PT103441A - Utilização de solutos compatíveis para melhorar o desempenho de técnicas utilizando materiais biológicos imobilizados - Google Patents

Abstract

ESTA INVENÇÃO TEM POR BASE A APLICAÇÃO DE SOLUTOS COMPATÍVEIS A MATERIAIS BIOLÓGICOS IMOBILIZADOS OU A IMOBILIZAR DE FORMA A MELHORAR O DESEMPENHO DE TÉCNICAS UTILIZANDO OS MESMOS, NOMEADAMENTE, MICRORREDES DE ÁCIDOS NUCLEICOS E DE PROTEÍNAS OU BIOSENSORES. OS SOLUTOS COMPATÍVEIS EM QUESTÃO SÃO SELECCIONADOS A PARTIR DE UM GRUPO QUE INCLUÍ O MANOSILGLICERATO (MC) E OS SEUS TRÊS DERIVADOS, MANOSILGLICERAMIDA (MOA), MANOSILGLICEROL (MOOR) E MANOSIL-LACTATO (MGLAC), E AINDA O 1,1-DIGLICEROL FOSFATO (OOP), A ECTOINA, A HIDROXIECTOINA E/OU DERIVADOS OU COMBINAÇÕES DESTES COMPOSTOS. O MELHORAMENTO DO DESEMPENHO DAS TÉCNICAS MENCIONADAS PODE SER DEVIDO A UM MELHOR ESTADO DE CONSERVAÇÃO DO MATERIAL A IMOBILIZAR, LEVANDO UM AUMENTO DA VIDA ÚTIL DO MATERIAL A UTILIZAR, E/OU UMA DIMINUIÇÃO DOS REQUISITOS DE ARMAZENAMENTO E/OU TRANSPORTE, UMA DEPOSIÇÃO MAIS EFICIENTE E UNIFORME DO MATERIAL SOBRE O SUPORTE, UMA MAIOR EFICÁCIA E/OU ESPECIFICIDADE DA HIBRIDAÇÃO DO MATERIAL MARCADO, TUDO ISTO ORIGINANDO UM AUMENTO DA RAZÃO SINAL/RUÍDO DE FUNDO.

Description

«fpocsiset m m mm&mm ©ioló&icõs «imi a BI gOMÍTOS COMÍMI^SIS fim ^MOlâE 0 DISI»NBO DE TÉCNICAS OTmaA88>0 MM® IMS BlÒ&toCOS IrámMDO® domínio técnico A presente invenção consiste na aplicação de solutos compatíveis com capacidade estabilizadora de biomateriais, assim como dos seus derivados e combinações, para o melhoramento de desempenho de técnicas utilizando materiais biológicos imobilizados, quer no desenvolvimento de metodologias aperfeiçoadas de utilização, quer na conservação e transporte dos suportes e amostras a utilizar nessas mesmas técnicas, como por exemplo, as decorrentes das microrredes de ADN, bem como as relativas as microrredes de proteínas e dos biossensores em vias de desenvolvimento, em biologia molecular.

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR

Uma grande variedade de microrganismos acumulam dentro da célula solutos de baixo peso molecular em níveis elevados quando sujeitos a condições ambientais extremas, nomeadamente agressões osmóticas ou térmicas. Estes solutos servem, de uma forma geral, como osmólitos em organismos halotolerantes ou halófilos. A variedade de solutos acumulada é relativamente baixa, e circunscreve-se a poucas categorias de compostos. Estes, incluem polióis, açúcares e derivados, aminoácidos e substâncias derivadas de aminoácidos, betaínas, ectoínas e oligopeptídeos (Brown 1979).

Para além de serem compatíveis com a actividade celular normal, crê-se que os osmólitos, acumulados em condições de

agressão ambiental, exercem um efeito estabilizador sobre os componentes celulares. Constatou-se que os solutos compatíveis têm um efeito estabilizador das proteínas, quer quando estas são sujeitas a agressão térmica, quer na presença de agentes desnaturantes, como detergentes, solventes orgânicos, ureia ou cloreto de guanidina (Arakawa e Timasheff, 1985) . 0 manosilglicerato (MG) é um soluto compatível derivado de manose que é acumulado por alguns microorganismos termófilos e hipertermófilos principalmente como resposta a agressão osmótica. (Santos e da Costa, 2002). O MG foi inicialmente identificado em algas vermelhas da família Ceramiales (Bouveng et al., 1955), nunca tendo sido observado em procariotas mesófilos. Entre os microorganismos que acumulam MG destacam-se os termófilos e hipertermófilos moderadamente halófilos dos domínios Archaea e bactéria, nomeadamente entre os géneros Pyrococcus, Thermococcus, Archaeoglobus, Aeropyrum, Thermus, e Rhodothermus (Martins e Santos, 1995; Lamosa et al., 1998; Nunes et al., 1995). A partir da observação da invariável associação do manosilglicerato a organismos característicos de ambientes de elevada temperatura, especulou-se sobre se este composto desempenharia um papel protector de estruturas biológicas de forma superior a dos seus homólogos mesófilos, contra os efeitos da temperatura elevada. De facto, experiências subsequentes demonstraram que o MG assim como a sua derivada amídica, a manosilgliceramida (MGA), são sem dúvida excelentes estabilizadores de proteínas contra a desnaturação térmica (Ramos et al., 1997; Santos et al., 1998). A mesma elevada capacidade estabilizadora foi também demonstrada para algumas variantes sintéticas do manosilglycerato, em particular para o manosilglicerol e para o manosil-lactato (Patente submetida).

ΐ ΐ ΐ ÍllllllirnilllllllllllllllliiiilliiiiijWW>WÉÉÉÉÉMÉÉÉÍ Ο fosfato de diglicerol é um soluto compatível raro, apenas encontrado em espécies do género Archaeoglogus, um arqueão hipertermófilo. Uma vez investigado, este composto também revelou possuir propriedades notáveis para a estabilização de proteínas em solução (Lamosa et al., 2000).

As ectoínas (tanto a ectoína simples como a sua versão hidroxilada, a hidroxiectoína) ocorrem em organismos halófilos mesófilos. Estão descritos para estes compostos propriedades protectoras que incluem não só a protecção estrutural de proteínas, ácidos nucleicos e vacinas em solução como propriedades de supressão de radicais livres de oxigénio e de hidratação de tecidos entre outras (Knapp et al., 1999; Malim et al., 1999) . O mecanismo através do qual estes, estes solutos de elevada capacidade estabilizadora de materiais biológicos em solução actuam ainda está por esclarecer. Uma das teorias mais difundidas baseia-se no facto de uma solução aquosa de compostos de baixo peso molecular apresentar propriedades físicas distintas da água; particularmente, de se observar na mesma um aumento da tensão superficial do líquido. Este aumento tem como consequência um estado de maior organização estrutural da água nas camadas de hidratação das proteínas. Este efeito leva a uma diminuição da entropia das camadas de hidratação, processo que por si só é termodinamicamente desfavorável, e que portanto, conduz a minimização da área de interface água/proteína. O processo de desnaturação proteica implica a abertura das cadeias laterais das proteínas e um aumento da área de exposição das mesmas ao solvente. Como tal, a adição de solutos a uma solução proteica diminui a área exposta da proteína dificultando o processo de desnaturação.

Daqui resulta uma razão proteína nativa/proteína desnaturada mais elevado (Arakawa e Timasheff 1985) .

Relativamente aos ácidos nucleicos, não existem resultados prévios que demonstrem qual o efeito dos solutos compatíveis na sua estabilidade in vitro. Sabe-se que a estabilização da dupla hélice do ADN depende do tamanho da molécula; quanto mais longa, mais elevada a temperatura de fusão, ou melting (Tm) . 0 conteúdo em emparelhamentos guanina-citosina (%GC)

também influencia a Tm, na razão: Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) °C

(Breslauer et al., 1986; Freier et al., 1986), a uma concentração constante de cloreto de sódio (NaCl) de 1M. A concentração salina (ex. [KCl]) é importante, uma vez que o sal, devido a sua polaridade, anula parcialmente as cargas negativas presentes nos grupos fosfato do ADN, que têm a tendência para se repelir. Este efeito estabilizador da molécula de ADN devido a força iónica do sal presente na solução, é traduzido matematicamente pela expressão: Tm = Tmstd + 16.6 (log C), onde C < 1M e C = concentração salina, ex. KCl. A implicação natural desta expressão matemática é de que a estabilização da molécula de ADN é tanto maior quanto maior for a concentração salina: um efeito da força iónica denominado de polielectrolítico (Record et al., 1978; Manning, 1978; Le Bret and Zimm, 1984). Por último, o número de emparelhamentos erróneos, ou mismatches, tem influência na TV Tm = Tmstd - 0.71 (% mismatch) . Quanto maior o número de emparelhamentos imperfeitos (outros que não os naturais, Watson e Crick, A-T e G-C), menos estável a ligação inter-cadeias e consequentemente, mais baixa a Tm (Breslauer et al., 1986; Freier et al., 1986).

Pode-se concluir que os dois factores que afectam a Tm são o efeito polielectrolítico (Record et al., 1978; Manning, 1978; Le Bret and Zimm, 1984) e a composição da molécula de ADN em termos de %GC (Breslauer et al., 1986; Freier et al., 1986). Sendo assim, a dependência da Tm da concentração salina e %GC pode ser representada empiricamente pela expressão: Tm = 16.6 log (S) + 41.5 (XGc) + 81.5, onde Tm = temperatura de desnaturação, S = concentração total de iões monovalentes (mol/L) , e XGc = fracção molar de pares de bases GC no ADN. Da expressão pode-se concluir que o efeito polielectrolitico é fortemente afectado pela força iónica do solvente, enquanto que o efeito da %GC é influenciado por qualquer aditivo que altere a hidrofobicidade do solvente (Rees et al, 1993).

Observações na base desta invenção demonstram que os solutos compatíveis são capazes de exercer uma actividade estabilizadora em materiais biológicos in vitro, em solução, o que os torna susceptíveis de proporcionar estabilidade acrescida a materiais biológicos imobilizados. Esta observação não é uma simples extensão de um conceito previamente estabelecido, uma vez que a imobilização destes materiais altera radicalmente as suas propriedades físicas, nomeadamente a sua estabilidade. Os mecanismos que explicariam um acréscimo de estabilidade a materiais biológicos em solução não são portanto extensíveis, de forma linear, a materiais biológicos imobilizados. Acresce que a própria imobilização dos materiais acarreta desafios estruturais específicos, nos quais a preservação da sua forma/função não depende necessariamente da sua estabilidade em solução.

Estas novas observações abrem uma janela de oportunidades para a aplicação de solutos compatíveis de elevada capacidade estabilizadora a técnicas utilizando materiais biológicos imobilizados, em particular, microrredes e biossensores. É também de notar que o efeito benéfico destas novas aplicações não se prende apenas com os efeitos estabilizadores/estruturais conferidos por estes solutos aos materiais biológicos imobilizados ou a imobilizar mas também, e de forma fundamental, com a especificidade acrescida que estes podem conferir ás técnicas mencionadas, como ficará evidente da leitura dos exemplos que se seguirão (ver secção de exemplos). A tecnologia das microrredes de ADN, ARN e proteínas constitui hoje em dia um dos mais importantes sustentáculos da área da Biologia Molecular no que se refere a análise da expressão global dos transcriptomas e proteomas e baseia-se na deposição e imobilização de material biológico (ADN, ARN, proteína) em locais (posições) com coordenadas pré-definidas numa superfície sólida. 0 princípio básico por trás do funcionamento das microrredes não é mais do que a interacção específica entre as moléculas imobilizadas no suporte sólido (sondas) e as moléculas que com elas interagem especificamente (alvos).

Uma solução de hibridação contendo a amostra de moléculas alvo marcadas quimicamente promove os contactos entre estas e as moléculas sonda imobilizadas. Depois do passo de hibridação a microrrede é lavada para remover moléculas-alvo não inter-actuantes e agentes de marcação não incorporados.

Finalmente, a marcação proveniente das moléculas alvo inter-actuantes com as moléculas sonda (ex. duplexes de ácidos nucleicos ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN ou proteína/proteína) é medida e quantificada através de um detector acoplado a hardware e software apropriados. No caso das microrredes de proteínas, estas distinguem-se em duas classes: as de fase directa, em que, tal como nas microrredes de ácidos nucleicos, os analitos, ou moléculas alvo, são capturados a partir da solução de hibridação, e as de fase reversa, em que os analitos estão fixados no suporte sólido. Tipicamente, nas microrredes de proteínas de fase directa, uma molécula sonda, como seja um anticorpo é imobilizado no suporte sólido com o intuito de capturar os analitos, que podem ser proteínas purificadas ou em soluções complexas como sejam lisados celulares ou mesmo preparações de tecidos celulares. Os analitos que se ligam aos anticorpos imobilizados são detectados através de marcação directa ou através de um anticorpo secundário marcado.

No caso das microrredes de proteínas de fase reversa, os analitos (tipicamente proteínas purificadas ou lisados celulares) são fixados directamente no suporte sólido e anticorpos ou proteínas inter-actuantes (proteínas inteiras, domínios de ligação ou simplesmente péptidos) são aplicados na solução de hibridação. Os analitos neste caso são marcados directamente ou detectados através de técnicas envolvendo amplificação do sinal.

Apesar da enorme variedade de tipos de microrredes já disponíveis, as microrredes contendo oligonucleótidos de ADN imobilizados numa superfície sólida pré-tratada quimicamente, são de longe as mais utilizadas em todos os ramos de investigação e diagnóstico. Nomeadamente, as microrredes do tipo da Affymetrix são neste momento as mais utilizadas a escala mundial para ensaios de diagnóstico e expressão genética comparativa, permitindo a análise da expressão genética global em vários organismos.

As microrredes do tipo GeneChip® da Affymetrix, apesar da sua enorme utilização, estão também ainda numa fase relativamente recente do seu desenvolvimento, havendo ainda possibilidade de melhorar o seu desempenho em vários parâmetros. Parâmetros estes que dificultam muitas vezes a comparação de resultados obtidos a partir experiências e de plataformas diferentes, afectando seriamente a sua reprodutibilidade.

Um dos problemas principais na análise das microrredes em geral consiste no ruído de fundo que provém do suporte sólido.

Até agora, este problema tem vindo a ser abordado através da optimização das condições de lavagem, nomeadamente das condições de restringência (passos mais ou menos desnaturantes, variando a temperatura, a concentração salina, e a presença de detergentes), e da tentativa de incrementar a quantidade e a qualidade do sinal que pode ser obtido a partir de cada posição na microrrede.

Na generalidade, o ideal seria encontrar um meio alternativo de estabilizar os complexos resultantes de hibridações específicas nas microrredes, de forma que, após o passo de lavagem, se aumentasse o número de locais/coordenadas nas microrredes a partir das quais se obtivessem maiores quantidades de sinal e com um grau de confiança estatisticamente mais significativo.

Por sua vez, o desenvolvimento da tecnologia dos biosensores levou a sua aplicação aos mais variados campos de actividade. De forma genérica, um biossensor pode ser definido como um aparelho analítico compacto incorporando um elemento sensitivo de origem biológica. Este elemento está integrado, ou intimamente associado, a um transdutor físico-químico capaz de produzir um sinal electrónico proporcional a quantidade de um analito ou grupo de analitos. A função do componente biológico nos biossensores é portanto, tal como no caso das microrredes, de reconhecimento de analitos, ou moléculas alvo. Desta forma, uma enzima irá reagir a presença do seu substrato específico, convertendo-o num produto mensurável, anticorpos ligar-se-ão a antigénios específicos, enquanto que biossensores baseados em ácidos nucleicos dependerão também, tal como as microrredes, da complementaridade entre as sequências das moléculas sonda e moléculas alvo. 0 biossensor com maior êxito comercial até a data é sem dúvida o destinado a determinação do teor de glucose no sangue, sendo que ocupa uma parcela superior a 90% da cota de mercado, cotada em mais de sete biliões de euros. Este instrumento é um exemplo de biossensor baseado na imobilização de uma enzima, a glucose oxidase (GOx), a superfície de um eléctrodo transdutor acoplado a um detector electroquímico. A montagem do transdutor é feita através de um processo de impressão da enzima no eléctrodo que permite a produção em massa a custos muito baixos. O sucesso comercial do biossensor para a glucose do sangue é devido principalmente a dois factores: a expansão do número de pacientes afectados pela diabetes e a natureza da GOx, caracterizada por uma robustez estrutural que permite um imobilização sem grandes efeitos nefastos para a sua actividade. Na verdade, a razão principal pela qual muitos outros biossensores não atingiram o sucesso comercial do da glucose do sangue foi a natureza estruturalmente mais instável do material a imobilizar. A maioria das enzimas, anticorpos e ácidos nucleicos são moléculas de natureza frágil e lábil, especialmente quando removidas do seu ambiente biológico nativo. Os meios de preservação da integridade estrutural e funcional destas moléculas tornaram-se portanto vitais para a indústria dos biossensores.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO A presente invenção divulga um processo de estabilização de materiais biológicos tendo por base a aplicação de solutos compatíveis a esses materiais biológicos imobilizados ou a imobilizar de forma a melhorar o desempenho de técnicas utilizando os mesmos, nomeadamente, as microrredes de ácidos nucleicos e de proteínas ou biossensores.

Os solutos compatíveis em questão são seleccionados a partir de um grupo que inclui manosilglicerato (MG) e os seus três derivados manosilgliceramida (MGA), manosilglicerol (MGOH) e manosil-lactato (MGLac), o diglicerol fosfato (DGP), a ectoína, a hidroxiectoína e/ou derivados ou combinações destes compostos. A invenção vem contribuir substancialmente para ultrapassar um dos problemas principais na análise das microrredes que consiste no ruído de fundo que provém do suporte sólido. A fórmula encontrada para a solução deste problema foi a de aplicar os solutos, tirando partido das suas propriedades estabilizadoras, as soluções de armazenamento do material biológico a imobilizar, as soluções de hibridação entre as moléculas sonda imobilizadas e as moléculas alvo, e/ou as soluções de fixação das moléculas sonda nos suportes sólidos. 0 melhoramento do desempenho das técnicas mencionadas, divulgado nesta invenção através de exemplos elucidativos, é portanto devido a um ou mais dos seguintes factores: um melhor estado de conservação do material a imobilizar, levando a um aumento da vida útil do material a utilizar, e/ou uma diminuição dos requisitos de armazenamento e/ou transporte, uma deposição mais eficiente e uniforme do material sobre o suporte, uma maior eficácia e/ou especificidade da hibridação do material marcado, tudo isto originando um aumento da razão sinal/ruido de fundo.

Como os exemplos descritos abaixo demonstram a invenção é suportada por evidencias claras de que os solutos compatíveis têm capacidade de preservar material biológico, prolongando a sua integridade no tempo, não se perdendo a competência das moléculas, por exemplo de ácidos nucleicos e proteínas, para serem utilizadas experimentalmente.

Isto traz grandes benefícios, nomeadamente para a preservação de longa duração de amostras biológicas, assim como para o transporte das mesmas, sendo que a capacidade estabilizadora dos solutos utilizados se exerce num intervalo alargado de temperaturas, incluindo a temperatura ambiente, a qual o transporte via correio se torna menos dispendioso (ver exemplos 1-3).

Desta forma, foram aplicados os solutos compatíveis como meio de estabilizar as interacções resultantes de hibridações específicas nas tecnologias baseadas em imobilização de material biológico de forma a melhorar o seu desempenho e fiabilidade.

Para o efeito utilizaram-se as microrredes de oligonucleótidos de ADN comerciais do tipo Θβη&€&'%$* da Affymetrix, microrredes artesanais de proteínas e biossensores.

Nas microrredes do tipo SSi*5i|? da Affymetrix existem múltiplos pares de sondas (ex. 11 pares) para cada gene representado na microrrede, escolhidos a partir do terminal 3' da respectiva sequência do ARNm. Cada par consiste numa sonda cuja sequência é perfeitamente complementar a sequência alvo (PM - perfect match) e numa sonda cuja sequência é idêntica a PM com excepção de uma única base alterada no centro do oligonucleótido (MM - mismatch), permitindo desta forma a quantificação e subtracção dos sinais provenientes da hibridação não especifica. A amostra (moléculas alvo) que se pretende analisar no é preparada a partir de células ou tecidos, de onde é isolado ARN total. A invenção demonstra que a aplicação dos solutos compatíveis no tampão de hibridação das microrredes do tipo da

Affymetrix melhora o desempenho das mesmas no que concerne ao aumento dos sinais totais e reais, com consequente aumento da razão entre o sinal total e o ruído de fundo, assim como ao aumento do número de locais, ou coordenadas, nas microrredes a partir das quais se obtêm sinais reais com um grau de confiança estatisticamente mais fiável para serem usados e interpretados experimentalmente (ver exemplo 4).

No caso das microrredes de proteínas, a invenção baseou-se num modelo onde epitopos diferentes de proteínas marcadas/ligadas com a Glutationa S-transferase (GST), domínios diferentes de ligação a GST e anticorpos foram misturados com solutos compatíveis e imobilizados em lâminas de vidro cobertos com poli-L-lisina.

Neste modelo de microrredes, baseadas em proteínas imobilizadas, o termo de comparação foram os mesmos materiais imobilizados sem a presença dos solutos. As diferentes proteínas imobilizadas foram detectadas após hibridação com um anticorpo primário seguido de um anticorpo secundário marcado com uma sonda fluorescênte. Demonstra-se que a aplicação dos solutos compatíveis na solução de imobilização/fixação dos materiais biológicos nas microrredes melhora a desempenho das mesmas no que concerne a eficiência e uniformização do depósito do material sobre o suporte, ao aumento dos sinais totais e reais, com consequente aumento da razão entre o sinal total e o ruído de fundo, assim como ao aumento da sensibilidade da técnica, permitindo utilizar menos quantidade de material imobilizado para a obtenção de resultados de qualidade (ver exemplo 5).

No caso dos biossensores, estes devem também, tal como as microrredes, exibir estabilidade ao nível da sua conservação e armazenamento, assim como estabilidade operacional durante o uso.

Os factores que podem levar a desestabilização do biossensor, como seja a desactivação duma enzima imobilizada, podem ser de várias ordens, por exemplo, a desnaturação, a perca de co-factores essenciais, a agregação proteica, inibição irreversível, proteólise, degradação microbiana a alterações químicas a estrutura funcional. Na maioria dos casos, o processo de desestabilização do biossensor envolve mais do que um destes factores. Esta invenção vem adicionar um leque de soluções dentro da estratégia que tem vindo a ser mais utilizada no sentido de preservar as qualidades do material imobilizado, que consiste na utilização de aditivos a solução de imobilização.

Aditivos como polímeros neutros ou carregados, sais, tampões, e compostos destinados a modificar a camada de hidratação, como sejam açúcares de pequeno peso molecular (tais como a trealose e a sucrose), ou poli-álcoois (como sejam o glicerol, sorbitol ou o lactitol) têm vindo a ser utilizados com algum sucesso. No entanto, mais do que no caso das microrredes, a estabilização dos materiais a imobilizar utilizados nos biossensores depende muito da especificidade desses mesmos materiais, fazendo com que seja essencial existir um leque muito mais vasto de soluções para colmatar tamanha diversidade. 0 exemplo 6 descrito nesta patente demonstra como os solutos compatíveis podem servir como alternativas mais eficazes a preservação da actividade enzimática de proteínas (glucose oxidase) imobilizadas em biossensores durante o período de armazenamento.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras IA e 1B - representam a acção do DGP na estabilização da dupla hélice do duplex SX/S2. A figura IA mostra um aumento da Tm do duplex S1/S2 em função da concentração de DGP, medida através da técnica de calorimetria. Uma estabilização máxima é atingida com DGP a uma concentração de 0,3 M em solução.

Os valores de Tm obtidos foram respectivamente 0,03°C), •'X' -* .js < (I e (I 0 para as três concentrações de DGP testadas, 0,25 M, 0,5 M e 1 M. A Figura 1B refere-se a representação gráfica dos termogramas obtidos para a dupla-hélice do duplex de ADN §1/32* tanto na presença apenas do tampão SSC 0,1% (controlo), como das três concentrações de DGP. 0 gráfico mostra a variação da capacidade calorífica (Cp; Kcal/mole/°C) da amostra em função da temperatura. Verifica-se que existe um pico correspondente ao máximo de energia necessário para a separação das cadeias de ADN. A diferença observada entre o controlo e a amostra na presença do soluto pode ser medida através da deslocação dos picos para a direita no eixo das abcissas, uma indicação de que desnaturação da dupla hélice se efectuou a temperaturas mais elevadas.

Figura 2 - Estabilização do ARN total a temperatura ambiente.

Amostras de 20 μg de ARN (500 ng/μΐ) extraído de Escherichia coli foram dissolvidas em água tratada para a ausência de ribonucleases (tratamento com DEPC) e mantidas a temperatura ambiente (~24°C) durante 12 semanas na ausência e na presença de concentrações crescentes (50 mM, 100 mM e 250 mM) de MG, MGA e DGP. Amostras de 500 ng foram colhidas ao longo do tempo e corridas através de electroforese em gel de agarose para verificar a sua integridade. A integridade foi medida através da observação de três bandas visíveis, correspondendo as três formas mais abundantes de RNA ribossomal (ARNr), com índices de sedimentação 30S, 23S e 5S respectivamente, após coloração do gel com brometo de etídio, e incidência com radiação Ultra Violeta. Assim, os ARNs mantidos a temperatura ambiente sem MG, MGA ou DGP começaram a mostrar sinais de degradação ao fim de 2 semanas enquanto que a presença de 50 mM MG, MGA e DGP retardou a degradação in vitro do ARN, evitando a sua degradação durante o período de 12, 6 e 10 semanas respectivamente. O marcador de peso molecular corrido em paralelo com as amostras foi o ADN do fago hdigerido com PstI.

Figura 3 - Estabilização do ARN por parte do MG e DGP, preservando a sua integridade e funcionalidade durante o transporte.

Figura 3A. Para analisar a integridade das amostras de ARN recorreu-se a electroforése capilar utilizando um Bioanalyser da marca Agilent. A figura mostra os resultados da análise por electroforése capilar onde se verifica que as amostras contendo os solutos, assim como a amostra conservada a -80°C se apresentavam integras, evidenciando-se se a presença de 3 bandas e de 3 picos no gel e nos fluorogramas respectivamente, correspondendo as três formas mais abundantes de ARN ribossomal (ARNr) , com índices de sedimentação 30S, 23S e 5S respectivamente. Por sua vez a amostra transportada na ausência de solutos compatíveis encontrava-se totalmente degradada (verifica-se isto pela presença de várias bandas, correspondendo aos produtos de degradação, na fotografia do gel, e de vários picos no fluorograma.

Figura 3B. Para analisar a funcionalidade biológica das amostras utilizaram-se vários kits comerciais para síntese de ADNc (Cloned AMV, Thermoscript e ainda Superscript III, todos provenientes da Invitrogen) a partir do ARN conservado nas condições acima descritas. A presença de ADNc foi visualizada em gel de agarose após electroforese através de um arrastamento que corresponde a ADNc produzido a partir de ARNm com distintas dimensões. Foi possível verificar que com a utilização dos três kits ocorreu consistentemente a formação de ADNc a partir das amostras conservadas na presença de MG ou DGP, assim como a partir da amostra controlo, conservada a -80°C.

Figura 4 - Aumento relativo do sinal real e da razão entre o sinal total e o ruído de fundo nos resultados obtidos a partir de microredes de proteínas, derivados da adição de solutos compatíveis a solução de imobilização/fixação.

Figura 4A. 0 gráfico mostra a variação do sinal real, relativamente ao controlo, para os dois canais, Cy5 e Cy3, dependendo do aditivo. 0 sinal foi determinado a partir da média das medianas do sinal (corrigido para o ruído de fundo) proveniente dos 4 epitopos diferentes da proteína ΡΙΝΙ, medidos a partir de 16 microredes hibridadas independentemente.

Figura 4B. 0 gráfico mostra a variação da razão, relativamente ao controlo, entre o sinal total e o ruído de fundo para os dois canais, Cy5 e Cy3, dependendo do aditivo. Os sinais totais e os ruídos de fundo foram determinados a partir das médias das medianas do sinal e do ruído de fundo respectivamente, provenientes dos 4 epitopos diferentes da proteína ΡΙΝΙ, medidos a partir de 16 microrredes hibridadas independentemente.

Figura 5 ~ Influência dos solutos compatíveis na actividade da glucose oxidase (GOx) imobilizada em biosensores durante o período de armazenamento.

Biossensores com eléctrodos activos baseados em GOx imobilizada foram armazenados durante 8 meses a 4°C. A actividade da GOx foi medida através da corrente gerada pela oxidação da glucose. 0 controlo refere-se a eléctrodos preparados sem a presença de qualquer soluto compatível. Concentrações dos solutos na solução de imobilização/fixação da GOx foram: ECT 100 mM; HECT 80 mM; MGA 50 mM; DGP 100 mM e MGLac 70 mM. EXEMPLO 1

As moléculas de ADN de cadeia dupla (dsADN) podem ser desemparelhadas/desnaturadas nas suas duas cadeias simples complementares (ssADN) através do aumento da temperatura do meio. A temperatura na qual 50% dos pares de bases já se encontram desemparelhados denomina-se temperatura de desnaturação, ou melting (Γ,) .

Neste exemplo, demonstra-se que a quantidade de calor, ou energia, necessária para desnaturar uma dupla hélice de ADN aumenta na presença do DGP em solução. Para isso procedeu-se a técnica da calorimetria, utilizando um modelo baseado em dois oligonucleótidos iSi e S2) complementares com 14 pares de bases: Sl-5'-GCGTCATACAGTGC-3'; S2-5'-GCACTGTATGACGC-3'.

Os oligonucleótidos foram dissolvidos em tampão SSC 0,1X, e dialisados contra o mesmo tampão. O seu emparelhamento foi promovido por uma incubação a 90°C durante 3 minutos no sentido de eliminar qualquer hibridação intra-molecular, seguida de um arrefecimento gradual a temperatura ambiente. Os ensaios de desnaturação térmica da dupla hélice foram realizados num VP-DSC MicroCalorimeter, da MicroCal, entre 10°C e 100°C e a uma taxa de aquecimento de 1°C /minuto.

Ambas as células do calorimetro, amostra e referência, encontravam-se sujeitas a uma pressão de 30 p.s.i, de N2.

Todos os ensaios foram realizados no mínimo três vezes. A concentração de ADN utilizada em cada ensaio foi de 88 μΜ, tendo sido testado o DGP em solução as concentrações de 0,25 Μ, 0,5 Μ e 1 Μ. Os termogramas resultantes foram analisados com o programa Origin, versão 5.0, da MicroCal.

Com base na bibliografia existente, o valor teórico da Tm da dupla hélice estaria entre os 52°C e os §$*£*> tendo o valor obtido com estes ensaios vindo a confirmar essa informação 151,14¾ ± 0#03s€).

Relativamente a acção do DGP na estabilização da dupla hélice, verifica-se uma variação da Tm em função da concentração de DGP. Verificou-se um máximo de estabilização com o DGP a uma concentração de 0,3 M em solução, a partir da qual não existem alterações significativas nos valores de Tm. Os valores de Tm obtidos foram respectivamente (± 0,03¾, 70,1¾¾ ( + 0,03¾) e 7'0i 13'!C (± para as três concentrações de DGP testadas, 0,25 M, 0,5 M e 1 M (Fig. IA) . A representação gráfica dos termogramas obtidos para a dupla-hélice de ADN, tanto na presença apenas do tampão SSC 0,1% (controlo), como das três concentrações de DGP (Fig. 1B) ilustra bem o resultado da variação da capacidade calorífica (Cp; Kcal/mole/°C) da amostra em função da temperatura. Verifica-se que existe um pico correspondente ao máximo de energia necessário para a separação das cadeias de ADN. A esta energia corresponde uma dada temperatura, denominada Tm. A diferença observada entre o controlo e a amostra na presença do soluto pode ser medida através da deslocação dos picos para a direita no eixo das abcissas, uma indicação de que desnaturação da dupla hélice se efectuou a temperaturas mais elevadas, e portanto, que houve uma estabilização da estrutura secundária das moléculas de ADN devido a presença de DGP em solução (Fig. 1B). EXEMPLO 2

Uma das preocupações inerentes a manipulação do ARN, como seja durante a sua aplicação nas experiências com microrredes, é a manutenção da sua integridade. É importante evitar ao máximo os naturalmente altos indices de degradação do ARN para que um eventual artefacto derivado da degradação de qualquer das amostras iniciais ou durante o processo de hibridação possa vir a influenciar os resultados. Assim, o MG, a MGA e o DGP foram testados como potenciais estabilizadores dos ARNs utilizados nestas experiências. Amostras de 20 μς de ARN total de Escherichia coli (500 ng/μΐ) dissolvidas em água tratada para a ausência de ribonucleases (tratamento com DEPC) foram mantidas a temperatura ambiente (~23°C) durante 12 semanas na ausência e na presença de concentrações crescentes (50 mM, 100 mM e 250 mM) de MG, MGA e DGP. Amostras de 500 ng foram colhidas ao longo do tempo e corridas através de electroforése em gel de agarose para verificar a sua integridade. A integridade foi medida através da observação de três bandas visíveis, correspondendo as três formas mais abundantes de ARN ribossomal (ARNr) , com índices de sedimentação 30S, 23S e 5S respectivamente, após coloração do gel com brometo de etídio, e incidência com radiação Ultra Violeta. Assim, os ARNs mantidos a temperatura ambiente sem MG, MGA ou DGP começaram a mostrar sinais de degradação ao fim de 2 semanas enquanto que a presença de 50 mM MG, MGA e DGP retardou a degradação in vitro do ARN, evitando a sua degradação durante o período de 12, 6 e 10 semanas respectivamente (Fig. 2). EXEMPLO 3

As propriedades estabilizadoras dos solutos compatíveis MG e DGP que levam a estabilização do material biológico preservando a sua integridade durante o transporte das mesmas a temperatura ambiente (temperatura a qual o transporte via correio se torna menos dispendioso) são demonstradas neste exemplo com o ARN total extraído a partir da linha celular HEK293 (células epiteliais de rim embrionário humano).

Assim, ARN total foi extraído de acordo com o protocolo do NucleoSpin RNAII-Kit (Macherey-Nagel).

As amostras (uma amostra contendo apenas ARN total em H20-DEPC e duas amostras contendo o ARN total em H2O-DEPC e 25mM MG ou 25mM DGP respectivamente) foram enviadas a partir da Universidade de Ferrara, Ferrara, Itália, para o laboratório da STAB VIDA Lda., Oeiras, Portugal, via correio, e sujeitas a temperatura ambiente, e respectivas variações da mesma inerentes ao transporte, durante 96 horas. Como controlo, foi ainda utilizada uma amostra do mesmo ARN mas que foi mantida a -80°C durante o período de transporte (com recurso a gelo seco) . Para analisar a integridade destas amostras recorreu-se a electroforese capilar utilizando um Bioanalyser da marca Agilent.

Os resultados da análise por electroforese capilar demonstram que as amostras contendo os solutos, assim como a amostra conservada a -80°C se apresentavam integras, evidenciando-se a presença de 3 bandas e de 3 picos no gel e nos fluorogramas, respectivamente, correspondendo as três formas mais abundantes de ARN ribossomal (ARNr) , com índices de sedimentação 30S, 23S e 5S, respectivamente.

Por sua vez a amostra transportada na ausência de solutos compatíveis encontrava-se totalmente degradada (verifica-se isto pela presença de várias bandas, correspondendo aos produtos de degradação, na fotografia do gel, e de vários picos no fluorograma - Fig.3A).

Efectuaram-se ainda estudos de competência para verificar se a presença dos solutos compatíveis em solução funcionaria como um factor inibidor ou indutor de reacções, como seja a síntese de ADN complementar (ADNc) a partir de ARN total, que utilizariam como molde este ARN conservado. Para isso, utilizaram-se vários kits comerciais para síntese de ADNc: Cloned AMV, Thermoscript e ainda Superscript III, todos provenientes da Invitrogen. De acordo com os resultados, verificou-se que, tanto o MG como o DGP, para além de preservarem a integridade do ARN total em condições de transporte também não interferiram com o funcionamento biológico do mesmo, tendo este ARN servido competentemente de molde para a síntese de ADNc (a presença de ADNc foi visualizada em gel de agarose após electroforese através de um arrastamento que corresponde a ADNc produzido a partir de ARNm com distintas dimensões - Fig.3B).

Foi de facto possível verificar que com a utilização dos três kits ocorreu consistentemente a formação de ADNc a partir das amostras conservadas na presença de MG ou DGP, assim como a partir da amostra controlo, conservada a -80°C. EXEMPLO 4

Neste exemplo demonstra-se como a aplicação dos solutos compatíveis no tampão de hibridação das microrredes de ADN, mais especificamente nas microrredes do tipo úmwChigf· da

Affymetrix, melhora a desempenho das mesmas no que concerne ao aumento dos sinais totais e reais, com consequente aumento da razão entre o sinal total e o ruído de fundo, assim como ao aumento do número de locais, ou coordenadas, nas microrredes a partir das quais se obtêm sinais reais, com um grau de confiança estatisticamente fiável para serem usados e interpretados experimentalmente. 0 protocolo utilizado foi de acordo com o Standard aconselhado pela firma MípiahUx ; rtr//w w .af f:r 1X .OCN /-5Upocrt /1uç:u; jç$ j /manua Λν>\\\ν^ν.ν.ν.ν>ν»ν»ν»ν»νν>ν>Λν.ν»ν»ν»ν»ν»ν»ν»ν»ν»ν»ν»ν»νννννν\\\\\\\\\\\\ν·

Assim, ARN total foi extraído de acordo com o protocolo do NucleoSpín RNAII-Kit (Macherey-Nagel) a partir da linha celular HEK293 (células epiteliais de rim embrionário humano). Utilizou-se depois este ARN para sintetizar ADNc em cadeia dupla contendo a sequência do promotor T7 no seu terminal 5'. Esta região foi então usada para transcrição in vitro, na qual nucleótidos marcados com biotina (biotina-ddUTP e biotina-ddCTP) foram incorporados, obtendo-se então ARNc.

Este segundo passo permitiu um aumento de aproximadamente lOOx do material inicial possibilitando utilizar apenas 5 pg de ARN total inicial. 0 ARNc marcado foi depois fragmentado, resultando daí moléculas com tamanhos entre 35-200 bases, e hibridado no GeneChip® durante 16 horas após marcação com um conjugado de estreptavidina fluorescente.

Após lavagem numa estação fluídica da Affymetrix, a intensidade da fluorescência em cada coordenada na microrrede foi medida com um detector Affymetrix GeneChip Scanner 3000, a um comprimento de onda de 570 nm.

As microrredes do tipo utilizadas foram mais especificamente os SfehéCh ip® Te st Arrays. Estas microrredes contêm grupos contendo 345 moléculas-alvo, consistindo de oligonucleótidos com tamanhos que variam entre os 16 os 25 nucleótidos de comprimento, representando sequências de ADN altamente conservadas entre espécies. 0 plano experimental consistiu na hibridação em triplicado (três amostras) de ú0.õèCM^f Te st Arrays fazendo variar a composição da solução de hibridação unicamente no que concerne ao conteúdo em termos de solutos compatíveis. Cada um dos solutos foi adicionado isoladamente a três concentrações diferentes (50 mM, 150 mM e 300 mM), sendo que o controlo consistiu num triplicado (um paralelo para cada concentração) de ensaios nos quais não foi adicionado qualquer aditivo a solução de hibridação.

Executaram-se depois três níveis de análise de resultados: 1- Intensidade média do sinal real obtido na presença dos solutos na sua globalidade versus intensidade média do sinal real obtido na ausência de solutos. 2- Intensidade média do sinal real obtido na presença de cada um dos solutos individualmente versus intensidade média do sinal real obtido na ausência de solutos. 3- Intensidade do sinal real de cada amostra versus intensidade do sinal real obtido a partir do controlo hibridado em paralelo (na mesma série).

Os resultados das análises estão resumidos nas tabelas seguintes:

Tabela I - Nível 1 de análise de resultados: Intensidade média do sinal real obtido na presença dos solutos na sua globalidade versus intensidade média do sinal real obtido na ausência de solutos (controlos). — Média dos controlos soas oi solutos Intensidade total (com ruído de fundo) 189260.6 173308.6 Intensidade real (sem ruído)* 117704.9 ΐ lí i. Ί: 7 ‘:,í: : % Intensidade real das amostras vs Intensidade real dos controlos +2L0%, | Intensidade do ruído de fundo* 71555.7 52131.4 % Intensidade do ruído das amostras vs Intensidade do ruído dos controlos -271% Intensidade total/ruído de fundo 2.64 3.32 % Incremento da intensidade total/Incremento do ruído fundo +25.7% *ρ<0.001

Na globalidade, e de acordo com a Tabela I, a presença dos solutos compatíveis na solução de hibridação incrementa a intensidade do sinal real em 3% em média, reduz o ruído de fundo em 27% em média, e aumenta a razão entre a intensidade do sinal total e o ruído de fundo em 25.7%.

Tabela XI - Nível 2 de análise de resultados: Intensidade média do sinal real obtido na presença de cada um dos solutos individualmente versus intensidade média do sinal real obtido na ausência de solutos. Média dos controlos Média na presença de DGP Média na presença de ECT Média na presença de HECT Média na presença de MG Média na presença de MGLac Intensidade total (com ruído de fundo) 189260.6 155205.4 188206.8 183128.9 153973.9 186028.3 Intensidade (sem ruído) 117704.9 116209.4 120918.1 139132.9 111499.2 118126.8 % Intensidade real das amostras vs Intensidade real dos controlos -1.3% +2.7% +18.2% -5.3% + 0. 4% Intensidade do ruído de fundo** 71555.7 38996.0 67288.7 43996.0 42474.7 67901.5 % Intensidade -dc; ruído das amostras vs Intensidade do ruído dos controlos -45.6% -6.0% -38.5% -40.7% -5.1% Intensidade total/ruido de 2.64 3.98 2.80 4.16 3.63 2.74 ;% Incremento da intensidade total/Incremento do ruído fundo L.......... 4-37.1% *1:; .6%

De acordo com a Tabela II, a HECT causou uma indução significativa, 18,2% do sinal real, todos os solutos compatíveis, a titulo individual, causaram uma redução do ruido de fundo em relação aos controlos, com especial incidência no DGP, HECT e MG. Como resultado, todos os solutos, a titulo individual, causaram um incremento na razão entre a intensidade do sinal real e o ruido de fundo, com especial incidência nos três compostos referidos anteriormente.

Tabela III - Nivel 3 de análise de resultados: Intensidade do sinal real de cada amostra versus intensidade do sinal real obtido a partir do controlo hibridado em paralelo (na mesma série) . Rácio dos valores p: p (controlo) / p (amostra) Onde p é o número de locais, ou coordenadas, na microrrede consideradas pelo software AffyMetrix GOCS como sendo locais de emissão a considerar Controlo série 1 Controlo série 2 Controlo série 3 l.DGP 150mM 0.014 2.DGP 30CmM 0.487 3. DGP 50mM 0.262 l.ECT 150mK 0.044 2.ECT 300mM 0.058 3.ECT 50mM 0.875 1.HECT 150mM 0.05

De acordo com a Tabela III, a concentração a qual os solutos compatíveis induziram o sinal total de forma a aumentar o número de locais, ou coordenadas, na microrede consideradas pelo software AffyMetrix GOCS como sendo locais de emissão a considerar, foi a de 150 mM. A esta concentração, o DGP, a ECT, a HECT e o MG apresentaram rácios p (controlo) / p (amostra) 10.05 relativo ao sinal total, representando um aumento dramático da sensibilidade da técnica. EXEMPLO 5

Neste exemplo demonstra-se como a aplicação dos solutos compatíveis na solução de imobilização/fixação dos materiais biológicos nas microrredes de proteínas melhora o desempenho das mesmas no que concerne ao aumento dos sinais totais e reais, com consequente aumento da razão entre o sinal total e o ruído de fundo.

Para o efeito utilizaram-se 16 microrredes consistindo de lâminas em vidro revestidos com poli-L-lisina. Nestas microrredes foram imprimidos e imobilizados 4 epítopos diferentes da proteína ΡΙΝΙ (100μς/ιη1) : ΡΙΝΙ, PIN2, C109A, T23A. A solução de imobilização/fixação consistiu de PBS contendo cada um dos solutos a uma concentração final de 150 mM ou, como controlos, glicerol 150 mM e glicerol 20% (2,7M -já utilizado comummente).

Imprimiram-se também em locais/coordenadas nas microrredes apenas solutos para efeitos de controlo negativo relativamente a hibridação não especifica com os anticorpos utilizados como moléculas alvo. A impressão fez-se com o auxilio de um impressor robotizado BioRobotics MicroGrid II, a 30°C e 60% de humidade. As microrredes foram secas e armazenadas a 4°C até a sua utilização. A proteína ΡΙΝΙ imobilizada foi detectada por hibridação directa com um anticorpo primário anti-PINl policlonal de coelho e seguidamente com uma mistura de anticorpos secundários anti-coelho marcados com os fluoróforos cianina-3 (Cy3), fúxia, e cianina-5 (Cy5), azul.

Todos os procedimentos referentes a hibridação e lavagem das microrredes foram realizados a temperatura ambiente. Antes da hibridação, as microrredes foram enxaguadas com PBS IX durante 2 min e bloqueadas com leite em pó dissolvido em PBS IX (3% p/v) durante 2 h. Depois foram lavadas 3 vezes com PBS IX (5 min cada lavagem) e procedeu-se então a hibridação com o anticorpo primário [leite em pó 5% (p/v), anticorpo primário (1:1000), 0, 1% (v/v) e NaN3 0,02% (p/v) em PBS IX]. Lavou-se novamente 3 vezes com PBS IX (5 min cada lavagem) procedendo-se depois a hibridação com a mistura de anticorpos secundários marcados [Leite em pó 5% (p/v), anticorpo secundário com fluoróforo fuxia (100μg /ml) 0,4% (v/v), anticorpo secundário com fluoróforo azul (ΙΟΟμρ/πιΙ) 0,4% (v/v) e NaN3 0,02% (p/v) em PBS IX] . A partir deste passo cobriram-se as microrredes com papel de alumínio para evitar a fotodecomposição. Procedeu-se a nova lavagem - 3 vezes com PBS IX (5 min cada) e a uma última incubação com água destilada. A secagem foi feita por centrifugação durante 5 min, a 20°C e a 1700 rpm.

Finalmente, as microrredes hibridadas foram submetidas a um feixe de radiação laser de um detector de emissão (Affymetrix 42;8;'*3as imagens obtidas foram analisadas e os resultados processados com o auxilio do programa 4,0 da

BioDiscovery, Inc. e do programa Microsoft Exceli. Durante a análise normalizaram-se as intensidades de sinal obtidas utilizando o método da Mediana Global.

Tabela IV A tabela mostra o sinal real para os dois canais, Cy5 e Cy3, que consiste na média das medianas do sinal (corrigido para o ruido de fundo) proveniente dos 4 epitopos diferentes da proteína ΡΙΝΙ, medidos a partir de 16 microrredes hibridadas independentemente na ausência (controlo) e na presença de vários aditivos na solução de imobilização/fixação. Mostra também a alteração do sinal real relativamente ao controlo a ao glicerol 20% (comummente utilizado). SôiutÔ Slsml EHpil ÍSMsm ; •JWLtSIKEEÇãA <J.O sisal rasl •“TW WWTO wy w w WTiW sisal K -sal cjrs €y3 ; ’U ; ... 00\ 2367, b> 3M4,76; 1201 - :"C ; ~ 5' O ; MS, €5 ; 1006,361 -a m 4 :s -732 -€54. DGF 1933,26 7370,30: mm 4ai% 132% 131% S81.fe7: ; 1211,33 ! '-131 -351 -101 mm 2436,· 53 2253,46 130\ :1031 —41 -71 hiú 1133,53 : :3327,14 22S% 1661 2$% 21 i HECT 34:2I:,33: mm llt% im S% ECT 305., 42: 1234f00 -31: -142 -63% -611. ÇoftCroid 642,33 1441,3:1: - -62 % -551

Da análise dos resultados visando a determinação comparativa do sinal real, na ausência (controlo) e presença de solutos compatíveis, resumida na tabela IV, verifica-se que, tanto na presença de DGP, MG ou HECT, se dá um incremento significativo do sinal real obtido a partir das microrredes. Este aumento relativo do sinal real é muito mais significativo relativamente ao controlo, na ausência de qualquer aditivo (ver Fig. 4A), mas mantém-se relativamente ao glicerol 20% (utilizado comummente), demonstrando que a aplicação dos solutos compatíveis (nomeadamente o DGP) são mais eficazes que os métodos actualmente utilizados para o mesmo fim.

Tabela V A tabela mostra a razão entre o sinal total e o ruído de fundo para os dois canais, Cy5 e Cy3, que consiste na média das medianas do sinal e do ruído de fundo respectivamente, provenientes dos 4 epitopos diferentes da proteína ΡΙΝΙ, medidos a partir de 16 microrredes hibridadas independentemente na ausência (controlo) e na presença de vários aditivos na solução de imobilização/fixação. Mostra também a alteração desta razão relativamente ao controlo a ao glicerol 20% (comummente utilizado).

Da análise dos resultados visando a determinação comparativa das razões entre o sinal total e o ruído de fundo, na ausência (controlo) e presença de solutos compatíveis, resumida na tabela V, verifica-se que, tanto na presença de DGP, MG, HECT ou ECT se dá um incremento significativo desta razão. Este aumento relativo do da razão entre o sinal total e o ruído de fundo é muito mais significativo relativamente ao controlo, na ausência de qualquer aditivo (ver Fig. 4B) , mas mantém-se relativamente ao glicerol 20% (utilizado comummente),

demonstrando que a aplicação dos solutos compatíveis (nomeadamente o DGP) é mais eficaz que os métodos actualmente utilizados para o mesmo fim. 0 aumento da razão entre o sinal total e o ruído de fundo tem repercussões directas na sensibilidade e reprodutibilidade da técnica. EXEMPLO 6

Neste exemplo demonstra-se como a aplicação dos solutos compatíveis na solução de imobilizaçao/fixação de enzimas (glucose oxidase - GOx) em biossensores melhora o desempenho das mesmas no que concerne ao incremento da actividade enzimática após um período de armazenamento. 0 biossensor modelo utilizado neste exemplo baseia-se na oxidação da glucose por parte da GOx, sendo os electrões resultantes desta oxidação transferidos através do grupo prostético da enzima para o di-oxigénio presente no meio da amostra. 0 di-oxigénio é capaz de funcionar como um aceitador de electrões sendo portanto reduzido a peróxido de hidrogénio. 0 peróxido de hidrogénio é então detectado amperométricamente através de um eléctrodo fixado a um determinado potencial que facilita a reacção de oxidação, com subsequente transferência de electrões para o eléctrodo activo.

Neste exemplo o transdutor electroquímico toma a forma de um rede impressa segundo o método descrito em Kroger et al. (1998) . Consiste num eléctrodo activo de carbono rodomisado, um contra-eléctrodo de carbono e um eléctrodo de referência em prata/cloreto de prata Câg/âgCls;) - 0 eléctrodo de carbono rodomisado promove a electrocatálise, reduzindo o potencial ao qual o peróxido de hidrogénio é oxidado.

Para a preparação dos eléctrodos, aliquotas de GOx (volumes de 10 μΐ contendo 2U á*!*4 em tampão 1¾¾ 0,1 M, pH 7.2) são pipetadas para dentro de estruturas próprias no eléctrodo activo e deixadas secar a temperatura ambiente (~23°C, 16h). A matriz de carbono rodomisado contém 2,5% p/v de um polímero de hidroxi-etil-celulose, solúvel em água, que foi previamente estabilizado para utilização em meio aquoso através de um tratamento com calor (120°C, 2h) . Esta matriz provou já ser bastante eficiente para a imobilização de soluções contendo proteínas devido a sua natureza hidrofilica a as propriedades físico-químicas da matriz de carbono. Os biossensores são finalmente armazenados a 4"C(, em condições de vácuo, até a sua utilização.

No caso deste exemplo, os eléctrodos foram preparados conforme descrito acima com a diferença que, nos casos onde os solutos compatíveis foram aplicados, 10 μΐ do composto seleccionado foram aplicados imediatamente após a adição da GOx, seguidos de uma homogeneização da mistura através de agitação suave para evitar danificar a superfície do eléctrodo activo. As concentrações óptimas para cada um dos compostos foram determinadas previamente como sendo: ECT (100 mM); HECT (80 mM); MGA (50 mM); DGP (100 mM) e MGLac (70 mM).

Os biossensores foram então testados após 8 meses de conservação. Aplicaram-se volumes de 25 μΐ de glucose 20 mM em tampão fosfato, pH 7.2/0.1 M KC1. O eléctrodo activo foi então sujeito a um potencial de +350 mV (contra o eléctrodo de referência e a corrente no dispositivo medida após 150 segundos.

De acordo com os resultados (Fig. 5) houve uma maior retenção da actividade da GOx (corrente > 0,5 μΑ) na presença de todos os solutos compatíveis testados relativamente aos eléctrodos controlo sem estabilizadores (corrente <0,4 μΑ). As melhorias na preservação da actividade da GOx foram mais evidentes com a adição do DGP, MGA e HECT.

REFERÊNCIAS LITERÁRIAS

Arakawa, T., and Timasheff, S.N. 1985. J. 47:411-414.

Bouveng, H., Lindberg, B., and Wickberg, B. 1955. Acta Chem. Scand. 9:807-809.

Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., and Marky, L. A. 1986. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:3746-3750.

Brown, A.D. 1976 Microbial water stress. Bacteriol. Rev. 40:803-846.

Frackman, S.; Kobs, G., Simpson, D. and Storts, D., Betaine and DMSO, enhancing agents for PCR, Promega notes, http://www.promega.com/pnotes

Freier, S. M., Kierzek, R., Jaeger, J. A., Sugimoto, N., Caruthers, Μ. H., Neilson, T. and Turner, D. H. 1986. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:9373-9377.

Knapp, S., Ladenstein, R., and Galinski, E.A. 1999. Extremophiles 3:191-198.

Kremer, B. P., and R. Vogl. 1975. Phytochemistry 14:1309-1314. Kroger, S., S. J. Setford, and A. P. F. Turner. 1998. Anal. Chem. 70:5047-5053.

Lamosa, P., L. 0. Martins, M. S. da Costa, and H. Santos. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64:3591-3598.

Lamosa, P., Burke, A., Peist, R., Huber, R., Liu, M.Y., Silva, G., Rodrigues-Pousada, C., LeGall, J., Maycock, C., and Santos, H. 2000. Microbiol. 66:1974-1979.

Le Bret, M. and Zimm, B. H. 1984 Biopolymers 23:287-312.

Malin, G., Iakobashvili, R., and Lapidot, A. 1999. Type II restriction endonucleases as a model system. J. Biol. Chem. 274:6920-6929.

Manning, G. S. Q. 1978. Rev. Biophys. 11:179-246.

Martins, L. O., and H. Santos. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61:3299-3303.

Nunes, 0. C., C. M. Manaia, M. S. da Costa, and H. Santos. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61:2351-2357.

Ramos, A., N. D. H. Raven, R. J. Sharp, S. Bartolucci, M.

Rossi, R. Cannio, J. Lebbink, J. Van der Oost, W. M. De Vos, and H. Santos. 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63:4020-4025. Record, Μ. T, Anderson, C. F., and Lohman, T. M. 1978. Q. Rev. Biophys. 11:103-178.

Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J. and von Hippel, P. H. 1993. Biochem., 32:137-144.

Santos, H., and M. S. da Costa. 2002. Environ Microbiol. 4:501-509.

Santos, Η., A. Ramos, and M. S. da Costa. 1998.

Thermostabilization, osmoprotection, and protection against desiccation of enzymes, cell components and cells by manosilglicerato. European Patent no. EP0816509.

Schwartz, T. 2003. Use of compatible solutes as substances having free radical scavenging properties. United States

Patent Application Publication.

Lisboa, 19 de Abril de 2007

Claims (10)

1. 1. Processo de estabilização de materiais biológicos caracterizado por se realizar misturas em solução de solutos compatíveis com materiais biológicos imobilizados.
2. 2. Processo de estabilização de materiais biológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o soluto compatível adjuvante ser o fosfato de di-glicerol, o manosil-glicerato, o manosil-gliceramida, o manosil-glicerol, o manosil-lactato, a ectoína, a hidroxiectoína, seus derivados e/ou combinações dos solutos e/ou derivados.
3. 3. Processo de estabilização de materiais biológicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os materiais biológicos serem tecidos, células, proteínas, enzimas e ácidos nucleicos, tais como ADN, ADNc ou ARN.
4. 4. Processo de estabilização de materiais biológicos, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por os materiais biológicos estarem imobilizados num suporte, como por exemplo, em microrredes e biossensores.
5. 5. Processo de estabilização de materiais biológicos, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por os materiais biológicos estarem imobilizados em microrredes de ADN, microrredes de ADNc, microrredes de ARN, microrredes de proteínas ou biossensores.
6. 6. Utilização do processo, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada por se destinar a aplicações para aumentar a estabilização de material biológico imobilizado em suportes.
7. 7. Utilização do processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por se destinar a estabilização de materiais biológicos durante a sua conservação, transporte, preparação e utilização desses mesmos materiais biológicos, a imobilizar ou imobilizados em suporte, nomeadamente em microrredes e biosensores.
8. 8. Utilização do processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por se destinar ao aumento do seu tempo útil de utilização do material biológico, ao aumento da razão sinal/ruido ou sensibilidade das técnicas que os utilizem e ao aumento da reprodutibilidade das respostas das mesmas técnicas.
9. 9. Utilização do processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por se destinar ao aumento do tempo útil de utilização dos materiais biológicos imobilizados em cerca de 100%.
10. 10. Utilização do processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por se destinar protecção contra a degradação e perdas de actividade de materiais biológicos imobilizados, como por exemplo as perdas que ocorrem devido ao transporte e armazenamento do material biológico imobilizado. Lisboa, 19 de Abril de 2007