수의 RF 태그(14)와 송신기(12)를 함유한다. RF 태그는 주요 3종으로 분류된다. 즉, 광선식 수동 태그, 전지식 반수동 태그 및 능동 태그가 그것이다. 각 태그는 기본적으로 다른 방식으로 작동한다.
광선식 RF 태그는 종종 수동 장치라 불리는데, 그 이유는 작동에 필요한 에너지가 이 태그에 조사된 송신 시그널에서 유래하는 것이기 때문이다. 이 태그는 필드(field)를 정류하여 태그 자체의 반사 특성을 변화시킴으로써 송신기에서 관찰되는 반사율의 변화를 발생시킨다. 전지식 반수동 RF 태그는 유사한 방식으로 작동하며, RF 횡단면적을 델타를 송신기로 반사하도록 변조함으로써 통신 링크를 발생시킨다. 여기서, 전지는 태그 작동 동력의 근원이다. 마지막으로, 능동 RF 태그는 전송기를 사용하여 전지에 의해 공급된 자신의 무선 주파 에너지를 발생시킨다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 시스템은 3부분, 즉 소모성 하드웨어 장치, 재고 및 관리 소프트웨어 및 상기 하드웨어 장치와 소프트웨어 사이의 RFID 인터페이스로 구성된다. 본 명세서에서 제시하는 도 10을 참조하여 보면, 본 발명의 일 양태에 따라 형성된 시스템(100)은 전술한 보관 장치(102), 재고 및 관리 소프트웨어 부재(104), 바람직하게는 컴퓨터 시스템(106)에서 실행되는 소프트웨어 부재 및 상기 보관 장치(102)와 소프트웨어(106)을 연결하는 무선 주파 식별 인터페이스(108)을 포함한다. 바람직하게는, RFID 인터페이스(108)는 보관 장치(102)에 연결된 응답기(100) 및 컴퓨터 실행 시스템(106)에 결합된 송신기(112)를 포함한다.
이러한 양태에 따르면, 응답기(110)는 보관 장치(102)의 외부면에 응답기(110)를 부착시키는 방식 등으로 시료 보관 장치(102)와 연결된다. 하지만, 응답기(110)가 튜브, 플레이트, 랙 또는 심지어 보관 장치(102)가 유지되는 방에 부착되거나 연결될 수도 있음은 너무 당연한 것이다. 하나의 응답기(110)가 하나의 보관 장치(102)에 연결되어야 하는 것이 바람직하지만, 보관 장치(102)에 보관된 특정 시료마다 응답기(110)가 연결되는 것도 가능하다.
연결은 응답기(110)가 보관 장치(102)에 끼워지도록 보관 장치(102) 제조 중이나, 보관 장치(102)를 만든 후 보관 장치(102)에 접착제 부착을 통해 달성할 수 있다. 자성은 다양한 양태들에서 시료 보관 장치(102)에 사용되는 바람직한 연결 기작이므로, 당해 기술분야의 숙련자라면 응답기(110)에 보관된 정보의 우연한 변경 및 응답기(110)와 송신기(112) 사이의 무선 주파 통신의 방해를 방지하기 위하여 적당한 차폐가 필요할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
응답기(110)는 보관 장치(102)와 이 보관 장치(102)에 보관된 시료에 대한 데이타, 예컨대 소유권 정보, 위치 정보, 분석 정보, 생산 과정, 임상 시험 수행, 합성 방법, 시료 수집 및 다른 시료 관리에 중요할 수 있는 당업자에게 공지된 정보가 사전프로그램될 수 있다. 이러한 데이타의 사전프로그램화 외에도, 응답기(110)는 메모리 안의 데이타를 변조 및 갱신할 수 있도록 구성될 수 있다. 또한, 응답기(110)는 데이타의 종류마다 정확한 접속 조건을 지정하여 읽기, 쓰기 및 갱신을 제한하는 보안 구성을 포함할 것이다. 예를 들어, RFID 인터페이스(108) 부재는 특정 컴퓨터 실행 데이타 처리 시스템, 예컨대 이하에 설명되는 소프트웨어 어플리케이션 유래의 제어 시그널을 수신하고, 그 시스템에 대해 응답하도록 구성될 수 있다. 또한, 응답기(110)에 쓰여있는 데이타는 인증 및 보관을 위해 암호화될 수 있다.
RFID 응답기 또는 칩의 사용은 기능 상실 없이 광범위한 온도 범위(-25℃ 내지 +85℃)가 장점이다. 또한, 응답기(110)는 이 응답기(110)에 연결된 물체에 경보를 울리고 위치를 알아내기 위한 가청 음조 발생기 또는 시그널링 빛과 같은 원격 장치의 제어에 활용될 수 있다. 또한, 응답기(110)에 정보 저장은 컴퓨터 실행 시스템(106)의 데이타가 손상되거나 손실되지 않게 하기 위한 추가 백업을 제공한다.
송신기(112)는 컴퓨터 실행 시스템(106)에 결합된 통상적인 무선 주파 식별 판독기이다. 명령 및 제어 시그널은 시스템(106)에 의해 발생되어 하나 이상의 응답기(110)의 송신을 개시하고 이로부터 컴퓨터 실행 시스템(106)이 소프트웨어(104)에 의해서 처리된 응답을 수신하게 한다. 일 구성에 따르면, 응답기(110)는 여기에 보관된 데이타의 교체 또는 갱신을 위하여 송신기(112)로부터의 통신을 통해 재프로그램될 수 있다.
일 실행에 따르면, 하나 또는 그 이상의 송신기(112)는 마이크로파 시그널과 같은 무선 주파 시그널을 통해 응답기(110)와 통신하기에 충분한 거리의 시설에 배치된다. 복수 종류의 응답기(110)를 위해 또는 각 응답기(110)마다 복수의 송신기(112)가 사용될 수 있다. 또는, 공지된 기술을 이용하는 하나의 송신기가 연속 방식이나 동시에 복수의 응답기(110) 또는 복수의 주파수와 통신할 수 있다. 시료 보관 장치(102) 또는 각 시료가 처리되는 용도들에서 콘베이어 시스템이나 운송 시스템, 예컨대 운송 라인 또는 열차 등의 이동 경로를 따라 또는 구조물 내의 다양한 장소에 위치한 복수의 송신기는 시료의 위치와 상태를 추적하는데 사용될 수 있다. 여기에는 표본 또는 보관 장치(102)가 위치해 있는 환경 요인, 예컨대 온도, 습도, 압력 등을 조사하는 것이 포함된다.
따라서, RFID 인터페이스(108)는 생물학적 생산 공정 중이나 실험 단계를 실행하는 동안과 같은 실험실에 위치하여 실험 로봇 등에 의해 조작되는 시료 또는 보관 장치(102)의 이동 및 분석과 관련된 데이타의 모니터 및 처리에까지 확장 사용할 수 있다. 이것은 또한 자동 및 반자동 연구 프로토콜을 통해 생물학적 시료 처리 및 품질 관리를 돕는다.
앞에서 언급한 바와 같이, 시료 보관 및 추적은 시료 보관 장치 상의 RF 응답기와 본 명세서에 기술된 컴퓨터 실행 시스템 사이의 RF 인터페이스를 사용함으로써 시료의 위치를 알아내어 용이하게 수행할 수 있다. 즉, 보관 랙, 보관실, 냉장고, 실험실 진열대, 책상 또는 선반 등의 보관 위치의 태그화 및 모니터링을 통해 실행된다.
특정 보관 장치(102) 또는 시료를 추적하기 위하여 응답기(110)는 자동 시스템이나 사람이 인식할 수 있는 보관 장치의 색 변화, 보관 장치와 연결된 가청 장치, 또는 보관 장치 위에 위치한 명멸 빛과 같은 원격 장치를 작동시켜 시료를 신속히 수집할 수 있도록 구성된다. 또한, 응답기(110)는 온도, 압력 및 습도(이에 국한되지 않는다) 등의 환경 조건이 소정 환경 범위를 초과했을 때 원격 알람을 작동시키도록 구성된다. 일 양태에 따르면, 응답기(110)는 송신 시그널로부터 작동력을 얻어 작동되는 수동 장치이다. 응답기(110)가 원격 장치의 작동이나 통신 범위의 증가를 위해 사용된다면 응답기는 전술한 바와 같이 반능동일 수 있다. 또는, 다량의 데이타가 응답기(110)로부터 읽히거나 쓰여져야 하고 필요한 경우 범위를 증가시켜야 하면 능동 응답기가 사용될 수 있다. 범위는 또한 당업계에 공지된 바와 같이 주파수 영향을 받으며, 당업자라면 환경 및 기능성 대상물에 따라 적당한 주파수 범위를 선택할 수 있을 것이다. 예컨대, 특정 표본은 무선 시그널의 특정 주파수에 민감할 수 있는데, 이러한 경우 시스템(100) 설계 시 그러한 주파수를 없애거나 표본을 적당히 차폐시킬 필요가 있다.
재고 및 관리 소프트웨어(104)는 무선 통신 시스템의 사용과 생명과학 관련 데이타의 처리를 위해 조정된다. 일 양태에 따르면, 이 소프트웨어는 주문제작된 사용자 인터페이스와 소정의 데이타베이스 테이블 세트로 구성된다. 사용자는 시료 관련 데이타를 입력하거나 외부에서 정보를 가져오기 할 수 있다. 소정 테이블은 시스템의 셋업을 용이하게 하기 위해 데이타베이스에 제공되지만, 사용자는 테이블의 범위를 주문제작할 수 있는 옵션을 가질 수 있다. 관계있는 데이타베이스로는 DNA 시료, 클론, 올리고뉴클레오타이드, PCR 단편, cDNA, 화학적 화합물, 단백질, 대사산물, 지질, 세포 분획, 바이러스, 세균 또는 다세포 유기체와 같은 여러 유기체 유래의 생물학적 시료, 혈액, 소변 및 협측 면봉채취물과 같은 환자 시료에 대한 테이블을 포함할 수 있다. 상세한 시료 정보와 시료 관련 데이타는 테이블로 프로그램되어 있다. 시료 정보로는 예컨대 시료 기원, 클론 명칭, 유전자 삽입체 명칭, 삽입체 크기, 삽입체 서열, 변형, 벡터 명칭, 벡터 크기, 항생제 선택성, 유도인자, 종결인자, 클로닝 시역, 5'-태그, 3'-태그, 정제 태그, 올리고뉴클레오타이드 명칭, 정제, 품질관리, 순방향 프라이머, 역방향 프라이머, Tm 값 및 크기 선택 등을 포함할 수 있다. 임상 환자 정보로는 예컨대 연령, 성별, 소재지, 인종 그룹, 체격지수(BMI), 가족력, 약물치료, 증상 개시 데이타, 질병 기간 및 의약 검사 등일 수 있다. 시료 관련 데이타는 DNA 서열분석기, 마이크로어레이 칩 유래의 전사 프로파일링 정보, 웨스턴 블롯팅 또는 동일계내 하이브리드화 유래의 단백질 데이타, 약물 개발을 위한 생물분석 데이타, 고처리량 약물 선별 데이타, 화학적 라이브러리 합성 데이타 등과 같은 다양한 기원에서 얻은 연구 데이타로 구성될 수 있다. 데이타는 텍스트, 수, 테이블 또는 이미지 형태로 제공될 수 있다.
또한, 소프트웨어는 다른 데이타 소스에 링크하여, 공공 도메인, 예컨대 GenBank, SwissProt 및 다른 유사 도메인이나 소유권이 있는 소스의 정보를 통합시킬 수 있다. 이상적인 것은, 소프트웨어가 공정 중의 시료를 추적하는 로봇 장치와 인터페이스할 수 있고, 공정의 추적이 RFID 응답기(110) 중의 기억장치와 같은 데이타베이스 뿐만 아니라 시료 장치 중의 기억장치에 대해서 축적된 시료 이력으로서 현시될 수 있다.
소프트웨어는 로컬 워크스테이션에서 로컬 데이타베이스 포맷으로 처음 저장된 데이타와 정보 세트를 사용자 한사람이 작성하는 정보망을 형성하도록 설계된다. 하지만, 소프트웨어는 계층별 환경에서 다수의 사용자를 링크시킬 수 있다. 한 사용자에 의해 축적된 정보는 서버의 중앙 데이타베이스 시스템에 가장 잘 올릴 수 있다. 또한, 네트워크 환경의 상호작용은 웹 브라우저 인터페이스일 수 있다. 다수 사용자 환경은 다수 사이트 환경으로 확장될 수 있고, 소프트웨어와 데이타베이스는 개인 컴퓨터, 인트라넷의 서버 또는 전자상거래 사이트와 같은 인터넷에 설치될 수 있다. 접속 제어 및 로그(log) 제어 시스템도 상기 소프트웨어에 제공된다.
도 11에 도시한 것은 하나 또는 그 이상의 원격 RFID 태그(122)와 통신하는 하나 또는 그 이상의 송신기(120)와 어플리케이션 프로세서(118)를 인터페이스하는 기업내 정보 통신망(LAN)(116)을 이용하는 컴퓨터 실행 시스템 구성(114)이다. 여기서, 어플리케이션 프로세서(118)는 데이타베이스(124)와 결합되어 있다. LAN 대신에 인터넷과 같은 국제 정보망이 이용될 수 있고, 이러한 경우에 웹 기반 어플리케이션이 활용될 수 있음은 너무 당연한 것이다.
이상적으로, 일 양태에 따르면 재고 및 관리 소프트웨어(104)는 3 부재, 즉 프론트엔드 소프트웨어 부재, 미들웨어 부재 및 백엔드 소프트웨어 부재로 구성된다.
상기 프론트엔드 소프트웨어는 "사용자 인터페이스" 형성에 활용하기 위한 것이다. 이것은 예컨대 웹브라우저 또는 마이크로소프트 엑셀일 수 있다. 웹브라우저 소프트웨어는 웹기반 시스템(100)에 사용될 수 있는 반면, 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어는 데스크탑 시스템에 사용될 수 있다. 웹기반 옵션은 다수 사용자, 네트워킹을 위한 것으로서, 수천명의 사용자까지 늘릴 수 있다. 데스크탑 옵션은 네트워크를 통한 데이타 및 시료 정보의 공유를 기대하지 않는 단독 사용자에게 충분하다.
미들웨어는 PHP와 같은 웹 기반 시스템에 사용하기에 적합한 프로그램밍 언어로 만든 주문형 소프트웨어 또는 데스크탑 옵션으로 사용하기 위해 개발한 마이크로소프트 엑셀 매크로를 포함할 수 있다. 이러한 미들웨어는 사용자 입력 및 질의를 수신하고 공지의 출력, 예컨대 프린터, 디스플레이 또는 가청 출력을 통해 사용자에게 데이타베이스 정보를 보고할 수 있는 프로그램 수집물로 구성된다.
백엔드 소프트웨어는 마이크로소프트 코포레이션에서 제공하고 마이크로소프트 엑셀에서 주관하는 소유권이 있는 데이타베이스 소프트웨어인 마이크로소프트 액세스(Microsoft Access)가 바람직하다. 이러한 특정 프로그램은 최고 50,000개의 기록, 성능 저하의 수준이 증가하면 최대 100,000개까지의 기록을 지원하기에 충분한 데이타베이스 용량을 제공한다. 또다른 옵션은 MySQL로서, 이것은 윈도우즈 및 리눅스 기판을 기반으로 한 것을 비롯하여 모든 주요 서버에서 작동하는, 합작 개발되고 무료로 이용할 수 있는 프리웨어 데이타베이스 소프트웨어이다. 이 데이타베이스는 수백만개의 기록을 취급할 수 있고, 정부 기관 대학 및 다국적 존재와 같은 대형 공공단체 사용자에게 적합할 것이다.
소프트웨어(104)는 RFID 인터페이스(108)에 제어 시그널을 제공하고 그 인터페이스(108)로부터 데이타와 정보를 받도록 구성된다. 또한, 정보가 응답기로 공급되면, 소프트웨어(104)는 당업계에 공지되고 시중에서 입수용이한 방법 및 장치를 사용하여 송신기(112)를 통해 응답기(110)로 데이타 쓰기를 개시하도록 구성되어 있다.
도 12는 데이타베이스(130)가 웹서버(134)를 통해 복수의 데스크탑 컴퓨터(132)에 링크된 또다른 시스템 구조(128)를 도시한 것이다. 서버(134)에 내재된 것은 사용자, 데이타베이스(130) 및 데스크탑 컴퓨터(132)에 내재된 데스크탑 소프트웨어(136) 사이에 통신 계층을 제공하는 소프트웨어이다. 웹브라우저 인터페이스(138)에 의해 사용자는 표준 USB 접속(140)을 통해 RFID 판독기(142)에 접속할 수 있다. 그 다음, 사용자는 RFID 판독기(142)의 읽기 및 쓰기 작업을 제어할 수 있고 무선 주파 통신에 의해 제공되는 무선 접속(146)을 통해 원격 RFID 태그(144)를 제어할 수 있다.
다음으로 도 13은 프론트엔드 웹브라우저(158)가 웹서버(152) 상의 웹서버 미들웨어(156)를 통해 백엔드 데이타베이스(154)에 링크되어 있는 데스크탑 컴퓨터(150)를 구비한 3계층 구조(148)를 이용하는 본 발명의 또다른 양태를 도시한 것이다. 미들웨어는 조사, 수집하고 사용자에게 디스플레이하는 능력이 있다. 더욱 구체적으로, 웹서버(152) 상의 미들웨어 소프트웨어(156)에는 비즈니스 로직이 내장되어 있다. 또한, RFID 판독기(160)는 USB 접속(162)을 통해 고객측 데스크탑 컴퓨터(150) 상의 프로그램(164)에 연결된다(선택적). 고객측 어플리케이션은 판독기(16)를 통해 RFID 태그(166)에 읽고 쓰기하여 웹브라우저(158)로부터 개시된다.
또다른 2계층 배열의 이러한 구조(148)로는, 백엔드의 데이타베이스(154)와 직접 통신하는 데스크탑 컴퓨터(150)의 엑셀 프론트엔드 프로그램이 있다. 여기서 비즈니스 로직은 엑셀 매크로 프로그램에 내재되어 있다. 이 방법은 복사, 드래그 다운 등과 같은 엑셀 기능을 이용하여 데이타베이스에 데이타(예컨대, 플레이트의 각 웰에 대응하는 96줄의 데이타)를 로딩하는데 특히 효과적이다.
또다른 대안적 2계층 배열의 구조(148)에서는 프론트엔드에 있는 자립형 고객 어플리케이션(170)은 백엔드에 있는 데이타베이스(154)와 직접 통신한다. 비즈니스 로직은 자립형 고객 어플리케이션에 내재해 있고, RFID 태그(166)에 읽기 및 쓰기를 위한 모듈도 상기 어플리케이션(170)에 내재할 수 있다. 여기서, 장점은 어플리케이션이 컴파일러형(소스 코드가 보이지 않는다)이고 제3자 소프트웨어(엑셀, 웹서버)를 필요로 하지 않는다는 점이다. 단점은 전술한 3계층 구조만큼 호환성 네트워크가 아니라는 점이다.
다음 실시예는 예시하기 위한 것으로서, 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
생물학적 시료 보관 장치의 매트릭스 제조
본 실시예는 용해성 매트릭스 물질을 사용하여 생물학적 시료 보관 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 예로 보관되는 생물학적 물질에 따라 매트릭스는 다른 보관 완충액을 이용하여 제조했다. 본 실시예에서 사용된 모든 시약은 다른 언급이 없는 한 시그마(St.Louis, MO)에서 입수했다. 핵산의 건조 보관에는 1% 폴리비닐 알콜(PVA, Sigma no. P8136) 기본 보관 매트릭스의 제조를 위해 20mM 트리스(pH 6.5)를 사용했다. 중합체는 0.1% 내지 10%(v/w) 범위의 농도로 하여 시험했다. 매트릭스의 pH는 pH 5 내지 8의 범위에서 시험했다. 편리한 생물학적 시료의 검출을 위해 페놀 레드를 0.0002%(w/v)의 농도로 액체 매트릭스에 첨가했다.
액체 형태의 매트릭스는 96웰 플레이트의 시료 웰에 첨가하고 진공 챔버 중의 진공 하에서 또는 표준 압력 하에서 실온에서 완전하게 건조했다. 50㎕ 부피의 매트릭스의 건조 시간은 하룻밤이고 진공 하에서는 더 짧은 건조 시간이 필요했다. 이로써 생물학적 물질의 보관을 위한 플레이트 준비를 완료했다.
추가 보관 첨가제, 예컨대 EDTA, NaCl, MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, MgSO4, CaCl2, Zn-아세테이트, Na-아세테이트, 시스테인, 디티오트레이톨(DTT, Cleland 시약), 아세트산칼륨, 트리스-아세테이트, 아세트산마그네슘, KPO4, 글리세롤, 트리톤 X-100®, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 아지화나트륨, 프로테아제 억제제(PMSF, 아미노에틸벤젠설포닐 플루오라이드, 펩스타틴, E64, 베스타틴, 류펩틴, 아프로티닌), 2-머캅토에탄올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 소 혈청 알부민(BSA), 니코틴 아데닌 디뉴 클레오타이드(NAD), ATP 중 하나 또는 그 이상은 검사되는 생물활성에 따라서 재수화후 안정화 및 활성화를 위해 보관 매트릭스에 직접 첨가할 수 있다. 효소와 같은 생물학적 활성과 관련 있는 생물학적 물질인 경우, 반응 조건은 보관 매트릭스에서 직접 조정될 수 있다. 몇몇 경우에 활성 반응 전에 재수화를 위해 첨가되어야 하는 유일한 물질은 물이다. 매트릭스는 또한 항균제 및/또는 항진균제와 같은 하나 또는 그 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 매트릭스는 각 보관 웰에 매트릭스를 분할하기 전에 멸균 여과 또는 오토클레이브를 통해 멸균할 수 있다. 오토클레이브된 매트릭스는 단일 튜브 또는 다중웰 플레이트 중 어느 한 보관 웰에, 96웰 플레이트의 경우 웰당 10 내지 100㎕의 액량으로 분할 적용한다.
실시예 2
핵산의 건조 보관
생물학적 시료 보관 장치는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 일반적인 분자생물학 재료와 방법은 문헌에 기술된 바와 같이 사용했다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel et al., 1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA). 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, 1kB 래더(ladder) 형태의 DNA 단편, PCR 산물, 게놈 DNA(고양이 및 사람) 및 RNA에 대하여 안정성 검사를 수행했다. 복원율 및 안정성 검사는 겔 기반 분석, PCR 분석 및 형질전환율 분석을 통해 실시했다.
A. 플라스미드 보관
이차증류수(ddH2O) 1㎕당 10ng 농도의 원형 플라스미드(puc19)(New England Biolabs Inc., Beverly, MA) 총 50ng을 96웰 폴리프로필렌 플레이트의 각 웰에 건조된 용해성 매트릭스 위에 점적했다. 이 시료를 건조하고 실온에서 보관했다. 대조용 플라스미드는 -20℃ 동결기에서 액체 형태로 보관했다. 복원을 위해 50㎕의 ddH2O를 건조 시료 웰에 첨가했다. 시료는 15분 동안 재수화하고, 10㎕ 분취량을 DH5-알파 컴피턴트 세균 세포의 형질전환에 사용했다. 형질전환된 세포를 LB 한천 플레이트 배지에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 항온배양했다. 각 플레이트 상의 세포를 계수했다. DNA 복원율은 대조용 DNA(-20℃에 보관된 puc19 10ng)의 형질전환을 기초로 하여 계산했다. DNA 복원율은 8개월간 보관한 후 5% PVA 매트릭스에서는 50%를 넘었다. 1% PVA 매트릭스는 1개월 시점에서 검사한 결과 복원율이 동결기 보관된 DNA와 동등하거나 그 이상의 복원율이었다.
장기 보관 후의 형질감염률은 5% PVA 매트릭스에서는 복원율이 60%이고 1% 매트릭스에서는 100%이어서 안정적이었다. 6개월 보관 후에 관찰되는 복원율의 감소는 없었다. 5% PVA는 완전하게 용액화되지 않았다.
재수화된 시료를 PCR 분석한 결과 기술된 조건 하에서 시료의 안정성이 지속적인 것을 확인했다. puc19 플라스미드의 480bp 스트레치를 증폭시키는 2개의 PCR 프라이머(순방향 및 역방향)를 설계했다. 재수화된 시료 5ng을 대조용 플라스미드 5ng과 비교하여 증폭 반응에 사용했다. PCR 반응은 비포화 조건 하에서 낮은 사이클 수만큼 수행했다. 8개월 후 건조 보관된 물질은 증폭 효율의 상실을 검출할 수 없을 만큼 증폭할 수 있었다.
B. 올리고뉴클레오타이드 보관
puc19 증폭용 올리고뉴클레오타이드 2개(PCR 프라이머 순방향 및 역방향)를 96웰 플레이트의 각 웰에 존재하는 1% PVA 건조 보관 매트릭스 위에 각각 총 농도가 10μM 및 20μM인 10㎕의 부피를 점적했다. 이러한 올리고뉴클레오타이드를 실온에서 하룻밤 동안 건조하고, 플레이트를 실온에서 보관했다. 대조용 올리고뉴클레오타이드는 -20℃ 동결기에서 액체 형태로 보관했다.
복원을 위해, 두 올리고뉴클레오타이드(PCR 프라이머)를 함유하는 웰을 1x PCR 완충액, puc19 플라스미드 5ng 및 dNTP를 함유하는 PCR 시약을 15분 동안 사용하여 재수화시켰다. 재수화된 반응 혼합물을 PCR 튜브로 옮기고 Taq 폴리머라제를 첨가했다. 반응은 25회 순환 반복한 후, 1% 아가로스 겔에서 전기영동 분석했다.
겔 분석 결과, 예상 크기의 PCR 산물이 증폭된 것을 확인했다. 대조용과 비교 시, 액체 보관된 프라이머에 비해 동량의 증폭을 달성하기 위하여 2배량의 프라이머가 필요했다. 1% PVA 매트릭스로부터의 복원율은 액체 보관된 대조군보다 낮았다. 복원율은 매트릭스에 PVA 농도의 감소를 통해 향상되었다.
C. DNA 단편 보관
1kb DNA 래더 (Invitrogen)(0.5㎍) 크기 표준물 형태의 DNA 단편을 페놀 레드 또는 다른 착색제와 50% 글리세롤을 함유하는 DNA 적재 완충액의 존재 하에 1% PVA 기반 건조 보관 매트릭스 위에 점적했다. 각 웰에 DNA 래더와 염료 10㎕를 점적했고, 이 부피는 전기영동 아가로스 겔의 한 웰에서 래드의 가시화에 사용한 새 DNA 래더의 부피와 동량인 것이다. 적재 염료와 DNA 단편은 하룻밤동안 탈수시키고 실온에서 보관했다.
복원을 위해, 1kB DNA 래더 크기 표준물 및 적재 완충액과 함께 세포를 ddH2O 10㎕로 재수화했다. 재수화 시간은 전기영동 겔에 1kB 래더 10㎕를 적재하기 전 각각 5분 및 10분이었다.
분석을 위해, -20℃에서 적재 완충액의 존재 하에 액체 형태로 보관된 대조용 래더 10㎕를 5분 및 10분 재수화된 건조 보관된 크기 표준물과 에티디움 브로마이드 염색을 이용한 형광 강도로서 비교했다. 다른 크기의 DNA 밴드들은 형광 강도의 차이가 전혀 관찰되지 않았다. 실온에서 건조 보관에 의한 DNA 분해가 관찰된 밴드는 없었다.
D. 게놈 DNA 보관
a) 고양이 게놈 DNA
고양이 총 게놈 DNA 20ng을 TE(pH 8) 완충액 10㎕에 용해시킨 용액 전량을 96웰 플레이트의 웰마다 5% PVA 기반 건조 보관 매트릭스 위에 점적했다. 이 게놈 DNA를 하룻밤동안 건조하고 실온에서 보관했다. 대조용 DNA는 -20℃에서 동결 보관했다.
복원을 위해, 고양이 게놈 DNA를 함유하는 웰을, 1x PCR 완충액, 10μM농도의 2가지 고양이 특이적 프라이머 및 dNTP를 함유하는 PCR 시약으로 15분 동안 재수화시켰다. 상기 프라이머들은 고양이 DNA 600bp 단편을 증폭시켰다. 재수화된 반 응 혼합물을 PCR 튜브로 옮기고 Taq 폴리머라제를 첨가했다. 반응을 35회 순환 반복하고 1% 아가로스 겔에서 분석했다.
PCR 분석은 건조 보관 후 1주 및 3.5개월 후에 실시했다. 어떠한 시점에서도 예상 크기의 DNA 단편이 동결 보관된 게놈 DNA에 비해 증폭률의 감소 없이 증폭되었다.
b) 사람 게놈 DNA
사람의 총 게놈 DNA 20ng을 TE(pH 8) 완충액 10㎕에 용해시킨 용액 전량을 96웰 플레이트의 웰마다 1% PVA 기반 건조 보관 매트릭스 위에 점적했다. 이 게놈 DNA를 하룻밤동안 건조하고 실온에서 보관했다. 대조용 DNA는 -20℃에서 동결 보관했다.
사람 게놈 DNA를 함유하는 웰을, 1x PCR 완충액, 10μM 농도의 2가지 사람 성장 인자 13(hFGF13) 특이적 프라이머 및 dNTP를 함유하는 PCR 시약으로 15분 동안 재수화시켰다. 재수화된 반응 혼합물을 PCR 튜브로 옮기고 Taq 폴리머라제를 첨가했다. 반응을 35회 순환 반복하고 1% 아가로스 겔에서 분석했다.
PCR 분석은 건조 보관 후 1개월 후에 실시했다. 예상 크기의 사람 성장 인자 유전자 단편이 동결 보관된 게놈 DNA에 비해 증폭률의 감소 없이 증폭되었다.
실시예 3
단백질의 건조 보관
생물학적 시료 보관 장치는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 본 실시예는 주위온도에서 단백질의 건조 보관이 활성의 완전한 복원을 통해, 액체 시료로 서 동결된 단백질의 보관에 비해 막대한 장점을 제공한다는 것을 보여준다.
여러 가지 시쿼나제, 열안정성 폴리머라제, 제한효소, 리가제, 프로테아제에 대하여 안정성 및 활성 검사를 수행하여 용해성 매트릭스의 보호 성질을 확인했다. 단백질의 안정성 및 활성 분자로의 복원은 전술한 장기간 용해성 매트릭스를 사용하여 달성했다. 매트릭스는 TRIS pH5-8, pH 지시제로서 페놀 레드 및 1% PVA의 존재 하에서 제조했다. 매트릭스는 탈수로 고형화하고 단백질은 액체 형태의 트레할로스(Fluka, cat. no. 90210) 또는 발리다마이신 A(연구 Products International Corp., catalog no. V21020)가 존재 또는 부재 하에 건조된 매트릭스 위에 점적했다. 단백질 용액 중의 물은 PCA를 수화 및 용해시켰다. 단백질 혼합물은 용해된 매트릭스에 침지시키고 주위온도에서 건조했다. 발리다마이신 A는 생물학적 물질에 0.5 내지 10% w/v의 농도로 첨가했다. 발리다마이신 A의 존재 하에 생물학적 시료의 혼합물은 용해성 PVA 시료 매트릭스에 적용했다.
실시예 4
용해성 PVA 매트릭스를 이용한 단백질의 장기 보관
본 실시예는 앞의 실시예들에서 기술한 바와 같이 제조한 용해성 PVA 매트릭스에서 장기 건조 보관한 후의 활성 단백질의 복원에 대한 것이다.
A. 폴리머라제
1) SEQUENASE™ -- Sequenase™(USB, 오하이오 클리브랜드)는 일반적으로 -20℃에서 보관되며, 반복적인 동결 해동을 통해 동결기에서 시간이 경과함에 따라 활성을 상실하여 서열분석 반응의 판독 길이 및 품질이 저하되었다. Sequenase™는 최종 농도 5%의 트레할로스 또는 발리다마이신 A가 존재하는 1x 서열분석 완충액에서 용해성 매트릭스에 적용했다. USB Sequenase™ Version 2.0, DNA 서열분석 키트(산물 번호 70770)를 공급자의 프로토콜에 따라 사용했다. 96웰 플레이트의 웰당 농도는 한 서열분석 반응에 사용된 동결 보관된 Sequenase™의 농도와 동일했다. 대조용 Sequenase™은 -20℃ 냉동기에서 통상적으로 보관했다. 복원을 위해 전체 웰을 1x 서열분석 완충액 20㎕로 5 내지 45분 동안 수화시켰다.
활성 분석을 위해 서열분석 반응은 S35 표지를 사용하여 준비하고 반응물을 아크릴아미드 서열분석 겔에서 전기영동시켰다. 동결 및 건조 보관된 시쿼나제의 서열은 서열 래더를 판독하여 비교했다. 두 서열은 동일한 판독 특성을 나타냈다.
2) TAQ 폴리머라제 -- PCR 반응의 Taq 폴리머라제는 -20℃에서 보관하고, 반복된 동결 해동을 통해 시간이 경과함에 따라 활성이 상실되어 낮은 증폭률을 나타냈다. Taq 폴리머라제(5U/웰)는 최종 농도 5%의 트레할로스 또는 발리다마이신 A가 존재하는 1x PCR 완충액 중에서 용해성 매트릭스에 적용했다. 96웰 플레이트의 웰당 농도는 한 PCR 반응에 사용된 동결 보관된 Taq 폴리머라제의 농도와 동일했다. 대조용 Taq 폴리머라제는 -20℃ 냉동기에서 통상적으로 보관했다. 복원을 위해 전체 웰을 1x PCR 완충액 20㎕로 5 내지 45분 동안 수화시켰다.
활성 분석을 위해 PCR 반응은 표준 PCR 프로토콜에 따라 실시하고 PCR 산물은 아가로스 겔에서 전기영동했다. 동결 및 건조 보관된 폴리머라제의 PCR 산물은 육안 조사하여 비교했다. 두 PCR 산물은 동일한 강도를 나타냈다.
3) DEEP VENT™ 고정확성(HIGH FIDELITY) 폴리머라제(New England Biolabs Inc., 매사츄세츠 비버리)-- PCR 반응용 Deep Vent™ 폴리머라제는 드라이아이스 상에서 운반하고 -20℃에 보관한다. 수송의 일련의 냉동이 중단되면 효소는 활성을 상실한다. 이러한 단백질은 반복된 동결 해동을 통해 경시적으로 활성을 상실하여 효소 활성이 저하되었다. 완전 활성의 Deep Vent™ 폴리머라제를 최종 농도 5%의 발리다마이신 A가 존재하는 1x PCR 완충액 중에서 용해성 PVA 매트릭스에 적용했다. 96웰 플레이트의 웰당 농도(웰당 5U)는 한 PCR 반응에 사용된 동결 보관된 Deep Vent™ 폴리머라제의 농도와 동일했다. 대조용 Deep Vent™ 폴리머라제는 -20℃ 냉동기에서 보관했다. 전체 웰을 1x PCR 완충액 20㎕로 5 내지 45분 동안 수화시켰다. PCR 반응은 표준 PCR 프로토콜에 따라 실시하고 PCR 산물은 아가로스 겔에서 전기영동했다. 도 14에 도시한 바와 같이, 동결 및 건조 보관된 서쿼나제의 PCR 산물은 육안 조사로 비교했다. 두 PCR 산물은 동일한 에티디움 브로마이드 강도를 나타냈다. 재수화 시간 5분 대 60분 사이의 정량적 차이는 검측할 수 없었다.
B. 제한 효소
HindIII은 최종 농도 5%의 트레할로스 또는 발리다마이신 A를 함유하는 1x 분해 완충액 중에서 용해성 매트릭스에 20U 및 40U/웰씩 점적했다. 96웰 플레이트의 웰당 농도는 한 PCR 반응에 사용된 동결 보관된 Taq 폴리머라제의 농도와 동일했다. 대조용 HindIII은 -20℃ 냉동기에서 통상적으로 보관했다. 전체 웰은 1x 제한효소 완충액 20㎕로 5 내지 45분 동안 수화했다. puc19 플라스미드 1㎍을 재수화된 제한 효소로 분해하고, 분해된 플라스미드를 아가로스 겔 전기영동했다. 동결된 HindIII 및 건조 보관된 HindIII의 DNA 밴드 패턴은 미분해 플라스미드와 육안 조사로 비교했다. 동결 및 건조 보관된 효소는 동등한 활성을 나타냈다.
C. BIG DYE™ 주기 서열분석 -- 주기 서열분석에 유용한 ABI Big Dye™(Applied Biosystems Inc., 캘리포니아 포스터 시티) 효소는 반복된 동결 해동 과정 후 경시적으로 활성을 상실했고, 그 결과 서열분석 반응의 판독 길이 및 판독의 특성이 저하되었다.
사용하지 않은 적당히 보관한 활성 Big Dye™(ABI)를 최종 5%의 트레할로스(Fluka #90210) 존재하에 1x 반응 완충액에서 용해성 PVA 매트릭스에 적용했다. Big Dye™ 효소가 플라스미드 및 서열분석 프라이머의 존재 하에 활성 상실 없이 탈수될 수 있는지를 검사하기 위하여 Big Dye™을 M13 정배향 프라이머 및 puc19의 존재 하에 점적했다. 96웰 플레이트의 웰당 농도는 한 서열분석 반응에 사용한 동결 보관된 Sequenase™(USB)의 농도와 동등했다. 대조용 Sequenase™는 -20℃ 냉동기에서 통상적으로 보관했다. 전체 웰은 1x 제한효소 완충액 20㎕로 30분 동안 수화했다. PCR 반응은 공급자의 권장에 따라 35회 동안 실시했다. 순환 서열분석 반응의 PCR 산물을 정제하고 ABI 모세관 서열분석 기구를 사용하여 제조자의 지시에 따라 분석했다. 플라스미드 및 서열분석 프라이머의 존재 및 부재 하에 건조된 Big Dye™뿐만 아니라 동결되고 건조 보관된 Big Dye™의 서열을 Mac 벡터 서열 분석 프로그램을 사용하여 비교했다. 서열 특성은 처음 700개 염기에서 동일했다. 도 15에 도시한 바와 같이 건조된 Big Dye 시약을 사용한 경우 더 오랜 판독이 수행되었다.
D. 프로테아제
프로테아제는 주요 약물 표적이다. 현재, 프로테아제는 HIV와 같은 바이러스 질환에 대한 신규 약물을 개발하기 위한 소분자 선별에 사용되고 있다. 프로테아제 분석은 종종 수행하기가 곤란한데, 그 이유는 프로테아제 활성이 각 분석 전에 보관된 프로테아제의 기본 활성을 조정해야만 하는 까다로운 효소 반응이기 때문이다. 반응의 동역학은 각 동결 해동 후 프로테아제 활성의 변화를 기초로 하여 달라진다. 본 실시예는 용해성 매트릭스의 존재 하에 건조된 프로테아제가 활성 상실로부터 보호되고 활성 프로필의 변화 없이 재수화 후 활성화될 수 있고, 그 결과 소분자 선별 프로젝트와 같은 임의의 효소 사용 시 막대한 시간 절감을 이룩할 수 있는지를 입증하기 위한 것이다.
1) HIV 프로테아제 -- HIV 프로테아제를 최종 농도 2.5 내지 10%(w/v)의 트레할로스 또는 발리다마이신 A를 함유하는 활성 완충액(0.5M MES, 25% 글리세롤, 1M NaCl, pH5.25)의 존재 하에 용해성 PVA 매트릭스로 예비처리한 96웰 플레이트의 웰당 25nM 농도로 점적했다. 대조군으로서 HIV 프로테아제를 PVA 매트릭스의 존재 없이 트레할로스 또는 발리다마이신의 존재 하에 폴리프로필렌 플레이트의 웰에 점적했다. 건조된 HIV 프로테아제는 150mM 구아니딘 염산염을 함유하는 1x 활성 완충액에서 복원시켰다. 완전한 복원은 재수화 후 1시간 후에 이루어졌다. 그 다음, 효소 반응 활성은 FRET 분석에서 20분 시간 경과 중에 두 형광 분자를 함유하는 형광원성 펩타이드를 이용한 동역학 연구로 실시했다. 반응물은 Packard Fusion 마이크로타이터 플레이트 형광분석계를 제조자의 지침에 따라 사용하여 분석했다.
용해성 PVA 매트릭스의 부재 하에 트레할로스 또는 발리다마이신 A 만이 점적된 HIV 프로테아제를 사용한 경우 효소 활성은 전혀 복원되지 않았다. 이에 반해, 트레할로스 존재 하에 PVA 매트릭스 상에 점적된 효소를 이용한 HIV 프로테아제는 활성이 100% 복원되었고, 추가 안정제 없이 용해성 매트릭스(PVA)만 사용하여 건조한 효소에서는 70%의 활성이 복원되었다.
2) FIV 프로테아제 -- FIV(고양이 면역결핍 바이러스)는 HIV와 근연성이 있는 렌티바이러스이다. FIV 프로테아제를 건조 용해성 매트릭스가 펩타이드계 억제제, TL-3(Lee et al., 1998 PNAS 95: 939)의 존재 및 부재 하에 웰당 0.5㎍ 농도로 사전처리된 웰에 점적했다. 이러한 매트릭스, 프로테아제 및 억제제 TL-3을 함유하는 웰을 완전히 건조하고 실온에서 보관했다. 건조된 HIV 프로테아제는 150mM 구아니딘 염산염의 존재 하에 1x 활성 완충액에서 1시간 동안 재수화했다. 그 다음, 효소 반응 활성은 FRET 분석에서 20분 시간 경과 중에 두 형광 분자를 함유하는 형광원성 펩타이드를 이용한 동역학 연구로 실시했다. 반응물은 Packard Fusion 마이크로타이터 플레이트 형광분석계를 제조자의 지침에 따라 사용하여 분석했다. FIV 프로테아제 활성은 재수화 과정 후 완전 복원되었고, 효소 활성은 TL-3에 의해 차단되어, 주위온도에서 건조 보관 후 프로테아제와 그 억제제가 완전히 활성 복원되었음을 입증했다.
또한, 트레할로스와 발리다마이신은 주위온도에서 프로테아제를 용해성 보관 매트릭스에서 장기간 건조 매트릭스 보관하는 동안 효소 활성이 보호되는지에 대한 프로테아제 분석에서 FIV 프로테아제에 미치는 영향에 대하여 전술한 바와 같이 비 교했다. 어떠한 첨가제도 효소를 보호 안정화시켰고 효소 보호에 대한 검출가능한 차이는 없었다(도 17).
E. 리가제 -- 웰당 T4 DNA 리가제(New England Biolabs, 매사츄세츠 비버리, #M0202L)(400U)를 최종 농도 5%의 발리다마이신 A의 존재 하에 1x 결찰 완충액 중에서 전술한 바와 같이 제조한 용해성 PVA 매트릭스에 적용했다. 대조용 리가제는 -20℃ 냉동기에서 보관했다. 전체 웰은 1x 결찰 완충액 20㎕로 5 내지 45분 동안 수화시켰다. SaII 분해되고 소 장 포스파타제로 탈인산화된 puc19 플라스미드 50ng을 동결 보관된 리가제와 나란히 재수화된 리가제로 하룻밤 동안 결찰시켰다. 결찰 반응물 절반으로 DH5알파 컴피턴트 세균 세포를 형질전환시켰다. 이 세포를 LB 한천 형판에 배양하고 형질전환율을 콜로니 계수로 분석했다. 재결찰된 플라스미드만이 이러한 조건에서 콜로니를 형성할 수 있었다. 건조 보관된 리가제는 동결 보관된 리가제보다 5배 높은 콜로니 수를 제공했다.
F. 재구성성 HIV 프로테아제 분석 -- 현재 HIV 프로테아제 분석은 해동된 효소 활성의 사전검사를 위하여 프로테아제 해동, 활성 완충액에 재현탁, 그 완충액 시스템에 형광원성 기질의 재현탁, 용액의 혼합 및 특정 형광성 96웰 플레이트 위에 혼합물의 적용을 필요로 한다. 프로테아제 활성 측정 후, 억제성 화합물을 선별하기 위한 분석을 개시할 수 있고 일반적으로 96웰 포맷에서 수행한다. 전술한 피펫팅 단계를 수반한 동일한 절차가 반복되어야 한다. 본 실시예는 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 공급된 프로테아제가 건조 형태로 용해성 매트릭스에 사용됨으로써 HIV 프로테아제 활성이 건조 상태에서 안정적으로 유지되기 때문에 사전검사 를 수행할 필요가 없음을 보여주는 것이다.
전술한 바와 같이 제조한 용해성 PVA 매트릭스를 사용하여 HIV 프로테아제 및 FIV 프로테아제를 점적하고 적당한 반응 농도의 각 활성 완충액에서 건조했다. 형광원성 프로테아제 기질 및 프로테아제 억제제를 함유하는 음성 대조군 웰 또한 각각의 완충액에서 96웰 플레이트에 건조 형태로 공급했다. 선별 작업자는 프로테아제 함유 웰의 재수화를 위해 물만을 첨가하거나 또는 검사 억제제 선별 화합물을 함유한 물을 첨가하고 형광 기질 웰에는 물을 첨가했다. 따라서, 재수화 시 일부 FIV 프로테아제 웰은 전술한 TL-3 억제제를 함유했다. 분석의 취급 시간은 10배 이상 줄었고, 대표적인 결과는 도 18에 제시했다. 이와 유사한 시간 절감은 다른 생화학적 분석, 선별 또는 실험 프로토콜에서도 수득될 수 있다.
실시예 5
용해성 PVA 매트릭스를 이용한 세포의 장기 보관
본 실시예는 용해성 매트릭스 물질에서 에스케리치아 콜리 세포를 장기간 주위온도 건조 보관한 예를 설명한 것이다.
에스케리치아 콜리(DH5 알파) 세균의 동일한 수를 LB 증식 배지에 재현탁하고 96웰 플레이트의 웰에 다음과 같은 조건 하에 점적했다: a) 증식 배지에 용해성 매트릭스 없이, b) 건조된 용해성 PVA 매트릭스와 함께, c) 5% 발리다마이신 A와 혼합하고 건조된 용해성 매트릭스에 점적했다. 플레이트를 하룻밤 동안 건조하고 주위온도에서 보관했다. 3가지 다른 조건의 웰을 증식 배지로 1시간 동안 수화시키고 웰의 내용물을 세균 배양 LB 플레이트 위에 도말했다. 플레이트를 37℃에서 하 룻밤 동안 항온배양했다. 에스케리치아 콜리 복원율은 도 19에 도시한 바와 같이 세균 콜로니의 계수를 통해 분석했다.
또한, 용해성 매트릭스는 기타 세균, 식물, 동물 또는 사람 세포 등의 다양한 세포의 건조 장기 보관을 위해, 그리고 파지, 바이러스(예, 렌티바이러스, 바큘로바이러스 등)의 건조 보관을 위해 제조하고 사용할 수 있다.
본 발명의 건조 매트릭스 보관 조성물 및 방법의 구체예들은 본 명세서에 제시된 바와 같이 항체, RNA, 효소 및 다른 생물학적 시료들에도 사용될 수 있을 것이다.
실시예 6
가열 유도된 스트레스하에서 건조 보관 후 DNA 복원
당해 실시예는 다양한 건조 보관 매트릭스 조성물의 보호 효과를 나타내는 승온에서 DNA의 건조 보관을 기재한다.
실험의 제1 그룹에서, 건조 보관 매트릭스를 20㎕의 1% PVA 용액을 스폿팅하고 밤새 건조시켜 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 개별적인 건조된 매트릭스에 단일 안정화제(1% w/v)의 상이한 용액을 적용하고, 매트릭스를 다시 밤새 건조시켰다. 상이한 매트릭스에 사용된 안정화제(제조원: SigmaAldrich, Fluka and Research Products Int'l.)는 다음과 같다: β-락토스, D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트, β-겐티오비오스, 트레할로스, 엑토인, 미오-이노시톨, D-락토스 일수화물, 하이드록시엑토인, 말티톨, 마그네슘 D-글루코네이트 하이드레이트, 수크로스, D-말토스, 2-케토-D-글루콘산 헤미칼슘 염 수화물, D(+)-멜레지토스, 및 칼슘 락토비오네이트 일수화물. 대조 매트릭스는 안정화제를 함유하지 않는 액체 비히클을 수용한다.
수성 용액 중 플라스미드 DNA(500ng)를 건조된 매트릭스에 스폿팅하고, 이어서 공기 건조하였다. 이어서, 건조된 DNA 시료를 함유하는 매트릭스를 70℃에서 3일 동안 온도조절되는 오븐에 위치시켜 가열-유도된 스트레스를 적용하였다. 이어서, 매트릭스를 오븐에서 제거하고, 개별적인 시료를 수화로 16㎕ 물 중에 복원하고, 이어서, 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 겔의 대조 레인(lane)은 가열-유도된 스트레스가 적용되는 대신 4℃에서 유지되는 DNA 시료를 함유한다. 개방 순환(open circular)(oc) DNA 및 수퍼코일된(supercoiled)(sc) DNA에 상응하는 개개의 DNA 밴드는 자외선 조사하에 염색된 에티디움 브로마이드에 의해 가시화된다.
가열-유도된 스트레스 이후에, oc 및 sc DNA 밴드의 10% 미만의 대조(4℃ 보관) 수준은 건조 매트릭스 상에서 안정화제의 부재하에 보관되는 시료에서 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화될 수 있다. 엑토인 또는 말티톨을 안정화제로서 함유하는 매트릭스 상 건조 보관 동안 가열-유도된 스트레스가 적용되는 시료에서, 명백한 에티디움 브로마이드 염색의 강도는 대조 (4℃ 보관) 레인에서 나타난 것의 약 50-70%이다. 안정화제로서 β-락토스, D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트, β-겐티오비오스, 트레할로스, 미오-이노시톨, D-락토스 일수화물, 하이드록시엑토인, 마그네슘 D-글루코네이트 하이드레이트, 수크로스, D-말토스, 2-케토-D-글루콘산 헤미칼슘 염 수화물, D(+)-멜레지토스, 또는 칼슘 락토비오네이트 일수화물의 하나를 함유하는 매트릭스 상에서 건조 보관 되는 동안 가열-유도된 스트레스가 적용되는 시료에서, 명백한 에티디움 브로마이드 염색의 강도는 대조 (4℃ 보관) 레인에서 나타난 것의 약 80% 이상이다.
제2 시험 그룹에서, PVA 이외에 매트릭스 물질을 사용하였다. 건조 보관 매트릭스를 상기한 마이크로퓨지 관에서 제조하고, 단, PVA 대신에, 매트릭스를 다음의 각 하나의 1% 용액으로부터 제조하였다: 카복시메틸 셀룰로스 (CMC, SigmaAldrich, 분자량 5,000-40,000 Da); 2-하이드록시에틸 셀룰로스 ((C2H602)x, SigmaAldrich, 분자량 30,000-48,000 Da); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), ([-N(COC2H5)CHCH2-]n, VWR, West Chester, PA, 분자량 5,000-80,000 Da); 및 폴리비닐 피롤리돈 (PVP, SigmaAldrich, 분자량 15,000-35,000).
1㎍의 플라스미드 DNA를 각각의 건조된 매트릭스로 스폿팅하고, 밤새 공기-건조시켰다. 이어서, 관을 상기한 열 유도 스트레스를 검정하기 위해 70℃로 항온처리하고, 3일 후 70℃에서 관을 제거하고, 건조 매트릭스를 16㎕의 물로 수화하였다. 이어서, 재수화된 시료를 에티디움 브로마이드 염색된 아가로스 겔(0.8%)에서 70℃ 대신에 4℃에서 유지되는 대조 DNA 시료와 함께 전기영동시킨다. 모든 4개의 매트릭스 물질, CMC, PVP, 2-하이드록시에틸 셀룰로스, 및 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)에 있어서, 손상되지 않은 oc 및 sc DNA 밴드의 명백한 에티디움 브로마이드 염색으로 평가되는 바와 같이, 70℃ 가열-스트레스 DNA의 복원은 70℃ 대신에 4℃에서 유지되는 대조 DNA 시료의 복원율을 초과했다.
이상, 본 발명의 구체적 양태들은 예시하기 위한 목적으로 본 명세서에서 설명되었지만 다양한 변형이 본 발명의 취지와 범위 안에서 이루어질 수 있음은 자명한 것이다. 따라서, 본 발명은 후속되는 청구의 범위를 제외하고는 제한되지 아니한다.

Claims (69)

  1. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하고,
    여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니고,
    여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  2. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 2개 이상의 안정화제를 포함하고,
    여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니고,
    여기서, 2개 이상의 안정화제 중 하나가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  3. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질;
    (b) 하나 이상의 안정화제; 및
    (c) 하나 이상의 생물학적 시료를 포함하고,
    여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아니고,
    여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  4. (a) 폴리비닐 알콜을 포함하는, 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  5. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 트레할라스 억제제를 포함하는 하나 이상의 안정화제를 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  6. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 하나 이상 및 2개 이하의 안정화제를 포함하고,
    여기서, 안정화제는 트레할로스, 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아닌, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  7. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 하나 이상의 안정화제를 포함하고,
    여기서, 하나 이상의 안정화제는
    (i) 트레할라스 억제제,
    (ii) 키티나제 억제제,
    (iii) α-글리코시다제 억제제,
    (iv) 글리코겐 포스포릴라제 억제제,
    (vi) 뉴라미니다제 억제제,
    (vi) 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제, 및
    (vii) 리소좀 글리코시다제 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글리코시다제 억제제를 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  8. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 트레할라스 억제제가 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 매트릭스.
  9. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 물질이 용매에 용해 되는 매트릭스.
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 안정화제가 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 억제제를 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  11. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 용매가 생체적합성 용매를 포함하는 매트릭스.
  12. 제11항에 있어서, 매트릭스 물질이 생체적합성 용매에 용해되는 매트릭스.
  13. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 물질이 폴리비닐 알콜을 포함하는 매트릭스.
  14. 제13항에 있어서, 약 0.1% 내지 약 10%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조되는 매트릭스.
  15. 제13항에 있어서, 약 0.5% 내지 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조되는 매트릭스.
  16. 제13항에 있어서, 약 1% 내지 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조되는 매트릭스.
  17. 제13항에 있어서, 약 0.5% 내지 약 1.5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액으로부터 건조되는 매트릭스.
  18. 제13항에 있어서,
    (i) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액,
    (ii) 약 3%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액,
    (iii) 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜을 포함하는 용액,
    (iv) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 5%(중량/용적) 트레할로스를 포함하는 용액,
    (v) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 5%(중량/용적) 발리다마이신을 포함하는 용액, 및
    (vi) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜, 약 5%(중량/용적) 트레할로스 및 약 5%(중량/용적) 발리다마이신을 포함하는 용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액으로부터 건조되는 매트릭스.
  19. 제13항에 있어서,
    (i) 약 1%(중량/용적) 내지 약 5%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 5%(중량/ 용적)의 트레할라스 억제제를 포함하는 용액,
    (ii) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜 및 약 1% 내지 약 10%(중량/용적)의 트레할라스 억제제를 포함하는 용액, 및
    (iii) 약 1%(중량/용적) 폴리비닐 알콜, 약 5%(중량/용적) 트레할로스 및 약 5%(중량/용적)의 트레할라스 억제제를 포함하는 용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액으로부터 건조되는 매트릭스.
  20. 제19항에 있어서, 트레할라스 억제제가 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 매트릭스.
  21. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 물질이 폴리에틸렌 글리콜, 아가로스, 폴리-N-비닐아세트아미드, 카복시메틸 셀룰로스, 2-하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리비닐피롤리돈, 폴리(4-비닐피리딘), 폴리페닐렌 옥사이드, 가교된 아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 카본 나노튜브, 폴리락타이드, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 하이드록시메타크릴레이트 공중합체, 칼슘 펙티네이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 석시네이트, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알우론산, 글루쿠론산, 트롬보스폰딘-1 N-말단 헤파린-결합 도메인, 피브로넥틴, 펩타이드/수용성 중합체 변형제 접합체 및 콜라겐으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포 함하는 매트릭스.
  22. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 존재하는 하나 이상의 안정화제가 트레할라스 억제제를 포함하는 매트릭스.
  23. 제22항에 있어서, 트레할라스 억제제가 발리다마이신을 포함하는 매트릭스.
  24. 제22항에 있어서, 트레할라스 억제제가 수이다트레스틴, 발리다마이신 A, 발리독실아민 A, MDL 26537, 트레하졸린, 살보스타틴 및 카수아린-6-O-α-D-글루코피라노시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 매트릭스.
  25. 제3항에 있어서, 생물학적 시료가
    (i) DNA, RNA, 단백질, 폴리펩타이드, 지질, 당포합체(glyconconjugate), 올리고삭카라이드, 및 폴리삭카라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분리된 생체분자, 및
    (ii) 포유동물의 세포, 세균, 효모세포, 바이러스, 백신, 혈액, 소변, 생물학적 유체, 및 구강 면봉채취물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물학적 물질 중 하나 이상을 포함하는 매트릭스.
  26. (a) 폴리비닐 알콜을 포함하는, 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및
    (b) 트레할로스를 포함하는 제1 안정화제; 및
    (c) 발리다마이신 A를 포함하는 제2 안정화제를 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  27. 제1항 내지 제7항 또는 제26항에 있어서, 목적하는 pH를 유지할 수 있는 완충제를 추가로 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  28. 제27항에 있어서, 완충제가 Tris, 시트레이트, 아세테이트, 인산염, 붕산염, HEPES, MES, MOPS, PIPES, 탄산염 및 중탄산염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 매트릭스.
  29. 제10항에 있어서, 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제가 발리다마이신 A, TL-3, 나트륨 오르토바나데이트, 불화나트륨, N-α-토실-Phe-클로로메틸케톤, N-α-토실-Lys-클로로메틸케톤, 아프로티닌, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 디이소프로필플루오로-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스.
  30. 제10항에 있어서, 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제가 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 카스파제 억제제, 그랜자임 억제제, 세포 부착 억제제, 세포 분열 억제제, 세포 주기 억제제, 지질 시그널링 억제제 및 프로테아제 억제제로 이 루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스.
  31. 제10항에 있어서, 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제가 환원제, 알킬화제 및 항미생물제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스.
  32. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 물질이 하이드록시엑토인 및 폴리스티렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 매트릭스.
  33. 제1항 내지 제7항 또는 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 검출성 지시제를 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  34. 제33항에 있어서, 검출성 지시제가 비색 지시제를 포함하는 매트릭스.
  35. 제33항에 있어서, 검출성 지시제가 하나 또는 다수의 GCMS 태그 화합물을 포함하는 매트릭스.
  36. 제33항에 있어서, 검출성 지시제가 형광 지시제, 발광 지시제, 인광 지시제, 방사분석 지시제, 염료, 효소, 효소의 기질, 에너지 전달 분자, 및 친화성 표지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스.
  37. 제33항에 있어서, 검출성 지시제가 아민, 알콜, 알데하이드, 물, 티올, 설파이드, 니트라이트, 아비딘, 비오틴, 면역글로불린, 올리고삭카라이드, 핵산, 폴리펩타이드, 효소, 세포골격 단백질, 반응성 산소 종, 금속 이온, pH, Na+, K+, Cl-, 시아나이드, 포스페이트 및 셀레늄 중 하나 이상의 존재를 검출가능하게 나타낼 수 있는 매트릭스.
  38. 제33항에 있어서, 검출성 지시제가 페놀 레드, 에티디움 브로마이드, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제, 코발트 클로라이드, 레이챠드(Reichardt) 염료 및 형광원성 프로테아제 기질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 매트릭스.
  39. 제1항 내지 제7항 또는 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 시료를 냉동하지 않고 건조 보관할 수 있는 매트릭스 물질.
  40. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 중합체를 포함하는 하나 이상의 매트릭스 물질; 및
    (b) 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨 또는 키토산이 아닌 하나 이상의 안정화제를 포함하고,
    여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경 우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하고,
    여기서,
    (I) (a)의 매트릭스 물질은 공유결합으로 자가-조립되지 않고, 다음의 구조를 갖고:
    -[-X-]n-
    여기서, X는 CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, 치환된 -CH2CH(OH)-, -CH2CH(COOH)-, 치환된 -CH2CH(COOH)-, -CH=CH2, -CH=CH-, C1-C24 알킬 또는 치환된 알킬, C2-24 알케닐 또는 치환된 알케닐, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 또는 이의 랜덤 또는 블록 공중합체이고;
    n은 약 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, 또는 1501-3000의 값을 갖는 정수이고;
    (II) 안정화제는 중합체에 공유결합되지 않고, 트레할로스, 트레할라스 억제제, 또는 화학식 (i)-(xv)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 포함하는 화합물을 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
    Figure 112008047676800-PCT00018
    여기서, R은 -H, -OH, -CH2OH, -NHAc 및 -OAc로부터 선택된다.
  41. 제40항에 있어서, 중합체가 하나의 또는 다수의 수소결합을 형성하여 비-공유결합으로 자가-조립될 수 있는 매트릭스.
  42. 제40항에 있어서, 중합체가 하나 이상의 안정화제로 하나 이상의 수소결합을 형성할 수 있는 매트릭스.
  43. 제40항에 있어서, 중합체가 핵산 분자 및 폴리펩타이드 중 하나 이상과 하나 이상의 수소결합을 형성할 수 있는 매트릭스.
  44. 제40항에 있어서, 매트릭스 물질이 폴리비닐 알콜, 카복시메틸 셀룰로스, 2-하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루 어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중합체를 포함하는 매트릭스.
  45. 제40항에 있어서, 하나 이상의 안정화제가 D-(+)-라피노스, β-겐티오비오스, 트레할로스, 엑토인, 미오-이노시톨, 하이드록시엑토인, 마그네슘 D-글루코네이트, 2-케토-D-글루콘산 헤미칼슘 염 수화물, D(+)-멜레지토스 및 칼슘 락토비오네이트 일수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 매트릭스.
  46. (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하는 매트릭스로서 이때, 안정화제가 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 생물학적 시료와 접촉시키고,
    이에 따라 당해 생물학적 시료를 보관함을 포함하는, 생물학적 시료를 보관하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 접촉 단계 이후에 매트릭스를 냉동하지 않고 유지함을 포함하는 방법.
  48. (a) (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 이때, 안정화제가 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 여기서, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스를 생물학적 시료와 접촉시키고,
    (b) 매트릭스를 건조시키고, 이에 따라 당해 생물학적 시료를 보관함을 포함하는, 생물학적 시료의 보관 방법.
  49. 제48항에 있어서, 접촉 및 건조 단계 이후에 매트릭스를 냉동하지 않고 유지함을 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 유지 단계 이후의 시료의 생물학적 활성이 접촉 단계 이전의 시료의 생물학적 활성과 실질적으로 동일한 방법.
  51. 제49항에 있어서, 생물학적 시료의 변성이, 냉동하지 않고 매트릭스 물질의 부재하에 유지되는 대조군 생물학적 시료의 변성과 비교하여 감소되는 방법.
  52. 제48항에 있어서, 접촉 단계가 매트릭스 물질을 용매에 동시에 용해 또는 해리함을 포함하는 방법.
  53. 제48항에 있어서, 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리한 후 접촉 단계가 진행되는 방법.
  54. 제48항에 있어서, 접촉 단계 이후 매트릭스 물질을 용매에 용해 또는 해리가 수행되는 방법.
  55. (a) 매트릭스를 생물학적 시료 보관 장치의 하나 또는 다수의 시료 웰에 투여하고, 여기서, (1) 생물학적 시료 보관 장치는 (i) 뚜껑, 및 (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 다수의 시료 웰을 포함하는 시료 플레이트를 포함하고, (2) 매트릭스는 (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질; 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 여기서, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하고;
    (b) 하나 이상의 시료 웰을 건조시키고, 이에 따라 생물학적 시료 보관 장치를 제조함을 포함하는, 하나 또는 다수의 생물학적 시료를 위한 생물학적 시료 보관 장치를 제조하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 투여 단계가 매트릭스 물질 및 용매를 함유하는 액체 용액 또는 액체 현탁액을 투여함을 포함하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 하나 이상의 웰이 하나 이상의 검출성 지시제를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 검출성 지시제가 비색 지시제를 포함하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 검출성 지시제가 하나 또는 다수의 GCMS 태그 화합물을 포함하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, 검출성 지시제가 형광 지시제, 발광 지시제, 인광 지시제, 방사분석 지시제, 염료, 효소, 효소의 기질, 에너지 전달 분자, 및 친화성 표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  61. 제57항에 있어서, 검출성 지시제가 아민, 알콜, 알데하이드, 물, 티올, 설파이드, 니트라이트, 아비딘, 비오틴, 면역글로불린, 올리고삭카라이드, 핵산, 폴리펩타이드, 효소, 세포골격 단백질, 반응성 산소 종, 금속 이온, pH, Na+, K+, Cl-, 시아나이드, 포스페이트 및 셀레늄 중 하나 이상의 존재를 검출 가능하게 지시할 수 있는 방법.
  62. 제57항에 있어서, 검출성 지시제가 페놀 레드, 에티디움 브로마이드, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제, 코발트 클로라이드, 레이챠드 염료 및 형광원성 프로테아제 기질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  63. 제55항에 있어서, 하나 이상의 웰이 생물학적 억제제 또는 생화학적 억제제인 하나 이상의 안정화제를 포함하는 방법.
  64. (a) 동시에 또는 연속적으로 및 임의의 순서로, 생물학적 시료 보관 장치내에서 하나 또는 다수의 생물학적 시료를 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스와 접촉시키고, 여기서, (1) 생물학적 시료 보관 장치는 (i) 뚜껑, 및 (ii) 생물학적 시료를 함유할 수 있는 하나 또는 다수의 시료 웰을 포함하는 시료 플레이트를 포함하고, 이때 하나 이상의 웰은 매트릭스를 포함하고, (2) 매트릭스는 (i) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질, 및 (ii) 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 이때, 안정화제는 락티톨, 락토스, 말토스, 말티톨, 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 셀로비오스, 이노시톨, 또는 키토산이 아니고, 하나 이상의 안정화제가 트레할로스인 제1 안정화제를 포함하는 경우, 트레할라스 억제제가 또한 제2 안정화제로서 존재하고;
    (b) 하나 이상의 시료 웰을 건조시키고;
    (c) 접촉 및 건조 단계에 후속적으로 생물학적 시료 보관 장치를 냉동하지 않고 유지시키고;
    (d) 생물학적 시료를 제2 용매 중 재현탁 또는 재용해시키고, 이로부터 보관된 생물학적 시료를 복원하는 것을 포함하는, 보관된 생물학적 시료를 복원하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 유지 단계 이후의 시료의 생물학적 활성이 접촉 단계 이전의 시료의 생물학적 활성과 실질적으로 동일한 방법.
  66. 제64항에 있어서, 제2 용매가 (i) 제1 용매와 동일한 용매 및 (ii) 제1 용매와 상이한 용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  67. 제64항에 있어서, 제1 용매 및 제2 용매 중 하나 이상이 활성 완충제인 방법.
  68. (a) 용매에 용해 또는 해리되는 매트릭스 물질;
    (b) 하나 이상의 안정화제; 및
    (c) 시료 처리 조성물을 포함하는, 생물학적 시료의 실질적인 건조 보관용 매트릭스.
  69. 제68항에 있어서, 시료 처리 조성물이 활성 완충제, 세포 용해 완충제, 유리 라디칼 포획제, 시료 변성제 및 병원균-중화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조 성물을 포함하는 매트릭스.
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