RU2731563C2 - Производные гексозы, их получение и применение - Google Patents

Производные гексозы, их получение и применение Download PDF

Info

Publication number
RU2731563C2
RU2731563C2 RU2016140337A RU2016140337A RU2731563C2 RU 2731563 C2 RU2731563 C2 RU 2731563C2 RU 2016140337 A RU2016140337 A RU 2016140337A RU 2016140337 A RU2016140337 A RU 2016140337A RU 2731563 C2 RU2731563 C2 RU 2731563C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
compound
mmol
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
experiment
Prior art date
Application number
RU2016140337A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016140337A (ru
RU2016140337A3 (ru
Inventor
МЭЙКОК Кристофер ДЭВИД
БОРДАЛУ ВЕНТУРА СЕНТЕНУ ЛИМА Мария Рита МЕНДЕШ
ЛОРЕНСУ Эва КОРРЕЯ
ДУЖ САНТОШ Мария Элена ДИАШ
КУНЬЯ МИГЕЛ Ана София ДА
Original Assignee
Факулдади Ди Сиенсиас Да Универсидади Ди Лисбоа
Институто Ди Тешноложиа Кимика И Биоложика Антониу Шавьер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Факулдади Ди Сиенсиас Да Универсидади Ди Лисбоа, Институто Ди Тешноложиа Кимика И Биоложика Антониу Шавьер filed Critical Факулдади Ди Сиенсиас Да Универсидади Ди Лисбоа
Publication of RU2016140337A publication Critical patent/RU2016140337A/ru
Publication of RU2016140337A3 publication Critical patent/RU2016140337A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2731563C2 publication Critical patent/RU2731563C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H9/00—Compounds containing a hetero ring sharing at least two hetero atoms with a saccharide radical
    • C07H9/06—Compounds containing a hetero ring sharing at least two hetero atoms with a saccharide radical the hetero ring containing nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Abstract

Изобретение относится к соединению, его фармацевтически приемлемой соли, композиции на его основе и способу с его использованием в промышленности для стабилизации ферментов, где соединение характеризуется одной из формул:
Figure 00000172
,
где R1 представляет собой
Figure 00000173
R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3;
Figure 00000174
,
где R1 представляет собой -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH; R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3; X представляет собой -CH3, -CH2OH или CH2C(=O)OH; n равен 0 или 1;
Figure 00000175
,
где R1 представляет собой -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH; R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3; и X представляет собой -H или CH2C(=O)OH; n равен 0 или 1; R1 представляет собой
Figure 00000176
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000177
и R2 представляет собой OH, X представляет собой H и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000178
; и
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000179
и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH и n равен 0, тогда соединение представляет собой
Figure 00000180
.
Предложены новые соединения и композиции на их основе, эффективные для стабилизации полипептида, фермента, антитела, белка плазмы, гормона, инсулина, малатдегидрогеназы, стафилококковой нуклеазы или лизоцима. 6 н. и 23 з.п. ф-лы, 51 пр., 7 табл., 11 ил.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке США № 61/953392, поданной 14 марта 2014 г., содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.
По всему описанию имеются ссылки на различные публикации, включая приведенные в скобках. Полное содержание ссылок на публикации, указанных в скобках, можно найти в перечне ссылок, приведенном в алфавитном порядке в конце данного описания, непосредственно перед формулой изобретения. Содержание всех ссылочных публикаций во всей их полноте включены в настоящее описание посредством ссылки в предложенном порядке для того, чтобы более полно описать уровень техники в области, к которой относится настоящее изобретение.
Предпосылки создания изобретения
Низкомолекулярные органические соединения, называемые совместимыми осмолитами, были идентифицированы в цитоплазме многих галофильных или галотолерантных организмов, которые уравновешивают осмотическое давление внешней среды, и которые способствуют правильной укладке белков, ингибируют агрегацию белка и предотвращают вызванную теплом денатурацию (Faria 2008, Faria 2013). Поэтому, совместимые осмолиты полезны в промышленном масштабе, например, для стабилизации белков в фармацевтических и косметических составах (Luley-Goedl 2011, Lentzen 2006).
Совместимыми осмолитами обычно являются аминокислоты, углеводы, полиолы, бетаины и эктоины. Трегалоза, глицерин, глицин, бетаин и эктоин являются обычными совместимыми осмолитами мезофилов. Открытие экстремальных термофильных и гипертермофильных микроорганизмов привело к открытию дополнительных совместимых осмолитов, таких как маннозилглицерат (MG) и ди-мио-инозитол-1,3ʹ-фосфат (Faria 2008).
Соединения, структурно относящиеся к MG, называемые (2S)-2-(1-O-α-D-маннопиразил)пропионатом (ML), 2-(1-O-α-D-маннопиразил)ацетатом (MGlyc), 1-O-(2-глицерил)-α-D-маннопиранозидом (MGOH), были синтезированы и протестированы на их способность стабилизировать модель белков против теплового стресса. (Faria 2008).
Существует потребность в новых соединениях для стабилизации биологических материалов.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложено соединение формулы I:
Figure 00000001
Формула I
или его соль, где:
R1 представляет собой -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH;
R2 представляет собой -OH, -N3 или -N(H)C(=O)CH3; или
R1 и R2, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют
Figure 00000002
;
R3 представляет собой -H, -CH3, -CH2C(=O)OH или -CH2OH;
X представляет собой -H, -CH3, -CH2OH или CH2C(=O)OH; и
n равен 0 или 1;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000003
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH3, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000004
;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000005
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой H, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000006
;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000007
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000008
;
и в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000009
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000010
.
В настоящем изобретении дополнительно предложена композиция, содержащая по меньшей мере одно соединение формулы I или его соль и биологический материал.
В настоящем изобретении дополнительно предложен способ стабилизации биологического материала, включающий добавление по меньшей мере одного соединения формулы I или его соли к раствору, содержащему биологический материал, с получением стабилизированного раствора.
В настоящем изобретении дополнительно предложено соединение формулы I или его соль для стабилизации биологического материала.
В настоящем изобретении дополнительно предложено применение соединения формулы I или его соли для стабилизации биологического материала.
Краткое описание фигур
Фиг.1: Приращение температуры плавления (TM) малатдегидрогеназы (MDH, серые полосы), стафилококковой нуклеазы (SNase, черные полосы) и лизоцима (белые полосы) в присутствии 0,5М различных осмолитов. Температуры плавления (TM) в отсутствие осмолитов составляли 50°C для MDH, 52°C для SNase и 71°C для лизоцима.
Фиг.2: Стабилизирующий эффект различных производных глюкозы против тепловой денатурации малатдегидрогеназы (MDH), стафилококковой нуклеазы (SNase) и лизоцима. На оси абсцисс отложено приращение температуры плавления MDH, индуцированное несколькими 0,5М соединениями, и на оси ординат отложено приращение температуры плавления SNase (закрашенные обозначения) и лизоцима (незакрашенные обозначения).
Фиг.3: Стабилизирующий эффект различных производных галактозы против термической денатурации малатдегидрогеназы (MDH), стафилококковой нуклеазы (SNase) и лизоцима. На оси абсцисс отложено приращение температуры плавления MDH, индуцированное некоторыми 0,5М соединениями, и на оси ординат отложено приращение температуры плавления SNase (закрашенные обозначения) и лизоцима (незакрашенные обозначения).
Фиг.4: Стабилизирующий эффект различных производных лактата против термической денатурации малатдегидрогеназы (MDH), стафилококковой нуклеазы (SNase) и лизоцима. На оси абсцисс отложено приращение температуры плавления MDH, индуцированное некоторыми 0,5М соединениями, и на оси ординат отложено приращение температуры плавления SNase (закрашенные обозначения) и лизоцима (незакрашенные обозначения).
Фиг.5: Стабилизирующий эффект различных производных малата против термической денатурации малатдегидрогеназы (MDH), стафилококковой нуклеазы (SNase) и лизоцима. На оси абсцисс отложено приращение температуры плавления MDH, индуцированное некоторыми 0,5М соединениями, и на оси ординат отложено приращение температуры плавления SNase (закрашенные обозначения) и лизоцима (незакрашенные обозначения).
Фиг.6: Стабилизирующий эффект в зависимости от концентрации только AcOK и в конъюгации с различными гиперосмолитами (0,5M).
Фиг.7: Стабилизирующий эффект различных производных галактозилглицерата против термической денатурации малатдегидрогеназы (MDH), стафилококковой нуклеазы (SNase) и лизоцима. На оси абсцисс отложено приращение температуры плавления MDH, индуцированное некоторыми 0,5М соединениями, и на оси ординат отложено приращение температуры плавления SNase (закрашенные обозначения) и лизоцима (незакрашенные обозначения).
Фиг.8: Зависимость температуры плавления SNase от концентрации осмолитов.
Фиг.9: Зависимость температуры плавления MDH от концентрации осмолитов.
Фиг.10: Зависимость температуры плавления лизоцима от концентрации осмолитов.
Фиг.11: Приращение температуры плавления свиного инсулина, полученное для различных осмолитов при 0,1 и 0,25М. Левая полоса для каждого осмолита показывает результат при 0,25М, и правая полоса показывает результат при 0,1М.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании использовали следующие аббревиатуры.
Ac Ацетат
BnBr Бензилбромид
DIP ди-мио-инозитфосфат
DGP ди-глицеринфосфат
DMAP 4-Диметиламинопиридин
ДМФА Диметилформамид
DSF Дифференциальная сканирующая флуориметрия
Et этил
Et2O Простой диэтиловый эфир
EtOAc Этилацетат
GG α-D-Гликозил-D-глицерат
GGG α-D-глюкопиранозил-(1→6)-α-D-глюкопиранозил-(1→2)-D-глицерат
GL α-D-Гликозил-S-лактат
Hex Гексан
MDH Малатдегидрогеназа
Me Метил
MeOH Метанол
MG α-D-Маннозил-D-глицерат
MGA α-D-Маннозил-D-глицерамид
MGG α-D-Маннопиразил-(1→2)-α-D-глюкопиранозил-(1→2)-D-глицерат
MGly α-D-Маннозилгликолят
MGGly (2R)-2-(1-O-α-D-маннопиразил)-3-(1-O-α-D-глюкопиранозил)глицерат
ML α-D-Маннозил-S-лактат
NaOMe Метоксид натрия
NIS N-Йодсукцинимид
ЯМР Ядерно-магнитный резонанс
Ph Фенил
ТСХ Тонкослойная хроматография
SNase Стафилококковая нуклеаза
TBAF Тетра-н-бутиламмонийфторид
TBDPSCl трет-бутилхлордифенилсилан
TBDMS трет-бутилдиметилсилан
TfOH Трифторметансульфоновая кислота
ТГФ Тетрагидрофуран
В настоящем изобретении предложено соединение формулы I:
Figure 00000001
Формула I
или его соль, где:
R1 представляет собой -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH;
R2 представляет собой -OH, -N3 или -N(H)C(=O)CH3; или
R1 и R2, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют
Figure 00000002
;
R3 представляет собой -H, -CH3, -CH2C(=O)OH или -CH2OH;
X представляет собой -H, -CH3, -CH2OH или CH2C(=O)OH; и
n равен 0 или 1;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000003
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH3, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000004
;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000005
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой H, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000006
;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000007
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000008
;
и в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000009
, и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000010
.
В одном из вариантов осуществления данным соединением не являются
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
или их соль.
В одном из вариантов осуществления соединение формулы I не является существующим в природе соединением.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представляет собой
Figure 00000014
,
Figure 00000015
или
Figure 00000016
или его соль.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представляет собой
Figure 00000017
или его соль.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представляет собой
Figure 00000018
или его соль.
В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой
Figure 00000019
или его соль.
В одном из вариантов осуществления соотношение α/β аномеров соединения или его соли составляет 1:1-99:1. В одном из вариантов осуществления соотношение α/β аномеров соединения или его соли составляет 1:1-10:1. В одном из вариантов осуществления соотношение α/β аномеров соединения или его соли составляет 1:1-5:1. В другом варианте осуществления соотношение α/β аномеров соединения или его соли составляет 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1. В одном из вариантов осуществления соотношение α/β аномеров соединения или его соли составляет больше, чем 10:1. В одном из вариантов осуществления соотношение α/β аномеров соединения или его соли больше, чем 99:1. В одном из вариантов осуществления данное соединение или его соль представляет собой α-аномер.
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000020
или
Figure 00000021
.
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000022
Figure 00000023
или
Figure 00000024
.
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000025
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000026
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000027
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000028
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000029
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000030
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000031
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000032
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000033
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000034
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000035
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000036
В одном из вариантов осуществления R1 представляет собой
Figure 00000037
В одном из вариантов осуществления, когда асимметрический центр присутствует в R1, данное соединение представляет собой смесь двух энантиомеров.
В одном из вариантов осуществления, когда асимметрический центр присутствует в R1, данное соединение представляет собой S энантиомер.
В одном из вариантов осуществления, когда асимметрический центр присутствует в R1, данное соединение представляет собой R энантиомер.
В одном из вариантов осуществления R2 представляет собой -OH.
В одном из вариантов осуществления R2 представляет собой N3.
В одном из вариантов осуществления R2 представляет собой -N(H)C(=O)CH3.
В одном из вариантов осуществления R1 и R2, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют
Figure 00000002
.
В одном из вариантов осуществления R1 и R2, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют
Figure 00000038
.
В одном из вариантов осуществления R1 и R2, вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют
Figure 00000039
.
В одном из вариантов осуществления R3 представляет собой -H.
В одном из вариантов осуществления R3 представляет собой -CH3.
В одном из вариантов осуществления R3 представляет собой -CH2C(=O)OH.
В одном из вариантов осуществления R3 представляет собой -CH2OH.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представляет собой
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000048
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
или его соль.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представляет собой любое из соединений предшествующего варианта осуществления или его соль.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представлено в форме соли.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представлено в форме фармацевтически приемлемой соли.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представлено в форме калиевой соли.
В одном из вариантов осуществления данное соединение представлено в форме натриевой соли.
В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению или его соль и биологический материал.
В одном из вариантов осуществления композиция представляет собой жидкость. В одном из вариантов осуществления композиция представляет собой твердое вещество. В одном из вариантов осуществления композиция является лиофилизированной. В одном из вариантов осуществления композиция высушена вымораживанием.
В одном из вариантов осуществления композиция представляет собой жидкость, и по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению присутствует в композиции в концентрации 0,01-1M. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению присутствует в концентрации 0,1-0,5М. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению присутствует в концентрации 0,01-1М. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению присутствует в композиции в концентрации 0,1М, 0,2М, 0,25М, 0,3М, 0,4М или 0,5М.
В одном из вариантов осуществления композиция представляет собой твердое вещество, которое получают сушкой жидкой композиции по настоящему изобретению.
В одном из вариантов осуществления композиция содержит по меньшей мере один совместимый осмолит в дополнение к по меньшей мере одному соединению по настоящему изобретению. По меньшей мере один совместимый осмолит, например, может быть по меньшей мере одним другим совместимым осмолитом, известным в данной области техники. В композициях, имеющих по меньшей мере один другой совместимый осмолит и/или более чем одно соединение по настоящему изобретению, количество другого совместимого осмолита и/или количество каждого соединения по настоящему изобретению, необходимое для стабилизации биологического материала, может быть меньше, чем количество только каждого агента, необходимое для стабилизации биологического материала.
В одном из вариантов осуществления композиция дополнительно содержит одну или более солей в дополнение к по меньшей мере одному соединению по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления одна или более дополнительных солей являются фармацевтически приемлемыми солями. В одном из вариантов осуществления одна или более солей включают ацетат калия.
В одном из вариантов осуществления композиция является фармацевтической композицией, косметическим или пищевым продуктом.
В одном из вариантов осуществления биологический материал представляет собой нуклеиновую кислоту, полипептид, цельную клетку, вирус, вирусоподобную частицу, клеточную мембрану, клеточный компонент, липосому, ткань или смесь любого из перечисленного выше. В одном из вариантов осуществления биологический материал включает один, два, три или более видов биологического материала.
В одном из вариантов осуществления биологический материал представляет собой один или более типов нуклеиновых кислот. В одном из вариантов осуществления нуклеиновой кислотой является РНК, ДНК или смесь РНК и ДНК. В одном из вариантов осуществления РНК представляет собой одноцепочечную РНК. В одном из вариантов осуществления РНК является двухцепочечной. В одном из вариантов осуществления РНК представляет собой мРНК. В одном из вариантов осуществления РНК представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. В одном из вариантов осуществления ДНК является двухцепочечной. В одном из вариантов осуществления ДНК является одноцепочечной.
В одном из вариантов осуществления биологический материал представляет собой один или более видов цельных клеток.
В одном из вариантов осуществления биологическим материалом является полипептид.
В одном из вариантов осуществления полипептид представляет собой фермент, антитело, белок плазмы или гормон.
В одном из вариантов осуществления полипептид представляет собой инсулин, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу или лизоцим. В одном из вариантов осуществления полипептидом является инсулин.
В одном из вариантов осуществления полипептидом является рекомбинантный полипептид. В одном из вариантов осуществления полипептид выделен из дрожжей или культуры клеток млекопитающих.
В одном из вариантов осуществления полипептидом является нерекомбинантный полипептид. В одном из вариантов осуществления полипептид выделен из растения, животного, грибов или бактерии. В одном из вариантов осуществления полипептидом является полипептид, выделенный из сыворотки животного или человека.
В одном из вариантов осуществления композиция дополнительно содержит буфер.
В настоящем изобретении предложен способ стабилизации биологического материала, включающий добавление по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению или его соли к раствору, содержащему биологический материал, с получением стабилизированного раствора.
В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает стадию сушки стабилизированного раствора.
В одном из вариантов осуществления сушка представляет собой сушку спреем или лиофилизацию.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению или его соль выбирают на основе свойств биологического материала для стабилизации. Например, если биологическим материалом является белок, соединение по настоящему изобретению или комбинация соединений по настоящему изобретению может быть выбрана на основе гидрофобности и/или гидрофильности поверхности данного белка.
В настоящем изобретении предложено соединение по настоящему изобретению или его соль для стабилизации биологического материала.
В настоящем изобретении предложено применение соединения по настоящему изобретению или его соли для стабилизации биологического материала.
В одном из вариантов осуществления стабилизация представляет собой защиту биологического материала от денатурации. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является увеличение температуры плавления биологического материала. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является защита биологического материала от десикации. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является защита биологического материала от агрегации. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является защита биологического материала от нагревания. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является защита биологического материала от замораживания. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является защита биологического материала в ходе сушки. В одном из вариантов осуществления стабилизацией является увеличение срока хранения биологического материала.
В настоящем изобретении предложен диагностический набор, включающий соединение по настоящему изобретению или его соль.
В одном из вариантов осуществления диагностическим набором является микрочип, биосенсор или ферментативный препарат. В одном из вариантов осуществления микрочип, биосенсор или ферментативный препарат содержат иммобилизованный биологический материал. Совместимые осмолиты по настоящему изобретению могут быть использованы в способах, известных в данной области техники, в которых совместимые осмолиты полезны для повышения функционирования методов, использующих иммобилизованные биологические материалы. См., например, публикацию международной заявки PCT № WO/2007/097653.
В настоящем изобретении предложена косметическая или другая дерматологическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению или его соль и эксципиент, подходящий для местного введения людям или животным.
В одном из вариантов осуществления косметическая или дерматологическая композиция содержит один или более биологических материалов.
В настоящем изобретении предложены соединения, композиции, способы и применения, как описано выше, где соединение представляет собой любое из соединений, перечисленных в таблице 6 или 7, или его соль. Например, в настоящем изобретении предложена композиция для стабилизации биологического материала, содержащая одно или более соединений, перечисленных в таблицах 6 и 7, и биологический материал. В качестве другого примера, в настоящем изобретении предложен способ стабилизации биологического материала, включающий добавление по меньшей мере одного соединения из перечисленных в таблицах 6 и 7, или его соли, к раствору, содержащему биологический материал, с получением стабилизированного раствора.
Конкретные варианты осуществления и примеры, описанные в данном описании, являются иллюстративными, и многие варианты могут быть включены в эти варианты осуществления и примеры, не отходя от существа изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения. Элементы и/или признаки различных иллюстративных вариантов осуществления и/или примеров могут быть объединены друг с другом и/или заменять друг друга в объеме данного описания и пунктов прилагаемой формулы изобретения.
Каждый из вариантов осуществления, описанных в данном описании, применительно к или включая соединение по настоящему изобретению, в равной степени применим к соли данного соединения.
Для приведенных выше вариантов осуществления каждый вариант, раскрываемый в данном описании, рассматривается применительно к каждому другому из раскрытых вариантов осуществления.
Любой из диапазонов, представленных в настоящем описании, означает, что все количественные диапазоны десятых и целых чисел конкретно раскрыты как часть настоящего изобретения. Так, например, от 0,1М до 0,5М означает, что 0,1М, 0,2М, 0,3М, 0,4М, и 0,5М являются вариантами осуществления, входящими в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение будет более понятным при отсылке к примерам, которые следуют далее, предоставленным в помощь к пониманию существа изобретения, но не предназначены и ни в кое случае не должны рассматриваться в качестве ограничения прилагаемой ниже формулы изобретения.
Пример 1: Синтез новых совместимых осмолитов
Получали химическую библиотеку на основе производных сахара для того, чтобы определить новые органические соединения с повышенными стабилизационными свойствами белка. Вводили разнообразные аналоговые структуры с использованием различных гексоз, таких, как глюкоза, галактоза, монноза и глюкозамин, и с использованием гликозильных акцепторов реакции гликозилирования.
Аналоги галактозы и глюкозамина синтезировали в дополнение к маннозидам и глюкозидам для того, чтобы оценить вклад структуры сахара в эффект стабилизации. Насколько известно авторам, из гипертермофилов была выделена только одна галактоза, содержащая совместимый осмолит, β-галактопиранозил-5-гидроксилизин (GalHI) из Thermococcus litoralis:
Figure 00000052
Несколько аминокислот, подобно глутамату, пролину и глутамину, могут функционировать в качестве совместимых осмолитов во многих мезофильных организмах, и как α-, так и β-аминокислоты могут быть использованы для осмоадаптации (Costa 1998). Для того чтобы определить, будут ли аминогруппы или избыточный заряд способствовать эффекту стабилизации, синтезировали производные глюкозамина. Насколько известно авторам, из гипертермофилов был выделен только один глюкозамин, содержащий совместимый осмолит, ди-N-ацетилглюкозаминфосфат (DAGAP) из Rubrobacter xylanophilus:
Figure 00000053
(Empadinhas 2007).
DAGAP структурно одинаков с фосфодиэфирными совместимыми осмолитами, обнаруженными в гипертермофилах, подобно DIP или DGP, однако его роль в качестве совместимого осмолита получила опровержение из-за концентраций, которые являются слишком низкими, чтобы способствовать осмотическому балансу клетки.
Все гликозильные акцепторы, выбранные для этого исследования, заряжены и структурно относятся к глицератам с точки зрения модификаций, таких как, в известной степени, касательно атомов углерода, потери гидроксильной группы, дополнительных карбоксильных групп и конфигурации асимметричного центра, когда присутствуют:
Figure 00000054
Figure 00000055
Для синтеза производных глюкозы и галактозы, синтезировали тиогликозидные доноры 1 и 19. Результаты, полученные для реакции гликозилирования доноров 1 и 19 с гликозильными акцепторами, выше, использовали систему NIS/TfOH (Lourenco 2009) в дихлорметане, как описано в таблице 1. Все акцепторы были коммерчески доступны, за исключением производных метилглицерата 9 и 135, которые синтезировали согласно экспериментальной методике, сообщенной для D-серина (Lourenco 2009; Lok 1976).
Схема 1: Реакция гликозилирования с использованием тиогликозидных доноров 1 и 19
Figure 00000056
Реакции давали смесь аномеров для большинства гликозильных акцепторов. Это обеспечивало возможность протестировать α и β-аномеры отдельно, чтобы определить важность стереохимии аномерного положения для эффекта стабилизации. Тестирование проводили на примере галактозильных производных D/L-глицерата и малата.
Таблица 1
Результаты, полученные для реакции гликозилирования с тиогликозидными донорами 1 и 19
ROH Донор Продукт Выход α/β
4 1
Figure 00000057
 10 91 4:1
19
Figure 00000058
 32 87 3:1
7 1
Figure 00000059
 13 93 4:1
19
Figure 00000060
 34 95 3:1
9 19
Figure 00000061
 35 88 2:1
133 1
Figure 00000062
 136 84 9:1a
19
Figure 00000063
 137 95 3:1a
134 1
Figure 00000064
 138 94 7:1
19
Figure 00000065
 139 87 5:1
135 1
Figure 00000066
 140 98 >10:1
19
Figure 00000067
 141 88 2,6:1
а рассчитанное после удаления защиты с ацетатной группы.
После последовательного удаления защитных групп с использованием общих органических реакций, таких как метанолиз ацетатов, кислотный (HF) сольволиз силилового эфира в случае аналогов глицерата (соединения 35, 140 и 141) и гидролиз сложных эфирных групп (схема 2), получали желаемые продукты (таблица 2).
Схема 2: Общая схема удаления защиты для аналогов глюкозы и галактозы
Figure 00000068
Figure 00000069
Figure 00000070
Таблица 2
Конечные продукты и общие выходыa для производных глюкозы и галактозы
Номер соединения Конечный продукт Выход (%)a
10
Figure 00000071
 142 78
32
Figure 00000072
 143 83
13
Figure 00000073
 144 73
34
Figure 00000074
 145 77
35
Figure 00000075
 146 α
147 β		 61
21
136
Figure 00000076
 148 68
137
Figure 00000077
 149 86
138
Figure 00000078
 150 42
139
Figure 00000079
 151 α
152 β		 57
16
140
Figure 00000080
 153 60
141
Figure 00000081
 154 α
155 β		 43
14
a Рассчитанный для реакции гликозилирования.
В целом, продукты успешно получали с хорошими выходами, и α-аномер был основным продуктом. Хотя в некоторых случаях получали смесь α и β-аномеров (обогащенный α), их использовали для предварительного скринирования, где наиболее перспективные соединения затем тестировали по отдельности. Самые низкие выходы были получены для производных диметил-(S)-малата (150, 151 и 152, таблица 2) из-за использования основания при удалении ацетатов и при гидролизе метилового эфира, который способствует гидролизу в аномерном положении, путем элиминации малатной группы. Об этой проблеме сообщалось в литературе при синтезе бациллтиольных соединений (bacillithiol (BSH)) (Sharma 2011). Чтобы свести к минимуму элиминацию малатной группы, тщательно следили за сложноэфирным гидролизом со следами моноэфира в конечном продукте.
Для синтеза 1,2-транс маннозидов, применяли стратегию с участием C-2 ацильных соседних групп с использованием ацетатов в качестве защитных групп, и трихлорацетамидатов в качестве гликозильных доноров, которые являются относительно быстрыми в получении и экономичными. Реакция гликозилирования между маннозным трихлорацетимидатным донором 103 и гликозильными акцепторами, при использовании BF3OEt2 в качестве промотора, приводила, как и ожидалось, исключительно к получению α-продуктов. Результаты, полученные для реакции гликозилирования с маннозным донором 103, представлены в таблице 3.
Схема 3: Реакция гликозилирования с маннозным трихлорацетимидным донором 103
Figure 00000082
Таблица 3
Результаты, полученные для реакции гликозилирования с маннозным трихлорацетимидным донором 103
ROH Продукт Выход (%)
133
Figure 00000083
 156 91
134
Figure 00000084
 157 88
135
Figure 00000085
 158 73
Последовательное удаление защитных групп с использованием общих органических реакций (схема 4), обеспечивало желаемые продукты (таблица 4) с хорошими общими выходами.
Схема 4: Общая схема удаления защиты для маннозных аналогов
Figure 00000086
Figure 00000087
Таблица 4
Конечные продукты и общие выходыa для маннозных продуктов
Номер соединения Конечный продукт Общий выход (%)a
156
Figure 00000088
 159 73
157
Figure 00000089
 160 69
158
Figure 00000090
 161 50
a Рассчитанный для реакции гликозилирования
При гидролизе ацетатных групп и метилового эфира производного диметилманнозил-(S)-малата возникает та же самая проблема, как описано выше для глюкозы и производных галактозы.
1,2-цис производные глюкозамина синтезировали из 2-азидо-2-дезокситиоглюкозидного донора 90, и реакцию гликозилирования с гликозильными акцепторами проводили в смеси CH2Cl2/Et2O (4:1) при -10°C и с использованием NIS/TfOH в качестве промотора. Результаты представлены в таблице 5.
Схема 5: Реакция гликозилирования с 2-азидо-2-дезокситиоглюкозидным донором 90
Figure 00000091
Таблица 5
Результаты, полученные для реакции гликозилирования с 2-азидо-2-дезокситиоглюкозидным донором 90
ROH Продукт Выход (%) α/β
4
Figure 00000092
 95 86 8,7:1
7
Figure 00000093
 96 76 12:1
9
Figure 00000094
 97 84 >10:1
134
Figure 00000095
 162 86 1:0
α-Аномер был основным продуктом для всех использованных акцепторов. После метанолиза ацетатной группы и, в случае производного глицерата, кислотного (HF) сольволиза простого силилового эфира, каталитическое гидрирование бензильной группы при одновременном восстановлении азида способствовало формированию нежелательного циклического амида (схема 6). Этот эффект наблюдался только для α-аномеров.
Схема 6: Гидрирование производных 2-азидо-2-дезоксиглюкозида
Figure 00000096
Поскольку заряд имеет важное значение для эффекта стабилизации, для преодоления проблемы, возникавшей ранее при восстановлении азида с использованием реакции Штаудингера, последующая защита полученной в результате аминной группы ацетатом (схема 7) блокировала амин и предотвращала циклизацию. После удаления защитных групп и гидролиза метилового эфира, получали конечные производные N-ацетилглюкозамина.
Схема 7: Синтез производных N-ацетилглюкозамина
Figure 00000097
Figure 00000098
Подробности экспериментов
Эксперимент 1. Синтез этил 6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (1)
Синтез соединения 1 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в литературе (Lourenco 2009).
Эксперимент 2. Общая методика гликозилирования
Суспензию тиогликозидного донора (0,15 ммоль), акцептора (0,15 ммоль) и 4Å MS в растворителе/смеси указанных растворителей (1 мл) перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем охлаждали до 0°C. Добавляли N-йодсукцинимид (0,19 ммоль) и TfOH (0,9 мкл) при 0°C, и после завершения реакции (ТСХ), добавляли 10% водный раствор Na2S2O3 (2 мл) и насыщенный водный раствор NaHCO3 (1 мл), и полученную смесь экстрагировали CH2Cl2 (3×5 мл); объединенные органические фазы сушили (MgSO4), фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. Неочищенный продукт очищали препаративной ТСХ (3:7, EtOAc/Hex). Соотношение α/β выделенного продукта измеряли по спектру 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3).
Эксперимент 3. Синтез метил (2S)-2-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-глюкопиранозил)пропаноата (10)
Реакцию гликозилирования донора 1 с акцептором 4 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 4. Синтез метил 2-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-глюкопиранозил)ацетата (13)
Реакцию гликозилирования донора 1 с акцептором 7 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 5. Синтез этил 6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-1-тио-α/β-D-галактопиранозида (19)
К перемешиваемому раствору метил α-D-галактопиранозида (2,0 г, 10,3 ммоль) в ДМФА (20 мл) добавляли бензилбромид (6,3 мл, 51,5 ммоль). Полученную смесь охлаждали до 0°C и частями добавляли гидрид натрия (1,48 г, 61,8 ммоль). Полученную реакционную смесь выдерживали в течение ночи при комнатной температуре (к.т.), и после завершения преобразования исходных веществ добавляли MeOH при 0°C. Полученную смесь экстрагировали Et2O, и объединенные органические фазы сушили, фильтровали и концентрировали. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (10:90, EtOAc/Hex) приводила к получению продукт в виде вязкой бесцветной пены (5,14 г, 90%).
Концентрированную серную кислоту (1,0 мл) по каплям добавляли к перемешиваемому раствору метил тетра-O-бензилгалактопиранозида (5,72 г, 10,7 ммоль) в смеси уксусная кислота/уксусный ангидрид (1:1, 50 мл) при 0°C. После завершения преобразования исходных веществ, полученную реакционную смесь гасили насыщенным раствором NaHCO3 и охлажденной льдом дистиллированной водой до pH 7. Полученную смесь экстрагировали EtOAc (3×70 мл), и объединенные органические фазы сушили, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (20:80, EtOAc/Hex), с получением диацетата (4,29 г, 75%, α:β=3,7:1) в виде вязкой бесцветной пены.
Этантиол (1,56 мл, 20,7 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору диацетата (3,69 г, 6,9 ммоль) в DCM (30 мл). Полученную реакционную смесь охлаждали до 0°C и по каплям добавляли трифториддиэтилэфират бора (1,31 мл, 10,35 ммоль). После завершения преобразования исходных веществ, полученную реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (2×40 мл) и гасили насыщенным раствором NaHCO3 до pH 7. Водную фазу экстрагировали CH2Cl2 (2×40 мл), и объединенные органические экстракты сушили, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (20:80, EtOAc/Hex), с получением тиогалактозида 19 (3,39 г, 91%, α/β=2,4:1) в виде вязкой бесцветной пены.
Эксперимент 6. Синтез метил (2S)-2-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозил)пропаноата (32)
Реакцию гликозилирования донора 19 с акцептором 4 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 7. Синтез метил 2-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозил)ацетата (34)
Реакцию гликозилирования донора 19 с акцептором 7 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 8. Синтез метил 3-O-трет-бутилдиметилсилил-(2R)-2-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата (35)
Реакцию гликозилирования донора 19 с акцептором 9 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 9. Синтез фенил 3,4,6-три-O-ацетил-2-азидо-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (85)
К раствору 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-азидо-2-дезокси-α/β-D-глюкопиранозы (Goddard-Borger 2007) (6,42 г, 17,2 ммоль) добавляли тиофенол (3,55 мл, 34,4 ммоль) в CH2Cl2 (60 мл) при 0°C и BF3OEt2 (9,81 мл, 77,4 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при к.т. в течение 48 часов, затем разбавляли CH2Cl2 и промывали NaHCO3. Водную фазу экстрагировали CH2Cl2, и объединенные органические фазы сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtoAc/гексан), с получением соединения 85 (5,40 г, 74%, α/β=2,5:1) в виде вязкой бесцветной пены, и восстанавливали в исходный тетраацетат (1,30 г, 20%).
Эксперимент 10. Синтез п-толил 3,4,6-три-O-ацетил-2-азидо-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (86)
К раствору 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-азидо-2-дезокси-α/β-D-глюкопиранозы (Goddard-Borger 2007) (3,87 г, 10,4 ммоль) добавляли п-толуолтиол (2,57 г, 20,7 ммоль) в CH2Cl2 (60 мл) при 0°C и BF3OEt2 (6,57 мл, 51,8 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при к.т. в течение 60 часов, затем разбавляли CH2Cl2 и промывали NaHCO3. Водную фазу экстрагировали CH2Cl2, и объединенные органические фазы сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/гексан), с получением соединения 85 (2,26 г, 50%, α/β=1,8:1) в виде вязкой бесцветной пены, и восстанавливали в исходный тетраацетат (1,69 г, 44%).
Эксперимент 11. Синтез фенил 2-азидо-6-O-трет-бутилдифенилсилил-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (87)
Раствор NaOMe 1Н (6,73 мл, 6,73 ммоль) в MeOH добавляли к перемешиваемому раствору соединения 85 (4,75 г, 11,21 ммоль) в MeOH (20 мл) при 0°C. Спустя 3 часа исходные вещества были израсходованы. Полученную реакционную смесь разбавляли MeOH и добавляли смолу Dowex-H+ до нейтрального pH. Фильтрование и выпаривание растворителей приводило к получению триола (3,23 г, 97%) в виде вязкой смолы. К раствору триола (2,46 г, 8,27 ммоль) в пиридине (20 мл) при к.т. добавляли TBDPSCl (2,36 мл, 9,10 ммоль), с последующим добавлением каталитического количества DMAP. Полученную смесь перемешивали в течение ночи, затем гасили H2O (20 мл), экстрагировали CH2Cl2 (3×20 мл), и объединенные органические фазы сушили (MgSO4) и концентрировали. Очистка колоночной флэш-хроматографией (30:70 AcOEt/гексан) приводила к получению продукта 87 (4,12 г, 93%, α/β=1,8:1) в виде белого твердого вещества.
Эксперимент 12. Синтез п-толил 2-азидо-6-O-трет-бутилдифенилсилил-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (88)
Методику эксперимента 11 применяли к соединению 86, с получением соединения 88 в виде вязкой бесцветной смолы с 98% выходом (α/β=1,8:1) за две стадии.
Эксперимент 13. Синтез фенил 6-O-ацетил-2-азидо-3,4-ди-O-бензил-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (89)
К перемешиваемому раствору соединения 87 (3,91 г, 7,30 ммоль) и бензилбромида (1,97 мл, 22,6 ммоль) в ДМФА (15 мл) при 0°C добавляли частями гидрид натрия (0,45 г, 18,6 ммоль). Спустя 2 часа, добавляли MeOH при 0°C, и полученную реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором и экстрагировали Et2O. Объединенные органические фазы сушили над MgSO4, фильтровали и упаривали в вакууме. Очистка колоночной флэш-хроматографией (10:90 AcOEt/гексан) приводила к получению дибензилированного продукта (4,45 г, 85%) в виде белого твердого вещества, и трибензилированного продукта 92 (0,31 г, 7%) в виде вязкой смолы.
К раствору дибензилированного продукта (2,42 г, 3,38 ммоль) в ТГФ (10 мл) при к.т. добавляли TBAF (1,15 г, 4,39 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали AcOEt (3×20 мл), сушили (MgSO4) и концентрировали до образования вязкого желтого остатка. Очистка колоночной флэш-хроматографией (30:70, AcOEt/гексан) приводила к получению спирта (1,43 г, 88%) в виде вязкой смолы.
К перемешиваемому раствору полученного спирта (1,396 г, 2,92 ммоль) в пиридине (5 мл) при 0°C добавляли уксусный ангидрид (0,55 мл, 5,85 ммоль) и каталитическое количество DMAP. После завершения преобразования исходных веществ добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали до образования вязкого остатка. Фильтрование через целит смесью EtOAc/гексан (10/90) приводило к получению продукта 89 в виде вязкой бесцветной смолы (1,38 г, 91%, α:β=1,4:1).
Эксперимент 14. Синтез фенил 2-азидо-3,4-ди-O-бензил-6-O- хлорацетил-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (90)
Методику эксперимента 13 применяли к соединению 87 с использованием хлоруксусного ангидрида и с получением соединения 90 в виде вязкой бесцветной смолы с 66% (α/β=1,6:1) выходом за три стадии. Характеристики данных соединения 90 идентичны литературным данным (Csiki 2010).
Эксперимент 15. Синтез п-толил 2-азидо-3,4-ди-O-бензил-6-O-хлорацетил-2-дезокси-1-тио-α/β-D-глюкопиранозида (91)
Методику эксперимента 13 применяли к соединению 88 с использованием хлоруксусного ангидрида и с получением соединения 91 в виде вязкой бесцветной смолы с 82% выходом (α/β=1:1) за три стадии.
Эксперимент 16. Синтез метил (2S)-2-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-6-O-хлорацетил-2-дезокси-α/β-D-глюкопиранозил)пропаноата (95)
Реакции гликозилирования донора 90 и 91 с акцептором 4 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 17. Синтез метил 2-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-6-O-хлорацетил-2-дезокси-α/β-D-глюкопиранозил)ацетата (96)
Реакцию гликозилирования донора 91 с акцептором 7 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 18. Синтез метил (2R)-трет-бутилдиметилсилил-3-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-6-O-хлорацетил-2-дезокси-α/β-D-глюкопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата (97)
Реакцию гликозилирования донора 91 с акцептором 9 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 2.
Эксперимент 19. Синтез 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-маннопиразилтрихлорацетимидата (103)
Синтез соединения 103 осуществляли в соответствии с методикой, описанной в литературе (Hanessian 1997).
Эксперимент 20. Синтез этил 3-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-глюкопиранозил)-3-гидроксибутирата (136)
Суспензию тиоглюкозидного донора 1 (0,815 г, 1,52 ммоль), этил 3-гидроксибутирата 133 (0,197 мл, 1,52 ммоль) и 4Å MS в CH2Cl2 (6 мл) перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем охлаждали до 0°C. Добавляли N-йодсукцинимид (0,434 г, 1,93 ммоль) и TfOH (0,112 мл) при 0°C, и после завершения реакции, добавляли 10% водный раствор Na2S2O3 (6 мл) и насыщенный водный раствор NaHCO3 (3 мл). Полученную смесь экстрагировали CH2Cl2 (3×6 мл), объединенные органические фазы сушили (MgSO4), фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (20:80, EtOAc/Hex), с получением продукта 136 в виде вязкой бесцветной пены (0,771 г, 84%).
Эксперимент 21. Синтез этил 3-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозил)-3-гидроксибутирата (137)
Реакцию гликозилирования тиогалактозидного донора 19 (0,638 г, 1,19 ммоль) и этил 3-гидроксибутирата 133 (0,170 мл, 1,31 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 20. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (20:80, EtOAc/Hex), с получением продукта 137 в виде вязкой бесцветной смолы (0,685 г, 95%).
Эксперимент 22. Синтез диметил (2S)-2-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-глюкопиранозил)-2-гидроксисукцината (138)
Реакцию гликозилирования тиогалактозидного донора 1 (0,850 г, 1,58 ммоль) и диметил (S)-малата 134 (0,208 мл, 1,58 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 20. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением продукта 138 в виде вязкой бесцветной смолы (0,949 г, 94%, α/β=7:1).
Эксперимент 23. Синтез диметил (2S)-2-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозил)-2-гидроксисукцината (139)
Реакцию гликозилирования тиогалактозидного донора 19 (1,20 г, 2,23 ммоль) и диметил (S)-малата 134 (0,294 мл, 2,23 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 20. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением продукта 139 в виде вязкой бесцветной смолы (1,235 г, 87%, α/β=5:1).
Эксперимент 24. Синтез метил 3-O-трет-бутилдиметилсилил-(2S)-2-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-глюкопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата (140)
Реакцию гликозилирования тиогалактозидного донора 1 (0,300 г, 0,56 ммоль) и акцептора 135 (0,200 г, 0,56 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 20. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (10:90, EtOAc/Hex), с получением продукта 140 в виде вязкой бесцветной смолы (0,463 г, 98%, α/β>10:1).
Эксперимент 25. Синтез метил 3-O-трет-бутилдиметилсилил-(2S)-2-O-(6-O-ацетил-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата (141)
Реакцию гликозилирования тиогалактозидного донора 1 (0,300 г, 0,56 ммоль) и акцептора 135 (0,200 г, 0,56 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 20. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (10:90, EtOAc/Hex), с получением продукта 140 в виде вязкой бесцветной смолы (0,463 г, 98%, α/β>10:1).
Эксперимент 26. Синтез (2S)-2-(α-D-глюкопиранозил)пропаноата калия (142)
Раствор NaOMe 1Н (0,443 мл, 0,443 ммоль) в MeOH добавляли к перемешиваемому раствору соединения 10 (0,427 г, 0,74 ммоль) в MeOH (4 мл) при 0°C. Спустя 1 ч, полученную реакционную смесь нейтрализовали насыщенным водным NH4Cl. Водную фазу экстрагировали EtOAc, и объединенные органические экстракты сушили (MgSO4), фильтровали и удаляли растворитель. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением α-спирта (0,310 г, 78%) и β-спирта (0,027 г, 7%) в виде вязких бесцветных смол.
Раствор α-спирта (0,300 г, 0,56 ммоль) в EtOAc гидрировали при 50 ф.кв.д. в присутствии Pd/C 10% (0,25 эквив.). Спустя 5 часов, полученную реакционную смесь фильтровали, и растворитель выпаривали, с получением сложного эфира в виде очень вязкой бесцветной пены (0,149 г, количественный). Раствор 2М KOH (0,28 мл) добавляли к перемешиваемому раствору полученного сложного эфира (0,149 г, 0,56 ммоль) в H2O (2 мл). После того, как все исходные вещества были израсходованы, pH доводили до 7 добавлением 10% HCl, и растворитель выпаривали, с получением соединения 142 в виде вязкой бесцветной пены (0,162 г, количественный). [α]20 D=+107,2 (c=0,60, H2O).
1H ЯМР (D2O): δ 4,93 (д, J=3,9 Гц, 1H, H-1), 3,96 (кв, J=6,8 Гц, 1H, CHCH3), 3,75-3,68 (м, 5H), 3,44 (дд, J=9,9 Гц, J=4,0 Гц, 1H, H-2), 3,35 (т, J=9,3 Гц, 1H, H-4), 1,28 (д, J=6,8 Гц, 3H, CHCH 3) м.д. 13C ЯМР (CDCl3): δ 181,0 (CHCO2 -), 97,3 (C-1), 75,5 (CHCH3), 73,1 (C-3), 71,9 (C-5), 71,5 (C-2), 69,4 (C-4), 60,1 (C-6), 17,5 (CHCH3) м.д.
Эксперимент 27. Синтез (2S)-2-(α/β-D-галактопиранозил)пропаноата калия (143)
Метанолиз ацетатной группы галактозида 32 (1,720 г, 2,63 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/Hex), с получением спиртового соединения в виде вязкой бесцветной смолы (1,350 г, 96%, α/β=3:1). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров (1,323 г, 2,46 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 23, соединение 143 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,715 г, количественный, α/β=3:1). FTIR (пленка) vmax: 1635 (C=O), 3332 (O-H) см-1.
1H ЯМР (D2O): δ 4,97 (д, J=3,9 Гц, H-1 (α)), 4,58 (кв, J=7,0 Гц, CHCH3 (β)), 4,37 (д, J=7,7 Гц, H-1 (β)), 4,25 (кв, J=6,9 Гц, CHCH3 (α)), 3,93-3,88 (м), 3,84-3,79 (м), 3,76-3,64 (м), 3,63-3,52 (м), 3,47 (дд, J=9,9, 7,7 Гц), 1,38 (д, J=7,0 Гц, CHCH 3 (β)), 1,35 (д, J=6,8 Гц, CHCH 3 (α)) м.д. 13C ЯМР (CDCl3): δ 187,3 (CHCO2 -), 101,8 (C-1 (β)), 98,9 (C-1 (α)), 75,2, 73,7, 73,1, 72,6, 71,4, 70,7, 69,21, 69,07, 68,5, 68,0, 60,84, 60,80, 52,68, 52,62, 17,1 (CHCH3) м.д.
Эксперимент 28. Синтез 2-(α/β-D-глюкопиранозил)ацетата калия (144)
Метанолиз ацетатной группы глюкозида 13 (0,940 г, 1,66 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/Hex), с получением спиртового соединения в виде вязкой бесцветной смолы (0,765 г, 88%, α/β=11:1). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров (0,715 г, 1,37 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 144 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,378 г, количественный, α/β=10:1).
1H ЯМР (D2O): δ 4,88 (д, J=3,8 Гц, H-1 (α)), 4,41 (д, J=7,9 Гц, H-1 (β)), 4,22 (д, J=15,6 Гц, CHHʹCO2 - (β)), 4,06 (д, J=15,5 Гц, CHHʹCO2 - (α)), 4,03 (д, J=15,8 Гц, CHHʹCO2 - (α)), 3,88 (д, J=15,5 Гц, CHHʹCO2 - (β)), 3,79-3,61 (м), 3,46 (дд, J=9,8, 3,8 Гц), 3,34 (т, J=9,5 Гц) м.д. 13C ЯМР (CDCl3): δ 177,4, 102,3 (C-1 (β)), 98,3 (C-1 (α)), 75,9 (β), 75,5 (β), 73,1, 71,9, 71,5, 69,5, 68,5 (CH2CO2 - (β)), 66,8 (CH2CO2 - (α)), 60,61 (C-6 (β)), 60,43 (C-6 (α)) м.д.
Эксперимент 29. Синтез 2-(α/β-D-галактопиранозил)ацетата калия (145)
Метанолиз ацетатной группы галактозида 34 (1,079 г, 1,91 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/Hex), с получением спиртового соединения в виде вязкой бесцветной смолы (0,800 г, 81%, α/β=2:1). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров (0,787 г, 1,50 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 145 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,416 г, количественный, α/β=2:1).
1H ЯМР (D2O): δ 4,91 (д, J=3,9 Гц, H-1 (α)), 4,34 (д, J=7,7 Гц, H-1 (β)), 4,24 (д, J=15,6 Гц, CHHʹCO2 - (β)), 4,06 (д, J=15,6 Гц, CHHʹCO2 - (α)), 4,03 (д, J=15,6 Гц, CHHʹCO2 - (β)), 3,92-3,84 (м), (д, J=15,6 Гц, CHHʹCO2 - (α)), 3,75-3,71 (м), 3,69-3,58 (м), 3,52 (дд, J=10,0 Гц, J=7,6 Гц, H-2 (β)) м.д. 13C ЯМР (CDCl3): δ 177,5, 102,9 (C-1 (β)), 98,3 (C-1 (α)), 75,2 (β), 72,6 (β), 71,1 (α), 70,8 (β), 69,5 (α), 69,2 (α), 68,6 (β), 68,5 (CH2CO2 - (β)), 68,4 (α), 66,8 (CH2CO2 - (α)), 61,15 (C-6 (α)), 60,95 (C-6 (β)) м.д.
Эксперимент 30. Синтез (2R)-2-O-(α/β-D-галактопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата калия (146, 147)
Метанолиз ацетатной группы галактозида 35 (1,078 г, 1,29 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (20:80, EtOAc/Hex), с получением α-спирта (0,671 г, 66%) и β-спирта (0,286 г, 28%) в виде вязких бесцветных смол.
TBAF (1M в ТГФ; 0,83 мл, 0,83 ммоль) добавляли к раствору α-галактозида (0,655 г, 0,83 ммоль) в ТГФ (4 мл) при к.т. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали, с получением вязкого остатка. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (80:20, EtOAc/гексан) приводила к получению α-диола в виде вязкой бесцветной смолы (0,457 г, 92%). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров α-диола (0,140 г, 1,50 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 146 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,416 г, количественный). Альфа продукт 146: [α]20 D=+127,6 (c=0,62, H2O).
1H ЯМР (D2O): δ 4,97 (д, J=3,9 Гц, 1H, H-1), 4,13 (дт, J=4,7 Гц, J=2,3 Гц, 1H, CHCH2OH), 3,99 (т, J=6,2 Гц, 1H,), 3,93-3,87 (м, 2H), 3,81 (дд, J=12,1, 3,2 Гц, 1H), 3,77-3,70 (м, 2H), 3,69-3,64 (м, 2H, H-6, Hʹ-6) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 177,1 (CHCO2 -), 97,6 (C-1), 79,2 (CHCH2OH), 71,3, 69,6, 69,3, 68,5, 63,1 (CHCH2OH), 61,2 (C-6) м.д.
Такую же стратегию применяли для удаления защиты у β-галактозида (0,266 г, 0,34 ммоль). После кислотного (HF) сольволиза (0,140 г, 76%), каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров β-диола (0,340 г, 0,615 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира, соединение 147 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,188 г, количественный). Бета продукт 147:
1H ЯМР (D2O): δ 4,42 (д, J=7,5 Гц, 1H, H-1), 4,11 (дд, J=6,5 Гц, J=3,2 Гц, 1H, CHCH2OH), 3,83-3,77 (м, 2H), 3,73-3,67 (м, 2H), 3,64-3,53 (м, 4H) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 177,9 (CHCO2 -), 102,6 (C-1), 81,3 (CHCH2OH), 75,1, 72,6, 70,9, 68,7, 62,6 (CHCH2OH), 60,9 (C-6) м.д.
Эксперимент 31. Синтез 3-O-(α-D-глюкопиранозил)-3-гидроксибутирата калия (148)
Метанолиз ацетатной группы глюкозида 136 (0,823 г, 1,36 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/Hex), с получением α-спирта (0,594 г, 82%) и β-спирта (0,066 г, 9%) в виде вязких бесцветных смол.
После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров α-спирта (0,516 г, 0,94 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 148 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,285 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 4,98 (д, J=4,0 Гц, H-1), 4,97 (д, J=4,2 Гц, H-1), 4,14-4,04 (м, CHCH3), 3,80-3,59 (м), 3,45-3,39 (м, H-2), 3,34-3,28 (м, H-4), 2,47 (дд, J=14,2 Гц, J=6,9 Гц, CHCH 2CO2 -), 2,40-2,22 (м, CHCH 2CO2 -), 1,21 (д, J=6,1 Гц, CHCH 3), 1,14 (д, J=5,9 Гц, CHCH 3) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 180,19, 180,16, 97,6 (C-1), 94,9 (C-1), 73,4 (CHCH3), 73,15 (CHCH3), 73,06, 71,9, 71,51, 71,48, 71,32, 70,5, 69,62, 69,56, 60,6 (C-6), 60,3 (C-6), 45,6 (CHCH2CO2 -), 44,5 (CHCH2CO2 -), 20,6 (CHCH3), 18,0 (CHCH3) м.д.
Эксперимент 32. Синтез 3-O-(α/β-D-галактопиранозил)-3-гидроксибутирата калия (149)
Метанолиз ацетатной группы галактозида 137 (0,709 г, 1,17 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/Hex), с получением спиртового соединения в виде вязкой бесцветной смолы (0,584 г, 88%, α/β=3:1). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров (0,573 г, 1,01 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 145 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,309 г, количественный, α/β=3:1).
1H ЯМР (D2O): δ 5,01 (д, J=3,9 Гц, H-1 (α)), 4,99 (д, J=3,8 Гц, H-1 (α)), 4,42 (д, J=8,4 Гц, H-1 (β)), 4,40 (д, J=8,1 Гц, H-1 (β)), 4,23-4,04 (м), 3,97-3,89 (м), 3,84 (т, J=3,9 Гц), 3,78-3,54 (м), 3,40 (дд, J=9,6, 8,2 Гц), 2,54-2,44 (м), 2,40-2,22 (м), 1,22-1,13 (м) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 180,3, 179,9, 101,9 (C-1 (β)), 101,1 (C-1(β)), 97,9 (C-1 (α)), 95,1 (C-1 (α)), 75,14, 75,10, 74,99, 74,0, 73,4, 72,79, 72,65, 71,02, 71,01, 70,8, 70,52, 70,44, 69,58, 69,46, 69,30, 69,1, 68,72, 68,56, 68,46, 68,2, 68,72, 68,56, 68,46, 68,2, 61,23, 61,09, 60,9, 45,75 (CHCH2CO2 -), 45,57 (CHCH2CO2 -), 44,5 (CHCH2CO2 -), 20,6 (CHCH3), 19,3 (CHCH3), 18,0 (CHCH3) м.д.
Эксперимент 33. Синтез (2S)-2-O-(α/β-D-глюкопиранозил)-2-гидроксисукцината калия (150)
Метанолиз ацетатной группы глюкозида 138 (0,263 г, 0,41 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали препаративной ТСХ (50:50, EtOAc/Hex), с получением требуемого спиртового соединения (0,117 г, 48%) в виде вязкой бесцветной смолы, и восстановленного исходного соединения 138 (0,068 г, 26%) и продукта гидролиза в аномерном положении (0,046 г, 25%,). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров (0,565 г, 0,95 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 145 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,290 г, 94%).
1H ЯМР (D2O): δ 4,94 (д, J=3,9 Гц, H-1 (α)), 4,39 (д, J=7,9 Гц, H-1 (β)), 4,19 (дд, J=10,4, J=3,1 Гц, 1H, CO2 -CHCH2CO2 -), 3,80-3,63 (м), 3,45-3,28 (м), 3,21-3,15 (м), 2,59 (дд, J=15,1 Гц, J=2,9 Гц, CHCH 2CO2 - (β)), 2,52 (дд, J=15,2 Гц, J=3,2 Гц, CHCH 2CO2 - (α)), 2,42 (дд, J=15,2 Гц, J=10,4 Гц, CHCH 2CO2 - (α)) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 179,5, 179,1, 135,3 (C-1 (β)), 99,7 (C-1 (α)), 95,9, 79,0, 75,92, 75,72, 74,1, 73,1, 72,2, 71,8, 71,4, 69,6, 69,2, 60,7, 60,0, 41,5 м.д.
Эксперимент 34. Синтез (2S)-2-O-(α/β-D-галактопиранозил)-2-гидроксисукцината калия (151, 152)
Метанолиз ацетатной группы галактозида 139 (1,215 г, 1,91 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (50:50, EtOAc/Hex), с получением α-спирта (0,642 г, 57%) и β-спирта (0,176 г, 16%) в виде вязких бесцветных смол, и восстановленного исходного соединения 139 (0,020 г, 16%) и продукта гидролиза в аномерном положении (0,067 г, 8%). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров α-спирта (0,640 г, 1,07 ммоль) и β-спирта (0,159 г, 0,27 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединения 151 (0,401 г, количественный) и 152 (0,100 г, количественный) получали в виде вязких бесцветных пен. Альфа продукт 151: FTIR (пленка) vmax: 1634 (C=O), 3332 (O-H) см-1.
1H ЯМР (D2O): δ 4,96 (д, J=4,0 Гц, 1H, H-1) 4,20 (дд, J=10,3, 3,1 Гц, CO2 -CHCH2CO2 -), 4,05-4,02 (м), 3,94 (д, J=2,8 Гц), 3,86 (дд, J=10,4 Гц, J=3,3 Гц), 3,70-3,54 (м), 2,54 (дд, J=15,2 Гц, 3,2 Гц, 1H, CHCH 2CO2 -), 2,43 2,42 (дд, J=15,2 Гц, J=10,3 Гц, 1H, CHCH 2CO2 -) м.д.
Бета продукт 152: FTIR (пленка) vmax: 1736 (C=O), 3410 (O-H) см-1.
1H ЯМР (D2O): δ 4,52 (дд, J=10,0 Гц, J=3,1 Гц, 1H, CO2 - CHCH2CO2 -), 4,33 (д, J=7,5 Гц, 1H, H-1), 3,83-3,82 (м, 1H), 3,77-3,50 (м, 5H), 2,62 (дд, J=15,2, 3,1 Гц, 1H, CHCH 2CO2 -), 2,44 (дд, J=15,2, 10,0 Гц, 1H, CHCH 2CO2 -). 13C ЯМР (D2O): δ 179,4 (CO2 -), 179,0 (CO2 -), 102,0 (C-1), 77,6 (CHCH2CO2 -), 75,4, 72,8, 70,9, 68,8, 61,3 (C-6), 41,9 (CHCH2CO2 -) м.д.
Эксперимент 35. Синтез (2S)-2-O-(α-D-глюкопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата калия (153)
Метанолиз ацетатной группы глюкозида 140 (0,450 г, 0,54 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (20:80, EtOAc/Hex), с получением α-спирта (0,299 г, 70%) и β-спирта (0,030 г, 7%) в виде вязких бесцветных смол.
TBAF (1M в ТГФ; 0,37 мл, 0,37 ммоль) добавляли к раствору α-глюкозида (0,290 г, 0,37 ммоль) в ТГФ (2 мл) при к.т. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали, с получением вязкого остатка. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (80:20, EtOAc/гексан) приводила к получению α-диола в виде вязкой бесцветной смолы (0,162 г, 80%). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров α-диола (0,150 г, 0,27 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 153 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,077 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 4,96 (д, J=3,9 Гц, 1H, H-1), 3,96 (дд, J=3,3 Гц, J=6,5 Гц, 1H, CHCH2OH), 3,79- 3,75 (м, 3H), 3,72-3,63 (м, 3H), 3,48 (дд, J=3,9 Гц, J=9,9 Гц, 1H, H-2), 3,37 (т, J=9,6 Гц, 1H, H-4) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 177,4 (CO2 -), 99,2 (C-1), 81,4 (CHCH2OH), 72,9, 72,2, 71,7 (C-2), 69,3 (C-4), 62,6 (CHCH2OH), 60,0 (C-6) м.д.
Эксперимент 36. Синтез (2S)-2-O-(α-D-галактопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата калия (154)
Метанолиз ацетатной группы α-галактозида 141 (0,640 г, 0,77 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением спиртового соединения (0,572 г, 94%) в виде вязкого бесцветного остатка.
TBAF (1M в ТГФ; 0,83 мл, 0,88 ммоль) добавляли к раствору α-галактозида (0,695 г, 0,88 ммоль) в ТГФ (5 мл) при к.т. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов, и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали, с получением вязкого остатка. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (80:20, EtOAc/гексан) приводила к получению диола в виде вязкой бесцветной смолы (0,343 г, 71%). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров диола (0,310 г, 0,56 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 154 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,172 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 5,01 (д, J=3,9 Гц, 1H, H-1), 4,28 (т, J=4,2 Гц, 1H, CHCH2OH), 4,18-3,92 (м, 4H), 3,85-3,58 (м, 4H) м.д.
Эксперимент 37. Синтез (2S)-2-O-(β-D-галактопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата калия (155)
Метанолиз ацетатной группы β-галактозида 141 (0,275 г, 0,33 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/Hex), с получением спиртового соединения (0,243 г, 93%) в виде вязкого бесцветного остатка.
TBAF (1M в ТГФ; 0,83 мл, 0,44 ммоль) добавляли к раствору β-галактозида (0,350 г, 0,44 ммоль) в ТГФ (3 мл) при к.т. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов, и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали, с получением вязкого остатка. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (80:20, EtOAc/гексан) приводила к получению диола в виде вязкой бесцветной смолы (0,151 г, 62%). После каталитического гидрирования простых бензиловых эфиров диола (0,140 г, 0,25 ммоль) и гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 26, соединение 155 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,078 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 4,38 (д, J=7,4 Гц, 1H, H-1), 4,28 (дд, J=6,2 Гц, J=2,9 Гц, 1H, CHCH2OH), 3,84 (дт, J=7,2, 3,8 Гц, 2H), 3,76-3,68 (м, 3H), 3,66-3,53 (м, 4H) м.д. 13C ЯМР (D2O): δ 177,1 (CO2 -), 102,5 (C-1), 81,4 (CHCH2OH), 75,3, 72,8, 71,0, 68,6, 63,2 (CHCH2OH), 61,0 (C-6) м.д.
Эксперимент 38. Синтез этил 3-O-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-маннопиразил)-3-гидроксибутирата (156)
Этил 3-дигидроксибутират (0,348 мл, 2,68 ммоль) добавляли к раствору трихлорацетамидата 103 (1,100 г, 2,23 ммоль) в сухом CH2Cl2 (6 мл). Полученный раствор охлаждали до 0°C и медленно добавляли BF3OEt2 (0,0,282 мл, 2,23 ммоль). После завершения реакции, добавляли насыщенный водный раствор NaHCO3, с последующей экстракцией CH2Cl2 (3×15 мл). Объединенные органические фазы сушили (MgSO4) и концентрировали. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (40:60, EtOAc/гексан), с получением соединения 156 (0,943 г, 91%) в виде вязкого бесцветного остатка.
Эксперимент 39. Синтез диметил (2S)-2-O-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-маннопиразил)-2-гидроксисукцината (157)
Реакцию гликозилирования трихлорацетамидатного донора 103 (1,540 г, 3,12 ммоль) и этилдиметил-диметил-(S)-малата 134 (0,494 мл, 3,75 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 38. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением продукта 157 в виде вязкой бесцветной смолы (1,359 г, 88%).
Эксперимент 40. Синтез метил 3-O-трет-бутилдиметилсилил-(2S)-2-O-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-маннопиразил)-2,3-дигидроксипропаноата (158)
Реакцию гликозилирования трихлорацетамидатного донора 103 (1,30 г, 2,64 ммоль) и акцептора 135 (0,946 г, 2,64 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 38. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением продукта 158 в виде вязкой бесцветной смолы (1,33 г, 73%).
Эксперимент 41. Синтез 3-O-(α-D-маннопиразил)-3-гидроксибутирата калия (159)
1Н Раствор NaOMe (0,36 мл, 0,36 ммоль) в MeOH добавляли к перемешиваемому раствору соединения 156 (0,276 г, 0,60 ммоль) в MeOH (3 мл) при 0°C. После завершения преобразования исходных веществ, добавляли предварительно активированную смолу Dowex-H+ до нейтрального pH. После фильтрования MeOH и водой, растворитель удаляли в вакууме, с получением маннозида с удаленной защитой в виде вязкой бесцветной смолы (0,157 г, 90%).
Раствор 2М KOH (0,78 мл) добавляли к перемешиваемому раствору полученного выше маннозида (0,431 г, 1,56 ммоль) в H2O (4 мл). После того, как все исходные вещества были израсходованы, pH доводили до 7 добавлением 10% HCl, и растворитель выпаривали, с получением соединения 159 в виде вязкой бесцветной пены (0,446 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 4,91 (д, J=7,5 Гц), 4,18-4,09 (м, CHCH3), 3,84-3,77 (м), 3,74-3,63 (м), 3,57 (т, J=8,9 Гц), 2,43-2,21 (м, (CHCH 2CO2 -)), 1,20 (д, J=6,1 Гц, CHCH 2CO2 -), 1,14 (д, J=5,6 Гц, CHCH 2CO2 -) м.д. 13C ЯМР (CDCl3): δ 179,9 (CH2 CO2 -), 179,8 (CH2 CO2 -), 99,7 (C-1), 96,5 (C-1), 73,4, 72,9, 72,5, 70,57, 70,52, 70,41, 70,29, 70,24, 66,84, 66,72, 61,0 (C-6), 60,7 (C-6), 45,5 (CHCH2CO2 -), 44,8 (CHCH2CO2 -), 20,8 (CHCH3) м.д.
Эксперимент 42. Синтез (2S)-2-O-(α-D-маннопиразил)-2-гидроксисукцината калия (160)
Метанолиз ацетатных групп маннозида 157 (1,343 г, 2,72 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 41. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (20:80, MeOH/CH2Cl2), с получением требуемого миннозида с удаленной защитой (0,685 г, 78%) в виде вязкой бесцветной смолы, и продукта гидролиза в аномерном положении, D-маннопиранозида (0,100 г, 20%). После гидролиза сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 38, соединение 160 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,786 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 4,85 (т, J=15,6 Гц, 1H), 4,85 (с, 1H, H-1), 4,24 (дд, J=8,2 Гц, J=4,7 Гц, 1H), 3,90-3,58 (м, 5H), 2,79-2,64 (м, 2H) м.д.
Эксперимент 43. Синтез (2S)-2-O-(D-маннопиразил)-2,3-дигидроксипропаноата калия (161)
TBAF (1M в ТГФ; 0,38 мл, 0,38 ммоль) добавляли к раствору соединения 158 (0,220 г, 0,32 ммоль) в ТГФ (3 мл) при к.т. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали, с получением вязкого остатка. Очистка препаративной ТСХ (60:40, EtOAc/гексан) приводила к получению спирта в виде вязкой бесцветной смолы (0,103 г, 72%). Метанолиз ацетатных групп данного спирта (0,518 г, 1,15 ммоль) осуществляли в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 41. После завершения преобразования исходных веществ, добавляли предварительно активированную смолу Dowex-H+ до нейтрального pH. После фильтрования MeOH и водой, удаляли растворитель в вакууме, с получением маннозида с удаленной защитой в виде вязкой бесцветной смолы (0,312 г, 96%). Гидролиз сложного метилового эфира в соответствии с методикой, описанной в эксперименте 41, соединение 161 получали в виде вязкой бесцветной пены (0,300 г, количественный).
1H ЯМР (D2O): δ 4,89 (д, J=1,4 Гц, 1H, H-1), 4,02(дд, J=7,1, 3,2 Гц, 1H, CHCO2 -), 3,99 (дд, J=3,4, 1,6 Гц, 1H, H-), 3,89 (дд, J=9,5, 3,4 Гц, 1H), 3,79 (дд, J=12,2, 3,1 Гц, 1H, H-), 3,74-3,61 (м, 5H) м.д. 13C ЯМР (CDCl3): δ 100,8, 80,6 (C-1), 73,2, 70,5, 70,1, 66,5, 62,5, 60,5 м.д.
Эксперимент 44. Синтез диметил (2S)-2-O-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-6-O-хлорацетил-2-дезокси-α-D-глюкопиранозил)-2-гидроксисукцината (162)
Суспензию тиоглюкозидного донора 91 (0,750 г, 1,32 ммоль), метил-(S)-малата 134 (0,197 мл, 1,52 ммоль) и 4Å MS в CH2Cl2:Et2O (1:4, 20 мл) перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем охлаждали до 0°C. Раствор N-йодсукцинимида (0,594 г, 2,64 ммоль) и TfOH (0,027 мл) в CH2Cl2:Et2O (1:1, 20 мл) добавляли при 0°C. После завершения преобразования исходных веществ, добавляли 10% водный раствор Na2S2O3 (20 мл) и насыщенный водный раствор NaHCO3 (10 мл). Полученную смесь экстрагировали CH2Cl2 (3×20 мл), объединенные органические фазы сушили (MgSO4), фильтровали и растворитель удаляли в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением продукта 162 в виде вязкой бесцветной пены (0,672 г, 84%).
Эксперимент 45. Синтез метил (2S)-2-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-2-дезокси-α-D-глюкопиранозил)пропаноата (163)
1Н Раствор NaOMe (0,46 мл, 0,46 ммоль) в MeOH добавляли к перемешиваемому раствору соединения 95 (0,470 г, 0,77 ммоль) в MeOH (5 мл) при 0°C. Спустя 1 час, полученную реакционную смесь нейтрализовали насыщенным водным NH4Cl. Водную фазу экстрагировали EtOAc, и объединенные органические экстракты сушили (MgSO4), фильтровали и удаляли растворитель. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (30:70, EtOAc/Hex), с получением соединения 163 (0,355 г, 98%) в виде вязкой бесцветной смолы.
Эксперимент 46. Синтез метил 2-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-2-дезокси-α-D-глюкопиранозил)ацетата (164)
Методику эксперимента 45 применяли к соединению 96 (0,500 г, 0,94 ммоль), с получением соединения 164 в виде вязкой бесцветной смолы (0,393 г, 92%).
Эксперимент 47. Синтез метил (2R)-трет-бутилдиметилсилил-3-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-2-дезокси-α-D-глюкопиранозил)-2,3-дигидроксипропаноата (165)
TBAF (1M в ТГФ; 1,14 мл, 1,14 ммоль) добавляли к раствору соединения 97 (0,830 г, 1,03 ммоль) в ТГФ (7 мл) при к.т. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов и затем добавляли воду. Полученную смесь экстрагировали EtOAc, сушили (MgSO4) и концентрировали, с получением вязкого остатка. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (50:50, EtOAc/гексан) приводила к получению спирта в виде вязкой бесцветной смолы (0,401 г, 72%). Методику эксперимента 45 применяли к полученному спирту (0,296 г, 0,55 ммоль), с получением соединения 165 в виде вязкой бесцветной смолы (0,261 г, 92%).
Эксперимент 48. Синтез диметил (2S)-2-O-(2-азидо-3,4-ди-O-бензил-2-дезокси-α-D-глюкопиранозил)-2-гидроксисукцината (166)
Методику эксперимента 45 применяли к соединению 162 (0,670 г, 1,10 ммоль), с получением соединения 166 в виде вязкой бесцветной смолы (0,429 г, 73%).
Пример 2: Эффект совместимых осмолитов примера 1 на стабилизацию белка трех белковых моделей
Способность новых синтетических аналогов стабилизировать белок теплового стресса трех моделей оценивали с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). В этом исследовании в качестве модели белков использовали малатдегидрогеназу (MDH), стафилококковую нуклеазу (SNase) и лизоцим, и стабилизирующий эффект синтетического соединения сравнивали с эффектом природных осмолитов, подобно MG и GG, а также хлорида калия и других ранее синтезированных неприродных осмолитов, подобно MGlyc и ML.
Тестированные соединения показаны в таблицах 6 и 7.
Таблица 6
Химические структуры природных и синтетических производных глюкозы, галактозы и маннозы, протестированных в данном исследовании
Производные глюкозы Производные галактозы Производные маннозы
Figure 00000099
Figure 00000100
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Figure 00000105
Figure 00000106
Figure 00000107
Figure 00000108
Figure 00000109
Figure 00000110
Figure 00000111
Figure 00000112
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
Figure 00000116
Таблица 7
Химические структуры синтетических производных глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, протестированных в данном исследовании
Производные глюкозамина Производные N-ацетилглюкозамина
Figure 00000117
Figure 00000118
Figure 00000119
Figure 00000120
DSF на основе анализов на стабильность проводили для каждого белка при рабочем pH, и значения температур плавления (TM) определяли в отсутствие (контрольные эксперименты) и в присутствии осмолитов и при различных концентрациях осмолита. Денатурацию кривых для каждого образца анализировали, и температуры плавления определяли вычислением первой производной, которая соответствует средней температуре перехода развертывания белков. В отсутствие осмолитов, малатдегидрогеназа (MDH), стафилококковая нуклеаза (SNase) и лизоцим имеют температуру плавления (TM) 50, 52 и 71°C, соответственно. Сдвиги температуры развертывания (ΔTM) рассчитывали путем сопоставления значений ТМ, полученных в присутствии осмолитов, со значениями ТМ контрольных экспериментов (отсутствие осмолитов). Положительные значения ΔTM соответствуют росту ТМ, что означает, что белок является более стабильным и больше энергии (тепла) необходимо для его развертывания. Отрицательные ΔTM значения соответствуют понижению ТМ, что означает, что белок является менее стабильным.
Приращение температуры плавления (ΔTM) трех ферментов, вызванное присутствием синтетических и природных осмолитов, изображен на фиг.1.
Анализ различных производных глюкозы (фиг.2) и галактозы (фиг.3) показал важность негликозидных групп, присоединенных к гексозе.
Что касается важности структуры сахара, анализировали различные производные лактата (фиг.4) и малата (фиг.5).
При графическом изображении приращения температуры плавления MDH при сравнении с температурами плавления SNase и лизоцима (фиг.2-5), общий вид возникает из полученных результатов.
Общие выводы для протестированных белков:
- заряженные соединения являются более хорошими стабилизаторами;
- производные малата (самый лучший) и лактата дают более высокую стабилизацию;
- несахарный остаток имеет наибольшее влияние на эффект стабилизации, чем гексозные структуры; и
- производные глюкозы и галактозы являются лучшими стабилизаторами.
Эффект стабилизации ацетатной соли калия (AcOK) на лизоцим был изучен в конъюгации с гиперосмолитами (фиг.6). Результаты показали, что сама по себе AcOK не является хорошим стабилизатором, поскольку стабилизация осуществляется только при высокой концентрации этой соли. Однако в конъюгации с гиперосмолитами могут повыситься их стабилизационные свойства.
Для определения важности гликозидной связи сахара в эффекте стабилизации, исследовали различные α и β-аномеры D и L-галактозилглицератов (фиг.7). Результаты, полученные для трех ферментов, показали, что L-глицераты являются более лучшими стабилизаторами, чем природные производные D-глицерата, и что α-аномеры являются более лучшими стабилизаторами, чем аномеры с β конфигурацией.
Для того чтобы изучить зависимость увеличения температуры плавления от концентрации осмолитов, белки тестировали при различных концентрациях осмолит - 0,1, 0,25 и 0,5М (фиг.8, фиг.9 и фиг.10). Для трех белков результаты показали, что независимо от степени стабилизации, эффект стабилизации был прямо пропорционален концентрации осмолита. Хотя полученные результаты, как представляется, следуют общей тенденции, при ближайшем рассмотрении, в случае SNase (фиг.8) и лизоцима (фиг.10), α-галактозилмалат, несомненно, является более лучшим стабилизатором. В случае MDH, результаты показывают, что гликозилмалат был наилучшим стабилизатором для этого фермента.
Материалы
Маннозилглицерат (MG), гликозилглицерат (GG), гликозилгликозилглицерат (GGG), маннозилгликолят (MGly) и маннозиллактат (ML) получали химическим синтезом, как описано в литературе (Costa 1998). Новые синтетические соединения получали химическим синтезом, как описано в примере 1. Желаемые соединения очищали колоночной гель-фильтрационной хроматографией на Sephadex G-10 при элюировании водой. Фракции, содержащие чистые соединения, объединяли, лиофилизировали. Чистоту и концентрацию соединений оценивали спектром 1H ЯМР, полученном на 500 МГц спектрометре в D2O. Для целей количественного определения спектры получали с задержкой повторения 60 сек с формиатом в качестве концентрационного стандарта. Использовали только образцы с чистотой выше, чем 98%. Митохондриальную малатдегидрогеназу из сердца свиньи (MDH) покупали у фирмы Roche, и лизоцим из белого куриного яйцо покупали у фирмы Sigma-Aldrich. Эти ферменты использовали без дальнейшей очистки. Рекомбинантную стафилококковую нуклеазу A (SNase) изготавливали и очищали из клеток Escherichia coli, как описано у Faria 2008. Концентрацию белка определяли поглощением УФ при 280 нм, используя коэффициент затухания 0,28 (мг/мл)-1см-1 для MDH, 2,58 (мг/мл)-1см-1 для лизоцима и 0,93 (мг/мл)-1см-1 для SNase.
DSF анализ
Определение температуры плавления белка (TM) осуществляли мониторингом развертывания белка с помощью флюорозонда SYPRO с оранжевым красителем (Molecular Probes), который, хотя полностью блокирован в водной среде, излучает флуоресценцию при связи с гидрофобным участком белка. Такое увеличение флуоресценции можно измерить как функцию от температуры с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии. В обычной пробе с общим объемом 20 мкл, использовали концентрацию белка от 0,14 до 0,21 мг/мл, и 5-кратную концентрацию красителя, чтобы гарантировать лучшее соотношение сигнал/фон. Исходные белковые растворы SNase или MDH готовили в фосфатном буфере (20 мм фосфата натрия, pH 7,6), и растворы лизоцима готовили в цитратном буфере (цитрат натрия 40 мм, 110 мм NaCl, рН 6,0). Эти исходные растворы подвергали тщательному диализу против того же буфера перед анализами. Использовали концентрации белка приблизительно 1,9 мкМ для MDH, 12,4 мкМ для SNase и 13 мкМ для лизоцима. Растворы осмолита готовили в воде с соответствующими концентрациями. Пробу для анализа получали добавлением 2 мкл белка к 8 мкл красящего буферного раствора и 10 мкл раствора осмолита, все полученные в буфере белковые пробы очищали, за исключением растворов осмолитов. Интенсивность флуоресценции как функцию от температуры использовали для расчета температуры плавления белка (TM) путем определения первой производной (d(Rfu)/dT) для выделения точки перегиба кривой точной транзиции.
Пример 3: Эффект стабилизации шести совместимых осмолитов примера 1 на свиной инсулин
Способность галактозиллактата 143, галактозилбутирата 149, галактозилглицерата 146, гликозилбутирата 148, гликозилгликолята 144 и гликозилмалата 150 стабилизировать свиной инсулин исследовали с использованием DSF анализа, описанного в примере 2.
Для данного анализа готовили растворы, содержащие свиной инсулин в концентрации 129 мкМ и совместимые осмолиты при концентрациях 0,1 и 0,25М. Увеличение температуры плавления, наблюдаемое для каждого осмолита при 0,1М и 0,25М, показано на фиг.11.
Все шесть осмолитов стабилизировали свиной инсулин при обеих протестированных концентрациях, обеспечивая с гликозилгликолятом и гликозилмалатом наибольший прирост температуры плавления.
Обсуждение
Эффективность новых соединений в защите белковых моделей против вызванной теплом инактивации была оценена с помощью DSF, и сравнена с эффектом природных осмолитов, подобно MG и GG, а также хлорида калия и других ранее синтезированных неприродных осмолитов, таких как MGlyc и ML. DSF оказалась отличным методом высокой пропускной способности для получения оперативной информации о стабилизирующих свойствах молекул.
Анализ полученных результатов показал, что эффект стабилизации не является общим и строго зависит от взаимодействия конкретный белок-осмолит. Хотя некоторые осмолиты показали улучшенные свойства термостабилизации, степень стабилизации отличается для каждого белка.
Наличие заряда является одной из наиболее важных особенностей для эффекта стабилизации. Незаряженные осмолиты, подобно глюкозаминовым циклическим производным, дали низкую стабилизацию, а производные малата, располагающие двойным зарядом, были лучшими стабилизаторами.
Что касается использования различных гексоз, производные глюкозы и галактозы были более хорошими стабилизаторами, чем соответствующие производные маннозы и N-ацетилглюкозамина. Однако результаты показали, что группы, присоединенные к сахару, имеют большее влияние на эффект стабилизации, чем природные сахара.
Результаты, полученные с α и β-аномерами галактозилглицератов, показали, что α производные являются более лучшими стабилизаторами.
Предполагается, что новые соединения, описанные в данном описании, будут дополнительно стабилизировать белки, а также другие биологические материалы. Таким образом, новые соединения по настоящему изобретению полезны для стабилизации биологических материалов, применяемых в фармацевтических, например биопрепаратах, таких как антитела и гормоны, косметических продуктах, продуктах питания и т.д. Соединения по настоящему изобретению могут быть использованы для защиты биологических материалов от температурного стресса, агрегации и высокой солености. Например, соединения по настоящему изобретению можно использовать для стабилизации биопрепаратов во время обработки, например, очистки, формулирования и/или сушки, транспортировки и хранения.Перечень ссылок
Costa, M.S. et al., ʺAn overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea,ʺ Biotechnology of Extremophiles, Antranikian, G., Ed., Springer Berlin Heidelberg: 1998; vol. 61, pp 117-153.
Csiki, Z. and Fugedi, P., ʺSynthesis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Part 4: Synthesis of aza-L-iduronic acid-containing analogs of heparan sulfate oligosaccharides as heparanase inhibitors.ʺ Tetrahedron 2010, 66, 7821-7837.
Empadinhas, N. et al., ʺOrganic solutes in Rubrobacter xylanophilus: the first example of di-myo-inositol-phosphate in a thermophile.ʺ Extremophiles 2007, 11, 667-673.
Faria, C. et al., ʺDesign of new enzyme stabilizers inspired by glycosides of hyperthermophilic microorganisms,ʺ Carbohydrate Research 343 (2008) 3025-3033.
Faria, C. et al., ʺInhibition of formation of α-synuclein inclusions by mannosylglycerate in a yeast model of Parkinson's disease,ʺ Biochimica et Biophysica Acta 1830 (2013) 4065-4072.
Goddard-Borger, E. D. et al., ʺAn efficient, inexpensive, and shelf-stable diazotransfer reagent: Imidazole-1-sulfonyl azide hydrochloride,ʺ Organic Letters 2007, 9, 3797-3800.
Hanessian, S., Preparative Carbohydrate Chemistry. Taylor & Francis: 1997.
Lentzen, G. and Schwarz, T., ʺExtremolytes: natural compounds from extremophiles for versatile applications,ʺ Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72:623-634.
Lok, C. M et al., ʺSynthesis of Chiral Glycerides Starting from D-Serine and L-Serine.ʺ Chemistry and Physics of Lipids 1976, 16, 115-122.
Lourenco, E. C, ʺSynthesis of potassium (2R)-2-O-alpha-D-glucopyranosyl-(1→6)-alpha-D-glucopyranosyl-2,3-dihydroxypropanoate a natural compatible solute.ʺ Carbohydrate Research 2009, 344, 2073-2078.
Luley-Goedl, C. and Nidetzky B, ʺGlycosides as compatible solutes: biosynthesis and applications,ʺ Nat. Prod. Rep., (2011), 28, 875-896.
Pais, T. M. et al., ʺStructural determinants of protein stabilization by solutes - The importance of the hairpin loop in rubredoxins. Febs Journal 2005, 272, 999-1011.
PCT International Application Publication No. WO/2007/097653, published August 30, 2007 (Pereira de Oliveira da Silva Santos et al.).
Sharma, S. V. et al., ʺChemical and chemoenzymatic syntheses of Bacillithiol: A unique low-molecular-weight thiol amongst low G+C gram-positive bacteria,ʺ Angewandte Chemie-International Edition 2011, 50, 7101-7104.

Claims (125)

1. Соединение формулы
Figure 00000121
или его фармацевтически приемлемая соль,
где R1 представляет собой
Figure 00000122
и
R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3.
2. Соединение формулы
Figure 00000123
или его фармацевтически приемлемая соль,
где R1 представляет собой -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH;
R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3;
X представляет собой -CH3, -CH2OH или CH2C(=O)OH; и
n равен 0 или 1.
3. Соединение формулы
Figure 00000124
или его фармацевтически приемлемая соль,
где R1 представляет собой -OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH;
R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3; и
X представляет собой -H или CH2C(=O)OH;
n равен 0 или 1;
R1 представляет собой
Figure 00000125
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000126
и R2 представляет собой OH, X представляет собой H и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000127
; и
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000128
и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH, и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000129
.
4. Соединение по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где соотношение α/β аномеров данного соединения составляет 1:1-99:1.
5. Соединение по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где соотношение α/β аномеров данного соединения составляет больше чем 99:1.
6. Соединение по п.2 или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой
Figure 00000130
7. Соединение по п.2 или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой
Figure 00000131
8. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой
Figure 00000132
9. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой
Figure 00000133
10. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой
Figure 00000134
11. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где соединение представляет собой
Figure 00000135
или
Figure 00000136
12. Соединение по п.2 или его фармацевтически приемлемая соль, где соединение представляет собой
Figure 00000137
Figure 00000138
13. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где соединение представляет собой
Figure 00000139
14. Соединение формулы
Figure 00000140
или его соль,
где R1 представляет собой
Figure 00000141
и
R2 представляет собой -ОН или -N(H)C(=O)CH3, где соединение имеет структуру
Figure 00000142
15. Композиция, содержащая по меньшей мере одно соединение по любому из пп.1-14 или его фармацевтически приемлемую соль для стабилизации биологического материала, где биологический материал представляет собой фермент, инсулин, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу или лизоцим.
16. Композиция по п.15, дополнительно содержащая буфер.
17. Способ стабилизации биологического материала, включающий добавление по меньшей мере одного соединения или его фармацевтически приемлемой соли к раствору, содержащему биологический материал, с получением стабильного раствора, где соединение имеет формулу
(а)
Figure 00000140
или его фармацевтически приемлемой соли,
где R1 представляет собой
Figure 00000143
и
R2 представляет собой -OH или -N(H)C(=O)CH3, или
R1 и R2, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют
Figure 00000144
где R3 представляет собой -CH3 или -CH2OH;
или
(b)
Figure 00000145
или его фармацевтически приемлемую соль,
где R1 представляет собой –OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH;
R2 представляет собой -ОН или -N(H)C(=O)CH3;
Х представляет собой -CH3, -CH2OH или CH2C(=O)OH; и
n равен 0 или 1;
или
(c)
Figure 00000146
или его фармацевтически приемлемую соль,
где R1 представляет собой –OC(H)(X)(CH2)nC(=O)OH;
R2 представляет собой –OH или -N(H)C(=O)CH3; и
X представляет собой –H или CH2C(=O)OH; и
n равен 0 или 1; или
R1 представляет собой
Figure 00000147
где в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000148
и R2 представляет собой OH, X представляет собой H и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000149
или его фармацевтически приемлемую соль;
в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000150
и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000151
или его фармацевтически приемлемую соль;
и в случаях, когда соединение представляет собой
Figure 00000152
и R2 представляет собой OH, X представляет собой CH2OH и n равен 0, тогда данное соединение представляет собой
Figure 00000153
или его фармацевтически приемлемую соль.
18. Способ по п.17, где соединение представляет собой
Figure 00000121
,
Figure 00000123
или
Figure 00000124
или его фармацевтически приемлемую соль.
19. Способ по любому из пп.17, 18, где соединение представляет собой
Figure 00000154
или его фармацевтически приемлемую соль.
20. Способ по любому из пп.17, 18, где соединение представляет собой
Figure 00000155
или его фармацевтически приемлемую соль.
21. Способ по любому из пп.17, 18, где соединение представляет собой
Figure 00000156
или его фармацевтически приемлемую соль.
22. Способ по любому из пп.17-21, где соотношение α/β аномеров данного соединения составляет 1:1-99:1.
23. Способ по любому из пп.17-21, где соотношение α/β аномеров данного соединения составляет больше чем 99:1.
24. Способ по любому из пп.17-20 или 22, 23, где в соединении (b) R1 представляет собой
Figure 00000157
25. Способ по любому из пп.17-20 или 22, 23, где в соединении (с) R1 представляет собой
Figure 00000158
26. Способ по любому из пп.17-20 или 22, 23, где в соединении (а) R1 и R2, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют
Figure 00000159
где R3 представляет собой -CH3 или -CH2OH.
27. Способ по п.17, где соединение представляет собой
Figure 00000160
Figure 00000161
Figure 00000162
Figure 00000163
Figure 00000164
Figure 00000165
Figure 00000166
Figure 00000167
Figure 00000168
Figure 00000169
Figure 00000170
Figure 00000171
или его фармацевтически приемлемую соль.
28. Способ по любому из пп.17-27, дополнительно включающий стадию сушки стабилизированного раствора.
29. Способ по любому из пп.17-28, где биологическим материалом является полипептид, фермент, антитело, белок плазмы, гормон, инсулин, малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза или лизоцим.
RU2016140337A 2014-03-14 2015-03-13 Производные гексозы, их получение и применение RU2731563C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461953392P 2014-03-14 2014-03-14
US61/953,392 2014-03-14
PCT/PT2015/050001 WO2015137838A1 (en) 2014-03-14 2015-03-13 Hexose derivatives, preparation and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016140337A RU2016140337A (ru) 2018-04-17
RU2016140337A3 RU2016140337A3 (ru) 2018-10-30
RU2731563C2 true RU2731563C2 (ru) 2020-09-04

Family

ID=53264710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016140337A RU2731563C2 (ru) 2014-03-14 2015-03-13 Производные гексозы, их получение и применение

Country Status (12)

Country Link
US (2) US11708387B2 (ru)
EP (1) EP3116886A1 (ru)
JP (2) JP7067867B2 (ru)
KR (3) KR102401853B1 (ru)
CN (2) CN115448964A (ru)
BR (1) BR112016021231B1 (ru)
CA (1) CA2942635C (ru)
IL (1) IL247531B (ru)
MX (1) MX2016011808A (ru)
RU (1) RU2731563C2 (ru)
SG (2) SG11201607530XA (ru)
WO (1) WO2015137838A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115448964A (zh) * 2014-03-14 2022-12-09 里斯本大学科学与技术学院 己糖衍生物及其制剂和用途
FR3061013B1 (fr) * 2016-12-22 2020-04-17 Greenpharma Composition contenant le digeneaside, son procede d'obtention et son utilisation cosmetique, veterinaire ou nutraceutique
CN111683957A (zh) * 2017-11-13 2020-09-18 埃克斯特雷莫凯姆有限公司 作为用于生物分子的稳定剂的中性糖基化酰胺和双阴离子葡萄糖醛酸化的酸

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097652A2 (en) * 2006-02-24 2007-08-30 STAB VIDA, Investigação e Serviços em Ciências Biológicas, Lda Synthetic mannosylglycerate derivatives for the stabilisation and preservation of biomaterials
RU2008126716A (ru) * 2005-12-01 2010-01-10 Байоматрика, Инк. (Us) Объединение процессов хранения образцов и управления образцами в медико-биологических науках
US20130143787A1 (en) * 2010-07-27 2013-06-06 Henkel Ag & Co. Kgaa Stabilized liquid enzyme-containing surfactant preparation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT103441A (pt) 2006-02-24 2007-08-24 Stab Vida Investigacao E Servi Utilização de solutos compatíveis para melhorar o desempenho de técnicas utilizando materiais biológicos imobilizados
DE102011118027A1 (de) * 2011-09-12 2013-03-14 Henkel Ag & Co. Kgaa Verfahren zur Anpassung eines Hydrolytischen Enzyms an eine das hydrolytische Enzym stabilisierende Komponente
CN115448964A (zh) 2014-03-14 2022-12-09 里斯本大学科学与技术学院 己糖衍生物及其制剂和用途
JP2020097767A (ja) 2018-12-18 2020-06-25 株式会社東芝 表面処理剤、これを用いた積層体、及び無電解めっき製品

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2008126716A (ru) * 2005-12-01 2010-01-10 Байоматрика, Инк. (Us) Объединение процессов хранения образцов и управления образцами в медико-биологических науках
WO2007097652A2 (en) * 2006-02-24 2007-08-30 STAB VIDA, Investigação e Serviços em Ciências Biológicas, Lda Synthetic mannosylglycerate derivatives for the stabilisation and preservation of biomaterials
US20130143787A1 (en) * 2010-07-27 2013-06-06 Henkel Ag & Co. Kgaa Stabilized liquid enzyme-containing surfactant preparation

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ahmed Khodair et al., Synthesis, 2004, N1, 53-58. *
Ascencio S D, Carbohydrate research, 2006, vol 341, N5, 677-682. *
Ascencio S D, Carbohydrate research, 2006, vol 341, N5, 677-682. Faria T Q et al., Carbohydrate research, 2008, vol. 343, N18, 3025-3033. Sawangwan T. et al., Organic&biomolecular chemistry, 2009, vol. 7, 4267-4270. Rotzoll N et al., Journal of agricultural and food chemistry, American Chеmical Society, 2005, vol 53, N10, 4149-4156. Timell T.E., Canadian Journal of chemistry, 1964, vol. 42, N6, 1456-1472. *
Carlos A. Stortz et al., Carbohydrate research, 1990, vol. 207, N1, 101-120. *
Faria T Q et al., Carbohydrate research, 2008, vol. 343, N18, 3025-3033. *
Hermanson K et al, Phytochemistry, 1990, vol. 29, N2, 513-515. *
Hermanson K et al, Phytochemistry, 1990, vol. 29, N2, 513-515. Shimoda et al., Tetraheron Letters, 2007, vol. 49, N4, 601-604. Listkowski et al., Tetrahedron Asymmetry, 2007, vol. 18, N18, 2201-2210. Sanil V. Sharma et al., Angewandte chemie international edition, 2011, vol. 50, N31, 7101-7104. Carlos A. Stortz et al., Carbohydrate research, 1990, vol. 207, N1, 101-120. Tomabechi Y et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, vol. 18, N 3, 1259-1264. Katsuhiko Suzuki et al, Journal of carbohydrate chemistry, 2005, vol. 24, N1, 73-84. *
Katsuhiko Suzuki et al, Journal of carbohydrate chemistry, 2005, vol. 24, N1, 73-84. *
Listkowski et al., Tetrahedron Asymmetry, 2007, vol. 18, N18, 2201-2210. *
Rotzoll N et al., Journal of agricultural and food chemistry, American Chеmical Society, 2005, vol 53, N10, 4149-4156. *
Sanil V. Sharma et al., Angewandte chemie international edition, 2011, vol. 50, N31, 7101-7104. *
Sawangwan T. et al., Organic&biomolecular chemistry, 2009, vol. 7, 4267-4270. *
Shimoda et al., Tetraheron Letters, 2007, vol. 49, N4, 601-604. *
Timell T.E., Canadian Journal of chemistry, 1964, vol. 42, N6, 1456-1472 *
Tomabechi Y et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, vol. 18, N 3, 1259-1264. *

Also Published As

Publication number Publication date
IL247531B (en) 2021-04-29
KR102401853B1 (ko) 2022-05-25
CA2942635C (en) 2022-12-06
JP7077361B2 (ja) 2022-05-30
US11708387B2 (en) 2023-07-25
MX2016011808A (es) 2017-05-09
WO2015137838A1 (en) 2015-09-17
BR112016021231A2 (pt) 2018-07-10
US20230357301A1 (en) 2023-11-09
JP2017516838A (ja) 2017-06-22
RU2016140337A (ru) 2018-04-17
SG10201807891UA (en) 2018-10-30
JP7067867B2 (ja) 2022-05-16
JP2020183383A (ja) 2020-11-12
IL247531A0 (en) 2016-11-30
CN115448964A (zh) 2022-12-09
KR102651029B1 (ko) 2024-03-25
CA2942635A1 (en) 2015-09-17
KR20220153571A (ko) 2022-11-18
KR20240045328A (ko) 2024-04-05
BR112016021231B1 (pt) 2021-07-27
CN106573952A (zh) 2017-04-19
RU2016140337A3 (ru) 2018-10-30
EP3116886A1 (en) 2017-01-18
KR20160145584A (ko) 2016-12-20
US20180170955A1 (en) 2018-06-21
SG11201607530XA (en) 2016-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230357301A1 (en) Hexose derivatives, preparation and uses thereof
Okayama et al. The influence of p-nitrophenyl β-D-xyloside on the synthesis of proteochondroitin sulfate by slices of embryonic chick cartilage
Johnston et al. Synthesis of thio-linked disaccharides by 1→ 2 intramolecular thioglycosyl migration: oxacarbenium versus episulfonium ion intermediates
Wang et al. Synthesis of a suite of click-compatible sugar analogs for probing carbohydrate metabolism
Staehelin et al. N-deacetylation of Sinorhizobium meliloti Nod factors increases their stability in the Medicago sativa rhizosphere and decreases their biological activity
JP2007084484A (ja) 皮膚外用剤
CZ20023469A3 (cs) Lipopolysacharidy
Shashkov et al. Cell wall anionic polymers of Streptomyces sp. MB-8, the causative agent of potato scab
Busse et al. Galactose‐phosphonates as mimetics of the sialyltransfer by trypanosomal sialidases
Lourenço et al. The synthesis of compatible solute analogues—solvent effects on selective glycosylation
Allen et al. Syntheses of novel azasugar-containing mimics of heparan sulfate fragments as potential heparanase inhibitors
Pradhan et al. Synthesis of nonulosonic acids
Batrakov et al. Glycolipids of the filamentous fungus Absidia corymbifera F-295
Mills et al. The glycolipid involved in chitin synthesis by zoospores ofBlastocladiella emersonii is a monoglucosyldiacylglycerol
Lu et al. Structure of a major glycolipid from Thermus oshimai NTU-063
Wallace et al. Red algal molecules-Synthesis of methyl neo-β-carrabioside and its S-linked variant via two synthetic routes: a late stage ring closure and using a 3, 6-anhydro-D-galactosyl donor
Kumar et al. Novozyme-435: perfect catalyst for chemo-and regio-selective synthesis of modified carbohydrates–a review
Tamai et al. Less polar glycolipids in Alaskan pollack brain: isolation and characterization of acyl galactosyl diacylglycerol, acyl galactosyl ceramide, and acyl glucosyl ceramide.
Lamosa et al. A unique glyceryl diglycoside identified in the thermophilic, radiation-resistant bacterium Rubrobacter xylanophilus
Me2S2 4.4 2-Iodoalkylidene Acetals as Tether
JP2004059536A (ja) 新規擬似糖質、並びに新規擬似糖質を含む糖鎖合成用プライマーおよびグリコシダーゼ阻害剤
JP2022022995A (ja) 結合型セラミド産生促進剤
Lourenço Synthesis of new enzyme stabilisers inspired by compatible solutes of hyperthermophilic microorganisms
Tamura et al. Synthesis of linear-type chondroitin clusters having a C8 spacer between disaccharide moieties and enzymatic transfer of d-glucuronic acid to the artificial glycans
ES2554565B2 (es) Cepas bacterianas y sus usos en reacciones de acilación y/o desacilación