JP5119545B2 - 蛋白質を含む液状組成物中における蛋白質の安定化方法 - Google Patents
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また、請求項2記載の方法は、請求項1記載の方法において、ポリエチレングリコールの重量平均分子量が200〜50000であることを特徴とする。
(実験方法)
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に卵白リゾチームを溶解し、卵白リゾチームの濃度が1.0mg/mlの溶液を調製した。この溶液に重量平均分子量が6000(平均重合度150)のポリエチレングリコール(和光純薬社製のPEG6000)を0mg/ml〜200mg/mlの濃度範囲で添加した。得られた液状組成物を98℃で10分間加熱し、15,000rpmで20分間遠心分離(株式会社日立ハイテクノロジーズ製のhimac CF15RXを使用)後、上清画分を取り分けた。次に0.5mg/mlのMicrococcus lysodeikticus溶液(Sigma社製)(50mMリン酸緩衝液、pH6.5)1480μlに、上記の上清画分20μlを添加し、分光光度計(日本分光社製のV−550)を用いて波長600nmによる吸光度にてリゾチームの活性測定を行った。
図1に、横軸を液状組成物のポリエチレングリコール濃度とし、縦軸をリゾチーム活性(加熱処理前の酵素活性を100%とした場合の加熱処理後の残存酵素活性)とするグラフを示す。図1から明らかなように、ポリエチレングリコールを添加しなかった場合には、リゾチーム活性はわずか1.5%であり、そのほとんどが熱失活してしまっていたが、ポリエチレングリコールを添加することで濃度依存的にリゾチーム活性は向上した。しかしながら、ポリエチレングリコールの濃度を200mg/mlにしても、リゾチーム活性は約60%どまりであり、ポリエチレングリコールの濃度を高濃度にしても熱失活を効果的に抑制することはできなかった。
(実験方法)
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に卵白リゾチームを溶解し、卵白リゾチームの濃度が1.0mg/mlの溶液を調製した。この溶液に重量平均分子量が6000(平均重合度150)のポリエチレングリコール(和光純薬社製のPEG6000)を0mg/ml、50mg/ml、100mg/mlの濃度で添加するとともにアミノ酸又はその誘導体を0mM〜300mMの濃度範囲で添加した。得られた液状組成物を98℃で10分間加熱し、15,000rpmで20分間遠心分離(株式会社日立ハイテクノロジーズ製のhimac CF15RXを使用)後、上清画分を取り分けた。次に0.5mg/mlのMicrococcus lysodeikticus溶液(Sigma社製)(50mMリン酸緩衝液、pH6.5)1480μlに、上記の上清画分20μlを添加し、分光光度計(日本分光社製のV−550)を用いて波長600nmによる吸光度にてリゾチームの活性測定を行った。
図2に、アミノ酸又はその誘導体としてアルギニン(和光純薬社製)を用いた場合の、横軸を液状組成物のアルギニン濃度とし、縦軸をリゾチーム活性(加熱処理前の酵素活性を100%とした場合の加熱処理後の残存酵素活性)とするグラフを示す。また、アミノ酸又はその誘導体としてアラニン(和光純薬社製)、グルタミン酸(和光純薬社製)、塩酸グアニジン(和光純薬社製)、アルギニンエチルエステル(Sigma社製)を用いた場合の図2と同様のグラフを、それぞれ図3〜図6に示す。図2〜図6から明らかなように、ポリエチレングリコールのみを100mg/mlの濃度で添加してもリゾチーム活性は20%以下であり、熱失活を効果的に抑制することはできなかった。しかしながら、アミノ酸又はその誘導体をさらに添加することで、熱失活の抑制効果は、ポリエチレングリコールとアミノ酸又はその誘導体をそれぞれ単独で添加した場合の熱失活の抑制効果に比較して格段に向上し、両者を併用することによる相乗効果が見られた。特に顕著な熱失活の抑制効果が得られたのはアルギニンとアルギニンエチルエステルを添加した場合であり、ポリエチレングリコールのみを100mg/mlの濃度で添加してもリゾチーム活性は10%程度であり、アルギニンのみを200mMの濃度で添加してもリゾチーム活性は25%程度であったのが、両者を併用することでリゾチーム活性は90%程度まで上昇し、熱失活を効果的に抑制することができた(図2)。同様に、ポリエチレングリコールのみを100mg/mlの濃度で添加してもリゾチーム活性は10%程度であり、アルギニンエチルエステルを15mMの濃度で添加してもリゾチーム活性は10%程度であったのが、両者を併用することでリゾチーム活性は85%程度まで上昇し、熱失活を効果的に抑制することができた(図6)。
(実験方法)
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に卵白リゾチームを溶解し、卵白リゾチームの濃度が1.0mg/mlの溶液を調製した。この溶液に重量平均分子量が6000(平均重合度150)のポリエチレングリコール(和光純薬社製のPEG6000)を0mg/ml、50mg/ml、100mg/mlの濃度で添加するとともに無機塩を0mM〜300mMの濃度範囲で添加した。得られた液状組成物を98℃で10分間加熱し、15,000rpmで20分間遠心分離(株式会社日立ハイテクノロジーズ製のhimac CF15RXを使用)後、上清画分を取り分けた。次に0.5mg/mlのMicrococcus lysodeikticus溶液(Sigma社製)(50mMリン酸緩衝液、pH6.5)1480μlに、上記の上清画分20μlを添加し、分光光度計(日本分光社製のV−550)を用いて波長600nmによる吸光度にてリゾチームの活性測定を行った。
図7に、無機塩として塩化ナトリウム(ナカライテスク社製)を用いた場合の、横軸を液状組成物の塩化ナトリウム濃度とし、縦軸をリゾチーム活性(加熱処理前の酵素活性を100%とした場合の加熱処理後の残存酵素活性)とするグラフを示す。また、無機塩として塩化アンモニウム(和光純薬社製)、硫酸アンモニウム(和光純薬社製)、ヨウ化アンモニウム(和光純薬社製)を用いた場合の図7と同様のグラフを、それぞれ図8〜図10に示す。図7〜図10から明らかなように、ポリエチレングリコールのみを100mg/mlの濃度で添加してもリゾチーム活性は10%程度であり、熱失活を効果的に抑制することはできなかった。しかしながら、無機塩をさらに添加することで、熱失活の抑制効果は、ポリエチレングリコールと無機塩をそれぞれ単独で添加した場合の熱失活の抑制効果に比較して格段に向上し、両者を併用することによる相乗効果が見られた。特に顕著な熱失活の抑制効果が得られたのは塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ヨウ化アンモニウムを添加した場合であり、これらの無機塩を併用することで熱失活をほぼ完全に抑制することができた(図8〜図10)。
(実験方法)
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に卵白リゾチームを溶解し、卵白リゾチームの濃度が1.0mg/mlの溶液を調製した。この溶液に重量平均分子量が200(平均重合度5)、6000(平均重合度150)、20000(平均重合度500)のポリエチレングリコール(和光純薬社製のPEG200、PEG6000、PEG20000)を0mg/ml、50mg/mlの濃度で添加するとともにアミノ酸又はその誘導体としてアルギニンエチルエステル(Sigma社製)を0mM、25mMの濃度で添加した。得られた液状組成物を98℃で10分間加熱し、15,000rpmで20分間遠心分離(株式会社日立ハイテクノロジーズ製のhimac CF15RXを使用)後、上清画分を取り分けた。次に0.5mg/mlのMicrococcus lysodeikticus溶液(Sigma社製)(50mMリン酸緩衝液、pH6.5)1480μlに、上記の上清画分20μlを添加し、分光光度計(日本分光社製のV−550)を用いて波長600nmによる吸光度にてリゾチームの活性測定を行った。
図11に、ポリエチレングリコールの大きさとリゾチーム活性(加熱処理前の酵素活性を100%とした場合の加熱処理後の残存酵素活性)との関係を示す。図11から明らかなように、重量平均分子量が6000のポリエチレングリコールとアルギニンエチルエステルを併用した場合及び重量平均分子量が20000のポリエチレングリコールとアルギニンエチルエステルを併用した場合の熱失活の抑制効果は、重量平均分子量が200のポリエチレングリコールとアルギニンエチルエステルを併用した場合の熱失活の抑制効果に比較して優れていた。なお、アルギニンエチルエステルのかわりに、アルギニン(和光純薬社製)、アラニン(和光純薬社製)、塩酸グアニジン(和光純薬社製)、塩化ナトリウム(ナカライテスク社製)、塩化アンモニウム(和光純薬社製)を用いて同様の実験を行った場合でも、ポリエチレングリコールの大きさとリゾチーム活性との関係は、アルギニンエチルエステルを用いた場合と同じ傾向であった。
Claims (2)
- 蛋白質を含む液状組成物中における蛋白質の熱失活を抑制する方法であって、(成分1)濃度が10mg/ml〜250mg/mlのポリエチレングリコールと(成分2)濃度が10mM〜2Mのアラニン、アルギニン、グルタミン酸又はこれらの誘導体、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びグアニジンから選択される少なくとも1つを液状組成物中に共存させることを特徴とする方法。
- ポリエチレングリコールの重量平均分子量が200〜50000であることを特徴とする請求項1記載の方法。
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