CN115448964A - 己糖衍生物及其制剂和用途 - Google Patents

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CN115448964A CN202211044372.5A CN202211044372A CN115448964A CN 115448964 A CN115448964 A CN 115448964A CN 202211044372 A CN202211044372 A CN 202211044372A CN 115448964 A CN115448964 A CN 115448964A
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克里斯多夫·大卫·梅考克
玛利亚·丽塔·曼德斯·波尔达罗·范图拉·森特诺·利马
伊娃·科雷亚·洛伦索
玛利亚·海伦娜·迪亚斯·多斯·桑托斯
阿纳·索菲亚·达·库尼亚·米格尔
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Instituto De Tecnologia Quimica Biologica Antonio Xavier E
Universidade de Lisboa
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Instituto De Tecnologia Quimica Biologica Antonio Xavier E
Universidade de Lisboa
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Abstract

式I的化合物或其盐：
Figure DDA0003821777700000011
其中：R1为‑OC(H)(X)(CH2)nC(＝O)OH；R2为‑OH、‑N3或‑N(H)C(＝O)CH3；或者R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure DDA0003821777700000012
R3为‑H、‑CH3、‑CH2C(＝O)OH或‑CH2OH；X为‑H、‑CH3、‑CH2OH或CH2C(＝O)OH；n为0或1。

Description

己糖衍生物及其制剂和用途
本申请是申请日为2015年3月13日、中国专利申请号为201580014386.4且发明名称为“已糖衍生物及其制剂和用途”的中国专利申请的分案申请，并且本申请要求于2014年3月14日提交的美国临时申请第61/953,392号的优先权，其内容以引用的方式并入本文。
本申请全文引用了各种出版物，包含括号中引用的那些。可以发现在权利要求书之后说明书结尾按字母顺序列出了括号中引用的出版物的全部文献。所有引用的出版物的公开内容在此通过引用整体并入本申请，以便更全面地描述本发明所属领域的状态。
背景技术
已经在许多嗜盐或耐盐有机体中识别了称为相容性溶质的低分子量有机化合物，其能平衡外界介质的渗透压并促进正确的蛋白质折叠、抑制蛋白质聚集和预防热诱导的变性(Faria 2008，Faria 2013)。因此相容性溶质在工业上是有用的，例如用于稳定药物和化妆品制剂中的蛋白质(Luley-Goedl 2011，Lentzen 2006)。
相容性溶质通常为氨基酸、糖类、多元醇、甜菜碱和依克多因(ectoines)。海藻糖、甘油、甘氨酸-甜菜碱和依克多因是嗜温微生物的典型的相容性溶质。极端嗜热和超嗜热微生物的发现导致了其他相容性溶质的发现，例如甘露糖基甘油酸(MG)和二肌醇-1,3’-磷酸酯(dimyo-inositol-1,3'-phosphate)(Faria 2008)。
已经合成了与MG结构相关的化合物，即(2S)-2-(1-O-α-D-吡喃甘露糖基)丙酸酯(ML)、2-(1-O-α-D-吡喃甘露糖基)乙酸酯(MGlyc)、1-O-(2-丙三基)-α-D-吡喃甘露糖苷(MGOH)，并测试了它们稳定热应力下的模型蛋白的能力(Faria 2008)。
需要用于稳定生物材料的新化合物。
发明内容
本发明提供式I的化合物或其盐：
Figure BDA0003821777680000021
其中：
R1为-OC(H)(X)(CH2)nC(＝O)OH；
R2为-OH、-N3或-N(H)C(＝O)CH3；或者
R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure BDA0003821777680000022
R3为-H、-CH3、-CH2C(＝O)OH或-CH2OH；
X为-H、-CH3、-CH2OH或CH2C(＝O)OH；并且
n为0或1；
其中当所述化合物为
Figure BDA0003821777680000023
并且R2为OH，X为CH3，n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000024
其中当所述化合物为
Figure BDA0003821777680000031
并且R2为OH，X为H，n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000032
其中当所述化合物为
Figure BDA0003821777680000033
并且R2为OH，X为CH2OH，n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000034
其中当所述化合物为
Figure BDA0003821777680000035
并且R2为OH，X为CH2OH，n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000036
本发明还提供组合物，其包含至少一种式I的化合物或其盐，以及生物材料。
本发明还提供稳定生物材料的方法，其包括将至少一种式I的化合物或其盐添加至含有生物材料的溶液中，从而形成稳定化的溶液。
本发明还提供式I的化合物或其盐用于稳定生物材料。
本发明还提供式I的化合物或其盐用于稳定生物材料的用途。
附图说明
图1：在0.5M不同溶质存在下，苹果酸脱氢酶(MDH，灰条)、葡萄球菌核酸酶(SNase，黑条)和溶菌酶(白条)的解链温度(melting temperature)(TM)的增量。在不存在溶质时解链温度(TM)为MDH 50℃，SNase 52℃，溶菌酶71℃。
图2：不同葡萄糖衍生物对抗苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶的热变性的稳定化效果。横坐标上绘制由0.5M的若干化合物导致的MDH的解链温度的增量，纵坐标上绘制SNase(实心符号)和溶菌酶(空心符号)的解链温度的增量。
图3：不同半乳糖衍生物对抗苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶的热变性的稳定化效果。横坐标上绘制由0.5M的若干化合物导致的MDH的解链温度的增量，纵坐标上绘制SNase(实心符号)和溶菌酶(空心符号)的解链温度的增量。
图4：不同乳酸酯衍生物对抗苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶的热变性的稳定化效果。横坐标上绘制由0.5M的若干化合物导致的MDH的解链温度的增量，纵坐标上绘制SNase(实心符号)和溶菌酶(空心符号)的解链温度的增量。
图5：不同苹果酸酯衍生物对抗苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶的热变性的稳定化效果。横坐标上绘制由0.5M的若干化合物导致的MDH的解链温度的增量，纵坐标上绘制SNase(实心符号)和溶菌酶(空心符号)的解链温度的增量。
图6：仅有AcOK时和与不同超溶质(hypersolute)(0.5M)结合时，稳定化效果对AcOK浓度的依赖性。
图7：不同半乳糖基甘油酸酯衍生物对抗苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶的热变性的稳定化效果。横坐标上绘制由0.5M的若干化合物导致的MDH的解链温度的增量，纵坐标上绘制SNase(实心符号)和溶菌酶(空心符号)的解链温度的增量。
图8：SNase解链温度对溶质浓度的依赖性。
图9：MDH解链温度对溶质浓度的依赖性。
图10：溶菌酶解链温度对溶质浓度的依赖性。
图11：0.1M和0.25M不同溶质下获得的猪胰岛素解链温度的增量。每种溶质的左侧条显示0.25M的结果，右侧条显示0.1M的结果。
具体实施方式
本申请全文使用以下缩写。
Ac 乙酸酯
BnBr 苄基溴
DIP 二肌醇磷酸酯(di-myo-inositol phosphate)
DGP 二甘油磷酸酯(di-Glycerol phosphate)
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF 二甲基甲酰胺
DSF 差示扫描荧光测定法
Et 乙基
Et2O 乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
GG α-D-葡萄糖基-D-甘油酸酯
GGG α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-D-甘油酸酯
GL α-D-葡萄糖基-S-乳酸酯
Hex 己烷
MDH 苹果酸脱氢酶
Me 甲基
MeOH 甲醇
MG α-D-甘露糖基-D-甘油酸酯
MGA α-D-甘露糖基-D-丙酰胺(α-D-Mannosyl-D-glyceramide)
MGG α-D-吡喃甘露糖基-(1→2)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-D-甘油酸酯
MGly α-D-甘露糖基-乙醇酸酯
MGGly (2R)-2-(1-O-α-D-吡喃甘露糖基)-3-(1-O-α-D-吡喃葡萄糖基)-甘油酸酯
ML α-D-甘露糖基-S-乳酸酯
NaOMe 甲醇钠
NIS N-碘代丁二酰亚胺
NMR 核磁共振
Ph 苯基
TLC 薄层色谱法
SNase 葡萄球菌核酸酶
TBAF 四正丁基氟化铵
TBDPSCl 叔丁基二苯基氯硅烷
TBDMS 叔丁基二甲基硅烷
TfOH 三氟甲磺酸
THF 四氢呋喃
本发明提供式I的化合物或其盐：
Figure BDA0003821777680000061
其中：
R1为-OC(H)(X)(CH2)nC(＝O)OH；
R2为-OH、-N3或-N(H)C(＝O)CH3；或者
R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure BDA0003821777680000071
R3为-H、-CH3、-CH2C(＝O)OH或-CH2OH；
X为-H、-CH3、-CH2OH或CH2C(＝O)OH；并且
n为0或1；
其中当化合物为
Figure BDA0003821777680000072
并且R2为OH、X为CH3且n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000073
其中当化合物为
Figure BDA0003821777680000074
并且R2为OH、X为H且n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000075
其中当化合物为
Figure BDA0003821777680000076
并且R2为OH、X为CH2OH且n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000081
其中当化合物为
Figure BDA0003821777680000082
并且R2为OH、X为CH2OH且n为0时，该化合物为
Figure BDA0003821777680000083
在实施方案中，该化合物不是
Figure BDA0003821777680000084
Figure BDA0003821777680000091
或其盐。
在实施方案中，式I的化合物不是天然的化合物。
在实施方案中，该化合物为
Figure BDA0003821777680000092
或其盐。
在实施方案中，该化合物为
Figure BDA0003821777680000093
或其盐。
在实施方案中，该化合物为
Figure BDA0003821777680000094
或其盐。
在实施方案中，该化合物为
Figure BDA0003821777680000095
或其盐。
在实施方案中，该化合物或其盐的α/β端基异构体之比为1:1-99:1。在实施方案中，该化合物或其盐的α/β端基异构体之比为1:1-10:1。在实施方案中，该化合物或其盐的α/β端基异构体之比为1:1-5:1。在另一个实施方案中，该化合物或其盐的α/β端基异构体之比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在实施方案中，该化合物或其盐的α/β端基异构体之比大于10:1。在实施方案中，该化合物或其盐的α/β端基异构体之比大于99:1。在实施方案中，该化合物或其盐为α端基异构体。
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000101
Figure BDA0003821777680000102
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000103
Figure BDA0003821777680000104
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000105
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000106
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000107
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000108
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000109
在实施方案中，R1为
Figure BDA00038217776800001010
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000111
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000112
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000113
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000114
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000115
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000116
在实施方案中，R1为
Figure BDA0003821777680000117
在实施方案中，当R1存在不对称中心时，该化合物为两种对映体的混合物。
在实施方案中，当R1存在不对称中心时，该化合物为S对映体。
在实施方案中，当R1存在不对称中心时，该化合物为R对映体。
在实施方案中，R2为-OH。
在实施方案中，R2为N3。
在实施方案中，R2为-N(H)C(＝O)CH3。
在实施方案中，R1和R2为连同与其连接的碳原子形成
Figure BDA0003821777680000118
在实施方案中，R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure BDA0003821777680000121
在实施方案中，R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure BDA0003821777680000122
在实施方案中，R3为-H。
在实施方案中，R3为-CH3。
在实施方案中，R3为-CH2C(＝O)OH。
在实施方案中，R3为-CH2OH。
在实施方案中，该化合物为
Figure BDA0003821777680000123
Figure BDA0003821777680000131
Figure BDA0003821777680000141
或其盐。
在实施方案中，该化合物为前述实施方案中的任一种化合物或其盐。
在实施方案中，该化合物为盐的形式。
在实施方案中，该化合物为药学上可接受的盐的形式。
在实施方案中，该化合物为钾盐形式。
在实施方案中，该化合物为钠盐形式。
本发明还提供组合物，其包含至少一种本发明的化合物或其盐，以及生物材料。
在实施方案中，该组合物为液体。在实施方案中，该组合物为固体。在实施方案中，该组合物被冻干。在实施方案中，该组合物被冷冻干燥。
在实施方案中，该组合物为液体，且至少一种本发明的化合物在组合物中的浓度为0.01-1M。在实施方案中，所述至少一种本发明化合物的浓度为0.1-0.5M。在实施方案中，所述至少一种本发明化合物的浓度为0.01-1M。在实施方案中，所述至少一种本发明化合物在组合物中的浓度为0.1M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M或0.5M。
在实施方案中，该组合物为通过干燥本发明的液体组合物制备的固体。
在实施方案中，除了包含至少一种本发明的化合物之外，该组合物还包含至少一种其他相容性溶质。所述至少一种其他相容性溶质可以为，例如本领域已知的至少一种其他相容性溶质。在具有至少一种其他相容性溶质和/或多于一种本发明的化合物的组合物中，稳定生物材料所必需的其他相容性溶质的量和/或每一种本发明化合物的量可小于每种试剂单独稳定生物材料所必需的量。
在实施方案中，除了包含至少一种本发明的化合物之外，该组合物还包含一种或多种盐。在实施方案中，所述一种或多种其他盐为药学上可接受的盐。在实施方案中，所述一种或多种盐包含乙酸钾。
在实施方案中，该组合物为药物组合物、化妆品或食品。
在实施方案中，生物材料为核酸、多肽、全细胞、病毒、病毒样颗粒、细胞膜、细胞组分、脂质体、组织，或上述物质中任意的混合物。在实施方案中，生物材料包含一种、两种、三种或更多种的生物材料。
在实施方案中，生物材料为一种或多种核酸。在实施方案中，核酸为RNA、DNA，或RNA和DNA的混合物。在实施方案中，RNA为单链RNA。在实施方案中，RNA为双链。在实施方案中，RNA为mRNA。在实施方案中，RNA为反义寡核苷酸。在实施方案中，DNA为双链。在实施方案中，DNA为单链。
在实施方案中，生物材料为一种或多种全细胞。
在实施方案中，生物材料为多肽。
在实施方案中，多肽为酶、抗体、血浆蛋白或激素。
在实施方案中，多肽为胰岛素、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶或溶菌酶。在实施方案中，多肽为胰岛素。
在实施方案中，多肽为重组多肽。在实施方案中，从酵母或哺乳动物细胞培养物中分离多肽。
在实施方案中，多肽不是重组多肽。在实施方案中，从植物、动物、真菌或细菌中分离多肽。在实施方案中，多肽为动物或人类血清多肽。
在实施方案中，该组合物还包含缓冲剂。
本发明还提供稳定生物材料的方法，其包括将至少一种本发明的化合物或其盐加入含有该生物材料的溶液中以形成稳定化的溶液。
在实施方案中，该方法还包括干燥稳定化的溶液的步骤。
在实施方案中，干燥为喷雾干燥或冻干。
在实施方案中，根据待稳定化的生物材料选择至少一种本发明的化合物或其盐。例如，如果生物材料为蛋白质，则可根据蛋白质表面的疏水性和/或亲水性选择本发明的化合物或本发明化合物的组合。
本发明还提供用于稳定生物材料的本发明的化合物或其盐。
本发明还提供本发明的化合物或其盐用于稳定生物材料的用途。
在实施方案中，稳定化使生物材料免受变性。在实施方案中，稳定化提高生物材料的解链温度。在实施方案中，稳定化使生物材料免于变干(dessication)。在实施方案中，稳定化使生物材料免受聚集。在实施方案中，稳定化使生物材料免受热的影响。在实施方案中，稳定化使生物材料免受冷冻影响。在实施方案中，稳定化在干燥期间保护生物材料。在实施方案中，稳定化增加生物材料的保质期。
本发明还提供包含本发明的化合物或其盐的诊断试剂盒。
在实施方案中，诊断试剂盒为微阵列、生物传感器或酶制剂。在实施方案中，该微阵列、生物传感器或酶制剂包含固定化的生物材料。本发明的相容性溶质可用于本领域已知的利用相容性溶质从而提高使用固定化生物材料的技术的性能的方法中。参见，例如，PCT国际申请公开第WO/2007/097653号。
本发明还提供包含本发明的化合物或其盐以及适于局部施用于人类或动物的赋形剂的化妆品或其他皮肤用组合物。
在实施方案中，化妆品或皮肤用组合物包含一种或多种生物材料。
本发明还提供如上所述的化合物、组合物、方法和用途，其中化合物为表6或表7所列出的任意化合物或其盐。例如，本发明提供用于稳定生物材料、包含表6和表7所列出的一种或多种化合物以及生物材料的组合物。作为另一个实例，本发明提供稳定生物材料的方法，其包括将至少一种表6和表7所列出的化合物或其盐加入含有生物材料的溶液中以形成稳定化的溶液。
本文描述的具体实施方案和实施例是说明性的，在不脱离本公开的精神或不脱离所附权利要求书的范围的情况下，可将多种改变引入这些实施方案和实施例中。不同说明性实施方案和/或实施例的元素和/或特征可在本公开和所附权利要求书的范围内彼此组合和/或彼此替代。
本文描述的适用于或包含本发明化合物的每个实施方案同样适用于该化合物的盐。
对于前述实施方案，预期本文描述的每个实施方案适用于每个其他公开的实施方案。
本文公开的任何范围意味着该范围内所有分数(tenth)和整数单位量被具体公开作为本发明的一部分。因此，例如，0.1M-0.5M意指0.1M、0.2M、0.3M、0.4M和0.5M为本发明范围内的实施方案。
参照随后的实施例将更好地理解本发明，提供这些实施例以帮助理解主题，但不是为了也不应被解释为以任何方式限制随附的权利要求书。
实施例1：合成新相容性溶质
制备基于糖衍生物的化学库以便鉴定具有增强的蛋白稳定特性的新的有机化合物。在糖基化反应期间，通过使用不同的己糖例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺，并使用不同的糖基受体引入类似物结构的多样性。
除了合成甘露糖苷和葡萄糖苷之外，还合成半乳糖和葡萄糖胺类似物，以便评价糖结构对稳定化效果的贡献。据我们所知，只有一种含有半乳糖的相容性溶质从超嗜热菌(hyperthermophiles)中分离出来，来自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的β-吡喃半乳糖基-5-羟赖氨酸(GalHI)：
Figure BDA0003821777680000181
几种氨基酸，如谷氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺，可在许多嗜中温生物中用作相容性溶质，α-氨基酸和β-氨基酸都可用于渗透适应(osmoadaptation)(Costa 1998)。为了测定氨基或额外的电荷是否会增强稳定化效果，合成了葡萄糖胺衍生物。据我们所知，只有一种含有葡萄糖胺的相容性溶质从超嗜热菌分离，来自Rubrobacter xylanophilus的二-N-乙酰基-葡萄糖胺磷酸酯(DAGAP)(Empadinhas 2007)：
Figure BDA0003821777680000182
DAGAP结构类似于在超嗜热菌中发现的磷酸二酯相容性溶质，如DIP或DGP，然而，由于浓度太低而不能有助于细胞的渗透平衡，已推翻了其作为相容性溶质的作用。
当存在以下化合物时，为该研究选择的所有糖基受体均是带电荷的，在结构上与甘油酸酯相关，并且具有点修饰，所述点修饰例如或更多或更少的碳原子、羟基缺失、额外的羧基和不对称中心的结构：
Figure BDA0003821777680000191
合成硫代糖苷供体1和19用于合成葡萄糖和半乳糖衍生物。表1中描述了使用二氯甲烷中的NIS/TfOH体系(Lourenco 2009)时，供体1和19与上述糖基受体的糖基化反应所获得的结果。除了根据报道的D-丝氨酸的实验步骤合成甘油酸甲酯衍生物9和135(Lourenco2009；Lok 1976)之外，所有的受体均是市售可得的。
方案1：使用硫代糖苷供体1和19的糖基化反应
Figure BDA0003821777680000192
1：葡萄糖
19：半乳糖
反应产生大多数糖基受体的端基异构体混合物。这提供了分别检测α端基异构体和β端基异构体以确定端基异构位置的立体化学对稳定化效果的重要性的机会。D/L-甘油酸酯和苹果酸半乳糖衍生物的情况正是如此。
表1：用硫代糖苷供体1和19进行糖基化反应获得的结果
Figure BDA0003821777680000201
Figure BDA0003821777680000211
a乙酸酯基团去保护后计算得出
在使用常见有机反应例如乙酸酯的甲醇分解、在甘油酸酯类似物(化合物35、化合物140和化合物141)的情况中甲硅烷基醚的氟解(fluorolysis)和酯基的水解(方案2)连续去除保护基之后，得到期望的产物(表2)。
方案2：葡萄糖和半乳糖类似物的一般去保护方案
Figure BDA0003821777680000212
表2：葡萄糖和半乳糖衍生物的最终产物和总产率a
Figure BDA0003821777680000221
Figure BDA0003821777680000231
a根据糖基化反应计算得出
以良好的产率成功地获得了全部产物，α端基异构体是主要产物。虽然，在一些情况下获得了α端基异构体和β端基异构体的混合物(富含α)，但它们用于初步筛选，在初步筛选中单独测试最有可能的化合物。二甲基(S)-苹果酸酯衍生物(150、151和152，表2)获得的产率最低，是由于在去除乙酸酯和水解甲基酯的过程中使用了碱，这通过消除苹果酸酯部分而促进了端基异构位置的水解。在合成杆菌硫醇(bacillithiol)(BSH)的文献(Sharma2011)中已经报道了该问题。为了使苹果酸酯部分的消除最小化，要注意最终产品中留下的痕量单酯的酯水解。
对于1,2-反式甘露糖苷的合成，应用使用乙酸酯作为保护基、使用三氯乙酰胺酯(trichloroacetamidates)作为糖基供体的C-2酰基邻基参与策略，该策略相对快的进行制备且便宜。用BF3OEt2作为促进剂，甘露糖三氯乙酰亚胺酯供体103和糖基受体之间的糖基化反应能像预期那样只得到α-产物。甘露糖供体103的糖基化反应获得的结果示于表3中。
方案3：甘露糖三氯乙酰亚胺(trichloroacetimide)供体103的糖基化反应
Figure BDA0003821777680000232
表3：甘露糖三氯乙酰亚胺供体103的糖基化反应获得的结果
Figure BDA0003821777680000241
使用一般有机反应(方案4)连续去除保护剂，以良好的总产率提供期望产物(表4)。
方案4：甘露糖类似物的一般去保护方案
Figure BDA0003821777680000242
表4：最终产物和甘露糖产物总产率a
Figure BDA0003821777680000251
a根据糖基化反应计算得出
甘露糖基二甲基(S)-苹果酸酯衍生物的乙酸酯基团的水解和甲基酯的水解出现的问题与葡萄糖和半乳糖衍生物出现的上述问题相同。
由2-叠氮基-2-脱氧硫代葡萄糖苷供体90合成1,2-顺式葡萄糖胺衍生物，与糖基受体的糖基化反应于-10℃下在CH2Cl2/Et2O(4:1)的混合物中进行，并用NIS/TfOH作为促进剂。结果示于表5中。
方案5：2-叠氮基-2-脱氧硫代葡萄糖苷供体90的糖基化反应
Figure BDA0003821777680000252
表5：2-叠氮基-2-脱氧硫代葡萄糖苷供体90的糖基化反应获得的结果
Figure BDA0003821777680000261
对于所有使用的受体来说，α端基异构体是主要产物。在乙酸酯基团的甲醇分解和甘油酯衍生物情况中甲硅烷基醚的氟解之后，催化氢化苄基同时还原叠氮(azide)促进了不期望的环酰胺(cyclic amide)的形成(方案6)。只观察到对α端基异构体有该效果。
方案6：2-叠氮基-2-脱氧葡萄糖苷衍生物的氢化
Figure BDA0003821777680000262
由于电荷对稳定化效果是重要的，因此，为了克服该问题，先前使用Staudinger反应还原叠氮，随后用乙酸酯保护得到的胺基(方案7)阻断胺并避免环化。在去除保护基和甲基酯水解之后，获得最终的N-乙酰基葡萄糖胺衍生物。
方案7：合成N-乙酰基葡萄糖胺衍生物
Figure BDA0003821777680000271
实验细节
实验1.合成乙基6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(1)
根据文献(Lourenco 2009)中所描述的过程进行化合物1的合成。
实验2.一般糖基化过程
将硫代糖苷供体(0.15mmol)、受体(0.15mmol)和
Figure BDA0003821777680000272
MS于指示的溶剂/溶剂混合物(1mL)中的悬浮液在室温下搅拌1小时，然后冷却至0℃。在0℃下加入N-碘代丁二酰亚胺(0.19mmol)和TfOH(0.9μL)，当反应完成时(TLC)，加入10％Na2S2O3水溶液(2mL)和饱和的NaHCO3水溶液(1mL)，用CH2Cl2(3×5mL)萃取混合物；将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤，真空下去除溶剂。通过制备型TLC(3:7,EtOAc/Hex)纯化粗品。通过1H NMR(400MHz,CDCl3)光谱测量分离的产物的α/β比。
实验3.合成甲基(2S)-2-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃葡萄糖基)丙酸酯(10)
根据实验2所述的过程进行供体1与受体4的糖基化反应。
实验4.合成甲基2-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃葡萄糖基)乙酸酯(13)
根据实验2所述的过程进行供体1与受体7的糖基化反应。
实验5.合成乙基6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-1-硫代-α/β-D-吡喃半乳糖苷(19)
向甲基α-D-吡喃半乳糖苷(2.0g,10.3mmol)的DMF(20mL)搅拌溶液中加入苄基溴(6.3mL,51.5mmol)。将混合物冷却至0℃，分批加入氢化钠(1.48g,61.8mmol)。将反应在室温(r.t.)下保持过夜，在起始物料完全转化之后，在0℃下加入MeOH。用Et2O萃取混合物，将合并的有机相干燥、过滤并浓缩。通过快速柱色谱(10:90,EtOAc/Hex)用硅胶纯化得到粘的无色泡沫状(viscous colourless foam)产物(5.14g,90％)。
0℃下将浓硫酸(1.0mL)滴加至甲基四-O-苄基吡喃半乳糖苷(5.72g，10.7mmol)的乙酸/乙酸酐(1:1，50mL)搅拌溶液中。在起始物料完全转化之后，用饱和的NaHCO3溶液和冰冷的蒸馏水淬灭，直至pH为7。用EtOAc(3×70mL)萃取混合物，将合并的有机相干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过快速柱色谱用硅胶(20:80，EtOAc/Hex)纯化，得到粘的无色泡沫状二乙酸酯(4.29g，75％，α:β＝3.7:1)。
将乙硫醇(1.56mL，20.7mmol)加入二乙酸酯(3.69g，6.9mmol)的DCM(30ml)搅拌溶液中。将反应混合物冷却至0℃，滴加三氟化硼乙醚(1.31mL，10.35mmol)。在起始物料完全转化之后，将反应混合物用CH2Cl2(2×40mL)稀释，并用饱和的NaHCO3溶液淬灭，直至pH为7。用CH2Cl2(2×40mL)萃取水相，将合并的有机萃取物干燥、过滤并真空浓缩。将残余物通过快速柱色谱纯化(20:80，EtOAc/Hex)纯化，得到粘的无色泡沫状硫代半乳糖苷19(3.39g，91％，α/β＝2.4:1)。
实验6.合成甲基(2S)-2-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃半乳糖基)丙酸酯(32)
根据实验2所述的过程进行供体19与受体4的糖基化反应。
实验7.合成甲基2-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃半乳糖基)乙酸酯(34)
根据实验2所述的过程进行供体19与受体7的糖基化反应。
实验8.合成甲基3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-(2R)-2-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃半乳糖基)-2,3-二羟基丙酸酯(35)
根据实验2所述的过程进行供体19与受体9的糖基化反应。
实验9.合成苯基3,4,6-三-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(85)
在0℃下向1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α/β-D-吡喃葡萄糖(Goddard-Borger 2007)(6.42g,17.2mmol)和苯硫酚(3.55mL,34.4mmol)的CH2Cl2(60mL)溶液中加入BF3OEt2(9.81mL,77.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌48小时，然后用CH2Cl2稀释，并用NaHCO3洗涤。将水相用CH2Cl2萃取，将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtoAc/己烷)用硅胶纯化，得到无色粘的泡沫状85(5.40g，74％，α/β＝2.5:1)，并回收初始的四乙酸酯(1.30g，20％)。
实验10.合成对甲苯基3,4,6-三-O-乙酰基-2-叠氮基-2-去氢-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(86)
在0℃下向1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α/β-D-吡喃葡萄糖(Goddard-Borger 2007)(3.87g，10.4mmol)和对甲苯硫醇(2.57g,20.7mmol)的CH2Cl2(60mL)溶液中加入BF3OEt2(6.57mL,51.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌60小时，然后用CH2Cl2稀释，并用NaHCO3洗涤。将水相用CH2Cl2萃取，将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtoAc/己烷)用硅胶纯化，得到无色粘的泡沫状85(2.26g，50％，α/β＝1.8:1)，并回收初始的四乙酸酯(1.69g，44％)。
实验11.合成苯基2-叠氮基-6-O-乙酰基-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-去氢-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(87)
0℃下将NaOMe 1N(6.73mL,6.73mmol)的MeOH溶液加入85(4.75g,11.21mmol)的MeOH(20mL)搅拌溶液中。3小时之后，起始物料被消耗尽。将反应混合物用MeOH稀释，加入Dowex-H+树脂直至中性pH。过滤并蒸发溶剂，得到粘胶状三醇(3.23g,97％)。室温下将TBDPSCl(2.36mL,9.10mmol)加入三醇(2.46g,8.27mmol)的吡啶(20mL)溶液中，然后加入催化量的DMAP。搅拌混合物过夜，然后用H2O(20mL)淬灭，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机相干燥(MgSO4)、浓缩。通过快速柱色谱(30:70AcOEt/己烷)纯化得到白色固体产物87(4.12g,93％,α/β＝1.8:1)。
实验12.合成对甲苯基2-叠氮基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(88)
将实验11的过程应用于化合物86，从而经过两个步骤以98％的产率(α/β＝1.8:1)得到无色粘胶状化合物88。
实验13.合成苯基6-O-乙酰基-2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(89)
0℃下向87(3.91g,7.30mmol)和苄基溴(1.97mL,22.6mmol)的DMF(15mL)搅拌溶液中分批加入氢化钠(0.45g,18.6mmol)。2小时之后，在0℃下加入MeOH，将反应混合物用饱和水溶液淬灭，并用Et2O萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速柱色谱(10:90AcOEt/己烷)纯化得到白色固体二苄基化产物(4.45g,85％)和粘胶状三苄基化产物92(0.31g,7％)。
室温下向二苄基化产物(2.42g,3.38mmol)的THF(10mL)溶液中加入TBAF(1.15g,4.39mmol)。将反应混合物搅拌3小时，然后加入水。将混合物用AcOEt(3×20mL)萃取，干燥(MgSO4)并浓缩，得到黄色的粘的残余物。通过快速柱色谱(30:70,AcOEt/己烷)纯化得到粘胶状的醇(1.43g,88％)。
0℃下向该醇(1.396g,2.92mmol)的吡啶(5mL)搅拌溶液中加入乙酸酐(0.55mL,5.85mmol)和催化量的DMAP。在起始物料完全转化之后，加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)，浓缩得到粘残余物。用EtOAc/己烷(10/90)混合物经硅藻土(celite)过滤得到粘的无色胶状产物89(1.38g,91％,α:β＝1.4:1)。
实验14.合成苯基2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-6-O-氯乙酰基-2-脱氧-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(90)
使用氯乙酸酐将实验13的过程应用于化合物87，经过三个步骤后以66％(α/β＝1.6:1)的产率得到无色粘胶状化合物90。化合物90的表征数据与文献(Csiki 2010)相同。
实验15.合成对甲苯基2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-6-O-氯乙酰基-2-脱氧-1-硫代-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(91)
使用氯乙酸酐将实验13的过程应用于化合物88，经过三个步骤后以82％(α/β＝1:1)的产率得到无色粘胶状化合物91。
实验16.合成甲基(2S)-2-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-6-O-氯乙酰基-2-脱氧-α/β-D-吡喃葡萄糖基)丙酸酯(95)
根据实验2所述的过程进行供体90和91与受体4的糖基化反应。
实验17.合成甲基2-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-6-O-氯乙酰基-2-脱氧-α/β-D-吡喃葡萄糖基)乙酸酯(96)
根据实验2所述的过程进行供体91与受体7的糖基化反应。
实验18.合成甲基(2R)-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-6-O-氯乙酰基-2-脱氧-α/β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二羟基丙酸酯(97)
根据实验2所述的过程进行供体91与受体9的糖基化反应。
实验19.合成2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基三氯乙酰亚胺酯(103)
根据文献(Hanessian 1997)所述的过程合成化合物103。
实验20.合成乙基3-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃葡萄糖基)-3-羟基丁酸酯(136)
将硫代葡萄糖苷供体1(0.815g,1.52mmol)、乙基3-羟基丁酸酯133(0.197mL,1.52mmol)和
Figure BDA0003821777680000311
MS的CH2Cl2(6mL)悬浮液在室温下搅拌1小时，然后冷却至0℃。在0℃下加入N-碘代丁二酰亚胺(0.434g,1.93mmol)和TfOH(0.112mL)，当反应完成时，加入10％Na2S2O3水溶液(6mL)和饱和NaHCO3水溶液(3mL)。将混合物用CH2Cl2(3×6mL)萃取，将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂真空蒸发。将粗品通过快速柱色谱(20:80,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色泡沫状产物136(0.771g,84％)。
实验21.合成乙基3-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃半乳糖基)-3-羟基丁酸酯(137)
根据实验20所述的过程进行硫代半乳糖苷供体19(0.638g,1.19mmol)和乙基3-羟基丁酸酯133(0.170mL,1.31mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(20:80,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状产物137(0.685g,95％)。
实验22.合成二甲基(2S)-2-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃葡萄糖基)-2-羟基琥珀酸酯(138)
根据实验20所述的过程进行硫代半乳糖苷供体1(0.850g,1.58mmol)和二甲基(S)-苹果酸酯134(0.208mL,1.58mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状产物138(0.949g,94％,α/β＝7:1)。
实验23.合成二甲基(2S)-2-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃半乳糖基)-2-羟基琥珀酸酯(139)
根据实验20所述的过程进行硫代半乳糖苷供体19(1.20g,2.23mmol)和二甲基(S)-苹果酸酯134(0.294mL,2.23mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状产物139(1.235g,87％,α/β＝5:1)。
实验24.合成甲基3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-(2S)-2-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二羟基丙酸酯(140)
根据实验20所述的过程进行硫代半乳糖苷供体1(0.300g,0.56mmol)和受体135(0.200g,0.56mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(10:90,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状产物140(0.463g,98％,α/β>10:1)。
实验25.合成甲基3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-(2S)-2-O-(6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-苄基-α/β-D-吡喃半乳糖基)-2,3-二羟基丙酸酯(141)
根据实验20所述的过程进行硫代半乳糖苷供体1(0.300g,0.56mmol)和受体135(0.200g,0.56mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(10:90,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状产物140(0.463g,98％,α/β>10:1)。
实验26.合成钾(2S)-2-(α-D-吡喃葡萄糖基)丙酸盐(142)
0℃下将NaOMe 1N(0.443mL,0.443mmol)的MeOH溶液加入10(0.427g,0.74mmol)的MeOH(4mL)搅拌溶液中。1小时之后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液中和。将水相用EtOAc萃取，将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤，并去除溶剂。将粗产物通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状α-醇(0.310g,78％)和β-醇(0.027g,7％)。
50psi下，在Pd/C 10％(0.25当量)的存在下将α-醇(0.300g,0.56mmol)的EtOAc溶液氢化。5小时之后，将反应混合物过滤，将溶剂蒸发得到非常粘的无色泡沫状的酯(0.149g，定量)。将2M KOH(0.28mL)溶液加入上述酯(0.149g,0.56mmol)的H2O(2mL)搅拌溶液中。在所有起始物料消耗尽之后，用10％HCl将pH调节至7，将溶剂蒸发得到粘的无色泡沫状的142(0.162g，定量)。[α]20 D＝+107.2(c＝0.60,H2O).1H NMR(D2O):δ4.93(d,J＝3.9Hz,1H,H-1),3.96(q,J＝6.8Hz,1H,CHCH3),3.75-3.68(m,5H),3.44(dd,J＝9.9Hz,J＝4.0Hz,1H,H-2),3.35(t,J＝9.3Hz,1H,H-4),1.28(d,J＝6.8Hz,3H,CHCH 3)ppm.13C NMR(CDCl3):δ181.0(CHCO2 -),97.3(C-1),75.5(CHCH3),73.1(C-3),71.9(C-5),71.5(C-2),69.4(C-4),60.1(C-6),17.5(CHCH3)ppm。
实验27.合成钾(2S)-2-(α/β-D-吡喃半乳糖基)丙酸盐(143)
根据实验26所述的过程进行半乳糖苷32(1.720g,2.63mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的醇(1.350g,96％,α/β＝3:1)。在根据实验23所述的过程进行苄醚(1.323g,2.46mmol)的催化氢化和甲基酯的水解之后，得到粘的无色泡沫状化合物143(0.715g，定量，α/β＝3:1)。FTIR(膜)v最大:1635(C＝O),3332(O-H)cm-1.1HNMR(D2O):δ4.97(d,J＝3.9Hz,H-1(α)),4.58(q,J＝7.0Hz,CHCH3(β)),4.37(d,J＝7.7Hz,H-1(β)),4.25(q,J＝6.9Hz,CHCH3(α)),3.93-3.88(m),3.84-3.79(m),3.76-3.64(m),3.63-3.52(m),3.47(dd,J＝9.9,7.7Hz,),1.38(d,J＝7.0Hz,CHCH 3(β)),1.35(d,J＝6.8Hz,CHCH 3(α))ppm.13CNMR(CDCl3):δ187.3(CHCO2 -),101.8(C-1(β)),98.9(C-1(α)),75.2,73.7,73.1,72.6,71.4,70.7,69.21,69.07,68.5,68.0,60.84,60.80,52.68,52.62,17.1(CHCH3)ppm。
实验28.合成钾2-(α/β-D-吡喃葡萄糖基)乙酸盐(144)
根据实验26所述的过程进行葡萄糖苷13(0.940g,1.66mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的醇(0.765g,88％,α/β＝11:1)。在根据实验26所述的过程进行苄醚(0.715g,1.37mmol)的催化氢化和甲基酯的水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物144(0.378g，定量，α/β＝10:1)。1HNMR(D2O):δ4.88(d,J＝3.8Hz,H-1(α)),4.41(d,J＝7.9Hz,H-1(β)),4.22(d,J＝15.6Hz,CHH’CO2 -(β)),4.06(d,J＝15.5Hz,CHH’CO2 -(α)),4.03(d,J＝15.8Hz,CHH’CO2 -(α)),3.88(d,J＝15.5Hz,CHH’CO2 -(β)),3.79-3.61(m),3.46(dd,J＝9.8,3.8Hz),3.34(t,J＝9.5Hz)ppm.13CNMR(CDCl3):δ177.4,102.3(C-1(β)),98.3(C-1(α)),75.9(β),75.5(β),73.1,71.9,71.5,69.5,68.5(CH2CO2 -(β)),66.8(CH2CO2 -(α)),60.61(C-6(β)),60.43(C-6(α))ppm。
实验29.合成钾2-(α/β-D-吡喃半乳糖基)乙酸盐(145)
根据实验26所述的过程进行半乳糖苷34(1.079g,1.91mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的醇(0.800g,81％,α/β＝2:1)。在根据实验26进行苄醚(0.787g,1.50mmol)的催化氢化和甲基酯的水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物145(0.416g，定量，α/β＝2:1)。1HNMR(D2O):δ4.91(d,J＝3.9Hz,H-1(α)),4.34(d,J＝7.7Hz,H-1(β)),4.24(d,J＝15.6Hz,CHH’CO2 -(β)),4.06(d,J＝15.6Hz,CHH’CO2 -(α)),4.03(d,J＝15.6Hz,CHH’CO2 -(β)),3.92-3.84(m),(d,J＝15.6Hz,CHH’CO2 -(α)),3.75-3.71(m),3.69-3.58(m),3.52(dd,J＝10.0Hz,J＝7.6Hz,H-2(β))ppm.13CNMR(CDCl3):δ177.5,102.9(C-1(β)),98.3(C-1(α)),75.2(β),72.6(β),71.1(α),70.8(β),69.5(α),69.2(α),68.6(β),68.5(CH2CO2 -(β)),68.4(α),66.8(CH2CO2 -(α)),61.15(C-6(α)),60.95(C-6(β))ppm。
实验30.合成钾(2R)-2-O-(α/β-D-吡喃半乳糖基)-2,3-二羟基丙酸盐(146,147)
根据实验26所述的过程进行半乳糖苷35(1.078g,1.29mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(20:80,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的α-醇(0.671g,66％)和β-醇(0.286g,28％)。
室温下将TBAF(THF中1M；0.83mL,0.83mmol)加入α-半乳糖苷(0.655g,0.83mmol)的THF(4mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时，然后加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)、浓缩得到黄色粘的残余物。通过快速柱色谱(80:20,EtOAc/己烷)用硅胶进行纯化得到粘的无色胶状的α-二醇(0.457g,92％)。在根据实验26所述的过程进行α-二醇(0.140g,1.50mmol)的苄醚的催化氢化和甲基酯的水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物146(0.416g，定量)。α产物146:[α]20 D＝+127.6(c＝0.62,H2O).1H NMR(D2O):δ4.97(d,J＝3.9Hz,1H,H-1),4.13(dt,J＝4.7Hz,J＝2.3Hz,1H,CHCH2OH),3.99(t,J＝6.2Hz,1H,),3.93-3.87(m,2H),3.81(dd,J＝12.1,3.2Hz,1H),3.77-3.70(m,2H),3.69-3.64(m,2H,H-6,H’-6)ppm.13C NMR(D2O):δ177.1(CHCO2 -),97.6(C-1),79.2(CHCH2OH),71.3,69.6,69.3,68.5,63.1(CHCH2OH),61.2(C-6)ppm。
将相同的策略应用于β-半乳糖苷(0.266g,0.34mmol)的去保护。在β-二醇(0.340g,0.615mmol)的苄醚的氟解(0.140g,76％)、催化氢化和甲基酯的水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物147(0.188g，定量)。β产物147:1HNMR(D2O):δ4.42(d,J＝7.5Hz,1H,H-1),4.11(dd,J＝6.5Hz,J＝3.2Hz,1H,CHCH2OH),3.83-3.77(m,2H),3.73-3.67(m,2H),3.64-3.53(m,4H)ppm.13CNM R(D2O):δ177.9(CHCO2 -),102.6(C-1),81.3(CHCH2OH),75.1,72.6,70.9,68.7,62.6(CHCH2OH),60.9(C-6)ppm。
实验31.合成钾3-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)-3-羟基丁酸盐(148)
根据实验26所述的过程进行葡萄糖苷136(0.823g,1.36mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的α-醇(0.594g,82％)和β-醇(0.066g,9％)。
在根据实验26所述的过程进行α-醇(0.516g,0.94mmol)的苄醚催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物148(0.285g，定量)。1HNMR(D2O):δ4.98(d,J＝4.0Hz,H-1),4.97(d,J＝4.2Hz,H-1),4.14-4.04(m,CHC H3),3.80-3.59(m),3.45-3.39(m,H-2),3.34-3.28(m,H-4),2.47(dd,J＝14.2Hz,J＝6.9Hz,CHCH 2CO2 -),2.40-2.22(m,CHCH 2CO2 -),1.21(d,J＝6.1Hz,CHCH 3),1.14(d,J＝5.9Hz,CHCH 3)ppm.13CNMR(D2O):δ180.19,180.16,97.6(C-1),94.9(C-1),73.4(CHCH3),73.15(CHCH3),73.06,71.9,71.51,71.48,71.32,70.5,69.62,69.56,60.6(C-6),60.3(C-6),45.6(CHCH2CO2 -),44.5(CHCH2CO2 -),20.6(CHCH3),18.0(CHCH3)ppm。
实验32.合成钾3-O-(α/β-D-半乳吡喃糖基)-3-羟基丁酸盐(149)
根据实验26所述的过程进行半乳糖苷137(0.709g,1.17mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的醇(0.584g,88％,α/β＝3:1)。在根据实验26所述的过程进行苄醚(0.573g,1.01mmol)的催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物145(0.309g，定量，α/β＝3:1)。1HNMR(D2O):δ5.01(d,J＝3.9Hz,H-1(α)),4.99(d,J＝3.8Hz,H-1(α)),4.42(d,J＝8.4Hz,H-1(β)),4.40(d,J＝8.1Hz,H-1(β)),4.23-4.04(m),3.97-3.89(m),3.84(t,J＝3.9Hz),3.78-3.54(m),3.40(dd,J＝9.6,8.2Hz),2.54-2.44(m),2.40-2.22(m),1.22-1.13(m)ppm.
13CNMR(D2O):δ180.3,179.9,101.9(C-1(β)),101.1(C-1(β)),97.9(C-1(α)),95.1(C-1(α)),75.14,75.10,74.99,74.0,73.4,72.79,72.65,71.02,71.01,70.8,70.52,70.44,69.58,69.46,69.30,69.1,68.72,68.56,68.46,68.2,68.72,68.56,68.46,68.2,61.23,61.09,60.9,45.75(CHCH2CO2 -),45.57(CHCH2CO2 -),44.5(CHCH2CO2 -),20.6(CHCH3),19.3(CHCH3),18.0(CHCH3)ppm。
实验33.合成钾(2S)-2-O-(α/β-D-吡喃葡萄糖基)-2-羟基琥珀酸盐(150)
根据实验26所述的过程进行葡萄糖苷138(0.263g,0.41mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过制备型TLC(50:50,EtOAc/Hex)纯化，得到粘的无色胶状的期望醇(0.117g,48％)，并回收起始138(0.068g,26％)和在端基异构位置上水解的产物(0.046g,25％)。在根据实验26所述的过程进行苄醚(0.565g,0.95mmol)的催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物145(0.290g,94％)。1HNMR(D2O):δ4.94(d,J＝3.9Hz,H-1(α)),4.39(d,J＝7.9Hz,H-1(β)),4.19(dd,J＝10.4,J＝3.1Hz,1H,CO2 -CHCH2CO2 -),3.80-3.63(m),3.45-3.28(m),3.21-3.15(m),2.59(dd,J＝15.1Hz,J＝2.9Hz,CHCH 2CO2 -(β)),2.52(dd,J＝15.2Hz,J＝3.2Hz,CHCH 2CO2 -(α)),2.42(dd,J＝15.2Hz,J＝10.4Hz,CHCH 2CO2 -(α))ppm.13CNMR(D2O):δ179.5,179.1,135.3(C-1(β)),99.7(C-1(α)),95.9,79.0,75.92,75.72,74.1,73.1,72.2,71.8,71.4,69.6,69.2,60.7,60.0,41.5ppm。
实验34.合成钾(2S)-2-O-(α/β-D-吡喃半乳糖基)-2-羟基琥珀酸盐(151,152)
根据实验26所述的过程进行半乳糖苷139(1.215g,1.91mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(50:50,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的α-醇(0.642g,57％)和β-醇(0.176g,16％)，并回收起始物料139(0.020g,16％)和端基异构位置上水解的产物(0.067g,8％)。在根据实验26所述的过程进行α-醇(0.640g,1.07mmol)和β-醇(0.159g,0.27mmol)的苄醚催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物151(0.401g，定量)和152(0.100g，定量)。α产物151:FTIR(膜)v最大:1634(C＝O),3332(O-H)cm-1.1HNMR(D2O):δ4.96(d,J＝4.0Hz,1H,H-1)4.20(dd,J＝10.3,3.1Hz,CO2 -CHCH2CO2 -),4.05-4.02(m),3.94(d,J＝2.8Hz),3.86(dd,J＝10.4Hz,J＝3.3Hz),3.70-3.54(m),2.54(dd,J＝15.2Hz,3.2Hz,1H,CHCH 2CO2 -),2.432.42(dd,J＝15.2Hz,J＝10.3Hz,1H,CHCH 2CO2 -)ppm。β产物152:FTIR(膜)v最大:1736(C＝O),3410(O-H)cm-1.1HNMR(D2O):δ4.52(dd,J＝10.0Hz,J＝3.1Hz,1H,CO2 - CHCH2CO2 -),4.33(d,J＝7.5Hz,1H,H-1),3.83-3.82(m,1H),3.77-3.50(m,5H),2.62(dd,J＝15.2,3.1Hz,1H,CHCH 2CO2 -),2.44(dd,J＝15.2,10.0Hz,1H,CHCH 2CO2 -).13CNMR(D2O):δ179.4(CO2 -),179.0(CO2 -),102.0(C-1),77.6(CHCH2CO2 -),75.4,72.8,70.9,68.8,61.3(C-6),41.9(CHCH2CO2 -)pp m。
实验35.合成钾(2S)-2-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二羟基丙酸盐(153)
根据实验26所述的过程进行葡萄糖苷140(0.450g,0.54mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(20:80,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的α-醇(0.299g,70％)和β-醇(0.030g,7％)。
室温下将TBAF(THF中1M，0.37mL,0.37mmol)加入α-葡萄糖苷(0.290g,0.37mmol)的THF(2mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时，然后加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)、浓缩，得到黄色粘的残余物。通过快速柱色谱(80:20,EtOAc/己烷)用硅胶进行纯化，得到粘的无色胶状的α-二醇(0.162g,80％)。在根据实验26所述的过程进行α-二醇(0.150g,0.27mmol)的苄醚的催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物153(0.077g，定量)。1HNMR(D2O):δ4.96(d,J＝3.9Hz,1H,H-1),3.96(dd,J＝3.3Hz,J＝6.5Hz,1H,CHCH2OH),3.79-3.75(m,3H),3.72-3.63(m,3H),3.48(dd,J＝3.9Hz,J＝9.9Hz,1H,H-2),3.37(t,J＝9.6Hz,1H,H-4)ppm.13CNMR(D2O):δ177.4(CO2 -),99.2(C-1),81.4(CHCH2OH),72.9,72.2,71.7(C-2),69.3(C-4),62.6(CHCH2OH),60.0(C-6)ppm。
实验36.合成钾(2S)-2-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2,3-二羟基丙酸盐(154)
根据实验26所述的过程进行α-半乳糖苷141(0.640g,0.77mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色残余物的醇(0.572g,94％)。
室温下将TBAF(THF中1M，0.83mL,0.88mmol)加入α-半乳糖苷(0.695g,0.88mmol)的THF(5mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时，然后加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)、浓缩，得到黄色粘残余物。通过快速柱色谱(80:20,EtOAc/己烷)用硅胶进行纯化，得到粘的无色胶状的二醇(0.343g,71％)。在根据实验26所述的过程进行二醇(0.310g,0.56mmol)的苄醚的催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物154(0.172g，定量)。1HNMR(D2O):δ5.01(d,J＝3.9Hz,1H,H-1),4.28(t,J＝4.2Hz,1H,CHCH2OH),4.18-3.92(m,4H),3.85-3.58(m,4H)ppm。
实验37.合成钾(2S)-2-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-2,3-二羟基丙酸盐(155)
根据实验26所述的过程进行β-半乳糖苷141(0.275g,0.33mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色残余物的醇(0.243g,93％)。
室温下将TBAF(THF中1M，0.83mL,0.44mmol)加入β-半乳糖苷(0.350g,0.44mmol)的THF(3mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时，然后加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)、浓缩，得到黄色粘的残余物。通过快速柱色谱(80:20,EtOAc/己烷)用硅胶进行纯化，得到粘的无色胶状的二醇(0.151g,62％)。在根据实验26所述的过程进行二醇(0.140g,0.25mmol)的苄醚的催化氢化和甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物155(0.078g，定量)。1HNMR(D2O):δ4.38(d,J＝7.4Hz,1H,H-1),4.28(dd,J＝6.2Hz,J＝2.9Hz,1H,CHCH2OH),3.84(dt,J＝7.2,3.8Hz,2H),3.76-3.68(m,3H),3.66-3.53(m,4H)ppm.13CNMR(D2O):δ177.1(CO2 -),102.5(C-1),81.4(CHCH2OH),75.3,72.8,71.0,68.6,63.2(CHCH2OH),61.0(C-6)ppm。
实验38.合成乙基3-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基)-3-羟基丁酸酯(156)
将乙基3-二羟基丁酸酯(0.348mL,2.68mmol)加入三氯乙酰亚胺酯103(1.100g,2.23mmol)的无水CH2Cl2(6mL)中。将溶液冷却至0℃，缓慢加入BF3OEt2(0.282mL,2.23mmol)。当反应完成时，加入饱和NaHCO3水溶液，然后用CH 2Cl2(3×15mL)萃取。将合并的有机相干燥(MgSO4)、浓缩。将残余物通过快速柱色谱(40:60,EtOAc/己烷)用硅胶纯化，得到粘的无色残余物的156(0.943g,91％)。
实验39.合成二甲基(2S)-2-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基)-2-羟基琥珀酸酯(157)
根据实验38所述的过程进行三氯乙酰亚胺酯供体103(1.540g,3.12mmol)和乙基二甲基二甲基(S)-苹果酸酯134(0.494mL,3.75mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的产物157(1.359g,88％)。
实验40.合成甲基3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-(2S)-2-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基)-2,3-二羟基丙酸酯(158)
根据实验38所述的过程进行三氯乙酰亚胺酯供体103(1.30g,2.64mmol)和受体135(0.946g,2.64mmol)的糖基化反应。将粗品通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的产物158(1.33g,73％)。
实验41.合成钾3-O-(α-D-吡喃甘露糖基)-3-羟基丁酸盐(159)
0℃下将NaOMe 1N(0.36mL,0.36mmol)的MeOH溶液加入156(0.276g,0.60mmol)的MeOH(3mL)搅拌溶液中。在起始物料完全转化之后，加入先前活化的Dowex-H+树脂，直至中性pH。在用MeOH和水过滤之后，将溶剂真空去除，得到粘的无色胶状的脱保护的甘露糖苷(0.157g,90％)。
将2M KOH(0.78mL)溶液加入先前的甘露糖苷(0.431g,1.56mmol)的H2O(4mL)搅拌溶液中。在所有起始物料被消耗尽之后，将pH用10％HCl调节至7，将溶剂蒸发得到粘的无色泡沫状的159(0.446g，定量)。1HNMR(D2O):δ4.91(d,J＝7.5Hz),4.18-4.09(m,(CHCH3),3.84-3.77(m),3.74-3.63(m),3.57(t,J＝8.9Hz),2.43-2.21(m,(CHCH 2CO2 -)),1.20(d,J＝6.1Hz,CHCH 2CO2 -),1.14(d,J＝5.6Hz,CHCH 2CO2 -)ppm。13CNMR(CDCl3):δ179.9(CH2 CO2 -),179.8(CH2 CO2 -),99.7(C-1),96.5(C-1),73.4,72.9,72.5,70.57,70.52,70.41,70.29,70.24,66.84,66.72,61.0(C-6),60.7(C-6),45.5(CHCH2CO2 -),44.8(CHCH2CO2 -),20.8(CHCH3)ppm。
实验42.合成钾(2S)-2-O-(α-D-吡喃甘露糖基)-2-羟基琥珀酸盐(160)
根据实验41所述的过程进行甘露糖苷157(1.343g,2.72mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。将粗品通过柱色谱(20:80,MeOH/CH2Cl2)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的所期望的脱保护甘露糖苷(0.685g,78％)，以及在端基异构位置上水解的产物，D-吡喃甘露糖苷(0.100g,20％)。在根据实验38所述的过程进行甲基酯水解之后，得到粘的无色泡沫状的化合物160(0.0.786g，定量)。1HNMR(D2O):δ4.85(t,J＝15.6Hz,1H),4.85(s,1H,H-1),4.24(dd,J＝8.2Hz,J＝4.7Hz,1H),3.90-3.58(m,5H),2.79-2.64(m,2H)ppm。
实验43.合成钾(2S)-2-O-(D-吡喃甘露糖基)-2,3-二羟基丙酸盐(161)
室温下将TBAF(THF中1M，0.38mL,0.38mmol)加入158(0.220g,0.32mmol)的THF(3mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时，然后加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)并浓缩，得到黄色粘的残余物。通过制备型TLC(60:40,EtOAc/己烷)纯化得到粘的无色胶状的醇(0.103g,72％)。根据实验41所述的过程进行该醇(0.518g,1.15mmol)的乙酸酯基的甲醇分解。在起始物料完全转化之后，加入先前活化的Dowex-H+树脂直至中性pH。在用MeOH和水过滤之后，将溶剂真空去除，得到粘的无色胶状的脱保护甘露糖苷(0.312g,96％)。根据实验41所述的过程进行甲基酯的水解，得到粘的无色泡沫状的化合物161(0.300g，定量)。1HNMR(D2O):δ4.89(d,J＝1.4Hz,1H,H-1),4.02(dd,J＝7.1,3.2Hz,1H,CHCO2 -),3.99(dd,J＝3.4,1.6Hz,1H,H-),3.89(dd,J＝9.5,3.4Hz,1H),3.79(dd,J＝12.2,3.1Hz,1H,H-),3.74-3.61(m,5H)ppm。13CNMR(CDCl3):δ100.8,80.6(C-1),73.2,70.5,70.1,66.5,62.5,60.5ppm。
实验44.合成二甲基(2S)-2-O-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-6-O-氯乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2-羟基琥珀酸酯(162)
将硫代葡萄糖苷供体91(0.750g,1.32mmol)、甲基(S)-苹果酸酯134(0.197mL,1.52mmol)和
Figure BDA0003821777680000411
MS的CH2Cl2:Et2O(1:4，20mL)悬浮液在室温下搅拌1小时，然后冷却至0℃。在0℃下加入N-碘代丁二酰亚胺(0.594g,2.64mmol)和TfOH(0.027mL)的CH 2Cl2:Et2O(1:1,20mL)溶液。在起始物料完全转化之后，加入10％Na2S2O3水溶液(20mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)。将混合物用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤，并将溶剂真空去除。将粗产物通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色泡沫状的产物162(0.672g,84％)。
实验45.合成甲基(2S)-2-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)丙酸酯(163)
0℃下将NaOMe 1N(0.46mL,0.46mmol)的MeOH溶液加入95(0.470g,0.77mmol)的MeOH(5mL)搅拌溶液中。1小时之后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液中和。将水相用EtOAc萃取，将合并的有机相干燥(MgSO4)、过滤，并将溶剂去除。将粗产物通过快速柱色谱(30:70,EtOAc/Hex)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的163(0.355g,98％)。
实验46.合成甲基2-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)乙酸酯(164)
将实验45的过程应用于化合物96(0.500g,0.94mmol)，得到粘的无色胶状的化合物164(0.393g,92％)。
实验47.合成甲基(2R)-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二羟基丙酸酯(165)
室温下将TBAF(THF中1M，1.14mL，1.14mmol)加入97(0.830g,1.03mmol)的THF(7mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时，然后加入水。将混合物用EtOAc萃取，干燥(MgSO4)并浓缩得到黄色粘的残余物。通过快速柱色谱(50:50,EtOAc/己烷)用硅胶纯化，得到粘的无色胶状的醇(0.401g,72％)。将实验45的过程应用于该醇(0.296g,0.55mmol)，得到粘的无色胶状的165(0.261g,92％)。
实验48.合成二甲基(2S)-2-O-(2-叠氮基-3,4,二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2-羟基琥珀酸酯(166)
将实验45的过程应用于化合物162(0.670g,1.10mmol)，得到粘的无色胶状的化合物166(0.429g,73％)。
实施例2：在三种蛋白质模型中实施例1的相容性溶质的蛋白稳定化效果
使用差示扫描荧光测定法(DSF)评价新的合成类似物稳定三种模型蛋白对抗热应力的能力。该研究中，苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶用作模型蛋白质，并将合成化合物的稳定化效果与天然溶质如MG和GG和氯化钾以及其它先前合成的非天然溶质如MGlyc和ML的稳定化效果进行比较。
测试的化合物示于表6和表7中。
表6：该研究中测试的天然的和合成的葡萄糖衍生物、半乳糖衍生物和甘露糖衍生物的化学结构
Figure BDA0003821777680000441
表7：该研究中测试的合成的葡萄糖胺衍生物和N-乙酰基葡萄糖胺衍生物的化学结构
Figure BDA0003821777680000451
在每种蛋白质的工作pH下进行基于DSF的稳定试验，在不存在(对照实验)和存在溶质以及在不同溶质浓度下测定解链温度(TM)值。分析每个试验的变性曲线和通过计算第一衍生物测定解链温度，该解链温度对应蛋白质解折叠转变(protein-unfoldingtransition)的中间(midpoint)温度。在不存在溶质的情况下，苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄球菌核酸酶(SNase)和溶菌酶的解链温度(TM)分别为50℃、52℃和71℃。通过将在存在溶质的情况下获得的TM值与对照实验(不存在溶质)的TM值比较而计算解折叠温度变化(ΔTM)。正ΔTM值对应TM增大，这意味着蛋白质更稳定，使其解折叠需要更多的能量(热量)。负ΔTM值对应TM减小，这意味着蛋白质没那么稳定。
图1描述了由合成溶质和和天然溶质的存在引起的三种酶的解链温度(ΔTM)的增量。
对不同葡萄糖衍生物(图2)和半乳糖(图3)的分析示出了与己糖连接的非糖苷基团的重要性。
关于糖结构的重要性，分析了不同乳酸酯衍生物(图4)和苹果酸酯衍生物(图5)。
当绘制MDH解链温度增量对SNase和溶菌酶的解链温度增量时(图2-5)，生成了结果的总图。
对测试的蛋白质的一般结论：
-带电的化合物是更好的稳定剂；
-苹果酸酯衍生物(最好)和乳酸酯衍生物给出更高的稳定化作用；
-非糖部分对稳定化效果的影响比己糖结构的大；以及
-葡萄糖衍生物和半乳糖衍生物是更好的稳定剂。
结合超溶质(hypersolute)研究了乙酸钾盐(AcOK)对溶菌酶的稳定化效果(图6)。结果显示，单独的AcOK不是良好的稳定剂，仅在高盐浓度时发挥稳定化作用。然而，结合超溶质能够增强其稳定化性能。
为了测定糖的糖苷键对稳定化效果的重要性，研究了D-半乳糖甘油酸酯和L-半乳糖甘油酸酯的不同的α端基异构体和β端基异构体(图7)。对三种酶获得的结果显示与天然D-甘油酸酯衍生物相比L-甘油酸酯是更好的稳定剂；与具有β结构的那些相比，β-端基异构体是更好的稳定剂。
为了研究解链温度的增量对溶质浓度的依赖性，在不同溶质浓度-0.1M、0.25M和0.5M(图8、图9和图10)下测试蛋白质。对于这三种蛋白质，结果显示了独立的稳定化作用程度，稳定化效果与溶质浓度直接成比例。虽然获得的结果似乎遵循总趋势，但当仔细观察SNase(图8)和溶菌酶(图10)的情况时，α-半乳糖基苹果酸酯显然是最好的稳定剂。在MDH的情况下，结果显示葡萄糖基苹果酸酯是该酶最好的稳定剂。
材料
如文献(Costa 1998)所述通过化学合成获得甘露糖基甘油酸酯(MG)、葡萄糖基甘油酸酯(GG)、葡萄糖基葡萄糖基甘油酸酯(GGG)、甘露糖基乙醇酸酯(MGly)和甘露糖基乳酸酯(ML)。如实施例1所述通过化学合成获得新的合成化合物。通过尺寸排阻色谱用SephadexG-10柱(用水洗脱)纯化所期望的化合物。将含有纯化合物的部分合并，冻干。通过于D2O中在500MHz分光仪获得的1H NMR光谱评估化合物的纯度和浓度。为了定量的目的，以重复延迟60秒获得光谱，甲酸盐作为浓度标准。仅使用纯度高于98％的样品。从Roche购得来自猪心的线粒体苹果酸脱氢酶(MDH)，从Sigma-Aldrich购得母鸡卵清溶菌酶。这些酶不需要进一步纯化即可使用。如Faria 2008所述，从大肠杆菌(Escherichia coli)细胞生产重组葡萄球菌核酸酶A (SNase)，并对其进行纯化。根据280nm处的UV吸光度测定蛋白质浓度，MDH的消光系数使用0.28(mg/mL)-1cm-1，溶菌酶的消光系数使用2.58(mg/mL)-1cm-1，SNase的消光系数使用0.93(mg/mL)-1cm-1。
DSF试验
通过用荧光探针SYPRO橙色染料(分子探针)监控蛋白质解折叠来实施蛋白质解链温度(TM)的测定，虽然该荧光探针在水环境中完全淬灭，但在结合至蛋白质疏水区(hydrophobic patch)时发射荧光。可使用差示扫描荧光测定法测量随温度变化的这样的荧光增加。在总体积为20μL的典型试验中，0.14-0.21mg/mL的蛋白质浓度和5倍的染料浓度用于保障最佳信噪比。在磷酸盐缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.6)中制备SNase或MDH的蛋白质原液，在柠檬酸盐缓冲液(40mM柠檬酸钠，110mM NaCl，pH 6.0)中制备溶菌酶的蛋白质原液。在试验前将这些原液用相同的缓冲液进行充分透析。约1.9μM的蛋白质浓度用于MDH，12.4μM的浓度用于SNase，13μM的浓度用于溶菌酶。在水中制备各自浓度的溶质溶液。通过将2μL蛋白质加入8μL染料缓冲溶液和10μL溶质溶液中准备试验，除了溶质溶液之外所有溶液都在蛋白质纯化缓冲液中制备。通过测定第一衍生物(d(Rfu)/dT)以获得确切的转换拐点，将荧光强度对温度用于计算蛋白质解链温度(TM)。
实施例3：实施例1的六种相容性溶质对猪胰岛素的稳定化效果
使用实施例2所述的DSF试验研究了半乳糖基乳酸酯143、半乳糖基丁酸酯149、半乳糖基甘油酸酯146、葡萄糖基丁酸酯148、葡萄糖基乙醇酸酯144和葡萄糖基苹果酸酯150稳定猪胰岛素的能力。
对于该试验，制备包含浓度为129μM的猪胰岛素和浓度为0.1M和0.25M的相容性溶质的溶液。浓度为0.1M和0.25M的每种溶质下观察到的解链温度的增量示于图11中。
在两个测试浓度下，所有六种溶质使猪胰岛素稳定，其中葡萄糖基乙醇酸酯和葡萄糖基苹果酸酯提供的解链温度的增加最高。
讨论
使用DSF评价新化合物保护蛋白质模型免受热诱导的失活的有效性，并与天然溶质如MG和GG以及氯化钾，和其它先前合成的非天然溶质如MGlyc和ML的效果作比较。DSF被证明是快速获得关于分子稳定化性能的信息的优异非高通量方法。
对获得的结果的分析显示，稳定化效果不是普遍的，其强烈依赖于特定的蛋白质-溶质相互作用。虽然一些溶质显示出众的热稳定化性能，但对每种蛋白质的稳定化程度是不同的。
对稳定化效果而言，电荷的存在是最重要的特征之一。未带电的溶质，如葡萄糖胺环状衍生物给出最低的稳定化作用，而具有双电荷(double charge)的苹果酸酯衍生物是最好的稳定剂。
对于使用的不同己糖，葡萄糖衍生物和半乳糖衍生物是分别比甘露糖衍生物和N-乙酰基葡萄糖胺衍生物更好的稳定剂。然而，结果显示，连接至糖的基团对稳定化效果的影响大于糖的性质的影响。
用半乳糖基甘油酸酯的α端基异构体和β端基异构体获得的结果显示，α衍生物是更好的稳定剂。
可以预期的是，本文所描述的新化合物将稳定其他蛋白质以及其它生物材料。因此，本发明的新化合物用于稳定药物例如生物制剂如抗体和激素，化妆品，食品等中使用的生物材料。本发明的化合物可用于保护生物材料免受温度应力、聚集和高盐度的影响。例如，本发明的化合物可用于在处理例如纯化、配制和/或干燥、运输和贮存期间稳定生物制剂。
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Claims (37)

1.式I的化合物或其盐：
Figure FDA0003821777670000011
其中：R1为-OC(H)(X)(CH2)nC(＝O)OH；
R2为-OH、-N3或-N(H)C(＝O)CH3；或者
R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure FDA0003821777670000012
R3为-H、-CH3、-CH2C(＝O)OH或-CH2OH；
X为-H、-CH3、-CH2OH或CH2C(＝O)OH；并且
n为0或1；
其中当所述化合物为
Figure FDA0003821777670000013
并且R2为OH，X为CH3，n为0时，所述化合物为
Figure FDA0003821777670000014
其中当所述化合物为
Figure FDA0003821777670000021
并且R2为OH，X为H，n为0时，所述化合物为
Figure FDA0003821777670000022
其中当所述化合物为
Figure FDA0003821777670000023
并且R2为OH，X为CH2OH，n为0时，所述化合物为
Figure FDA0003821777670000024
其中当所述化合物为
Figure FDA0003821777670000025
并且R2为OH，X为CH2OH，n为0时，所述化合物为
Figure FDA0003821777670000026
2.根据权利要求1-2中任一项所述的化合物或其盐，其中所述化合物为
Figure FDA0003821777670000031
3.根据权利要求1-2中任一项所述的化合物或其盐，其中所述化合物为
Figure FDA0003821777670000032
4.根据权利要求1-2中任一项所述的化合物或其盐，其中所述化合物为
Figure FDA0003821777670000033
5.根据权利要求1-2中任一项所述的化合物或其盐，其中所述化合物为
Figure FDA0003821777670000034
6.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物或其盐，其中所述化合物的α/β端基异构体之比为1:1-99:1。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物或其盐，其中所述化合物的α/β端基异构体之比大于99:1。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物或其盐，其中R1为
Figure FDA0003821777670000035
Figure FDA0003821777670000041
9.根据权利要求8所述的化合物或其盐，其中R1为
Figure FDA0003821777670000042
Figure FDA0003821777670000043
10.根据权利要求8所述的化合物或其盐，其中R1为
Figure FDA0003821777670000044
Figure FDA0003821777670000045
11.根据权利要求8所述的化合物或其盐，其中R1为
Figure FDA0003821777670000046
Figure FDA0003821777670000047
12.根据权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐，其中R2为-OH。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的化合物或其盐，其中R2为-N(H)C(＝O)CH3。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物或其盐，其中R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure FDA0003821777670000048
15.根据权利要求14所述的化合物或其盐，其中R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure FDA0003821777670000051
16.根据权利要求14所述的化合物或其盐，其中R1和R2连同与其连接的碳原子形成
Figure FDA0003821777670000052
17.根据权利要求14-16中任一项所述的化合物，其中R3为-CH3。
18.根据权利要求14-16中任一项所述的化合物，其中R3为-CH2OH。
19.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为
Figure FDA0003821777670000053
Figure FDA0003821777670000061
Figure FDA0003821777670000071
20.组合物，其包含至少一种权利要求1-19中任一项所述的化合物或其盐，以及生物材料。
21.根据权利要求20所述的组合物，其还包含缓冲剂。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的组合物，其中所述生物材料为多肽。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述多肽为酶、抗体、血浆蛋白或激素。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的组合物，其中所述多肽为胰岛素、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶或溶菌酶。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的组合物，其中所述多肽为重组多肽。
26.根据权利要求22-24中任一项所述的组合物，其中所述多肽不是重组多肽。
27.稳定生物材料的方法，其包括将至少一种权利要求1-19中任一项所述的化合物或其盐添加至含有所述生物材料的溶液中从而形成稳定化的溶液。
28.根据权利要求27所述的方法，其还包括将所述稳定化的溶液干燥的步骤。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述生物材料为多肽。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多肽为酶、抗体、血浆蛋白或激素。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的方法，其中所述多肽为胰岛素、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶或溶菌酶。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述多肽为重组多肽。
33.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述多肽不是重组多肽。
34.权利要求1-19中任一项所述的化合物或其盐用于稳定生物材料。
35.权利要求1-19中任一项所述的化合物或其盐用于稳定生物材料的用途。
36.诊断试剂盒，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物或其盐。
37.根据权利要求36所述的诊断试剂盒，其包含微阵列、生物传感器或酶制剂。
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