PT103442A

PT103442A - Derivados sintéticos de manosil-glicerato para a estabilização e/ou preservação de biomateriais

Info

Publication number: PT103442A
Application number: PT103442A
Authority: PT
Inventors: Christopher David Maycock; Maria Rita Mendes Bordalo Ventura Centeno Lima; Pedro Lamosa Antonio; Helena Santos; Tiago Quininha Faria
Original assignee: Stab Vida Investigacao E Servi
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2007-08-31
Also published as: WO2007097652A2; WO2007097652A3

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO CONSISTE NA UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS SINTÉTICOS DO MANOSIL-GLICERATO, TAIS COMO O MANOSIL-LACTATO OU O MANOSIL-GLICEROL, OU MISTURAS DESTES, ISOLADAMENTE OU COMO CONSTITUINTES DE UMA FORMULAÇÃO ADEQUADA, COM VISTA À PROTECÇÃO E/OU ESTABILIZAÇÃO DE ENZIMAS, PROTEÍNAS, ANTI-CORPOS, MOLÉCULAS DE DNA OU RNA, MEMBRANAS BIOLÓGICAS, LIPOSSOMAS, OU OUTROS COMPONENTES CELULARES E BIOMATERIAIS FACE A CONDIÇÕES AGRESSIVAS PARA OS MESMOS.

Description

Derivados Sintéticos de Manosil-glicerato para a Estabilização e/ou Preservação de Biomateriais

DOMÍNIO DA TÉCNICA A presente invenção contempla o uso de derivados sintéticos de manosil-glicerato, tais como o manosil-lactato ou manosil-glicerol, isoladamente ou como componentes de uma formulação para proteger e/ou estabilizar enzimas ou outros componentes celulares, ou outros materiais contendo componentes de origem biológica, contra agressões deletérias, nomeadamente as causadas por temperaturas elevadas, elevada osmolaridade, radicais livres, dessecação, liofilização, armazenamento e/ou uso continuado, conducente a um melhoramento de processos, sensibilidade, e/ou condições de armazenamento.

Os ditos compostos podem ser descritos como hexoses envolvidas numa ligação glicosidica com um composto linear de três carbonos, obedecendo a formula genérica representada na Figura 1.

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR

Recentemente, os microorganismos termófilos e hipertermófilos têm sido reconhecidos como fonte de novos compostos utilizáveis em variadíssimas aplicações biotecnológicas. Entre estas, encontra-se o uso de novos solutos compatíveis, altamente eficientes na preservação de biomateriais. Nestes organismos têm-se encontrado vários solutos novos e pouco usuais tais como o fosfato de di-mio-inositol, o fosfato de di-mannosí1-di-mío-inositol, o fosfato de diglicerol, o manosil-glucosil-glicerato, o manosil-glicerato, e a manosil-gliceramida, cujos níveis intracelulares respondem a condições de stress, tais como osmolaridade ou temperaturas supra-óptimas, com a provável função de minimizar essas agressões.

De entre estes compostos, o manosil-glicerato tem sido o mais extensamente estudado. Foi demonstrado que este composto possui uma capacidade superior à dos solutos compatíveis mais 1 comummente usados na protecção de enzimas e proteínas in vitro [1-3]. 0 uso de manosil-glicerato como agente estabilizador de biomateriais é já conhecido, de facto, o manosil-glicerato é um reconhecido bioestabilizador de origem termófila, cujas aplicações industriais estão protegidas por uma patente Europeia [4] . A estabilidade adicional a proteínas por alguns solutos orgânicos de baixo peso molecular permite a enzimas funcionar sob condições mais agressivas de temperatura, pressão, força iónica, pH, presença de detergentes ou solventes orgânicos. Uma das prioridades da biotecnologia moderna é a obtenção de enzimas estáveis ou de agentes com a capacidade de as estabilizar contra a desnaturação térmica ou química. A capacidade de alguns solutos compatíveis para realizar essa função é assim de grande importância para biotecnologia moderna. Esta lógica estende-se obviamente a todas as proteínas que sejam ou possam ser usadas em processos onde a sua estabilidade é necessária, uma vez que, todas as proteínas com ou sem actividade enzimática partilham os mesmos elementos básicos de estrutura e podem portanto ser protegidas contra a desnaturação, agregação ou inativação usando os mesmos processos ou mecanismos gerais.

Também deve ser enfatizado que os solutos compatíveis são capazes de proteger proteínas, membranas celulares, lipossomas, e células dos efeitos deletérios da dessecação, e que possuem fortes propriedades hidratantes. A preservação de células ou componentes celulares e biomateriais dessecados ou liofilizados tem inúmeras aplicações na medicina, indústria farmacêutica, indústria cosmética, indústria alimentar, e investigação científica. Apesar da grande importância da dessecação e congelamento na conservação de amostras biológicas, um determinado grau de desnaturação proteica ou um decréscimo no numero de células viáveis ocorre inevitavelmente durante estes processos de conservação, que poderiam ser evitados ou diminuídos através do uso de estabilizadores de baixa massa molecular. E também de referir que a estabilidade dos ácidos nucleicos como o DNA ou o RNA, pode ser aumentada através da adição de solutos compatíveis de hipertermófilos, tal como descrito para as ectoínas [5], e o seu uso pode-se antever em várias aplicações médicas, farmacêuticas, ou de investigação cientifica.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Na origem da presente invenção está a descoberta que, apesar das capacidades notáveis do manosil-glicerato como estabilizador, é possível melhorar essas capacidades através da síntese química de análogos desenhados para o efeito. É este o caso do manosil-lactato, um derivado sintético do manosil-glicerato, que não se encontra na natureza e que contém uma única substituição do grupo hidroxilo por um átomo de hidrogénio na posição 3 do glicerato. Esta simples substituição confere ao novo composto um desempenho melhorado como estabilizador de enzimas ou ácidos nucléicos. É portanto lógico assumir que substituições semelhantes produzam melhoramentos iguais ou ainda maiores.

Assim, e de acordo com o exposto no estado da técnica, o desenvolvimento de estabilizadores de biomateriais de eficácia aumentada através da síntese química de derivados do manosil-glicerato será (como os exemplos mostrarão) um considerável avanço na área da estabilização de biomateriais e em todos os processos industriais e/ou comerciais onde a estabilidade de biomateriais seja um factor a ter em conta.

Desta forma, a utilização de derivados sintéticos de manosil glicerato como o manosil-lactato, o manosil-glicerol, o glucosil-lactato, ou a glucosil-gliceramida, entre outros, como aditivos em formulações adequadas, conduzirá ao melhoramento de processos utilizando materiais de origem biológica. Este melhoramento pode ter como objecto: a obtenção de proteínas apresentando uma estabilidade adicional mais elevada; o funcionamento melhorado de enzimas sob condições mais agressivas de temperatura, pressão, força iónica, pH, presença de detergentes ou solventes orgânicos; a estabilização e/ou protecção contra a desnaturação de proteínas imobilizadas, ácidos nucléicos, membranas celulares ou lipossomas; a protecção de proteínas, ácidos nucléicos, membranas celulares, lipossomas ou células face aos efeitos deletérios da dessecação; ou a protecção de biomateriais em geral contra a perda de função ou viabilidade durante o seu transporte, armazenamento ou uso frequente.

Os derivados sintéticos de manosil-glicerato podem ser adicionados em concentrações da ordem dos milimolar a preparações de componentes biológicos, melhorando o seu desempenho ou tempo de vida de uma forma mais eficaz do que outros compostos naturais. EXEMPLO 1

Este exemplo mostra que o manosil-lactato apresenta um efeito estabilizador sobre estruturas protéicas mais elevado em comparação com outros estabilizadores. Em particular, o manosil-lactato é capaz de elevar a temperatura de fusão da nuclease A de estafilococos (SNase) e da lisozima de clara de ovo de galinha mais eficazmente que o seu homólogo natural, o manosil-glicerato, sendo portanto mais eficaz na protecção destas proteínas contra a desnaturação térmica e consequente inactivação. A SNase recombinante foi produzida em células de Escherichia coli (estirpe HB101) e purificada através de choque osmótico e cromatografia catiónica. A solução stock de proteína foi preparada após diálises sucessivas a 4°C em tampão fosfato de sódio (10 mM, pH 7,5). Usou-se uma concentração final de proteína de aproximadamente 0,02 mM nos ensaios de calorimetria diferencial de varrimento (DSC). A lisozima de clara de ovo de galinha foi obtida comercialmente (Fluka) sob a forma de um pó liofilizado, e usada sem qualquer passo adicional de purificação. A solução stock de proteína foi preparada após diálises sucessivas a 4°C em tampão citrato de sódio (20 mM, pH 6,0). Usou-se uma concentração final de proteína de aproximadamente 0,025 mM nos ensaios de calorimetria diferencial de varrimento (DSC).

Os solutos compatíveis utilizados neste exemplo foram o manosil-glicerato de potássio, o fosfato de di-mio-inositol de potássio, a ectoína, a hidroxiectoína, a trehalose e o glicerol. Para além destes solutos, o efeito do manosil-glicerol e dos sais de potássio de manosil-lactato, fosfato inorgânico e cloreto 4 também foram testados. Todos os solutos foram utilizados a uma concentração final de 500 mM. O manosil-lactato e o manosil-glicerol foram sintetizados quimicamente, enquanto o manosil-glicerato foi extraído e purificado a partir de células de Rhodothermus obamensis. O fosfato de di-mio-inositol, a ectoina e a hidroxiectoina foram obtidas comercialmente (Bitop). O grau de pureza e a quantificação de todos os compostos foram aferidas por NMR.

Os ensaios de DSC foram realizados num microcalorímetro MicroCal VP-DSC. As amostras foram sujeitas a um processo de desarejamento por aplicação de vácuo durante 8 minutos, após o que foram aquecidas de 25°C a 95°C a uma taxa de aquecimento de l°C/min. O manosil-lactato (500 mM) provou ser um exelente estabilizador, elevando a temperatura de fusão da SNase e da lisozima de 10.0°C e respectivamente (figuras 2 e 3), enquanto que, nas mesmas condições, o homólogo natural - manosil glicerato - apenas eleva as respectivas temperaturas de fusão de 7.1°C e St?5!:* Nenhum dos outros compostos testados foi capaz de superar o efeito estabilizador do manosil-lactato. EXEMPLO 2

Este exemplo mostra que o manosil-lactato é capaz de elevar mais a temperatura de fusão da nuclease A de estafilococos do que o seu homólogo natural - manosil-glicerato - ao longo de uma maior gama de temperaturas, podendo, portanto, ser utilizado na protecção de proteínas em geral contra a desnaturação térmica e consequente perda de actividade ao longo de uma maior gama de temperaturas, sendo ainda capaz de conferir o mesmo grau de estabilização que o seu homólogo natural - manosil-glicerato - a concentrações inferiores. A nuclease A de estafilococos foi produzida e purificada tal como descrito no EXEMPLO 1, bem como a obtenção da solução stock de proteína e a realização dos ensaios de DSC. O efeito da concentração do manosil-lactato na temperatura de fusão da nuclease A de estafilococos foi estudado até a concentração de 1 Μ. O resultado está exposto na figura 4 em 5 comparação com o obtido, em iguais condições, na presença manosil-glicerato. Mostra-se assim que o manosil-lactato é capaz de elevar mais a temperatura de fusão da nuclease A de estafilococos do que o manosil-glicerato em concentrações até 1 M. EXEMPLO 3

Este exemplo mostra que o manosil-lactato e o manosil-glicerol são capazes de diminuir fortemente o grau de agregação proteica na desidrogenase do malato de coração de porco. A desidrogenase do malato de coração de porco foi obtida comercialmente (Roche) em solução aquosa contendo 50% de glicerol e extensamente dialisada contra tampão fosfato de sódio a 50 mM (pH 7.6). A enzima (a 0.2 mg/ml) foi incubada a 20°C numa célula termo-estatizada na presença ou ausência de 500 mM de manosil-glicerol ou manosil-lactato num espectrofluorimetro (SPEX-Fluorologl680, Edison, NJ, USA) e mediu-se a dispersão de luz a 320 nm. No inicio da experiência, a temperatura foi elevada rapidamente até aos 40°C e o aumento de dispersão de luz em virtude da agregação proteica foi monitorizado ao longo do tempo. Os resultados, apresentados na figura 5, demonstram claramente a capacidade destes dois solutos para diminuírem a extensão da agregação proteica desta enzima. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1.

Representa a estrutura química genérica dos derivados sintéticos de manosil-glicerato contemplados nesta patente, em todas as suas possíveis formas estéreo-isoméricas. A figura pretende representar todas as hexoses quer estejam na configuração a ou β. As letras "Ri" e w§Vf pretendem representar um grupo carboxilato, metilo, amida, ou um grupo álcool primário.

Figura 2.

Temperatura de fusão da nuclease A de estafilococos na presença ou ausência de diferentes solutos adicionados a uma concentração de 500 mM. &

Figura 3.

Temperatura de fusão da lisozima na presença ou ausência de diferentes solutos adicionados a uma concentração de 500 mM.

Figura 4.

Temperatura de fusão da nuclease A de estafilococos em função da concentração de manosil-glicerato (linha tracejada) e de manosil-lactato (linha continua).

Figura 5

Agregação da desidrogenase do malato medida por dispersão de luz a 320 nm na presença ou ausência de manosil-glicerol e de manosil-lactato adicionados a uma concentração de 500 mM.

REFERÊNCIAS

[13 Ramos, A., N. D. H. Raven, R. J. Sharp, S. Bartolucci, M. Rossi, R. Cannio, J. Lebbink, J. van der Oost, W. M. de Vos e H. Santos. 1997. Stabilisation of enzimes against thermal stress and freeze-drying bi mannosyl-glycerate. Appl. Environ. Microbiol. 63:4020-4025.

[2] Borges, N., A. Ramos, N. D. H. Raven, R. J. Sharp, e H. Santos. 2002. Comparative study of the thermostabilising properties of mannosyl-glycerate and other compatible solutes on model enzimes. Extremophiles 6:209-216.

[3] Lamosa, P., A. Burke, R. Peist, R. Huber, M. Liu, G. Silva, C. Rodrigues-Pousada, J. LeGall, C. Maicock, e H. Santos. 2000. Thermostabilisation of proteins by diglycerol phosphate, a new compatible solute from the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidus. Appl. Environ. Microbiol. 66:1974-1979.

[4] Santos, Η., A. Ramos, M. S. da Costa. Thermostabilisation, osmoprotection, and protection against desiccation of enzimes, cell components and cells by mannosyl-glycerate. European Patent no. 97670002.1 [5] Malin G, Iakobashvili R, e Lapidot A (1999) Effect of tetrahidropirimidine derivatives on protein-nucleic acids interaction. Tipe II restriction endonucleases as a model sistem. J. Biol. Chem. 274:6920-6929. $

Claims

1. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, nomeadamente manosil-lactato ou manosil-glicerol, incluindo todas as suas possíveis formas estereo-isoméricas, isoladamente ou como constituinte de uma formulação adequada caracterizada por conferir protecção ou estabilidade acrescida a enzimas, outros componentes celulares ou outros biomateriais, em situações de stress, melhorando por esta via o desempenho, sensibilidade ou tempo útil de armazenagem dos ditos materiais.

2. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com a reivindicação n°l, caracterizada pela substituição do resíduo de glicerato por um grupo polar de três carbonos.

3. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl e 2, caracterizada pela substituição do resíduo de glicerato por um grupo lactilo.

4. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl e 2, caracterizada pela substituição do resíduo de glicerato por um grupo glicerilo.

5. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 4, caracterizada pelo facto de o resíduo polar de três carbonos poder estar na configuração D ou L.

6. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 5, caracterizada pelo facto de a ligação glicosídica se estabelecer entre a posição 1 da hexose e a posição 3 do resíduo polar de três carbonos.

7. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 5, caracterizada pelo facto de a ligação glicosídica se estabelecer entre a posição 1 da hexose e a posição 2 do resíduo polar de três carbonos.

8. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 5, caracterizada pelo facto de a ligação glicosídica se estabelecer entre a posição 1 da hexose e a posição 1 do resíduo polar de três carbonos.

9. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 8, caracterizada pela substituição do resíduo de manose por qualquer outra hexose, nomeadamente glucose, galactose, gulose, talose, fucose, ramnose, idose, or altrose.

10. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 9, caracterizada pelo facto de a hexose apresentar uma configuração a ou β.

11. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir protecção a enzimas ou outras proteínas contra a desnaturação térmica e/ou agregação induzidas pela purificação, transporte, uso repetido e/ou armazenamento.

12. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 11, caracterizada por conferir protecção a actividade das enzimas de polimerização por reacção em cadeia (PCR) com intuitos industriais, clínicos ou de investigação científica, durante a reciclagem a alta temperatura das enzimas, bem como durante o seu transporte ou armazenamento.

13. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 11, caracterizada por conferir estabilidade a enzimas ou outras proteínas durante a liofilização, dessecação e armazenamento a baixas temperaturas.

14. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 11, caracterizada por conferir estabilidade acrescida durante a produção, armazenamento e utilização de enzimas de "test-kit" utilizados para fins de diagnóstico, industriais ou de investigação científica.

15. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 11, caracterizada por conferir estabilidade acrescida a enzimas ou outras proteínas durante a sua utilização rotineira para fins de diagnóstico, industriais ou de investigação científica.

16. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 11, caracterizada por suprimir ou diminuir a extensão da agregação proteica para fins terapêuticos, de diagnóstico, industriais ou de investigação científica.

17. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir protecção estrutural e/ou estabilidade acrescida face a uma agressão térmica ou degradação enzimática de moléculas de DNA ou RNA.

18. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir protecção estrutural e/ou estabilidade acrescida a membranas celulares e lipossomas sujeitos a condições de stress tais como dessecação e/ou liofilização.

19. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir estabilidade acrescida ou aumentar as capacidades hidratantes de produtos cosméticos, estabilizar compostos inclusos em lipossomas, ou suprimir radicais livres de oxigénio.

20. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir estabilidade acrescida a anticorpos durante a sua utilização para fins clínicos, académicos, ou industriais.

21. A utilização de derivados sintéticos de manosil- glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir estabilidade acrescida a vacinas durante a sua utilização para fins clínicos, académicos, ou industriais. HMM 4

22. A utilização de derivados sintéticos de manosil-glicerato, de acordo com as reivindicações nosl a 10, caracterizada por conferir protecção acrescida a células microbianas contra os danos causados por processos como liofilização, dessecação, temperatura elevada, ou congelamento.