JP2020183383A - ヘキソース誘導体、その製剤および使用 - Google Patents

Abstract

【課題】生物学的物質を安定させるためのヘキソース誘導体の提供。【解決手段】式：［式中、Ｒ１は下記構造、Ｒ２は、−ＯＨ、−Ν３等］の化合物又はその塩。【選択図】なし

Description

本出願は２０１４年３月１４日に提出された米国仮出願第６１／９５３，３９２号の優先権を主張し、その内容は全部で引用により本出願に取り込まれている。

本出願の全体において、様々な文献が参照され、括弧内で参照されるものを含む。括弧内で参照される文献の完全な書誌的事項は、特許請求の範囲直前の、明細書の最後にアルファベット順に列挙され、発見され得る。全体において参照される全ての文献の開示は、この発明に関連する技術の状況をより完全に記載するために、本明細書中に全体としての参照により援用される。

発明の背景
適合溶質と称される低分子量有機化合物は、外部媒体の浸透圧と釣り合い、正確なタンパクのフォールディングを促進し、タンパクの凝集を阻害し、熱起因の変性を防ぐ、たくさんの好温性または耐温性の微生物で確認されている（Ｆａｒｉａ ２００８，Ｆａｒｉａ ２０１３）。適合溶質は、例えば、薬学的および表面の変性におけるタンパクを安定させるため、したがって産業的に有用である（Ｌｕｌｅｙ−Ｇｏｅｄｌ ２０１１，Ｌｅｎｔｚｅｎ ２００６）。

適合溶質は、通常にアミノ酸、炭水化物、ポリオール、ベタインおよびエクトインである。トレハロース、グリセロール、グリセリン−ベタインおよびエクトインは、中温性の典型的な適合溶質である。極端な好熱性および超好熱性の微生物の発見は、マンノシルグリセラート（ＭＧ）およびジミオ−イノシトール−１，３’−リン酸（Ｆａｒｉａ，２００８）のような、さらなる適合溶質の発見へと至った。

化合物は、構造的に、ＭＧ、言い換えれば（２Ｓ）−２−（１−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル）プロピオナート（ＭＬ）、２−（１−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル）アセタート（ＭＧｌｙｃ）、１−Ｏ−（２−グリセリル）−α−Ｄ−マンノピラノシド（ＭＧＯＨ）に関連し、これらは、熱応力に対するモデルタンパクを安定させることができるために合成され、試験されている（Ｆａｒｉａ ２００８）。

生物学的物質の安定のために新規化合物が必要とされる。

発明の要旨
本発明は、式Ｉ：

［式中、Ｒ^１は、−ＯＣ（Η）（Ｘ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＯＨであり、
Ｒ^２は、−ＯＨ、−Ｎ_３、もしくは−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３であり、または
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって

を形成し、
Ｒ^３は、−Η、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ_２ＯＨであり、
Ｘは、−Η、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＯＨ、またはＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであり、
ｎは、０または１である］の化合物またはその塩であって、
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_３であり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

であり；
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

であり；
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_２ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

であり；
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_２ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

である、該化合物またはその塩を提供する。

本発明は、さらに式Ｉの少なくとも１種の化合物またはその塩、および生物学的物質を含む組成物を提供する。

本発明は、さらに生物学的物質を含んでいる溶液へ、式Ｉの少なくとも１種の化合物またはその塩を加えて、安定した溶液を形成することを含む、生物学的物質を安定させる方法を提供する。

本発明は、さらに生物学的物質を安定させるための式Ｉの化合物またはその塩を提供する。

本発明は、さらに生物学的物質を安定させるための式Ｉの化合物またはその塩の使用を提供する。

０．５Ｍの異なる溶質の存在下におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ，灰色バー）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ，黒色バー）およびリゾチーム（白色バー）の融点（ＴＭ）の増加量。溶質無しの融点（Ｔ_Ｍ）は、ＭＤＨが５０℃、ＳＮａｓｅが５２℃およびリゾチームが７１℃であった。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームの熱変性に対する異なるグルコース誘導体の安定化効果。横軸には０．５Ｍのいくつかの化合物によって誘導されるＭＤＨの融点の増加量、ならびに縦軸にはＳＮａｓｅ（黒塗り）およびリゾチーム（白抜き）の融点の増加量が図示されている。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームの熱変性に対する異なるガラクトース誘導体の安定化効果。横軸には０．５Ｍのいくつかの化合物によって誘導されるＭＤＨの融点の増加量、ならびに縦軸にはＳＮａｓｅ（黒塗り）およびリゾチーム（白抜き）の融点の増加量が図示されている。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームの熱変性に対する異なるラクタート誘導体の安定化効果。横軸には０．５Ｍのいくつかの化合物によって誘導されるＭＤＨの融点の増加量、ならびに縦軸にはＳＮａｓｅ（黒塗り）およびリゾチーム（白抜き）の融点の増加量が図示されている。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームの熱変性に対する異なるマラート誘導体の安定化効果。横軸には０．５Ｍのいくつかの化合物によって誘導されるＭＤＨの融点の増加量、ならびに縦軸にはＳＮａｓｅ（黒塗り）およびリゾチーム（白抜き）の融点の増加量が図示されている。 単独および異なるハイパーソリュート（ｈｙｐｅｒｓｏｌｕｔｅ）（０．５Ｍ）と合わせたＡｃＯＫの濃度に対する安定化効果の依存性。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームの熱変性に対する異なるガラクトシルグリセラート誘導体の安定化効果。横軸には０．５Ｍのいくつかの化合物によって誘導されるＭＤＨの融点の増加、ならびに縦軸にはＳＮａｓｅ（黒塗り）およびリゾチーム（白抜き）の融点の増加量が図示されている。 溶質の濃度に対するＳＮａｓｅの融点の依存性。 溶質の濃度に対するＭＤＨの融点の依存性。 溶質の濃度に対するリゾチームの融点の依存性。 ０．１および０．２５Ｍの異なる溶質で得られたブタのインスリンの融点の増加量。各溶質の左のバーは０．２５Ｍにおける結果を示し、右のバーは０．１Ｍにおける結果を示している。

発明の詳細な説明
以下の略語は、本明細書を通じて使用される。

Ａｃ アセタート
ＢｎＢｒ 臭化ベンジル
ＤＩＰ ジ−ミオ−イノシトールリン酸
ＤＧＰ ジ−グレセロールリン酸
ＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＳＦ 示差走査型蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）
Ｅｔ エチル
Ｅｔ_２Ｏ ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＧＧ α−Ｄ−グルコシル−Ｄ−グリセラート
ＧＧＧ α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−Ｄ−グリセラート
ＧＬ α−Ｄ−グルコシル−Ｓ−ラクタート
Ｈｅｘ ヘキサン
ＭＤＨ リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
Ｍｅ メチル
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＧ α−Ｄ−マンノシル−Ｄ−グリセラート
ＭＧＡ α−Ｄ−マンノシル−Ｄ−グリセルアミド
ＭＧＧ α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−Ｄ−グリセラート
ＭＧｌｙ α−Ｄ−マンノシル−グリコラート
ＭＭＧｌｙ （２Ｒ）−２−（１−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル）−３−（１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−グリセラート
ＭＬ α−Ｄ−マンノシル−Ｓ−ラクタート
ＮａＯＭｅ ナトリムメトキシド
ＮＩＳ Ｎ−ヨードスクシンイミド
ＮＭＲ 核磁気共鳴
Ｐｈ フェニル
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＳＮａｓｅ ブドウ球菌性ヌクレアーゼ
ＴＢＡＦ テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド
ＴＢＤＰＳＣｌ ｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン
ＴＢＤＭＳ ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン
ＴｆＯＨ トリフルオロメタンスルホン酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
本発明は、式Ｉ：

［式中、Ｒ^１は、−ＯＣ（Η）（Ｘ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＯＨであり、
Ｒ^２は、−ＯＨ、−Ｎ_３、もしくは−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３であり、または
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって

を形成し、
Ｒ^３は、−Η、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ_２ＯＨであり、
Ｘは、−Η、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＯＨ、またはＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであり、
ｎは、０または１である］の化合物またはその塩であって、
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_３であり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

であり；
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

であり；
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_２ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

であり；
前記化合物が

であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_２ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、

である、該化合物またはその塩を提供する。
１つの実施形態において、前記化合物は、

またはその塩ではない。
１つの実施形態において、式Ｉの化合物は、天然由来の化合物ではない。

１つの実施形態において、前記化合物は、

またはその塩である。
１つの実施形態において、前記化合物は、

またはその塩である。
１つの実施形態において、前記化合物は、

またはその塩である。
１つの実施形態において、前記化合物は、

またはその塩である。
１つの実施形態において、前記化合物またはその塩のα／βアノマー比は、１：１から９９：１までである。１つの実施形態において、前記化合物またはその塩のα／βアノマー比は、１：１から１０：１までである。１つの実施形態において、前記化合物またはその塩のα／βアノマー比は、１：１から５：１までである。別の実施形態において、前記化合物またはその塩のα／βアノマー比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または１０：１である。１つの実施形態において、前記化合物またはその塩のα／βアノマー比は、１０：１より大きい。１つの実施形態において、前記化合物またはその塩のα／βアノマー比は、９９：１より大きい。１つの実施形態において、前記化合物またはその塩は、αアノマーである。

１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、Ｒ^１は

である。
１つの実施形態において、不斉中心がＲ^１に存在しているとき、前記化合物は、２つの鏡像異性体の混合物である。

１つの実施形態において、不斉中心がＲ^１に存在しているとき、前記化合物は、Ｓ鏡像異性体である。

１つの実施形態において、不斉中心がＲ^１に存在しているとき、前記化合物は、Ｒ鏡像異性体である。

１つの実施形態において、Ｒ^２は−ＯＨである。

１つの実施形態において、Ｒ^２はＮ_３である。

１つの実施形態において、Ｒ^２は−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３である。

１つの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって

を形成している。
１つの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって

を形成している。
１つの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって

を形成している。
１つの実施形態において、Ｒ^３は−Ｈである。

１つの実施形態において、Ｒ^３は−ＣＨ_３である。

１つの実施形態において、Ｒ^３は−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである。

１つの実施形態において、Ｒ^３は−ＣＨ_２ＯＨである。

１つの実施形態において、前記化合物は、

またはその塩である。
１つの実施形態において、前記化合物は、前の実施形態のいずれか１種の化合物、またはその塩である。

１つの実施形態において、前記化合物は、塩の形態である。

１つの実施形態において、前記化合物は、薬学的に許容され得る塩の形態である。

１つの実施形態において、前記化合物は、カリウム塩の形態である。

１つの実施形態において、前記化合物は、ナトリウム塩の形態である。

本発明はまた、本発明の少なくとも１種の化合物またはその塩、および生物学的物質を含む組成物を提供する。

１つの実施形態において、前記組成物は液体である。１つの実施形態において、前記組成物は固体である。１つの実施形態において、前記組成物は、凍結乾燥されている。１つの実施形態において、前記組成物は、フリーズドライされている。

１つの実施形態において、前記組成物は液体であり、本発明の少なくとも１種の化合物は０．０１から１Ｍまでの濃度の組成物中に存在している。１つの実施形態において、本発明の少なくとも１種の化合物は０．１から０．５Ｍまでの濃度で存在している。１つの実施形態において、本発明の少なくとも１種の化合物は０．０１から１Ｍまでの濃度で存在している。１つの実施形態において、本発明の少なくとも１種の化合物は０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、または０．５Ｍの濃度の組成物中に存在している。

１つの実施形態において、前記組成物は、本発明の液体の組成物を乾燥することによって調製された固体である。

１つの実施形態において、前記組成物は、本発明の少なくとも１種の化合物に加えて、少なくとも１種の他の適合溶質を含む。前記少なくとも１種の他の適合溶質は、例えば、当技術分野で周知の少なくとも１種の他の適合溶質であり得る。少なくとも１種の他の適合溶質および／または本発明の２種以上の化合物を有している組成物において、生物学的物質を安定させるために必要な、他の適合溶質の量および／または本発明の各化合物の量は、単独で生物学的物質を安定させるために必要な各試薬の量未満であり得る。

１つの実施形態において、前記組成物は、本発明の少なくとも１種の化合物に加えて、１種またはそれ以上の塩をさらに含む。１つの実施形態において、１種またはそれ以上の追加の塩は、薬学的に許容され得る塩である。１つの実施形態において、前記１種またはそれ以上の塩は、酢酸カリウムを含む。

１つの実施形態において、前記組成物は、医薬組成物、化粧品、または食品である。

１つの実施形態において、前記生物学的物質は、核酸、ポリペプチド、ホールセル（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）、ウイルス、粒子のようなウイルス、細胞膜、細胞成分、リポソーム、組織、または上述のいずれかの混合物である。１つの実施形態において、前記生物学的物質は、１種、２種、３種またはそれ以上の種の生物学的物質を含む。

１つの実施形態において、生物学的物質は、１種またはそれ以上の種の核酸である。１つの実施形態において、前記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。１つの実施形態において、前記ＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。１つの実施形態において、前記ＲＮＡは二本鎖である。１つの実施形態において、前記ＲＮＡはｍＲＮＡである。１つの実施形態において、前記ＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、前記ＤＮＡは二本鎖である。１つの実施形態において、前記ＤＮＡは一本鎖である。

１つの実施形態において、前記生物学的物質は、１種またはそれ以上の種のホールセルである。

１つの実施形態において、前記生物学的物質は、ポリペプチドである。

１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、酵素、抗体、血漿タンパク質、またはホルモンである。

１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、インスリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼまたはリゾチームである。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、インスリンである。

１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、酵母または哺乳類の細胞培養から単離される。

１つの実施形態において、ポリペプチドは、組換えポリペプチドではない。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、植物、動物、真菌、または細菌から単離される。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、動物またはヒトの血清ポリペプチドである。

１つの実施形態において、前記組成物はさらにバッファーを含む。

本発明はまた、生物学的物質を含んでいる溶液へ、本発明の少なくとも１種の化合物またはその塩を加えて、安定した溶液を形成することを含む、生物学的物質を安定させる方法を提供する。

１つの実施形態において、前記方法は前記安定した溶液を乾燥する工程をさらに含む。

１つの実施形態において、前記乾燥は、噴霧乾燥または凍結乾燥である。

１つの実施形態において、本発明の少なくとも１種の化合物またはその塩は、安定させるために前記生物学的物質の特性に基づいて選択される。例えば、前記生物学的物質がタンパク質である場合には、本発明の化合物、または本発明の化合物の組合せは、タンパク質の表面の疎水性および／または親水性に基づいて選択され得る。

本発明はまた、生物学的物質を安定させるための本発明の化合物またはその塩を提供する。

本発明はまた、生物学的物質を安定させるための本発明の化合物またはその塩の使用を提供する。

１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質を変性から保護することである。１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質の融点を増加することである。１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質を乾燥から保護することである。１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質を凝集から保護することである。１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質を熱から保護することである。１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質を凍結から保護することである。１つの実施形態において、安定化は、乾燥中に生物学的物質を保護することである。１つの実施形態において、安定化は、生物学的物質の貯蔵寿命を向上することである。

本発明はまた、本発明の化合物またはその塩を含む診断キットを提供する。

１つの実施形態において、前記診断キットは、マイクロアレイ、バイオセンサー、または酵素製剤である。１つの実施形態において、前記マイクロアレイ、バイオセンサー、または酵素製剤は、固定化生物学的物質を含む。本発明の適合溶質は、固定化生物学的物質を用いる技術の実施を改善するために、適合溶質を当技術分野で周知の方法に用いられ得る。例えば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ／２００７／０９７６５３号を参照。

本発明はまた、本発明の化合物、もしくはその塩を含む化粧品または他の皮膚科学的組成物、およびヒトまたは動物への局所投与に適した賦形剤を提供する。

１つの実施形態において、前記化粧品または皮膚科学的組成物は、１種またはそれ以上の生物学的物質を含む。

本発明はまた、上記のような化合物、組成物、方法、および使用を提供し、該化合物は、表６または７に記載したいずれかの化合物またはその塩である。例えば、本発明は、表６と７に記載した１種またはそれ以上の化合物および生物学的物質を含む生物学的物質を安定させるための組成物を提供する。他の例として、本発明は、生物学的物質を含んでいる溶液へ、表６と７に記載した少なくとも１種の化合物またはその塩を加えて、安定した溶液を形成することを含む、生物学的物質を安定させる方法を提供する。

本明細書に記載した具体的な実施形態および例は例示であり、多くの変形は、開示の意志から、または添付された請求項の範囲から外れることなしに、これらの実施形態および例から導出され得る。異なる例示した実施形態および／または例の、要素および／または特性は、この開示および添付された請求項の範囲内で、互いに組み合わされおよび／または互いに置き換えられ得る。

本発明の化合物を含み、または適用可能であるとして本明細書に記載された各実施形態は、化合物の塩にも等しく適用できる。

上述の実施形態において、本明細書に開示された各実施形態は、それぞれの他の開示された実施形態に適用可能であると予想される。

本明細書に開示された任意の範囲で、範囲内の全ての１０分の１および整数の単位量は、発明の一部として明確に開示されるということを意味する。このように、例えば０．１Ｍから０．５Ｍまでは、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、および０．５Ｍが、発明の範囲内の実施形態であることを意味する。

本発明は、後の例を参照することによってより理解されるであろうし、それらは主題の理解を援用するように記載され、後に続く特許請求の範囲のいずれを限定するように解釈されるべきではないし、意図されるものではない。

例１： 新規適合溶質の合成
糖誘導体に基づく化学ライブラリが、増加したタンパク質の安定化特性を有する新規有機化合物を決定するために調製された。類似体構造の多様性は、例えばグルコース、ガラクトース、マンノースおよびグルコサミンのような異なるヘキソースを用いること、ならびにグリコシル化反応中に異なるグリコシルアクセプターを用いることによって導入された。

ガラクトースおよびグルコサミン類似体は、安定化効果に対する糖構造の寄与を評価するために、マンノシドおよびグルコシドに加えて合成された。我々の知る限りにおいて、適合溶質を含む唯一のガラクトースは、超好熱菌である、サーモコッカスリトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からのβ−ガラクトピラノシル−５−ヒドロキシリシン（ＧａｌＨＩ）：

から単離されている。
グルタマート、プロリン、およびグルタミンのようないくつかのアミノ酸は、多くの中温性の有機体における適合溶質として機能することができ、α−およびβ−アミノ酸の両方は、オスモアダプテーション（ｏｓｍｏａｄａｐｔａｔｉｏｎ）に用いられる（Ｃｏｓｔａ １９９８）。アミノ基または追加の電荷が、安定化効果を高めるかどうか決定するために、グルコサミン誘導体が合成された。我々の知る限りにおいて、適合溶質を含む唯一のグルコサミンは、超好熱菌である、ルブロバクターキシラノフィラス（Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ）からのジ−Ｎ−アセチル−グルコサミンホスファート（ＤＡＧＡＰ）：

から単離されている（Ｅｍｐａｄｉｎｈａｓ ２００７）。

ＤＡＧＡＰは、ＤＩＰまたはＤＧＰのような、超好熱菌で発見されたホスホジエステル適合溶質に構造的に類似しているが、濃度が低すぎると細胞の浸透圧のバランスに貢献できないことに起因し、適合溶質としての役割は異議が唱えられている。

本研究で選択されたグリコシルアクセプターの全ては、荷電され、例えば多少の炭素原子、水酸基の欠如、追加のカルボン酸基および不斉中心における立体配置のような変更点で、グリセラートに構造的に関連し、

に提示する。
グルコースおよびガラクトース誘導体の合成のために、チオグリコシドドナー１および１９が合成された。ジクロロメタン中、ＮＩＳ／ＴｆＯＨシステム（Ｌｏｕｒｅｎｃｏ ２００９）を用いる、上記のグリコシルアクセプターによるドナー１および１９のグリコシル化反応で得られた結果が、表１に記載されている。全てのアクセプターは、グリセリン酸メチル誘導体９および１３５を除いて市販され、それらはＤ−セリンについて報告された実験手法に従って合成された（Ｌｏｕｒｅｎｃｏ ２００９；Ｌｏｋ １９７６）。

反応は、グリコシルアクセプターの大部分についてアノマーの混合物を与えた。これは、安定化効果に対するアノマー位の立体化学の重要性を決定するために、αおよびβアノマーを分けて試験する機会が提供された。これは、Ｄ／Ｌ−グリセラートおよびマラートガラクトシル誘導体の場合であった。

例えばアセタートのメタノリシス、グリセラート類似体（化合物３５、１４０および１４１）の場合におけるシリルエーテルのフルオロリシス（ｆｌｕｏｒｏｌｙｓｉｓ）、およびエステル基の加水分解（スキーム２）のような、一般的な有機反応を用いる保護基の連続的な除去の後に、目的の生成物が得られた（表２）。

全体的に、生成物は良い収率でうまく得られ、αアノマーが主生成物であった。いくつかのケースでαおよびβアノマーの混合物が得られたが（αに富む）、それらは予備スクリーニングに用いられ、最も有望な化合物がその後に別々に試験されることになる。最も低い収率は、アセタートの除去およびメチルエステルの加水分解における塩基の使用が、マラート部分の脱離による、アノマー位の加水分解を促進したことに起因し、（Ｓ）−リンゴ酸ジメチルの誘導体（１５０、１５１および１５２、表２）で得られた。この問題は、バシリチオール（ｂａｃｉｌｌｉｔｈｉｏｌ）（ＢＳＨ）の合成についての文献に報告されている（Ｓｈａｒｍａ ２０１１）。マラート部分の脱離を最小限にするために、慎重なエステル加水分解が、最終生成物中にモノエステルの形跡を残した。

１，２−トランスマンノシドの合成について、Ｃ−２アシル隣接基の合成戦略は、保護基としてのアセタート、およびグリコシルドナーとしてのトリクロロアセトアミダートを用いて応用され、それらは比較的早く調製でき、安価である。反応促進剤としてＢＦ_３ＯＥｔ_２を用いる、マンノーストリクロロアセトイミダートドナー１０３とグリコシルアクセプターとの間のグリコシル化反応は、予想通り独占的にα−生成物として与えた。マンノースドナー１０３によるグリコシル化反応で得られた結果が、表３に提示されている。

一般的な有機反応を用いる保護基の連続的な除去（スキーム４）は、良い全収率で目的の生成物を与えた（表４）。

アセタート基およびマンノシルジメチル（Ｓ）−マラート誘導体のメチルエステルの加水分解には、グルコースおよびガラクトース誘導体について上記記載した同様の問題が存在した。

１，２−シスグルコサミン誘導体は、２−アジド−２−デオキシチオグルコシドドナー９０、ならびに−１０℃でＣＨ_２Ｃｌ_２／Ｅｔ_２Ｏ（４：１）の混合物中で実施されたグリコシルアクセプターによるグリコシル化反応、反応促進剤としてのＮＩＳ／ＴｆＯＨを用いることから合成された。結果は表５に提示されている。

αアノマーが、用いた全てのアクセプターにおいて主生成物であった。アセタート基のメタノリシス、およびシリルエーテルのグリセラート誘導体のフルオロリシスのケースの後に、アジドの同時還元によるベンジル基の接触水素化が、不必要の環状アミドの形成を促進した（スキーム６）。この効果は、αアノマーでのみ観察された。

電荷が安定化効果に対して重要であるため、この問題を克服するために、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）反応を用いるアジドの事前の還元、続いて生じたアセタートを有するアミン基の保護（スキーム７）は、アミンをブロックし、環化を回避した。保護基の除去およびメチルエステルの加水分解の後に、最終のＮ−アセチルグルコサミン誘導体が得られた。

実験の詳細
実験１． エチル６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（１）の合成
化合物１の合成は、文献（Ｌｏｕｒｅｎｃｏ ２００９）に記載した手法に従って行った。

実験２． 一般的なグリコシル化法
指摘した溶媒／溶媒混合物（１ｍＬ）中のチオグリコシドドナー（０．１５ｍｍｏｌ）、アクセプター（０．１５ｍｍｏｌ）および４ÅＭＳの懸濁液を、室温で１ｈ撹拌した後に、０℃に冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミド（０．１９ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．９μＬ）を０℃で加え、反応完結時（ＴＬＣ）に、１０％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液（２ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１ｍＬ）を加え、その混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、溶媒を減圧除去した。粗生成物を、分取ＴＬＣ（３：７，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製した。単離した生成物のα／β比を、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）スペクトルによって測定した。

実験３． （２Ｓ）−２−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）プロパン酸メチル（１０）の合成
アクセプター４によるドナー１のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験４． ２−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）酢酸メチル（１３）の合成
アクセプター７によるドナー１のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験５． エチル６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１９）の合成
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のメチルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（２．０ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ、臭化ベンジル（６．３ｍＬ，５１．５ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を０℃に冷却し、水素化ナトリウム（１．４８ｇ，６１．８ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。その反応を室温（ｒ．ｔ．）で一晩維持し、出発物質の変換完了後にＭｅＯＨを０℃で加えた。その混合物をＥｔ_２Ｏで抽出し、合わせた有機相を乾燥し、ろ過し、濃縮した。シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（１０：９０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のフォームとして生成物を得た（５．１４ｇ，９０％）。

濃硫酸（１．０ｍＬ）を０℃で、酢酸／無水酢酸（１：１，５０ｍＬ）中のメチルテトラ−Ｏ−ベンジルガラクトピラノシド（５．７２ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ滴下した。出発物質の変換完了後に、反応混合物を、ｐＨ７まで飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液および氷冷の蒸留水でクエンチした。その混合物をＥｔＯＡｃ（３×７０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残分を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のフォームとしてジアセタートを得た（４．２９ｇ，７５％，α：β＝３．７：１）。

エタンチオール（１．５６ｍＬ，２０．７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のジアセタート（３．６９ｇ，６．９ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。反応混合物を０℃に冷却し、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（１．３１ｍＬ，１０．３５ｍｍｏｌ）を滴下した。出発物質の変換完了後に、反応混合物をＣＨ _２Ｃｌ_２（２×４０ｍＬ）で希釈し、ｐＨ７まで飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液でクエンチした。水相をＣＨ_２Ｃｌ_２（２×４０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残分を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のフォームとしてチオガラクトシド１９を得た（３．３９ｇ，９１％，α／β＝２．４：１）。

実験６． （２Ｓ）−２−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）プロパン酸メチル（３２）の合成
アクセプター４によるドナー１９のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験７． ２−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）酢酸メチル（３４）の合成
アクセプター７によるドナー１９のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験８． ３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−（２Ｒ）−２−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸メチル（３５）の合成
アクセプター９によるドナー１９のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験９． フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（８５）の合成
ＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）中の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α／β−Ｄ−グルコピラノース（Ｇｏｄｄａｒｄ−Ｂｏｒｇｅｒ ２００７）（６．４２ｇ，１７．２ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（３．５５ｍＬ，３４．４ｍｍｏｌ）の溶液へ、０℃でＢＦ_３ＯＥｔ_２（９．８１ｍＬ，７７．４ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物をｒ．ｔ．で４８時間撹拌した後に、ＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。水相をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。粗製物を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔｏＡＣ／ヘキサン）によって精製し、無色の粘性のフォームとして８５（５．４０ｇ，７４％，α／β＝２．５：１）を得て、最初のテトラアセタートを回収した（１．３０ｇ，２０％）。

実験１０． ｐ−トリル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（８６）の合成
ＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）中の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α／β−Ｄ−グルコピラノース（Ｇｏｄｄａｒｄ−Ｂｏｒｇｅｒ ２００７）（３．８７ｇ，１０．４ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンチオール（２．５７ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）の溶液へ、０℃でＢＦ_３ＯＥｔ_２（６．５７ｍＬ，５１．８ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物をｒ．ｔ．で６０時間撹拌した後に、ＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。水相をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。粗製物を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製し、無色の粘性のフォームとして８５（２．２６ｇ，５０％，α／β＝１．８：１）を得て、最初のテトラアセタートを回収した（１．６９ｇ，４４％）。

実験１１． フェニル２−アジド−６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（８７）の合成
ＭｅＯＨ中のＮａＯＭｅ １Ｎ（６．７３ｍＬ，６．７３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の８５（４．７５ｇ，１１．２１ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。３時間後、出発物質を消費した。反応混合物を、ＭｅＯＨで希釈し、Ｄｏｗｅｘ−Ｈ^＋樹脂を中性ｐＨまで加えた。ろ過および溶媒の蒸発で、粘性のガムとしてトリオールを得た（３．２３ｇ，９７％）。ピリジン（２０ｍＬ）中のトリオール（２．４６ｇ，８．２７ｍｍｏｌ）の溶液へ、ｒ．ｔ．でＴＢＤＰＳＣｌ（２．３６ｍＬ，９．１０ｍｍｏｌ）、続いて触媒量のＤＭＡＰを加えた。その混合物を一晩撹拌した後に、Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）による精製で、白色の固体として生成物８７を得た（４．１２ｇ，９３％，α／β＝１．８：１）。

実験１２． ｐ−トリル２−アジド−６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（８８）の合成
実験１１の手法を化合物８６へ応用し、２つの工程を通して９８％の収率（α／β＝１．８：１）で、無色の粘性のガムとして化合物８８を得た。

実験１３． フェニル６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（８９）の合成
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の８７（３．９１ｇ，７．３０ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（１．９７ｍＬ，２２．６ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ、０℃で水素化ナトリウム（０．４５ｇ，１８．６ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。２時間後、ＭｅＯＨを０℃で加え、その反応混合物を飽和水溶液でクエンチし、Ｅｔ_２Ｏで抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、減圧蒸発した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（１０：９０，ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）による精製で、白色の固体としてジベンジル化された生成物（４．４５ｇ，８５％）、および粘性のガムとしてトリベンジル化された生成物９２（０．３１ｇ，７％）を得た。

ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のジベンジル化された生成物（２．４２ｇ，３．３８ｍｍｏｌ）の溶液へ、ｒ．ｔ．でＴＢＡＦ（１．１５ｇ，４．３９ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を３時間撹拌した後に、水を加えた。その混合物をＡｃＯＥｔで抽出し（３×２０ｍＬ）、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）による精製で、粘性のガムとしてアルコールを得た（１．４３ｇ，８８％）。

ピリジン（５ｍＬ）中の前記アルコール（１．３９６ｇ，２．９２ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ、０℃で無水酢酸（０．５５ｍＬ，５．８５ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰを加えた。出発物質の変換完了後に、水を加えた。その混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して粘性の残分を得た。ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１０／９０）の混合物によるセライトを通すろ過で、粘性の無色のガムとして生成物８９を得た（１．３８ｇ，９１％，α：β＝１．４：１）。

実験１４． フェニル２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−クロロアセチル−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（９０）の合成
実験１３の手法を化合物８７へ応用し、無水クロロ酢酸を用いて、３つの工程を通して６６％（α／β＝１．６：１）の収率で、無色の粘性のガムとして化合物９０を得た。化合物９０のキャラクタリゼーションデータは、文献（Ｃｓｉｋｉ ２０１０）と同一であった。

実験１５． ｐ−トリル２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−クロロアセチル−２−デオキシ−１−チオ−α／β−Ｄ−グルコピラノシド（９１）の合成
実験１３の手法を化合物８８へ応用し、無水クロロ酢酸を用いて、３つの工程を通して８２％の収率（α／β＝１：１）で、無色の粘性のガムとして化合物９１を得た。

実験１６． （２Ｓ）−２−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−クロロアセチル−２−デオキシ−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）プロパン酸メチル（９５）の合成
アクセプター４によるドナー９０および９１のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験１７． ２−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−クロロアセチル−２−デオキシ−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）酢酸メチル（９６）の合成
アクセプター７によるドナー９１のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験１８． （２Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−クロロアセチル−２−デオキシ−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸メチル（９７）の合成
アクセプター９によるドナー９１のグリコシル化反応を、実験２に記載した手法に従って実施した。

実験１９． ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルトリクロロアセトイミダート１０３の合成
化合物１０３の合成は、文献（Ｈａｎｅｓｓｉａｎ １９９７）に記載した手法に従って行った。

実験２０． ３−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）−３−ヒドロキシ酪酸エチル（１３６）の合成
ＣＨ_２Ｃｌ_２（６ｍＬ）中のチオグルコシドドナー１（０．８１５ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ酪酸エチル１３３（０．１９７ｍＬ，１．５２ｍｍｏｌ）および４ÅＭＳの懸濁液を、室温で１ｈ撹拌した後に０℃に冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミド（０．４３４ｇ，１．９３ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．１１２ｍＬ）を０℃で加え、反応完結時に、１０％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液（６ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３ｍＬ）を加えた。その混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×６ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、溶媒を減圧除去した。粗生成物を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のフォームとして生成物１３６を得た（０．７７１ｇ，８４％）。

実験２１． ３−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−ヒドロキシ酪酸エチル（１３７）の合成
チオガラクトシドドナー１９（０．６３８ｇ，１．１９ｍｍｏｌ）および３−ヒドロキシ酪酸エチル１３３（０．１７０ｍＬ，１．３１ｍｍｏｌ）のグリコシル化反応を、実験２０に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１３７を得た（０．６８５ｇ，９５％）。

実験２２． （２Ｓ）−２−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸ジメチル（１３８）の合成
チオガラクトシドドナー１（０．８５０ｇ，１．５８ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−リンゴ酸ジメチル１３４（０．２０８ｍＬ，１．５８ｍｍｏｌ）のグリコシル化反応を、実験２０に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１３８を得た（０．９４９ｇ，９４％，α／β＝７：１）。

実験２３． （２Ｓ）−２−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸ジメチル（１３９）の合成
チオガラクトシドドナー１９（１．２０ｇ，２．２３ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−リンゴ酸ジメチル１３４（０．２９４ｍＬ，２．２３ｍｍｏｌ）のグリコシル化反応を、実験２０に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１３９を得た（１．２３５ｇ，８７％，α／β＝５：１）。

実験２４． ３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−（２Ｓ）−２−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸メチル（１４０）の合成
チオガラクトシドドナー１（０．３００ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）およびアクセプター１３５（０．２００ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）のグリコシル化反応を、実験２０に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（１０：９０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１４０を得た（０．４６３ｇ，９８％，α／β＞１０：１）。

実験２５． ３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−（２Ｓ）−２−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸メチル（１４１）の合成
チオガラクトシドドナー１（０．３００ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）およびアクセプター１３５（０．２００ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）のグリコシル化反応を、実験２０に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（１０：９０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１４０を得た（０．４６３ｇ，９８％，α／β＞１０：１）。

実験２６． （２Ｓ）−２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）プロパン酸カリウム（１４２）の合成
ＭｅＯＨ中のＮａＯＭｅ １Ｎ（０．４４３ｍＬ，０．４４３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃
で、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中の１０（０．４２７ｇ，０．７４ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。１ｈ後、その反応混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で中和した。水相をＥｔＯＡｃで抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてα（０．３１０ｇ，７８％）およびβ−アルコール（０．０２７ｇ，７％）を得た。

ＥｔＯＡｃ中のα−アルコール（０．３００ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｐｄ／Ｃ １０％（０．２５ｅｑｕｉｖ）の存在下、５０ｐｓｉで水素化した。５時間後、反応混合物をろ過し、溶媒を蒸発して、非常に粘性の無色のフォームとしてエステルを得た（０．１４９ｇ，定量的（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ））。２Ｍ ＫＯＨ（０．２８ｍＬ）の溶液を、Ｈ_２Ｏ（２ｍＬ）中の前記エステル（０．１４９ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。全ての出発物質を消費した後に、１０％ＨＣｌを用いてｐＨを７に調節し、溶媒を蒸発して、粘性の無色のフォームとして１４２を得た（０．１６２ｇ，定量的）。[α]²⁰ _D = +107.2 (c = 0.60, H₂O). ¹H NMR (D₂O): δ 4.93 (d, J = 3.9 Hz, 1H, H-1), 3.96 (q, J = 6.8 Hz, 1H, CHCH₃), 3.75-3.68 (m, 5H), 3.44 (dd, J = 9.9 Hz, J = 4.0 Hz, 1H, H-2), 3.35 (t, J = 9.3 Hz, 1H, H-4), 1.28 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CHCH ₃) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃): δ 181.0 (CHCO₂ ^-), 97.3 (C-1), 75.5 (CHCH₃), 73.1 (C-3), 71.9 (C-5), 71.5 (C-2), 69.4 (C-4), 60.1 (C-6), 17.5 (CHCH₃) ppm.
実験２７． （２Ｓ）−２−（α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）プロパン酸カリウム（１４３）の合成
ガラクトシド３２（１．７２０ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてアルコールを得た（１．３５０ｇ，９６％，α／β＝３：１）。ベンジルエーテル（１．３２３ｇ，２．４６ｍｍｏｌ）の接触水素化、および実験２３に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４３を粘性の無色のフォームとして得た（０．７１５ｇ，定量的，α／β＝３：１）。FTIR (フィルム) v_max: 1635 (C=O), 3332 (O-H) cm^-1. ¹H NMR (D₂O): δ 4.97 (d, J = 3.9 Hz, H-1 (α)), 4.58 (q, J = 7.0 Hz, CHCH₃ (β)), 4.37 (d, J = 7.7 Hz, H-1 (β)), 4.25 (q, J = 6.9 Hz, CHCH₃ (α)), 3.93-3.88 (m), 3.84-3.79 (m), 3.76-3.64 (m), 3.63-3.52 (m), 3.47 (dd, J = 9.9, 7.7 Hz, ), 1.38 (d, J = 7.0 Hz, CHCH ₃ (β)), 1.35 (d, J = 6.8 Hz, CHCH ₃ (α)) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃): δ 187.3 (CHCO₂ ^-), 101.8 (C-1 (β)), 98.9 (C-1 (α)), 75.2, 73.7, 73.1, 72.6, 71.4, 70.7, 69.21, 69.07, 68.5, 68.0, 60.84, 60.80, 52.68, 52.62, 17.1 (CHCH₃) ppm.
実験２８． ２−（α／β−Ｄ−グルコピラノシル）酢酸カリウム（１４４）の合成
グルコシド１３（０．９４０ｇ，１．６６ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてアルコールを得た（０．７６５ｇ，８８％，α／β＝１１：１）。ベンジルエーテル（０．７１５ｇ，１．３７ｍｍｏｌ）の接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４４を粘性の無色のフォームとして得た（０．３７８ｇ，定量的，α／β＝１０：１）。¹H NMR (D₂O): δ 4.88 (d, J = 3.8 Hz, H-1 (α)), 4.41 (d, J = 7.9 Hz, H-1 (β)), 4.22 (d, J = 15.6 Hz, CHH’CO₂ ^-(β)), 4.06 (d, J = 15.5 Hz, CHH’CO₂ ^- (α)), 4.03 (d, J = 15.8 Hz, CHH’CO₂ ^- (α)), 3.88 (d, J = 15.5 Hz, CHH’CO₂ ^- (β)), 3.79-3.61 (m), 3.46 (dd, J = 9.8, 3.8 Hz), 3.34 (t, J = 9.5 Hz) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃): δ 177.4, 102.3 (C-1 (β)), 98.3 (C-1 (α)), 75.9 (β), 75.5 (β), 73.1, 71.9, 71.5, 69.5, 68.5 (CH₂CO₂ ^- (β)), 66.8 (CH₂CO₂ ^- (α)), 60.61 (C-6 (β)), 60.43 (C-6 (α)) ppm.
実験２９． ２−（α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）酢酸カリウム（１４５）の合成
ガラクトシド３４（１．０７９ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてアルコールを得た（０．８００ｇ，８１％，α／β＝２：１）。ベンジルエーテル（０．７８７ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）の接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４５を粘性の無色のフォームとして得た（０．４１６ｇ，定量的，α／β＝２：１）。¹H NMR (D₂O): δ 4.91 (d, J = 3.9 Hz, H-1 (α)), 4.34 (d, J = 7.7 Hz, H-1 (β)), 4.24 (d, J = 15.6 Hz, CHH’CO₂ ^- (β)), 4.06 (d, J = 15.6 Hz, CHH’CO₂ ^- (α)), 4.03 (d, J = 15.6 Hz, CHH’CO₂ ^- (β)), 3.92-3.84 (m), (d, J = 15.6 Hz, CHH’CO₂ ^- (α)), 3.75-3.71 (m), 3.69-3.58 (m), 3.52 (dd, J = 10.0 Hz, J = 7.6 Hz, H-2 (β)) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃): δ 177.5, 102.9 (C-1 (β)), 98.3 (C-1 (α)), 75.2 (β), 72.6 (β), 71.1 (α), 70.8 (β), 69.5 (α), 69.2 (α), 68.6 (β), 68.5 (CH₂CO₂ ^- (β)), 68.4 (α), 66.8 (CH₂CO₂ ^- (α)), 61.15 (C-6 (α)), 60.95 (C-6 (β)) ppm.
実験３０． （２Ｒ）−２−Ｏ−（α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸カリウム（１４６，１４７）の合成
ガラクトシド３５（１．０７８ｇ，１．２９ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてα（０．６７１ｇ，６６％）およびβ−アルコール（０．２８６ｇ，２８％）を得た。

ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ；０．８３ｍＬ，０．８３ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．でＴＨＦ（４ｍＬ）中のα−ガラクトシド（０．６５５ｇ，０．８３ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その反応混合物を４時間撹拌した後に、水を加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（８０：２０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製で、粘性の無色のガムとしてα−ジオールを得た（０．４５７ｇ，９２％）。α−ジオール（０．１４０ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）からベンジルエーテルの接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４６を粘性の無色のフォームとして得た（０．４１６ｇ，定量的）。アルファ生成物１４６：[α]²⁰ _D = +127.6 (c = 0.62, H₂O). ¹H NMR (D₂O): δ 4.97 (d, J = 3.9 Hz, 1H, H-1), 4.13 (dt, J = 4.7 Hz, J = 2.3 Hz, 1H, CHCH₂OH), 3.99 (t, J = 6.2 Hz, 1H,), 3.93-3.87 (m, 2H), 3.81 (dd, J = 12.1, 3.2 Hz, 1H), 3.77-3.70 (m, 2H), 3.69-3.64 (m, 2H, H-6, H’-6) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 177.1 (CHCO₂ ^-), 97.6 (C-1), 79.2 (CHCH₂OH), 71.3, 69.6, 69.3, 68.5, 63.1 (CHCH₂OH), 61.2 (C-6) ppm.
同じ手法をβ−ガラクトシド（０．２６６ｇ，０．３４ｍｍｏｌ）の脱保護に応用した。フルオロリシス（０．１４０ｇ，７６％）、β−ジオール（０．３４０ｇ，０．６１５ｍｍｏｌ）からベンジルエーテルの接触水素化、およびメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４７を粘性の無色のフォームとして得た（０．１８８ｇ，定量的）。ベータ生成物１４７：¹H NMR (D₂O): δ 4.42 (d, J = 7.5 Hz, 1H , H-1), 4.11 (dd, J = 6.5 Hz, J = 3.2 Hz, 1H, CHCH₂OH), 3.83-3.77 (m, 2H), 3.73-3.67 (m, 2H), 3.64-3.53 (m, 4H) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 177.9 (CHCO₂ ^-), 102.6 (C-1), 81.3 (CHCH₂OH), 75.1, 72.6, 70.9, 68.7, 62.6 (CHCH₂OH), 60.9 (C-6) ppm.
実験３１．
３−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル）−３−ヒドロキシ酪酸カリウム（１４８）の合成
グルコシド１３６（０．８２３ｇ，１．３６ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてα（０．５９４ｇ，８２％）およびβ−アルコール（０．０６６ｇ，９％）を得た。α−アルコール（０．５１６ｇ，０．９４ｍｍｏｌ）のベンジルエーテルの接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４８を粘性の無色のフォームとして得た（０．２８５ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 4.98 (d, J = 4.0 Hz, H-1), 4.97 (d, J = 4.2 Hz, H-1), 4.14-4.04 (m, CHCH₃), 3.80-3.59 (m), 3.45-3.39 (m, H-2), 3.34-3.28 (m, H-4), 2.47 (dd, J = 14.2 Hz, J = 6.9 Hz, CHCH ₂CO₂ ^-), 2.40-2.22 (m, CHCH ₂CO₂ ^-), 1.21 (d, J = 6.1 Hz, CHCH ₃), 1.14 (d, J = 5.9 Hz, CHCH ₃) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 180.19, 180.16, 97.6 (C-1), 94.9 (C-1), 73.4 (CHCH₃), 73.15 (CHCH₃), 73.06, 71.9, 71.51, 71.48, 71.32, 70.5, 69.62, 69.56, 60.6 (C-6), 60.3 (C-6), 45.6 (CHCH₂CO₂ ^-), 44.5 (CHCH₂CO₂ ^-), 20.6 (CHCH₃), 18.0 (CHCH₃) ppm.
実験３２． ３−Ｏ−（α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−ヒドロキシ酪酸カリウム（１４９）の合成
ガラクトシド１３７（０．７０９ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてアルコールを得た（０．５８４ｇ，８８％，α／β＝３：１）。ベンジルエーテル（０．５７３ｇ，１．０１ｍｍｏｌ）の接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４５を粘性の無色のフォームとして得た（０．３０９ｇ，定量的，α／β＝３：１）。¹H NMR (D₂O): δ 5.01 (d, J = 3.9 Hz, H-1 (α)), 4.99 (d, J = 3.8 Hz, H-1 (α)), 4.42 (d, J = 8.4 Hz, H-1 (β)), 4.40 (d, J = 8.1 Hz, H-1 (β)), 4.23-4.04 (m), 3.97-3.89 (m), 3.84 (t, J = 3.9 Hz), 3.78-3.54 (m), 3.40 (dd, J = 9.6, 8.2 Hz), 2.54-2.44 (m), 2.40-2.22 (m), 1.22-1.13 (m) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 180.3, 179.9, 101.9 (C-1 (β)), 101.1 (C-1(β)), 97.9 (C-1 (α)), 95.1 (C-1 (α)), 75.14, 75.10, 74.99, 74.0, 73.4, 72.79, 72.65, 71.02, 71.01, 70.8, 70.52, 70.44, 69.58, 69.46, 69.30, 69.1, 68.72, 68.56, 68.46, 68.2, 68.72, 68.56, 68.46, 68.2, 61.23, 61.09, 60.9, 45.75 (CHCH₂CO₂ ^-), 45.57 (CHCH₂CO₂ ^-), 44.5 (CHCH₂CO₂ ^-), 20.6 (CHCH₃), 19.3 (CHCH₃), 18.0 (CHCH₃) ppm.
実験３３． （２Ｓ）−２−Ｏ−（α／β−Ｄ−グルコピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸カリウム（１５０）の合成
グルコシド１３８（０．２６３ｇ，０．４１ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物を分取ＴＬＣ（５０：５０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして目的のアルコール（０．１１７ｇ，４８％）、ならびに最初の１３８の回収物（０．０６８ｇ，２６％）およびアノマー位における加水分解の生成物（０．０４６ｇ，２５％）を得た。ベンジルエーテル（０．５６５ｇ，０．９５ｍｍｏｌ）の接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１４５を粘性の無色のフォームとして得た（０．２９０ｇ，９４％）。¹H NMR (D₂O): δ 4.94 (d, J = 3.9 Hz, H-1 (α)), 4.39 (d, J = 7.9 Hz, H-1 (β)), 4.19 (dd, J = 10.4, J = 3.1 Hz, 1H, CO₂ ^-CHCH₂CO₂ ^-), 3.80-3.63 (m), 3.45-3.28 (m), 3.21-3.15 (m), 2.59 (dd, J = 15.1 Hz, J = 2.9 Hz, CHCH ₂CO₂ ^- (β)), 2.52 (dd, J = 15.2 Hz, J = 3.2 Hz, CHCH ₂CO₂ ^- (α)), 2.42 (dd, J = 15.2 Hz, J = 10.4 Hz, CHCH ₂CO₂ ^- (α)) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 179.5, 179.1, 135.3 (C-1 (β)), 99.7 (C-1 (α)), 95.9, 79.0, 75.92, 75.72, 74.1, 73.1, 72.2, 71.8, 71.4, 69.6, 69.2, 60.7, 60.0, 41.5 ppm.
実験３４． （２Ｓ）−２−Ｏ−（α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸カリウム（１５１，１５２）の合成
ガラクトシド１３９（１．２１５ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（５０：５０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてα（０．６４２ｇ，５７％）およびβ−アルコール（０．１７６ｇ，１６％）と、出発物質１３９の回収物（０．０２０ｇ，１６％）と、アノマー位における加水分解の生成物（０．０６７ｇ，８％）とを得た。α（０．６４０ｇ，１．０７ｍｍｏｌ）とβ−アルコール（０．１５９ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）とからベンジルエーテルの接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１５１（０．４０１ｇ，定量的）および１５２（０．１００ｇ，定量的）を、粘性の無色のフォームとして得た。アルファ生成物１５１：FTIR (フィルム) v_max: 1634 (C=O), 3332 (O-H) cm^-1. ¹H NMR (D₂O): δ 4.96 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H-1) 4.20 (dd, J = 10.3, 3.1 Hz, CO₂ ^-CHCH₂CO₂ ^-), 4.05-4.02 (m), 3.94 (d, J = 2.8 Hz), 3.86 (dd, J = 10.4 Hz, J = 3.3 Hz), 3.70-3.54 (m), 2.54 (dd, J = 15.2 Hz, 3.2 Hz, 1H , CHCH ₂CO₂ ^-), 2.43 2.42 (dd, J = 15.2 Hz, J = 10.3 Hz, 1H,CHCH ₂CO₂ ^-) ppm.ベータ生成物１５２：FTIR (フィルム) v_max: 1736 (C=O), 3410 (O- H) cm^-1. ¹H NMR (D₂O): δ 4.52 (dd, J = 10.0 Hz, J = 3.1 Hz, 1H, CO₂ ^- CHCH₂CO₂ ^-), 4.33 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-1), 3.83-3.82 (m, 1H), 3.77-3.50 (m, 5H), 2.62 (dd, J = 15.2, 3.1 Hz, 1H, CHCH ₂CO₂ ^-), 2.44 (dd, J = 15.2, 10.0 Hz, 1H, CHCH ₂CO₂ ^-). ¹³C NMR (D₂O): δ 179.4 (CO₂ ^-), 179.0 (CO₂ ^-), 102.0 (C-1), 77.6 (CHCH₂CO₂ ^-), 75.4, 72.8, 70.9, 68.8, 61.3 (C-6), 41.9 (CHCH₂CO₂ ^-) ppm.
実験３５． （２Ｓ）−２−Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸カリウム（１５３）の合成
グルコシド１４０（０．４５０ｇ，０．５４ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとしてα（０．２９９ｇ，７０％）およびβ−アルコール（０．０３０ｇ，７％）を得た。

ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ；０．３７ｍＬ，０．３７ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．でＴＨＦ（２ｍＬ）中のα−グルコシド（０．２９０ｇ，０．３７ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その反応混合物を４時間撹拌した後に、水を加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（８０：２０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製で、粘性の無色のガムとしてα−ジオールを得た（０．１６２ｇ，８０％）。α−ジオール（０．１５０ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）からベンジルエーテルの接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１５３を粘性の無色のフォームとして得た（０．０７７ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 4.96 (d, J = 3.9 Hz, 1H, H-1), 3.96 (dd, J = 3.3 Hz, J = 6.5 Hz, 1H, CHCH₂OH), 3.79- 3.75 (m, 3H), 3.72-3.63 (m, 3H), 3.48 (dd, J = 3.9 Hz, J = 9.9 Hz, 1H, H-2), 3.37 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 177.4 (CO₂ ^-), 99.2 (C-1), 81.4 (CHCH₂OH), 72.9, 72.2, 71.7 (C-2), 69.3 (C-4), 62.6 (CHCH₂OH), 60.0 (C-6) ppm.
実験３６． （２Ｓ）−２−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸カリウム（１５４）の合成
α−ガラクトシド１４１（０．６４０ｇ，０．７７ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色の残分としてアルコール（０．５７２ｇ，９４％）を得た。

ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ；０．８３ｍＬ，０．８８ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．でＴＨＦ（５ｍＬ）中のα−ガラクトシド（０．６９５ｇ，０．８８ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その反応混合物を４時間撹拌した後に、水を加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（８０：２０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製で、粘性の無色のガムとしてジオールを得た（０．３４３ｇ，７１％）。ジオール（０．３１０ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）からベンジルエーテルの接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１５４を粘性の無色のフォームとして得た（０．１７２ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 5.01 (d, J = 3.9 Hz, 1H, H-1), 4.28 (t, J = 4.2 Hz, 1H, CHCH₂OH), 4.18-3.92 (m, 4H), 3.85-3.58 (m, 4H) ppm.
実験３７． （２Ｓ）−２−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸カリウム（１５５）の合成
β−ガラクトシド１４１（０．２７５ｇ，０．３３ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験２６に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色の残分としてアルコール（０．２４３ｇ，９３％）を得た。

ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ；０．８３ｍＬ，０．４４ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．でＴＨＦ（３ｍＬ）中のβ−ガラクトシド（０．３５０ｇ，０．４４ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その反応混合物を４時間撹拌した後に、水を加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（８０：２０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製で、粘性の無色のガムとしてジオールを得た（０．１５１ｇ，６２％）。ジオール（０．１４０ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）からベンジルエーテルの接触水素化、および実験２６に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１５５を粘性の無色のフォームとして得た（０．０７８ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 4.38 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-1), 4.28 (dd, J = 6.2 Hz, J = 2.9 Hz, 1H, CHCH₂OH), 3.84 (dt, J = 7.2, 3.8 Hz, 2H), 3.76-3.68 (m, 3H), 3.66-3.53 (m, 4H) ppm. ¹³C NMR (D₂O): δ 177.1 (CO₂ ^-), 102.5 (C-1), 81.4 (CHCH₂OH), 75.3, 72.8, 71.0, 68.6, 63.2 (CHCH₂OH), 61.0 (C-6) ppm.
実験３８． ３−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−３−ヒドロキシ酪酸エチル（１５６）の合成
３−ジヒドロキシ酪酸エチル（０．３４８ｍＬ，２．６８ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（６ｍＬ）中のトリクロロアセトアミダート１０３（１．１００ｇ，２．２３ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その溶液を０℃に冷却し、ＢＦ_３ＯＥｔ_２（０．０．２８２ｍＬ，２．２３ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。反応完結時に、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液を加え、その後にＣＨ _２Ｃｌ_２（３×１５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮した。残分を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０：６０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、粘性の無色の残分として１５６を得た（０．９４３ｇ，９１％）。

実験３９． （２Ｓ）−２−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸ジメチル（１５７）の合成
トリクロロアセトアミダートドナー１０３（１．５４０ｇ，３．１２ｍｍｏｌ）と（Ｓ）リンゴ酸エチルジメチルジメチル１３４（０．４９４ｍＬ，３．７５ｍｍｏｌ）とのグリコシル化反応を、実験３８に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１５７を得た（１．３５９ｇ，８８％）。

実験４０． ３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−（２Ｓ）−２−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸メチル（１５８）の合成
トリクロロアセトアミダートドナー１０３（１．３０ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）とアクセプター１３５（０．９４６ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）とのグリコシル化反応を、実験３８に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして生成物１５８を得た（１．３３ｇ，７３％）。

実験４１． ３−Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−３−ヒドロキシ酪酸カリウム（１５９）の合成
ＭｅＯＨ中のＮａＯＭｅ １Ｎ（０．３６ｍＬ，０．３６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中の１５６（０．２７６ｇ，０．６０ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。出発物質の変換完了後に、事前に活性化したＤｏｗｅｘ−Ｈ^＋樹脂を中性ｐＨまで加えた。ＭｅＯＨと水とを用いてのろ過の後に、溶媒を減圧除去し、粘性の無色のガムとして脱保護したマンノシドを得た（０．１５７ｇ，９０％）。

２Ｍ ＫＯＨ（０．７８ｍＬ）の溶液を、Ｈ_２Ｏ（４ｍＬ）中の上記のマンノシド（０．４３１ｇ，１．５６ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。全ての出発物質を消費した後に、１０％ＨＣｌを用いてｐＨを７に調節し、溶媒を蒸発して、粘性の無色のフォームとして１５９を得た（０．４４６ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 4.91 (d, J = 7.5 Hz), 4.18-4.09 (m,(CHCH₃), 3.84-3.77 (m), 3.74-3.63 (m), 3.57 (t, J = 8.9 Hz), 2.43-2.21 (m,(CHCH ₂CO₂ ^-)), 1.20 (d, J = 6.1 Hz, CHCH ₂CO₂ ^-), 1.14 (d, J = 5.6 Hz, CHCH ₂CO₂ ^-) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃): δ 179.9 (CH₂ CO₂ ^-), 179.8 (CH₂ CO₂ ^-), 99.7 (C-1), 96.5 (C-1), 73.4, 72.9, 72.5, 70.57, 70.52, 70.41, 70.29, 70.24, 66.84, 66.72, 61.0 (C-6), 60.7 (C-6), 45.5 (CHCH₂CO₂ ^-), 44.8 (CHCH₂CO₂ ^-), 20.8 (CHCH₃) ppm.
実験４２． （２Ｓ）−２−Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸カリウム（１６０）の合成
マンノシド１５７（１．３４３ｇ，２．７２ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験４１に記載した手法に従って実施した。粗製物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（２０：８０，ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製し、粘性の無色のガムとして目的の脱保護したマンノシド（０．６８５ｇ，７８％）と、アノマー位における加水分解の生成物と、Ｄ−マンノピラノシド（０．１００ｇ，２０％）とを得た。実験３８に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解の後に、化合物１６０を粘性の無色のフォームとして得た（０．０．７８６ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 4.85 (t, J = 15.6 Hz, 1H), 4.85 (s, 1H, H-1), 4.24 (dd, J = 8.2 Hz, J = 4.7 Hz, 1H), 3.90-3.58 (m, 5 H), 2.79-2.64 (m, 2H) ppm.
実験４３． （２Ｓ）−２−Ｏ−（Ｄ−マンノピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸カリウム（１６１）の合成
ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ；０．３８ｍＬ，０．３８ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．でＴＨＦ（３ｍＬ）中の１５８（０．２２０ｇ，０．３２ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その反応混合物を４時間撹拌した後に、水を加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。分取ＴＬＣ（６０：４０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製で、粘性の無色のガムとしてアルコールを得た（０．１０３ｇ，７２％）。アルコール（０．５１８ｇ，１．１５ｍｍｏｌ）のアセタート基のメタノリシスを、実験４１に記載した手法に従って実施した。出発物質の変換完了後に、事前に活性化したＤｏｗｅｘ−Ｈ^＋樹脂を中性ｐＨまで加えた。ＭｅＯＨと水とを用いてのろ過の後に、溶媒を減圧除去し、粘性の無色のガムとして脱保護したマンノシドを得た（０．３１２ｇ，９６％）。実験４１に記載した手法に従うメチルエステルの加水分解、化合物１６１を粘性の無色のフォームとして得た（０．３００ｇ，定量的）。¹H NMR (D₂O): δ 4.89 (d, J = 1.4 Hz, 1H, H-1), 4.02(dd, J = 7.1, 3.2 Hz, 1H, CHCO₂ ^-), 3.99 (dd, J = 3.4, 1.6 Hz, 1H, H-), 3.89 (dd, J = 9.5, 3.4 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 12.2, 3.1 Hz, 1H, H-), 3.74-3.61 (m, 5H) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃): δ 100.8, 80.6 (C-1), 73.2, 70.5, 70.1, 66.5, 62.5, 60.5 ppm.
実験４４． （２Ｓ）−２−Ｏ−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−クロロアセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸ジメチル（１６２）の合成
ＣＨ_２Ｃｌ_２：Ｅｔ_２Ｏ（１：４，２０ｍＬ）中のチオグルコシドドナー９１（０．７５０ｇ，１．３２ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−リンゴ酸メチル１３４（０．１９７ｍＬ，１．５２ｍｍｏｌ）および４ÅＭＳの懸濁液を、室温で１ｈ撹拌した後に０℃に冷却した。ＣＨ _２Ｃｌ_２：Ｅｔ_２Ｏ（１：１，２０ｍＬ）中のＮ−ヨードスクシンイミド（０．０．５９４ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．０２７ｍＬ）の溶液を０℃で加えた。出発物質の変換完了後に、１０％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液（２０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）を加えた。混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、溶媒を減圧除去した。粗生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のフォームとして生成物１６２を得た（０．６７２ｇ，８４％）。

実験４５． （２Ｓ）−２−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）プロパン酸メチル（１６３）の合成
ＭｅＯＨ中のＮａＯＭｅ １Ｎ（０．４６ｍＬ，０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の９５（０．４７０ｇ，０．７７ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液へ加えた。１時間後、その反応混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で中和した。水相をＥｔＯＡｃで抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：７０，ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、粘性の無色のガムとして１６３を得た（０．３５５ｇ，９８％）。

実験４６． ２−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）酢酸メチル（１６４）の合成
実験４５の手法を化合物９６（０．５００ｇ，０．９４ｍｍｏｌ）へ応用し、無色の粘性のガムとして化合物１６４を得た（０．３９３ｇ，９２％）。

実験４７． （２Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸メチル（１６５）の合成
ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ，１．１４ｍＬ，１．１４ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．でＴＨＦ（７ｍＬ）中の９７（０．８３０ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）の溶液へ加えた。その反応混合物を４時間撹拌した後に、水を加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して黄色の粘性の残分を得た。シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（５０：５０，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製で、粘性の無色のガムとしてアルコールを得た（０．４０１ｇ，７２％）。実験４５の手法をアルコール（０．２９６ｇ，０．５５ｍｍｏｌ）へ応用し、粘性の無色のガムとして１６５を得た（０．２６１ｇ，９２％）。

実験４８． （２Ｓ）−２−Ｏ−（２−アジド−３，４，ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２−ヒドロキシコハク酸ジメチル（１６６）の合成
実験４５の手法を化合物１６２（０．６７０ｇ，１．１０ｍｍｏｌ）へ応用し、粘性の無色のガムとして化合物１６６を得た（０．４２９ｇ，７３％）。

例２：３つのモデルタンパク質における例１の適合溶質のタンパク質の安定化効果
熱ストレスに対する３つのモデルタンパク質を安定させるための新規合成類似体の能力は、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて評価された。本研究において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームが、モデルタンパク質として用いられ、合成化合物の安定化効果は、塩化カリウムと同様のＭＧおよびＧＧのような天然の溶質、ならびにＭＧｌｙｃおよびＭＬのような事前に合成された非天然の溶質の効果と比較した。

試験された化合物が、表６および７に示されている。

安定アッセイに基づいたＤＳＦは、各タンパク質の機能するｐＨ、溶質無し（コントロール実験）および有りで決定された融点（Ｔ_Ｍ）、ならびに異なる溶質濃度で実施された。各アッセイの変性曲線が分析され、第１の導関数の計算によって決定された融点はタンパク質−変性推移の中間の温度に対応する。溶質無しの場合、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）およびリゾチームは、それぞれ５０、５２および７１℃の融点（Ｔ_Ｍ）を有する。変性温度シフト（△Ｔ_Ｍ）は、溶質有りで得られたＴ_Ｍ値と、コントロール実験（溶質無し）のＴ_Ｍ値とを比較することによって算出された。Ｔ_Ｍの増加に対応する正の△Ｔ_Ｍ値は、タンパク質がより安定で、それを変性するためにより多くのエネルギー（熱）が必要とされることを意味する。Ｔ_Ｍの減少に対応する負の△Ｔ_Ｍ値は、タンパク質が安定ではないことを意味する。

合成および天然の溶質の存在によって誘導される３つの酵素の融点（△Ｔ_Ｍ）の増加量が、図１に示されている。

異なるグルコース誘導体（図２）およびガラクトース（図３）の分析は、ヘキソースに結合している非グリコシド基の重要性を示した。

糖の構造の重要性について、異なるラクタート（図４）およびマラート誘導体（図５）が分析された。

ＭＤＨの融点の増加量に対する、ＳＮａｓｅおよびリゾチームの融点の増加量を図示するとき（図２−５）、結果の概観が現れる。

試験したタンパク質についての一般的な結論は、
−荷電された化合物は、より良い安定剤であり、
−マラート（最も良い）およびラクタート誘導体は、より高い安定化を与え、
−無糖の部分は、ヘキソース構造より安定化効果においてより大きな影響を有し、および
−グルコースおよびガラクトース誘導体は、より良い安定剤である。

リゾチームに対する酢酸カリウム塩（ＡｃＯＫ）の安定化効果は、ハイパーソリュートとともに研究された（図６）。その結果は、ＡｃＯＫ単独が、高い塩濃度でのみ安定させ、良い安定剤ではないということを示した。しかしながら、ハイパーソリュートとともに安定化特性を高めることができる。

安定化効果に対する糖のグリコシド結合の重要性を決定するために、ＤおよびＬ−ガラクトシルグリセラートの異なるαおよびβアノマーが研究された（図７）。３つの酵素で得られた結果は、Ｌ−グリセラートが天然のＤ−グリセラート誘導体よりも良い安定剤であり、β−アノマーはβ配置を有するものより良い安定剤であるということを示した。

溶質の濃度に対する融点の増加量の依存性を研究するために、前記タンパク質は異なる溶質濃度（０．１、０．２５および０．５Ｍ）で試験された（図８、図９、および図１０）。３つのタンパク質において、結果は、安定化の度合いに無関係で、安定化効果が溶質の濃度に直接に比例した、ということを示した。得られた結果は、一般的な傾向に従うように見えるが、ＳＮａｓｅ（図８）およびリゾチーム（図１０）の場合には、より近い見た目をとり、α−ガラクトシルマラートは明確に最も良い安定剤である。ＭＤＨの場合、結果はグルコシルマラートがこの酵素のための最も良い安定剤であったことを示す。

材料
マンノシルグリセラート（ＭＧ）、グルコシルグリセラート（ＧＧ）、グルコシルグルコシルグリセラート（ＧＧＧ）、マンノシルグリコラート（ＭＧｌｙ）およびマンノシルラクタート（ＭＬ）は、文献に記載されたような化学合成によって得られた（Ｃｏｓｔａ １９９８）。新規合成化合物は、例１に記載したような化学合成によって得られた。目的の化合物は、水を用いて希釈したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。純粋な化合物を含む分画が貯められ、凍結乾燥された。化合物の純度および濃度は、Ｄ_２Ｏ中、５００ＭＨｚ分光計で得られた^１ＨＮＭＲスペクトルによって評価された。定量化目的のために、スペクトルは、標準濃度としてのギ酸塩を用いて、６０ｓの繰り返し時間によって取得された。９８％より高い純度のサンプルのみが用いられた。ブタの心臓からのミトコンドリアのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＩＩ）は、Ｒｏｃｈｅから購入し、ニワトリ卵白リゾチームは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。これらの酵素は、さらなる精製なしに用いられた。組換えブドウ球菌性ヌクレアーゼＡ（ＳＮａｓｅ）は、Ｆａｒｉａ ２００８によって記載されたような大腸菌の細胞から産生され、精製された。タンパク質の濃度は、ＭＤＨの吸光係数については０．２８（ｍｇ／ｍＬ）^−１ｃｍ^−１、リゾチームについては２．５８（ｍｇ／ｍＬ）^−１ｃｍ^−１、およびＳＮａｓｅについては０．９３（ｍｇ／ｍＬ）^−１ｃｍ^−１を用いて、２８０ｎｍのＵＶ吸収から決定された。

ＤＳＦアッセイ
タンパク質の融点（Ｔ_Ｍ）決定は、水溶性環境で完全にクエンチされているにも関わらず、タンパク質の疎水性パッチと結合して蛍光を発する、蛍光プローブＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（分子プローブ）を用いるタンパク質の変性をモニターすることによって実施された。そのような蛍光の増加は、示差走査型蛍光定量法を用いて融点の関数として測定できる。２０μＬの総容積を有する典型的なアッセイにおいて、０．１４から０．２１ｍｇ／ｍＬまでのタンパク質の濃度、および５倍の色素濃度が、ノイズ比に対して最も良い信号を保証するために用いられた。ＳＮａｓｅまたはＭＤＨのタンパク質の貯蔵液は、リン酸緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６）で調製され、リゾチームは、クエン酸緩衝液（４０ｍＭ クエン酸ナトリウム，１１０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０）で調製された。これらの貯蔵液は、アッセイ前に同じバッファーに対して広範に透析された。タンパク質の濃度は、ＭＤＨが約１．９μＭ、ＳＮａｓｅが１２．４μＭ、リゾチームが１３μＭで用いられた。溶質溶液は、それぞれの濃度に水で調製された。アッセイは、８μＬの色素緩衝溶液、および１０μＬの溶質溶液へ２μＬのタンパク質を加えることによって調製し、溶質溶液を除いて、全てがタンパク質の精製緩衝液に調製された。温度に対する蛍光強度は、正確な推移変曲点を抽出するために、第１の導関数（ｄ（Ｒｆｕ）／ｄＴ）を決定することによって、タンパク質の融点（Ｔ_Ｍ）を計算するために用いられる。

例３： ブタのインスリンに対する例１の６つの適合溶質の安定化効果。

ブタのインスリンを安定させるガラクトシルラクタート１４３、ガラクトシルブチラート１４９、ガラクトシルグリセラート１４６、グルコシルブチラート１４８、グルコシルグリコラート１４４、およびグルコシルマラート１５０の能力は、例２に記載したＤＳＦアッセイを用いて研究された。

アッセイのために、１２９μＭの濃度のブタのインスリン、ならびに０．１および０．２５Ｍの濃度の適合溶質を含む溶液が作製された。０．１Ｍおよび０．２５Ｍの各溶質で観察される融点の増加が、図１１に示されている。

６つ全ての溶質は、試験された両方の濃度のブタのインスリンを安定させ、グルコシルグルコラートおよびグルコシルマラートという条件で融点の最も高い増加となった。

考察
熱誘導による不活性化に対するモデルタンパク質の保護における新規化合物の効果は、ＤＳＦを用いて評価され、塩化カリウムと同様なＭＧおよびＧＧのような天然の溶質と、ＭＧｌｙｃおよびＭＬのような他の事前に合成された非天然の溶質の効果とが比較された。ＤＳＦは、分子の安定化特性について迅速な情報を得るための優れた高スループット法であることを証明した。

得られた結果の分析は、安定化効果が一般的ではなく、特定のタンパク質−溶質相互作用に強く依存するということを示した。いくつかの溶質は優れた熱安定化特性を示したにも関わらず、安定化の度合いは各タンパク質で異なる。

電荷の存在が、安定化効果のための最も重要な特性の一つである。グルコサミン環状誘導体のような無電荷の溶質は、最も低い安定化を与え、２つの電荷を有するマラート誘導体は、最も良い安定剤であった。

異なるヘキソースの使用に関して、グルコースおよびガラクトース誘導体が、それぞれのマンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン誘導体より良い安定剤であった。しかしながら結果は、糖に結合しているグループが天然の糖より安定化効果により多くの影響を与えるということを示した。

ガラクトシルグリセラートのαおよびβアノマーを用いて得られた結果は、α誘導体がより良い安定剤であることを示した。

本発明に記載された新規化合物は、他の生物学的物質と同様な追加のタンパク質を安定させるであろうということが予期される。上述のように、本発明の新規化合物は、例えば抗体およびホルモンのような生物製剤、化粧品、食品など、薬学的に用いられる生物学的物質の安定のために有用である。本発明の化合物は、熱ストレス、凝集、および高塩分濃度に対して生物学的物質を保護するために使用できる。例えば、本発明の化合物は、精製、合成および／または乾燥、輸送、および保管のようなプロセス中の生物製剤を安定させるために使用できる。

参考文献
Costa, M.S. et al., “An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea,” Biotechnology of Extremophiles, Antranikian, G., Ed., Springer Berlin Heidelberg: 1998; vol. 61, pp 117-153.
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Faria, C. et al., “Design of new enzyme stabilizers inspired by glycosides of hyperthermophilic microorganisms,” Carbohydrate Research 343 (2008) 3025−3033.
Faria, C. et al., “Inhibition of formation of α-synuclein inclusions by mannosylglycerate in a yeast model of Parkinson's disease,” Biochimica et Biophysica Acta 1830 (2013) 4065−4072.
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Lourenco, E. C, “Synthesis of potassium (2R)-2-O-alpha-D-glucopyranosyl-(1 -> 6)-alpha-D-glucopyranosyl-2,3-dihydroxypropanoate a natural compatible solute.” Carbohydrate Research 2009, 344, 2073-2078.
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Pais, T. M. et al., “Structural determinants of protein stabilization by solutes − The importance of the hairpin loop in rubredoxins. Febs Journal 2005, 272, 999-1011.
２００７年８月３０日に公開されたＰＣＴ国際出願公開WO/2007/097653号(Pereira de Oliveira da Silva Santos et al.).
Sharma, S. V. et al., “Chemical and chemoenzymatic syntheses of Bacillithiol: A unique low-molecular-weight thiol amongst low G+C gram-positive bacteria,” Angewandte Chemie-International Edition 2011, 50, 7101-7104.

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２００７年８月３０日に公開されたＰＣＴ国際出願公開WO/2007/097653号(Pereira de Oliveira da Silva Santos et al.).
Sharma, S. V. et al., “Chemical and chemoenzymatic syntheses of Bacillithiol: A unique low-molecular-weight thiol amongst low G+C gram-positive bacteria,” Angewandte Chemie-International Edition 2011, 50, 7101-7104.
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］式Ｉ：
［式中、Ｒ ^１ は、−ＯＣ（Η）（Ｘ）（ＣＨ _２ ）ｎＣ（＝Ｏ）ＯＨであり、
Ｒ ^２ は、−ＯＨ、−Ｎ _３ 、もしくは−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ _３ であり、または
Ｒ ^１ およびＲ ^２ は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
を形成し、
Ｒ ^３ は、−Η、−ＣＨ _３ 、−ＣＨ _２ Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ _２ ＯＨであり、
Ｘは、−Η、−ＣＨ _３ 、−ＣＨ _２ ＯＨ、またはＣＨ _２ Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであり、
ｎは、０または１である］の化合物またはその塩であって、
前記化合物が
であり、かつＲ ^２ がＯＨであり、ＸがＣＨ _３ であり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
であり；
前記化合物が
であり、かつＲ ^２ がＯＨであり、ＸがＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
であり；
前記化合物が
であり、かつＲ ^２ がＯＨであり、ＸがＣＨ _２ ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
であり；
前記化合物が
であり、かつＲ ^２ がＯＨであり、ＸがＣＨ _２ ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
である化合物またはその塩。
［２］前記化合物は、
である［１］から［２］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［３］前記化合物は、
である［１］から［２］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［４］前記化合物は、
である［１］から［２］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［５］前記化合物は、
である［１］から［２］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［６］前記化合物のα／βアノマー比は、１：１から９９：１までである［１］から［５］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［７］前記化合物のα／βアノマー比は、９９：１より大きい［１］から［５］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［８］Ｒ ^１ が
である、［１］から［７］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［９］Ｒ ^１ が
である［８］の化合物またはその塩。
［１０］Ｒ ^１ が
である［８］の化合物またはその塩。
［１１］Ｒ ^１ が
である［８］の化合物またはその塩。
［１２］Ｒ ^２ が−ＯＨである［１］から［１１］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［１３］Ｒ ^２ が−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ _３ である［１］から［１１］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［１４］Ｒ ^１ およびＲ ^２ は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
を形成している［１］から［７］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［１５］Ｒ ^１ およびＲ ^２ は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
を形成している［１４］の化合物またはその塩。
［１６］Ｒ ^１ およびＲ ^２ は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
を形成している［１４］の化合物またはその塩。
［１７］Ｒ ^３ が−ＣＨ _３ である［１４］から［１６］までのいずれか一つに記載の化合物。
［１８］Ｒ ^３ が−ＣＨ _２ ＯＨである［１４］から［１６］までのいずれか一つに記載の化合物。
［１９］前記化合物は、
である［１］の化合物またはその塩。
［２０］［１］から［１９］までのいずれか一つに記載の少なくとも１種の化合物またはその塩、および生物学的物質を含む組成物。
［２１］さらにバッファーを含む［２０］の組成物。
［２２］前記生物学的物質は、ポリペプチドである［２０］から［２１］までのいずれか一つに記載の組成物。
［２３］前記ポリペプチドは、酵素、抗体、血漿タンパク質、またはホルモンである［２２］の組成物。
［２４］前記ポリペプチドは、インスリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼまたはリゾチームである［２２］から［２３］までのいずれか一つに記載の組成物。
［２５］前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドである［２２］から［２４］までのいずれか一つに記載の組成物。
［２６］前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドではない［２２］から［２４］までのいずれか一つに記載の組成物。
［２７］生物学的物質を含んでいる溶液へ、［１］から［１９］までのいずれか一つに記載の少なくとも１種の化合物またはその塩を加えて、安定した溶液を形成することを含む、生物学的物質を安定させる方法。
［２８］前記安定した溶液を乾燥する工程をさらに含む［２７］の方法。
［２９］前記生物学的物質は、ポリペプチドである［２７］から［２８］までのいずれか一つに記載の方法。
［３０］前記ポリペプチドは、酵素、抗体、血漿タンパク質、またはホルモンである［２９］の方法。
［３１］前記ポリペプチドは、インスリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼまたはリゾチームである［２９］から［３０］までのいずれか一つに記載の方法。
［３２］前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドである［２９］から［３１］までのいずれか一つに記載の方法。
［３３］前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドではない［２９］から［３１］までのいずれか一つに記載の方法。
［３４］生物学的物質を安定させるための［１］から［１９］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩。
［３５］生物学的物質を安定させるための［１］から［１９］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩の使用。
［３６］［１］から［１９］までのいずれか一つに記載の化合物またはその塩を含む診断キット。
［３７］マイクロアレイ、バイオセンサー、または酵素製剤を含む［３６］の診断キット。

Claims (37)

1. 式Ｉ：
   
   ［式中、Ｒ^１は、−ＯＣ（Η）（Ｘ）（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＯＨであり、
   Ｒ^２は、−ＯＨ、−Ｎ_３、もしくは−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３であり、または
   Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
   
   を形成し、
   Ｒ^３は、−Η、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ_２ＯＨであり、
   Ｘは、−Η、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＯＨ、またはＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであり、
   ｎは、０または１である］の化合物またはその塩であって、
   前記化合物が
   
   であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_３であり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
   
   であり；
   前記化合物が
   
   であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
   
   であり；
   前記化合物が
   
   であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_２ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
   
   であり；
   前記化合物が
   
   であり、かつＲ^２がＯＨであり、ＸがＣＨ_２ＯＨであり、ｎが０であるとき、当該化合物は、
   
   である、該化合物またはその塩。
2. 前記化合物は、
   
   である請求項１から請求項２までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
3. 前記化合物は、
   
   である請求項１から請求項２までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
4. 前記化合物は、
   
   である請求項１から請求項２までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
5. 前記化合物は、
   
   である請求項１から請求項２までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
6. 前記化合物のα／βアノマー比は、１：１から９９：１までである請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
7. 前記化合物のα／βアノマー比は、９９：１より大きい請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
8. Ｒ^１が
   
   である、請求項１から請求項７までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
9. Ｒ^１が
   
   である請求項８の化合物またはその塩。
10. Ｒ^１が
    
    である請求項８の化合物またはその塩。
11. Ｒ^１が
    
    である請求項８の化合物またはその塩。
12. Ｒ^２が−ＯＨである請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
13. Ｒ^２が−Ν（Η）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３である請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
14. Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
    
    を形成している請求項１から請求項７までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
15. Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
    
    を形成している請求項１４の化合物またはその塩。
16. Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって
    
    を形成している請求項１４の化合物またはその塩。
17. Ｒ^３が−ＣＨ_３である請求項１４から請求項１６までのいずれか一項に記載の化合物。
18. Ｒ^３が−ＣＨ_２ＯＨである請求項１４から請求項１６までのいずれか一項に記載の化合物。
19. 前記化合物は、
    
    
    
    である請求項１の化合物またはその塩。
20. 請求項１から請求項１９までのいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物またはその塩、および生物学的物質を含む組成物。
21. さらにバッファーを含む請求項２０の組成物。
22. 前記生物学的物質は、ポリペプチドである請求項２０から請求項２１までのいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記ポリペプチドは、酵素、抗体、血漿タンパク質、またはホルモンである請求項２２の組成物。
24. 前記ポリペプチドは、インスリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼまたはリゾチームである請求項２２から請求項２３までのいずれか一項に記載の組成物。
25. 前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドである請求項２２から請求項２４までのいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドではない請求項２２から請求項２４までのいずれか一項に記載の組成物。
27. 生物学的物質を含んでいる溶液へ、請求項１から請求項１９までのいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物またはその塩を加えて、安定した溶液を形成することを含む、生物学的物質を安定させる方法。
28. 前記安定した溶液を乾燥する工程をさらに含む請求項２７の方法。
29. 前記生物学的物質は、ポリペプチドである請求項２７から請求項２８までのいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ポリペプチドは、酵素、抗体、血漿タンパク質、またはホルモンである請求項２９の方法。
31. 前記ポリペプチドは、インスリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼまたはリゾチームである請求項２９から請求項３０までのいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドである請求項２９から請求項３１までのいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ポリペプチドは、組換えポリペプチドではない請求項２９から請求項３１までのいずれか一項に記載の方法。
34. 生物学的物質を安定させるための請求項１から請求項１９までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
35. 生物学的物質を安定させるための請求項１から請求項１９までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
36. 請求項１から請求項１９までのいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む診断キット。
37. マイクロアレイ、バイオセンサー、または酵素製剤を含む請求項３６の診断キット。