KR20240045328A - 헥소스 유도체, 그의 제제 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
하기 식에서,
R1은 -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH이고;
R2는 -OH, -N3, 또는 -N(H)C(=O)CH3 이거나;
R1 및 R2는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 하기 화합물을 형성하되, R3은 -H, -CH3, -CH2C(=O)OH, 또는 -CH2OH이고;
X는 -H, -CH3, -CH2OH, 또는 CH2C(=O)OH이고;
n은 0 또는 1이다.
하기 식에서,
R1은 -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH이고;
R2는 -OH, -N3, 또는 -N(H)C(=O)CH3 이거나;
R1 및 R2는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 하기 화합물을 형성하되, R3은 -H, -CH3, -CH2C(=O)OH, 또는 -CH2OH이고;
X는 -H, -CH3, -CH2OH, 또는 CH2C(=O)OH이고;
n은 0 또는 1이다.
Description
본원은, 본원에서 그 내용이 참고문헌으로 인용된 것으로, 2014년 3월 14일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/953,392 호를 우선권으로 주장한다.
본원 전반에 걸쳐서, 삽입 어구에 인용된 것을 비롯하여, 다양한 출판물이 인용된다. 삽입 어구에 인용된 출판물에 대한 전체 인용은, 본 명세서의 끝이면서 특허청구범위 바로 앞에 알파벳 순서로 나열됨을 발견할 수도 있다. 그의 전체에서 모든 인용된 출판물의 개시내용은, 본원에서 참고문헌으로서 본원에 도입되어서, 본 발명이 속하는 분야의 상태를 보다 충분히 기술한다.
양립 용질로 지칭되는 것으로, 낮은 분자량의 유기 화합물은 많은 호염성 또는 내염성 유기체의 세포질에서 확인되어 왔는데, 이는 외부 매질의 삼투압의 균형을 잡아주고, 올바른 단백질 접힘을 촉진하고 단백질 응집을 억제하고 열-유도된 변성을 방지한다(패리아(Faria) 2008, 패리아 2013). 따라서, 양립 용질은, 예를 들어 약학 및 화장품 제형에서 단백질을 안정화시키기 위한 것과 같이, 산업적으로 유용하다(룰리-고들(Luley-Goedl 2011), 렌첸(Lentzen) 2006).
양립 용질은 일반적으로 아미노산, 탄수화물, 폴리올, 베타인과 에크토인이다. 트레할로스, 글리세롤, 글리신-베타인, 및 에크토인은 정형적으로 중온균의 전형적인 양립 용질이다. 극도의 호열성 세균 및 고호열성 세균 유기체의 발견은, 부가적인 양립 용질, 예를 들어 만노실글리세레이트(MG) 및 다이미오-이노시톨-1,3'-포스페이트로 이어졌다(패리아 2008).
MG, 즉 (2S)-2-(1-O-α-D-만노피라노실) 프로피오네이트(ML), 2-(1-O-α-D-만노피라노실) 아세테이트(MGlyc), 1-O-(2-글리세릴)-α-D-만노피라노시드(MGOH)와 구조적으로 관련된 화합물이 합성되었고 열 스트레스에 대해 모델 단백질을 안정화시키는 이들의 능력에 대해 시험하였다(패리아 2008).
생물학적 물질의 안정화를 위한 신규한 화합물이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제공한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
R1은 -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH이고;
R2는 -OH, -N3, 또는 -N(H)C(=O)CH3 이거나;
R1 및 R2는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 을 형성하되, R3은 -H, -CH3, -CH2C(=O)OH, 또는 -CH2OH이고;
X는 -H, -CH3, -CH2OH, 또는 CH2C(=O)OH이고;
n은 0 또는 1이고;
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH3이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 H이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH2OH이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH2OH이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이다.
본 발명은, 추가로 하나 이상의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염, 및 생물학적 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은, 하나 이상의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을, 생물학적 물질을 함유하는 용액에 첨가하여 안정화된 용액을 형성함을 포함하는, 생물학적 물질의 안정화 방법을 제공한다.
본 발명은, 추가로 생물학적 물질을 안정화시키기 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제공한다.
본 발명은, 추가로 생물학적 물질을 안정화시키기 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염의 용도를 제공한다.
도 1은, 0.5M의 상이한 용질의 존재하에서, 말레이트 탈수소효소(MDH, 회색 바), 포도상구균 (staphylococcal)의 뉴클레아제(SNase, 흑색 바) 및 라이소자임(백색 바)의 융점(TM)의 증가분을 도시한다. 용질의 부재하에서의 융점(TM)은, MDH의 경우 50℃이고, SNase의 경우 52 ℃이고, 라이소자임의 경우 71℃였다.
도 2는, 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 글루코스 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에서는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 3은 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 갈락토스 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 4는 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 락테이트 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 5는 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 말레이트 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점 증가분을 도시한다.
도 6은 AcOK 단독일 때, 상이한 하이퍼용질(hypersolute)(0.5M)과 함께일 때, AcOK의 농도에 대한 안정화 효과의 의존성을 도시한다.
도 7은 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 갈락토실 글리세레이트 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 8은 용질의 농도에 대한 SNase의 융점의 의존성을 도시한다.
도 9는 용질의 농도에 대한 MDH의 융점의 의존성을 도시한다.
도 10은 용질의 농도에 대한 라이소자임 융점의 의존성을 도시한다.
도 11은 0.1 및 0.25 M에서 상이한 용질에 대해 수득된 돼지 인술린의 융점의 증가분을 도시한다. 각각의 용질에 대해, 좌측 바는 0.25M에서의 결과를 나타내고 우측 바는 0.1 M에서의 결과를 나타낸다.
도 2는, 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 글루코스 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에서는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 3은 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 갈락토스 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 4는 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 락테이트 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 5는 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 말레이트 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점 증가분을 도시한다.
도 6은 AcOK 단독일 때, 상이한 하이퍼용질(hypersolute)(0.5M)과 함께일 때, AcOK의 농도에 대한 안정화 효과의 의존성을 도시한다.
도 7은 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임의 열 변성에 대한 상이한 갈락토실 글리세레이트 유도체의 안정화 효과를 도시한다. 가로축에는 0.5M의 몇몇 화합물에 의해 유도된 MDH의 융점의 증가분을, 세로축에서는 SNase(속이 찬 도형) 및 라이소자임(속이 빈 도형)의 융점의 증가분을 도시한다.
도 8은 용질의 농도에 대한 SNase의 융점의 의존성을 도시한다.
도 9는 용질의 농도에 대한 MDH의 융점의 의존성을 도시한다.
도 10은 용질의 농도에 대한 라이소자임 융점의 의존성을 도시한다.
도 11은 0.1 및 0.25 M에서 상이한 용질에 대해 수득된 돼지 인술린의 융점의 증가분을 도시한다. 각각의 용질에 대해, 좌측 바는 0.25M에서의 결과를 나타내고 우측 바는 0.1 M에서의 결과를 나타낸다.
하기 약어가 본원 전반에 걸쳐서 사용된다.
Ac: 아세테이트
BnBr: 벤질 브로마이드
DIP: 다이-미오(myo)-이노시톨 포스페이트
DGP: 다이-글리세롤 포스페이트
DMAP: 4-다이메틸아미노피리딘
DMF: 다이메틸폼아마이드
DSF: 시차 주사 형광측정법
Et: 에틸
Et2O: 다이에틸 에테르
EtOAc: 에틸 아세테이트
GG: α-D-글루코실-D-글리세레이트
GGG: α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→2)-D-글리세레이트
GL: α-D-글루코실-S-락테이트
Hex: 헥산
MDH: 말레이트 탈수소효소
Me: 메틸
MeOH: 메탄올
MG: α-D-만노실-D-글리세레이트
MGA: α-D-만노실-D-글리세라이드
MGG: α-D-만노피라노실-(1→2)-α-D-글루코피라노실-(1->2)-D-글리세레이트
MGly: α-D-만노실-글리콜레이트
MGGly:(2R)-2-(1-O-α-D-만노피라노실)-3-(1-O-α-D-글루코피라노실)-글리세레이트
ML: α-D-만노실-S-락테이트
NaOMe: 나트륨 메톡사이드
NIS: N-요오도숙신이미드
NMR: 핵 자기 공명
Ph: 페닐
TLC: 박층 크로마토그래피
SNase: 포도상구균의 뉴클레아제
TBAF: 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드
TBDPSCl: 3급-부틸클로로다이페닐실란
TBDMS: 3급-부틸다이메틸실란
TfOH: 트리플루오로메탄설폰산
THF: 테트라하이드로푸란
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제공한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
R1은 -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH이고;
R2는 -OH, -N3, 또는 -N(H)C(=O)CH3 이거나;
R1 및 R2는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 을 형성하되, R3은 -H, -CH3, -CH2C(=O)OH, 또는 -CH2OH이고;
X는 -H, -CH3, -CH2OH, 또는 CH2C(=O)OH이고;
n은 0 또는 1이고;
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH3이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 H이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH2OH이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH2OH이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이다.
실시양태에서, 상기 화합물은
또는 그의 염이 아니다.
실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 천연-발생 화합물이 아니다.
실시양태에서, 상기 화합물은
또는 그의 염이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 또는 그의 염이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 또는 그의 염이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 또는 그의 염이다.
실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염의 α/β 아노머 비는 1:1 내지 99:1이다. 실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염의 α/β 아노머 비는 1:1 내지 10:1이다. 실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염의 α/β 아노머 비는 1:1 내지 5:1이다. 또다른 실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염의 α/β 아노머 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1이다. 실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염의 α/β 아노머 비는 10:1 초과이다. 실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염의 α/β 아노머 비는 99:1 초과이다. 실시양태에서, 상기 화합물 또는 그의 염은 α-아노머이다.
실시양태에서, R1은
이다.
실시양태에서, R1은
이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, R1은 이다.
실시양태에서, 비대칭 중심이 R1 안에 있는 경우, 상기 화합물은 2개의 에난티오머의 혼합물이다.
실시양태에서, 비대칭 중심이 R1 안에 있는 경우, 상기 화합물은 S 에난티오머이다.
실시양태에서, 비대칭 중심이 R1 안에 있는 경우, 상기 화합물은 R 에난티오머이다.
실시양태에서, R2는 -OH이다.
실시양태에서, R2는 N3이다.
실시양태에서, R2는 -N(H)C(=O)CH3이다.
실시양태에서, R1 및 R2는, 이들이 결합된 탄소 원자와 함께, 를 형성한다.
실시양태에서, R1 및 R2는, 이들이 결합된 탄소 원자와 함께, 를 형성한다.
실시양태에서, R1 및 R2는, 이들이 결합된 탄소 원자와 함께, 를 형성한다.
실시양태에서, R3은 -H이다.
실시양태에서, R3은 -CH3이다.
실시양태에서, R3은 -CH2C(=O)OH이다.
실시양태에서, R3은 -CH2OH이다.
실시양태에서, 화합물은
또는 그의 염이다.
실시양태에서, 화합물은 이전의 실시양태의 임의의 하나의 화합물 또는 그의 염이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 염의 형태이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 칼륨 염의 형태이다.
실시양태에서, 상기 화합물은 나트륨 염의 형태이다.
본 발명은, 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 그의 염, 및 생물학적 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
실시양태에서, 상기 조성물은 액체이다. 실시양태에서, 상기 조성물은 고체이다. 실시양태에서, 상기 조성물은 동결 건조되어 있다. 실시양태에서, 상기 조성물은 냉동-건조되어 있다.
실시양태에서, 상기 조성물은 액체이고 본 발명의 하나 이상의 화합물은 0.01 M 내지 1 M의 농도로 상기 조성물에 존재한다. 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 0.1 M 내지 0.5 M의 농도로 상기 조성물에 존재한다. 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 0.01 M 내지 1 M의 농도로 존재한다. 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 조성물에 0.1 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.4 M, 또는 0.5 M의 농도로 존재한다.
실시양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 액체 조성물을 건조함으로써 제조된 고체이다.
실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 본 발명의 화합물에 추가로 하나 이상의 기타 양립 용질을 포함한다. 하나 이상의 기타 양립 용질은, 예를 들어, 당업계에 공지된 하나 이상의 기타 양립 용질일 수 있다. 하나 이상의 기타 양립 용질 및/또는 하나 초과의 본 발명의 화합물을 갖는 조성물에서, 생물학적 물질을 안정화시키기 위해서 필요한 기타 양립 용질의 양 및/또는 본 발명의 각각의 화합물의 양은, 생물학적 물질 단독을 안정화시키기 위해 필요한 각각의 시약의 양 미만일 수도 있다.
실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 본 발명의 화합물에 추가로, 하나 이상의 염을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 하나 이상의 부가적인 염은 약학적으로 허용가능한 염이다. 실시양태에서, 하나 이상의 염은 칼륨 아세테이트를 포함한다.
실시양태에서, 상기 조성물은, 약학 조성물, 화장품 또는 식제품이다.
실시양태에서, 생물학적 물질은 핵산, 폴리펩티드, 전세포, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 세포막, 세포 성분, 리포좀, 조직, 또는 이들 중 임의의 것의 혼합물이다. 실시양태에서, 생물학적 물질은 하나, 2종, 3종 또는 그 이상의 종의 생물학적 물질을 포함한다.
실시양태에서, 생물학적 물질은 하나 이상의 종의 핵산이다. 실시양태에서, 핵산은 RNA, DNA, 또는 RNA와 DNA의 혼합물이다. 실시양태에서, RNA는 단일 가닥 RNA이다. 실시양태에서, RNA는 이중 가닥이다. 실시양태에서, RNA는 mRNA이다. 실시양태에서, RNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 실시양태에서, DNA는 이중 가닥이다. 실시양태에서, DNA는 단일 가닥이다.
실시양태에서, 생물학적 물질은 전세포의 하나 이상의 종이다.
실시양태에서, 생물학적 물질은 폴리펩티드이다.
실시양태에서, 상기 폴리펩티드는, 효소, 항체, 혈장 단백질 또는 호르몬이다.
실시양태에서, 폴리펩티드는 인슐린, 말레이트 탈수소효소, 포도상구균의 뉴클레아제 또는 라이소자임이다. 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 인슐린이다.
실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 효모 또는 포유동물 세포 배양액 중에서 단리된다.
실시양태에서, 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드가 아니다. 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 식물, 동물, 균류 또는 박테리아 중에서 단리된다. 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 동물 또는 인간 혈청 폴리펩티드이다.
실시양태에서, 상기 조성물은 추가로 완충제를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 그의 염을, 생물학적 물질을 포함하는 용액에 첨가하여 안정화된 용액을 형성함을 포함하는, 생물학적 물질의 안정화 방법을 제공한다.
실시양태에서, 상기 방법은 안정화된 용액을 건조시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태에서, 상기 건조 단계는 분사-건조 또는 동결건조이다.
실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 그의 염은 안정화될 생물학적 물질의 특성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 생물학적 물질이 단백질이면, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물들의 조합이, 단백질 표면의 친수성도 및/또는 친유성도에 따라 선택될 수도 있다.
본 발명은 또한, 생물학적 물질을 안정화시키기 위해 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 제공한다.
본 발명은 또한, 생물학적 물질을 안정화시키기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 염의 용도를 제공한다.
실시양태에서, 안정화는 변성으로부터 생물학적 물질을 보호하는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 생물학적 물질의 융점을 높이는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 건조(dessication)로부터 생물학적 물질을 보호하는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 응집으로부터 생물학적 물질을 보호하는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 열로부터 생물학적 물질을 보호하는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 냉동으로부터 생물학적 물질을 보호하는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 건조 동안 생물학적 물질을 보호하는 것이다. 실시양태에서, 안정화는 생물학적 물질의 유통-기한을 증가시키는 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
실시양태에서, 상기 진단 키트는 마이크로어레이, 바이오센서, 또는 효소 제제이다. 실시양태에서, 상기 마이크로어레이, 바이오센서, 또는 효소 제제는 부동화된 생물학적 물질을 포함한다. 본 발명의 양립 용질은, 부동화된 생물학적 물질을 사용하는 기법의 성능을 양립 용질이 개선시키게 만드는, 당업계에 공지된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, PCT 국제특허 공개공보 제 WO/2007/097653 호를 참고한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물 또는 그의 염, 및 인간 또는 동물로의 국소 투여에 적합한 부형제를 포함하는, 화장품 또는 기타 피부과 조성물을 제공한다.
실시양태에서, 상기 화장품 또는 피부과 조성물은 하나 이상의 생물학적 물질을 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 화합물이 표 6 또는 7에 열거된 임의의 화합물 또는 이들의 염인, 전술한 바와 같은, 화합물, 조성물, 방법 및 용도를 제공한다. 예를 들어, 이 발명은 표 6 및 7에 열거된 하나 이상의 화합물 및 생물학적 물질을 포함하는, 생물학적 물질을 안정화시키는 조성물을 제공한다. 또다른 예로서, 본 발명은, 표 6 및 7에 열거된 하나 이상의 화합물 또는 그의 염을, 생물학적 물질을 함유하는 용액에 첨가하여 안정화된 용액을 형성함을 포함하는, 생물학적 물질의 안정화 방법을 제공한다.
본원에 기술된 구체적인 실시양태 및 실시예는 예시적인 것이며, 첨부된 특허청구범위의 범주로부터 또는 개시내용의 진의로부터 벗어나지 않으면서 이러한 실시양태 및 실시예에 많은 변형을 도입할 수 있다. 상이한 예시적인 실시양태 및/또는 실시예의 구성요소 및/또는 특징부는, 이러한 개시내용 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에서 서로 조합될 수 있고/있거나 다른 것으로 치환될 수도 있다.
본 발명의 화합물에 적용가능하거나 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 것으로 본원에거 기술된 실시양태 각각은, 상기 화합물의 염에도 동등하게 적용가능하다.
전술한 실시양태의 경우, 본원에 개시된 각각의 실시양태는, 다른 개시된 실시양태 각각에 적용가능한 것으로 고려된다.
본원에 개시된 임의의 범위에 의해, 상기 범위 내에서 모든 1/10 및 정수 단위량이 본 발명의 일부로서 구체적으로 개시된 것을 의미한다. 따라서, 0.1 M 내지 0.5 M은, 본 발명의 범위 내에서 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 및 0.5 M인 실시양태를 의미한다.
본 발명은, 뒤따르는 실시예를 참고하여 잘 이해될 것이며, 상기 실시예는, 청구 대상을 이해하는 것을 보조하는 것으로 설명되지만, 이후에 뒤따르는 특허청구범위를 어떠한 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니고 이렇게 의도되는 것은 아님이 이해되어야만 한다.
실시예 1: 신규한 양립 용질의 합성
증가된 단백질 안정화 특성을 갖는 신규한 유기 화합물을 확인하기 위해서 당 유도체에 기초한 화학물질 목록을 준비하였다. 상이한 헥소스, 예를 들어 글루코스, 갈락토스, 만노스 및 글루코사민을 사용함으로써, 및 글리코실화 반응 동안 상이한 글리코실 억셉터를 사용함으로써, 유사체 구조물의 다양성을 도입하였다.
안정화 효과에 대한 당 구조물의 기여를 평가하기 위해서, 만노시드 및 글루코시드 외에 갈락토스 및 글루코사민 유사체를 합성하였다. 우리의 지식으로, 단지 하나의 갈락토스-함유 양립 용질은 극호열균으로부터 단리되고, 하기 β-갈락토피라노실-5-하이드록실리신(GalHI)은 초호열성 고세균 (Thermococcus litoralis)으로부터 단리되었다:
글루타메이트, 프롤린 및 글루타민과 같은 몇몇의 아미노산은, 많은 중온성 유기체에서 양립 용질로서 작용할 수 있고 α- 및 β-아미노산 둘 다는 삼투적응을 위해 사용된다(코스타(Costa) 1998). 안정화 효과를, 아미노기 또는 여분의 전하가 개선하는지 여부를 측정하기 위해서, 글루코사민 유도체가 합성되었다. 우리의 지식으로는, 단지 하나의 글루코사민-함유 양립 용질은 극호열균 (hyperthermohpile)으로부터 단리되고, 하기 다이-N-아세틸-글루코사민 포스페이트(DAGAP)는 루브로박테르속 자일라노필루스(Rubrobacter xylanophilus)로부터 단리되었다:
(엠파딘하스(Empadinhas) 2007) .
DAGAP는 극호열균에서 발견된 포스포다이에스테르 양립 용질, 예를 들어 DIP 또는 DGP와 구조적으로 유사하지만, 그러나 양립 용질로서의 역할은, 세포의 삼투압 밸런스에 기여하기에는 너무 낮은 농도 때문에 부인되어 왔다.
이러한 연구를 위해 선택된 모든 글리코실 억셉터는, 하전되고, 많거나 적은 탄소수, 하이드록실 기의 손실, 부가적인 카복실기, 및 존재하는 경우 비대칭 중심에서의 구조와 같은 포인트 개질(point modification)을 갖는 글리세레이트와 구조적으로 관련되었다:
글루코스 및 갈락토스 유도체의 합성을 위해, 티오글리코시드 도너(1 및 19)를 합성하였다. 다이클로로메탄 내에서 NIS/TfOH 시스템(로렌코(Lourenco) 2009)을 사용하는 도너 (donor) 1 및 19와 글리코실 억셉터의 글리코실화 반응에 대해 수득된 결과는 하기 표 1에 기술한다. 메틸 글리세레이트 유도체(9 및 135)를 제외하면, 모든 억셉터는 시판중이며, 상기 메틸 글리세레이트 유도체(9 및 135)는 D-세린에 대해 보고된 실험 절차에 따라 합성하였다(루렌코 2009; 록크(Lok) 1976) .
[반응식 1]
티오글리코시드 도너(1 및 19)를 사용한 글리코실화 반응
대부분의 글리코실 억셉터의 경우, 반응에 의해 아노머의 혼합물이 수득되었다. 이는, 안정화 효과에 대한 아노머 위치의 입체화학의 중요성을 측정하기 위해서 a 및 β 아노머를 개별적으로 평가하기 위한 기회를 제공한다. 이는 D/L-글리세레이트 및 말레이트 갈락토실 유도체에 대한 경우였다.
일반적인 유기 반응, 예를 들어 아세테이트의 가메탄올분해, 글리세레이트 유사체(화합물 35, 140 및 141)의 경우에서의 실릴 에테르의 가플루오로분해, 및 에스테르 기의 가수분해(반응식 2)를 사용하여 보호 기를 연속적으로 제거한 후, 목적하는 생성물을 수득하였다(표 2).
[반응식 2]
전체적으로, 생성물은 우수한 수율로 성공적으로 수득되었고 α-아노머는 주된 생성물이었다. 일부 경우에, α- 와 β-아노머의 혼합물이 수득되지만(α-아노머가 풍부함), 이들은 예비 스크리닝을 위해 사용되고, 그다음 상기 예비 스크리닝에서 가장 유망한 화합물이 개별적으로 테스트된다. 가장 낮은 수율은, 말레이트 모이어티의 제거에 의해, 아노머 위치의 가수분해를 촉진하는, 메틸 에스테르의 가수분해에서의 및 아세테이트의 제거에서의 염기의 사용으로 인하여 다이메틸(S)-말레이트의 유도체(150, 151 및 152, 표 2)에 대해 수득하였다. 이러한 문제점은, 바실리티올(BSH)(샤르마 2011)의 합성에서 문헌에 보고되었다. 말레이트 모이어티의 제거를 최소화하기 위해서, 조심스러운 에스테르 가수분해는, 최종 생성물에 미량의 모노-에스테르를 남긴다.
1,2-트랜스 만노시드의 합성의 경우, 제조하기에 비교적 빠르고 덜 비싼, 글리코실 도너로서 트리클로로아세트아미데이트, 및 보호기로서 아세테이트를 사용하는 C-2 아실 이웃 기 (neighboring group) 참여 전략이 적용되었다. 촉진제로서 BF30Et2를 사용하는, 만노스 트리클로로아세트이미데이트 도너(103)와 글리코실 억셉터 사이의 글리코실화 반응은, 예상되는 바와 같이, 배타적으로 α-생성물을 제공한다. 만노스 도너(103)와의 글리코실화 반응에 대해 수득된 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
[반응식 3]
일반적인 유기 반응(반응식 4)을 사용하여 보호기를 연속적으로 제거하면, 우수한 총 수율로 목적하는 제품이 수득된다(표 4).
[반응식 4]
만노실 다이메틸(S)-말레이트 유도체의 메틸 에스테르 유도체와 아세테이트 기의 가수분해는, 글루코스 및 갈락토스 유도체에 대해 전술한 것과 동일한 문제를 보여준다.
1,2-시스 글루코사민 유도체는 2-아지도-2-데옥시티오글루코시드 도너(90)로부터 합성되고, 글리코실 억셉터와의 글리코실화 반응은, 촉진제로서 NIS/TfOH를 사용하여 -10℃에서 CH2Cl2/Et20(4:1)의 혼합물에서 수행되었다. 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
[반응식 5]
α-아노머는 사용된 모든 억셉터의 주요 생성물이었다. 실릴 에테르의 글리세레이트 유도체의 가플루오로분해의 경우에, 아세테이트 기의 가메탄올분해 이후에, 동시에 일어나는 아지드의 환원과 함께 벤질기의 촉매작용 수소첨가는, 원치않는 사이클릭 아미드의 형성을 촉진한다(반응식 6). 이러한 영향은 단지 α-아노머의 경우에 관찰되었다.
[반응식 6]
2-아지도-2-데옥시글루코시드 유도체의 수소첨가반응
전하는 안정화 효과를 위해 중요하기 때문에, 이러한 문제점을 극복하기 위해서, 스타우딩거 반응(Staudinger reaction)을 이용하는 아지드의 이전의 환원 및 그 이후의 생성된 아민 기의 아세테이트에 의한 보호(반응식 7)는, 아민을 차단하고 환형화 (cyclisation)를 피하였다. 보호기의 제거 및 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 최종 N-아세틸 글루코사민 유도체가 수득되었다.
[반응식 7]
실험적인 세부사항
실험 1. 에틸 6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(1)의 합성
화합물 1의 합성은, 문헌(로렌코 2009)에 기술된 절차에 따라 수행하였다.
실험 2. 일반적인 글리코실화 절차
용매/보여준 용매들(1 mL) 내 티오글리코시드 도너(0.15 mmol), 억셉터(0.15 mmol) 및 4Å MS의 현탁액을 상온에서 1시간 동안 교반하고, 그다음 0℃로 냉각시켰다. N-요오도숙신이미드(0.19 mmol) 및 TfOH(0.9 μL)를 0℃에서 첨가하고, 상기 반응이 완료되었을 때(TLC), 10% Na2S2O3 수용액(2 mL) 및 포화 수성 NaHCO3(1 mL)를 첨가하고 혼합물을 CH2Cl2(3x5 mL)로 추출하고; 유기 상을 모아 건조하고(MgS04), 여과하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 조질의 생성물을 제조용 TLC(3:7, EtOAc/Hex)로 정제하였다. 단리된 생성물의 α/β비는 1H NMR(400 MHz, CDCl3) 스펙트럼으로 측정하였다.
실험 3. 메틸(2S)-2-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-글루코피라노실)프로파노에이트(10)의 합성
억셉터 4와 도너 1의 글리코실화 반응은, 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 4. 메틸 2-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-글루코피라노실) 아세테이트(13)의 합성
억셉터 7과 도너 1의 글리코실화 반응은 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 5. 에틸 6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-1-티오-α/β-D-갈락토피라노시드(19)의 합성
DMF(20 mL) 내 메틸 α-D-갈락토피라노시드(2.0 g, 10.3 mmol)의 교반 용액에, 벤질 브로마이드(6.3 mL, 51.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃로 냉각하고 나트륨 하이드리드(1.48 g, 61.8 mmol)를 나눠서 첨가하였다. 상기 반응물은 밤새 상온(r.t.)으로 유지하고, 출발 물질의 완전한 전환 이후에, MeOH를 0℃에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 Et20로 추출하고 유기상을 모아 건조하고, 여과하고, 농축시켰다. 실리카 겔(10:90, EtOAc/Hex) 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 점성의 무색 발포체로서 생성물을 수득하였다(5.14 g, 90%).
농축된 황산(1.0 mL)을, 0℃에서, 아세트산/아세트산 무수물(1:1, 50 mL) 내 메틸 테트라-O 벤질갈락토피라노시드(5.72 g, 10.7 mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 출발 물질의 완전한 전환 이후에, pH 7이 될 때까지, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 및 빙냉 증류수로 급랭하였다 (quenched). 혼합물을 EtOAc(3x70 mL)로 추출하고 유기층을 모아 건조하고, 여과하고, 진공 하에서 농축하였다. 잔사를, 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(20:80, EtOAc/Hex)로 정제하여 다이아세테이트(4.29 g, 75%, α:β= 3.7:1)를 점성의 무색 발포체로서 수득하였다.
에탄티올(1.56 mL, 20.7 mmol)을 DCM(30 ml) 내 다이아세테이트(3.69 g, 6.9 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 붕소 트리플루오라이드 다이에틸 에테르에이트(1.31 mL, 10.35 mmol)를 나눠서 첨가하였다. 출발 물질의 완전한 전환 이후에, 반응 혼합물을 CH 2Cl2(2x40 mL)로 희석하고 pH 7이 될 때까지 포화 NaHCO3 용액으로 급랭하였다.
수성상을 CH2Cl2(2x40 mL)로 추출하고 유기 추출액을 모아 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(20:80, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 발포체로서 티오갈락토시드(19)(3.39 g, 91%, α/β=2.4:1)로서 수득하였다.
실험 6. 메틸(2S)-2-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-갈락토피라노실) 프로파노에이트(32)의 합성
억셉터 4와 도너 19의 글리코실화 반응은, 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 7. 메틸 2-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-갈락토피라노실) 아세테이트(34)의 합성
억셉터 7과 도너 19의 글리코실화 반응은 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 8. 메틸 3-O-3급-부틸다이메틸실릴-(2R)-2-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-갈락토피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(35)의 합성
억셉터 9와 도너 19의 글리코실화 반응은 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 9. 페닐 3,4,6-트리-O-아세틸-2-아지도-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(85)의 합성
0℃에서 CH2Cl2(60 mL) 내 1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-아지도-2-데옥시-α/β-D-글루코피라노스(고다드-보거(Goddard-Borger) 2007)(6.42 g, 17.2 mmol) 및 티오페놀(3.55 mL, 34.4 mmol)의 용액에 BF3OEt2(9.81 mL, 77.4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 48시간 동안 상온에서 교반하고, 그다음 CH2Cl2로 희석하고, NaHCO3로 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2로 추출하고 유기상을 모아 MgS04로 건조하고, 여과하고, 진공 하에서 농축하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtoAc/헥산)로 정제하여 화합물 85(5.40 g, 74%, α/β=2.5:1)을 무색 점성 발포체로서 수득하고 초기 테트라아세테이트(1.30 g, 20%)를 회수하였다.
실험 10. p-톨릴 3,4,6-트리-O-아세틸-2-아지도-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(86)의 합성
0℃에서 CH2Cl2(60 mL) 내 1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-아지도-2-데옥시-α/β-D-글루코피라노스(고다드-보거 2007)(3.87 g, 10.4 mmol) 및 p-톨루엔티올(2.57 g, 20.7 mmol)의 용액에 BF3OEt2(6.57 mL, 51.8 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60시간 동안 상온에서 교반하고, 그다음 CH2Cl2로 희석하고, NaHCO3로 세척하였다. 수성상을 CΗ2Cl2로 추출하고 유기상을 모아 MgS04로 건조하고, 여과하고, 진공 하에서 농축하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 점성 발포체로서 화합물 85(2.26 g, 50%, α/β=1.8:1)를 수득하고, 초기 테트라아세테이트(1.69 g, 44%)를 회수하였다.
실험 11. 페닐 2-아지도-6-O-3급-부틸다이페닐실릴-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(87)의 합성
0℃에서 MeOH(20 mL) 내 화합물 85(4.75 g, 11.21 mmol)의 교반 용액에 MeOH 내 NaOMe 1N(6.73 mL, 6.73 mmol)의 용액을 첨가하였다. 3시간 이후에, 출발 물질이 소비되었다. 반응 혼합물을 MeOH로 희석하고 중성 pH까지 도웍스(Dowex)-H+ 수지를 첨가하였다. 용매의 여과 및 증발은 점성 검으로서 트리올(3.23 g, 97%)을 제공하였다. 상온에서 피리딘(20 mL) 내 트리올(2.46 g, 8.27 mmol)의 용액에 TBDPSCl(2.36 mL, 9.10 mmol), 그다음 촉매작용량의 DMAP를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하고 그다음 H20(20 mL)로 급랭하고 CH2Cl2로 추출하고 유기상을 모아 건조하고(MgS04) 농축시켰다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70 AcOEt/헥산)에 의한 정제는 백색 고체로서 생성물 87(4.12 g, 93%, α/β=1.8:1)을 제공하였다.
실험 12. p-톨릴 2-아지도-6-O-3급-부틸다이페닐실릴-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(88)의 합성
실험 11의 절차는 화합물 86에 적용하여 2단계 이후에 98% 수율의 무색 점성 검으로서 화합물 88를 수득하였다(α/β=1.8:1).
실험 13. 페닐 6-O-아세틸-2-아지도-3 ,4 ,다이-O-벤질-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(89)의 합성
0℃에서 DMF(15 mL) 내 화합물 87(3.91 g, 7.30 mmol) 및 벤질 브로마이드(1.97 mL, 22.6 mmol)의 교반 용액에 나트륨 하이드라이드(0.45 g, 18.6 mmol)를 나눠서 첨가하였다. 2시간 이후에, MeOH을 0℃에 첨가하고, 반응 혼합물을 포화 수용액으로 급랭하고 Et20로 추출하였다. 유기 상을 모아 MgS04로 건조하고, 여과하고 진공 하에서 증발시켰다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(10:90 AcOEt/헥산)로 정제하여 다이벤질화 생성물(4.45 g, 85%)을 백색 고체로서, 트리벤질화 생성물 92(0.31 g, 7%)를 점성 검으로서 수득하였다.
상온에서 THF(10 mL) 내 다이벤질화 생성물(2.42 g, 3.38 mmol)의 용액에 TBAF(1.15 g, 4.39 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 그다음 물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 AcOEt(3x20 mL)로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축시켜 황색 점성 잔사를 제공하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, AcOEt/헥산)로 정제하여 알콜(1.43 g, 88%)을 점성 검으로서 제공하였다.
0℃에서 피리딘(5 mL) 내 알콜(1.396 g, 2.92 mmol)의 교반 용액에 아세트산 무수물(0.55 mL, 5.85 mmol) 및 촉매작용량의 DMAP를 첨가하였다. 출발 물질을 완전히 전환한 후 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 점성 잔사를 제공하였다. EtOAc/헥산의 혼합물(10/90)을 사용하여 셀라이트를 통해 여과하여, 점성 무색 검(1.38g, 91%, α:β=1.4:1)으로서 생성물 89을 제공하였다.
실험 14. 페닐 2-아지도-3,4,다이-O-벤질-6-O-클로로아세틸-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(90)의 합성
실험 13의 절차를, 클로로아세트산 무수물을 사용하면서 화합물 87에 적용하여, 3단계 이후에 화합물 90을 무색 점성 검으로서 66%(α/β=1.6:1)의 수율로 제공하였다. 화합물 90의 특징화 데이타는 문헌(크시키(Csiki) 2010)과 동일하다.
실험 15. p-톨릴 2-아지도-3,4,다이-O-벤질-6-O-클로로아세틸-2-데옥시-1-티오-α/β-D-글루코피라노시드(91)의 합성
실험 13의 절차를, 클로로아세트산 무수물을 사용하면서 화합물 88에 적용하여, 3단계 이후에 화합물 91을 무색 점성 검으로서 82%(α/β=1:1)의 수율로 제공하였다.
실험 16. 메틸(2S)-2-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-6-O-클로로아세틸-2-데옥시-α/β-D-글루코피라노실) 프로파노에이트(95)의 합성
억셉터 4와 도너 90 및 91의 글리코실화 반응은, 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 17. 메틸 2-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-6-O-클로로아세틸-2-데옥시-α/β-D-글루코피라노실) 아세테이트(96)의 합성
억셉터 7과 도너 91의 글리코실화 반응은, 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 18. 메틸 (2R)-3급-부틸다이메틸실릴-3-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-6-O-클로로아세틸-2-데옥시-α/β-D-글루코피라노실)-2,3-다이하이드록시로파노에이트(97)의 합성
억셉터 9와 도너 91의 글리코실화 반응은, 실험 2에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 19. 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노실 트리클로로아세트이미데이트(103)의 합성
화합물(103)의 합성이 문헌(하네시안(Hanessian) 1997)에 기술된 절차에 따라 수행되었다.
실험 20. 에틸 3-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-글루코피라노실)-3-하이드록시부티레이트(136)의 합성
CH2Cl2(6 mL) 내 티오글루코시드 도너 1(0.815 g, 1.52 mmol), 에틸 3-하이드록시부티레이트 133(0.197 mL, 1.52 mmol) 및 4Å MS의 현탁액을 1시간 동안 상온에서 교반하고, 그다음 0℃로 냉각하였다. N-요오도숙신이미드(0.434 g, 1.93 mmol) 및 TfOH(0.112 mL)를 0℃에서 첨가하고, 반응이 완료되면, 10% Na2S2O3 수용액(6 mL) 및 포화 NaHCO3 수용액(3 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 CH2Cl2(3x6 mL)로 추출하고, 유기상을 모아 건조하고(MgS04), 여과하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 조질의 생성물을, 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(20:80, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성 무색 발포체로서 생성물(136)을 제공하였다(0.771 g, 84 %).
실험 21. 에틸 3-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-갈락토피라노실)-3-하이드록시부티레이트(137)의 합성
티오갈락토시드 도너 19(0.638 g, 1.19 mmol) 및 에틸 3-하이드록시부티레이트 133(0.170 mL, 1.31 mmol)의 글리코실화 반응을 실험 20에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(20:80, EtOAc/Hex)로 정제하여 생성물(137)을 점성 무색 검(0.685 g, 95 %)으로서 제공하였다.
실험 22. 다이메틸(2S)-2-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-글루코피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(138)의 합성
티오갈락토시드 도너 1(0.850 g, 1.58 mmol) 및 다이메틸 (S)-말레이트 134(0.208 mL, 1.58 mmol)의 글리코실화 반응을 실험 20에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/Hex)로 정제하여 생성물(138)을 점성 무색 검(0.949 g, 94 %, α/β=7:1)으로서 제공하였다.
실험 23. 다이메틸(2S)-2-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-갈락토피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(139)의 합성
티오갈락토시드 도너 19(1.20 g, 2.23 mmol) 및 다이메틸(S)-말레이트 134(0.294 mL, 2.23 mmol)의 글리코실화 반응을, 실험 20에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/Hex)로 정제하여 생성물(139)을 점성 무색 검(1.235 g, 87 %, α/β=5:1)으로서 제공하였다.
실험 24. 메틸 3-O-3급-부틸다이메틸실릴-(2S)-2-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-글루코피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(140)의 합성
티오갈락토시드 도너 1(0.300 g, 0.56 mmol) 및 억셉터 135(0.200 g, 0.56 mmol)의 글리코실화 반응을, 실험 20에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(10:90, EtOAc/Hex)로 정제하여 생성물(140)을 점성 무색 검(0.463 g, 98 %, α/β>10:1)으로서 제공하였다.
실험 25. 메틸 3-O-3급-부틸다이메틸실릴-(2S)-2-O-(6-O-아세틸-2,3,4-트리-O-벤질-α/β-D-갈락토피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(141)의 합성
티오갈락토시드 도너 1(0.300 g, 0.56 mmol) 및 억셉터 135(0.200 g, 0.56 mmol)의 글리코실화 반응을, 실험 20에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(10:90, EtOAc/Hex)로 정제하여 생성물(140)을 점성 무색 검(0.463 g, 98 %, α/β>10:1)으로서 제공하였다.
실험 26. 칼륨 (2S)-2-(α-D-글루코피라노실)프로파노에이트(142)의 합성
MeOH 내 NaOMe 1N(0.443 mL, 0.443 mmol)의 용액을, 0℃에서 MeOH(4 mL) 내 화합물 10(0.427 g, 0.74 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 1시간 이후에, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 수용액으로 중화하였다. 수성상을 EtOAc로 추출하고 유기 추출액을 모아 건조하고(MgS04), 여과하고, 용매를 제거하였다. 조질의 생성물을, 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/Hex)에 의해 정제하여 α-알콜(0.310 g, 78%) 및 β-알콜(0.027 g, 7%)을 점성 무색 검으로써 제공하였다.
EtOAc 내 α-알콜(0.300 g, 0.56 mmol)의 용액을, Pd/C 10%(0.25 당량)의 존재하에서 50psi에서 수소첨가반응하였다. 5시간 후, 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 증발시켜, 에스테르를 매우 점성의 무색 발포체(0.149 g, 정량적)로서 제공하였다. 2 M KOH의 용액(0.28 mL)을, H20(2 mL) 내 에스테르(0.149 g, 0.56 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 모든 출발 물질이 소모된 이후에, 10% HCl를 사용하여 pH를 7로 조정하고, 용매를 증발시켜 화합물 142를 점성의 무색 발포체(0.162 g, 정량적)로서 제공하였다. [α] 20 D=+107.2(c=O.60, H20). 1 H NMR(D20): δ 4.93(d, J=3.9 Hz, 1H, H-1), 3.96(q, J= 6.8 Hz, 1H, CHCH3), 3.75-3.68(m, 5H), 3.44(dd, J=9.9 Hz, J=4.0 Hz, 1H, H-2), 3.35(t, J=9.3 Hz, 1H, H-4), 1.28(d, J=6.8 Hz, 3H, CHCH 3) ppm. 13 C NMR(CDCl3): δ 181.0(CHCO2 -), 97.3(C-1), 75.5(CHCH3), 73.1(C-3), 71.9(C-5), 71.5(C-2), 69.4(C-4), 60.1(C-6), 17.5(CHCH3) ppm.
실험 27. 칼륨 (2S)-2-(α/β-D- 갈락토피라노실)프로파노에이트(143)의 합성
갈락토시드 32(1.720 g, 2.63 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 검(1.350 g, 96 %, α/β=3:1)으로서 알콜을 제공하였다. 벤질 에테르(1.323 g, 2.46 mmol)의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 23에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 143을 점성의 무색 발포체(0.715 g, 정량적, α/β=3:1)로서 수득하였다. FTIR(필름) vmax: 1635(C=O), 3332(0-H) cm-1. 1 H NMR(D20): δ 4.97(d, J=3.9 Hz, H-1(α)), 4.58(q, J=7.0 Hz, CHCH3(β)), 4.37(d, J=7.7 Hz, H-1(β)), 4.25(q, J=6.9 Hz, CHCH3(α)), 3.93-3.88(m), 3.84-3.79(m), 3.76-3.64(m), 3.63-3.52(m), 3.47(dd, J=9.9, 7.7 Hz), 1.38(d, J=7.0 Hz, CHCH 3(β)), 1.35(d, J=6.8 Hz, CHCH 3(α)) ppm. 13 C NMR(CDCl3): δ 187.3(CHCO2 -), 101.8(C-1(β)), 98.9(C-1(α)), 75.2, 73.7, 73.1, 72.6, 71.4, 70.7, 69.21, 69.07, 68.5, 68.0, 60.84, 60.80, 52.68, 52.62, 17.1(CHCH3) ppm.
실험 28. 칼륨 2-(α/β-D-글루코피라노실) 아세테이트(144)의 합성
글루코시드 13(0.940 g, 1.66 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 검(0.765 g, 88 %, α/β=11:1)으로서 알콜을 제공하였다. 벤질 에테르(0.715 g, 1.37 mmol)의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 144를 점성의 무색 발포체(0.378 g, 정량적, α/β=10:1)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 4.88(d, J=3.8 Hz, H-1(α)), 4.41(d, J=7.9 Hz, H-1(β)), 4.22(d, J=15.6 Hz, CHH'CO2 -(β)), 4.06(d, J=15.5 Hz, CHH'CO2 -(α)), 4.03(d, J=15.8 Hz, CHH'CO2 -(α)), 3.88(d, J=15.5 Hz, CHH'CO2 -(β)), 3.79-3.61(m), 3.46(dd, J=9.8, 3.8 Hz), 3.34(t, J=9.5 Hz) ppm. 13 C NMR(CDCl3): δ 177.4, 102.3(C-1(β)), 98.3(C-1(α)), 75.9(β), 75.5(β), 73.1, 71.9, 71.5, 69.5, 68.5(CH2CO2 -(β)), 66.8(CH2CO2 -(α)), 60.61(C-6(β)), 60.43(C-6(α)) ppm.
실험 29. 칼륨 2-(α/β-D-갈락코피라노실) 아세테이트(145)의 합성
갈락토시드 34(1.079 g, 1.91 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 검(0.800 g, 81 %, α/β=2:1)으로서 알콜을 제공하였다. 벤질 에테르(0.787 g, 1.50 mmol)의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 145를 점성의 무색 발포체(0.416 g, 정량적, α/β=2:1)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 4.91(d, J=3.9 Hz, H-1(α)), 4.34(d, J=7.7 Hz, H-1(β)), 4.24(d, J=15.6 Hz, CHH'CO2 -(β)), 4.06(d, J=15.6 Hz, CHH'CO2 -(α)), 4.03(d, J=15.6 Hz, CHH'CO2 -(β)), 3.92-3.84(m),(d, J=15.6 Hz, CHH'CO2 -(α)), 3.75-3.71(m), 3.69-3.58(m), 3.52(dd, J=10.0 Hz, J=7.6 Hz, H-2(β)) ppm. 13 C NMR(CDCl3): δ 177.5, 102.9(C-1(β)), 98.3(C-1(α)), 75.2(β), 72.6(β), 71.1(α), 70.8(β), 69.5(α), 69.2(α), 68.6(β), 68.5(CH2CO2 -(β)), 68.4(α), 66.8(CH2CO2 -(α)), 61.15(C-6(α)), 60.95(C-6(β)) ppm.
실험 30. 칼륨 (2R)-2-O-(α/β-D-갈락토피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(146 , 147)의 합성
갈락토시드 35(1.078 g, 1.29 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(20:80, EtOAc/Hex)로 정제하여 α-알콜(0.671 g, 66 %) 및 β-알콜(0.286 g, 28 %)을 점성의 무색 검으로써 제공하였다.
TBAF(THF 내 1M; 0.83 mL, 0.83 mmol)를, 상온에서 THF(4mL) 내 α-갈락토시드(0.655 g, 0.83 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하고 그다음 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 황색 점성의 잔사를 제공하였다. 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제(80:20, EtOAc/헥산)하여, α-다이올을 점성의 무색 검(0.457 g, 92%)으로서 제공하였다. α-다이올(0.140 g, 1.50 mmol)로부터의 벤질 에테르의 촉매작용 수소첨가 및 실험 26에 기술한 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 146을 점성의 무색 발포체(0.416 g, 정량적)로서 수득하였다. 알파 생성물 146: [α] 20 D =+127.6(c=O.62, H20). 1 H NMR(D20): δ 4.97(d, J=3.9 Hz, 1H, H-1), 4.13(dt, J=4.7 Hz, J=2.3 Hz, 1H, CHCH2OH), 3.99(t, J=6.2 Hz, 1H), 3.93-3.87(m, 2H), 3.81(dd, J=12.1, 3.2 Hz, 1H), 3.77-3.70(m, 2H), 3.69-3.64(m, 2H, H-6, H'-6) ppm. 13 C NMR(D20): δ 177.1(CHCO2 -), 97.6(C-1), 79.2(CHCH2OH), 71.3, 69.6, 69.3, 68.5, 63.1(CHCH2OH), 61.2(C-6) ppm.
동일한 전략을 β-갈락토시드(0.266 g, 0.34 mmol)의 탈보호에도 적용하였다. 가플루오로분해(0.140 g, 76%) 이후에, β-다이올(0.340 g, 0.615 mmol)로부터의 벤질 에테르의 촉매작용 수소첨가반응, 및 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화학식 147는 점성의 무색 발포체(0.188 g, 정량적)로서 수득하였다. 베타 생성물 147: 1 H NMR(D20): δ 4.42(d, J=7.5 Hz, 1H , H-1), 4.11(dd, J=6.5 Hz, J=3.2 Hz, 1H, CHCH2OH), 3.83-3.77(m, 2H), 3.73-3.67(m, 2H), 3.64-3.53(m, 4H) ppm. 13 C NMR(D20): δ 177.9(CHCO2 -), 102.6(C-1), 81.3(CHCH2OH), 75.1, 72.6, 70.9, 68.7, 62.6(CHCH2OH), 60.9(C-6) ppm.
실험 31. 칼륨 3-O-(α-D-글루코피라노실)-3-하이드록시부티레이트(148)의 합성
글루코시드 136(0.823 g, 1.36 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 검으로서 α-알콜(0.594 g, 82 %) 및 β-알콜(0.066 g, 9 %)을 점성의 무색 검으로서 제공하였다.
α-알콜의 벤질 에테르(0.516 g, 0.94 mmol)의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 148을 점성의 무색 발포체(0.285 g, 정량적)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 4.98(d, J=4.0 Hz, H-1), 4.97(d, J=4.2 Hz, H-1), 4.14-4.04(m, CHCH3), 3.80-3.59(m), 3.45-3.39(m, H-2), 3.34-3.28(m, H-4), 2.47(dd, J=14.2 Hz, J=6.9 Hz, CHCH 2CO2 -), 2.40-2.22(m, CHCH 2CO2 -), 1.21(d, J=6.1 Hz, CHCH 3), 1.14(d, J=5.9 Hz, CHCH 3) ppm. 13 C NMR(D20): δ 180.19, 180.16, 97.6(C-1), 94.9(C-1), 73.4(CHCH3), 73.15(CHCH3), 73.06, 71.9, 71.51, 71.48, 71.32, 70.5, 69.62, 69.56, 60.6(C-6), 60.3(C-6), 45.6(CHCH2CO2 -), 44.5(CHCH2CO2 -), 20.6(CHCH3), 18.0(CHCH3) ppm.
실험 32. 칼륨 3-O-(α/β-D-갈락토피라노실)-3-하이드록시부티레이트(149)의 합성
갈락토시드 137(0.709 g, 1.17 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 검(0.584 g, 88 %, α/β=3:1)으로서 알콜을 제공하였다. 벤질 에테르(0.573 g, 1.01 mmol)의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 145를 점성의 무색 발포체(0.309 g, 정량적, α/β=3:1)로서 수득하였다. 1H NMR(D20): δ 5.01(d, J=3.9 Hz, H-1(α)), 4.99(d, J=3.8 Hz, H-1(α)), 4.42(d, J=8.4 Hz, H-1(β)), 4.40(d, J=8.1 Hz, H-1(β)), 4.23-4.04(m), 3.97-3.89(m), 3.84(t, J=3.9 Hz), 3.78-3.54(m), 3.40(dd, J=9.6, 8.2 Hz), 2.54-2.44(m), 2.40-2.22(m), 1.22-1.13(m) ppm. 13 C NMR(D20): δ 180.3, 179.9, 101.9(C-1(β)), 101.1(C-1(β)), 97.9(C-1(α)), 95.1(C-1(α)), 75.14, 75.10, 74.99, 74.0, 73.4, 72.79, 72.65, 71.02, 71.01, 70.8, 70.52, 70.44, 69.58, 69.46, 69.30, 69.1, 68.72, 68.56, 68.46, 68.2, 68.72, 68.56, 68.46, 68.2, 61.23, 61.09, 60.9, 45.75(CHCH2CO2 -), 45.57(CHCH2CO2 -), 44.5(CHCH2CO2 -), 20.6(CHCH3), 19.3(CHCH3), 18.0(CHCH3) ppm.
실험 33. 칼륨 (2S)-2-O-(α/β-D-글루코피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(150)의 합성
글루코시드 138(0.263 g, 0.41 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 제조용 TLC(50:50, EtOAc/Hex)로 정제하여 목적하는 알콜(0.117 g, 48%)을 점성의 무색 검으로서 제공하고, 초기 화합물 138(0.068 g, 26 %) 및 아노머 위치에서의 가수분해 생성물(0.046 g, 25 %)을 회수하였다. 벤질 에테르(0.565 g, 0.95 mmol)의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 145를 점성의 무색 발포체(0.290 g, 94%)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 4.94(d, J=3.9 Hz, H-1(α)), 4.39(d, J=7.9 Hz, H-1(β)), 4.19(dd, J=10.4, J=3.1 Hz, 1H, CO2 -CHCH2CO2 -), 3.80-3.63(m), 3.45-3.28(m), 3.21-3.15(m), 2.59(dd, J=15.1 Hz, J=2.9 Hz, CHCH 2CO2 -(β)), 2.52(dd, J=15.2 Hz, J=3.2 Hz, CHCH 2CO2 -(α)), 2.42(dd, J=15.2 Hz, J=10.4 Hz, CHCH 2CO2 -(α)) ppm. 13 C NMR(D20): δ 179.5, 179.1, 135.3(C-1(β)), 99.7(C-1(α)), 95.9, 79.0, 75.92, 75.72, 74.1, 73.1, 72.2, 71.8, 71.4, 69.6, 69.2, 60.7, 60.0, 41.5 ppm.
실험 34. 칼륨 (2S)-2-O-(α/β-D-갈락토피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(151, 152)의 합성
갈락토시드 139(1.215 g, 1.91 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(50:50, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 검으로서 α-알콜(0.642 g, 57 %) 및 β-알콜(0.176 g, 16%)를 제공하고, 출발 물질 139(0.020 g, 16 %) 및 아노머 위치에서의 가수분해의 생성물(0.067 g, 8 %)을 회수하였다. α-알콜(0.640 g, 1.07 mmol) 및 β-알콜(0.159 g, 0.27 mmol)로부터의 벤질 에테르의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 151(0.401 g, 정량적) 및 화합물 152(0.100 g, 정량적)는 점성의 무색 발포체로서 수득되었다. 알파 생성물 151: FTIR(film) vmax::: 1634(C=O), 3332(0-H) cm-1. 1 H NMR(D20): δ 4.96(d, J=4.0 Hz, 1H, H-1) 4.20(dd, J=10.3, 3.1 Hz, CO2 -CHCH2CO2 -), 4.05-4.02(m), 3.94(d, J=2.8 Hz), 3.86(dd, J=10.4 Hz, J=3.3 Hz), 3.70-3.54(m), 2.54(dd, J=15.2 Hz, 3.2 Hz, 1H , CHCH 2CO2 -), 2.43 2.42(dd, J=15.2 Hz, J=10.3 Hz, 1H, CHCH 2CO2 -) ppm. 베타 생성물 152: FTIR(필름) vmax:, 1736(C=O), 3410(0-H) cm-1. 1 H NMR(D20): δ 4.52(dd, J=10.0 Hz, J=3.1 Hz, 1H, CHCH2CO2 -), 4.33(d, J=7.5 Hz, 1H, H-1), 3.83-3.82(m, 1H), 3.77-3.50(m, 5H), 2.62(dd, J=15.2, 3.1 Hz, 1H, CHCH 2CO2 -), 2.44(dd, J=15.2, 10.0 Hz, .1H, CHCH 2CO2 -). 13 C NMR(D20): δ 179.4(CO2 -), 179.0(CO2 -), 102.0(C-1), 77.6(CHCH2CO2 -), 75.4, 72.8, 70.9, 68.8, 61.3(C-6), 41.9(CHCH2CO2 -) ppm.
실험 35. 칼륨 (2S)-2-O-(α-D-글루코피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(153)의 합성
글루코시드 140(0.450 g, 0.54 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(20:80, EtOAc/Hex)로 정제하여 α-알콜(0.299 g, 70 %) 및 β-알콜(0.030 g, 7 %)을 점성의 무색 검으로써 제공하였다.
TBAF(THF 내 1M; 0.37 mL, 0.37 mmol)를, 상온에서 THF(2 mL) 내 α-글루코시드(0.290 g, 0.37 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하고 그다음 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 황색 점성의 잔사를 제공하였다. 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(80:20, EtOAc/헥산)로 정제하여, α-다이올을 점성의 무색 검(0.162 g, 80%)으로서 제공하였다. α-다이올(0.150 g, 0.27 mmol)로부터의 벤질 에테르의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술한 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 153을 점성의 무색 발포체(0.077 g, 정량적)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 4.96(d, J=3.9 Hz, 1H, H-1), 3.96(dd, J=3.3 Hz, J=6.5 Hz, 1H, CHCH2OH), 3.79- 3.75(m, 3H), 3.72-3.63(m, 3H), 3.48(dd, J=3.9 Hz, J=9.9 Hz, 1H, H-2), 3.37(t, J=9.6 Hz, 1H, H-4) ppm. 13 C NMR(D20): δ 177.4(CO2 -), 99.2(C-1), 81.4(CHCH2OH), 72.9, 72.2, 71.7(C-2), 69.3(C-4), 62.6(CHCH2OH), 60.0(C-6) ppm.
실험 36. 칼륨 (2S)-2-O-(α-D-갈락토피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(154)의 합성
α-갈락토시드 141(0.640 g, 0.77 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/Hex)로 정제하여 알콜(0.572 g, 94 %)을 점성의 무색 잔사로서 제공하였다.
TBAF(THF 내 1M; 0.83 mL, 0.88 mmol)를, 상온에서 THF(5 mL) 내 α-갈락토시드(0.695 g, 0.88 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하고 그다음 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 황색 점성의 잔사를 제공하였다. 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제(80:20, EtOAc/헥산)하여, 다이올을 점성의 무색 검(0.343 g, 71%)으로서 제공하였다. 다이올(0.310 g, 0.56 mmol)로부터의 벤질 에테르의 촉매작용 수소첨가반응 및 실험 26에 기술한 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 154를 점성의 무색 발포체(0.172 g, 정량적)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 5.01(d, J=3.9 Hz, 1H, H-1), 4.28(t, J=4.2 Hz, 1H, CHCH2OH), 4.18-3.92(m, 4H), 3.85-3.58(m, 4H) ppm.
실험 37. 칼륨 (2S)-2-O-(β-D-갈락토피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(155)의 합성
β-갈락토시드 141(0.275 g, 0.33 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 26에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/Hex)로 정제하여 알콜(0.243 g, 93 %)을 점성의 무색 잔사로서 제공하였다.
TBAF(THF 내 1M; 0.83 mL, 0.44 mmol)를, 상온에서 THF(3 mL) 내 β-갈락토시드(0.350 g, 0.44 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하고 그다음 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 황색 점성의 잔사를 제공하였다. 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(80:20, EtOAc/헥산)로 정제하여, 다이올을 점성의 무색 검(0.151 g, 62%)으로서 제공하였다. 다이올(0.140 g, 0.25 mmol)로부터의 벤질 에테르의 촉매작용 수소첨가 및 실험 26에 기술한 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 화합물 155를 점성의 무색 발포체(0.078 g, 정량적)로서 수득하였다. 1 H NMR(D20): δ 4.38(d, J=7.4 Hz, 1H, H-1), 4.28(dd, J=6.2 Hz, J=2.9. Hz, 1H, CHCH2OH), 3.84(dt, J=7.2, 3.8 Hz, 2H), 3.76-3.68(m, 3H), 3.66-3.53(m, 4H) ppm. 13 C NMR(D20): δ 177.1(CO2 -), 102.5(C-1), 81.4(CHCH2OH), 75.3, 72.8, 71.0, 68.6, 63.2(CHCH2OH), 61.0(C-6) ppm.
실험 38. 에틸 3-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노실)-3-하이드록시부티레이트(156)의 합성
에틸 3-다이하이드록시부티레이트(0.348 mL, 2.68 mmol)를, 무수 CH2Cl2(6 mL) 내 트리클로로아세트아미데이트 103(1.100 g, 2.23 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 0℃로 냉각하고 BF3OEt2(0.0.282 mL, 2.23 mmol)를 서서히 첨가하였다. 반응이 완료되었을 때, NaHCO3의 포화 수용액을 첨가하고, 그다음 CH2Cl2(3x15 mL)로 추출하였다. 유기 상을 모아 건조하고(MgS04) 농축하였다. 잔사를 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(40:60, EtOAc/헥산)로 정제하여, 점성의 무색 잔사로서 화합물 156(0.943 g, 91 %)을 수득하였다.
실험 39. 다이메틸 (2S)-2-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노실) -2-하이드록시숙시네이트(157)의 합성
트리클로로아세트아미데이트 도너 103(1.540 g, 3.12 mmol) 및 에틸 다이메틸 다이메틸(S)-말레이트 134(0.494 mL, 3.75 mmol)의 글리코실화 반응을 실험 38에 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔(30:70, EtOAc/Hex) 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물 157을 점성의 무색 검(1.359 g, 88 %)으로서 수득하였다.
실험 40. 메틸 3-O-3급-부틸다이메틸실릴-(2S)-2-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(158)의 합성
트리클로로아세트아미데이트 도너 103(1.30 g, 2.64 mmol) 및 억셉터 135(0.946 mL, 2.64 mmol)의 글리코실화 반응을 실험 38에 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔(30:70, EtOAc/Hex) 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물 158를 점성의 무색 검(1.33 g, 73 %)으로서 수득하였다.
실험 41. 칼륨 3-O-(α-D-만노피라노실)-3-하이드록시부티레이트(159)의 합성
MeOH 내 NaOMe 1N(0.36 mL, 0.36 mmol)의 용액을, 0℃에서 MeOH(3 mL) 내 화학식 156(0.276 g, 0.60 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 출발 물질의 완전한 전환 이후에, 이전에 활성화된 도웩스(Dowex)-H+ 수지를, 중성 pH까지, 첨가하였다. MeOH 및 물로 여과한 이후에, 용매를 진공 하에서 제거하여 탈보호된 만노시드를 점성의 무색 검(0.157 g, 90 %)으로서 수득하였다.
2 M KOH(0.78 mL)의 용액을 H20(4 mL) 내 이전의 만노시드(0.431 g, 1.56 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 모든 출발 물질이 소비된 이후에, 10% HCl로 pH를 7로 조절하고, 용매를 증발시켜 화합물 159를 점성의 무색 발포체(0.446 g, 정량적)로서 수득하였다. 1H NMR(D20): δ4.91(d, J=7.5 Hz), 4.18-4.09(m,(CHCH3), 3.84-3.77(m), 3.74-3.63(m), 3.57(t, J=8.9 Hz), 2.43-2.21(m,(CHCH 2CO2 -)), 1.20(d, J=6.1 Hz, CHCH 2CO2 -), 1.14(d, J=5.6 Hz, CHCH 2CO2 -) ppm. 13 C NMR(CDCl3): δ 179.9(CH2 CO2 -), 179.8(CH2 CO2 -), 99.7(C-1), 96.5(C-1), 73.4, 72.9, 72.5, 70.57, 70.52, 70.41, 70.29, 70.24, 66.84, 66.72, 61.0(C-6), 60.7(C-6), 45.5(CHCH2CO2 -), 44.8(CHCH2CO2 -), 20.8(CHCH3) ppm.
실험 42. 칼륨 (2S)-2-O-(α-D-만노피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(160)의 합성
만노시드 157(1.343 g, 2.72 mmol)의 아세테이트 기의 가메탄올분해를, 실험 41에서 기술한 절차에 따라 수행하였다. 조질의 물질을 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피(20:80, MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 목적하는 탈보호화된 만노시드(0.685 g, 78 %)를 점성의 무색 검으로서 제공하고, 아노머 위치에서의 가수분해의 생성물인 D-만노피라노시드(0.100 g, 20 %)를 제공한다. 실험 38에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해는 점성의 무색 발포체(0.786 g, 정량적)로서 수득되었다. 1 H NMR(D20): δ 4.85(t, J=15.6 Hz, 1H), 4.85(s, 1H, H-1), 4.24(dd, J=8.2 Hz, J=4.7 Hz, 1H), 3.90-3.58(m, 5H), 2.79-2.64(m, 2H) ppm.
실험 43. 칼륨 (2-5)-2-O-(D-만노피라노실)-2,3-다이하이드록시프로파노에이트(161)의 합성
TBAF(THF 내 1M; 0.38 mL, 0.38 mmol)를, 상온에서 THF(3 mL) 내 화합물 158(0.220 g, 0.23 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하고 그다음 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 황색 점성의 잔사를 제공하였다. 제조용 TLC(60:40, EtOAc/헥산)에 의해 정제하여, 알콜을 점성의 무색 검(0.103 g, 72%)으로서 제공하였다. 알콜(0.518 g, 1.15 mmol)의 아세테이트 기의 가멘탄올분해를 실험 41에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 출발 물질의 전환을 완료한 후, 이전에 활성화된 도웩스-H+ 수지를, 중성 pH까지 첨가하였다. MeOH 및 물로 여과한 후, 용매를 진공 하에서 제거하여 점성의 무색 검(0.312 g, 96 %)로서 탈보호된 만노시드를 수득하였다. 실험 41에 기술된 절차에 따른 메틸 에스테르의 가수분해 이후에, 상기 화합물 161이 점성의 무색 발포체(0.300 g, 정량적)로서 수득되었다. 1 H NMR(D20): δ 4.89(d, J=1.4 Hz, 1H, H-1), 4.02(dd, J=7.1, 3.2 Hz, 1H, CHCO2 -), 3.99(dd, J=3.4, 1.6 Hz, 1H, H-), 3.89(dd, J=9.5, 3.4 Hz, 1H), 3.79(dd, J=12.2, 3.1 Hz, 1H, H-), 3.74-3.61(m, 5H) ppm. 13 C NMR(CDCl3): δ 100.8, 80.6(C-1), 73.2, 70.5, 70.1, 66.5, 62.5, 60.5 ppm.
실험 44. 다이메틸(2S)-2-O-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-6-O-클로로아세틸-2-데옥시-α-D-글루코피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(162)의 합성
CH2Cl2:Et20(1:4, 20 mL) 내 티오글루코시드 도너 91(0.750 g, 1.32 mmol), 메틸(S)-말레이트 134(0.197 mL, 1.52 mmol) 및 4Å MS의 현탁액을 상온에서 1시간 동안 교반하고, 그다음 0℃로 냉각하였다. CH 2Cl2:Et20(1:1, 20 mL) 내 N-요오도숙신이미드(0.594 g, 2.64 mmol) 및 TfOH(0.027 mL)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 출발 물질의 완전한 전환 이후에, 10% Na2S2O3 수용액(20 mL) 및 NaHCO3의 포화 수용액(10 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 CH2Cl2(3x20 mL)로 추출하고, 유기상을 모아 건조하고(MgS04), 여과하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 조질의 생성물을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/Hex)로 정제하여 점성의 무색 발포체(0.672 g 84 %)로서 생성물 162를 제공하였다.
실험 45. 메틸(2S)-2-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-2-데옥시-α-D-글루코피라노실) 프로파노에이트(163)의 합성
MeOH 내 NaOMe 1N의 용액(0.46 mL, 0.46 mmol)을, 0℃에서 MeOH(5 mL) 내 화합물 95(0.470 g, 0.77 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 수용액으로 중화하였다. 수성상을 EtOAc로 추출하고 유기 추출액을 모아 건조시키고(MgS04), 여과하고, 용매를 제거하였다. 조질의 생성물을 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(30:70, EtOAc/Hex)에 의해 정제하여 화합물 163(0.355 g, 98%)을 점성의 무색 검으로서 제공하였다.
실험 46. 메틸 2-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-2-데옥시-α-D-글루코피라노실) 아세테이트(164)의 합성
실험 45의 절차를 화합물 96(0.500 g, 0.94 mmol)에 적용하여, 화합물 164를 점성의 무색 검(0.393 g, 92 %)으로서 제공하였다.
실험 47. 메틸(2R)-3급-부틸다이메틸실릴-3-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-2-데옥시-α-D-글루코피라노실)-2,3-다이하이드록시로파노에이트(165)의 합성
TBAF(THF 내 1M; 1.14 mL, 1.14 mmol)를 상온에서 THF(7 mL) 내 화합물 97(0.830 g, 1.03 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하고, 그다음 물을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 건조하고(MgS04), 농축하여 황색 점성의 잔사를 제공하였다. 실리카 겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(50:50, EtOAc/헥산)로 정제하여 알콜을 점성의 무색 검(0.401 g, 72%)으로서 제공하였다. 실험 45의 절차는 알콜(0.296 g, 0.55 mmol)에 적용하여 화합물 165를 점성의 무색 검(0.261 g, 92 %)으로서 제공하였다.
실험 48. 다이메틸(2S)-2-O-(2-아지도-3,4,다이-O-벤질-2-데옥시-α-D-글루코피라노실)-2-하이드록시숙시네이트(166)의 합성
실험 45의 절차를 화합물 162(0.670 g, 1.10 mmol)에 제공하여, 화합물 166을 점성의 무색 검(0.429 g, 73%)으로서 제공하였다.
실시예 2: 3개의 모델 단백질에서의 실시예 1의 양립 용질의 단백질 안정화 효과
열 스트레스에 대한 3개의 모델 단백질을 안정화시키는 신규한 합성 유사체의 능력을 시차 주사 형광측정법(DSF)을 사용하여 평가하였다. 이 연구에서, 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임을 모델 단백질로서 사용하였고, 합성 화합물의 안정화 효과를 천연 용질, 예를 들어 MG와 GG 뿐만 아니라 염화 칼륨, 및 다른 이전의 합성된 비-천연 용질, 예를 들어 MGlyc 및 ML의 효과와 비교하였다.
테스트한 화합물은 표 6 및 7에 나타냈다.
DSF 기반 안정도 분석은 각각의 단백질 작업 pH에서 수행되었고, 상이한 용질 농도에서, 용질의 존재 및 부재(대조군 실험)하에서 융점(TM)이 측정되었다. 각각의 분석에 대한 변성 곡선이 분석되었고, 융점은, 단백질-풀림 전이(protein-unfolding transition)의 중간 온도에 해당하는 1차 도함수의 계산에 의해 측정되었다. 용질의 부재하에서, 말레이트 탈수소효소(MDH), 포도상구균의 뉴클레아제(SNase) 및 라이소자임은 각각 50℃, 52℃ 및 71℃의 융점을 갖는다. 풀림 온도 쉬프트(ΔTM)는, 대조군(용질의 부재) 실험의 TM 값과, 용질의 존재하에서 수득된 TM 값을 비교함으로써 계산되었다. 양의 ΔTM 값은 TM의 증가와 연관되며 이는 단백질이 보다 안정하며 이것을 풀리게 하기 위해서 보다 많은 에너지(열)가 필요함을 의미한다. TM의 감소에 해당하는 음의 ΔTM이란, 단백질이 덜 안정함을 의미한다.
합성 및 천연 용질의 존재하에서 유도된 3개의 효소의 융점의 증가분(ΔTM)을 하기 도 1에 도시한다.
상이한 글루코스 유도체(도 2) 및 갈락토스(도 3)의 분석은, 헥소스에 부착된 비-글리코시드 기의 중요성을 나타냈다.
당 구조의 중요성과 관련하여, 상이한 락테이트(도 4) 및 말레이트 유도체(도 5)가 분석되었다.
MDH의 융점의 증가분 대 SNase 및 라이소자임의 증가분을 도면을 그리면(도 2 내지 5), 결과의 전체적인 관점이 나타난다.
테스트된 단백질에 대한 일반적인 결론:
- 하전된 화합물이 보다 우수한 안정화제이다.
- 말레이트(최고) 및 락테이트 유도체는 보다 높은 안정화를 제공한다.
- 비-당 모이어티는, 헥소스 구조보다 안정화 영향에 보다 큰 영향을 미친다.
- 글루코스 및 갈락토스 유도체는 보다 우수한 안정화제이다.
라이소자임에 대한 칼륨 아세테이트 염(AcOK)의 안정화 효과는 하이퍼용질 (hypersolute)과 함께 연구하였다(도 6). 그 결과는, AcOK 단독은 우수한 안정화제가 아니며 단지 높은 염 농도에서만 안정화시킴을 나타낸다. 그러나, 하이퍼용질과 함께 하면, 그의 안정화 특성이 개선될 수 있다.
안정화 효과에 대한 당의 글리코시드 연결의 중요성을 측정하기 위해서, D- 및 L-갈락토실 글리세레이트의 상이한 α 및 β 아노머가 연구되었다(도 7). 3종의 효소에 대해 수득된 결과는, L-글리세레이트가 천연 D-글리세레이트 유도체에 비해 우수한 안정화제라는 점, 및 β-아노머는 β 구조를 갖는 것보다 보다 우수한 안정화제라는 점을 나타낸다.
용질의 농도에 대한 융점의 증가분의 의존성을 연구하기 위해서, 단백질은 상이한 용질의 농도 - 0.1M, 0.25M 및 0.5M에서 테스트하였다(도 8, 도 9, 및 도 10). 3개의 단백질에 대해, 결과는, 안정화도와는 무관하게, 안정화 효과는 용질의 농도에 직접적으로 비례한다는 점을 나타냈다. 수득된 결과는 일반적인 경향을 따르는 것으로 보이지만, SNase의 경우(도 8) 및 라이소자임의 경우(도 10)를 보다 밀접하게 관찰하면, α-갈락토실 말레이트가 명백하게 우수한 안정화제이다. MDH의 결과는 글루코실 말레이트가 이 효소에 대해 우수한 안정화제임을 나타냈다.
재료
만노실글리세레이트(MG), 글루코실글리세레이트(GG), 글루코실글루코실글리세레이트(GGG), 만노실 글리콜레이트(MGly) 및 만노실 락테이트(ML)는 문헌(코스타 1998)에서 기술한 바와 같은 화학 합성에 의해 수득되었다. 신규한 합성 화합물은, 실시예 1에 기술된 바와 같은 화학 합성에 의해 수득되었다. 목적하는 화합물은, 물로 용리되는 세파덱스 G-10 컬럼 상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 순수한 화합물을 함유하는 분획을 모아, 동결 건조시켰다. 화합물의 순도 및 농도는 D2O에서 500 MHz 스펙트로미터에서 수득된 1H NMR 스펙트럼에 의해 평가되었다. 정량적인 목적을 위해서, 농도 표준으로서 폼에이트를 사용하여, 60초의 반복 지연과 함께, 스펙트럼이 수득되었다. 98% 초과의 순도를 갖는 샘플만이 사용되었다. 돼지 심장(MDII)으로부터의 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소는 로슈(Roche)로부터 구입하고, 달걀의 백색 라이소자임은 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 이들 효소들은 추가의 정제 없이 사용되었다. 재조합 포도상구균의 뉴클레아제 A(SNase)가 패리아 2008에 의해 설명된 바와 같이 대장균속 콜라이로부터 준비되고 정제하였다. 단백질 농도는, MDH의 흡광 계수인 0.28(mg/mL)-1cm-1, 라이소자임에 대해서는 2.58(mg/mL)-1cm-1, 및 SNase에 대해서는 0.93(mg/mL)-1cm-1을 사용하여, 280nm에서의 UV 흡광도에서 측정하였다.
DSF 분석
단백질 융점(TM) 측정은, 플루오로탐침자 시프로(SYPRO) 주황색 염료(모러큘러 프로브(Molecular Probes))를 사용하여 단백질 풀림을 모니터링함으로써 수행되었는데, 이는, 수성 환경에서 완전히 소광(quench)되더라도, 단백질 소수성 패치에 결합되면 형광발광을 방출한다. 이러한 형광발광의 증가는 시차 주사 형광측정법을 사용하여 온도의 함수로서 측정될 수 있다. 총 체적이 20 μL인 전형적인 분석에서, 0.14 내지 0.21 mg/mL의 단백질 농도, 및 5배의 염료 농도는 우수한 신호 대 노이즈 비를 보장하기 위해 사용되었다. SNase 또는 MDH의 단백질 스탁 용액은 포스페이트 완충제(나트륨 포스페이트의 20 mM, pH 7.6)에서 제조하고, 라이소자임은 시트레이트 완충액(40 mM 나트륨 시트레이트, 110 mM NaCl, pH 6.0)에서 제조하였다. 이러한 스탁 용액은 분석하기 이전에 동일한 완충액에 대해 광범위하게 투석되었다. 단백질 농도인 약 1.9 μM은 MDH에 대해 사용하였고, SNase에 대해서는 12.4 μM, 라이소자임에 대해서는 13 μM이 사용되었다. 용질 용액은, 개별적인 농도로 물에서 제조되었다. 분석은, 2 μL의 단백질을 8 L의 염료 완충제 용액, 및 10 μL의 용질 용액에 첨가함으로써 제조되되, 용질 용액을 제외하면, 모두 단백질 정제 완충제에서 제조되었다. 형광발광 세기 대 온도는, 정확한 전이 변곡점을 추출하기 위해서 1차 도함수(d(Rfu)/dT)를 측정함으로써 단백질 융점(TM)을 계산하기 위해서 사용되었다.
실시예 3: 돼지 인슐린에 대한 실시예 1의 6종의 양립 용질의 안정화 효과
갈락토실 락테이트 143, 갈락토실 부티레이트 149, 갈락토실 글리세레이트 146, 글루코실 부티레이트 148, 글루코실 글리콜레이트 144, 및 글루코실 말레이트 150의 돼지 인슐린을 안정화시키는 능력은 실시예 2에서 기술한 DSF 분석을 사용하여 연구하였다.
분석을 위해서, 129 μM 농도의 돼지 인슐린, 및 0.1 및 0.25 M의 농도의 양립 용질을 포함하는 용액을 제조하였다. 0.1 M 및 0.25 M에서 각각의 용질에 대해 관찰된 융점의 증가분을 도 11에 나타냈다.
글루코실 글리콜레이트 및 글루코실 말레이트를 포함하는, 테스트된 둘 다의 농도에서의 모든 6종의 용질 안정화된 돼지 인슐린은, 융점에서의 최고 증가분을 제공하였다.
논의
열-유도된 불활성화에 대한 모델 단백질의 보호에서의 신규한 화합물의 영향은, DSF를 사용하여, 천연 용질, 예를 들어 MG와 GG 뿐만 아니라 염화 칼륨, 및 기타 이전의 합성된 비-천연 용질, 예를 들어 MGlyc 및 ML와 비교하면서, 평가하였다. DSF는, 분자의 안정화 특성에 대한 신속한 정보를 수득하기 위한 우수한 높은-처리량 방법임이 밝혀졌다.
수득된 결과의 분석은, 안정화 효과가 일반적이지 않고, 특정 단백질-용질 상호작용에 크게 의존함을 나타냈다. 일부 용질은 우수한 열안정화 특성을 나타내지만, 안정화도는 각각의 단백질에 대해 상이하였다.
전하의 존재는, 안정화 효과를 위한 가장 중요한 특징부이다. 하전되지 않은 용질, 예를 들어 글루코사민 사이클릭 유도체는, 가장 낮은 안정화를 제공하고, 이중 하전을 보유한 말레이트 유도체는 우수한 안정화제이다.
상이한 헥소스의 사용과 관련하여, 글루코스 및 갈락토스 유도체는, 각각의 만노스 및 N-아세틸글루코사민 유도체에 비해 우수한 안정화제였다. 그러나, 결과는, 당에 부착된 기가 당의 특성에 비해 안정화 영향에 대해 보다 영향을 미침을 나타냈다.
갈락토실 글리세레이트의 α 및 β 아노머를 사용하여 수득된 결과는, α 유도체가 우수한 안정화제임을 나타낸다.
본원에 기술된 신규한 화합물은 부가적인 단백질 뿐만 아니라 기타 생물학적 물질을 안정화시킬 것으로 예상되었다. 따라서, 본 발명의 신규한 화합물은 약학 제품, 예를 들어 생물학 제품, 예를 들어 항체와 호르면, 화장품, 식품 등에 사용되는 생물학적 물질의 안정화를 위해 유용하다. 본 발명의 화합물은 온도 스트레스, 응집, 및 높은 염분에 대해 생물학적 물질을 보호하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은, 가공, 예를 들어 정제, 배합 및/또는 건조, 수송 및 저장 동안 생물학 제품을 안정화시키기 위해서 사용될 수 있다.
참고문헌
Claims (37)
- 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염:
[화학식 I]
상기 식에서,
R1은 -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH이고;
R2는 -OH, -N3, 또는 -N(H)C(=O)CH3 이거나;
R1 및 R2는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 을 형성하되, R3은 -H, -CH3, -CH2C(=O)OH, 또는 -CH2OH이고;
X는 -H, -CH3, -CH2OH, 또는 CH2C(=O)OH이고;
n은 0 또는 1이고;
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH3이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 H이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH2OH이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이고,
상기 화합물이 이고 R2가 OH이고 X가 CH2OH이고 n이 0이면, 상기 화합물은 이다. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 화합물이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 화합물이 인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 화합물이 인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 화합물이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물의 α/β 아노머 비가 1:1 내지 99:1인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물의 α/β 아노머 비가 99:1 초과인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
R1이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 8 항에 있어서,
R1이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 8 항에 있어서,
R1이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 8 항에 있어서,
R1이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
R2가 -OH인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
R2가 -N(H)C(=O)CH3인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
R1과 R2가, 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 를 형성하는, 화합물 또는 그의 염. - 제 14 항에 있어서,
R1과 R2가, 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 를 형성하는, 화합물 또는 그의 염. - 제 14 항에 있어서,
R1과 R2가, 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 를 형성하는, 화합물 또는 그의 염. - 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
R3이 -CH3인, 화합물 또는 그의 염. - 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
R3이 -CH2OH인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항에 있어서,
상기 화합물이
인, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물 또는 그의 염, 및 생물학적 물질을 포함하는 조성물.
- 제 20 항에 있어서,
완충제를 추가로 포함하는, 조성물. - 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
상기 생물학적 물질이 폴리펩티드인, 조성물. - 제 22 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 효소, 항체, 혈장 단백질, 또는 호르몬인, 조성물. - 제 22 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 인슐린, 말레이트 탈수소효소, 포도상구균의 뉴클레아제 또는 라이소자임인, 조성물. - 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 재조합 폴리펩티드인, 조성물. - 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 재조합 폴리펩티드가 아닌 것인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물 또는 그의 염을, 생물학적 물질을 함유하는 용액에 첨가하여 안정화된 용액을 형성함을 포함하는, 생물학적 물질의 안정화 방법.
- 제 27 항에 있어서,
상기 안정화된 용액을 건조시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
상기 생물학적 물질이 폴리펩티드인, 방법. - 제 29 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가, 효소, 항체, 혈장 단백질, 또는 호르몬인, 방법. - 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 인슐린, 말레이트 탈수소효소, 포도상구균의 뉴클레아제 또는 라이소자임인, 방법. - 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 재조합 폴리펩티드인, 방법. - 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 재조합 폴리펩티드가 아닌 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 물질을 안정화시키기 위한, 화합물 또는 그의 염. - 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 염의, 생물학적 물질의 안정화를 위한 용도.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 염을 포함하는, 진단 키트.
- 제 36 항에 있어서,
마이크로어레이, 바이오센서, 또는 효소 제제(enzymatic preparation)를 포함하는, 진단 키트.
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